ES2579803T3 - Composiciones y métodos mejorados para la síntesis de ADNc - Google Patents

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Abstract

Una mezcla de reactivo almacenable adecuada para usarse en una reacción de transcripción inversa de al menos un ácido nucleico molde, donde la mezcla de reactivo está lista para uso como una mezcla maestra y se puede usar directamente para una reacción de transcripción inversa sin adición de transcriptasa inversa adicional, y en donde dicha mezcla de reactivo comprende: a) glicerol en una concentración entre 10% y 40% y, b) una transcriptasa inversa, en donde dicha transcriptasa inversa se selecciona entre el grupo que consiste en AMV RT, RSV RT, MML RT, HIV RT, EIAV RT, RAV2 RT, THERMOSCRIPT RTMMLV, 1) y sus mutantes de RNasa H-, SUPERSCRIPT II RT, y SUPERSCRIPT 1RT, y c) un tampón, en donde dicho tampón comprende además: un ion metálico necesario para la actividad de la transcriptasa inversa; y nucleósido trifosfatos.

Description

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Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es la Tabla 1 que muestra secuencias de Cebadores de qPCR e información de Secuencia de ARNm Diana.
La Figura 2 es la Tabla 2 que muestra valores CT promedios para SYBR Green qRT-PCR de los ADNcs de primera cadena iniciados con cantidades variantes de hexámero aleatorio u oligo(dT)20.
La Figura 3 es la Tabla 3 que muestra valores de CT promedios para SYBR Green qRT-PCR de los ADNcs de primera cadena sintetizados en presencia de diferentes cationes. El texto en negrita indica el CT promedio más bajo para cada conjunto de reacción. (NA = no amplificación)
La Figura 4 es la Tabla 4 que muestra la información de estabilidad para diversas mezclas de reacción para usarse en reacciones de transcripción inversa.
Descripción detallada de la invención
Sorprendentemente, se ha encontrado que variando la concentración y las relaciones de oligo dT y los cebadores aleatorios, la eficacia de la síntesis de ADNc y la representación uniforme de las secuencias de ARNm se pueden mejorar enormemente. Estos mejoramientos se realizaron usando una cantidad fijada de una mezcla de oligo(dT) y cebador aleatorio sobre un amplio intervalo de cantidades de patrón de ARN de inicio. Aunque la relación de cebador y ARNm variase sobre 6 órdenes de magnitud, tanto la representación relativa como absoluta de la secuencia de ARNm se mantenía en la ADNc. A diferencia de los descubrimientos de estudios anteriores, sorprendentemente se ha descubierto que incluso cuando se usa transcriptasas inversas tipo salvaje con completa actividad de RNasa H, la sensibilidad de detección se puede mejorar debido a mejor conversión y más eficiente de ARNm en ADNc.
Un sorprendente descubrimiento adicional es que las condiciones de reacción mejoradas para la síntesis de ADNc se pueden obtener a través de la inclusión de una cantidad eficaz de una sal de litio en la mezcla de reacción, dando como resultado rendimiento de ADNc inesperadamente aumentado, particularmente a bajas concentraciones de patrón de ARN. Otros aspectos de la descripción se refieren a mezclas de reacción concentradas estabilizadas para la síntesis de ADNc de primera cadena que simplifican y mejoran la fiabilidad de la transcripción inversa.
Por lo tanto, la presente descripción se refiere a métodos de aumento de la eficacia de síntesis de ADNc y más particularmente, de aumento de la sensibilidad y exactitud de cuantificación de la expresión génica. Por tanto, la presente descripción proporciona síntesis de ADNc mejorada útil en el descubrimiento del gen, investigación genómica, diagnósticos e identificación de genes expresados diferentemente e identificación de genes de importancia a enfermedad.
Uso de combinaciones de cebador
Específicamente, la presente descripción describe nuevas combinaciones de cebador que proporcionan inicio más eficiente y uniforme para la síntesis de ADNc. La concentración y combinaciones de los cebadores aleatorios y oligo dT usados proporcionan conversión eficiente y representativa de secuencias de ARNm en ADNc. Este método proporciona conversión superior y no sesgada de secuencias de ARNm en ADNc sin reparar en la distancia a partir del extremo 3’ del ARNm.
