JP2010517514A - 核酸分子の作製法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、概して、強化型固相ポリヌクレオチド増幅の後に、一本鎖核酸分子を作製する方法に関する。さらに、本発明は、固体マトリックスを、一本鎖核酸分子および二本鎖核酸分子で標識する方法を提供する。一本鎖核酸分子の作製および増幅反応の実施のためのキットも本発明の一部をなす。さらに、本発明は、レポーター分子で標識されてもよい一本鎖核酸分子を作製するための増幅系、ならびにこの一本鎖核酸分子の、特に、標識、プライマー、およびプローブとしての使用法を提供する。
本明細書におけるいかなる先行技術に対する言及も、この先行技術があらゆる国におけるありふれた一般知識の一部をなすことを認識するものでも、いかなる形で示唆するものでもなく、またそのように解釈されるべきではない。
本明細書および以下の特許請求の範囲全体を通じて、文脈によって特に必要とされない限り、単語「含む(comprise)」ならびに「含む(comprises)」または「含む(comprising)」などの語尾変化は、述べられた整数または整数もしくは工程の集まりを含むことを意味するが、他の任意の整数または整数の集まりを排除することを意味しないことが理解されるだろう。
固定化されたプライマーは、
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっている(nested)プライマー;
からなるリストより選択される、工程を含む。
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される、工程、ならびに
次いで、固定化されたポリヌクレオチドを変性条件に供して、固定化された一本鎖ポリヌクレオチドおよび液相一本鎖ポリヌクレオチドを作製する工程を含む。
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される、工程を含む。
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される、工程を含む。
本発明は、一本鎖(ss)ポリヌクレオチド、特に、固体支持体に固定化されたssDNA、または固定化された鎖(ds)ポリヌクレオチドから作製された固定化型ssDNAもしくは水性型ssDNAの作製を促進する改良された増幅反応に関する。本発明は、一部、増幅反応において、あるアニーリング条件セットでは類似のアニーリング特徴を有し(ここで、プライマーは「バランスがとれている(balanced)」とみなされ、アニーリング条件は「相互許容(mutually permissive)」とみなされる)、別のアニーリング条件セットでは、異なる、またはディファレンシャルな、または似ていないアニーリング特徴を有する(ここで、プライマーは「バランスがとれていない(unbalanced)」とみなされ、アニーリング条件は「「ディファレンシャル許容(differentially permissive)」」とみなされる)プライマーを使用することに基づいている。代わりに、もしくは加えて、水相オリゴヌクレオチドのプライミングを上回る、固体支持体プライミングの異なる速度論上の利点を可能にするプライマー設計から異なるアニーリング条件が生じる。
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される、工程を含む。
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される、工程、ならびに、次いで、固定化されたポリヌクレオチドを変性条件に供して、固定化された一本鎖ポリヌクレオチドおよび液相一本鎖ポリヌクレオチドを作製する工程を含む。
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される、工程を含む。
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される、工程を含む。
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される工程、ならびに、次いで、固定化されたポリヌクレオチドを変性条件に供して、固定化された一本鎖ポリヌクレオチドおよび液相一本鎖ポリヌクレオチドを作製する工程を含む。
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される、工程を含む。
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される工程を含む。
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される。
段階的非対称PCR法
