CN1334872A - 将寡核苷酸固定在载体上的方法 - Google Patents

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Abstract

通过将包含寡核苷酸的缓冲液点样在载体上,从而将寡核苷酸固定在载体上的方法,其特征在于所述核苷酸序列通过共价键固定在所述载体上。

Description

将寡核苷酸固定在载体上的方法
技术领域
本发明涉及将寡核苷酸固定在固体支持物上的方法，该方法可用于制备DNA微阵列等。本发明还涉及按照所述方法将寡核苷酸固定其上的材料以及用所述材料检测靶核酸的方法。
背景技术
随着分析包括人类在内的生物体基因组计划的进展，逐渐阐明了各种生物基因组的结构。同时，为了利用关于基因组的大量信息开发药物、或者保持或改善健康，分析基因组功能的技术也得到发展。为此，DNA芯片技术成为引人瞩目的主要技术之一。DNA芯片是一种微阵列(DNA阵列)，其中许多不同基因或DNA片段排列并固定在固体支持物例如载玻片上。DNA芯片作为极大地加快分析基因的表达、突变或多态性的手段非常有用。
为了制备DNA芯片，必需将DNA固定在支持物上。固定DNA的已知方法一般分为两类。
一类方法是：其中DNA是在通过共价键与支持物连接的接头顶端上化学合成的，例如见Science，251：767-773(1991)和Nucleic AcidsResearch，20：1679-1684(1992)所述。这样的方法可用于固定可合成而且其序列已知的DNA(寡核苷酸)。据认为，该方法每个步骤的产率比常规固相合成低。此外，所述方法需要完全密封反应部位的微型装置。
另一类方法是：其中预先合成的DNA或聚合酶链式反应(PCR)制备的DNA(PCR扩增产物)通过共价键(例如Nucleic Acids Research，22：5456-5465(1994))或非共价键(或静电；例如Science，270：467-470(1995))与支持物结合。据推测，按照这样的方法人们可固定任何DNA。
但是例如在非共价键结合的情况下，难以固定短链DNA(寡核苷酸)，例如合成DNA。如果需要把长链DNA如PCR产物通过非共价键固定在支持物上，一般如下固定所述DNA：使溶解于盐溶液如氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、tris-盐酸盐/EDTA(TE)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)的DNA变性，然后将其点样到用聚阳离子如包被聚赖氨酸或聚乙二胺的载玻片(支持物)上。在这种情况下，已知在随后的洗涤或与靶核酸杂交的步骤中，大量DNA脱离支持物。这一现象是降低检测靶核酸的敏感性的因素。而且，Nucleic Acids Research，22：5456-5465(1994)中所述的上述方法不是常规方法，因为它需要用非水性系统处理所述支持物。
为了提高与支持物的固定效率，必需预先热变性或碱变性DNA。已知在不变性的情况下固定效率明显降低。此外，如果采用制备DNA芯片的仪器(阵列仪)将许多DNA溶液固定在载玻片上，则变性步骤使整个步骤复杂化，导致所述方法难以自动化。
通过增加需要点样到固定DNA的支持物上的溶液DNA浓度，从而增加固定DNA的绝对量。然而，因此减少对支持物的固定率，并增加所用DNA的损失。
当制备以单位区域形成各种DNA斑点的高密度DNA阵列时，使用制备DNA芯片的仪器(阵列仪)。在制备高密度DNA阵列时，使用某种类型的仪器将DNA溶液点样到支持物上的体积是非常小的。因此，所述DNA溶液在支持物表面上弥散开之前就可能干了，导致形成不均一斑点。
如果采用DNA阵列检测靶核酸，则检测敏感性取决于固定在单位区域(一个斑点)中的DNA量。因此，增加固定在斑点上的DNA量的方法，换句话说，增加固定DNA的密度的方法成为非常重要的问题。而且，点样DNA溶液同时使其均一弥散的方法也非常重要。
发明目的
本发明的主要目的是：(1)将寡核苷酸固定在固体支持物上的有效方法；(2)按照所述方法制备寡核苷酸固定在其上的材料；和(3)采用所述材料检测靶核酸的方法。
发明概述
本发明人进行了深入的研究而且发现，可用寡核苷酸作为微斑固定其上的材料检测目的靶核酸，所述寡核苷酸微斑的制备如下：将含特定浓度或特定浓度以上的寡核苷酸的小体积溶液点样到支持物上固定。本发明人还发现，可获得寡核苷酸稳定固定其上的材料，因为按照上述方法固定的寡核苷酸不容易与支持物脱离。本发明人还发现，采用所述材料可以高敏感性检测靶核酸。从而完成了本发明。
因此，本发明提供以下方法和材料：
(1)将寡核苷酸固定在支持物上的方法，该方法包括将含寡核苷酸的缓冲液点样到支持物上，使所述寡核苷酸通过共价键固定在所述支持物上；
(2)按照上述(1)的方法，其中在所述寡核苷酸中导入官能团；
(3)按照上述(2)的方法，其中在所述寡核苷酸的末端导入所述官能团；
(4)按照上述(2)和(3)的方法，其中在所述寡核苷酸中导入氨基；
(5)按照上述(1)-(4)任一项的方法，其中所述支持物具有官能团；
(6)按照上述(5)的方法，其中所述支持物具有醛基；
(7)按照上述(1)-(6)任一项的方法，其中将所述寡核苷酸通过寡核苷酸和支持物表面之间的间隔物固定在所述支持物上；
(8)按照上述(1)-(7)任一项的方法，其中将200nl或200nl以下的含1μM或1μM以上浓度寡核苷酸的缓冲液点样到所述支持物上；
(9)按照上述(1)-(8)任一项的方法，其中所述支持物由玻璃或石英制成，或者为通过处理玻璃或石英表面制得的材料；
(10)按照上述(1)-(9)任一项的方法，其中所述缓冲液含有至少一种选自以下的物质：吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐；
(11)按照上述(10)的方法，其中所述缓冲液中至少一种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质的浓度为10-500mM；
(12)寡核苷酸固定其上的材料，它是按照上述(1)-(11)任一项定义的方法制得的材料；
(13)按照上述(12)的材料，其中以1.25fmole/斑点或1.25以上fmole/斑点固定所述寡核苷酸；
(14)检测靶核酸的方法，该方法包括采用上述(12)或(13)定义的、寡核苷酸固定其上的材料检测靶核酸；和
(15)按照上述(14)的方法，包括使寡核苷酸固定其上的材料与靶核酸在严格条件下杂交。本发明详述
本文使用的寡核苷酸是指较短的核酸。尽管不是用它来限制本发明，但是它包括6-100个碱基长度的核酸。在本发明中优选使用8-50个碱基长度的核酸。本发明的寡核苷酸包括DNA、RNA、其嵌合分子及其衍生物。可通过化学合成或酶合成制备这样的寡核苷酸。另一方面，也可通过化学或酶学处理天然核酸制得。本发明的寡核苷酸可以是单链或双链寡核苷酸。如果所述寡核苷酸用于杂交，则常常使用单链寡核苷酸。
