CN109196114A - 等温扩增组分和工艺 - Google Patents

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Abstract

本技术部分涉及用于核酸等温扩增的方法和组合物。

Description

等温扩增组分和工艺
相关专利申请
本专利申请要求2016年4月4日提交的名称为“等温扩增组分和工艺(ISOTHERMALAMPLIFICATION COMPONENTS AND PROCESSES)”的美国专利申请第15/090,405号的权益，该美国专利申请指定Andrew P.Miller和Honghua Zhang为发明人，并指定代理人案卷号NAT-1001-UTt。出于所有目的，前述申请的全部内容通过引用并入本文，包括所有文本、表格和附图。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式通过电子方式提交，并且其全部内容通过引用并入本文。2017年3月2日创建的所述ASCII拷贝被命名为NAT-1001-PC_SL.txt，大小为16,533字节。
技术领域
本技术部分涉及用于核酸等温扩增的方法和组合物。
背景技术
基于核酸的诊断可用于快速检测感染、疾病和/或遗传变异。例如，鉴定样品中的细菌或病毒核酸可用于诊断特定类型的感染。其他实例包括鉴定用于疾病管理或法医学的单核苷酸多态性，以及鉴定指示遗传修饰食品的遗传变异。通常，基于核酸的诊断测定需要扩增样品中特定部分的核酸。用于核酸扩增的常用技术是聚合酶链式反应(PCR)。该技术通常需要温度循环(即热循环)以进行以下步骤：变性(即，双链DNA(dsDNA)复合物中的链的分离)、寡核苷酸引物(互补DNA序列的短链)的退火和通过聚合酶沿着互补靶标延伸引物。这种热循环可能是耗时的过程，通常需要专门的机器。因此，需要可以在没有热循环的情况下进行的更快速的核酸扩增方法。这些方法可用于例如现场测试和即时诊断(point-of-carediagnostics)。
发明内容
本文在某些方面提供了用于扩增核酸的方法，其包括在等温扩增条件下使非变性样品核酸与包含以下物质的组分接触：a)至少一种寡核苷酸，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和b)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物。
本文还在某些方面提供了用于扩增核酸的方法，其包括在等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下组分接触：a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的的靶序列互补的多核苷酸，和b)由超嗜热菌聚合酶或包含与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶组成的酶组分，从而产生核酸扩增产物。
本文还在某些方面提供了用于扩增核酸的方法，其包括在等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下组分接触：a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和b)由i)超嗜热菌聚合酶活性和任选地ii)逆转录酶活性组成的酶活性，从而产生核酸扩增产物。
本文还在某些方面提供了用于加工核酸的方法，其包括扩增核酸，其中所述扩增基本上由在等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触组成：a)至少一种寡核苷酸，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和b)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物。
本文还在某些方面提供了用于加工核酸的方法，其包括扩增核酸，其中所述扩增基本上由在等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触组成：a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和b)由超嗜热菌聚合酶或包含与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶组成的酶组分，从而产生核酸扩增产物。
本文还在某些方面提供了用于加工核酸的方法，其包括扩增核酸，其中所述扩增基本上由在等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触组成：a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和b)由i)超嗜热菌聚合酶活性和任选地ii)逆转录酶活性组成的酶活性，从而产生核酸扩增产物。
本文还在某些方面提供了用于加工核酸的方法，其包括扩增核酸，其中所述扩增由在等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触组成：a)至少一种寡核苷酸，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和b)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物。
本文还在某些方面提供了用于加工核酸的方法，其包括扩增核酸，其中所述扩增由在等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触组成：a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和b)由超嗜热菌聚合酶或包含与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶组成的酶组分，从而产生核酸扩增产物。
本文还在某些方面提供了用于加工核酸的方法，其包括扩增核酸，其中所述扩增由在等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触组成：a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和b)由i)超嗜热菌聚合酶活性和任选地ii)逆转录酶活性组成的酶活性，从而产生核酸扩增产物。
