KR100906185B1

KR100906185B1 - 조류 종 판별용 프로브 및 ｄｎａ 칩

Info

Publication number: KR100906185B1
Application number: KR1020070134729A
Authority: KR
Inventors: 김창배; 유혜숙; 황승용; 정인혁; 정진욱; 어재영
Original assignee: 한국생명공학연구원; (주)지노첵
Priority date: 2007-12-20
Filing date: 2007-12-20
Publication date: 2009-07-03
Also published as: KR20090066972A

Abstract

본 발명은 조류의 종을 판별하는데 유용한 프로브 및 DNA 칩에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 조류의 미토콘드리아 COI(Cytochrome c Oxidase 1) 유전자로부터 얻어진 조류 종 판별용 프로브 및 상기 프로브가 기질 상에 고정된 조류 종 판별용 DNA 칩에 관한 것이다.

조류, 종 판별, 프로브, DNA 칩

Description

조류 종 판별용 프로브 및 ＤＮＡ 칩{Probe and DNA Chip for Identifying Avian Species}

본 발명은 조류의 종 판별용 프로브 및 DNA칩에 관한 것이다.

세계 45개국 150여 개의 기관이 CBOL(Consortium for the Barcode of Life, http://barcoding.si.edu/)을 구성하여 유전자 신분증인 생물 바코드(Barcode of Life)는 확립하는 연구를 수행하고 있다. 생물 바코드는 게놈 상에 종특이적으로 존재하는 단편의 DNA 서열로서 이러한 서열을 분석하여 식물 및 동물을 포함하는 각 생물종에 대한 표준화된 바코드를 부여하여 각각의 종을 식별하는데 사용된다.

생물 바코드가 확립됨으로써 동물 및 식물에 대해 보다 정확한 분류학적 연구를 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 동물 또는 식물을 원료로 하는 식품을 제조하는 과정에서 엄격한 관리하에 얻어진 식용 동물 및 식물에 실수로 혼합된 불순 생물 원료를 신속하게 분석 및 제거를 통한 고품질의 유지 및 관리가 쉬워질 수 있으며, 유사한 형태를 가진 유해한 생물을 구별하는 등의 보다 확실한 생물종의 인식을 가 능케 하는 수단을 제공할 수 있다.

대부분의 고등동물의 표준화된 바코드를 얻을 수 있는 게놈부위는 COI(Cytochrome c Oxidase 1)의 5'말단의 'Folmer region'으로, 648 bp 크기의 상기 부위에는 보존서열이 인접해 있기 때문에, 분리하거나 분석하기가 매우 용이하며, 또한 COI 유전자 부위는 서열은 종내(種內) 다양성이 1-2% 이하로 낮기 때문에 종간(種間) 구별에 사용함에 있어서 결과에 대한 신뢰도가 상당히 높은 것으로 알려져 있다. 그러나, COI 유전자를 사용하여 구별할 수 없는 생물종이 존재하기 때문에, 생물 바코드를 위한 다른 표준화된 게놈 부위를 개발하려는 시도가 활발하게 이루어지고 있다 (Paul D. et al., Proceeding : Biological Science , 270(spl):S96, 2003).

현재까지 생물 바코드 데이터베이스 시스템(www.bardocidnglife.com)에 등록된 생물 바코드는 총 324,987건으로, 국내 연구진에 의해서는 연어과 어류 및 홍어-가오리 어종에 대한 생물 바코드가 개발되어, 이를 이용한 DNA 칩에 대한 기술개발(한국공개특허 KR2006-00369711)이 이루어졌으며, 향후 성게류, 갯지렁이류, 갈치, 오징어등의 주요 수산물에 대한 생물 바코드를 응용한 DNA 칩을 개발하여 종판별 표준 시스템을 확립할 계획으로 알려져 있다. 이외 동물의 종 판별에 관한 기술로는 당귀(Angelica speices)의 종간 유전자 판별(한국공개특허 KR2005-005866), 녹용의 종간 유전자 판별(한국공개특허 KR2005-0080659) 등에 대한 기술이 특허출원되어 있다.

