CN1653191A - 靶核酸的检测方法 - Google Patents

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Abstract

按照下述步骤检测样品中具有靶序列的靶核酸：(a)将样品与第一探针和第二探针在允许第一探针与第二探针以及第一探针与靶核酸退火的条件下混合，其中第一探针包括的核酸具有一个其序列与如上所述的靶序列互补的特异性区和一个其序列与所述靶序列不互补的非特异性区；而第二探针包括的核酸具有至少与第一探针的非特异性区部分互补的第一区、其序列与第一探针不互补的环状区和至少与第一探针的特异性区部分互补的第二区，所述环状区当第二探针与第一探针退火时能形成一个环，其中所述核酸用标记物质标记，所述标记物质使得能够检测出以上所形成的环；和(b)检测由第一探针和第二探针所形成的所述环。

Description

靶核酸的检测方法
技术领域
本发明涉及检测样品中具有靶序列的靶核酸的方法和试剂盒。本发明的方法和试剂盒使得靶核酸可以实时检测，并且可用于生物化学等领域。
背景技术
已用于检测样品中具有靶序列的靶核酸的方法包括其中使用探针的杂交法、其中使用寡核苷酸引物的PCR法和其它方法。此外，PCR法一般用于包括靶核酸检测和克隆在内的各个领域，并且已开发出各种改进方法。
所谓实时PCR已知是靶序列扩增及其扩增产物分析同时进行的PCR法。扩增产物的分析手段已知包括例如Taq-Man探针法(US5,210,015A、JP 06-500021 A和Holland等，Pro.Natl.Aca.Sci.USA.，88，7276-7280，1991)、分子信标法(molecular beacon method)(JP 05-123195A，Sanjay Tyagi等，Nature Biotechnology，第14卷，1996年3月)、嵌入剂法(interealator method)(Bio/Technology，10，413-417，1992，Bio/Technology，11，1026-1030，1993，和JP 05-237000A)等。
在Taq-Man探针法中，使用荧光物质和用猝灭剂标记的探针，猝灭剂猝灭由荧光物质发射的荧光。当探针与靶核酸杂交时，猝灭剂猝灭荧光，而当探针被PCR扩增反应中所用的5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶切割，结果是荧光物质因与猝灭剂分离而发射荧光。根据这种荧光，即可获知双链DNA分子的含量。
此外，分子信标法是使用探针的方法，该探针包括一段与靶序列互补的序列和所述序列两端彼此互补的臂、以及与其两端键合的荧光物质和猝灭剂。当探针退火至靶核酸时，荧光物质发射荧光，而当探针与靶核酸分离时，探针形成臂，结果是荧光物质和猝灭剂彼此靠得较近，引起猝灭。
另一方面，嵌入剂法是使用诸如溴化乙锭等嵌入剂检测双链DNA的方法。
如上所述，虽然已经知道实时定量检测PCR扩增产物的方法，但是还存在一些问题：Taq-Man探针法不能在使用没有5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶扩增方法的情况下使用；分子信标法在设计探针上有困难而且因为分子间键使检测效果差；而嵌入剂法没有序列特异性。
发明内容
本发明是根据上述观点提出来的，本发明的目的是提供一种用于简便地实时定量检测靶核酸的方法和试剂盒，且无需使用具有5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶。
本发明的发明人已经进行了深入的研究，以便达到上述目的，结果，他们发现了使用两种不同长度的探针能简便地定量检测靶核酸，因而完成了本发明。
也就是说，本发明涉及：
(1)一种用于检测样品中具有靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)将第一探针、第二探针和样品在其中第一探针和第二探针退火以及第一探针和靶核酸退火的条件下混合，其中第一探针包括的核酸具有一个其序列与所述靶序列互补的特异性区和一个其序列与所述靶核酸的靶序列不互补的非特异性区；而第二探针包括的核酸具有至少与第一探针的非特异性区部分互补的第一区、其序列与第一探针不互补的环状区和至少与第一探针的特异性区部分互补的第二区，所述环状区当第二探针与第一探针退火时能形成一个环，其中所述核酸用标记物质标记，所述标记物质产生可以检测出上述环形成的信号；和