所述寡核苷酸衍生物的实例包括分子中包含不同于组成通常的核酸的诸如肌苷或7-去氮杂鸟苷的核苷酸的寡核苷酸、其中磷酸键被硫代磷酸键取代的寡核苷酸和进行了修饰以固定在支持物表面上的寡核苷酸。所述修饰没有特别的限制。其中导入官能团如氨基、羧基、巯基、醛基或表氧基的寡核苷酸是范例寡核苷酸。在本发明中优选使用在寡核苷酸的末端导入官能团的寡核苷酸。特别优选使用其中导入氨基的寡核苷酸。
在本发明中用于固定寡核苷酸的支持物不限于特定的支持物，前提是它是由几乎不溶的材料制成。这样的材料实例包括纸、尼龙、纤维素、诸如硝酸纤维素的纤维素衍生物、塑料和诸如聚碳酸酯、聚苯乙烯和聚丙烯的塑料衍生物、磁性金属或非磁性金属、石英和玻璃。所述材料可以是有孔的、表面光滑的、聚合或非聚合材料。
在本发明中使用的支持物不限于由所述材料构成的支持物。任何能够用作DNA芯片或生物传感器的载体的支持物均可使用，前提是它们能够保持固定在其表面的寡核苷酸。例如，可优选使用在其表面具有亲水或疏水官能团的支持物，所述官能团例如为羟基、氨基、巯基、醛基、羧基、表氧基或酰基。特别优选使用具有醛基的支持物。这样的官能团可以原样或者以合适的衍生物使用。例如如果为羧基，它可以诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯的活化酯衍生物使用。
所述支持物包括其表面具有作为支持物材料性质的官能团的支持物。如果通过表面处理可使其表面具有亲水或疏水官能团，则可以没有限制地使用支持物表面没有亲水或疏水官能团的支持物。
通过表面处理制备的这样的支持物实例包括通过用市售硅烷偶联剂如氨基烷基硅烷或用聚阳离子如聚赖氨酸或聚乙二胺处理玻璃或石英制得的支持物，以及进一步用戊二醛、二异氰酸苯酯等处理由此获得的支持物制得的支持物。可从Sigma市售获得具有导入如上所述官能团的载玻片。
可通过所述寡核苷酸与所述支持物之间的间隔物固定所述寡核苷酸，使得固定的寡核苷酸与靶核酸有效杂交。这样的间隔物并不限于特定的间隔物，只要它可在所述寡核苷酸和所述支持物之间提供一定程度的间隔。例如，与靶核酸非互补核酸(DNA、RNA)或烷基链可用作间隔物。如果烷基链用作间隔物，则使用具有3个或3个以上碳原子、优选6个或6个以上碳原子的烷基链。
导入所述间隔物的方法没有特别限制。可使用以下方法：使用具有导入间隔物的寡核苷酸固定到支持物上的方法，在支持物上导入间隔物后固定寡核苷酸的方法和使用具有间隔物的偶联剂将寡核苷酸固定在支持物上的方法。
以下详述将寡核苷酸固定在本发明支持物上的方法。
将需要固定的寡核苷酸溶解在合适缓冲液中以制备寡核苷酸溶液。该缓冲液任选含有中性盐和/或表面活性剂。
用于本发明的缓冲液不限于特定缓冲液。可使用常规用于溶解核酸的各种缓冲液。一般使用氯化钠/柠檬酸钠(SSC)作为缓冲液。例如，可优选使用包含吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的缓冲液作为缓冲组分。
吗啉、吗啉衍生物及其盐的实例包括但不限于吗啉、用C1-3烷基取代的N-烷基吗啉(例如N-甲基吗啉、N-乙基吗啉或N-丙基吗啉)及其与无机酸(例如盐酸或碳酸)、有机酸(例如乙酸、乳酸或柠檬酸)或脂肪酸(例如月桂酸或硬脂酸)的盐。
碳酸盐包括但不限于碳酸与碱金属、碱土金属、铵或有机胺的盐，例如碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、碳酸铵或碳酸三乙胺。
可单独使用这样的基本缓冲组分，或者可联合使用2种或2种以上缓冲组分。
用于固定的缓冲液除了包含上述基本缓冲组分之外，还可包含其它盐例如氯化钠。所述缓冲液可含有表面活性剂。可使用的表面活性剂不限于具体表面活性剂。可使用任何表面活性剂，只要加入它可调制所述寡核苷酸溶液均匀分散在支持物表面。
调节在本发明中使用的固定缓冲液的pH优选为7-11、更优选为8-10。所述缓冲液的盐浓度优选为10-500mM、更优选为50-200mM。
增加DNA固定率可提高检测靶核酸的敏感性。因此，最好使用含有吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的缓冲液，它作为缓冲组分使固定效率提高。
最好制备尽可能多数量的以单位区域固定在支持物上的寡核苷酸，以便可同时使许多寡核苷酸与靶核酸杂交。为此，限制寡核苷酸溶液的点样体积，以减少寡核苷酸尽可能多地固定其上的区域(斑点)面积。与固定寡核苷酸杂交的靶核酸的信号取决于固定在斑点中的寡核苷酸量。因此，必需在小斑点中固定足够量的寡核苷酸，以便有效检测杂交信号。
一般来说，当增加用于固定到支持物上的溶液含有的寡核苷酸浓度时，可增加固定寡核苷酸量。但是，可常规使用的寡核苷酸量是受限制的。
在一个实施方案中，固定寡核苷酸的本发明方法的特征在于将200nl或200nl以下的含1μM或1μM以上浓度的寡核苷酸的缓冲液点样在支持物上。可用如上所述制备的寡核苷酸固定其上的支持物，以高敏感性检测与无数寡核苷酸中的寡核苷酸杂交的靶核酸。
如果采用用于固定的制备DNA芯片等的仪器以高密度形成斑点，从而制备寡核苷酸阵列时，需要进一步使点样寡核苷酸溶液体积更小。例如，用Genetic MicroSystems(GMS)的GMS417阵列仪在支持物上点样的寡核苷酸溶液体积为1n1或1nl以下。在此情况下，如果点样寡核苷酸浓度100μM或100μM以上的溶液，则可以足够敏感性检测杂交靶核酸。
将需要固定在支持物上的寡核苷酸以合适浓度溶解在缓冲液中，所述浓度适合支持物类型或适合使用具有固定寡核苷酸的材料的目的。采用微量加液器、微量分散器或制备DNA芯片的仪器将预定体积的制备溶液点样到支持物(例如载玻片)上。将点样寡核苷酸的支持物在湿化培养箱中温育例如1小时。然后用紫外辐射交联寡核苷酸。用0.2％十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液洗涤支持物，然后用蒸馏水洗涤并干燥。
采用制备DNA芯片的仪器(阵列仪)将寡核苷酸溶液点样在支持物上，从而可制备寡核苷酸以高密度排列并固定其上的DNA芯片(寡核苷酸芯片)。只要市售仪器能够在短时间内反复制备均一的高密度阵列，均可用作阵列仪。例如可使用GMS417阵列仪。用此仪器点样的寡核苷酸溶液的体积通常小于1nl。斑点之间的距离通常约300μm。采用所述规格的阵列仪，可将5000个或5000个以下的寡核苷酸容易地排列在载玻片上。
寡核苷酸可通过其碱基部分的氨基与支持物连接。进行修饰以固定在支持物上的寡核苷酸可以适合修饰类型的方式连接到支持物上。
例如，通过采用其表面具有与氨基反应的官能团如醛基或羧基的支持物，具有导入氨基的寡核苷酸可通过共价键固定在支持物上。可按照已知方法在支持物上导入这样的官能团。
具有导入氨基的寡核苷酸可固定在用戊二醛或二硫代氰酸苯酯处理的支持物上。用二硫代氰酸苯酯处理需要以非水性系统处理。另一方面，用戊二醛处理方便，优选用于本发明的固定方法。如果使用用戊二醛处理的载玻片作支持物，首先将包含具有导入氨基的寡核苷酸的溶液点样在载玻片上，使醛基和氨基形成Schiff碱。然后使载玻片还原，将Schiff碱转化为稳定的胺。由此可制备目的寡核苷酸牢固固定其上的载玻片。