이에, 본 발명자들은 상기의 연구기조에 부응하여 조류의 생물 바코드를 개발하고자 미토콘드리아 COI 유전자 부위에서 생물 바코드로 이용가능한 단편의 DNA 마커를 얻고, 이를 프로브로서 DNA 칩 상에 고정하여 조류의 게놈과의 혼성화 방법을 수행한 결과, 조류 종의 판별에 효과적이라는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 조류 종 판별용 프로브를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로브가 기질상에 고정되어 있는 조류 종 판별용 DNA 칩을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로브를 포함하는 조류 종 판별용 키트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 19의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드로 구성된 그룹 중에서 선택되는 조류 종 판별용 프로브를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프로브가 기질 상에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 조류 종 판별용 DNA 칩을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프로브를 포함하는 조류 종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 조류 종 판별용 프로브 및 상기 프로브가 고정되어 있는 DNA칩은 많은 수의 조류 종을 간단하고 신속하며 정확하게 판별할 수 있는 편리함을 제공하며, 조류 독감의 매개체를 분석하거나, 철새의 이동경로 추적 또는 항공기 조류 충돌 사고를 예방하기 위한 대책을 마련하는데 유용하다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 19의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드로 구성된 그룹 중에서 선택되는 조류 종 판별용 프로브에 관한 것이다.

본 발명의 프로브는 가창오리, 큰기러기, 쏙독새, 붉은어깨도요, 검은댕기해오라기, 왜가리, 중대백로, 중백로, 황로, 멧비둘기, 까치, 큰부리까마귀, 아비, 참새, 직박구리, 떼까마귀, 꿩, 독수리를 포함하는 조류의 종 판별에 사용할 수 있다.

위의 종을 포함하는 105종의 국내 서식 조류 종(첨부1)의 조직으로부터 DNA를 추출하고, 미토콘드리아 COI 유전자의 염기서열 분석을 통하여, 18개의 종 특이적인 염기서열을 선별하였으며, 상기 염기서열에 특이적으로 반응하는 형광 표지된 조류의 종 판별용 프로브를 제조하였다.

본 명세서의 '프로브'는 검출하고자 하는 표적 염기 서열과 충분히 상보적이어서 혼성화하는 염기 서열을 갖는 단일 가닥에 특이적인 올리고뉴클레오타이드를 가리킨다.

본 명세서의 '올리고뉴클레오타이드'는 일반적으로 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 고분자를 의미한다. 그러나, 뉴클레오타이드의 길이는 100개 이상이거나 10개 이하일 수 있다.

'뉴클레오타이드'는 포스페이트 그룹, 5-탄당 및 질소 염기로 구성된 핵산의 기본 단위이다. RNA에서 5-탄당은 리보스이다. DNA에서 5-탄당은 2-데옥시리보스이다. 5-뉴클레오타이드의 경우, 당은 5-탄당-2에서 하이드록실그룹(-OH)을 함유한다. 이 용어는 또한 리보스의 2 위치에 메톡시 그룹과 같이 상기 기본 단위의 유사체를 포함한다.

'혼성화'는 표적 핵산(검출하고자 하는 서열)에 상보 서열의 교잡(annealing)을 의미한다. 상보 서열을 포함한 두 핵산 고분자가 서로를 발견하고 염기 쌍 상호작용을 통해 교잡하는 능력은 잘 알려진 현상이다.

'하이브리드'는 상보적인 염기사이의 왓슨-크릭 염기 쌍 또는 비표준 염기 쌍에 의해 두 개의 단일가닥 뉴클레오타이드 서열 사이에 형성된 복합체이다.

'표지'는 검출가능한 (바람직하게는 정량가능한) 시그날을 제공하고 핵산에 결합될 수 있는 모든 원자 또는 분자를 가리킨다. 표지는 형광, 방사성, 색도, X-선 회절 또는 흡수, 마그네티즘 등에 의해 검출가능한 시그날을 제공할 수 있다.

'특이성'은 표적과 비표적 서열을 구분하는 능력을 기술하기 위한 프로브의 특징을 가리킨다. 이와 관련하여, 프로브가 특이적라는 것은 뉴클레오타이드 서열이 정해진 표적 서열과 혼성화하고 비표적 서열과는 실질적으로 하이브리드하지 않거나 비표적 서열과의 혼성화가 최소로 이루어진다는 것을 의미한다. 프로브 특이성은 서열 및 검정 조건에 의해 좌우된다.

본 발명의 프로브를 제조하기 위해서는, 각 프로브는 해당 조류에 대해 특이성을 가져야 하는데, 이를 위해서는 각 조류의 프로브 후보군을 선정하여 그 염기서열을 분석하고, 다중 정렬(multiple alignment)를 통해 상호 유사성을 비교하여 유사도가 가장 낮은 염기서열로 최종 선별한다.

