JP7426901B2 - 等温増幅の成分およびプロセス - Google Patents
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Description
この特許出願は、表題「ISOTHERMAL AMPLIFICATION COMPONENTS AND PROCESSES」の2016年4月4日に出願された米国特許出願第15/090,405号(発明者としてAndrew P.MillerおよびHonghua Zhangの名前が挙げられ、代理人管理番号NAT-1001-UTtによって指定される)の利益を主張する。上記出願の全体の内容は、全ての目的のために、本文、表および図面全てを含めて参考として本明細書に援用される。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、その全体が参考として本明細書に援用される配列表を含む。上記ASCIIコピーは、2017年3月2日に作成され、NAT-1001-PC_SL.txtとの名称であり、16,533バイトのサイズである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法であって、
a)前記試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
前記標的配列が第1の鎖および第2の鎖を含み、
前記第1の鎖および前記第2の鎖が互いに相補的であり、かつ
前記増幅するステップが、切断剤不含、ヘリカーゼ不含、かつリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
i)第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドであって、前記第1のオリゴヌクレオチドが前記第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが前記第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドからなる、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド、ならびに
ii)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、
前記核酸増幅産物が、1)前記第1のオリゴヌクレオチドの前記第1のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたは実質的に同一の第1のヌクレオチド配列、2)前記第2のオリゴヌクレオチドの前記第2のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第2のヌクレオチド配列、および3)1~10塩基を含むスペーサー配列からなり、かつ
前記スペーサー配列が前記第1のヌクレオチド配列および前記第2のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
b)前記核酸増幅産物を検出するステップであって、前記核酸増幅産物を検出するステップは、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ前記試料核酸を(a)(i)および(a)(ii)と接触させた時から10分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、方法。
(項目2)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約90%同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片によって提供される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号8のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片、または配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片によって提供される、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いまたはエキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、項目1、2、または3に記載の方法。
(項目5)
要素(a)(ii)が、逆転写酵素活性を提供する少なくとも1つの成分をさらに含む、項目1~4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記少なくとも1つの成分が、逆転写酵素活性をさらに提供する、項目1~5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
増幅の前または増幅の間に前記試料核酸を変性させるステップを含まない、項目1~6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間に一本鎖DNA結合性タンパク質と接触させない、項目1~7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
精製されていない試料核酸が増幅される、項目1~8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記増幅が、約55℃から約75℃の一定温度で行われる、項目1~9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記増幅が、約65℃の一定温度で行われる、項目1~9のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記増幅が、約60℃の一定温度で行われる、項目1~9のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドがそれぞれ約8~16塩基の長さである、項目1~12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記核酸増幅産物が約20~40塩基の長さである、項目1~13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記スペーサー配列が、1~5塩基を含み、かつ前記試料核酸中の前記標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、項目1~14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、項目1~15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記核酸増幅産物を、i)前記増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにii)フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、項目1~17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
単一の反応容器中で行われる、項目1~18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
マルチプレックス増幅を含む、項目1~19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記増幅するステップが、切断剤不含、ヘリカーゼ不含、かつリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
i)第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドであって、前記第1のオリゴヌクレオチドが前記第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが前記第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドからなる、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド、ならびに
ii)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する成分からなる酵素成分
と接触させることを含む、項目1~20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記第1のオリゴヌクレオチドが、DNA塩基、修飾DNA塩基、またはDNA塩基および修飾DNA塩基からなる第1のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが、DNA塩基、修飾DNA塩基、またはDNA塩基および修飾DNA塩基からなる第2のポリヌクレオチドからなる、項目1~21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
核酸を増幅するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を、
a)前記試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、および
b)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
を含む成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
(項目24)
核酸を増幅するための方法であって
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
a)前記試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、および