选择具有适合修饰类型的官能团的支持物，按照已知方法也可以将具有氨基以外的修饰的寡核苷酸通过共价键固定在支持物上。
按照上述固定方法通过共价键固定在支持物上的寡核苷酸在洗涤或杂交步骤期间的脱离非常少。所以，它可用于获得稳定的实验结果。而且，通过使用所述固定方法可提高斑点区域或单位区域的寡核苷酸固定率。换句话说，可增加固定在单位区域的寡核苷酸密度。因此，与常规方法相比，通过采用具有按照上述方法固定的寡核苷酸的支持物，可提高检测靶核酸的敏感性。
可如下评价寡核苷酸固定到支持物上的固定率：将标记荧光物质(例如罗丹明)的寡核苷酸固定在支持物上，采用荧光成象分析仪如FMBIO II Multi-View(Takara Shuzo)检测支持物上的斑点发出的荧光强度。按照以下方程1可计算固定率。
方程1：
固定率(％)＝100×(固定并洗涤后支持物上的斑点荧光强度)/(固定后斑点的即时荧光强度)
例如如下可测定固定寡核苷酸的密度。固定标记荧光物质(例如罗丹明)的寡核苷酸。可用荧光成象分析仪如FMBIO II Multi-View测量寡核苷酸固定在其中的斑点发出的荧光强度。根据所用的荧光标记寡核苷酸量和荧光强度制成的校准曲线可计算斑点中固定的寡核苷酸量。
例如采用荧光成象分析仪通过测量斑点区域，可测定固定在单位区域的寡核苷酸量，即固定DNA的密度。
或者，按照本发明固定方法将预定量寡核苷酸溶液点样在支持物上，检测固定率。根据测得的固定率和点样的寡核苷酸量可计算固定的寡核苷酸量。例如通过采用显微镜可测量所形成斑点面积。根据固定的寡核苷酸量和如上所述测定的面积也可以确定固定的寡核苷酸密度。
本发明还包括如上所述获得的寡核苷酸固定其上的材料。
采用GMS417阵列仪点样在支持物上的寡核苷酸溶液体积约50-100皮升(pl)。按照以下实施例所述的固定寡核苷酸的本发明方法，固定寡核苷酸的效率为25％或25％以上。因此，如果采用阵列仪将含寡核苷酸浓度为100μM的溶液点样在支持物上，制备其上一个斑点固定至少1.25毫微微摩尔(fmole)寡核苷酸的材料。采用这样的其上固定寡核苷酸的材料可以足够敏感性检测靶核酸。
此外，通过采用GMS417阵列仪可制备其上以单位区域在支持物上固定无数寡核苷酸的材料(例如在支持物的1cm2区域形成36个或36个以上斑点的高密度寡核苷酸阵列)。这样的高密度寡核苷酸阵列可用于检测微量靶核酸。因此，它可用于分析样品中有限量的基因。例如按照本发明的方法采用上述仪器可制备1cm2面积具有100个或100个以上、优选400个或400个以上、更优选900个斑点的高密度寡核苷酸阵列。
本发明也包括采用寡核苷酸固定其上的材料检测靶核酸的方法。在该方法中，使寡核苷酸固定其上的材料与靶核酸在严格条件下杂交。
本文使用的严格条件是指Molecular cloning，A laboratory manual，第二版，第9.47-9.51页(1989，Cold Spring Harbor Laboratory)所述的条件。例如在如下的严格条件下使寡核苷酸固定其上的材料与靶核酸杂交，不过所述条件可随许多因素而不同，其中包括靶核酸与固定DNA杂交的部分的碱基序列长度。根据杂交部分的长度计算Tm值。在合适的缓冲液中例如高离子强度的溶液(例如6×SSC或6×SSPE)，在低于计算Tm值20-25℃的温度下进行杂交。通常优选在低于Tm值12-20℃的温度下进行洗涤，同时改变随后洗涤步骤的洗涤缓冲液的盐浓度。
靶核酸不限于具体某种核酸。例如可使用任何核酸作靶，筛选与固定在支持物上的寡核苷酸中与靶核酸杂交的寡核苷酸。通常使用通过合适途径例如采用荧光物质标记的靶核酸，以进行有效筛选。可如下检测或定量与支持物上的寡核苷酸杂交的靶核酸：采用标记靶核酸如上所述进行杂交-洗涤步骤，然后测定支持物上的荧光。
此外，可将寡核苷酸固定其上的DNA芯片用于对基因进行杂交测序(SBH)和单个核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析。
如上所述，通过采用寡核苷酸固定在支持物上的本发明方法，可增加寡核苷酸在支持物单位区域的斑点数，可增加固定在斑点中的寡核苷酸量，可减少寡核苷酸在实验步骤中的脱离，而不会降低检测靶核酸的敏感性。而且，通过采用按照本发明方法提供的寡核苷酸固定其上的材料，可以高效率和高检测敏感性地检测靶核酸。
实施例
下述实施例进一步详细阐明本发明，而不能将其解释为限制本发明范围。
将制备的具有以下组分的溶液稀释为特定浓度，用作以下实施例所述各种试验的缓冲液。
20×SSC：含3M氯化钠的0.3M柠檬酸钠溶液。TE缓冲液：含1mM EDTA的10mM tris-盐酸盐(pH8.0)。磷酸缓冲盐溶液(PBS)：采用PBS片(Takara shuzo)制成。500mM碳酸盐缓冲液：通过混合500mM碳酸钠溶液和500mM碳酸氢钠溶液，将pH调节至特定值而制得。500mM吗啉缓冲液：用稀盐酸将500mMN-甲基吗啉的pH调节至特定值而制得。50mM硼酸盐缓冲液：用2N氢氧化钠将含50mM氯化钾的50mM硼酸溶液的pH调节至特定值而制得。
实施例1
(1)固定寡核苷酸
采用DNA合成仪合成以下寡核苷酸：具有SEQ ID NO：1的碱基序列、其5’末端与罗丹明X(PE Biosystems，下文称为ROX)连接的寡核苷酸(下文称为ROX寡聚物)；也具有SEQ ID NO：1的碱基序列、其5’末端和3’末端分别与具有6个碳(C6)的烷基链的烷基氨基接头(PEBiosystems)和罗丹明X连接的寡核苷酸(下文称为ROX氨基寡聚物)。用50mM N-甲基吗啉盐酸盐(NMM)缓冲液(PH9.5)或50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)以10μM浓度溶解这两种合成DNA，制备寡核苷酸溶液。
另一方面，检查用TE缓冲液溶解的寡核苷酸作对照的固定情况。
使用氨基烷基硅烷(AAS)包被的载玻片(AAS处理，Sigma)以及进一步在2.5％戊二醛(GA)水溶液浸泡1小时、用蒸馏水洗涤3次并风干的AAS包被的载玻片(AAS＋GA处理)。
将所述寡核苷酸溶液各0.2μl点样在每块载玻片上。风干后，将载玻片在湿化培养箱中于37℃温育1小时。用60mJ紫外线照射载玻片，然后将其在琥珀酸溶液中浸泡15分钟以封闭游离氨基。如下制备琥珀酸溶液：将5g琥珀酸酐(Nacalai Tesque)溶解于315mlN-甲基-2-吡啶酮(Nacalai Tesque)溶液中，进一步向其中加入35ml 0.2M硼酸盐缓冲液(pH8.0)。最后，用0.2％SDS溶液洗涤载玻片2分钟，然后用蒸馏水洗涤，并在室温下干燥。
对于戊二醛处理的载玻片，将洗涤后的载玻片进一步浸泡在磷酸缓冲盐溶液(PBS)与含0.25％硼氢化钠(Wako Pure Chemical Industries)的100％乙醇的3∶1混合液中5分钟，然后如上所述洗涤并干燥，以使支持物上的醛基和DNA的氨基之间形成Schiff碱还原为稳定的胺。
使按照所述制备的固定寡核苷酸进行如下的严格杂交条件。将含0.2％SDS的4×SSC点样在每块载玻片的点样区域。用盖玻片盖住斑点，使其中没有气泡。用封蜡(seal)严密封闭载玻片，将载玻片在37-40℃温育2-6小时。在去除封蜡后，将载玻片以含0.1％SDS的0.2×SSC洗涤30分钟，然后以0.2×SSC洗涤30分钟，干燥。