De acuerdo con la descripción los cebadores aleatorios se pueden mezclar con oligo dT para iniciar la síntesis de ADNc. Una diversidad de concentraciones y relaciones de cada tipo de cebador se pueden usar de acuerdo con el método de la descripción. Sorprendentemente se ha encontrado que la amplificación óptima de algunos genes requiere oligo dT mientras que otros requieren cebadores aleatorios. Al combinar tanto los tipos de cebador como una mezcla de esta descripción produce síntesis de ADNc óptima y amplificación para todos los ARNm sin reparar en la proximidad de la región de amplificación a los extremos 3’ o 5’. Lo cebadores aleatorios usados de acuerdo con la descripción varían en tamaño desde 5 bases a 12 bases.
La longitud del oligo dT puede variar de 8 bases a 30 bases. Se pueden usar otros tipos de cebadores con diferente composición en lugar de oligo dT. Ejemplos de tales composiciones incluyen, pero no se limitan a, oligo dT donde la base 3’ es A o C, o G (dT anclado). Alternativamente, dos bases en el extremo 3’ pueden ser variables y pueden ser cualquier combinación de A, C o G. También se pueden usar otras secuencias o restos que pueden emparejarse por base con secuencias de poli A de ARNm. Un ejemplo, sin limitación, es la deoxi uridina (dU).
La cantidad de cebadores aleatorios pueden variar entre 25 ng y 800 ng para cada reacción (20 uL), por ejemplo, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600 o 700 ng o valores intermedios. De acuerdo con los métodos de la descripción la concentración de oligo dT puede ser 25 nM o 500 nM, por ejemplo, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 2.000, 3.000 o 4.000 nM o valores intermedios. Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden usar diversas relaciones de cebadores aleatorios y oligo dT.
Los expertos en la técnica reconocerán que cuando las concentraciones de los cebadores aleatorios o oligo dT
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Tris-HCl, HEPES, etc, son bien conocidos en la técnica. Los iones metálicos necesarios para la actividad de RT, tal como Mg y un catión monovalente tal como Li, K, Na o NH4 pueden estar presentes en concentraciones que son adecuadas para la actividad RT sobre la adición a una disolución de patrón. Los componentes adicionales que pueden estar presentes son un agente de reducción, tal como DTT, moléculas cebador tales como cebadores específicos a gen, cebadores aleatorios de cualquier longitud adecuada, compuestos de oligo(dT) de cualquier longitud adecuada, moléculas de oligo(dT) ancladas de longitud adecuada, detergentes o mezclas de detergentes tales como Tween, NP-40 y Igepal CA-630 y reactivos equivalentes, dNTPs, y una o más proteínas inhibidoras de RNasa. Las cantidades relativas contenidas en la mezcla de tales reactivos necesarios para usarse en las reacciones de RT, cuando están presentes, pueden ser fácilmente determinadas por los expertos en la técnica. Además, al menos una polimerasa de ADN termoestable también puede estar presente, la cual se puede usar para reacciones de PCR posteriores o similares.
Por consiguiente, la presente invención proporciona configuraciones recientemente mejoradas, convenientes y preparadas para usar para la síntesis de ADNc. La invención reduce el número de adiciones para la reunión de las reacciones de síntesis de ADNc que es altamente buscada por los investigadores especialmente en aplicaciones de alta producción.
De acuerdo con la invención, las mezclas preparadas para usar para la síntesis de ADNc se pueden realizar a diferentes concentraciones y proporcionar como 1X a 20X “mezclas maestras”. Lo siguiente es un ejemplo de una 5X mezcla maestra para la síntesis de ADNc que contiene todos los componentes necesarios para la síntesis de ADNc de acuerdo con los métodos de esta invención. Usando 4 uL de esta mezcla maestra y la preparación de ARN de interés a un volumen total de 20 uL proporciona una mezcla de reacción completa para la conversión de ARN en ADNc. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente cómo preparar las 1x a 20x mezclas maestras adecuadas.
Formulación para la 5X mezcla maestra de ADNc:
5X Tampón (Tris-HCl 0,1 M, pH 8,4, KCl 0,25 M)
LiCl 0,1 M
MgCl2 25 mM
dNTP 2,5 mM (cada uno)
DTT 50 mM
Oligo(dT)20 500 nM
Cebador aleatorio 50 ug/ml
Glicerol al 30%
Igepal CA-630 al 0,005%
Tween 20 al 0,005%
MMLV RT 10.000 U/ml
Proteína inhibidora de RNasa 5.000 U/ml
Además de la anterior formulación, se prepararon otras tres mezclas maestras que contenían todos los reactivos excepto los cebadores.