본 발명의 프로브는 통상의 클로닝 방법(Maniatis, T., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982)을 이용하여 목적하는 서열을 클로닝하거나 시판되는 DNA 합성기를 이용하여 화학적으로 합성하여 다량으로 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 어떠한 통상의 표지, 예를 들면 ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I, ³H 및 ¹⁴C와 같은 방사성 동위원소, 면역 특성을 갖는 잔기(예, 항원 또는 합텐), 일부 시약에 대해 특이적 친화성을 갖는 잔기(예, 리간드), 검출가능한 효소 반응을 제공한 잔기(예, 효소, 보조효소, 효소 기질 또는 효소 반응에 참여하는 기질) 또는 어떤 파장에서 형광, 발광 또는 흡광의 물리적 특성을 제공하는 잔기 등을 포함하는 비방사성 물질로 표지될 수 있다.

본 발명의 프로브는 조류 종의 판별을 위한 시험을 하는데 있어서 공지된 모든 혼성화 기술, 예를 들면 도트-블롯(Dotblot: Maniatis, et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982), 써던 블롯(Southern Blot: Southern, E.M. et al., J. Mol. Biol. 98:503, 1975) , 샌드위치 혼성화, 경쟁 혼성화, 역혼성화 등에 이용될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 서열번호 1 내지 19 중 하나 이상의 프로브가 기질 상에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 조류 종 판별용 DNA 칩에 관한 것이다.

본 발명의 프로브를 알데히드-아민 결합으로 슬라이드 글라스 상에 고정하여 조류 종 판별용 DNA 칩을 제조하였다.

본 발명의 DNA 칩은 가창오리, 큰기러기, 쏙독새, 붉은어깨도요, 검은댕기해오라기, 왜가리, 중대백로, 중백로, 황로, 멧비둘기, 까치, 큰부리까마귀, 아비, 참새, 직박구리, 떼까마귀, 꿩, 독수리를 포함하는 조류의 종 판별에 사용할 수 있다.

본 발명의 종 판별용 프로브 및 상기 프로브가 집적된 DNA 칩의 특이성을 검증하기 위하여, 조류의 조직에서 DNA를 분리하고, 이를 주형으로 PCR을 수행한 다음, PCR 산물을 DNA 칩과 혼성화시켜 얻어진 형광 판독결과로서, 상기 DNA 칩이 조류 종 판별에 효과적임을 확인하였다. 또한, 프로브의 서열에 15개의 올리고 dT를 부가하여 합성함으로써 시그널을 증가시키고 혼성화 오류로 인한 노이즈를 최소화 함으로써 종특이적인 검출결과의 신뢰도가 보다 높아짐을 확인하였다.

본 발명의 DNA칩은 서열번호 1 내지 19의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 기질 상에 포함할 수 있으며, 모두를 포함할 수 있으며, 아울러 서열번호 20의 염기서열로 나타내는 위치마커(position marker)를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조류 종 판별용 DNA칩은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 프로브가 고체 지지체에 단일의 또는 여러 가지 올리고뉴클레오타이드 프로브가 고밀도로 집적된 것으로서, 기판에 고정된 DNA와 이에 상보적인 미지의 DNA 시료 사이의 혼성화에 의해 미지 시료의 DNA를 검출 또는 판독하는데 사용한다. 프로브를 고정시킬 기판은 유리, 실리콘 등과 같은 무기질이나, 아크릴계, 폴리에틸렌 테리프탈레이트(polyethylene terephtalate, PET), 폴리스틸렌 (polystylene), 플로카보네이트 (polycarbonate), 폴리프로필렌 (polypropylene) 등과 같은 고분자 물질로 이루어지고, 기판의 표면은 편평하거나 다수 개의 구성(hole)이있는 것으로 사용할 수 있다. 프로브의 고정은 5' 또는 3' 중 어느 한 위치가 기판에 공유결합으로 고정된다. 고정화 방법은 통상의 기술로서, 예를 들면 정전기적 힘을 이용하거나, 합성된 올리상에 아민기를 붙여 알데하이드 코팅된 슬라이에 붙여 이 둘간의 결합을 유도하거나, 아민기 코팅된 슬라이드 상에 혹은 L-라이신이 코팅된 슬라이드 상에 혹은 니트로셀룰로즈 막이 코팅된 슬라이드 상에 집적함으로써 이루어질 수 있다.

