CN1268979A - 阵列单元的多功能性及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供固体基质上的寡核苷酸阵列,其中分开的区域含有至少两个具不同序列的寡核苷酸。这些阵列在杂交分析中,特别是与可切割的质谱标记结合时有用。

Description

阵列单元的多功能性及其用途
技术领域：
本发明一般地涉及在其表面印有核苷酸阵列的固体基质，具体地涉及在分开的区域中含有具不同序列的多种核苷酸的阵列。
发明背景：
生物试剂的重复阵列已用于促进许多样品的平行测试。例如，无菌丝绒布和活塞环装置长期以来已用于作为快速筛选大量不同生长表现型的独立菌落的方法，在各含有不同生长培养基的琼脂平板上复制细菌和酵母的菌落(Lederberg和Lederberg，细菌学杂志，63：399，1952)。同样，96孔微量滴定板以易于应用的方式用于组织和贮存大量例如细胞系、代表重组DNA文库的病毒分离物或单克隆抗体细胞系。
大规模基因组计划的出现和分子诊断逐渐增加的应用需要发展大量筛选核酸的大处理量方法。近来，已发展出合成与玻璃或硅表面结合的、代表所有可能的核苷酸序列或所有可能的核苷酸序列的部分的短寡脱氧核苷酸(ODN)大型阵列的方法(Maskos和Southern，核酸研究20：1675，1992)。这些ODN阵列已制备用于通过杂交进行DNA序列分析(Southern等，基因组13：1008，1992；Drmanac等，科学260：1649，1993)、测定表达分布图、筛选突变等。对于所有这些用途而言，所需寡核苷酸数是大量的，并因此已发展出高密度阵列(每1cm2＞1000个核苷酸)。然而，就时间和经济因素来说，使用更低密度阵列是有利的。目前，这些阵列受到寡核苷酸结合方法(常在原位合成中)和可检测标记种类的限制。
本发明公开了制备在每个分开区域含有一个以上核苷酸序列的阵列的方法和组合物，并进一步提供其它相关优点。
发明概述：
在本发明的一个方面中，提供寡核苷酸阵列，包括表面含有核酸分子、优选地寡核苷酸的分开区域的固体基质，其中至少一个区域含有所选的至少两个具不同序列的核酸分子。优选地，有少于1000个分开区域。同样优选地，每一区域含有至少两个具不同序列的寡核苷酸，并且更优选地，至少一个区域含有从2到约100个不同寡苷酸序列。
在某些实施方案中，阵列区域的直径是从约20到约500微米，并且其中区域之间中心到中心的距离是从约50到1500微米。
在优选的实施方案中，寡核苷酸具有已知序列。在其它优选实施方案中，寡核苷酸共价结合到基质表面上，优选地通过胺连接如聚(乙烯亚胺)结合。
在另一方面，本发明提供杂交分析方法，包括(a)将标记的核酸分子与此处所述的寡核苷酸阵列杂交；及(b)检测阵列区域中的标记，从而测定阵列上哪些寡核苷酸发生了杂交。在优选的实施方案中，阵列的至少一个区域含有已知序列的寡核苷酸并且标记的核酸分子之一与寡核苷酸互补。优选地，标记的核酸分子包含具不同序列的核酸分子，各带有不同标记。这样的标记可选自放射性分子、荧光分子和可切割的质谱标记。
在另一方面，本发明提供鉴定样品中核酸分子的方法，包括(a)使标记的寡核苷酸与核酸分子杂交以形成双链体；(b)分离双链体；(c)将双链体变性；(d)将标记的寡核苷酸与此处所述的寡核苷酸阵列杂交，其中阵列上的寡核苷酸与标记的寡核苷酸互补；并且(e)检测阵列区域中的标记；从而鉴定样品中的核酸分子。
在另一方面，提供鉴定样品中核酸分子的方法，包括(a)使寡核苷酸与核酸分子杂交；(b)在单个标记核苷酸的参与下延伸寡核苷酸以形成双链体；(c)使双链体变性；(d)使标记的寡核苷酸与此处所述的寡核苷酸阵列杂交，其中阵列上的寡核苷酸与标记的寡核苷酸互补；并且(e)检测阵列区域中的标记；从而鉴定样品中的核酸分子。在优选实施方案中，阵列分开区域中的寡核苷酸与核酸分子的延伸产物互补。
在另一方面，本发明提供鉴定样品中核酸分子的方法，包括(a)使至少两个寡核苷酸与核酸分子杂交以形成双链体，其中至少一个寡核苷酸是标记的并且这两个寡核苷酸与核酸分子上的相邻序列杂交；(b)连接寡核苷酸；(c)使双链体变性；(d)使标记的寡核苷酸与此处所述的寡核苷酸阵列杂交，其中阵列上的寡核苷酸与连接的寡核苷酸互补；并且其中不与未连接的寡核苷酸发生杂交；并且(e)检测阵列区域中的标记；从而鉴定样品中的核酸分子。
在另一方面，提供鉴定样品中mRNA分子的方法，包括(a)使标记的寡核苷酸与mRNA分子杂交以形成双链体；(b)分离双链体；(c)使双链体变性；(d)使标记的寡核苷酸与此处所述的寡核苷酸阵列杂交，其中阵列上的寡核苷酸与标记的寡核苷酸互补，并且(e)检测阵列区域中的标记；从而鉴定样品中的mRNA分子。在优选实施方案中，从用怀疑是毒素的化合物处理的细胞中分离mRNA分子。在另一优选实施方案中，阵列上的寡核苷酸是细胞因子的序列。
参考下面的详述和附图，本发明的这些和其它方面将是变得显而易见。并且，更详细描述特定方法或组合物(如质粒等)的各种参考文献在下面说明，并因此全文引用作为参考。
本发明的生物分子阵列可包含标记的生物分子，例如与可裂解的标记共价结合的寡核苷酸，或与其结合使用。这些标记的生物分子可用于本发明方法和一些分析方法如寡核酸测序和基因表达分析等。作为范例的标记的生物分子和使用其的分析法在各于1997年1月22日提交的美国专利申请Nos.08/786,835；08/786,834以及各于1997年7月22日提交的具有申请号08/898,180；08/898,564和08/787,521的三个美国部分继续申请中有所描述；并且在PCT国际公开Nos.WO97/27331；WO 97/27325和WO 97/27327中也有描述。这6个美国专利申请和3个PCT国际公开的全文在此充分引用作为参考。
本发明的生物分子阵列也可用于进行扩增和其它酶反应，如1997年7月22日提交的题为“核酸阵列上进行的扩增和其它酶反应”的美国临时专利申请No.60/053,426和同时提交的相似题目的美国非临时专利申请No＿＿中所述，两者的全文在此引用作为参考。
本发明的生物分子阵列以及用于本发明方法的阵列，可以根据例如1997年7月22日提交的题为“固体支持物上布列溶液的装置和方法”的美国临时专利申请No.60/053,435和同时提交的相似题目的美国非临时专利申请No.＿＿中公开的技术进行制备，两者的全文在此引用作为参考。