本文还在某些方面提供了用于确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的方法，其包括a)扩增所述样品核酸中的靶序列，其中所述靶序列包含第一链和第二链，所述第一链和第二链彼此互补，并且所述扩增包括在无解旋酶和/或无重组酶的等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触：i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包含与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸，并且所述第二寡核苷酸包含与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸；和ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物，其中所述核酸扩增产物包含1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列，并且所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；和b)检测所述核酸扩增产物，其中检测所述核酸扩增产物包括使用实时检测方法，并且在所述样品核酸与(a)(i)和(a)(ii)接触后的10分钟或更短时间内进行，由此确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量。
本文还在某些方面提供了用于确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的方法，其包括a)扩增所述样品核酸中的靶序列，所述靶序列包含第一链和第二链，所述第一链和第二链彼此互补，其中所述扩增包括在无解旋酶和/或无重组酶的等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触：i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸由与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成；和ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物，其中所述核酸扩增产物由以下组成：1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列，其中所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；和b)检测所述核酸扩增产物，其中检测所述核酸扩增产物包括使用实时检测方法，并且在所述样品核酸与(a)(i)和(a)(ii)接触后的10分钟或更短时间内进行，由此确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量。
本文还在某些方面提供了用于确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的试剂盒，其包含a)用于在无解旋酶和/或无重组酶的等温扩增条件下扩增所述样品核酸中的靶序列的组分，所述组分包含i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包含与所述靶序列的第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸，并且所述第二寡核苷酸包含与所述靶序列的第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸，所述靶序列的所述第一链和第二链彼此互补；和ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分；和b)至少一种为核酸扩增产物提供实时检测活性的组分。
本文还在某些方面提供了用于确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的试剂盒，其包含a)用于在无解旋酶和/或无重组酶的等温扩增条件下扩增所述样品核酸中的靶序列的组分，所述组分包含i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸由与所述靶序列的第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述靶序列的第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成，所述靶序列的所述第一链和第二链彼此互补；和ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分；和b)至少一种为核酸扩增产物提供实时检测活性的组分。
在以下说明、实施例、权利要求和附图中进一步描述了某些实施方案。
附图说明
附图示出了本技术的某些实施方案，并且不是限制性的。为了清楚和便于说明，附图未按比例绘制，并且在一些情况下，可扩大或放大地示出各个方面以便于理解特定实施方案。
图1显示了用dH2O或Tris-EDTA缓冲液(TE)作为无靶对照(NTC；阴性对照)一式两份进行的衣原体基因组DNA扩增反应的实时检测。
图2显示了衣原体基因组DNA测定产物的电喷雾电离质谱(ESI-MS)检测。
图3显示了通过终点分子信标检测的衣原体基因组DNA检测限(LOD)。
图4显示了通过分子信标的衣原体基因组DNA实时检测。
图5显示了本文所述的等温扩增反应的示意图。
具体实施方式
本文提供了用于扩增核酸的方法和组合物。传统的核酸扩增方法通常需要热循环过程、核酸变性、促进链解旋、链分离和/或链交换的蛋白质(例如酶)(例如解旋酶、重组酶)和/或核酸内切酶试剂(例如限制性内切酶、切口酶)，并且通常需要20至30分钟的最短反应时间。本文提供的核酸扩增方法可以在没有热循环、没有核酸变性、没有添加用于促进链解旋、链分离和/或链交换的蛋白质(例如酶)、没有核酸内切酶试剂的情况下和在10分钟的反应时间内进行。
核酸、受试者、样品和核酸加工