Mezcla RT 1 no tenía cebadores.
Mezcla RT 2 contenía oligo dT como cebadores.
Mezcla RT 3 contenía hexámeros aleatorios y octámeros como cebadores.
Se encontró que todas las anteriores 5X mezclas maestras de ADNc eran estables durante meses cuando se almacenaban a -20ºC. La Tabla 4 muestra los resultados y la eficacia de la síntesis de ADNc con estas mezclas maestras comparadas con los reactivos almacenados por separado bajo condiciones recomendadas en la bibliografía.
Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden usar una diversidad de diferentes transcriptasas inversas de acuerdo con la invención. Las transcriptasas inversas pueden incluir, sin limitación, AMV RT, RSV RT, MMLV RT, mutantes de RNasa H-de diversas transcriptasas inversas, HTV RT, EIAV RT, RAV2 RT, TTH ADN polimerasa, ADN polimerasa de C. hydrogenoformans, Superscript II RT, Superscript I RT, Thermoscript RT y mezclas de los mismos. También será obvio que uno o más de los componentes de la anterior mezcla maestra se puede sustituir con otro reactivo o proteína equivalente. Por ejemplo, hay un número de diferentes proteínas
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inhibidoras de RNasa que se pueden usar. Si se desea, la proteína inhibidora de RNasa también se puede excluir de la mezcla puesto que no siempre es necesaria para la síntesis de ADNc. Las ADN polimerasas termoestables adecuadas para usarse en las mezclas maestras son bien conocidas en la técnica e incluyen ADN polimerasas Taq, Tth, Tne, Tma, Tli, Pfu, Pwo, Bst, Bca, Sac, Tac, Tfl/Tub, Tru, Mth, Mtb y Mlep y similares.
También se puede variar la composición del 5X tampón, por ejemplo, mediante el uso de otros tampones tales como tampones que contienen sulfato o tampones basados en acetato que se han usado para la síntesis de ADNc. Será aparente para los expertos en la técnica que se pueden optimizar las diferentes formulaciones para diferentes aplicaciones.
Tal como se ha descrito anteriormente, la amplificación de las secuencias de ARN mediante PCR se pueden conseguir mediante un protocolo de dos etapas o de una etapa. Las formulaciones de mezcla maestra se pueden preparar por el uso de RT PCR en una etapa cambiando los cebadores y mediante la inclusión de una ADN polimerasa termoestable apropiada tal como ADN polimerasa Taq. Se han descrito una diversidad de formulaciones para la RT PCR en una etapa, sin embargo, en todos los casos los tampones y las enzimas se mantienen por separado y solamente se mezclan inmediatamente antes de la reacción de transcripción inversa. De acuerdo con los métodos de la invención, la transcriptasa inversa, la ADN polimerasa Taq y tampones, dNTP’s, cofactores y todos los otros componentes para la RT PCR en una etapa se pueden mezclar juntos en una diversidad de concentraciones diferentes para proporcionar una mezcla maestra preparada para usar.
Ejemplos
Métodos:
Aislamiento y purificación del ARN:
Se aisló ARN total de célula HeLa S3 usando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con la recomendación del fabricante. Después del tratamiento con ADNasa libre de RNasa para degradar la contaminación de ADN genómico residual, se purificó el ARN mediante un cartucho de centrifuga de sílice, RNeasy, (Qiagen), y se cuantificó mediante absorbancia óptica a 260 nm.
Síntesis de ADNc:
La síntesis de ADNc de primera cadena se llevó a acabo usando componentes suministrados del Sistema de Síntesis de Primera Cadena SuperScript para RT PCR, (Invitrogen). En ciertos experimentos, M-MLV RT, diluido a 50 U/µl en tampón de almacenamiento de enzima, se sustituyó por SuperScript II RT. Los cebadores para la síntesis de ADNc, hexámero, octámero, u oligo(dT)20 eran de Oligos Etc. Las reacciones (volúmenes de 20 µl) se juntaron sobre hielo con todos los componentes requeridos incluyendo: tampón (Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM); 0,5 mM cada dNTP, cloruro de magnesio 5 mM, ditiotreitol (DTT) 10 mM, 20 unidades de proteína inhibidora de RNasa, 50 unidades de transcriptasa inversa, variando cantidades de ARN total de célula HeLa, y cebador(es) como se indica en cada ejemplo. Las reacciones de primera cadena se incubaron 5-10 min a 25ºC, seguido de 30 minutos a 42ºC. Después de la síntesis de primera cadena, las reacciones se finalizaron por calor a 85ºC durante 5 min, se diluyeron en tampón TE y se almacenaron a 4ºC.