本发明的生物分子阵列以及用于本发明方法的阵列可以根据例如1997年7月22日提交的题为“基于聚乙烯亚胺的生物分子阵列”的美国临时专利申请No.60/053,352和同时提交的相似题目的美国非临时专利申请No.＿＿中公开的技术进行制备，两者的全文在此引用作为参考。
在如1997年7月22日提交的题为“使数据相关的计算机方法和系统”的美国临时专利申请No.60/053,429和同时提交的相似题目的美国非临时专利申请No.＿＿(两者的全文在此引用作为参考)中公开的使数据相关的计算机系统和方法可与本文所述的生物分子阵列和方法结合使用。
附图简述：
图1表示在可见光照射(顶端道)和荧光照射(底端道)下摄制的排列微球体的显微照片。
图2表示用本发明的方法学由机器人制备的阵列的CCD相机图像，其中区域平均直径约100-150微米，点与点之间中心到中心的间隔为200微米。点直径的标准偏差约为15％。
图3表示根据本发明制备并用Vector Blue(Vector实验室，Burlingame，加利福尼亚)显色且由CCD相机和显微镜成像的微点的阵列。
图4是表示存在于单一阵列单元中的两个不同寡核苷酸如何根据本发明得到鉴定和部分定量的说明。
发明详述：
如上所述，本发明提供在单独的分开区域中有多个序列的阵列。在特定的实施方案中，发明提供阵列内单一单元中1个以上、优选地10到100个不同寡核苷酸序列或多核苷酸序列。以寡核苷酸为例，2到约100个寡核苷酸可在商用合成仪上单独合成、混合并作为单一单元印迹到阵列的分开区域中。双链、单链的核酸包括DNA、RNA或两者均可与固体基质结合。双链分子可通过扩增、酶消化等制备。本质上，任何具有伯胺基团(与聚乙烯亚胺结合)或其它反应基团的核酸分子均能与本发明中的阵列结合。同时在本发明中，特定区域中的每一单独核酸的序列可能是未知的。
如本文所用的，阵列是指置于固体支持物之上分开区域中的寡核苷酸或多核苷酸序列集合体。优选地，区域形成一些可识别的模式或规则的间隔。阵列典型地由2到1000个单元组成，但也可由1000个以上单元(分开区域)组成。每个区域通过没有核酸或寡核苷酸结合或附着的一定距离分开。典型的区域大小是20到500微米并且区域中心到中心的典型距离是从50到1500微米。
本发明还描述了阵列内单一单元中多个序列的用途。方法允许低单元阵列(即10个单元到例如400个单元)用于许多目的。例如，这些结合的序列、低单元阵列可用于病原体鉴定、分布测定、毒理学测试等。I.模板上样到固体基质上
A.基质制备
从适当材料制备阵列的基质。基质优选地是坚硬的并优选地具有基本上平的表面。在一些实施方案中，表面可以有升高的部分以划分区域。典型的基质是硅片和硼硅酸盐载片(如显微镜玻璃载片)，尽管可换用本领域所知的其它材料。特别有用的固体支持物的例子是典型地用于电子工业中半导体制造的硅片。硅片一面是高度磨光和反光的并且易于用各种连接体如使用硅烷化学法的聚(乙烯亚胺)涂敷。硅片可从诸如Wafer Net，San Jose，CA的公司商业购买。
核酸分子或其它生物多聚物如肽可得到合成、制备或分离并上样到基质上。核酸和肽可用商业上可获得的机器以自动方式合成。在优选实施方案中，分子上样到固体基质上并与基质共价结合。
在某些实施方案中，制备用于寡核苷酸的基质表面。表面可通过例如用增加或降低疏水性的化学物质涂敷或用使核酸分子或其它多聚物序列共价连接的化学物质涂敷来制备。一些化学涂层既可改变疏水性又可允许共价连接形成。固体基质上的疏水性易于通过硅烷处理或其它本领域所知的处理来增加。允许共价连接形成的化学物质一般称为连接体。这些连接体分子附着在基质表面并包含与生物分子反应的功能基团。许多这样的连接体易于得到。例如，固体支持物可用光不稳定-保护的羟基(见美国专利Nos.5,412,087；5,571,639；5,593,839)、烷氧基或脂肪族衍生的羟基(美国专利No.5,436,327)或其它化学物质(见例如美国专利No.5,445,934；EP专利No.EP-B1-0,373,203；美国专利No.5,474,796；美国专利No.5,202,231)进行修饰。
降低疏水性并提供连接体的优选涂层是聚(乙烯亚胺)。并且，聚(乙烯亚胺)(PEI)涂敷的固体基质有较长保质期稳定性的优点。用多聚物如聚(乙烯亚胺)涂敷硅片和玻璃载片可在室内或通过诸如CelAssociates(休斯顿，得克萨斯)的公司进行。玻璃载片可用反光性材料涂敷或使用硅烷化学法用PEI涂敷。PEI涂层允许单链或双链寡核苷酸、单链或双链长DNA分子或片段或任何其它含有胺的生物分子共价结合到固体支持物上。寡核苷酸可用己胺修饰在5′共价结合，该修饰在寡核苷酸的5′-末端加上伯胺。然后寡核苷酸上的5′-胺可与交联剂反应使得寡核苷酸共价结合到固体支持物上的多聚物涂层上。
只要核酸含有伯胺，任何类型的核酸都能共价结合到有PEI涂层的表面上。扩增产物(如通过PCR)可通过使用5′-己胺-偶联的引物得到修饰从而含有伯胺。使用烯丙基-dUTP(Sigma公司，St.Louis，MO)通过切口平移可以将胺基团引入扩增产物和其它核酸双链体。同样，可通过聚合酶如末端转移酶或通过连接短的含胺寡核苷酸将胺引入核酸。也可换用其它本领域所知的适当方法。
适用于胺基团的交联剂一般是商业上可获得的(见例如Pierce，Rockford，IL)。典型的交联剂是三氯三嗪(氰尿酰氯)(Van Ness等，核酸研究19：3345-3350，1991)。简短地说，在典型的寡核苷酸浓度0.01到1μg/ml，并优选地约0.1μg/ml时，将过量的氰尿酰氯加入寡核苷酸溶液(例如超过胺10到1000倍摩尔量过量的氰尿酰氯)。反应用普通缓冲液如磷酸钠、硼酸钠、碳酸钠或pH7.0到9.0的Tris HCl缓冲。优选的缓冲液是新鲜制备的pH 8.3到pH 8.5的0.2M硼酸钠。加入10μl 15mg/ml的氰尿酰氯溶液并连续搅动1到12小时、优选地约1小时使之反应。反应温度可从20到50℃，优选的反应温度为25℃(或室温)。
当氰尿酰氰用作交联剂时，不需要在将核酸印迹到固体支持物上之前去除过量的交联剂。反应混合物中的过量氰尿酰氯不影响或竞争核酸或寡核苷酸与PEI涂敷的固体支持物的共价结合，这是因为固体支持物上有超过氰尿酰氯分子数的过量胺。在优选实施方案中，交联的寡核苷酸不在印迹步骤之前纯化。