기판 표면에 각기 다른 프로브들을 고정, 배열하는 것은 핀 마이크로어레이, 잉크젯, 포토리소그래피, 전기적 어레이 등의 방법을 사용할 수 있다.

생존 유기체로부터 유래된 세포 또는 유기체 자체를 검출하기 위해 필요한 경우 이들 세포를 화학적 및/또는 물리적 방법으로 부분적으로 또는 완전히 용해시켜 그들 세포의 RNA 및/또는 DNA에 접근이 용이하게 만들고, 본 발명의 프로브와 접촉시킨다. 접촉은 액체 매질 또는 용액 중에서 니트로셀룰로즈, 셀룰로즈 또는 나일론 필터와 같은 적절한 지지체 상에서 수행할 수 있다.

조류의 종 판별을 위해서는 조류로부터 유래된 조직 또는 세포에서 뉴클레오타이드를 추출한다. 뉴클레오타이드는 표준 기술 또는 시판되고 있는 키트를 사용하여 다양한 시료로부터 추출할 수 있다. 뉴클레오타이드는 음파분쇄(US 5,374,522), 효소분해, 삼투압 쇼크, 화학처리 및 유리비드와의 와동으로 세포로부터 추출할 수 있다. 세포에서 뉴클레오타이드가 방출되면 방출 후 또는 방출과 동시에 표지된 프로브와 혼성화 촉진제의 존재하에 혼합되어 최적의 혼성화 온도에서 유의적인 혼성화 반응에 도달하는데 필요한 시간 동안 반응시킬 수 있다.

표적 핵산이 이본쇄인 경우에는 검출 과정을 이행하기 이전에 변성을 실시하는 것이 바람직하다. 이본쇄 핵산의 변성은 화학적, 물리적 또는 효소적 변성의 공지 방법, 특히 적절한 온도, 80℃ 이상의 온도로 가열함으로써 수행할 수 있다.

또한, 프로브와 혼성화 반응을 하는 표적 DNA는 보통 두 종류의 방법으로 준비될 수 있다. 첫째는, 서던 블럿 또는 노던 블럿시 사용되는 방법으로, 게놈 DNA 혹은 플라스미드 DNA를 적당한 제한효소로 자른 후 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동을 하여 크기별로 DNA 조각을 분리하여 사용한다. 둘째는, 전방향과 역방향의 프라이머 쌍을 사용한 PCR 방법을 이용하여 원하는 부분의 DNA를 증폭시켜 사용하는 방법이다.

혼성화 기술은 본 발명에서 특정적인 것이 아니다. 이 기술은 일반적으로 문헌(Gall and Pardue, Proc . Natl . Acad . Sci ., U.S.A., 63:378, 1969, John, Burnsteil and Jones, Nature, 223:582, 1969)에 기술되어 있다.

당업자는 프로브와 표적 사이에 형성된 하이브리드의 열 안정성에 영향을 미치는 인자들 또한 프로브 특이성에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 프로브와 표적의 하이브리드의 융점 온도를 포함하여 융점 프로필이 각각의 프로브와 표적의 하이브리드에 대해 경험적으로 결정되어야 한다. 이러한 결정은 Arnold 등의 미국특허 5,283,174호에 기술된 방법에 따라 수행할 수 있다. 프로브와 표적의 하이브리드의 융점 온도를 결정하는 한 가지 방법은 혼성화 보호 검정을 수행하는 것으로 포함한다. 다른 방도로서, 프로브와 표적의 하이브리드에 대한 융점 온도는 방사성 동위원소로 표지된 프로브를 이용하여 결정할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 서열번호 1 내지 19 중 하나 이상의 프로브를 포함하는 조류 종 판별용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 프로브는 본 발명에서 목적하는 조류의 종판별의 존재 여부를 신속히 결정하는데 사용할 수 있는 키트에 포함될 수 있다. 키트는 조류의 종판별에 필요한 모든 구성요소를 포함한다. 통상의 개념으로, 키트는 표지된 프로브의 안정화 제제, 표적과 프로브 뉴클레오타이즈의 혼성화를 유도하기 위한 무수 또는 액상의 혼성화액, 세척용 버퍼, 표지된 하이브리드를 검출하기 위한 기질 및 임의의 표지를 검출하기 위한 기기를 포함한다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실 시 예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 종 판별용 프로브의 제조

가창오리, 큰기러기, 쏙독새, 붉은어깨도요, 검은댕기해오라기, 왜가리, 중대백로, 중백로, 황로, 멧비둘기, 까치, 큰부리까마귀, 아비, 참새, 직박구리, 떼까마귀, 꿩, 독수리를 포함하는 조류의 조직으로부터 추출한 DNA를 주형으로 PCR을 수행하기 위하여, 표 1의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 제조하였다.