b)超好熱菌ポリメラーゼまたは超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約90%同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼからなる酵素成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
(項目25)
核酸を増幅するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
a)前記試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、ならびに
b)i)超好熱菌ポリメラーゼ活性、および任意選択でii)逆転写酵素活性からなる酵素活性
と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
(項目26)
前記酵素活性が、i)超好熱菌ポリメラーゼ活性、およびii)逆転写酵素活性からなる、項目25に記載の方法。
(項目27)
増幅の前または増幅の間に前記試料核酸を変性させるステップを含まない、項目23~26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間にエンドヌクレアーゼと接触させない、項目23~27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間に巻き戻し剤と接触させない、項目23~28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間にヘリカーゼと接触させない、項目23~29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間にリコンビナーゼと接触させない、項目23~30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間に一本鎖DNA結合性タンパク質と接触させない、項目23~31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記試料核酸が、増幅の前に非修飾である、項目23~32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
非修飾の前記試料核酸が破砕細胞に由来する、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記試料核酸がDNAを含む、項目23~34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記試料核酸がゲノムDNAを含む、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記試料核酸がRNAを含む、項目23~34のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記試料核酸がウイルスRNAを含む、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記試料核酸が細菌RNAを含む、項目37に記載の方法。
(項目40)
前記試料核酸が一本鎖核酸を含む、項目23~39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記試料核酸が、第1の鎖および第2の鎖を含む二本鎖核酸を含む、項目23~39のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドを含む、項目23~41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドからなる、項目23~41のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドがそれぞれ8~16塩基を含む、項目42または43に記載の方法。
(項目45)
前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第1の鎖中の標的配列に相補的な第1のポリヌクレオチドを含み、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第2の鎖中の標的配列に相補的な第2のポリヌクレオチドを含む、項目42、43、または44に記載の方法。
(項目46)
前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第1の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドを含み、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第2の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドを含む、項目42、43、または44に記載の方法。
(項目47)
前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第1の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第2の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドからなる、項目42、43、または44に記載の方法。
(項目48)
試料核酸が、増幅の前に被験体から得られる、項目23~47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
精製されていない試料核酸が増幅される、項目23~48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
精製された試料核酸が増幅される、項目23~48のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
増幅の前に試料核酸を精製するステップをさらに含む、項目23~48のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目23~51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約90%同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目23~51のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、古細菌の超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目23~51のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号8のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目23~54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目23~54のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いポリメラーゼによって提供される、項目23~56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、項目23~56のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記増幅が約55℃から約75℃の一定温度で行われる、項目23~58のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
前記増幅が約55℃から約65℃の一定温度で行われる、項目23~58のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
前記増幅が約65℃の一定温度で行われる、項目23~58のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記増幅が約60℃の一定温度で行われる、項目23~58のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記核酸増幅産物が、10分またはそれ未満以内に検出可能である、項目23~62のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
前記核酸増幅産物が、前記試料核酸中の標的配列に連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一のポリヌクレオチドを含む、項目23~63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
前記核酸増幅産物が、前記試料核酸中の標的配列に連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一のポリヌクレオチドからなる、項目23~63のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
前記核酸増幅産物が、約20~40塩基の長さである、項目23~65のいずれか一項に記載の方法。
(項目67)
前記核酸増幅産物が、i)前記第1のオリゴヌクレオチドの前記第1のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第1のヌクレオチド配列、ii)前記第2のオリゴヌクレオチドの前記第2のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第2のヌクレオチド配列、およびiii)前記第1のヌクレオチド配列および前記第2のヌクレオチド配列に挟まれているスペーサー配列を含む、項目43~66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