如果要使核酸或其它含胺多聚物共价结合，使活化的多聚物与固体支持物于20到50℃反应1到20小时，并且优选地于25℃反应1小时。然后将固体支持物上的游离胺加帽以防止其它核酸的非特异性结合。加帽通过使固体支持物与0.1到0.2M琥珀酸酐、优选地与70％m-pyrol和0.1M硼酸钠中的1.0M琥珀酸酐反应15分钟到4小时来完成，优选的反应时间是于25℃30分钟。然后将固体支持物在含有0.1到5M甘氨酸(优选地0.2M甘氨酸)的pH 7到pH9的0.1到10.0M硼酸钠(优选地pH 8.3的0.1M硼酸钠)溶液中温育，并且然后用含有去污剂的溶液洗涤。此“帽”可以是与PEI表面共价结合的任何二氯三嗪。优选地，将固体支持物在0.01M NaCl、0.05M EDTA和10mM Tris pH 8.0中进一步加热到95℃持续5分钟以去除任何未共价结合的核酸。在将双链核酸印迹到固体支持物上的情况下，这一步也将双链转变(变性)为单链形式。
在目前所使用的阵列形式中，阵列含有最低可能的信息量；阵列中每单元仅对应一个序列。因此，阵列中的每单元都是已知序列，并且如果阵列中单元评估为阳性(如杂交)，那么命中的序列是已知的。大体上，阵列单元中所含的物质与阵列中所含的信息量有一一对应关系。
在本发明的阵列中，通过在每单元中含有多个序列提供额外的信息量。在最简单的形式中，阵列的每个区域中含有单一序列以及用于测定阵列中每单元物质量的对照序列。如果将两个寡核苷酸固定在单一单元内，其中一个寡核苷酸可用作在阵列上进行质量控制或质量保证的工具。“对照”寡核苷酸可作为包含或带有某种可检测标记的互补寡核苷酸的捕捉位点。“对照”寡核苷酸也可作为布列过程和方法的内对照。
在此形式以及下述形式中，至少一个区域含有多个核酸序列。在优选实施方案中，每个区域均含有多个序列。对于某些目的，中间情况是部分区域含有多个序列而剩余部分含有单个序列。同样，当存在多个序列时，至少含有2个序列，一般不超过1000、优选地2到100个。
在优选方面中，阵列含有中等量的信息量。例如，在一个实施方案中，阵列每单元含有两个序列。因此，每单元的信息量与每阵列的单元数之间有2∶1的对应关系，但在此形式中使用单一标记不能精确鉴定序列。阵列中的每单元由两个可能的已知序列组成，并且如果阵列中的单元评估为阳性，那么命中的序列可能是两个不同的序列。然而阳性的鉴定可通过使用多个检测分子来测定。如下所述，使用不同的荧光分子、有色微滴、放射性分子、生色底物、这些标记的结合、这些标记之一与化学发光物质或可切割质谱标记的结合可提供阵列区域中哪些序列发生杂交的信息。
如下表中所示，当阵列的每个区域中不同序列的数目增加时，为明确鉴定而需进行的重复反应数和所需的不同标记数(重叠法)都增加。#序列/单元  已知序列？    对应关系    重叠法     #标记
 1        已知          1∶1        无         1
 2        未知          2∶1        1/2        2
 3        未知          3∶1        1/3        3
 5        未知          5∶1        1/5        4
 10       未知         10∶1        1/10      10
 n        未知          n∶1        1/n        n
其中阵列中每单元的n优选1-100。每单元的序列数是置于每个阵列单一单元中的不同序列数。已知序列一栏代表用单一标记测定靶(测试)样品序列的能力。对应关系是指阵列或亚阵列内单一单元内的信息量或代表任何给定序列的可能性。重叠法一栏代表为测定阵列中评估为阳性的靶(测试样品)的确切序列所需进行的亚分析数。例如，如果命中发生在含有10个不同序列的区域中，可通过分别印迹10个不同的序列和杂交来明确测定。
在阵列内每单元使用一个以上核酸序列或一个以上寡核苷酸有很多优点。例如，相关核酸序列家族可置于阵列单一单元中，从而可通过检测阵列间杂交模式来测定任何测试样品的基因活性。在毒理学测试中，可建立具有下列单元的阵列：含有促炎细胞因子诱导(IL-1、IL-2、IL-6、IL-8)序列的单元、含有抗炎细胞因子诱导(IL-4、IL-12)序列的单元、含有脂修饰酶(血小板-活化因子乙酰转移酶、血小板活化因子乙酰水解酶)序列的单元和含有TNF(TNF-α和TNF-β)序列的单元等。本领域技术人员将意识到核酸序列的选择将部分取决于所测试的样品。
B.将核酸分子上样到固体基质上的方法
将寡核苷酸、核酸分子或其它生物多聚物“印迹”(转移或上样)到固体基质上。在优选实施方案中，多聚物以规则模式或阵列上样。
各种印迹方法可用于将核酸如寡核苷酸或DNA片段印迹到固体基质上的阵列模式中。作为一般原则，转移机制必须能在较小区域内上样非常少量的液体(如钠升)，其中区域互相之间很接近(如1mm或更小的间距)。优选地，印迹技术易于自动化。一种这样的技术是使用多头的喷墨印迹。也可使用很细的移液管。优选的印迹方法是使用本文所述的弹性探头。
当使用具亲水表面的液体转移装置时，特别是当该装置是修饰的弹性探头时，样品的汲取、转移和微滴附着大大加强。通过使用作用以修饰探头表面的化学试剂或通过用亲水物质涂敷探头使弹性探头亲水。在优选方法中，将弹性探头的端部浸入25-200mM 1，4-二硫苏糖醇、0.1M硼酸钠溶液中15分钟到2小时。二硫苏糖醇通过硫醇-金配位与金表面反应，这使表面基本上羟化，使之亲水。
当弹性探头浸入溶液时，亲水表面可促进样品的均匀涂布。有凹槽的探头通过其亲水性质可均匀而恒定地装载吸附在探针表面上的液体。含有粘性增强化学物质如甘油的溶液使用亲水表面可提供特别改善的操作能力。对于这些溶液，甘油甚至在探头从液体源中取出时仍附着其上。当将样品从其来源转移到固体支持物上时，探头的亲水表面通过留住所要转移的样品并防止样品在转移过程中随机滴落或流出而持续有益于液体操作。当带有样品的弹性探头与固体支持物接触时，样品从弹性探头的端部点样到固体支持物的表面，特别当样品含有粘性增强溶液时更是如此。印迹区域的大小一般为10-200μm，典型的中心到中心的距离为25-500μm。