(b)检测所述标记物质的信号。
(2)项(1)的方法，其中第二探针的第二区要比第一探针的特异性区短。
(3)项(1)或(2)的方法，其中所述标记物质包括荧光物质和猝灭剂，所述猝灭剂当靠近荧光物质并排列成将所述环状区夹在其中时，能猝灭所述荧光物质的荧光，其中当第一探针和第二探针退火形成所述环时，所述荧光物质的荧光被猝灭剂猝灭，而当第一探针和第二探针没有退火时与所述探针退火时相比则所述荧光物质的荧光未被猝灭。
(4)项(1)-(3)中任一项的方法，其中对所述信号进行定量检测，从而定量检测所述靶核酸。
(5)一种用于检测样品中具有靶序列的靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含第一探针和第二探针，其中第一探针包括的核酸具有一个其序列与所述靶序列互补的特异性区和一个其序列与所述靶核酸的靶序列不互补的非特异性区；而第二探针包括的核酸具有至少与第一探针的非特异性区部分互补的第一区、其序列与第一探针不互补的环状区和至少与第一探针的特异性区部分互补的第二区，所述环状区当第二探针与第一探针退火时能形成一个环，其中所述核酸用标记物质标记，所述标记物质产生可以检测出上述环形成的信号。
附图简述
图1是说明本发明构思的示意图，其中F表示荧光物质，而Q表示猝灭剂。
图2图示反应混合物(未经加热处理)的荧光强度随时间的变化，其中
实线：探针1+探针2+靶寡核苷酸
虚线：探针1+探针2
长短交替的虚线：探针2。
图3图示反应混合物(经加热处理)的荧光强度随时间的变化。
实施本发明的最佳方式
在下文，将详细地描述本发明。
本发明的方法是用于检测样品中具有靶序列的靶核酸的方法。所述靶核酸并无具体限制，只要具有所述靶序列即可；它可以是DNA或RNA，它可以是单链或双链。本发明最好应用于特别是双链DNA的检测。在本发明的优选模式中，所述靶核酸是定量检测的。注意到定量检测包括核酸绝对量的检测以及核酸相对量的检测。
所述靶序列通常是特异性针对所述靶核酸的序列，所述靶序列在序列和长度上并无具体限制，只要它可与探针形成特异性杂交即可，所述探针具有与所述靶序列互补的序列。所述靶序列的长度最好是不少于6个碱基，更优选不少于15个碱基。
含有所述靶核酸的样品并无具体限制，它们包含从细胞或组织提取的核酸或核酸混合物，PCR核酸扩增反应混合物采用这样的核酸或核酸混合物作为模板。
在本发明中，在检测所述靶核酸中使用了两种探针(参见图1)。第一探针(在下文也称为“探针1”)包括的核酸具有一个其序列与所述靶序列互补的特异性区和一个其序列与所述靶核酸的靶序列不互补的非特异性区(图1A)。因为具有这样的结构，当探针1与所述靶核酸杂交时，所述非特异性区仍然保持为单链并形成一个瓣(flap)(图1B)。所述非特异性区的长度优选不少于10个碱基，更优选10-30个碱基。
第二探针(在下文也称为“探针2”)包含的核酸具有至少与上述探针1的非特异性区部分互补的第一区、其序列与探针1不互补的环状区和至少与探针1的特异性区部分互补的第二区，所述环状区当第二探针与第一探针退火时能形成一个环，所述核酸用标记物质标记，所述标记物质产生可以检测出上述环形成的信号(图1A)。
注意到图1显示探针1和探针2的实例，所述探针1在其5’端具有特异性区而在其3’端具有非特异性区，而探针2自其5’端起依次具有第一区、环状区和第二区。在本发明中，探针1在其3’端可具有特异性区而在其5’端可具有非特异性区，而探针2自其3’端起依次可具有第一区、环状区和第二区。
第一区具有至少与探针1的非特异性区部分互补的序列，优选具有与整个非特异性区互补的序列。另一方面，第二区具有至少与探针1的特异性区部分互补的序列，优选比所述特异性区短。通过使第二区比所述特异性区更短，探针1与探针2相比可以优先与所述靶核酸退火。优选第二区的长度不少于6个碱基，更优选6-20个碱基。或者，优选第二区比所述特异性区短1个或更多碱基，更优选短4个或更多碱基。