서열번호	프라이머	Cy3 labeling	염기서열(5‘->3’)
21	BirdF1	X	TTCTCCAACCACAAAGACATTGGCAC
22	BirdR1	O	ACGTGGGAGATAATTCCAAATCCTG
23	BirdR2	O	ACTACATGTGAGATGATTCCGAATCCAG
24	BirdF4	X	AACCAACCACAAAGACATTGG
25	BirdR4	O	CCATGTAGCCGAATGGTTCT

가창오리, 큰기러기, 쏙독새, 붉은어깨도요, 검은댕기해오라기, 왜가리, 중대백로, 중백로, 황로, 멧비둘기, 까치, 큰부리까마귀, 아비, 참새, 직박구리, 떼까마귀, 꿩, 독수리를 포함하는 105종의 조류의 미토콘드리아 COI 유전자의 염기서열 중, 가장 변이가 적은 공통서열(consensus) 부분을 바탕으로 상기 프라이머의 서열을 결정하였으며, Cy3(Molecular Probe, USA)를 reverse primer에(5’-말단에) 부착하여 판독이 용이하도록 하였다. 제조된 프라이머를 사용하여, 표 2의 조건에서 Enzynomics Premix(제노텍, 한국)를 사용하여 PCR을 수행하고, 염기서열 분석을 통하여 각 조류의 미토콘드리아 COI 유전자 염기서열을 얻었다 (도 1).

반응조성	반응양	반응온도	반응시간	cycle 수
genomic DNA	4	95℃	5분	1
Forward primer (10pmol)	0.5	95℃	30초	39
Reverse primer (10pmol)	0.5	52℃	30초
2X Premix	10	72℃	30초
멸균증류수	5	72℃	7분	1

각 조류의 미토콘드리아 COI 유전자 서열의 다중 비교를 통해 가장 상동성이 낮은 염기서열 부위를 바탕으로 가창오리, 큰기러기, 쏙독새, 붉은 어깨도요, 검은댕기 해오라기, 왜가리, 중대백로, 중백로, 황로, 멧비둘기, 까치, 큰부리까마귀, 아비, 참새, 직박구리, 떼까마귀, 꿩, 독수리등을 포함하는 18종의 조류에 특이적인 프로브의 염기서열을 결정하였으며, 프로브 5’말단에 아미노 링크를 수식하였고, 혼성화 반응 시 슬라이드 글라스 위에 집적되어 있는 프로브 간의 공간적인 방해를 최소화하기 위해서 15개의 올리고 dT를 부가하여 최종적으로 20개의 프로브를 합성하였다(표 3). 상기 과정으로 제조된 아미노 링크를 함유하는 프로브는 알데하이드 작용기가 처리되어 있는 DNA 칩의 슬라이드(CEL Associates, 미국)와 공유결합을 형성하여 칩 상에 집적하는데 용이하게 사용할 수 있다.