简单地说，在典型方法中，将核酸溶液均匀地混合于57％甘油中并印迹到固体支持物上。在本发明的上下文中，生物多聚物可以是核酸分子或蛋白分子。当使用核酸时，它们可包括单链或双链DNA、单链或双链RNA、寡核苷酸、杂合DNA-RNA分子或双链体、带有蛋白主链的PNA核酸等。II.反应成分和条件：
如上所述，本发明提供与固体基质上核酸分子进行杂交的方法。如上所述，核酸可与基质表面共价结合或不结合而附着基质上。通常，先印迹寡核苷酸，随后加其它试剂。
A.试剂、缓冲液、辅因子等
每一进行杂交的阵列区域除了模板核酸还含有适当的标记核酸、缓冲液、辅因子等。使用短片段核酸进行杂交的条件众所周知(见Ausubel等，分子生物学常用方法，Greene出版社，1995；Sambrook等，分子克隆：实验室方法，冷泉港出版社，1987)并得到详细描述。
在优选实施方案中，可加入hybotrope以改善模板与寡核苷酸引物的退火〔见美国专利申请Nos.60/026,621(1996年9月24日提交)；08/719,132(1996年9月24日提交)；08/933,924(1997年9月23日提交和PCT国际公开No.WO 98/13527，在此全文引用所有参考文献〕。hybotrope是指相对于标准盐溶液(即0.165M NaCl)能使核酸双链体的焓增加20％或更多的任何化学物质。在作为溶液含有50％G+C的18bp寡核苷酸双链体具有15℃或更低的螺旋-卷曲转换(HCT)时，化学物质表现hybotropic特性。HCT是80％和20％的双链体为单链时的温度间差异。然后选择处于辨别温度的退火温度，即进行杂交反应允许错配双链体和正确配对的双链体间可检测辨别的温度。一定范围的温度可满足辨别温度的标准。III.反应产物的检测：
反应产物可通过各种方法检测。优选地，标记反应成分之一。在扩增反应中，方便地将寡核苷酸引物或核苷酸标记。优选地，引物含有标记。在单核苷酸延伸分析中，加入的核苷酸一般是标记的；在寡核苷酸连接分析中，一个或多个寡核苷酸是标记的；在其它合成反应中，引物和寡核苷核是标记的。
常用标记包括但不限于生物素、荧光分子、放射性分子、生色底物、化学发光物质等。象将荧光分子和放射性分子引入寡核苷酸和核苷酸的方法一样，使核酸分子生物素化的方法在本领域内众所周知。
当使用生物素时，生物素通过抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白等检测，它们与可检测的标记如酶(例如辣根过氧化物酶)或放射性标记(例如32P、35S、33P)偶联。酶偶联物在商业上可从例如VectorLaboratories(Burlingame，CA)获得。链霉抗生物素蛋白以高亲和性与生物素结合，洗去未结合的链霉抗生物素蛋白，并且然后在过氧化物和适当缓冲液的参与下用沉淀底物来检测辣根过氧化物酶的存在。产物可用装有可见光源和CCD相机(Princeton Instruments，普林斯顿，NJ)的显微镜进行检测。使用这样的仪器一次可扫描约10,000μM×10,000μM图像。
上述标记如荧光或放射性标记的检测方法众所周知。荧光标记可通过其吸收以及荧光发射波长和强度得到鉴定和定量。使用荧光光源的显微镜/相机装置是检测荧光标记的便利方法。放射性标记可通过常规放射自显影、磷光图像分析或CCD检测仪观察。其它检测系统是可得到的并且在本领域内已知。对于诸如生物素、放射性或荧光的标记，能一次检测的不同反应数是有限的。例如，如常用于DNA测序分析的四种荧光分子，一次只限于分析四个样品。实际上，由于此限制，当使用这些检测方法时，每个反应必须单独评估。
更先进的检测方法允许样品反应集中于至少一个阵列上并同时检测产物。通过使用在每个反应中具有不同分子量或其它物理属性的标记，可一起收集并分析整套反应产物。(见均在1997年1月22日提交的美国专利申请Nos.08/786,835、08/786,834和08/787,521；均在1997年7月22日提交的美国专利申请Nos.08/898,180、08/898,564和08/898,501以及PCT国际公开Nos.WO 97/27331、WO 97/27325和WO 97/27327)。简言之，将“标记”分子用作标记。如本文所用的，“标记”是指用于特别鉴定“目的分子”的化学部分，并且更具地是指标记可变成分以及在任何标记反应物、标记成分和标记部分中可与之最紧密结合的任何成分。
用于本发明的标记具有几个属性：
(1)它能区别于所有其它标记。与其它化学部分的这种区别可基于标记的层析行为(特别是切割反应之后)、其光谱或电势特性或这些特征的组合。可有效辨别标记的光谱方法包括质谱(MS)、红外(IR)、紫外(UV)和荧光，其中MS、IR和UV是优选的，而MS是最优选的光谱方法。电势电流测定法是优选的电势法。
(2)标记以10-22到10-6摩尔存在时是能检测到的。
(3)标记含有通过其能与MOI结合的化学手柄，标记用于特别鉴定。可直接与MOI结合或通过“连接体”基团间接结合。
(4)标记对于所有进行的处理包括结合和从MOI上切割以及当标记结合其上时任何MOI的处理是化学稳定的。
(5)标记结合在MOI上时不显著影响MOI上所进行的处理。例如，如果标记结合在寡核苷酸上，标记必须不影响在寡核苷酸上进行的任何杂交或酶反应(如扩增反应)。
预期通过特定光谱或电势方法检测的标记部分应具有增强该方法检测敏感性和特异性的特性。通常，标记部分将具有那些特点，因为这些特点已设计进标记可变成分，它们通常将构成标记部分的主要部分。在下面的讨论中，词语“标记”的使用通常指标记部分(即含有标记可变成分的切割产物)，但也可认为是指标记可变成分本身，因为它是标记部分通常负责提供可特别检测的特性的部分。在具化学式T-L-X的化合物中，“T”部分含有标记可变成分。当标记可变成分设计为例如通过质谱来鉴定时，T-L-X的“T”部分可称为TmS。同样，来自T-L-X的含有T的切割产物可称为含有TmS的部分。下面的光谱和电势方法可用于鉴定含有TmS的部分。
因此，在本发明的一个方面中，提供测定核酸分子或片段特性(或检测所选核酸分子或片段的存在)的方法，包括以下步骤(a)使标记的核酸分子与一个或多个所选的靶核酸分子杂交，其中标记与特定核酸分子相关并可通过非荧光光谱测定法或电位滴定法检测，(b)洗去未杂交的标记核酸分子；(c)从标记的分子上切下标记，并且(d)通过非荧光光谱测定法或电位滴定法检测标记，从而测定核酸分子的特性。这些技术的例子包括质谱测定法、红外光谱测定法、电势电流测定法或紫外光谱测定法。IV.用途
