CN114324291A

CN114324291A - 固定于特制玻片上的光交联分子探针及其制备方法、应用

Info

Publication number: CN114324291A
Application number: CN202111618384.XA
Authority: CN
Inventors: 张慧; 陈若雨; 谢建辉; 颜继忠
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明公开了一种固定于特制玻片上的光交联分子探针及其制备方法、应用，涉及中药活性成分筛选相关的技术领域。所述的光交联分子探针以三氟甲基苯基双吖丙啶作为光交联基团，通过含氧直链连接桥固定于氨基载玻片，在365nm紫外光照射下可与多种中药小分子结合构建光交联分子探针。本发明的光交联基团与载体间的距离通过含氧直链连接桥得以延长，增加了活性小分子与靶蛋白特异性结合的机率，活性小分子通过光亲和连接链固定于特制载体上，方便实现对“钓取”的靶标蛋白进一步的确证分析。本发明以非选择性的方式进行光交联反应，适用于成分复杂多样的中药及复方体系，应用于中药活性成分筛选领域，具有通量高、速度快、时效性强、易于实现的优点。

Description

固定于特制玻片上的光交联分子探针及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于药物活性成分筛选相关的技术领域，具体涉及一种固定于特制玻片上的光交联分子探针及其制备方法、应用。

背景技术

分子探针技术是从化学生物学角度发展起来的靶点研究技术，在基于活性的蛋白质谱分析和以化合物为中心的化学蛋白质组学中都发挥关键的作用，通过运用活性导向的探针分子在复杂的生物样品中特异性地标记靶标蛋白，从而对小分子与靶标蛋白的相互作用进行研究。光交联反应作为一种快速、简单和时效可控的交联工具广泛地应用于化学、生物、医学和材料等多个研究领域，将合成的光敏小分子化合物作为工具探针，在特定波长的光照射下，产生高活性的中间体，与其受体活性部位形成特异性的不可逆共价键结合的化学反应。

随着光学技术与生物医学的不断发展，光交联分子探针逐渐成为发现蛋白与小分子、生物大分子、蛋白或受体间相互作用的重要工具。光交联分子探针一般由活性分子、光交联基团、连接部位及报告基团组成，但在应用上存在诸多限制：对于结构复杂的天然小分子，化学修饰难度较大且无法进行充分的构效关系研究；化学标记后的小分子可能因化学性质的改变而与靶蛋白结合造成假阳性结果；构建的分子探针仅用于单一成分靶点的筛选，对于化学成分多样的中药而言需要极大的工作量；同时游离状态下的分子探针与靶蛋白结合后存在示踪困难，分离、鉴定步骤复杂繁琐等问题。基于以上问题，需要设计合成一种固定于特制玻片上的光交联分子探针，与相关疾病靶标蛋白共孵育后，借助现代光谱分析手段对其进行直接鉴定，用于探究中药复杂成分与蛋白质之间的相互作用以及针对特定靶标蛋白筛选中药活性成分。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法及应用，以获得结构和性能较优，固定于特定载体上的光交联分子探针，这种特殊的分子探针可与疾病靶标蛋白共孵育后检测玻片表面的蛋白质分子信号，实现药物活性成分的高通量筛选，也可利用光交联分子探针“钓取”更多可能与活性成分特异性结合的靶标蛋白，实现靶蛋白的富集，为发现药物治疗新靶标，进一步验证光交联分子探针技术在靶标蛋白确证方面提供可行性研究基础。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)普通载玻片经(3-氨丙基)三甲氧基硅烷处理得到氨基玻片；

(2)将步骤(1)制得的氨基玻片与光亲和连接链孵育得到光亲和连接链负载的特制玻片；

(3)将药物小分子化合物与步骤(2)得到的光亲和连接链负载的特制玻片进行光交联反应得到光交联分子探针。

进一步地，所述光亲和连接链为：

N-[2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl]-4-[3-(trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl]benzamide；

结构式如下：

进一步地，所述步骤(1)的具体过程为：

将普通载玻片表面清洗干净后置于玻片架上，浸入无水乙醇中浸泡过夜后用质量分数5～10％的氢氧化钠溶液浸泡1～3h，洗涤后放入质量分数0.5～1％HCl水溶液浸泡1～3h，再用纯水洗涤干燥。待玻片冷却至室温后与体积分数9％的(3-氨丙基)三甲氧基硅烷甲醇溶液充分反应，经洗涤干燥冷却后得到氨基玻片。