(2)定量固定的寡核苷酸
在固定以及杂交条件下处理后立即用荧光成象分析仪FMBIO IIMulti-View(Takara Shuzo)检测荧光强度。根据相应的荧光强度值计算固定率。结果见下表1。表1
寡核苷酸的溶剂 寡核苷酸类型 载玻片表面处理 固定率(％)
TE缓冲液 ROX寡聚物 AAS 0.7
AAS＋GA 1.4
ROX氨基寡聚物 AAS 0.9
AAS＋GA 1.6
NMM缓冲液 ROX寡聚物 AAS 5.8
AAS＋GA 13.2
ROX氨基寡聚物 AAS 19.1
AAS＋GA 65.6
碳酸盐缓冲液 ROX寡聚物 AAS 4.4
AAS＋GA 7.7
ROX氨基寡聚物 AAS 16.6
AAS＋GA 25.7
如表1所示，证实采用N-甲基吗啉盐酸盐(NMM)缓冲液或碳酸盐缓冲液可提高在5’末端具有氨基的寡核苷酸(ROX氨基寡聚物)的固定率。当使用以戊二醛处理的AAS载玻片(AAS＋GA处理)时，进一步增加固定率。另一方面，无论什么类型的固定寡核苷酸或支持物表面处理，使用TE缓冲液的对照的固定率均低。
实施例2
(1)固定寡核苷酸
根据人转铁蛋白受体(TFR)基因的碱基序列合成具有SEQ ID NO：2碱基序列的寡核苷酸TFR AS7。利用C12烷基氨基接头(PEBiosystems)在寡核苷酸的5末端加入氨基。通过在3’末端进一步加入ROX标记(TFR AS7 3-ROX)或以ROX(没有氨基，TFR AS7 5-ROX)取代5’末端的氨基由所述寡核苷酸制备两种寡核苷酸衍生物。将每种寡核苷酸以1或10μM浓度溶解于50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)、3×SSC或TE缓冲液。
按照实施例1所述用戊二醛处理AAS包被的载玻片进行活化。把所述溶液各0.2μl点样在每块载玻片上并按照实施例1所述固定。以两种方式进行固定，即用硼氢化钠还原(表2的“还原”)或不用硼氢化钠还原(表2的“不还原”)方式。固定后，用水于25℃或95℃洗涤载玻片。
(2)杂交以及信号检测
采用FMBIO II Multi-View经扫描分析上述(1)制备的每种载玻片上固定的ROX信号。采用碳酸盐缓冲液、3×SSC或TE缓冲液获得的结果见表2。在表2中，-和+分别表示没有观测到信号和观测到信号。+至4+表示信号强度。数字越大表示信号强度越强。
a.缓冲液
测得的所述缓冲液的寡核苷酸固定率如下：碳酸盐缓冲液＞3×SSC＞TE缓冲液。其中当采用TE缓冲液点样含寡核苷酸浓度为1μM的溶液时，没有观测到信号，说明该缓冲液不适合固定寡核苷酸。
b.寡核苷酸
已经证实，与没有氨基的寡核苷酸(TFR AS7 5-ROX)相比，采用5’末端具有氨基的寡核苷酸(TFR AS7 3-ROX)一般可获得更高的固定效率。具体地说，当以还原进行固定时，无论使用什么缓冲液(碳酸盐缓冲液或3×SSC)，观测到两种洗涤温度(25℃和95℃)的信号没有差异，说明寡核苷酸获得稳定固定。
如上所述，证实了采用硼氢化钠还原是有效的而且当寡核苷酸固定在用戊二醛处理的AAS包被载玻片上时，采用碳酸盐缓冲液的固定获得良好的结果。表2
                                    碳酸盐缓冲液
        载玻片      寡核苷酸  洗涤温度(℃)    寡核苷酸浓度
  1μM  10μM
用戊二醛处理的包被AAS的载玻片(还原) TFR AS7 3-ROX     25     3+     4+
    95     3+     4+
TFR AS7 5-ROX     25     +     2+
    95     +     2+
用戊二醛处理的AAS包被的载玻片(非还原) TFR AS7 3-ROX     25     2+     3+
    95     +     2+
TFR AS7 5-ROX     25     +     2+
    95     +     +
                                     3×SSC
        载玻片     寡核苷酸  洗涤温度(℃)    寡核苷酸浓度
  1μM  10μM
用戊二醛处理的包被AAS的载玻片(还原) TFR AS7 3-ROX     25     +     2+
    95     +     2+
TFR AS7 5-ROX     25     -     +
    95     -     +
用戊二醛处理的AAS包被的载玻片(非还原) TFR AS7 3-ROX     25     +     2+
    95     -     +
TFR AS7 5-ROX     25     -     +
    95     -     +
                                TE缓冲液
        载玻片      寡核苷酸  洗涤温度(℃)    寡核苷酸浓度
  1μM  10μM
用戊二醛处理的AAS包被的载玻片(还原) TFR AS7 3-ROX     25    -     +
    95    -     -
TFR AS7 5-ROX     25    -     +
    95    -     -
用戊二醛处理的AAS包被的载玻片(非还原) TFR AS7 3-ROX     25    -     +
    95    -     +
TFR AS7 5-ROX     25    -     +
    95    -     -
实施例3
(1)固定寡核苷酸
按照实施例1所述用戊二醛处理包被氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)的载玻片(Matsunami Glass)进行活化。合成以下8种寡核苷酸：c-K-ras/61Q(野生型)、c-K-ras/61K、c-K-ras/61E、c-K-ras/61R、c-K-ras/61P、c-K-ras/61L、c-K-ras/61H1和c-K-ras/61H2。这些寡核苷酸相当于野生型K-ras基因以及突变K-ras基因的碱基序列，突变K-ras基因编码蛋白于野生型K-ras蛋白位置61的氨基酸Gln被Lys、Glu、Arg、Pro、Leu或His(两种类型)取代。SEQ ID NO：3-10显示所述合成的八种寡核苷酸的碱基序列。在SEQ ID NO：4-10各序列中，突变密码子位于位置10-12。实施例2合成的寡核苷酸TFR AS7(SEQ IDNO：2)用作阴性对照。在这些寡核苷酸的5’末端通过C12烷基链加入氨基。将每种寡核苷酸以1mM、100μM、10μM或1μM(分别相当于6.6、0.66、0.066或0.0066mg/ml)浓度溶解于50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将含一种相应浓度寡核苷酸的溶液各0.2μl点样在每块载玻片上。将所述载玻片进行固定、紫外线照射、封闭以及按照实施例1所述用硼氢化钠进行还原。