如上所述，此处所述的方法可用于多种目的。例如，寡核苷酸阵列可用于控制制备阵列的质量、核酸分子的定量或定性分析、检测突变、测定表达分布、毒理学测试等。
A.阵列杂交或制备中的内对照
在此实施方案中，阵列的每个区域除了任何含有其它序列之外，还含有相同核酸序列。因此，一个共同序列位于每单元中。共同序列可用作监测阵列制备质量控制或质量保证的对照。“对照”序列可作为含有或带有可检测标记的互补寡核苷酸的捕捉位点。象这样，可测定每个区域中核酸量的重复性。如果需要，结果可相对于对照序列标准化。对照序列可引入到此处所述的任何用途中。
B.探针定量或分类
在此实施方案中，阵列中每单元固定2到100个寡核苷酸，其中单元中的每个寡核苷酸是不同的或相关的序列。优选地，每单元含有已知的或相关的序列组。标记的探针与这样的阵列的杂交使得可以鉴定探针并对探针群体中所含序列定性和定量。
可用于下面所讨论的具体应用的一般分析模式是三明治分析模式。在此模式中，将多个已知序列的寡核苷酸(如2到100个)固定在阵列的相同单元中。每单元因此含有已知的或相关的序列组。固定的寡核苷酸用于捕捉核酸(如RNA、rRNA、PCR产物、片段化的DNA)，然后使信号探针与捕捉到的靶核酸的不同部分杂交。
另一一般分析模式是二级检测系统。在此模式中，阵列用于鉴定和定量已在初级结合分析中使用的标记的核酸。例如，如果分析产生标记的核酸，该核酸的性质可通过核酸与阵列的杂交测定。这些分析模式与可切割的质谱标记相结合时特别有用。
C.突变检测
疾病的检测在预防和治疗中日益重要。虽然难以设计用于多因子疾病的遗传测试，但是200多种已知的人类疾病是由单基因的缺陷引起，常常是单个氨基酸残基的改变引起疾病(Olsen，生物技术：成熟工业的到来，Mational Academic Press，1986)。
分析可在受精卵移植之前进行(Holding和Monk，柳叶刀3：532，1989)或在与健康检查相关从呼吸道或膀胱脱落的细胞中进行(Sidransky等，科学252：706，1991)。并且，当未知基因引起遗传疾病时，监测DNA序列变体的方法对于通过遗传连锁分析研究疾病的遗传是有用的。
包括单核苷酸的突变可通过物理、化学或酶学方法在样品中进行鉴定。一般地，突变检测方法可分为适于鉴定以前未知的突变的搜索技术和设计用于检测、辨别或定量已知序列变体的技术。基于观察结果即野生型和突变序列的错配互补DNA链异源双链体表现异常迁移行为，几种突变检测搜索技术已得到发展。
此处所述的方法可用于突变筛选。检测DNA链中的突变的一个策略是通过使测试序列与是野生型或突变序列的靶序列杂交。错配的序列对短寡核苷酸探针与靶序列的杂交有不稳定影响(见Wetmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol，26：227，1991)。测试的核酸来源可以是基因组DNA、RNA、cDNA或任何这些核酸的扩增产物。优选地，首先进行测试序列的扩增，再与固定在阵列上的短寡核苷酸探针进行杂交。通过测定扩增产物与固定的寡核苷酸探针阵列的杂交模式可搜索出许多可能的序列变体。
正如此处所述的，一般通过使用标记的核苷酸或通过使用标记的引物将标记掺入最终的扩增引物。将扩增产物变性并与阵列杂交。洗去未结合的产物并通过此处所述的方法之一检测与阵列结合的标记。例如，使用可切割的质谱标记。
D.表达分布/差异展示
哺乳动物如人类在其基因组中有约100,000个不同基因，而其中仅一小部分、可能是15％在任何单独细胞中表达。正常的细胞生长和分化过程以及在诸如癌症的疾病中发生的病理学变化都是由基因表达的变化所引起的。差异展示技术使得能够鉴定对独立细胞类型特异的基因。
简言之，在差异展示中，mRNA的3′末端部分在大小的基础上得到扩增和鉴定。用设计以与poly(A)尾的5′边界结合的引物进行逆转录，接着用上游随机序列引物进行cDNA扩增，获得mRNA亚群体。差异展示方法具有在哺乳动物细胞中通过使用多个引物组合观察所有表达基因(约10,000到15,000种mRNA)的潜力。
扩增的cDNA与固定在阵列相同单元中的多个寡核苷酸的杂交使得可以对扩增的序列进行鉴定和定量，并由此对起始mRNA群体进行鉴定和定量。在阵列上，每单元可固定2到100个寡核苷酸，其中单元中的每个寡核苷酸是不同的或相关的序列。杂交序列的鉴定可得到从中产生探针的靶核酸序列的表达分布。表达分布可用于测量基因和信使RNAs(mRNA)应答细胞信号、刺激等的调节。例如，可构建用于毒理学测试的阵列使得单独区域含有与各种细胞因子(见上)互补的序列。对于毒理学测试或者在要测试小有机分子的毒理学时，刺激一般是小有机化合物或怀疑是毒素的分子。
如此处公开的，提供测量大量基因(如1-2000)表达的高处理量方法。在本发明的一个实施方案中，提供分析所选生物样品的基因表达模式的方法，包括以下步骤：(a)用两个或多个标记的引物扩增来自生物样品的cDNA，其中标记与特定核酸探针相关并可通过非荧光光谱测定法或电位滴定法进行检测，(b)使扩增的片段与此处所述的寡核苷酸阵列杂交，(c)洗去未杂交的物质，并且(d)通过非荧光光谱测定法或电位滴定法检测标记，从而测定生物样品的基因表达模式。
以标记为基础的差异展示，特别是在固体基质上使用可切割的质谱标记以鉴定差异表达基因。这基于此原则：大部分在两种或多种细胞类型或目的样品中表达的mRNA可在扩增来自mRNA亚群的部分cDNA序列后直接比较。简言之，将三个单碱基锚定的oliga-dT引物与一系列随机的13碱基寡核苷酸结合使用以从细胞或目的样品逆转录和扩增mRNA。为监测15,000个基因的表达，优选地使用至少九个不同的随机引物。对于两个细胞群体或两个目的样品的完全的差异展示分析，进行至少400个扩增反应。对于两个细胞类型的以标记为基础的差异展示分析，应方便且快速地进行至少1500个扩增反应。
E.单核苷酸的延伸分析
引物延伸技术可用于检测核酸模板中的单核苷酸(Sokolov，核酸研究18：3671，1989)。在其最初模式中，与已知的囊性纤维化基因序列互补的20和30个碱基寡核苷酸在标记的单核苷酸的参与下得到延伸并正确地鉴定出基因内的单核苷酸变化。该技术一般可用于检测任何单碱基突变(Kuppuswamy等，美国国家科学院院报88：1143-1147，1991)。