进一步地，所述步骤(2)的具体过程为：将步骤(1)得到的氨基玻片插入装有玻片活化液的染色缸中，室温下振摇活化，得到活化后的玻片。将活化后的玻片用N,N-二甲基甲酰胺振摇洗涤；将洗涤后的玻片与含有N,N-二异丙基乙胺和光亲和连接链的N,N-二甲基甲酰胺溶液在室温黑暗干燥条件下孵育过夜，所述N,N-二异丙基乙胺的浓度为50mM，所述光亲和连接链的浓度为10mM。依次用无水乙醇、N,N-二甲基甲酰胺振摇洗涤；将洗涤后的玻片放入装有封闭液的染缸中振摇，再用无水乙醇、超纯水振摇洗涤，经氮气干燥后，得到特制玻片。

进一步地，所述玻片活化液为含有N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(10mM)与N,N-二异丙基乙胺(10mM)的N,N-二甲基甲酰胺溶液；封闭液为浓度为1M乙醇胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液；所述N,N-二甲基甲酰胺均需要过分子筛并静置24h以上。

进一步地，所述步骤(3)的具体过程为：吸取10mM药物小分子化合物溶液点样1μL至特制玻片表面，将点样后的玻片干燥后，置于UV 365nm下照射3h，用甲醇淋洗，再依次用N,N-二甲基甲酰、二氯甲烷、无水乙醇、超纯水振摇洗涤，经氮气干燥玻片表面，得到光交联分子探针。

进一步地，所述步骤(2)和步骤(3)振摇频率为120～160r/min；所述步骤(2)和步骤(3)的实验操作在避光条件下进行，以保证光亲和连接链中三氟甲基苯基双吖丙啶光活性基团的稳定性。

进一步地，所述药物小分子化合物为皂苷类、黄酮类、木脂素类或糖类化合物。

本发明提出一种固定于特制玻片上的光交联分子探针，由上述方法制备得到。

本发明提出了一种固定于特制玻片上的光交联分子探针在药物活性成分筛选方面的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过使用以三氟甲基苯基双吖丙啶为光交联基团的光亲和连接链，将其固定于特定载体上后可与多种中药活性小分子结合构建光交联分子探针，通过与疾病相关靶标蛋白共孵育实现中药活性成分的高通量筛选。光亲和连接链中的三氟甲基苯基双吖丙啶光活性基团在黑暗条件下具有良好的稳定性，同时具有较好的光交联活性，在365nm紫外光照射下产生的高活性反应中间体卡宾不可逆地结合或插入到多种小分子的C(sp2)-H、C(sp3)-H、O-H、N-H化学键发生反应，通量高、速度快、适用性强。

本发明中光交联基团与载体间的距离通过含氧直链连接桥得以延长同时增加了亲水性。进一步地，本发明中光交联分子探针的制备过程选择具有良好化学稳定性和低挥发性的N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，减少对实验人员及环境的危害，其余所用溶剂均廉价易得。将其应用于中药活性成分的筛选具有良好前景，这一新方法具有操作简单快速，易于实现，时效性大的特点，能够广泛适用于成分复杂、化学结构多样的中药复方制剂在玻片上的固定化。

附图说明

图1为本发明提供的一种固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备路线图；

图2为固定于特制玻片上的光交联分子探针的性能验证示意图，其中，图2中的A为罗丹明6G点样位置与玻片边缘处在显微镜50倍镜下的白光图，图2中的B为红框所标注区域的拉曼Mapping图；

图3为游离状态阿卡波糖在不同激光条件下采集的拉曼谱图；

图4为固定于特制玻片上的光交联阿卡波糖探针与游离状态阿卡波糖的拉曼谱图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述的实施例仅为本发明的部分实施例，而非全部的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性改善的前提下所得到的所有其他实施方式，均属于本发明所保护的范围。

本发明通过使用三氟甲基苯基双吖丙啶与含氧直链连接桥合成的光亲和连接链，将其固定于氨基载玻片上，在特定波长紫外光照射下与多种中药活性小分子发生光交联反应获得固定于特制玻片上的光交联分子探针，该光交联分子探针能够用于中药活性成分的快速、高通量筛选。

此外，下述实施例不对权利要求所记载的发明内容起任何限定作用。

实施例1

本发明提出了一种固定于特制玻片上的光交联分子探针，该光交联分子探针结构如下：

本发明提出了一种固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，如图1所示，其中，1为氨基玻片，2为活化后的氨基玻片，3为固定于特制玻片上的光交联分子探针。试剂与条件：(a)为10％NaOH,1％HCl,9％APTES,rt；(b)为10mM DSC,10mM DIEA,DMF,rt；(c)为N-[2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl]-4-[3-(trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl]benzamide,DIEA,DMF,rt。具体包括以下步骤：