(2)杂交和信号检测
采用ras突变组c-Ki-ras密码子61(ras Mutant set c-Ki-ras codon61)(Takara Shuzo)包含的8种模板DNA作模板和ras基因引物组c-Ki-ras/61(Takara Shuzo)进行PCR。利用CentriSep柱(PE Biosystems)纯化所扩增的128-bp PCR产物并回收。用ROX标记后使用反向引物。使用由此获得的ROX-标记的PCR产物作探针。
用杂交溶液(含0.2％SDS的4×SSC)将8种探针浓度调节为3μM。将获得的溶液点样在按照实施例2-(1)所述制备的寡核苷酸固定其上的载玻片上，并盖上盖玻片。在湿化培养箱中于50℃温育2小时后，去除盖玻片。用含0.1％SDS的0.2×SSC于25℃洗涤载玻片30分钟，然后用0.2×SSC洗涤30分钟。
在载玻片干燥后，采用FMBIO II Multi-View检测每块载玻片上的ROX荧光，确定与每种寡核苷酸杂交的探针量。3种探针c-K-ras密码子61AAA、c-K-ras密码子61GAA和c-K-ras密码子61CGA(分别相当于寡核苷酸c-K-ras/61K、c-K-ras/61E和c-K-ras/61R)获得的结果见表3。在表3中，-和+分别表示没有观测到信号和观测到信号。+至6+表示信号强度。数字越大表示信号强度越强。
如表3所示，对于每种探针，对寡核苷酸序列与所用的相应探针序列100％匹配的寡核苷酸斑点观测到强信号。另一方面，对错配寡核苷酸斑点仅观测到弱信号。因此，证实使用如上所述制备的寡核苷酸固定其上的材料可区别靶核酸的碱基序列(探针)。当点样的寡核苷酸浓度越高时观测到的信号越强。表3
       探针        寡核苷酸       寡核苷酸浓度(μM)
   10   100    1000
c-K-ras密码子61AAA(相当于c-K-ras/61K) c-K-ras/61Q    +   2+    3+
c-K-ras/61K    2+   3+    5+
c-K-ras/61E    +   2+    3+
c-K-ras/61R    -   -    -
c-K-ras/61P    -   -    -
c-K-ras/61L    -   -    -
c-K-ras/61H1    -   -    -
c-K-ras/61H2    -   -    -
TFRAS7    -   -    -
c-K-ras密码子61GAA(相当于c-K-ras/61E) c-K-ras/61Q    +   +    +
c-K-ras/61K    +   +    +
c-K-ras/61E    3+   5+    6+
c-K-ras/61R    -   -    -
c-K-ras/61P    -   -    -
c-K-ras/61L    -   -    -
c-K-ras/61H1    -   -    -
c-K-ras/61H2    -   -    -
TFRAS7    -   -    -
c-K-ras密码子61CGA(相当于c-K-ras/61R) c-K-ras/61Q    -   -    +
c-K-ras/61K    -   -    -
c-K-ras/61E    -   -    -
c-K-ras/61R    4+   5+    6+
c-K-ras/61P    -   -    -
c-K-ras/61L    -   -    -
c-K-ras/61H1    -   -    -
c-K-ras/61H2    -   -    -
TFRAS7    -   -    -
实施例4
(1)固定寡核苷酸
制备包被APS的载玻片和按照实施例1所述用戊二醛处理活化的包被APS的载玻片。把含浓度为1μM-1mM的实施例3使用的寡核苷酸c-Ki-ras/61Q、c-Ki-ras/61K或TFR AS7(阴性对照)之一的溶液各0.2μl点样在两种类型的载玻片上，并按照实施例1所述固定。对没有用戊二醛处理的包被APS的载玻片不用硼氢化钠还原。
(2)杂交和信号检测
按照实施例2所述对ras突变组的c-Ki-ras密码子61中的c-Ki-ras密码子61AAA(相当于寡核苷酸c-K-ras/61K)进行PCR，以制备ROX标记的DNA探针。用杂交溶液(含0.2％SDS的4×SSC)调节所述探针浓度至2μM。将获得的溶液点样在寡核苷酸固定其上的上述每种载玻片上，并盖上盖玻片。在湿化培养箱中于37℃温育2小时或于50℃温育2小时后，去除盖玻片。用含0.1％SDS的0.2×SSC于25℃洗涤载玻片30分钟，然后用0.2×SSC洗涤30分钟。干燥载玻片后，用FMBIO II Multi-View通过扫描分析每个载玻片上的信号。结果见表4。在表4中，-和+分别表示没有观测到信号和观测到信号。+至5+表示信号强度。数字越大表示信号强度越强。
对于用戊二醛处理的APS载玻片，不管用于固定的寡核苷酸浓度或杂交温度怎样，对寡核苷酸序列与探针序列100％匹配的寡核苷酸观测到特异性信号(c-k-ras/61K)。尽管信号强度取决于所用寡核苷酸的浓度，但是即使将寡核苷酸浓度为1μM的溶液点样在一个斑点上，仍可观测到足够强度的信号并且可区分匹配探针和错配探针。采用未用戊二醛处理的载玻片观测到的匹配探针信号和错配探针信号之间的差值小于用戊二醛处理的载玻片观测到的差值。这些结果表明，通过将寡核苷酸固定在用戊二醛处理的载玻片上，可获得对碱基序列高度特异性的寡核苷酸固定其上的材料。表4
                              包被APS的载玻片
 杂交温度        寡核苷酸           寡核苷酸浓度(μM)
    1     10     100     1000
    37℃     c-K-ras/61Q     -     +     +     2+
    c-K-ras/61K     2+     2+     4+     4+
    TFRAS7     -     -     -     -
    50℃     c-K-ras/61Q     +     +     2+     2+
    c-K-ras/61K     2+     2+     4+     4+
    TFRAS7     -     -     -     -
                      用戊二醛处理的包被APS的载玻片
 杂交温度      寡核苷酸            寡核苷酸浓度(μM)
    1     10     100     1000
    37℃     c-K-ras/61Q     +     +     2+     2+
    c-K-ras/61K     2+     3+     4+     5+