PCR cuantitativa en tiempo real:
La PCR en tiempo real se llevó a cabo en volúmenes de reacción de 50 µl usando el iCycler y iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories) de acuerdo con la recomendación del fabricante. Las mezclas maestras específicas objeto se prepararon con 300 nM cada cebador y se dispensaron como volúmenes de 40 µl en placas de PCR de 96 pocillos. Se añadió la muestra de ADNc (10 µl) a los pocillos apropiados y la placa se selló con una película de sellado por calor clara (Marsh Bio Products). Las reacciones se mezclaron mediante agitación por vortex a continuación se centrifugaron brevemente para recoger los contenidos en el fondo de cada pocillo. Las qPCRs se incubaron durante 3 min a 95ºC seguido de 45 ciclos de 95ºC, 3 min; 60ºC, 30 s. Se recogió la señal fluorescente y se analizó en la etapa de alineamiento/extensión a 60ºC.
Secuencias de cebador para qPCR:
Los cebadores usados para la PCR en tiempo real con SYBR Green I se diseñaron usando el programa de ordenador OLIGO (Molecular Biology Insights) o Cebador Express (Applied Biosystems). La información del cebador y la secuencia diana están resumidas en la tabla 1.
La presente invención, generalmente así descrita, se entenderá más fácilmente en referencia a los siguientes ejemplos, los cuales están proporcionados a modo de ilustración y no se entienden como limitantes de la presente invención.
Ejemplo I: el método de inicio del ADNc influye en la cuantificación de ARNm mediante RT-PCR en tiempo real
Se usaron diversas cantidades de hexámero aleatorio (25 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng o 400 ng) u oligo(dT)20 (25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 0,5 µM, 1µM o 2µM) o una mezcla de 250 ng de hexámero y oligo(dT)20 100 nM para iniciar
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ciclos antes (rendimiento de ADNc 4 veces mayor) en comparación con las reacciones de ADNc suplementadas con una cantidad equivalente de potasio. La qRT-PCR en dos etapas desde cantidades superiores de patrón total de ARN (200 ng) también mostró sensibilidades de detección mejoradas cuando el litio estaba incluido en la reacción de ADNc. En promedio, el CT para el producto de qRT-PCR a partir de reacciones de ADNc que contenían litio
5 fueron de 0,3 ciclos más bajo que las reacciones control o las reacciones suplementadas con potasio 20 mM, y 0,4 ciclos más bajo que las reacciones de ADNc que contenían sodio 20 mM. Colectivamente estos datos demuestran que el ion litio mejora la eficacia y el rendimiento de la síntesis de ADNc mediante transcriptasa inversa retroviral.
Ejemplo III. Estabilidad de las mezclas maestras de ADNc:
Se prepararon tres mezclas maestras de ADN de acuerdo con las formulaciones descritas anteriormente y se
10 almacenaron a -20ºC. A los tiempos indicados (tabla 4) los reactivos se ensayaron funcionalmente mediante la síntesis de ADNc usando 1 ug de ARN de HeLa como patrón. Como control también se usaron un conjunto de reactivos idénticamente preparado que se había almacenado por separado (en tampones recomendados en la bibliografía) para juntar una reacción de ADNc recientemente producido. La síntesis de ADNc se inició a temperatura ambiente durante 5 minutos seguido de 30 min de incubación a 42ºC. Las reacciones se pararon por inactivación por
15 calentamiento a 85ºC durante 5 min y se diluyeron 10 veces con el tampón TE. Las muestras diluidas se almacenaron congeladas hasta que se ensayaron por Q-PCR usando un conjunto de cebadores para beta actina. El protocolo de amplificación está descrito en la anterior sección de amplificación usando IQ SYBR Green supermix y BioRad IQ cycler. Las amplificaciones se realizaron por triplicado usando 1/20 de la reacción de ADNc (50 ng de ARN analizado en cada reacción de amplificación).
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