简言之，此方法首先使引物与接近已知单核苷酸多态性的序列杂交。然后如果模板中的相邻碱基与反应混合物中的标记核苷酸互补，那么引物DNA就符合DNA聚合酶加入标记dNTP、典型地ddNTP的条件。在修饰中，首先扩增到含有两个等位基因间单碱基差异的目的序列的cDNA。然后通过使单碱基引物退火到多态性5′端和一个标记碱基(一般是双脱氧核苷酸)的延伸来分析每个扩增产物中每个等位基因的存在、缺失或相对量。只有在反应中可获得正确碱基时，才将碱基掺入引物的3′端。然后通过与寡核苷酸阵列杂交来分析延伸产物，未延伸的产物不发生杂交。
简言之，在本发明中，每种双脱氧核苷酸用特别的标记进行标记。在四个反应混合物中，只有一个在引物序列上加入双脱氧终止子。如果突变存在，将在与阵列杂交后通过双脱氧核苷酸上的特别标记检测出来。同样通过用特别标记标记DNA引物可同时测定多个突变。因此，在四个分开的反应中反应的DNA片段各包含不同的标记双脱氧终止子，其中标记与特定双脱氧核苷酸相关并可通过非荧光光谱测定法或电位滴定法检测。使DNA片段与阵列杂交并洗去未杂交的物质。将标记从杂交片段上切下并通过各自的检测技术(如质谱测定法、红外光谱测定法、电势电流测定法或UV/可见光光谱测定法)检测。测定的标记可通过研究与特定DNA片段以及突变核苷酸的特征相关。
本发明的阵列可用于检测单核苷酸延伸分析(SNEA)的产物。阵列中每单元可固定2到100个寡核苷酸，其中单元中每个寡核苷酸是不同的或相关的序列并与单核苷酸延伸分析(SNEA)的给定产物互补。优选地，每个用于检测SNEA的寡核苷酸序列将包含在相邻单元中。例如，SNEA的“A”产物将包含在单元1中，SNEA的“T”产物将包含在单元2中，SNEA的“C”产物将包含在单元3中，SNEA的“G”产物将包含在单元4中。
F.寡核苷酸连接分析
寡核苷酸连接分析(OLA)(Landegen等，科学241：487，1988)对于在非常大且复杂的基因组中鉴定已知序列是有用的。OLA的原理是基于连接酶在两个诊断性寡核苷酸在给定的靶DNA上彼此相邻杂交时将它们共价连接的能力。如果探针接合处的序列不是完全碱基配对的，那么探针将不会通过连接酶连接。热稳定的连接酶在位于“上游”探针的3′末端时分辨潜在单碱基对差异的能力提供了单碱基对的分辨机会(Barony，美国国家科学院院报，88：189，1991)。当使用标记时，将它们与探针结合，而探针与扩增产物连接。OLA完成后，使片段与互补序列的阵列杂交，切割标记并通过质谱测定法检测标记。
在本发明的一个实施方案中，提供利用寡核苷酸连接分析技术测定例如生物样品中核酸分子特性或检测核酸分子的方法。简言之，这样的方法一般包括以下步骤：在靶DNA上进行扩增，接着与5′标记的报告DNA探针和5′磷酸化的探针杂交。将样品与T4DNA连接酶一起温育。通过与阵列杂交捕捉带有连接的探针的DNA链，其中未连接的产物不发生杂交。从分开的片段切下标记，然后通过各自的检测技术(如质谱测定法、红外光谱测定法、电势电流测定法或UV/可见光光谱测定法)检测标记。
在本发明中，可同时分析多个样品和多个突变。简言之，该方法包括扩增含有目的突变的基因片段。然后使扩增产物与共同探针和两个等位基因特异的寡核苷酸探针(一个含有突变而另一个不含突变)杂交使得等位基因特异的探针的3′末端与共同探针的5′末端紧密相邻。这在每个位点的两个等位基因探针与共同探针之间建立了竞争性的杂交-连接过程。
在本发明的一个实施方案中，提供利用用于同时检测多个样品的寡核苷酸连接分析技术测定例如生物样品中核酸分子特性或检测核酸分子的方法。简言之，这样的方法一般包括以下步骤：扩增靶DNA，接着与共同探针(未标记的)和根据本发明说明书标记的两个等位基因特异的探针杂交。将样品与T4DNA连接酶一起温育。通过与阵列杂交捕捉带有连接的探针的DNA链，其中未连接的产物不发生杂交。从分开的片段切下标记，然后通过各自的检测技术(如质谱测定法、红外光谱测定法、电势电流测定法或UV/可见光光谱测定法)检测标记。
如最初由Landegren等(Landegen等，科学241：487，1988)描述的寡核苷酸连接分析对于在非常大且复杂的基因组中鉴定序列(已知的)是有用的技术。OLA反应的原理是基于连接酶在两个诊断性寡核苷酸在给定的靶DNA上彼此相邻杂交时将它们共价连接的能力。如果探针接合处的序列不是完全碱基配对的，那么探针将不会通过连接酶连接。热稳定的连接酶在位于“上游”探针的3′末端时分辨潜在单碱基对差异的能力提供了单碱基对分辨的机会(Barony，美国国家科学院院报，88：189，1991)。在使用标记时，将它们与探针结合，而探针与扩增产物连接。OLA完成后，使片段与互补序列的阵列杂交，切割标记并通过质谱测定法检测标记。
在另一实施方案中，寡核苷酸-连接分析使用两个相邻的寡核苷酸：“报告”探针(在5′末端标记)和5′磷酸化/3′标记的“锚定”探针。使已掺入不同标记的两个寡核苷酸与靶DNA退火，如果有完全互补，两个探针将通过T4DNA连接酶连接。在一个实施方案中，3′标记是生物素并且将生物素化的锚定探针捕捉在固定的链霉抗生物素蛋白上同时分析共价连接的报告探针以测试靶序列的存在或缺失。
G.其它分析
此处所述的方法也可用于基因型测定或病毒或微生物的鉴定。例如，F+RNA大肠杆菌噬菌体是有用的肠道病毒感染标志的候选者。作为血清型鉴定替代方法，通过核酸扩增和杂交方法确定基因型是可靠、快速、简单且廉价的(Kafatos等，核酸研究，7：1541，1979)。扩增技术和核酸杂交技术已成功地用于大量微生物包括大肠杆菌(Feng，分子细胞探针7：151，1993)、轮状病毒(Sethabutr等，J.MedVirol.37：192，1992)、丙型肝炎病毒(Stuyuer等，J.Gen Virol.74：1093，1993)和单纯疱疹病毒(Matsumoto等，病毒学方法杂志40：119，192)的分类。
大量实验动物和人类肿瘤中的遗传改变已有描述并且代表致癌作用中观察到的形态学变化的序列的形态基础(Vogalstein等，NEJM319：525，1988)。近年来由于分子生物学技术的进步，特定染色体上的等位基因丢失或肿瘤抑制基因的突变以及数个癌基因(如c-myc、c-jun和ras家族)中的突变已得到大量研究。以前的工作(Finkelstein等，Arch Surg.128：526，1993)已鉴定了K-ras癌基因中点突变的特定类型与结肠癌诊断阶段的相关性。结果表明突变分析可以提供肿瘤侵蚀性包括转移模式和扩散的重要信息。最近已证明了TP53和K-ras-2突变分析在III期结肠癌中的预后价值(Pricolo等，Am.J.Surg.171：41，1996)。因此很明显肿瘤和癌前期细胞的基因型测定和特异性突变的检测在人类癌症治疗中将变得更重要。