(1)氨基玻片的制备，具体过程如下：

将25×75mm普通载玻片表面清洗干净后置于不锈钢玻片架上，浸入无水乙醇中浸泡过夜后用10％氢氧化钠溶液浸泡1h，纯水洗涤三次后放入1％HCl水溶液浸泡1h，再用纯水洗涤三次，放入120℃烘箱干燥30min。待玻片冷却至室温后与体积分数为9％的(3-氨丙基)三甲氧基硅烷甲醇溶液反应30min，经乙醇等有机溶剂洗涤后放入110℃烘箱干燥15min，冷却后得到氨基玻片，室温干燥条件下储存备用。

(2)将步骤(1)制得的氨基玻片与光亲和连接链孵育得到光亲和连接链负载的特制玻片，将步骤(1)得到的氨基玻片浸入活化液中进行活化，将活化后的玻片用N,N-二甲基甲酰胺振摇洗涤，将洗涤后的玻片与含光亲和连接链的N,N-二甲基甲酰胺溶液在室温黑暗干燥条件下孵育过夜。依次用无水乙醇、N,N-二甲基甲酰胺振摇洗涤，浸入封闭液中封闭。经无水乙醇、超纯水充分洗涤后进行氮气干燥得到特制玻片。具体过程如下：

氨基玻片的活化：将N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(128mg,10mM)与N,N-二异丙基乙胺(83uL,10mM)加至50mL，过分子筛干燥处理的N,N-二甲基甲酰胺中得到玻片活化液。将氨基玻片竖直插入装有玻片活化液的染缸中，室温下振摇活化2h，振摇频率140r/min，得到活化后的玻片。将活化后的玻片用分子筛干燥处理后的N,N-二甲基甲酰胺振摇洗涤四次，每次10min，振摇频率140r/min。洗涤过程中更换试剂时速度应尽可能快，避免玻片变干。

光亲和连接链的固定：为保证光亲和连接链中三氟甲基苯基双吖丙啶光活性基团的稳定性，后续的操作需要在避光条件下进行。实验所用N,N-二甲基甲酰胺均需过分子筛并静置24h以上。将洗涤后的玻片与含有N,N-二异丙基乙胺(413.5uL,50mM)和光亲和连接链(180mg,10mM)的N,N-二甲基甲酰胺溶液在室温干燥条件下孵育过夜，依次用无水乙醇振摇洗涤三次、N,N-二甲基甲酰胺振摇洗涤一次，每次10min，振摇频率140r/min。将3mL乙醇胺加至47mL N,N-二甲基甲酰胺中得到封闭液，洗涤后的玻片放入装有封闭液的染缸中振摇1h，振摇频率140r/min，所述封闭液为1M乙醇胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液，所述N,N-二甲基甲酰胺均需要过分子筛并静置24h以上。取出玻片分别用无水乙醇、超纯水振摇洗涤两次，每次10min，振摇频率140r/min，氮气干燥，收集玻片，-20℃储存备用得到固定于特制玻片上的光交联分子探针。

上述光亲和连接链为：

N-[2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl]-4-[3-(trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl]benzamide，结构如下：

得到特制玻片的结构如下：

(3)将药物小分子与固定于特制玻片上的光交联分子探针进行光交联反应得到光交联分

子探针，其结构如下：

将浓度为10mM的中药小分子溶液点样至步骤(2)得到的固定于特制玻片上的光交联分子探针上，真空干燥除去玻片表面多余的溶剂，将玻片置于UV 365nm下照射3h，取出玻片后依次用甲醇淋洗、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、无水乙醇、超纯水振摇洗涤，氮气干燥后装入玻片盒密封，-20℃储存备用。

实施例2

以具有荧光特性的罗丹明6G作为小分子验证固定于特制玻片上的光交联分子探针的活性性能，具体过程如下：

为保证光亲和连接链中三氟甲基苯基双吖丙啶光活性基团的稳定性，下述操作仍需在避光条件下进行。首先，配制1mM罗丹明6G的DMSO溶液，用量程为0.5-10μL移液枪均匀等距地点样至固定于特制玻片上的光交联分子探针表面，将玻片置于真空干燥箱中干燥除去玻片表面的溶剂，UV 365nm照射3h后依次用甲醇淋洗五次，N,N-二甲基甲酰、二氯甲烷、无水乙醇、超纯水振摇洗涤一次，每次6min，振摇频率140r/min，氮气干燥后-20℃储存，激光显微共聚焦拉曼检测点样位置的荧光信号。

参见图2，可以看出，在显微镜50倍镜视野下，点样位置在玻片上有明显的圆弧形边界，通过对红框所标注区域进行拉曼Mapping表征，发现点样位置边界内有明显的荧光信号，而边界外无荧光信号，以上结果表明，罗丹明6G与特制玻片上的光交联基团经365nm紫外照射发生光交联反应后被固定在玻片上，得到的固定于特制玻片上的光交联分子探针具有较好的光交联活性。