本文提供了用于扩增核酸的方法和组合物。术语“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用。这些术语是指任何组成的核酸，例如DNA(例如互补DNA(cDNA)、基因组DNA(gDNA)等)、RNA(例如信使RNA(mRNA)、短抑制RNA(siRNA)、核糖体RNA(rRNA)、tRNA、微小RNA)和/或DNA或RNA类似物(例如，含有碱基类似物、糖类似物和/或非天然骨架等)、RNA/DNA杂合体和聚酰胺核酸(PNA)，所有这些都可以是单链或双链形式，并且除非另有限制，否则可以涵盖天然核苷酸的已知类似物，其可以与天然存在的核苷酸类似的方式起作用。核酸可以是或可以来自质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒、人工染色体、染色体或能够在体外或在宿主细胞、细胞、细胞核、线粒体中或者在某些实施方案中在细胞的细胞质中复制或被复制的其他核酸。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性并以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因，直系同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。术语核酸可与基因座、基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。该术语还可以包括单链(“有义”或“反义”、“正”链或“负”链、“正向”阅读框或“反向”阅读框、“正向”链或“反向”链)和双链多核苷酸作为从核苷酸类似物合成的RNA或DNA的等同物、衍生物、变异体和类似物。术语“基因”意指参与产生多肽链的DNA片段；并且通常包括参与基因产物的转录/翻译和转录/翻译调节的编码区之前和之后的区域(前导序列和尾随序列)，以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。核苷酸或碱基通常是指核酸的嘌呤和嘧啶分子单元(例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C))。对于RNA，碱基胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。核酸长度或大小可以表示为碱基数。
在本文提供的方法的一些实施方案中，扩增一种或多种核酸靶标。靶核酸可以称为靶序列、靶多核苷酸和/或靶多核苷酸序列，并且可以包括双链和单链核酸分子。靶核酸可以是例如DNA或RNA。在靶核酸是RNA分子的情况下，分子可以是例如双链、单链，或RNA分子可以包含单链的靶序列。在靶核酸是双链的情况下，靶核酸通常包括第一链和第二链。第一链和第二链可以称为正向链和反向链，并且通常彼此互补。在靶核酸是单链的情况下，可以例如通过聚合和/或逆转录产生互补链，使靶核酸成为双链并具有第一/正向链和第二/反向链。
靶序列可以指核酸序列的有义链或反义链，并且还可以指存在于原始靶序列的靶核酸、扩增的拷贝或扩增产物上的序列。靶序列可以是较大多核苷酸内的子序列。例如，靶序列可以是核酸片段、染色体、质粒内的被靶向以进行扩增的短序列(例如20至50个碱基)。在一些实施方案中，靶序列可以指靶核酸中与用于扩增核酸的寡核苷酸(例如引物)互补的序列。因此，靶序列可以指被靶向以进行扩增的整个序列，或者可以指寡核苷酸结合的靶核酸中的子序列。扩增产物可以是包含靶序列以及至少一种其他序列或其他核苷酸的较大分子。在一些实施方案中，扩增产物与靶序列的长度大约相同。在一些实施方案中，扩增产物与靶序列的长度完全相同。在一些实施方案中，扩增产物包含靶序列。在一些实施方案中，扩增产物由靶序列组成。
靶序列的长度和/或鸟苷胞嘧啶(GC)浓度(百分比)可部分取决于扩增反应进行的温度，并且该温度可部分取决于反应中使用的聚合酶的稳定性。可以进行样品测定以确定用于一组反应条件的合适的靶序列长度和GC浓度。例如，当聚合酶在高达60℃至65℃下稳定时，则靶序列可以是例如长度为19至50个核苷酸，或例如长度为约40至50、20至45、20至40或20至30个核苷酸。在这些条件下的GC浓度可以是例如小于60％，小于55％，小于50％，或小于45％。
靶核酸可包括例如基因组核酸、质粒核酸、线粒体核酸、细胞核酸、细胞外核酸、细菌核酸和病毒核酸。在一些实施方案中，靶核酸可包括基因组DNA、染色体DNA、质粒DNA、线粒体DNA、基因、任何类型的细胞RNA、信使RNA、细菌RNA、病毒RNA或合成寡核苷酸。基因组核酸可包括来自任何基因组的任何核酸，例如包括动物、植物、昆虫、病毒和细菌基因组，包括例如存在于孢子中的基因组。在一些实施方案中，基因组靶核酸可以在特定基因组基因座(genomic locus)或多个基因组基因座内。基因组基因座可包括开放阅读框DNA、非转录DNA、内含子序列、外显子序列、启动子序列、增强子序列、侧翼序列或任何被认为与给定基因组基因座相关的序列中的任何一种或组合。
在一些实施方案中，靶序列包含一个或多个重复元件(例如，多重复序列、反向重复序列、回文序列、串联重复序列、微卫星、小卫星等)。在一些实施方案中，靶序列作为重复元件(例如，多重复序列、反向重复序列、回文序列、串联重复序列、微卫星重复序列、小卫星重复序列等)存在于样品核酸内(例如，存在于核酸片段、染色体、基因组、质粒内)。例如，靶序列可以作为重复元件多次出现，并且可以使用本文描述的方法扩增重复元件内的一个、一些或所有出现的靶序列(例如，使用单对引物)。在一些实施方案中，靶序列作为复制物和/或旁系同源物存在于样品核酸内(例如，存在于核酸片段、染色体、基因组、质粒内)。
靶核酸可包括微小RNA(microRNA)。微小RNA、miRNA或小时序RNA(small temporalRNA，stRNA)是参与基因调节的短的(例如，长约21至23个核苷酸)单链RNA序列。微小RNA可干扰信使RNA的翻译，并且与信使RNA部分互补。靶核酸可包括微小RNA前体，例如初级转录物(pri-miRNA)和pre-miRNA茎-环结构的RNA，其进一步加工成miRNA。靶核酸可包括短干扰RNA(siRNA)，其是参与RNA干扰(例如，下调病毒复制或基因表达))的短(例如约20至25个核苷酸长)的至少部分双链的RNA分子。
本文所述方法中使用的核酸可以从任何合适的生物样本或样品中获得，并且通常从获自受试者的样品中分离。受试者可以是任何活的或非活的有机体，包括但不限于人、非人动物、植物、细菌、真菌、病毒或原生生物。可以选择任何人或非人动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、禽类、两栖动物、鱼类、有蹄类动物、反刍动物、牛科动物(例如牛)、马科动物(例如马)、山羊(caprine)和绵羊(ovine)(例如，绵羊(sheep)、山羊(goat))、猪科动物(例如猪)、骆驼科动物(例如骆驼、美洲驼、羊驼)、猴子、猿(例如大猩猩、黑猩猩)、熊科动物(例如熊)、家禽、狗、猫、小鼠、大鼠、鱼、海豚、鲸鱼和鲨鱼。受试者可以是男性或女性，并且受试者可以是任何年龄(例如，胚胎、胎儿、婴儿、儿童、成人)。