提供以下实施例作为举例说明而不是作为限制。实施例实施例1从商用弹性探头制备点样头
此实施例描述了用于在阵列中上样样品的弹性探头端部的制备和修饰。
XP54P弹性探头购自Osby-Barton[Everett Charles(Pomona，CA)的分公司]。将探头“端部向下”放在极细的金刚磨石上并用轻微压力在磨石上横移约0.5cm。通过显微镜观察到约0.005英寸(0.001到0.01英寸)的金属已从点样头的末端去掉。通过在皮革带上摩擦端部将点样头末端磨光，然后用水洗。将点样头干燥贮存或于-20℃贮存于50％甘油中。为了用于阵列的制备，将点样头以阵列方式装在头部。头部装在机器人臂上，它具有Z-轴上可控制的移动。实施例2：玻璃载片上微球体阵列的制备
将易于检测的微球体点样到玻璃载片上证明阵列形成的可重复性。在此方法中，制备含有56％甘油、0.01M Tris pH 7.2、5mM EDTA、0.01％肌氨酰和1％V/V Fluoresbrite Plain 0.5μM微球体(2.5％固体-乳胶)的溶液(Polysciences，Warrington，PA)。将点样针浸入此溶液5mm持续5秒。然后使微球体重复地布列到玻璃载片上。使用荧光过滤器在荧光下对载片进行显微摄影。图1证明阵列每个区域中布列溶液的量是非常恒定的。而且，每次汲取可制备100份实际上相同的附着物。实施例3：使用修饰的亲水弹性探头制备阵列
当使用具有亲水表面的液体转移装置，特别是当该装置是修饰的弹性探头时，样品汲取、转移和微滴附着大大加强。通过使用作用以修饰探针表面的化学试剂或通过用亲水物质涂敷探头使弹性探头亲水。在优选实施方案中，将弹性探头的端部浸入25-200mM 1，4-二硫苏糖醇、0.1M硼酸钠溶液中15分钟到2小时。二硫苏糖醇通过硫醇-金配位与金表面反应，这使表面基本上羟化，使之变得亲水。
制备含有56％甘油和44％用蓝色食物色素染色的水的布列溶液。将点样头浸入布列溶液中5mm持续2秒。然后带有甘油的点样头在自动控制下在硅片上的12×6网格中印迹72个微点。产生的点直径约100-150微米，点与点之间中心到中心的距离为200微米。图2表示所产生网格的CCD相机图像。点直径的标准偏差约为15％。实施例4：排列的寡核苷酸的比色测定
模板寡核苷酸(75μl 0.5μg/μl)5′-己胺GTCATACTCCT-GCTTGCTGATCCACATGTG-3′)与5μl 20mg/ml氰尿酰氯在20μl 1M的硼酸钠中于室温反应30分钟。从该反应制备布列溶液，包含56％甘油、56ng/ml寡核苷酸、0.06mM硼酸钠和0.3mg/ml氰尿酰氯。将点样头浸入布列溶液中5mm持续2秒。然后带有溶液的点样头在自动控制下在聚乙烯亚胺(PEI)涂敷的硅片上的12×6网格上印迹72个微点。产生的点直径约100-150微米，点与点之间中心到中心的距离为200微米。布列之后，硅片上未反应的PEI位点用100％n-甲基吡咯烷酮中的100mg/ml琥珀酸酐封闭15分钟，再在水中洗三次。未反应的氰尿酰氯位点用0.01M Tris中的0.1M甘氨酸封闭15分钟，再在Tens缓冲液(0.1M NaCl、0.1％SDS、0.01M Tris、5mM EDTA)中洗4次。然后将模板寡聚体与其生物素化的互补产物(5′-生物素-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3′)于37℃杂交20分钟，然后在6×Tens和2×OHS[0.06M Tris、2mM EDTA、5×Denhardt’s溶液、6×SSC(3M NaCl、0.3M柠檬酸钠，pH 7.0))、3.68mM N-月桂酰肌氨酸、0.005％NP-40]中洗。然后将硅片浸入0.5μg/ml与链霉抗生物素蛋白偶联的碱性磷酸酶中15分钟，再在2×Tens、4×TWS(0.1M NaCl、0.1％Tween 20、0.05M Tris)中洗。然后用Vector Blue(VectorLaboratories，Burlingame，加利福尼亚)(按照试剂盒说明)使微点显色并通过CDD相机和显微镜成像。图3表示获得的图像。正如通过NIHImage(国家健康研究所，Bethesda，MD)所测定的，所得的微点的直径约有15％差异，强度值约有10％变化。实施例5：单个阵列单元中的多个寡核苷酸
两个0.5μg/μl的模板寡核苷酸(#1：5′-己胺-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3′，#2：5′-己胺-ACTACTGATCAGGCGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′)在100μl总反应体积中分别与5μl 20mg/ml氰尿酰氯和20μl 1M硼酸钠于室温反应30分钟。由这两个反应制备含有56％甘油和两种反应的寡核苷酸的稀释组合的布列溶液(见下表)。将8个点样头浸入8种布列溶液中5毫米持续2秒。带有溶液的点样头在自动控制下在聚乙烯亚胺(PEI)涂敷的硅片上印迹两组8个各含72个微点的12×6网格。每个网格代表单独的布列溶液。产生的点直径约100-150微米，点与点之间中心到中心的距离为200微米。