前記核酸増幅産物が、i)前記第1のオリゴヌクレオチドの前記第1のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第1のヌクレオチド配列、ii)前記第2のオリゴヌクレオチドの前記第2のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第2のヌクレオチド配列、およびiii)前記第1のヌクレオチド配列および前記第2のヌクレオチド配列に挟まれているスペーサー配列からなる、項目43~66のいずれか一項に記載の方法。
(項目69)
前記スペーサー配列が1~10塩基を含む、項目67または68に記載の方法。
(項目70)
前記スペーサー配列が1~5塩基を含む、項目67または68に記載の方法。
(項目71)
前記スペーサー配列が、前記第1のオリゴヌクレオチドの前記第1のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもなく、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドの前記第2のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもない、項目67~70のいずれか一項に記載の方法。
(項目72)
前記スペーサー配列が、前記試料核酸中の標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、項目67~71のいずれか一項に記載の方法。
(項目73)
前記核酸増幅産物を検出するステップをさらに含む、項目23~72のいずれか一項に記載の方法。
(項目74)
前記核酸増幅産物を検出するステップが、前記試料核酸を、前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記成分および前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドと接触させた時から10分またはそれ未満以内に行われる、項目73に記載の方法。
(項目75)
前記核酸増幅産物を検出するステップが、リアルタイム検出方法の使用を含む、項目73または74に記載の方法。
(項目76)
前記核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、項目73、74、または75に記載の方法。
(項目77)
前記蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、項目76に記載の方法。
(項目78)
前記核酸増幅産物を、i)前記増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにii)フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、項目23~77のいずれか一項に記載の方法。
(項目79)
前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドの1つまたは複数が、前記試料核酸中の配列に相補的でないポリヌクレオチドであって、シグナル生成オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、かつ前記方法が、前記増幅産物を、フルオロフォアおよび消光剤を含む前記シグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、項目23~78のいずれか一項に記載の方法。
(項目80)
単一の反応容量中で行われる、項目23~79のいずれか一項に記載の方法。
(項目81)
単一の反応容器中で行われる、項目23~80のいずれか一項に記載の方法。
(項目82)
マルチプレックス増幅を含む、項目23~81のいずれか一項に記載の方法。
(項目83)
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間に切断剤と接触させない、項目23~82のいずれか一項に記載の方法。
(項目84)
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するためのキットであって、
a)ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で前記試料核酸中の標的配列を増幅するための成分であって、以下:
i)第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドであって、前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドを含み、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドを含み、前記標的配列の前記第1の鎖および前記第2の鎖が互いに相補的である、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド、ならびに
ii)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
を含む、成分と、
b)核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも1つの成分と
を含む、キット。
(項目85)
前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドから本質的になる、項目84に記載のキット。
(項目86)
前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドからなる、項目84に記載のキット。
(項目87)
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するためのキットであって、
a)ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で前記試料核酸中の標的配列を増幅するための成分であって、以下:
i)第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドであって、前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドからなり、前記標的配列の前記第1の鎖および前記第2の鎖が互いに相補的である、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド、ならびに
ii)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
を含む、成分と、
b)核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも1つの成分と
を含む、キット。
(項目88)
前記試料核酸が、ヘリカーゼ不含かつリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で増幅される、項目84~87のいずれか一項に記載のキット。
(項目89)
前記試料核酸が、ヘリカーゼ不含、リコンビナーゼ不含、かつ切断剤不含の等温増幅条件下で増幅される、項目84~87のいずれか一項に記載のキット。
(項目90)
超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記少なくとも1つの成分が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約90%同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片を含む、項目84~89のいずれか一項に記載のキット。
(項目91)
超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記少なくとも1つの成分が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約90%同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片からなる、項目84~89のいずれか一項に記載のキット。
(項目92)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、古細菌の超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目84~91のいずれか一項に記載のキット。
(項目93)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号8のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目84~92のいずれか一項に記載のキット。(項目94)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目84~92のいずれか一項に記載のキット。
(項目95)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いポリメラーゼによって提供される、項目84~94のいずれか一項に記載のキット。
(項目96)
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、項目84~94のいずれか一項に記載のキット。
(項目97)
要素(a)(ii)が、逆転写酵素活性を提供する少なくとも1つの成分をさらに含む、項目84~96のいずれか一項に記載のキット。
(項目98)
超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記少なくとも1つの成分が逆転写酵素活性をさらに提供する、項目84~96のいずれか一項に記載のキット。
(項目99)
前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドがそれぞれ8~16塩基を含む、項目84~98のいずれか一項に記載のキット。