    TFRAS7     -     -     -     -
    50℃     c-K-ras/61Q     +     +     2+     2+
    c-K-ras/61K     2+     3+     4+     5+
    TFRAS7     -     -     -     -
实施例5
(1)固定寡核苷酸
合成实施例3所述的寡核苷酸c-Ki-ras/61Q和TFR AS7(阴性对照)，它们均在与寡核苷酸5’末端连接的C3、C6或C12烷基链末端具有氨基。PE Biosystems的烷基氨基接头用于合成这些寡核苷酸。将每种所述寡核苷酸以1、10或100μM浓度溶解于50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将所述溶液各0.2μl点样在包被APS的载玻片或用戊二醛处理的包被APS的载玻片上，按照实施例1所述固定。对于没有用戊二醛处理的包被APS的载玻片不用硼氢化钠还原。
(2)杂交和信号检测
将实施例3所用的探针(c-K-ras密码子61CAA；相对于寡核苷酸c-K-ras/61Q)以2或4μM浓度溶解于杂交溶液(含0.2％SDS的4×SSC)中。将获得的溶液点样在上述每种载玻片上，并盖上盖玻片。在湿化培养箱中于37℃温育2小时后，去除盖玻片。用含0.1％SDS的0.2×SSC于25℃洗涤载玻片30分钟，然后用0.2×SSC洗涤30分钟。干燥载玻片后，用FMBIO II Multi-View通过扫描分析载玻片上的信号。结果见表5。在表5中，-和+分别表示没有观测到信号和观测到信号。+至4+表示信号强度。数字越大表示信号强度越强。
当使用戊二醛处理的载玻片时，采用寡核苷酸末端和氨基之间的烷基链(间隔物)越长，观测到的信号越强(C3＜C6＜C12)。在烷基链长度相同的寡核苷酸中，信号强度随用于固定溶液中的寡核苷酸浓度而变化。另一方面，当使用包被APS的载玻片时，在烷基链长度和信号强度之间没有观察到明显的相关性。此外，证实在使用相同寡核苷酸和相同缓冲液的情况下，采用戊二醛处理载玻片观测到更强的信号。表5
                                    包被APS的载玻片
       探针(浓度)           寡核苷酸     寡核苷酸浓度(μM)
   1     10    100
c-K-ras密码子61CAA(4μM)     c-K-ras/61Q    C3    +     +     +
   C6    +     +     2+
   C12    +     +     2+
    TFR AS7    C3    -     -     -
   C6    -     -     -
   C12    -     -     -
c-K-ras密码子61CAA(2μM)     c-K-ras/61Q    C3    +     +     +
   C6    +     +     2+
   C12    +     +     2+
    TFR AS7    C3    -     -     -
   C6    -     -     -
   C12    -     -     -
                      戊二醛处理的包被APS的载玻片
        探针(浓度)           寡核苷酸     寡核苷酸浓度(μM)
  1     10    100
c-K-ras密码子61CAA(4μM)     c-K-ras/61Q    C3   -     +     +
   C6   +     +     2+
   C12   +     3+     4+
    TFRAS7    C3   -     -     -
   C6   -     -     -
   C12   -     -     -
c-K-ras密码子61CAA(2μM)     c-K-ras/61Q    C3   +     +     +
   C6   +     +     2+
   C12   +     2+     3+
    TFRAS7    C3   -     -     -
   C6   -     -     -
   C12   -     -     -
实施例6
(1)制备微阵列
采用GMS417阵列仪(Genetic MicroSystems)，将含有浓度为1mM或100μM的实施例3所用的8种K-ras61寡核苷酸之一和作为阴性对照的寡核苷酸TFR AS7的碳酸盐缓冲液的各溶液，点样在戊二醛处理的AAS包被的载玻片上。按照实施例1所述将载玻片进行固定。
(2)杂交和信号检测
采用按照实施例3所述制备的8种ROX标记的探针进行杂交。将探针以3μM浓度溶解于杂交溶液(含0.2％SDS的4×SSC)。将获得的溶液点样在上述载玻片上并盖上盖玻片。在湿化培养箱中于37℃温育4小时后，去除盖玻片。用含0.2％SDS的0.2×SSC于25℃洗涤载玻片30分钟，然后用0.2×SSC洗涤30分钟。干燥载玻片后，采用CMS418阵列扫描仪(Genetic MicroSystems)扫描分析各载玻片上的信号。用c-K-ras密码子61GAA、c-K-ras密码子61CGA和c-K-ras密码子61CAT(分别相当于寡核苷酸c-K-ras/61E、c-K-ras/61R和c-K-ras/61H1)作探针获得的结果见表6。此表中，-和+分别表示没有观测到信号和观测到信号。+至7+表示信号强度。数字越大表示信号强度越强。
对于每种探针，对寡核苷酸序列与使用的探针序列100％匹配的寡核苷酸斑点观测到强信号。另一方面，对错配寡核苷酸斑点仅观测到弱信号。尽管点样的寡核苷酸浓度越高观测到的信号越强，但是即使将寡核苷酸浓度为100μM的溶液点样在一个斑点上，仍可区分与探针序列匹配的碱基序列和错配碱基序列。表6
探针 寡核苷酸 寡核苷酸浓度
100μM 1mM
c-K-ras密码子61GAA(相当于c-K-ras/61E)     c-K-ras/61Q 3+ 4+
    c-K-ras/61K     3+     4+
    c-K-ras/61E     5+     7+
    c-K-ras/61R     2+     3+
    c-K-ras/61P     2+     3+
    c-K-ras/61L     +     2+
    c-K-ras/61H1     +     2+
    c-K-ras/61H2     +     2+
    TFRAS7     -     -
c-K-ras密码子61CGA(相当于c-K-ras/61R)     c-K-ras/61Q     2+     3+
    c-K-ras/61K     2+     2+
    c-K-ras/61E     2+     2+
    c-K-ras/61R     5+     7+
    c-K-ras/61P     3+     4+