所述环状区是没有与探针1互补的序列的区，优选它没有与所述靶核酸互补的序列。当探针2与探针1键合时，所述环状区形成一个环中的突出部分，但当探针2和探针1彼此分开时，所述环结构消失(图1C)。探针2用标记物质标记，所述标记物质产生可以检测出环形成的信号。所述标记物质具体包括例如能量供体和能量受体，它们排列成将所述环状区夹在其中。所述能量供体和能量受体包括例如荧光物质和猝灭剂，所述猝灭剂能猝灭荧光物质所产生的荧光。当所述猝灭剂靠近荧光物质时猝灭荧光，但当荧光物质和猝灭剂之间的距离等于或大于某一距离时，它将不再猝灭荧光。有了这样的荧光物质和猝灭剂，当探针1和探针2退火形成环时，荧光物质的荧光被猝灭剂猝灭，而当探针1和探针2没有退火时，荧光未被猝灭。因此，通过测定荧光物质的荧光，则可以测定环的形成，也就是说，探针1和探针2处于杂交状态。荧光物质的实例包括荧光素染料，例如荧光素和异硫氰酸荧光素(FITC)，而猝灭剂的实例包括罗丹明染料，例如四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)和磺基罗丹明101单磺酰氯衍生物(商品名：Texas Red)。其中，一种优选的组合是FITC和Texas Red。这些标记物质可以通过采用具有与这些标记物质键合的寡核苷酸进行探针2的化学合成，以引入到所述序列的任何所需部分。任何所述荧光物质和猝灭剂都可以在5’端。
所述环状区的序列和长度并无具体限制，只要当探针1和探针2退火时形成环状结构，且在所述环结构形成和消失的情况下有来自标记物质的信号不同即可。注意到优选的所述环状区是所述环状区既不与探针2的第一区和第二区形成部分双链，也不在环状区内形成部分双链。所述环状区的长度优选大于10个碱基，更优选大于20个碱基。所述标记物质最好键合到所述环状区两端的3个碱基内的部分，更优选键合到末端碱基上。
将上述探针1、探针2和样品在探针1和探针2退火以及探针1和靶核酸退火的条件下混合。然而，根据所述探针的上述结构，探针1比探针2优先与靶核酸退火。混合顺序不是特别的问题；例如，将探针1和探针2混合，然后加入样品。此外，可提前制备探针1和探针2的预混合物。此外，优选将不含有探针1和/或样品的反应混合物用作对照。
优选将探针1和探针2以摩尔比为1∶1混合。优选探针1和探针2各自在反应混合物中的终浓度不小于0.1μM。
当将探针1、探针2和样品混合后，或者可以将所述混合物本身暴露在其中探针1和探针2退火以及探针1和靶核酸退火的条件下，或者将所述混合物经加热变性处理后暴露在上述条件下。
让上述反应混合物静置一定时间，优选在达到平衡状态后，检测所述标记物质的信号。更优选实时检测所述信号。上述条件包括例如温度比探针1和探针2的Tm低3-10℃。通过用不同温度在不同阶段进行实时信号检测，以选择能达到与对照相比的差异最显著，可以容易地测定最佳条件。在使用FITC作为荧光物质而Texas Red作为猝灭剂的情况下，通过在515nm荧光波长下检测FITC的荧光强度，进行信号检测。用市售的仪器进行荧光强度的检测。检测结果示于图2和图3。这些结果将在以下的实施例中详细说明。
通过定量检测所述标记物质的信号，可以定量检测靶核酸的含量。
本发明的试剂盒是用于检测上述靶核酸的试剂盒，并且包括探针1和探针2。每种探针可以是溶液制剂或冻干制剂。此外，每种探针可装在单独容器中，或者混装于同一容器中。本发明的试剂盒还包含用于溶解或稀释各种探针或样品的缓冲液。
本发明的方法和试剂盒最好可用于实时定量检测核酸扩增反应混合物中的扩增产物。本发明的试剂盒可包含一种用于通过核酸扩增法扩增这样的靶核酸的寡核苷酸引物。所述引物可以装在单独容器中，与装各种探针的容器分开。
实施例
在下文，将通过实施例详细地描述本发明。
合成探针1(SEQ ID NO：1)、探针2(SEQ ID NO：2)和靶寡核苷酸(SEQ ID NO：3)。每种寡核苷酸都是请求Japan Bio Service Co.，Ltd.合成的。用FITC标记探针2的碱基21的核苷酸(T)，而用Texas Red标记碱基52的核苷酸(T)。注意到所述靶寡核苷酸是人糊精基因的部分序列。
探针1的碱基1-28与所述靶寡核苷酸的碱基6-33互补。探针1的碱基11-33和碱基35-55分别与探针2的碱基52-74和碱基1-21互补。注意到SEQ ID NO：2的碱基57-74与SEQ ID NO：3的碱基6-23同源。
将每种寡核苷酸溶于TE缓冲液中至5μM。在一支1.5ml试管中加入2.2μl 10×Ex Taq缓冲液(Takara Shuzo Co.，Ltd.Lot.A6501-1)、19.8μl无菌蒸馏水和1μl探针2溶液(5μM)，将它们混合均匀，将23μl所述混合物分装到反应器(Cepheid Co.，Smart Cycler)的每个25μl管中。在每管中加入1μl探针1溶液(5M)或TE缓冲液，再加入1μl靶寡核苷酸溶液(5μM)或TE缓冲液，以得到反应混合物。该操作在室温下进行。