样品或测试样品可以是从受试者或其部分分离或获得的任何样本。样本的非限制性实例包括来自受试者的液体或组织，包括但不限于血液或血液制品(例如血清、血浆等)、脐带血、骨髓、绒毛膜、羊水、脑脊髓液、脊髓液、灌洗液(例如支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳、关节镜下)、活检样品、腹腔穿刺(celocentesis)样品、细胞(例如血细胞)或其部分(例如线粒体、细胞核、提取物等)、女性生殖道洗液、尿液、粪便、痰液、唾液、鼻粘液、前列腺液、灌洗液、精液、淋巴液、胆汁、眼泪、汗液、母乳、乳腺体液、硬组织(例如肝脏、脾脏、肾脏、肺或卵巢)等或其组合。术语血液涵盖全血、血液制品或任何血液部分，例如常规定义的血清、血浆、血沉棕黄层等。血浆是指用抗凝血剂处理的血液经过离心后产生的全血级分。血清是指血液样品凝固后剩余的液体的水状部分。通常根据医院或诊所通常遵循的标准方案收集液体或组织样品。对于血液，通常收集适量的外周血(例如，在3-40毫升之间)，并且可以在制备之前或之后根据标准程序储存。
样品或测试样品可包括含有孢子、病毒、细胞、来自原核生物或真核生物的核酸、或任何游离核酸的样品。例如，本文描述的方法可用于检测孢子外部上的核酸(例如，不需要裂解)。可以从怀疑含有靶序列的任何材料中，例如从上述受试者中分离样品。在某些情况下，靶序列可以存在于空气、植物、土壤或怀疑含有生物有机体的其他材料中。
可以通过本领域已知的方法从一种或多种来源衍生(例如分离、提取、纯化)核酸。任何合适的方法都可用于从生物样品中分离、提取和/或纯化核酸，所述方法的非限制性实例包括本领域中的DNA制备方法，以及各种市售试剂或试剂盒，例如Qiagen的QIAampCirculating Nucleic Acid Kit(QIAamp循环核酸试剂盒)、QiaAmp DNA Mini Kit(QiaAmpDNA小型试剂盒)或QiaAmp DNA Blood Mini Kit(QiaAmp DNA血液小型试剂盒)(Qiagen,Hilden,Germany)、GenomicPrepTMBlood DNA Isolation Kit(GenomicPrepTM血液DNA分离试剂盒)(Promega,Madison,Wis.)、GFXTMGenomic Blood DNA Purification Kit(GFXTM基因组血液DNA纯化试剂盒)(Amersham,Piscataway,N.J.)等或其组合。
在一些实施方案中，进行细胞裂解程序。细胞裂解可以在开始本文所述的扩增反应之前进行(例如，以便从细胞中释放DNA和/或RNA用于扩增)。细胞裂解程序和试剂是本领域已知的，并且通常可以通过化学(例如，洗涤剂、低渗溶液、酶促程序等，或其组合)、物理(例如，法式压榨(French press)、超声处理等)或电解裂解方法来进行。可以使用任何合适的裂解程序。例如，化学方法通常使用裂解剂破坏细胞并从细胞中提取核酸，然后用离液盐处理。在一些实施方案中，细胞裂解包括使用洗涤剂(例如，离子、非离子、阴离子、两性离子)。在一些实施方案中，细胞裂解包括使用离子洗涤剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸钠(SLS)、脱氧胆酸盐、胆酸盐、月桂酰肌氨酸(sarkosyl))。物理方法，例如冷冻/解冻然后研磨，使用细胞压榨机等也可能是有用的。也可以使用高盐裂解程序。例如，可以使用碱裂解程序。后一种程序传统上包含使用苯酚-氯仿溶液，并且可以使用涉及三种溶液的替代性的不含苯酚-氯仿的程序。在后一种程序中，例如，一种溶液可含有15mM Tris(pH8.0)、10mM EDTA和100μg/ml Rnase A；第二种溶液可含有0.2N NaOH和1％SDS；第三种溶液可含有3M KOAc(pH 5.5)。在一些实施方案中，细胞裂解缓冲液与本文所述的方法和组分结合使用。
在某些实施方案中，可以提供核酸用于进行本文所述的方法而无需加工含有所述核酸的样品。例如，在一些实施方案中，提供核酸用于进行本文所述的扩增方法而无需预先纯化核酸。在一些实施方案中，直接从样品扩增靶序列(例如，不进行任何核酸提取、分离、纯化和/或部分纯化步骤)。在一些实施方案中，在加工含有核酸的样品之后提供所述核酸用于进行本文所述的方法。例如，可以从样品中提取、分离、纯化或部分纯化核酸。术语“分离的”通常是指从其原始环境(例如，其天然存在时的自然环境，或外源表达时的宿主细胞)中移除的核酸，因此通过人为干预(例如，“用人手”)从其原始环境改变。术语“分离的核酸”可以指从受试者(例如，人受试者)中移除的核酸。可以提供分离的核酸，其具有比源样品中存在的组分的量更少的非核酸组分(例如，蛋白质、脂质、碳水化合物)。包含分离的核酸的组合物可以约50％至大于99％不含非核酸组分。包含分离的核酸的组合物可以约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含非核酸组分。术语“纯化的”通常是指提供的核酸所含有的非核酸组分(例如，蛋白质、脂质、碳水化合物)少于在核酸进行纯化程序之前存在的非核酸组分的量。包含纯化的核酸的组合物可以约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含其他非核酸组分。
可以提供核酸用于进行本文所述的方法而无需修饰核酸。修饰可以包括例如变性、消化、切口、解旋、掺入和/或连接异源序列、添加表观遗传修饰、添加标记(例如，放射性标记例如32P、33P、125I或35S；酶标记例如碱性磷酸酶；荧光标记，例如异硫氰酸荧光素(FITC)；或其他标记，例如生物素、抗生物素蛋白、地高辛、抗原、半抗原、荧光染料)等。因此，在一些实施方案中，扩增未修饰的核酸。
扩增
本文提供了用于扩增核酸的方法。在一些实施方案中，使用合适的扩增工艺扩增核酸。核酸扩增典型地包括酶促合成核酸扩增子(拷贝)，其含有与被扩增的核苷酸序列互补的序列。在一些实施方案中，扩增方法在单个容器、单个腔室和/或单个体积(即，连续体积)中进行。在一些实施方案中，扩增方法和检测方法(例如，本文所述的检测方法)在单个容器、单个腔室和/或单个体积(即，连续体积)中进行。
术语“扩增(amplify)”、“扩增(amplification)”、“扩增反应(amplificationreaction)”或“扩增(amplifying)”是指用于增加靶核酸拷贝的任何体外过程。扩增有时是指靶核酸的“指数”增加。然而，“扩增”也可以指靶核酸数量的线性增加，但不同于一次性单引物延伸步骤。在一些实施方案中，可以进行有限的扩增反应，也称为预扩增。预扩增是一种其中由于执行少量循环(例如10个循环)而发生有限量的扩增的方法。预扩增可以允许一些扩增，但在指数期之前停止扩增，并且通常产生期望核苷酸序列的约500个拷贝。使用预扩增可在某些扩增反应中限制与耗尽的反应物相关的不准确性，并且还可减少由于靶标的核苷酸序列或物种丰度而引起的扩增偏好。在一些实施方案中，可以进行一次性引物延伸以作为线性或指数扩增的前奏。
本文提供了扩增过程的一般描述。例如，引物(例如本文所述的寡核苷酸)和靶核酸接触，互补序列彼此退火或杂交。引物可以在目的序列处或附近(例如，邻近、邻接等)与靶核酸退火。