    c-K-ras/61L     3+     4+
    c-K-ras/61H1     2+     3+
    c-K-ras/61H2     2+     3+
    TFRAS7     -     -
c-K-ras密码子61CAT(相当于c-K-ras/61H1)     c-K-ras/61Q     2+     3+
    c-K-ras/61K     2+     3+
    c-K-ras/61E     2+     3+
    c-K-ras/61R     2+     3+
    c-K-ras/61P     2+     3+
    c-K-ras/61L     2+     3+
    c-K-ras/61H1     5+     7+
    c-K-ras/61H2     3+     4+
    TFR AS7     -     -
工业实用性
提供可用于制备DNA微阵列等的将寡核苷酸固定在固体支持物上的方法。还提供按照所述方法将寡核苷酸固定其上的材料和用所述材料检测靶核酸的方法。
序列表独立文本
SEQ ID NO：1：用于测试固定效率的设计寡核苷酸。
SEQ ID NO：2：称为TFR AS7的设计寡核苷酸，相当于人转铁蛋白受体(TFR)基因的一部分。
SEQ ID NO：3：称为c-K-ras/61Q的设计寡核苷酸，相当于野生型K-ras基因的一部分。
SEQ ID NO：4：称为c-K-ras/61K的设计寡核苷酸，相当于突变K-ras基因的一部分。
SEQ ID NO：5：称为c-K-ras/61E的设计寡核苷酸，相当于突变K-ras基因的一部分。
SEQ ID NO：6：称为c-K-ras/61R的设计寡核苷酸，相当于突变K-ras基因的一部分。
SEQ ID NO：7：称为c-K-ras/61P的设计寡核苷酸，相当于突变K-ras基因的一部分。
SEQ ID NO：8：称为c-K-ras/61L的设计寡核苷酸，相当于突变K-ras基因的一部分。
SEQ ID NO：9：称为c-K-ras/61H1的设计寡核苷酸，相当于突变K-ras基因的一部分。
SEQ ID NO：10：称为c-K-ras/61H2的设计寡核苷酸，相当于突变K-ras基因的一部分。
            说明书的核苷酸和氨基酸列表
                        序列表<110>Takara Shuzo Co.，Ltd<120>将寡核苷酸固定支持物上的方法<130>661655<150>JP 10-351276<151>1998-12-10<160>10<210>1<211>20<212>DNA<213人工序列<220><223>用于测试固定效率的设计寡核苷酸<400>1caagctagat cagcattctc                                                        20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸，称为TFR AS7，相当于人转铁蛋白受体(TFR)基因的一部分<400>2tataccttta cctccaaaag                                                        20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸，称为c-K-ras/61Q，相当于野生型K-ras基因的一部分<400>3acagcaggtc aagaggagta                                                      20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸，称为c-K-ras/61K，相当于突变K-ras基因的一部分<400>4acagcaggta aagaggagta                                                      20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸，称为c-K-ras/61E，相当于突变K-ras基因的一部分<400>5acagcaggtg aagaggagta                                                      20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸，称为c-K-ras/61R，相当于突变K-ras基因的一部分<400>6acagcaggtc gagaggagta                                                     20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸，称为c-K-ras/61P，相当于突变K-ras基因的一部分<400>7acagcaggtc cagaggagta                                                     20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸，称为c-K-ras/61L，相当于突变K-ras基因的一部分<400>8acagcaggtc tagaggagta                                                     20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸，称为c-K-ras/61H1，相当于突变K-ras基因的一部分<400>9acagcaggtc atgaggagta                                                      20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸，称为c-K-ras/61H2，相当于突变K-ras基因的一部分<400>10acagcaggtc acgaggagta                                                      20

Claims (15)

1.用于将寡核苷酸固定在支持物上的方法，该方法包括将含寡核苷酸的缓冲液点样在支持物上，并使所述寡核苷酸通过共价键固定在所述支持物上。
2.按照权利要求1的方法，其中在所述寡核苷酸中导入官能团。
3.按照权利要求2的方法，其中在所述寡核苷酸的末端导入所述官能团。
4.按照权利要求2或3的方法，其中在所述寡核苷酸中导入氨基。
5.按照权利要求1-4任一项的方法，其中所述支持物具有官能团。
6.按照权利要求5的方法，其中所述支持物具有醛基。