서열번호	No	sequence (5'→3')	Tm (℃)	CG ratio (%)
1	1_2	TTCCTTCTACTACTCGCCTCATC	53.41	47.82
2	4_2	CTCCATTCTTGGAGCCATCAACT	58.13	47.82
3	6_2	CTCCTCTCCCTCCCCGTTTTAGC	62.07	60.86
4	10_4	CCGTCTTAATCACTGCCGT	52.28	52.63
5	11_2	CATCATTCATACTTCTTCTAGCC	54.56	30.43
6	12_2	TACCGCTGTCTTACTCTTACTCT	48.86	43.47
7	13_2	AGGTGTATCTTCCATTCTAGGGG	54.25	47.82
8	14_1	CATCATTTATACTCCTACTAGCC	60.23	56.52
9	15_4	TTTTCTCTCCACCTCGCTGGTAT	57.85	47.82
10	17_3	ATTTTCTCACTACATCTAGCAGGT	56.90	52.17
11	17_5	TCCTGTCCTTGCTGCTGGAATTA	59.57	47.82
12	18_2	AGTACTGCTTCTTCTCTCCCTAC	49.65	47.82
13	19_2	ACTACTGCTCCTGTCGCTACCCG	60.48	60.86
14	20_2	ACTAACCGATCGCAATCTAAACA	54.53	39.13
15	23_2	TCCTCTCACTCCCAGTTCTCGCT	60.19	56.52
16	28_1	TGCATCTGGCAGGTATCTACTCT	54.46	47.82
17	30_1	ACTTTCTTTACCCGTTCTAGCCG	56.83	47.82
18	31_2	CCACCTGCCCTTTCTCAAT	53.63	52.63
19	32_1	TGTCATTACCCGTACTAGCCGCT	58.64	52.17
20	PM	CATCCCCCTGGGACTGGAGT	59.42	65.0

실시예 2: 조류 종 판별용 DNA 칩의 제작

DNA 칩(Metabion, 독일)을 제작하기 위하여, 우선 칩의 기판으로 사용된 슬라이드 상의 각 도트에 하나의 프로브만이 함유되도록 집적하고, 사방 4개의 도트에는 위치 마커의 프로브를 집적하여 형광스캔 결과와 비교분석하는데 사용할 수 있도록 구성하였다 (도 2). 실시예 1에서 제조된 아미노 링크가 수식되어 있는 조류 종 판별용 프로브 50 μM을 동일한 양의 스포팅 버퍼(6X SSC, 1 M Betaine)와 혼합하여 VSS-25 Silyated 슬라이드(CEL Associates, 미국)상에 집적하여 이를 16시간 동안 실온에서 방치하였다. 이 후, 결합하지 않은 프로브는 0.1% SDS에서 5분간 슬라이드를 처리하여 증류수에서 5분간 2회 세척하여 제거하고, 세척한 슬라이드에 소디움 보로하이드라이드 용액(NaBH₄0.625 g : PBS 187.5 ml : Ethanol 62.5 ml)를 5분간 처리한 뒤, 증류수로 5분간 2회 세척하였다. 마지막으로 800 rpm에서 슬라이드를 회전건조시킨 후 상온에서 보관하였다.

실시예 3: DNA 칩을 사용한 종 판별 시험

가창오리, 큰기러기, 쏙독새, 붉은어깨도요, 검은댕기해오라기, 왜가리, 중대백로, 중백로, 황로, 멧비둘기, 까치, 큰부리까마귀, 아비, 참새, 직박구리, 떼까마귀, 꿩, 독수리를 포함하는 조류의 미토콘드리아 COI 유전자에 대한 실시예 1에서 수득된 PCR 산물을 각각 10 ㎕를 취하여 99℃에서 3분간 변성시키고, 90 ㎕의 혼성화 버퍼(3X SSC, 0.3% sarcosyl)와 혼합하여 실시예 2에서 제작된 DNA 칩에 도포하고, 55℃의 습윤 반응기에서 1 시간 동안 혼성화 반응이 일어나도록 하였다. 혼성화 반응이 종료되면 슬라이드를 250 ml의 1X SSC(150mM NaCl, 15mM sodium citrate)와 0.1% sarcosyl의 혼합용액에서 5분간, 다음엔 1X SSC에서 5분간, 그리고 마지막으로 0.1X SSC에서 1분간 교반 세척하고, 800 rpm에서 슬라이드를 5분간 회전건조시켰다. 혼성화 결과는 GenePix 4000B 스캐너(Molecular Device, USA)에서 PMT 게인은 600, 레이져 출력은 100% 및 픽셀 크기는 5의 조건에서 Cy3 형광값을 측정하여 분석하였다.

그 결과, 조류의 종에 따라 칩 상에 나타난 Cy3 형광의 분포가 다르게 나타남을 확인하였으며, 각 조류 종에 대한 형광결과를 분석한 결과, 종 사이의 판별력이 있음을 확인하였다 (도 3 및 표 4).