与靶标退火的引物可以称为引物-靶标杂交体、杂交的引物-靶标或引物-靶标双链体。当涉及目的核苷酸序列时，术语“附近”或“邻近”是指引物末端与靶标的一个或多个核苷酸(例如核苷酸序列)之间的距离(例如，碱基数)或区域。通常，“邻近”是在距离目的核苷酸或核苷酸序列约1个核苷酸至约50个核苷酸(例如，1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、约10个核苷酸、约20个核苷酸、约30个核苷酸、约40个核苷酸、约50个核苷酸)的范围。在一些实施方案中，一组(例如，一对引物、正向和反向引物、第一寡核苷酸和第二寡核苷酸)中的引物在距目的核苷酸或核苷酸序列约1至20个核苷酸内退火并产生扩增产物。在一些实施方案中，引物在目的核苷酸或核苷酸序列内退火。退火后，每种引物通过聚合酶沿靶标(即模板链)延伸以产生互补链。可以进行几个引物退火和延伸循环，例如，直到产生可检测量的扩增产物。在一些实施方案中，当靶核酸是RNA时，可以在扩增步骤之前或期间通过逆转录合成靶RNA的DNA拷贝(cDNA)。
扩增反应的组分可包括例如一种或多种引物(例如，单个引物、引物对、引物组、寡核苷酸、用于多重扩增的多个引物组等)、核酸靶标(例如，来自样品的靶核酸)、一种或多种聚合酶、核苷酸(例如，dNTP等)和合适的缓冲液(例如，包含洗涤剂、还原剂、一价离子和二价离子的缓冲液)。在一些实施方案中，扩增反应可以还包括逆转录酶。在一些实施方案中，扩增反应可以还包括一种或多种检测剂，例如本文所述的一种或多种检测剂。在一些实施方案中，扩增反应的组分由引物、靶核酸、聚合酶、核苷酸和合适的缓冲液组成。在一些实施方案中，扩增反应的组分由引物、靶核酸、聚合酶、逆转录酶、核苷酸和合适的缓冲液组成。在一些实施方案中，扩增反应的组分由引物、靶核酸、聚合酶、检测剂、核苷酸和合适的缓冲液组成。在一些实施方案中，扩增反应的组分由引物、靶核酸、聚合酶、逆转录酶、检测剂、核苷酸和合适的缓冲液组成。在一些实施方案中，扩增反应的组分基本上由引物、靶核酸、聚合酶、核苷酸和合适的缓冲液组成。在一些实施方案中，扩增反应的组分基本上由引物、靶核酸、聚合酶、逆转录酶、核苷酸和合适的缓冲液组成。在一些实施方案中，扩增反应的组分基本上由引物、靶核酸、聚合酶、检测剂、核苷酸和合适的缓冲液组成。在一些实施方案中，扩增反应的组分基本上由引物、靶核酸、聚合酶、逆转录酶、检测剂、核苷酸和合适的缓冲液组成。当扩增反应的组分基本上由某些组分组成时，可以包括对扩增没有显著影响和/或不是产生可检测产物所必需的另外的组分或特征。例如，可以包括另外的组分或特征，其对本文中的组分和条件在等温条件下实现扩增的能力没有显著影响，并且在约10分钟或更短的时间内产生可检测的扩增产物。这些另外的组分或特征可以称为非必需组分，并且可以包括典型的反应组分和/或常用添加剂，例如盐、缓冲液、洗涤剂、离子、油、蛋白质、聚合物等。
核酸扩增可以在天然核苷酸(例如双脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP))和/或衍生的核苷酸存在下进行。天然核苷酸通常是指腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸、胸苷酸或尿苷酸。衍生的核苷酸通常是天然核苷酸以外的核苷酸。核苷酸通常如下命名。核糖核苷三磷酸被称为NTP或rNTP，其中N可以是A、G、C、U。脱氧核苷三磷酸底物被称为dNTP，其中N可以是A、G、C、T或U。单体核苷酸亚基可以在本文中表示为A、G、C、T或U，不特指DNA或RNA。在一些实施方案中，可以使用非天然存在的核苷酸或核苷酸类似物，例如含有可检测标记(例如荧光或比色标记)的类似物。例如，核酸扩增可以在经标记的dNTP存在下进行，例如，放射性标记例如32P、33P、125I或35S；酶标记例如碱性磷酸酶；荧光标记例如异硫氰酸荧光素(FITC)；或其他标记，例如生物素、抗生物素蛋白、地高辛、抗原、半抗原或荧光染料。在一些实施方案中，核酸扩增可以在修饰的dNTP存在下进行，例如热活化的dNTP(例如来自TriLink的CleanAmpTM dNTP)。
在一些实施方案中，扩增反应的组分可包括非酶组分和酶组分。非酶组分可包括例如引物、核苷酸、缓冲液、盐、还原剂、洗涤剂和离子；并且通常不包括蛋白质(例如，核酸结合蛋白)、酶或具有酶活性的蛋白质，例如聚合酶、逆转录酶、解旋酶、拓扑异构酶、连接酶、核酸外切酶、核酸内切酶、限制内切酶、切口酶、重组酶等。在一些实施方案中，酶组分可以由聚合酶组成或可以由聚合酶和逆转录酶组成。因此，此类酶组分将排除其他蛋白质(例如，核酸结合蛋白和/或具有酶活性的蛋白质)，例如解旋酶、拓扑异构酶、连接酶、核酸外切酶、核酸内切酶、限制内切酶、切口酶、重组酶等。
在一些实施方案中，扩增条件包括酶活性。典型地，酶活性由聚合酶提供，并且在某些情况下，酶活性由聚合酶和逆转录酶提供。在一些实施方案中，酶活性由聚合酶活性组成。在一些实施方案中，酶活性由聚合酶活性和逆转录酶活性组成。因此，在一些实施方案中，酶活性不包括由其他酶提供的酶活性，例如解旋酶、拓扑异构酶、连接酶、核酸外切酶、核酸内切酶、限制内切酶、切口酶、重组酶等。在某些情况下，聚合酶活性和逆转录酶活性由分开的酶或分开的酶类型(例如聚合酶和逆转录酶)提供。在某些情况下，聚合酶活性和逆转录酶活性由单一酶或酶类型(例如聚合酶)提供。
在一些实施方案中，核酸的扩增包括非热循环型聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施方案中，核酸的扩增包括等温扩增过程。在一些实施方案中，核酸的扩增包括等温聚合酶链式反应(iPCR)。等温扩增通常是在恒定温度下进行的扩增过程。例如等温条件、等温和恒定温度等术语通常是指在扩增反应过程中反应温度基本保持恒定的反应条件。等温扩增条件通常不包括扩增过程中的热循环(即，在较高温度和较低温度之间循环)组分。当在等温条件下扩增时，反应可以保持在基本恒定的温度下，这意味着温度可能不能维持在精确地一个温度。例如，由于例如环境变量或基于设备的变量，在等温扩增过程中可能发生温度的小波动(例如，±1至5摄氏度)。通常，整个反应体积保持在基本恒定的温度，并且本文中的等温反应通常不包括依赖于在反应容器内产生的温度梯度和/或基于对流流动的温度循环的扩增条件。
本文中的等温扩增反应可在基本恒定的温度下进行。在一些实施方案中，本文的等温扩增反应在约55摄氏度的温度至约75摄氏度的温度下进行。例如，本文的等温扩增反应可以在约55摄氏度、约56摄氏度、约57摄氏度、约58摄氏度、约59摄氏度、约60摄氏度、约61摄氏度、约62摄氏度、约63摄氏度、约64摄氏度、约65摄氏度、约66摄氏度、约67摄氏度、约68摄氏度、约69摄氏度、约70摄氏度、约71摄氏度、约72摄氏度、约73摄氏度、约74摄氏度或约75摄氏度的温度下进行。在一些实施方案中，本文的等温扩增反应在约55摄氏度的温度至约65摄氏度的温度下进行。例如，本文的等温扩增反应可以在约60摄氏度的温度下进行。本文的等温扩增反应可以在约65摄氏度的温度下进行。在一些实施方案中，温度元件(例如，热源)保持在基本恒定的温度。在一些实施方案中，温度元件保持在约75摄氏度或低于约75摄氏度的基本恒定的温度。在一些实施方案中，温度元件保持在约70摄氏度或低于约70摄氏度的基本恒定的温度。在一些实施方案中，温度元件保持在约65摄氏度或低于约65摄氏度的基本恒定的温度。在一些实施方案中，温度元件保持在约60摄氏度或低于约60摄氏度的基本恒定的温度。