布列之后，硅片上未反应的PEI位点用100％n-甲基吡咯烷酮中的100mg/ml琥珀酸酐封闭15分钟，用水洗3次。未反应的氰尿酰氯位点用0.01M Tris中的0.1M甘氨酸封闭15分钟，用4×Tens(0.1MNaCl、0.1％SDS、0.01M Tris、5mM EDTA)洗。然后进行两个杂交反应。在第一个杂交反应中，一组8个布列的寡核苷酸组合与互补于寡核苷酸#1的寡核苷酸5′-生物素-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3′进行杂交。在第二个杂交反应中，另一组8个布列的寡核苷酸组合与互补于寡核苷酸#2的寡核苷酸(5′-生物素-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCGCGCCTGATCAGTAGT)进行杂交。杂交在Hybriwell Sealing Covers下(Research Products InternationalCorporation，Mount Prospect，Illinois)于37℃同时进行20分钟，然后用6×Tens、2×OHS[0.06 M Tris、2mM EDTA、5×Denhardt’s溶液、6×SSC(3M NaCl、0.3M柠檬酸钠，pH 7.0))、3.68mM N-月桂酰肌氨酸、0.005％NP-40]洗。杂交后，将硅片浸入0.5μg/ml辣根过氧化物酶链霉抗生物素蛋白中15分钟，然后用2×Tens、4×TWS(0.1MNaCl、0.1％Tween 20、0.05M Tris)洗。然后用0.4mg/ml 4-甲氧基1-napthol(0.02％过氧化氢、12％甲醇、PBS)使微点显色，最后用水洗3次。
与寡核苷酸#1的互补产物杂交的混合寡核苷酸组对于含有最高浓度寡核苷酸#1的网络表现最高的颜色强度，而对于含有最低浓度寡核苷酸#1的网格表现最低的颜色强度。而且，与寡核苷酸#2的互补产物杂交的混合寡核苷酸组对于含有最高浓度寡核苷酸#2的网格表现最高的颜色强度，而对于含有最低浓度寡核苷酸#2的网格表现最低的颜色强度(见图4)。布列溶液    布列溶液中寡核苷酸  布列溶液中寡核苷酸
         #1的浓度(ng/μl)    #2的浓度(ng/μl)1                  56                  0.442                  28                  0.883                  14                  1.84                  7                   3.55                  3.5                 76                  1.8                 147                  0.88                288                  0.44                56
从前述可以理解，尽管为达到举例说明的目的已在此描述了本发明的特定实施方案，但在不偏离发明精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，除所附的权利要求外本发明不受其它限制。

Claims (23)

1.一种核酸分子阵列，包括表面含有核酸分子的分开区域的固体基质，其中至少一个区域含有所选的至少两个具有不同序列的核酸分子。
2.根据权利要求1所述的阵列，其中有少于1000个分开区域。
3.根据权利要求1所述的阵列，其中核酸是寡核苷酸。
4.根据权利要求1所述的阵列，其中每个区域含有至少两个具不同序列的核酸分子。
5.根据权利要求1所述的阵列，其中至少一个区域含有从2到约100个不同核酸序列。
6.根据权利要求1所述的阵列，其中区域的直径是从约20到约500微米。
7.根据权利要求1所述的阵列，其中区域之间中心到中心的距离是从约50到1500微米。
8.根据权利要求1所述的阵列，其中核酸分子具有已知序列。
9.根据权利要求1所述的阵列，其中核酸分子与基质表面共价结合。
10.根据权利要求9所述的阵列，其中共价结合借助胺连接。
11.根据权利要求10所述的阵列，其中基质表面用聚(乙烯亚胺)涂敷。
12.一种杂交分析方法，包括：
(a)使标记的核酸分子与根据权利要求1所述的核酸分子阵列杂交；并且
(b)检测阵列区域中的标记，从而测定阵列上哪些核酸分子发生了杂交。
13.根据权利要求12所述的方法，其中阵列中的至少一个区域含有已知序列并且标记的核酸分子之一与已知序列互补。
14.根据权利要求13所述的方法，其中阵列的每个区域均含有已知序列。
15.根据权利要求12所述的方法，其中标记的核酸分子包括具有不同序列的核酸分子，各带有不同标记。
16.根据权利要求12所述的方法，其中标记选自放射性分子、荧光分子和可切割的质谱标记。
17.鉴定样品中核酸分子的方法，包括：
(a)使标记的寡核苷酸与核酸分子杂交以形成双链体；
(b)分离双链体；
(c)使双链体变性；
(d)使标记的寡核苷酸与根据权利要求2所述的寡核苷酸阵列杂交，其中阵列上的寡核苷酸与标记的寡核苷酸互补；并且
(e)检测阵列区域中的标记；从而鉴定样品中的核酸分子。
18.鉴定样品中核酸分子的方法，包括：
(a)使寡核苷酸与核酸分子杂交；
(b)在单个标记核苷酸的参与下延伸寡核苷酸以形成双链体；
(c)使双链体变性；
(d)使标记的寡核苷酸与根据权利要求2所述的寡核苷酸阵列杂交，其中阵列上的寡核苷酸与标记的寡核苷酸互补；并且
(e)检测阵列区域中的标记；从而鉴定样品中的核酸分子。
19.根据权利要求18所述的方法，其中阵列分开区域中的寡核苷酸与核酸分子的延伸产物互补。
20.鉴定样品中核酸分子的方法，包括：
(a)使至少两个寡核苷酸与核酸分子杂交以形成双链体，其中至少一个寡核苷酸是标记的并且这两个寡核苷酸与核酸分子上的相邻序列杂交；
(b)连接寡核苷酸；
(c)使双链体变性；
(d)使标记的寡核苷酸与根据权利要求2所述的寡核苷酸阵列杂交，其中阵列上的寡核苷酸与连接的寡核苷酸互补；并且其中不与未连接的寡核苷酸发生杂交；并且
(e)检测阵列区域中的标记；从而鉴定样品中的核酸分子。
21.鉴定样品中mRNA分子的方法，包括：
(a)使标记的寡核苷酸与mRNA分子杂交以形成双链体；
(b)分离双链体；
(c)使双链体变性；
(d)使标记的寡核苷酸与根据权利要求2所述的寡核苷酸阵列杂交，其中阵列上的寡核苷酸与标记的寡核苷酸互补；并且
(e)检测阵列区域中的标记；从而鉴定样品中的mRNA分子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中mRNA分子是从用怀疑是毒素的化合物处理的细胞分离的。
23.根据权利要求22所述的方法，其中阵列上的寡核苷酸是细胞因子的序列。
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