(項目100)
前記リアルタイム検出活性が分子ビーコンによって提供される、項目84~99のいずれか一項に記載のキット。
(項目101)
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法を実施するための指示をさらに含み、前記方法が、
a)前記試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
前記標的配列が第1の鎖および第2の鎖を含み、
前記第1の鎖および前記第2の鎖が互いに相補的であり、
かつ前記増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
i)第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドであって、前記第1のオリゴヌクレオチドが前記第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドを含み、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが前記第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドを含む、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド、ならびに
ii)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、前記核酸増幅産物が、1)前記第1のオリゴヌクレオチドの前記第1のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第1のヌクレオチド配列、2)前記第2のオリゴヌクレオチドの前記第2のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第2のヌクレオチド配列、および3)1~10塩基を含むスペーサー配列を含み、かつ
前記スペーサー配列が前記第1のヌクレオチド配列および前記第2のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
b)前記核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ前記試料核酸を(a)(i)および(a)(ii)と接触させた時から10分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、項目84~100のいずれか一項に記載のキット。
(項目102)
前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ/または、前記核酸増幅産物が、1)前記第1のオリゴヌクレオチドの前記第1のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第1のヌクレオチド配列、2)前記第2のオリゴヌクレオチドの前記第2のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第2のヌクレオチド配列、および3)1~10塩基を含むスペーサー配列から本質的になる、項目101に記載のキット。
(項目103)
前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドからなり、かつ/または、前記核酸増幅産物が、1)前記第1のオリゴヌクレオチドの前記第1のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第1のヌクレオチド配列、2)前記第2のオリゴヌクレオチドの前記第2のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第2のヌクレオチド配列、および3)1~10塩基を含むスペーサー配列からなる、項目101に記載のキット。
(項目104)
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法を実施するための指示をさらに含み、前記方法が、
a)前記試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
前記標的配列が第1の鎖および第2の鎖を含み、
前記第1の鎖および前記第2の鎖が互いに相補的であり、
かつ前記増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
i)第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドであって、前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドからなる、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド、ならびに
ii)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、前記核酸増幅産物が、1)前記第1のオリゴヌクレオチドの前記第1のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第1のヌクレオチド配列、2)前記第2のオリゴヌクレオチドの前記第2のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第2のヌクレオチド配列、および3)1~10塩基を含むスペーサー配列からなり、かつ
前記スペーサー配列が前記第1のヌクレオチド配列および前記第2のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
b)前記核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ前記試料核酸を(a)(i)および(a)(ii)と接触させた時から10分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、項目84~100のいずれか一項に記載のキット。
(項目105)
前記方法が、増幅の前または増幅の間に前記試料核酸を変性させるステップを含まない、項目101~104のいずれか一項に記載のキット。
(項目106)
前記試料核酸を、増幅の前、間、または後にエンドヌクレアーゼと接触させない、項目101~105のいずれか一項に記載のキット。
(項目107)
前記試料核酸が、増幅の前に非修飾である、項目101~106のいずれか一項に記載のキット。
(項目108)
非修飾の前記試料核酸が破砕細胞に由来する、項目107に記載のキット。
(項目109)
前記試料核酸がDNAを含む、項目101~108のいずれか一項に記載のキット。
(項目110)
前記試料核酸がゲノムDNAを含む、項目109に記載のキット。
(項目111)
前記試料核酸がRNAを含む、項目101~108のいずれか一項に記載のキット。
(項目112)
前記試料核酸がウイルスRNAを含む、項目111に記載のキット。
(項目113)
前記試料核酸が細菌RNAを含む、項目111に記載のキット。
(項目114)
前記試料核酸が一本鎖核酸を含む、項目101~113のいずれか一項に記載のキット。
(項目115)
前記試料核酸が二本鎖核酸を含む、項目101~113のいずれか一項に記載のキット。
(項目116)
試料核酸が、増幅の前に被験体から得られる、項目101~115のいずれか一項に記載のキット。
(項目117)
精製されていない試料核酸が増幅される、項目101~116のいずれか一項に記載のキット。
(項目118)
精製された試料核酸が増幅される、項目101~116のいずれか一項に記載のキット。
(項目119)
前記方法が、増幅の前に試料核酸を精製するステップをさらに含む、項目101~118のいずれか一項に記載のキット。
(項目120)
前記増幅が約55℃から約75℃の一定温度で行われる、項目101~119のいずれか一項に記載のキット。
(項目121)
前記増幅が約55℃から約65℃の一定温度で行われる、項目101~119のいずれか一項に記載のキット。
(項目122)
前記増幅が約65℃の一定温度で行われる、項目101~119のいずれか一項に記載のキット。
(項目123)
前記増幅が約60℃の一定温度で行われる、項目101~119のいずれか一項に記載のキット。
(項目124)
前記核酸増幅産物が約20~40塩基の長さである、項目101~123のいずれか一項に記載のキット。
(項目125)
前記スペーサー配列が1~5塩基を含む、項目101~124のいずれか一項に記載のキット。
(項目126)
前記スペーサー配列が、前記第1のオリゴヌクレオチドの前記第1のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもなく、かつ前記第2のオリゴヌクレオチドの前記第2のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもない、項目101~125のいずれか一項に記載のキット。
(項目127)
前記スペーサー配列が、前記試料核酸中の標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、項目101~126のいずれか一項に記載のキット。
(項目128)
前記核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、項目101~127のいずれか一項に記載のキット。
(項目129)
前記蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、項目128に記載のキット。
(項目130)
前記方法が、前記核酸増幅産物を、i)前記増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにii)フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、項目101~129のいずれか一項に記載のキット。
(項目131)