本文的扩增过程可以在一定长度的时间内进行。在一些实施方案中，进行扩增过程直至产生可检测的核酸扩增产物。可通过任何合适的检测方法和/或本文所述的检测方法检测核酸扩增产物。在一些实施方案中，扩增过程在约20分钟或更短的时间内进行一段时间。例如，扩增过程可在约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟或约20分钟内进行。在一些实施方案中，扩增过程在约10分钟或更短的时间内进行一段时间。
在一些实施方案中，可以在不暴露于使核酸变性的试剂或条件的情况下扩增核酸靶。使核酸变性的试剂或条件可包括促进链分离和/或促进解旋的试剂或条件。在一些实施方案中，可以在不暴露于促进链分离的试剂或条件的情况下扩增核酸靶。在一些实施方案中，可以在不暴露于促进解旋的试剂或条件的情况下扩增核酸靶。在一些实施方案中，如果靶核酸在扩增之前或期间未暴露于使核酸变性和/或促进链分离和/或促进解旋的试剂或条件，则认为靶核酸是非变性的。使核酸变性和/或促进链分离和/或促进解旋的试剂或条件可包括例如热条件(例如，高温)、pH条件(例如，高或低pH)、化学试剂、蛋白质(例如，酶试剂)等。
在一些实施方案中，可以在不暴露于使核酸变性的试剂或条件的情况下扩增核酸靶。核酸变性或解链是双链核酸解开并分离成单链的过程。可促进核酸变性的试剂和条件包括例如加热、高pH、低pH和与加热结合的变性剂(例如甲酰胺)。在一些情况下，可以通过将含有核酸的溶液加热到某一温度，例如高于75摄氏度、高于80摄氏度、高于90摄氏度、高于95摄氏度或更高的温度来实现变性。在某些情况下，可以通过暴露于变性剂(例如NaOH、HCl和甲酰胺)并结合加热来实现变性。用于DNA变性的具体方法描述于例如Singh等人,(1977)Chomosoma 60:377-389中。
在一些实施方案中，可以在不暴露于促进链分离和/或解旋的试剂或条件的情况下扩增核酸靶。例如，可以在不暴露于解旋酶的情况下扩增核酸靶。解旋酶是能够将双链核酸解旋并分离成单链的酶。解旋酶的实例包括人DNA解旋酶(及其在其他生物体中的等同物)，例如DNA解旋酶Q1,布卢姆综合征蛋白(Bloom syndrome protein)、沃纳综合征蛋白(Werner syndrome protein)、DNA解旋酶Q4、DNA解旋酶Q5、DNA解旋酶2亚基1、MCM2、MCM3、MCM、MCM5、MCM6、MCM7、MCM8、MCM9、MCM10、核仁素、CHD2、CHD7、XPB、XPD、淋巴特异性解旋酶、hINO、RuvB样1、RuvB样2、PIF1、Twinkle、BACH1、RecQ5α、RecQ5β、RecQ5γ和RTEL1；人RNA解旋酶(及其在其他生物体中的等同物)，例如RNA解旋酶DDX1、RNA解旋酶eIF4A-1、RNA解旋酶eIF4A-2、RNA解旋酶DDX3X、RNA解旋酶DDX3Y、RNA解旋酶DDX4、RNA解旋酶DDX5、RNA解旋酶DDX6、RNA解旋酶DHX8、RNA解旋酶A、RNA解旋酶DDX10、RNA解旋酶DDX11、RNA解旋酶DDX12,解旋酶SKI2W、RNA解旋酶DHX15、RNA解旋酶DHX16、RNA解旋酶DDX17、RNA解旋酶DDX18、RNA解旋酶DDX19A、RNA解旋酶DDX19B、RNA解旋酶DDX20、核仁RNA解旋酶2、RNA解旋酶DDX23、RNA解旋酶DDX24、RNA解旋酶DDX25、RNA解旋酶DDX27、RNA解旋酶DDX28、RNA解旋酶DHX29、RNA解旋酶DHX30、RNA解旋酶DDX31、RNA解旋酶DHX32、RNA解旋酶DHX33、RNA解旋酶DHX34、RNA解旋酶DHX35、RNA解旋酶DHX36、RNA解旋酶DHX37、RNA解旋酶PRP 16、RNA解旋酶DDX39、RNA解旋酶DHX40、RNA解旋酶DDX41、RNA解旋酶DDX42、RNA解旋酶DDX43、RNA解旋酶DDX46、RNA解旋酶DDX47、RNA解旋酶eIF4A-3、RNA解旋酶DDX49、RNA解旋酶DDX50、RNA解旋酶DDX51、RNA解旋酶DDX52、RNA解旋酶DDX53、RNA解旋酶DDX54、RNA解旋酶DDX55、RNA解旋酶DDX56、RNA解旋酶DHX57、RNA解旋酶DDX58、RNA解旋酶DHX58、RNA解旋酶DDX59、RNA解旋酶DDX60、剪接体RNA解旋酶BAT1、U5.snRNP 200kDa解旋酶、转录调节因子ATRX解旋酶、RNA解旋酶SUPV3L1、线粒体超级杀手杀病毒活性2样2(mitochondrial Superkiller viralicidic activity 2-like2)、和范可尼贫血J组蛋白(Fanconi anemia group J protein)；和市售的解旋酶。不包括使用解旋酶的扩增条件在本文中可称为无解旋酶的扩增条件。
在一些实施方案中，可以在不暴露于重组酶的情况下扩增核酸靶。重组酶是参与遗传重组的酶，并且有时参与核酸修复(例如，重组DNA修复)。例如，重组酶可以引发链交换。重组酶可以包括例如Cre重组酶、Hin重组酶、Tre重组酶、FLP重组酶、RecA、RAD51、RadA、T4uvsX。在一些实施方案中，可以在不暴露于重组酶辅助蛋白例如重组酶负载因子(例如，T4uvsY)的情况下扩增核酸靶。
在一些实施方案中，可以在不暴露于核酸结合蛋白(例如，单链结合蛋白或单链DNA结合蛋白(SSB))的情况下扩增核酸靶。单链结合蛋白通常用于防止过早退火，保护单链DNA不被核酸酶消化，和/或从DNA中去除二级结构(例如，使螺旋双链体不稳定)以允许其他酶的作用。在一些实施方案中，可以在不暴露于单链DNA结合蛋白例如T4 gp32的情况下扩增核酸靶。
在一些实施方案中，可以在不暴露于拓扑异构酶的情况下扩增核酸靶。拓扑异构酶是通过与单链或双链DNA结合并切割DNA磷酸骨架来调节DNA的过度缠绕或缠绕不足的酶。不包括使用拓扑异构酶的扩增条件在本文中可称为无拓扑异构酶的扩增条件。