实施例3

所述药物小分子选用降糖药物阿卡波糖，制备得到固定于特制玻片上的光交联阿卡波糖探针，通过激光显微共聚焦拉曼仪检测玻片上的阿卡波糖信号，依据此，实现药物小分子在光亲和性玻片上的固定化。其合成方法包括以下步骤：

为保证光亲和连接链中三氟甲基苯基双吖丙啶光活性基团的稳定性，下述操作仍需在避光条件下进行。将-20℃储存的固定于特制玻片上的光交联分子探针放至室温后用于点样，配置10mM阿卡波糖DMSO溶液，用量程为0.5-10μL移液枪吸取阿卡波糖DMSO溶液点样至玻片表面，点样量为1μL，将点样后的玻片置于玻璃培养皿中放入真空干燥箱中干燥除去多余溶剂，干燥温度为41℃，干燥时间1h，将玻片转移至UV 365nm下照射3h，取出后先用甲醇淋洗五次，再依次用N,N-二甲基甲酰、二氯甲烷、无水乙醇、超纯水振摇洗涤一次，每次6min，振摇频率140r/min，氮气干燥玻片表面，-20℃储存获得固定于特制玻片上的光交联阿卡波糖探针。激光显微共聚焦拉曼光谱仪进行分析，阿卡波糖被固定在特制玻片上后1667cm^-1处的特征峰消失、472cm^-1处的特征峰增强，如图3～图4。结合光交联反应原理推测，三氟甲基苯基双吖丙啶经光催化形成卡宾后插入了阿卡波糖中的C＝C，从而将阿卡波糖固定在玻片上获得固定于特制玻片上的光交联阿卡波糖探针。

通过激光显微共聚焦拉曼光谱仪进行分析，结果表明通过光交联反应固定在玻片上的小分子在拉曼光谱图上显示出区别于游离小分子的特征峰。

本发明进一步的改进在于，所述光交联分子探针可将降糖药物通过光交联反应固定于玻片上，得到的新型分子探针可与治疗糖尿病的相关靶标如α-葡萄糖苷酶共孵育，确证小分子与蛋白质之间的相互作用以实现药物活性成分的高通量快速筛选。

本发明所述药物小分子也可以为皂苷类、黄酮类、木脂素和糖类等化合物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims

1.一种固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)普通载玻片经(3-氨丙基)三甲氧基硅烷处理得到氨基玻片；

2.根据权利要求1所述的固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，其特征在于，所述光亲和连接链为：

结构式如下：

3.根据权利要求1所述的固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体过程为：

4.根据权利要求1所述的固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体过程为：

将步骤(1)得到的氨基玻片插入装有玻片活化液的染色缸中，室温下振摇活化，得到活化后的玻片。将活化后的玻片用N,N-二甲基甲酰胺振摇洗涤；将洗涤后的玻片与含有N,N-二异丙基乙胺和光亲和连接链的N,N-二甲基甲酰胺溶液在室温黑暗干燥条件下孵育过夜，所述N,N-二异丙基乙胺的浓度为50mM，所述光亲和连接链的浓度为10mM。依次用无水乙醇、N,N-二甲基甲酰胺振摇洗涤；将洗涤后的玻片放入装有封闭液的染缸中振摇，再用无水乙醇、超纯水振摇洗涤，经氮气干燥后，得到特制玻片。

5.根据权利要求4所述的固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，其特征在于，所述玻片活化液为含有N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(10mM)与N,N-二异丙基乙胺(10mM)的N,N-二甲基甲酰胺溶液；所述封闭液为浓度为1M乙醇胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液；所述N,N-二甲基甲酰胺溶液均需要过分子筛并静置24h以上。

6.根据权利要求1所述的固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体过程为：

吸取10mM药物小分子化合物溶液点样1μL至特制玻片表面，将点样后的玻片干燥后，置于UV 365nm下照射3h，用甲醇淋洗，再依次用N,N-二甲基甲酰、二氯甲烷、无水乙醇、超纯水振摇洗涤，经氮气干燥玻片表面，得到光交联分子探针。

7.根据权利要求4-6任一项所述的固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)振摇频率为120～160r/min；所述步骤(2)和步骤(3)的实验操作在避光条件下进行，以保证光亲和连接链中三氟甲基苯基双吖丙啶光活性基团的稳定性。

8.根据权利要求6所述的固定于特制玻片上的光交联分子探针的制备方法，其特征在于，所述药物小分子化合物为皂苷类、黄酮类、木脂素类或糖类化合物。

9.一种固定于特制玻片上的光交联分子探针，其特征在于，由权利要求1-7任一项所述方法制备得到。

10.一种权利要求1所述的固定于特制玻片上的光交联分子探针在药物活性成分筛选方面的应用。