前記方法が単一の反応容量中で行われる、項目101~130のいずれか一項に記載のキット。
(項目132)
前記方法が単一の反応容器中で行われる、項目101~131のいずれか一項に記載のキット。
(項目133)
前記方法がマルチプレックス増幅を含む、項目101~132のいずれか一項に記載のキット。
核酸を増幅するための方法および組成物が本明細書中で提供される。「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され得る。該用語は、任意の組成の核酸、例えば、DNA(例えば、相補的DNA(cDNA)、ゲノムDNA(gDNA)など)、RNA(例えば、メッセージRNA(mRNA)、短鎖阻害性RNA(siRNA)、リボソームRNA(rRNA)、tRNA、マイクロRNA、および/またはDNAもしくはRNAアナログ(例えば、塩基アナログ、糖アナログ、および/または非天然の骨格などを含有する)、RNA/DNAハイブリッド、およびポリアミド核酸(PNA)を指し、これらの全ては一本鎖または二本鎖の形態であってよく、別段に限定しない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能できる天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含し得る。核酸は、プラスミド、ファージ、自律複製配列(ARS)、セントロメア、人工染色体、染色体、あるいはin vitroでまたは宿主細胞、細胞、細胞核、ミトコンドリア、もしくはある特定の実施形態では細胞の細胞質中で複製できるまたは複製されることができるその他の核酸であり得、またはこれらに由来し得る。特に限定しない限り、該用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸を包含する。別段に示さない限り、具体的な核酸配列は、明示的に示した配列に加えて、保存的に修飾されたその改変体(例えば、縮重コドン置換)、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型(SNP)、および相補的配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された(または全ての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成できる。核酸という用語は、遺伝子座、遺伝子、cDNA、および遺伝子によってコードされるmRNAと交換可能に使用され得る。該用語はまた、同等物として、ヌクレオチドアナログ、一本鎖(「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレームまたは「リバース」リーディングフレーム、「フォワード」鎖または「リバース」鎖)および二本鎖ポリヌクレオチドから合成されたRNAまたはDNAの誘導体、改変体、およびアナログも包含し得る。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントを意味し、一般に、遺伝子産物の転写/翻訳および転写/翻訳の調節に関与するコーディング領域の前および後の領域(リーダーおよびトレイラー(trailer))、ならびに個々のコーディングセグメント(エクソン)間の介在配列(イントロン)を包含する。ヌクレオチドまたは塩基は、一般に、核酸のプリンおよびピリミジン分子単位(例えば、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)、およびシトシン(C))を指す。RNAの場合、塩基チミンはウラシルに置き換えられる。核酸の長さまたはサイズは、塩基数として表すことができる。
核酸を増幅するための方法が本明細書中で提供される。一部の実施形態では、核酸は、好適な増幅プロセスを使用して増幅される。核酸増幅は、通常、増幅されているヌクレオチド配列に相補的な配列を含有する核酸アンプリコン(コピー)の酵素合成を伴う。一部の実施形態では、増幅方法は、単一の容器、単一のチャンバー、および/または単一の容量(すなわち、連続の容量)中で行われる。一部の実施形態では、増幅方法および検出方法(例えば、本明細書中に記載する検出方法など)は、単一の容器、単一のチャンバー、および/または単一の容量(すなわち、連続の容量)中で行われる。
核酸増幅は、一般に、1つまたは複数のプライマーの存在下で実行される。プライマーは、一般に、特定の目的の領域(すなわち、標的配列)においてまたはその近く(例えば、その付近)において標的核酸にハイブリダイズまたはアニールできるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドとして特徴付けられる。プライマーは、例えば、標的核酸ヌクレオチド配列の特異的決定または標的核酸の検出(例えば、配列の存在または非存在)もしくはその特徴の検出を可能とし得る。プライマーは、天然に存在するものであってもよいし、合成のものであってもよい。特異的または特異性という用語は、一般に、標的ポリヌクレオチドに対するプライマーなど、ある分子の別の分子に対する結合またはハイブリダイゼーションを指す。すなわち、特異的または特異性とは、2分子間の認識、接触、および安定な複合体の形成であって、これと比べてその他の分子とのこれら2分子のいずれかの認識、接触、または複合体形成が実質的により低いことをいう。アニールまたはハイブリダイズという用語は、一般に、2分子間の安定な複合体の形成を指す。プライマーに言及する場合、プライマー、オリゴ、またはオリゴヌクレオチドという用語は、本明細書中で交換可能に使用され得る。
一部の実施形態では、増幅反応成分は、1つまたは複数のポリメラーゼを含む。
本明細書中に記載する方法は、核酸増幅産物を検出および/または定量化するステップをさらに含み得る。増幅産物は、例えば本明細書中に記載する任意の検出方法または定量化方法を含む、任意の好適な検出および/または定量化方法によって検出および/または定量化され得る。検出および/または定量化方法の非限定的な例としては、分子ビーコン(例えば、リアルタイム、エンドポイント)、ラテラルフロー、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、蛍光偏光法(FP)、表面捕捉、5’-3’エキソヌクレアーゼ加水分解プローブ(例えば、TAQMAN)、挿入/結合性色素、吸光度法(例えば、比色定量、濁度)、電気泳動(例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動)、質量分析、核酸シークエンシング、デジタル増幅、プライマー伸長法(例えば、iPLEX(商標))、AffymetrixのMolecular Inversion Probe(MIP)技術、制限酵素断片長多型(RFLP分析)、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)分析、メチル化特異的PCR(MSPCR)、パイロシークエンシング分析、acycloprime分析、リバースドットブロット、GeneChipマイクロアレイ、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(DASH)、ペプチド核酸(PNA)およびロックド核酸(LNA)プローブ、AlphaScreen、SNPstream、遺伝子ビット分析(genetic bit analysis)(GBA)、マルチプレックスミニシークエンシング、SNaPshot、GOODアッセイ、マイクロアレイminiseq、アレイ化プライマー伸長(APEX)、マイクロアレイプライマー伸長、タグアレイ、コード化ミクロスフェア、鋳型特異的組込み(Template-directed incorporation)(TDI)、比色定量オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)、配列コード化OLA、マイクロアレイライゲーション、リガーゼ連鎖反応、パッドロックプローブ(padlock probes)、invaderアッセイ、少なくとも1つのプローブを使用するハイブリダイゼーション、少なくとも1つの蛍光標識化プローブを使用するハイブリダイゼーション、クローニングおよびシークエンシング、ハイブリダイゼーションプローブおよび定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(QRT-PCR)の使用、ナノポアシークエンシング、チップ、およびこれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、リアルタイム検出方法の使用を含む(すなわち、産物は増幅プロセスの間に検出および/または連続的にモニターされる)。一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、エンドポイント検出方法の使用を含む(すなわち、産物は増幅プロセスの完了または停止後に検出される)。核酸検出方法はまた、標的配列中または標的への相補的配列を含有するプローブ中に直接的に組み込まれた標識化ヌクレオチドの使用を用い得る。そのような標識は、放射性および/または蛍光性のものであってよく、本明細書中に論じる様式のいずれかで解像することができる。一部の実施形態では、核酸増幅産物の定量化は、以下に記載するある特定の検出方法を使用して達成され得る。ある特定の例では、検出方法は、シグナル強度の測定、ならびに/または核酸増幅産物の定量化用の検量線および/もしくはルックアップ表の生成(もしくはそれらへの参照)と組み合わせて使用され得る。
キットは、例えば、本明細書中に記載するような、1つまたは複数のポリメラーゼおよび1つまたは複数のプライマー、ならびに任意選択で1つまたは複数の逆転写酵素を含み得る。1つの標的が増幅される場合、一対のプライマー(フォワードおよびリバース)がキットに含まれ得る。複数の標的配列が増幅される場合、複数のプライマー対がキットに含まれ得る。キットは、対照ポリヌクレオチドを含んでもよく、複数の標的配列が増幅される場合、複数の対照ポリヌクレオチドがキットに含まれ得る。