7.按照权利要求1-6任一项的方法，其中所述寡核苷酸通过所述寡核苷酸和所述支持物表面之间的一个间隔物固定在所述支持物上。
8.按照权利要求1-7任一项的方法，其中将200nl或200nl以下的含浓度为1μM或1μM以上的所述寡核苷酸的缓冲液点样在所述支持物上。
9.按照权利要求1-8任一项的方法，其中所述支持物由玻璃或石英制成或为一种通过处理玻璃或石英表面制得的材料。
10.按照权利要求1-9任一项的方法，其中所述缓冲液含有至少一种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质。
11.按照权利要求10的方法，其中至少一种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质在所述缓冲液中的浓度为10-500mM。
12.寡核苷酸固定在其上的一种材料，这种材料按照权利要求1-11任一项定义的方法制得。
13.按照权利要求12的材料，其中所述寡核苷酸以1.25fmole/斑点或以1.25fmole/斑点以上固定。
14.一种检测靶核酸的方法，该方法包括采用权利要求12或13定义的寡核苷酸固定在其上的材料检测靶核酸。
15.按照权利要求14的方法，该方法包括使寡核苷酸固定在其上的材料与所述靶核酸在严格条件下杂交。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100408697C (zh) * 2004-02-16 2008-08-06 三星电子株式会社 将生物分子非共价固定到固体基质上的方法和微阵列
CN105738326A (zh) * 2014-12-09 2016-07-06 南京理工大学 一种基于吗啉寡核苷酸功能化硅基芯片的高选择性dna荧光分析方法
CN113913945A (zh) * 2018-10-12 2022-01-11 深圳市真迈生物科技有限公司 制备芯片的方法、芯片以及固定生物分子的方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0016836D0 (en) 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (1)
AU2001279244A1 (en) * 2000-08-09 2002-02-18 Motorola, Inc. The use and evaluation of a (2+2) photocycloaddition in immobilization of oligonucleotides on a three-dimensional hydrogel matrix
KR100459865B1 (ko) * 2001-11-26 2004-12-03 아람 바이오시스템 주식회사 유전적 염기서열 고정 방법
JP2004286728A (ja) * 2002-07-09 2004-10-14 Sumitomo Bakelite Co Ltd 水性組成物、水性液および生理活性物質の固定化方法
JP2006028059A (ja) * 2004-07-14 2006-02-02 Canon Inc Ｄｎａ固定体、この製造方法及びこれを用いた捕集システム
JP4736439B2 (ja) * 2005-01-25 2011-07-27 東レ株式会社 核酸固定化担体
JP4635707B2 (ja) * 2005-05-09 2011-02-23 ソニー株式会社 検出表面と該検出表面の作製方法、並びにプローブ物質の固定密度制御方法
CN101595231A (zh) 2006-12-29 2009-12-02 霍尼韦尔国际公司 用于微阵列的反应缓冲液
US9797011B2 (en) 2013-09-13 2017-10-24 Life Technologies Corporation Device preparation using condensed nucleic acid particles
CN104142262B (zh) * 2014-07-22 2017-03-29 中国矿业大学 一种在载玻片表面固定dna碱基的方法
NL2020612B1 (en) * 2017-12-22 2019-07-02 Illumina Inc Light detection devices with protective liner and methods of manufacturing same

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU632494B2 (en) * 1988-05-20 1993-01-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Immobilized sequence-specific probes
IL90600A0 (en) * 1988-06-16 1990-01-18 Du Pont Polynucleotide phosphorylase immobilized on epoxy-activated beads
JPH07132077A (ja) * 1993-11-12 1995-05-23 Hamamatsu Photonics Kk 固相合成装置
JPH09322777A (ja) * 1996-06-04 1997-12-16 Japan Synthetic Rubber Co Ltd 固相担体を用いる生理活性物質の処理方法
EP0814156B1 (en) * 1996-06-18 2003-03-05 The Institute Of Physical & Chemical Research Method for the purification of DNA
JPH1033196A (ja) * 1996-07-23 1998-02-10 Unitika Ltd 試験片
JP4313861B2 (ja) * 1997-08-01 2009-08-12 キヤノン株式会社 プローブアレイの製造方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100408697C (zh) * 2004-02-16 2008-08-06 三星电子株式会社 将生物分子非共价固定到固体基质上的方法和微阵列
CN105738326A (zh) * 2014-12-09 2016-07-06 南京理工大学 一种基于吗啉寡核苷酸功能化硅基芯片的高选择性dna荧光分析方法
CN105738326B (zh) * 2014-12-09 2018-10-12 南京理工大学 一种基于吗啉寡核苷酸功能化硅基芯片的高选择性dna荧光分析方法
CN113913945A (zh) * 2018-10-12 2022-01-11 深圳市真迈生物科技有限公司 制备芯片的方法、芯片以及固定生物分子的方法

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