프로브

가 창 오 리

큰기러기

쏙 독 새

붉 은 어 깨 도 요

검 은 댕 기 해 오 라 기

왜 가 리

중 대 백 로

중 백 로

황 로

멧 비 둘 기

까 치

큰 부 리 까 마 귀

아 비

참 새

직 박 구 리

떼 까 마 귀

꿩

독 수 리

1_2

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4_2

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6_2

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9_2

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10_4

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20_2

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23_2

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28_1

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*signal intensity>1000 인 경우 ● 로 표시

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의한 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 조류의 mtDNA를 포함하는 벡터의 유전자 지도이다.

도 2는 본 발명에 따른 조류 종 판별용 DNA 칩의 구성도이다.

도 3은 본 발명에 따른 조류 종 판별용 DNA 칩을 이용하여 특정 조류의 종을 판별하는 형광 스캔 결과이다.

도 4는 국내 서식 조류종의 리스트이다.

<110> Korea research institute of bioscience and biotechnology <120> Probe and DNA Chip for Identifying Avian Species <130> p07-b252 <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1_2 probe <400> 1 ttccttctac tactcgcctc atc 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4_2 probe <400> 2 ctccattctt ggagccatca act 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6_2 probe <400> 3 ctcctctccc tccccgtttt agc 23 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10_4 probe <400> 4 ccgtcttaat cactgccgt 19 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11_2 probe <400> 5 catcattcat acttcttcta gcc 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12_2 probe <400> 6 taccgctgtc ttactcttac tct 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13_2 probe <400> 7 aggtgtatct tccattctag ggg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14_1 probe <400> 8 catcatttat actcctacta gcc 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 15_4 probe <400> 9 ttttctctcc acctcgctgg tat 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 17_3 probe <400> 10 attttctcac tacatctagc aggt 24 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 17_5 probe <400> 11 tcctgtcctt gctgctggaa tta 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18_2 probe <400> 12 agtactgctt cttctctccc tac 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 19_2 probe <400> 13 actactgctc ctgtcgctac ccg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20_2 probe <400> 14 actaaccgat cgcaatctaa aca 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 23_2 probe <400> 15 tcctctcact cccagttctc gct 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 28_1 probe <400> 16 tgcatctggc aggtatctac tct 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 30_1 probe <400> 17 actttcttta cccgttctag ccg 23 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 31_2 probe <400> 18 ccacctgccc tttctcaat 19 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32_1 probe <400> 19 tgtcattacc cgtactagcc gct 23 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PM probe <400> 20 catccccctg ggactggagt 20 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BirdF1 primer <400> 21 ttctccaacc acaaagacat tggcac 26 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BirdR1 primer <400> 22 acgtgggaga taattccaaa tcctg 25 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BirdR2 primer <400> 23 actacatgtg agatgattcc gaatccag 28 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BirdF4 primer <400> 24 aaccaaccac aaagacattg g 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BirdR4 primer <400> 25 ccatgtagcc gaatggttct 20

Claims

서열번호 1 내지 19의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오타이드로 구성된 그룹 중에서 선택되는 조류 종 판별용 프로브.
제1항에 있어서, 조류는 가창오리, 큰기러기, 쏙독새, 붉은어깨도요, 검은댕기해오라기, 왜가리, 중대백로, 중백로, 황로, 멧비둘기, 까치, 큰부리까마귀, 아비, 참새, 직박구리, 떼까마귀, 꿩, 독수리로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조류 종 판별용 프로브.
제1항의 프로브가 기질 상에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 조류 종 판별용 DNA 칩.
제3항에 있어서, 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 위치 마커(position marker)가 추가로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 조류 종 판별용 DNA 칩.
제3항 또는 제4항에 있어서, 서열번호 1 내지 19의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오타이드가 모두 고정되어 있는 조류 종 판별용 DNA 칩.
제3항 또는 제4항에 있어서, 조류는 가창오리, 큰기러기, 쏙독새, 붉은어깨도요, 검은댕기해오라기, 왜가리, 중대백로, 중백로, 황로, 멧비둘기, 까치, 큰부리까마귀, 아비, 참새, 직박구리, 떼까마귀, 꿩, 독수리로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조류 종 판별용 DNA 칩.
제1항의 프로브를 함유하는 조류 종 판별용 키트.
제7항에 있어서, 조류는 가창오리, 큰기러기, 쏙독새, 붉은어깨도요, 검은댕기해오라기, 왜가리, 중대백로, 중백로, 황로, 멧비둘기, 까치, 큰부리까마귀, 아비, 참새, 직박구리, 떼까마귀, 꿩, 독수리로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조류 종 판별용 키트.