本実施例では、等温増幅技術を使用してChlamydia trachomatis由来の核酸の検出を行う。
蛍光性DNA色素を用いたクラミジアゲノムDNAの検出用のリアルタイムアッセイを試験した。このアッセイではSYTO82を使用し、これはオレンジ蛍光性の核酸染色剤であり、核酸への結合時に明るいオレンジの蛍光を呈する。20mMトリス-HCl(pH8.8、25℃)、10mM (NH4)2SO4、10mM KCl、4mM MgSO4、0.1% Triton(登録商標)X-100、1mM DTT、2μM SYTO82、0.25mM dNTP、および1反応あたり1ユニットの改変9 Degrees North(9°Nm(商標))DNAポリメラーゼ(New England BioLabs、Ipswich、MA)を用いてマスターミックス溶液を調製した。9°Nm(商標)DNAポリメラーゼのアミノ酸配列は配列番号9として本明細書中に記載している。7,500塩基対のC.trachomatis潜在性プラスミドDNA内の特異的な配列を標的化するプライマーセットを使用し、これは11ヌクレオチドのフォワードプライマー(すなわち、Ct_F11:5’-GGCTTATGGAG-3’(配列番号1))および10ヌクレオチドのリバースプライマー(すなわち、Ct_R10:5’-ATACCGCTTA-3’(配列番号2))を含んでいた。1塩基のスペーサーを含む22塩基のDNA産物を生成するためにアッセイを設計した。スペーサーはプライマーの3’末端の間のヌクレオチドであり、このヌクレオチドはいずれのプライマー配列中にも存在しない。最終濃度500nMでプライマーをそれぞれ使用し、2000コピ
ーのクラミジアゲノムDNA、または標的のない対照(NTC)としてのトリス-EDTA緩衝液(TE)のいずれかと混合した。ある特定の例では、dH2OをNTCとして使用した。マスターミックス溶液とは別個の反応ウェル中にプライマー混合物を置いた。アッセイ成分を65℃で2分間インキュベートし、次いで、合わせて、等温反応を開始させた。等温増幅反応の結果を図1に示す。
上記の等温増幅反応から生成された増幅産物をエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)によって試験して、アッセイの特異性を検証した。最終濃度500nMで上記のプライマーをそれぞれ使用し、20,000コピーのクラミジアゲノムDNA、または標的のない対照(NTC)としてのトリス-EDTA緩衝液(TE)のいずれかと混合した。ある特定の例では、dH2OをNTCとして使用した。クラミジアゲノムDNAを上記の条件下で10分間、65℃で増幅した。増幅後、トリス-EGTA(最終20mMトリス-EGTA、pH8.5)を用いて反応を不活化した。次いで反応を脱塩し、ESI-MS分析の前に凍結乾燥した。
等温増幅アッセイを使用してクラミジアゲノムDNAの検出の感度を試験した。このアプローチでは、非対称増幅条件下での10ヌクレオチドのプライマーのアッセイをエンドポイント分子ビーコン検出のために使用した。20mMトリス-HCl(pH8.8、25℃)、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、4mM MgSO4、0.1% Triton(登録商標)X-100、1mM DTT、0.25mM dNTP、および1反応あたり1ユニットの改変9 Degrees North(9°Nm(商標))DNAポリメラーゼ(New England BioLabs、Ipswich、MA)を用いてマスターミックス溶液を調製した。7,500塩基対のC.trachomatis潜在性プラスミドDNA内の特異的な配列を標的化するプライマーセットを使用し、これは10ヌクレオチドのフォワードプライマー(すなわち、Ct_F10:5’-GCTTATGGAG-3’(配列番号3))および10ヌクレオチドのリバースプライマー(すなわち、Ct_R10:5’-ATACCGCTTA-3’(配列番号2))を含んでいた。1塩基のスペーサーを含む21塩基のDNA産物を生成するためにアッセイを設計した。スペーサーはプライマーの3’末端の間のヌクレオチドであり、このヌクレオチドはいずれのプライマー配列中にも存在しない。プライマー(すなわち、750nMのフォワードプライマーおよび200nMのリバースプライマー)をNTCとしてのTEまたは異なる量のクラミジアゲノムDNA(すなわち、20コピー、200コピー、1,000コピー、2,000コピー)のいずれかと混合し、マスターミックス溶液とは別個の反応ウェル中に置いた。ある特定の例では、dH2OをNTCとして使用した。アッセイ成分を65℃で2分間インキュベートし、次いで、合わせて、等温反応を開始させた。反応を65℃で10分間実行し、次いで、氷上に置き、EGTAを加えることによって不活化した。次いで、21塩基の特異的なフォワード産物に相補的な20塩基の配列を含有する分子ビーコン(すなわち、Ct FP MB5.18:Fam-CTGGCTACCGCTTAACTCCATAAGCCAG-3BHQ1(配列番号4))を各反応ウェルに加えた。分子ビーコンのエンドポイント蛍光の読出しによって反応産物を検出した。図3に示すように、等温反応によって20コピーのクラミジアゲノムDNAを、分子ビーコンのエンドポイント検出を使用して65℃、10分で検出可能なレベルへと増幅するこ
とができる。
クラミジアゲノムDNAのリアルタイム検出のための別のアプローチは、検出のために分子ビーコンを使用することである。このアプローチでは、非対称的増幅条件下での10ヌクレオチドのプライマーのアッセイを、dH2Oまたは標的のない対照(NTC)として使用されるTEを用いるリアルタイム分子ビーコン検出のために使用した。20mMトリス-HCl(pH8.8、25℃)、10mM (NH4)2SO4、10mM KCl、4mM MgSO4、0.1% Triton(登録商標)X-100、50nM fMB2 3PS(分子ビーコン)、0.25mM dNTP、および1ユニット/反応の改変9 Degrees North(9°Nm(商標))DNAポリメラーゼ(New England BioLabs、Ipswich、MA)を使用してマスターミックスを調製した。マスターミックスは、フォワード産物の一部分(大文字で示す14塩基の配列)に相補的な14塩基の配列を含む分子ビーコン(すなわち、Ct_3PSMB.2:Fam-ccgcgagccttATACCGCTTAACTCg*c*g*g-IBFQ(配列番号7))を含んでいた。*で印をしたヌクレオチドはホスホロチオエート修飾DNA塩基である。7,500塩基対のC.trachomatis潜在性プラスミドDNA内の特異的な配列を標的化するプライマーセットを使用し、これは10ヌクレオチドのフォワードプライマー(すなわち、Ct_F10+2:5’-AGGCTTATGG-3’(配列番号5))および10ヌクレオチドのリバースプライマー(すなわち、Ct_R10-2:5’-TTATACCGCT-3’(配列番号6))を含んでいた。5塩基のスペーサーを含む25塩基のDNA産物を生成するためにアッセイを設計した。スペーサーは各プライマーの3’末端の間に5ヌクレオチドを含み、これらの5ヌクレオチドはいずれのプライマー配列中にも存在しない。プライマー(すなわち、750nMのフォワードプライマーおよび200nMのリバースプライマー)を反応ウェル中でNTCとしてのTEまたは20,000コピーのクラミジアゲノムDNAのいずれかと合わせた。ある特定の例では、dH2OをNTCとして使用した。全ての成分を65℃で2分間インキュベートし、次いで、合わせて、65℃で実行される等温反応を開始させた。図4に示すように、分子ビーコンのリアルタイム蛍光の読出しによって様々な時点において反応産物が検出された。
以下に記載する実施例は、ある特定の実施形態を説明するものであり、本技術を限定するものではない。
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
a)試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、および
b)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
を含む成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
a)試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、および
b)超好熱菌ポリメラーゼまたは超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約90%同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼからなる酵素成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
a)試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、ならびに
b)i)超好熱菌ポリメラーゼ活性、および任意選択でii)逆転写酵素活性からなる酵素活性
と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
a)試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、および
b)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することから本質的になる核酸を増幅するステップ
を含む、方法。
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
a)試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、および
b)超好熱菌ポリメラーゼまたは超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約90%同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼからなる酵素成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することから本質的になる核酸を増幅するステップ