図1(i)は、一本鎖または二本鎖アンプリコンを固体支持体にローディングするための強化型固相PCRの模式図を示す。増幅しようとするDNA領域およびこれに由来するアンプリコンを実線で示した。破線は標的領域外の配列を表す。プライマーa(矢印で示した)は「フォワード」PCRプライマーを表し、プライマーbは「リバース」プライマーを表す。この実施例では、固体支持体は円で示される。固体支持体は、多数の固体支持体プライマーコピーとコンジュゲートしているが、図を簡単にするために、固体支持体プライマーは1つしか示されていないことに留意のこと。波線は非標的特異的リンカー配列である。長く濃い矢印は、Tmが高い標的特異的プライマーを表している。プライマーbには、直接検出系において使用するための標識分子(星印で示した)、例えば、蛍光が任意で含まれる。標識分子は、任意で、反応基質、例えば、蛍光標識dNTPとして含めることができる。任意で、プライマーbは、標的配列へのプライマーbの結合およびプライマーからのポリメラーゼ伸長のプライミングが、ある特定の温度範囲においてプライマーaより効率的になるように設計される。この目的を達成する設計方法の一例には、高いアニーリング温度において、プライマーbが結合およびプライミングを行うのに対して、プライマーaは結合もプライミングも行わないように、プライマーbの標的特異的融解温度をプライマーaより高くすることが含まれる。別の例は、ある特定の温度より低い温度では、プライマーbが結合およびプライミングを行うのに対して、プライマーaは結合もプライミングも行わないように、プライマーaが「パンハンドル抑制(panhandle suppression)」を示す設計である。
固相段階的非対称PCR法
強化型固相PCR(ESP-PCR)は、欠陥のない高感度の対称性「水性」PCRと効率的な固体支持体ローディングを組み合わせるように本明細書において設計された機構である。ESP-PCRは、「水性」プライマーと固体支持体プライマーとの競合を取り除いて、固体支持体プライマーのプライミングを高めることによって、アンプリコンが固体支持体にローディングされる機構を変えている(図2)。「水性」プライマーは制限される必要はなく、そのために、より感度の高い系が可能になる。さらに、ESP-PCRに固有のプライマー設計は、固体支持体プライマーの結合のみを許容するアニーリング温度で後の熱サイクルを適用する任意の可能性をもたらす。
オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies(Coralville, USA)から購入した。テンプレート作製用オリゴヌクレオチドならびにESP-PCR用およびSP-PCR用オリゴヌクレオチドを以下に列挙した。コンジュゲーション効率測定用オリゴヌクレオチド(Transprobe)配列は、
であった。全てのオリゴヌクレオチド配列を5-プライムから3-プライムの方向に列挙した。/5Phos/、/5AmMC6/、/5Acryd/、および/iAmMC6T/は、それぞれ、5-プライムリン酸基、5-プライムアミン修飾基、5-プライムアクリダイト(acrydite)基、および内部アミン修飾基を示す。Ngo、Ngps、およびCto3は、それぞれ、淋菌(Neisseria gonorrhoea)opa、淋菌pilS、およびトラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)潜在プラスミド(cryptic plasmid)orf3を指す。下線を引いた領域は、「アンプリコンローディング」間の標的特異的部分の提示を促進するために固体支持体プライマーの5-プライム部分に含まれる非標的「リンカー」配列を示す。この「リンカー」配列はSP-PCRおよびESP-PCR固体支持体プライマーに共通にあり、コンジュゲーション後に固体支持体へのプライマーローディングを評価するためのTransprobeハイブリダイゼーション標的としても使用した。
直径6.8μmのシリカマイクロスフェア(Bangs Laboratories, Fishers, USA)をスルフヒドリル基で官能化した後に、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートした。Integrated DNA Technologiesの製品資料では、固体支持体チオールと、5-プライムアクリダイト基で修飾したオリゴヌクレオチドとの反応について詳しく述べている(ウェブサイト:
からオンラインで入手可能)。コンジュゲーションの後に、マイクロスフェアを5回一続きのスピン/洗浄工程で処理して、結合しなかったオリゴヌクレオチドを除去した後に、緩衝液で1mg/mlまで懸濁した。オリゴヌクレオチドとマイクロスフェアのコンジュゲーションのレベルは、均一なマイクロスフェア懸濁液1μlと、50mM塩化ナトリウム含有緩衝液5μlおよび10μM Alexafluor647標識Transprobe 0.5μl(2:1の総Transprobe:Alexafluor647標識Transprobe比)を混合することによって評価した。Alexafluor647は、Molecular Probes(Mount Waverley, Australia)から購入した。ハイブリダイゼーション混合物を、以下の「ハイブリダイゼーション」熱プロフィール:90℃30秒、その後に、1℃/10秒の速度で20℃までの冷却に供した。ハイブリダイゼーションの後、緩衝液120μlを添加した後に、FACSArray (Becton Dickinson, North Ryde, Australia)による分析を行った。本研究において示されたデータは、この最新式のアッセイプロトコールから得た。マイクロスフェアは、「無テンプレート対照」のバックグラウンド蛍光を弱くする目的で、テンプレートとなるESP-PCR試料またはSP-PCR試料のシグナル強度を変えることなく、PCR後にさらに厳しい洗浄に供することができる。マイクロスフェアは全く同じ3つのものを同時に、以下の電圧パラメータ: FCS 550、SSC 400、Far Red 100、Yellow 650、NIR 200、Red 700、FCS threshold 20000を用いて動作させた同じ機器で評価した。赤色蛍光の中央値を求めるために、FCS Express v.3を用いて、*.fcsファイルを解析した。ESP-PCRおよびSP-PCR標的対の間で固体支持体プライマー-マイクロスフェアのコンジュゲーションが同等であることを証明するために、スチューデントT検定を適用した。
トラコーマクラミジア血清型E DNAを、Cto3テンプレート作製用フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いたPCRのテンプレートとして使用して、ESP-PCR/SP-PCRオリゴヌクレオチド標的領域を含むアンプリコンを得た。Qiaquick(登録)ゲル抽出キット(Qiagen, Doncaster, Australia)を用いて、アンプリコンをアガロースゲルから精製した。ゲル電気泳動により産物をHyperladder IV DNA標準(Bioline, Alexandria, Australia)と照らし合わせて評価することによって、収率を見積もった。同様に、淋菌ATCC株43069をPCRのテンプレートとして使用して、Ngo標的およびNgps標的を、それぞれの標的作製用プライマーを用いて作製した。
ESP-PCRおよびSP-PCRは全て、20μl反応体積で、1ユニットのHotStarTaq(登録)(Qiagen, Doncaster, Australia)を用いて行った。Mg2+およびdNTP(New England Biolabs, Genesearch, Arundel, Australia)の反応濃度が、それぞれ、2mMおよび200μMとなるように、HotStarTaq(登録)反応緩衝液にMg2+およびdNTPを加えた。反応物には、5μM「水性」フォワードプライマー1μl、5μM「水性」リバースプライマー(2:1の総オリゴヌクレオチド:蛍光標識オリゴヌクレオチド比でAlexafluor647標識した)1μl、および1mg/ml固体支持体プライマーコンジュゲートマイクロスフェア懸濁液1μlを含めた。SP-PCR固体支持体プライマーにコンジュゲートしたマイクロスフェアまたはESP-PCR固体支持体プライマーにコンジュゲートしたマイクロスフェアを、それぞれ、SP-PCR反応物またはESP-PCR反応物に含めた。ESP-PCRおよびSP-PCRは全く同じ3つのものを同時に、同じマスター混合物を用いて行った。それぞれの場合で、プライマーおよびマイクロスフェアは標的およびテンプレートに従ってグループ分けした。反応物は、それぞれ、40000コピーのCto3テンプレート、40000コピーのNgoテンプレート、または400000コピーのNgpsテンプレートを含んだ。使用した熱プロフィールは以下の通りであった:94℃15分、その後に、30サイクルの[90℃30秒、44℃1分、72℃1分]、その後に、5サイクルの[90℃、44℃2分、72℃2分]。
固相PCRの後に、底部5μlを、96ウェルマイクロタイタープレートの中の緩衝液120μlに移した。前記の同じ機器設定を用いて、FACSArrayにより*.fcsファイルを作成した。FCS Express v.3を用いて、赤色蛍光の中央値を求めた。
フローサイトメトリーサンプリングの後に、3%アガロース/TAEゲルを用いて、残りのPCR産物8μlを1.5μg New England Biolabs 100bpラダー(Genesearch, Arundel, Australia)と照らし合わせて分析した。
前記で列挙したNgo ESP-PCR固体支持体プライマーおよびCto3 ESP-PCR固体支持体プライマーを、それぞれ、直径5.6μmおよび直径6.8μmのシリカマイクロスフェア(Bangs Laboratories)にコンジュゲートし、洗浄し、ビーズ1集団あたり1mg/mlでプールした。プールしたビーズ懸濁液1μlを、淋菌opaプライマー:5'-GGCAACGMCGTACCGGTTT-3'(SEQ ID NO:20)および5-プライマーAlexafluor647標識