可以在暴露于或不暴露于使核酸不稳定的试剂或条件的情况下扩增核酸靶。去稳定化通常是指通过倾斜、滚动、扭曲、滑动和翻转效应中的一种或多种来破坏核酸分子(例如，双螺旋结构)的整体组织和几何取向(例如，如Lenglet等人,(2010)Journal ofNucleic Acids第2010卷,文章号290935,第17页中所述)。去稳定化通常不涉及如上文针对变性所述的核酸链的解链或分离。例如，通过暴露于诸如嵌入剂或烷化剂的试剂和/或诸如甲酰胺、尿素、二甲亚砜(DMSO)或N,N,N-三甲基甘氨酸(甜菜碱)的化学物质，可以实现核酸去稳定化。在一些实施方案中，扩增方法可包括使用一种或多种去稳定剂。在一些实施方案中，扩增方法不包括使用去稳定剂。
在一些实施方案中，可以在不暴露于连接酶的情况下扩增核酸靶。连接酶是可以通过形成新的化学键来催化氨基酸分子接合的酶。不包括使用连接酶的扩增条件在本文中可称为无连接酶的扩增条件。
在一些实施方案中，可以在不暴露于RNA复制酶的情况下扩增核酸靶。RNA复制酶、RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)或RDR是催化RNA从RNA模板复制的酶。不包括使用RNA复制酶的扩增条件在本文中可称为无RNA复制酶的扩增条件。
在某些实施方案中，可以在无裂解或消化的情况下扩增核酸靶。例如，在一些实施方案中，在不预先暴露于一种或多种裂解剂的情况下扩增核酸，并扩增完整的核酸。在某些实施方案中，在扩增期间不暴露于一种或多种裂解剂的情况下扩增核酸。在某些实施方案中，在扩增之后不暴露于一种或多种裂解剂的情况下扩增核酸。不包括使用裂解剂的扩增条件在本文中可称为无裂解剂的扩增条件。术语“裂解剂”通常是指可以在一个或多个特异性或非特异性位点处裂解核酸的试剂，有时是化学物质或酶。特异性裂解剂通常在特定位点处根据特定核苷酸序列特异性地裂解。裂解剂可包括核酸内切酶(例如，限制内切酶、切口酶等)；核酸外切酶(DNAse、RNAse(例如RNAseH)、5'至3'核酸外切酶(例如核酸外切酶II)、3'至5'核酸外切酶(例如核酸外切酶I)和聚(A)特异性3'至5'核酸外切酶)；和化学裂解剂。
在某些实施方案中，可以在不使用限制内切酶和/或切口酶的情况下扩增核酸靶。限制内切酶是在特异性位点处切割DNA并且通常裂解双链双螺旋的两条链的蛋白质，并且切口酶是与双链DNA结合并裂解双链双螺旋的一条链的蛋白质。在某些实施方案中，在不事先暴露于限制内切酶和/或切口酶的情况下扩增核酸。在某些实施方案中，在扩增期间不暴露于限制内切酶和/或切口酶的情况下扩增核酸。在某些实施方案中，在扩增之后不暴露于限制内切酶和/或切口酶的情况下扩增核酸。不包括使用限制内切酶的扩增条件在本文中可称为无限制内切酶的扩增条件。不包括使用切口酶的扩增条件在本文中可称为无切口酶的扩增条件。
在某些实施方案中，可以在没有核酸外切酶处理的情况下扩增核酸靶。核酸外切酶是通过在3'或5'末端破坏磷酸二酯键的水解反应，从多核苷酸链末端一次一个地裂解核苷酸而起作用的酶。核酸外切酶包括例如DNAse、RNAse(例如RNAseH)、5'至3'核酸外切酶(例如核酸外切酶II)、3'至5'核酸外切酶(例如核酸外切酶I)和聚(A)特异性3'至5'核酸外切酶。在某些实施方案中，在扩增之前不经核酸外切酶处理的情况下扩增核酸。在某些实施方案中，在扩增期间不经核酸外切酶处理的情况下扩增核酸。在某些实施方案中，在扩增之后不经核酸外切酶处理的情况下扩增核酸。不包括使用核酸内切酶的扩增条件在本文中可称为无核酸内切酶的扩增条件。在某些实施方案中，在不经DNAse处理的情况下扩增核酸。在某些实施方案中，在不经RNAse处理的情况下扩增核酸。在某些实施方案中，在不经RNAseH酶处理的情况下扩增核酸。不包括使用DNAse的扩增条件在本文中可称为无DNAse的扩增条件。不包括使用RNAse的扩增条件在本文中可称为无RNAse的扩增条件。不包括使用RNAseH的扩增条件在本文中可称为无RNAseH的扩增条件。
扩增的核酸在本文中可称为核酸扩增产物或扩增子。在一些实施方案中，扩增产物可包括天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸、核苷酸类似物等以及前述物质的组合。扩增产物典型地具有与样品核酸中的序列(例如，靶序列)或其互补序列相同或基本上相同的核苷酸序列。扩增产物中的“基本上相同的”核苷酸序列通常与被扩增的核苷酸序列或其互补序列具有高度的序列同一性(例如，约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的序列同一性)，并且变化有时是聚合酶失真(polymeraseinfidelity)或其他变量的结果。
在一些实施方案中，核酸扩增产物包含与样品核酸中的靶序列连续互补或基本上相同的多核苷酸。连续互补通常是指第一链中的核苷酸序列，例如，其中每个碱基依序(例如，从5'至3'读取)与第二链中的相应有序碱基配对，并且在被认为是连续互补的的序列内没有缺口、额外序列或未配对碱基。换句话说，连续互补通常是指第一链中核苷酸序列的所有连续碱基与第二链中核苷酸序列的相应连续碱基互补。例如，具有序列5’-ATGCATGCATGC-3’(SEQ ID NO:10)的第一链被认为与具有序列5’-GCATGCATGCAT-3’(SEQID NO:11)的第二链连续互补，其中第一链中的所有连续碱基与第二链中的所有相应的连续碱基互补。然而，具有序列5’-ATGCATAAAAAAGCATGC-3’(SEQ ID NO:12)的第一链不被认为与具有序列5’-GCATGCATGCAT-3’(SEQ ID NO:11)的第二链连续互补，因为第一链中间的六个腺嘌呤(6个A)的序列不会与第二链中的碱基配对。连续互补序列有时是约5个连续碱基至约25个连续碱基的长度，有时约6个连续碱基至约20个连续碱基的长度，有时约7个连续碱基至约18个连续碱基的长度，有时约8个连续碱基至约16个连续碱基的长度。在一些实施方案中，核酸扩增产物由与样品核酸中的靶序列连续互补或基本上相同的多核苷酸组成。因此，在一些实施方案中，核酸扩增产物不包括不是与靶序列连续互补或基本上相同的任何额外序列(例如，在5'和/或3'末端，或在产物内)，例如，通过加尾引物或连接而掺入到扩增产物中的额外序列，和/或提供裂解剂识别位点(例如，切口酶识别位点)的额外序列。通常，除非靶序列包含串联重复，否则扩增产物不包括串联重复形式的产物。
核酸扩增产物可包含与扩增反应中使用的一种或多种引物互补或基本上相同的序列。在一些实施方案中，核酸扩增产物包含与第一引物序列连续互补或相同的第一核苷酸序列，和与第二引物序列连续互补或相同的第二核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸扩增产物包含间隔子序列。通常，扩增产物中的间隔子序列是与样品核酸中靶序列的一部分连续互补或基本上相同的序列(1个或多个碱基)，并且侧翼是扩增产物中的与用于扩增反应的一种或多种引物互补或基本上相同的序列。侧接扩增产物中的序列的间隔子序列通常位于第一序列(与第一引物互补或基本上相同)和第二序列(与第二引物互补或基本相同)之间。因此，扩增产物典型地包括第一序列，接着是间隔子序列，接着是第二序列。间隔子序列通常不与引物中的序列互补或基本上相同。在一些实施方案中，间隔子序列包含约1至10个碱基。例如，间隔子序列可包含1个碱基、2个碱基、3个碱基、4个碱基、5个碱基、6个碱基、7个碱基、8个碱基、9个碱基或10个碱基。在一些实施方案中，间隔子序列包含约1至5个碱基。