を含む、方法。
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
a)試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、ならびに
b)i)超好熱菌ポリメラーゼ活性、および任意選択でii)逆転写酵素活性からなる酵素活性
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することから本質的になる核酸を増幅するステップ
を含む、方法。
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
a)試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、および
b)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することからなる核酸を増幅するステップを含む、方法。
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
a)試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、および
b)超好熱菌ポリメラーゼまたは超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約90%同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼからなる酵素成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することからなる核酸を増幅するステップを含む、方法。
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
a)試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、ならびに
b)i)超好熱菌ポリメラーゼ活性、および任意選択でii)逆転写酵素活性からなる酵素活性
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することからなる核酸を増幅するステップを含む、方法。
a)試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
標的配列が、互いに相補的な第1の鎖および第2の鎖を含み、かつ増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
i)第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドであって、上記第1のオリゴヌクレオチドが上記第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドを含み、かつ上記第2のオリゴヌクレオチドが上記第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドを含む、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド、ならびに
ii)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、核酸増幅産物が、1)第1のオリゴヌクレオチドの第1のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第1のヌクレオチド配列、2)第2のオリゴヌクレオチドの第2のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第2のヌクレオチド配列、および3)1~10塩基を含むスペーサー配列を含み、かつ
スペーサー配列が第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
b)核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ試料核酸を(a)(i)および(a)(ii)と接触させた時から10分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、方法。
a)試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
標的配列が、互いに相補的な第1の鎖および第2の鎖を含み、かつ増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
i)第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドであって、上記第1のオリゴヌクレオチドが上記第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドからなり、かつ上記第2のオリゴヌクレオチドが上記第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドからなる、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド、ならびに
ii)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、核酸増幅産物が、1)第1のオリゴヌクレオチドの第1のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第1のヌクレオチド配列、2)第2のオリゴヌクレオチドの第2のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第2のヌクレオチド配列、および3)1~10塩基を含むスペーサー配列からなり、かつ
スペーサー配列が第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
b)核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ試料核酸を(a)(i)および(a)(ii)と接触させた時から10分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、方法。
a)i)第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドであって、第1のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドを含み、かつ第2のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドを含み、標的配列の第1の鎖および第2の鎖が互いに相補的である、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド、ならびに
ii)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
を含む、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で試料核酸中の標的配列を増幅するための成分と、
b)核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも1つの成分と
を含む、キット。
a)i)第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドであって、第1のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドからなり、かつ第2のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドからなり、標的配列の第1の鎖および第2の鎖が互いに相補的である、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド、ならびに
ii)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
を含む、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で試料核酸中の標的配列を増幅するための成分と、
b)核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも1つの成分と
を含む、キット。
a)試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
標的配列が第1の鎖および第2の鎖を含み、
第1の鎖および第2の鎖が互いに相補的であり、
かつ増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
i)第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドであって、第1のオリゴヌクレオチドが第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドを含み、かつ第2のオリゴヌクレオチドが第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドを含む、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド、ならびに
ii)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、核酸増幅産物が、1)第1のオリゴヌクレオチドの第1のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第1のヌクレオチド配列、2)第2のオリゴヌクレオチドの第2のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第2のヌクレオチド配列、および3)1~10塩基を含むスペーサー配列を含み、かつ