およびトラコーマクラミジア潜在プラスミドorf3プライマー:
および5-プライムAlexafluor647標識
を含むESP-PCR反応物に含めた。淋菌ATCC株43069のゲノムDNAまたは前記で列挙した(テンプレート作製を参照されたい)トラコーマクラミジア潜在プラスミドorf3にまたがるアンプリコン領域を保有するプラスミドをJurkatヒトゲノムDNA 5ngと含めて、ヒトゲノムDNAまたは水対照と比べたPCRのテンプレートとして使用した。反応は、総体積20μlで、2ユニットのPlatinumTaq[商標](Invitrogen)を使用し、以下のサイクルパラメータ:94℃2分、その後に、50サイクルの[90℃30秒、55℃1分、72℃1分]、その後に、72℃5分を用いて行った。緩衝液を用いてシリカマイクロスフェアを2回、スピン/洗浄した後に、前記で列挙した機器設定を用いてFACSArray分析を行った。
ESP-PCR後のシリカマイクロスフェアへの赤色蛍光標識アンプリコンのローディングはSP-PCRに比べて高い。RFUは相対蛍光単位を指す。カッコ内の数字は3つ組のシリーズの平均の標準誤差を表す。
「熱段階的」または「非段階的」ESP-PCRおよびSP-PCR
実施例2に記載の実験の一部として、トラコーマクラミジア潜在プラスミドorf3標的について、熱段階的または非段階的プロトコールを同時に設定した。「非段階的」PCRについては、熱プロフィール44-44:94℃15分、その後に、[30サイクルの90℃30秒、44℃1分、72℃1分]、その後に、[5サイクルの90℃、44℃2分、72℃2分]を使用した。「段階的」PCRについては、熱プロフィール44-60:94℃15分、その後に、[30サイクルの90℃30秒、44℃1分、72℃1分]、その後に、[5サイクルの90℃、60℃2分、72℃2分]を使用した。結果を表4に示した。
「熱段階的」ESP-PCR後のシリカマイクロスフェアへの赤色蛍光標識アンプリコンのローディングは「非段階的」SP-PCRに比べて高い。Ct orf3はトラコーマクラミジア潜在プラスミドorf3を指している。RFUは相対蛍光単位を指している。カッコ内の数字は3つ組のシリーズの平均の標準誤差を表している。
Claims (17)
- 反応容器内で一本鎖ポリヌクレオチドを作製する方法であって、以下の工程を含む方法:
リンカー手段を介して固体マトリックスに結合しているプライマーを有する固体マトリックスと、少なくとも1つの核酸分子を含む試料を、固定化されたプライマーを伸長させて、固体マトリックスに固定化された二本鎖ポリヌクレオチドの作製を促進する反応条件下で接触させることによって、標的二本鎖ポリヌクレオチドまたはその一本鎖誘導体を指数関数的増幅に供する工程であって、
固定化されたプライマーが、
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっている(nested)プライマー
からなるリストより選択される、工程、ならびに、
次いで、固定化されたポリヌクレオチドを変性条件に供して、固定化された一本鎖ポリヌクレオチドおよび液相一本鎖ポリヌクレオチドを作製する工程。 - 固定化された一本鎖ポリヌクレオチドまたは水相一本鎖ポリヌクレオチドを単離するために、相分離工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 核酸分子を固相増幅する方法であって、以下の工程を含む方法:
リンカー手段を介して固体支持体に結合しているプライマーを有する固体支持体と、少なくとも1つの核酸分子を含む試料を、固定化されたプライマーを伸長させる反応条件下で接触させる工程であって、
固定化されたプライマーが、
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される、工程。 - 異なる融解温度が、異なるアニーリング温度、プライマーと標的相補ポリヌクレオチドとの間のミスマッチの程度、および/または外来配列の存在の1つまたは複数によるものである、請求項1または3記載の方法。
- プライマーの一方または両方が、標的相補ポリヌクレオチドと相同性によって関連してもよく、または関連しなくてもよいヘッド(head)ヌクレオチド配列またはヒール(heel)ヌクレオチド配列を含み、それによって、他のプライマーと比較して高い融解温度を与える、請求項4記載の方法。
- 増幅しようとする標的が陥凹(recessed)5'末端または平滑末端のいずれかを含み、5'→3'エキソヌクレアーゼとインキュベートされると一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを生じる、請求項1または3または4または5記載の方法。
- 固体マトリックスを一本鎖ポリヌクレオチドで標識する方法であって、以下の工程を含む方法:
第1のアニーリング条件セットで類似のアニーリング特性を有するが、第2のアニーリング条件セットでディファレンシャルなアニーリング特性を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、標的二本鎖ポリヌクレオチドまたはその一本鎖誘導体を指数関数的増幅に供する工程、
第2のアニーリング条件セット下で増幅産物の鎖にアニーリングすることができるプライマーの少なくとも1つがその上に固定化されている、固体マトリックスまたは固体マトリックスの組成物を、増幅の増幅産物と接触させる工程、ならびに
アニーリング条件を第2の条件セットに変え、それにより1種類のプライマーに基づく増幅を促進して、該固体マトリックスに固定化された一本鎖ポリヌクレオチドを作製する工程。 - 固体マトリックスを標識する方法であって、以下の工程を含む方法:
リンカー手段を介して固体マトリックスに結合しているプライマーを有する固体マトリックスと、少なくとも1つの核酸分子を含む試料を、固定化されたプライマーを伸長させる反応条件下で接触させる工程であって、
固定化されたプライマーが、
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される、工程。 - 異なるアニーリング条件または異なる融解温度が、異なるアニーリング温度、プライマーと標的相補ポリヌクレオチドとの間のミスマッチの程度、および/または外来配列の存在の1つまたは複数によるものである、請求項7または8記載の方法。
- プライマーの一方または両方が、標的相補ポリヌクレオチドと相同性によって関連してもよく、または関連しなくてもよいヘッドヌクレオチド配列またはヒールヌクレオチド配列を含み、それによって、他のプライマーと比較して高い融解温度を与える、請求項9記載の方法。
- 増幅しようとする標的が陥凹5'末端または平滑末端のいずれかを含み、5'→3'エキソヌクレアーゼとインキュベートされると一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを生じる、請求項7または8または9または10記載の方法。
- 反応を第2のアニーリング条件セットに供した後に、固定化された一本鎖ポリヌクレオチド上での相補鎖の作製を促進して固体マトリックスに固定化された二重鎖ポリヌクレオチドを形成するために、許容(permissive)アニーリング条件セットに戻す工程をさらに含む、請求項7または8または9または10記載の方法。
- ポリヌクレオチドがDNAである、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
- 反応容器内でssDNAを作製する方法であって、以下の工程を含む方法:
第1のアニーリング条件(相互許容(mutually permissive)条件)セットで類似の(バランスがとれている(balanced))アニーリングプライマーを有するが、第2のアニーリング条件(ディファレンシャル許容(differentially permissive)条件)セットでディファレンシャルなアニーリング特性を有する一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、反応容器内で、dsDNAまたはmRNA標的から、固定化された標的ssDNAテンプレートの増幅反応を行う工程であって、増幅は相互許容アニーリング条件下で進行させられる、工程;
条件をディファレンシャル許容条件に変えて、プライマーをアンバランスにし、それによって、実質的に、1種類だけのプライマーの存在下で、線形増幅を促進して、ssDNA産物を作製する工程;ならびに
ポリメラーゼ活性を不活性化して、dsDNA形成を実質的に減らすか、または妨げる工程。 - 二本鎖ポリヌクレオチドで標識された、固体マトリックスまたは固体マトリックスの組成物を作製する方法であって、以下の工程を含む方法:
リンカー手段を介して固体マトリックスに結合しているプライマーを有する固体マトリックスと、少なくとも1つの核酸分子を含む試料を、固定化されたプライマーを伸長させる反応条件下で接触させることによって、標的二本鎖ポリヌクレオチドまたはその一本鎖誘導体を指数関数的増幅に供する工程であって、固定化されたプライマーが、
(i)水相プライマーと配列同一性を共有するが、固定化されたプライマーと比べて異なる融解温度を有するプライマー;および
(ii)2つの水相プライマー間に入れ子になっているプライマー
からなるリストより選択される、工程。 - 増幅しようとする標的が陥凹5'末端または平滑末端のいずれかを含み、5'→3'エキソヌクレアーゼとインキュベートされると一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを生じる、請求項14または15記載の方法。
- エキソヌクレアーゼが等温増幅に必要な試薬と共にインキュベートされる、請求項6または11または16記載の方法。
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