将上述反应混合物或在94℃下加热处理3分钟的上述反应混合物放在Smart Cycler中，将温度调节到47℃，在505-537nm的波长下测量荧光。未经加热处理的反应混合物的结果示于图1，而经加热处理的反应混合物的结果示于图2。
仅用探针2，可观察到荧光，但是在加入了探针1的情况下荧光被大量猝灭。在除了向探针2中加入探针1以外，还加入所述靶寡核苷酸的情况下，在这两种情况下观察到中等强度的荧光。无论是否经加热处理结果都相同。
如上所述，在所述靶序列存在下，观察到的荧光强度要比靶序列不存在的情况下高，这证实了探针1比探针2优先键合所述靶序列，而一部分探针2是游离的。
工业应用性
通过本发明，可以简便地实时定量检测靶核酸。本发明的方法不需要具有5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶，所以可应用于各种反应体系。
                     序列表
<110>Arkray，Inc.
<120>靶核酸的检测方法
<140>PCT/JP03/05773
<141>2002-05-08
<150>JP 2002-132995
<151>2002-05-08
<160>3
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：探针1
<400>1
aaagttgttg ctggaatgaa ctaaaaaatg gcaatattca catgtacagg actcag      56
<210>2
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：探针2
<400>2
ctgagtccag tacaactgaa taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa attgccattt 60
tttagttcat tccag                                                  75
<210>3
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：靶寡核苷酸
<400>3
ggcaaatttt ttagttcatt ccagcaacaa ctttggtgcc attctctcat            50

Claims (5)

1.一种用于检测样品中具有靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)将第一探针、第二探针和样品在其中第一探针和第二探针退火以及第一探针和靶核酸退火的条件下混合，其中第一探针包括的核酸具有一个其序列与所述靶序列互补的特异性区和一个其序列与所述靶核酸的靶序列不互补的非特异性区；而第二探针包括的核酸具有至少与第一探针的非特异性区部分互补的第一区、其序列与第一探针不互补的环状区和至少与第一探针的特异性区部分互补的第二区，所述环状区当第二探针与第一探针退火时能形成一个环，其中所述核酸用标记物质标记，所述标记物质产生可以检测出上述环形成的信号；和
(b)检测所述标记物质的信号。
2.权利要求1的方法，其中第二探针的第二区要比第一探针的特异性区短。
3.权利要求1或2的方法，其中所述标记物质包括荧光物质和猝灭剂，所述猝灭剂当靠近荧光物质并排列成将所述环状区夹在其中时，能猝灭所述荧光物质的荧光，其中当第一探针和第二探针退火形成所述环时，所述荧光物质的荧光被猝灭剂猝灭，而当第一探针和第二探针没有退火时与所述探针退火时相比则所述荧光物质的荧光未被猝灭。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中对所述信号进行定量检测，从而定量检测所述靶核酸。
5.一种用于检测样品中具有靶序列的靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含第一探针和第二探针，其中第一探针包括的核酸具有一个其序列与所述靶序列互补的特异性区和一个其序列与所述靶核酸的靶序列不互补的非特异性区；而第二探针包括的核酸具有至少与第一探针的非特异性区部分互补的第一区、其序列与第一探针不互补的环状区和至少与第一探针的特异性区部分互补的第二区，所述环状区当第二探针与第一探针退火时能形成一个环，其中所述核酸用标记物质标记，所述标记物质产生可以检测出上述环形成的信号。
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