スペーサー配列が第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
b)核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ試料核酸を(a)(i)および(a)(ii)と接触させた時から10分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、実施形態D1からD12のいずれか1つに記載のキット。
a)試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
標的配列が第1の鎖および第2の鎖を含み、
第1の鎖および第2の鎖が互いに相補的であり、
かつ増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
i)第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドであって、第1のオリゴヌクレオチドが、第1の鎖中の配列に連続的に相補的な第1のポリヌクレオチドからなり、かつ第2のオリゴヌクレオチドが、第2の鎖中の配列に連続的に相補的な第2のポリヌクレオチドからなる、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド、ならびに
ii)超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも1つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、核酸増幅産物が、1)第1のオリゴヌクレオチドの第1のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第1のヌクレオチド配列、2)第2のオリゴヌクレオチドの第2のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第2のヌクレオチド配列、および3)1~10塩基を含むスペーサー配列からなり、かつ
スペーサー配列が第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
b)核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ試料核酸を(a)(i)および(a)(ii)と接触させた時から10分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、実施形態D1からD12のいずれか1つに記載のキット。
の値を修飾する(すなわち、「約1、2、および3」は約1、約2、および約3を指す)。例えば、「約100グラム」の質量は、90グラムから110グラムの間の質量を包含し得る。さらに、値の列挙が本明細書中に記載されている場合(例えば、約50%、60%、70%、80%、85%、または86%)、列挙はその全ての中間の値および小数の値(例えば、54%、85.4%)を包含する。よって、代表的な実施形態および任意選択の特徴によって本技術を具体的に開示したが、本明細書中に開示した概念の改変および変更を当業者は行うことができ、そのような改変および変更は本技術の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
Claims (21)
- 試料中の標的核酸配列を検出するための方法であって、
(a)互いに相補的である第1の鎖および第2の鎖を含む標的核酸配列を等温増幅条件で増幅するステップであって、
前記増幅するステップが、前記標的核酸配列を含む非変性核酸を
(i)第1のプライマーおよび第2のプライマーであって、前記第1のプライマーが前記標的核酸配列の前記第1の鎖の配列にハイブリダイズすることができ、かつ前記第2のプライマーが前記標的核酸配列の前記第2の鎖の配列にハイブリダイズすることができる、第1のプライマーおよび第2のプライマー、ならびに
(ii)超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素であって、前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号9のアミノ酸配列または配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼによって提供される、前記酵素
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、
前記核酸増幅産物が、
(1)前記第1のプライマーの配列、
(2)前記第2のプライマーの配列、および
(3)(1)前記第1のプライマーの配列および(2)前記第2のプライマーの配列によって挟まれたスペーサー配列であって、前記スペーサー配列は1~10塩基の長さである、スペーサー配列
を含み、かつ
前記増幅するステップが、前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素以外のいかなる酵素を用いるステップを含まず、かつ、前記増幅するステップが、前記非変性核酸を変性させるステップを含まない、ステップと、
(b)前記核酸増幅産物を検出するステップであって、前記核酸増幅産物を検出するステップは、前記非変性核酸を(a)(i)前記第1および第2のプライマーならびに(a)(ii)前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させた時から10分以内に行われる、ステップと
を含む、方法。 - 前記非変性核酸が、
(a)ゲノム核酸、プラスミド核酸、ミトコンドリア核酸、細胞性核酸、または細胞外核酸;
(b)細菌核酸またはウイルス核酸;
(c)二本鎖DNA;または
(d)逆転写反応の産物である、請求項1に記載の方法。 - 前記増幅するステップ(a)の前に逆転写反応によって非変性核酸を生成するステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記核酸増幅産物を検出するステップが、前記試料において、前記標的核酸配列を含む非変性核酸の量を決定するステップをさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸増幅産物を検出するステップが、前記試料において、前記標的核酸配列を含むdsDNAの量を決定するステップをさらに含む、請求項3に記載の方法。
- 非変性核酸を、増幅ステップの前または増幅ステップの間に一本鎖DNA結合性タンパク質と接触させるステップを含まない、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- dsDNAを、増幅ステップの前または増幅ステップの間に一本鎖DNA結合性タンパク質と接触させるステップを含まない、請求項5に記載の方法。
- 前記標的核酸配列が、細菌核酸配列またはウイルス核酸配列である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を有する酵素が、逆転写酵素活性を有する、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、原核生物または真核生物由来のRNAを含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸配列を等温増幅条件下で増幅するステップが、55℃から75℃の一定温度で行われる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプライマー、前記第2のプライマー、または前記第1のプライマーおよび前記第2のプライマーの両方が(a)8~16塩基の長さであるか、(b)1つ以上のDNA塩基、修飾DNA塩基、またはその組み合わせを含むか、または(a)および(b)の両方である、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸増幅産物が20~40塩基の長さである、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スペーサー配列が、前記標的核酸配列の一部分を含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸増幅産物を検出するステップが、
(a)前記核酸増幅産物を、前記増幅産物にハイブリダイズすることができるシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記シグナル生成オリゴヌクレオチドが、フルオロフォアおよび消光剤を含む、ステップ、または
(b)蛍光シグナルを検出するステップ
を含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。 - 単一の反応容器中で行われる、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記逆転写反応の産物が、細胞性RNA、mRNA、マイクロRNA、細菌RNA、またはウイルスRNAから生成される逆転写反応の産物である、請求項2に記載の方法。
- 前記試料がウイルスまたは細菌由来のRNAを含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸配列を等温増幅条件下で増幅するステップが、65℃の一定温度で行われる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スペーサー配列が、1~5塩基の長さである、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛍光シグナルが、分子ビーコンに由来する、請求項15に記載の方法。
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