在一些实施方案中，核酸扩增产物由以下序列组成：与第一引物序列连续互补或相同的第一核苷酸序列，与第二引物序列连续互补或相同的第二核苷酸序列，和间隔子序列。因此，在一些实施方案中，核酸扩增产物不包括不与第一引物序列和第二引物序列连续互补或相同并且不是间隔子序列的一部分的任何额外序列(例如，在5'和/或3'末端，或在产物内)，例如通过加尾引物或环状引物、连接或其他机制掺入到扩增产物中的额外序列。
在一些实施方案中，核酸扩增产物基本上由以下序列组成：与第一引物序列连续互补或相同的第一核苷酸序列，与第二引物序列连续互补或相同的第二核苷酸序列，和间隔子序列。因此，在一些实施方案中，核酸扩增产物通常不包括不与第一引物序列和第二引物序列连续互补或相同并且不是间隔子序列的一部分的任何额外序列(例如，在5'和/或3'末端，或在产物内)，例如通过加尾引物或环状引物、连接或其他机制掺入到扩增产物中的额外序列。然而，在此类实施方案中，核酸扩增产物可包括例如在扩增过程中因为错误或混杂而引入产物中的一些错配的(即，非互补的)碱基或一个或多个额外的碱基(例如，在5'和/或3'末端，或在产物内)。
核酸扩增产物的长度可高达50个碱基。在一些实施方案中，核酸扩增产物长约15至约40个碱基。例如，核酸扩增产物可以是15个碱基长，16个碱基长，17个碱基长，18个碱基长，19个碱基长，20个碱基长，21个碱基长，22个碱基长，23个碱基长，24个碱基长，25个碱基长，26个碱基长，27个碱基长，28个碱基长，29个碱基长，30个碱基长，31个碱基长，32个碱基长，33个碱基长，34个碱基长，35个碱基长，36个碱基长，37个碱基长，38个碱基长，39个碱基长或40个碱基长。在一些实施方案中，扩增产物长约20至约40个碱基。在一些实施方案中，扩增产物长约20至约30个碱基。在一些实施方案中，给定靶序列的核酸扩增产物具有相同的长度或基本上相同的长度(例如，在1至5个碱基内)。因此，给定靶序列的核酸扩增产物可产生单一信号(例如，电泳凝胶上的条带)，并且通常不产生指示多个长度的多个信号(例如，电泳凝胶上的ladder(梯状条带)或弥散)。对于多重反应，不同靶序列的核酸扩增产物可具有不同的长度。
本文描述的方法和组分可用于多重扩增。多重扩增通常是指多于一种目的核酸的扩增(例如，多于一种靶序列的扩增)。例如，多重扩增可以指来自相同样品的多个序列的扩增或样品中几个序列之一的扩增。多重扩增还可以指同时或以逐步方式扩增多个样品中存在的一种或多种序列。例如，多重扩增可用于扩增能够被扩增的至少两种靶序列(例如，扩增反应物包含适当的引物和酶以扩增至少两种靶序列)。在一些情况下，可以制备扩增反应物以检测至少两种靶序列，但是在待测样品中可以存在仅一种靶序列，使得两种序列都能够被扩增，但是仅一种序列被扩增。在某些情况下，当存在两种靶序列时，扩增反应可导致这两种靶序列的扩增。多重扩增反应可以导致一种、一些或所有靶序列的扩增，所述多重扩增反应包含适当的用于所述靶序列的引物和酶。在一些情况下，可以制备扩增反应物以用一对引物检测两种序列，其中一种序列是靶序列，另一种序列是对照序列(例如，能够通过与靶序列相同的引物扩增并具有与靶标不同的间隔碱基或序列的合成序列)。在一些情况下，可以制备扩增反应物以用相应引物对检测多组序列，其中每组包括靶序列和对照序列。
引物
核酸扩增通常在一种或多种引物的存在下进行。引物通常表征为寡核苷酸，其包括能够在特异性目的区域(即靶序列)处或附近(例如，邻近)与靶核酸杂交或退火的核苷酸序列。例如，引物可以允许特异性确定靶核酸核苷酸序列或检测靶核酸(例如，序列的存在或不存在)或其特征。引物可以是天然存在的或合成的。术语特异性的或特异性通常是指一个分子与另一个分子的结合或杂交，例如引物与靶多核苷酸。也就是说，特异性的或特异性是指两个分子之间的识别、接触和形成稳定复合物，相比之下，这两个分子中的任一个与其他分子的识别、接触或复合物形成明显较少。术语退火或杂交通常是指在两个分子之间形成稳定的复合物。当提及引物时，术语引物、寡(oligo)或寡核苷酸在本文中可互换使用。
可以使用合适的方法设计和合成引物，并且引物可以是适合与靶序列杂交并进行本文所述的扩增过程的任何长度。通常根据靶核酸中的序列设计引物。在一些实施方案中，引物的长度可为约5个碱基至约30个碱基。例如，引物的长度可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基。在一些实施方案中，引物的长度小于28个碱基。在一些实施方案中，引物的长度是约8至约16个碱基。在一些实施方案中，引物的长度是约10至约12个碱基。引物可以由天然存在的和/或非天然存在的核苷酸(例如，修饰的核苷酸、标记的核苷酸)或其混合物构成。适合与本文所述方法一起使用的引物可以使用任何合适的技术合成和标记。例如，可以如Needham-VanDevanter等人,Nucleic Acids Res.12:6159-6168,1984所述，根据Beaucage和Caruthers,TetrahedronLetts.,22:1859-1862,1981首次描述的固相亚磷酰胺三酯方法，使用自动合成仪化学合成引物。引物的纯化可以例如通过非变性丙烯酰胺凝胶电泳或通过阴离子交换高效液相色谱(HPLC)进行，例如，如Pearson和Regnier,J.Chrom.,255:137-149,1983所述。
在一些实施方案中，引物包含修饰的核苷酸。在一些实施方案中，引物基本上由修饰的核苷酸组成。在一些实施方案中，引物由修饰的核苷酸组成。可以根据本文描述的或本领域已知的任何修饰来修饰核苷酸(或碱基)。修饰可以包括在引物合成期间进行的修饰和/或可以包括合成后修饰。修饰可以包括内部修饰、在引物的3'末端的修饰和/或在引物的5'末端的修饰。在一些实施方案中，引物包含修饰的核苷酸和未修饰的核苷酸的混合物。在一些实施方案中，引物包含未修饰的核苷酸。在一些实施方案中，引物基本上由未修饰的核苷酸组成。在一些实施方案中，引物由未修饰的核苷酸组成。
修饰和经修饰的碱基可以包括例如磷酸化(例如3’磷酸化、5’磷酸化)；连接化学或接头修饰(例如AcryditeTM、腺苷酰化、叠氮化物(NHS酯)、地高辛(NHS酯)、胆固醇基-TEG、I-LinkerTM、氨基改性剂(例如氨基改性剂C6、氨基改性剂C12、氨基改性剂C6dT、Uni-LinkTM氨基改性剂)、炔烃(例如5'己炔基、5-辛二炔基dU)、生物素化(例如生物素、生物素(叠氮化物)、生物素dT、生物素-TEG、双生物素、PC生物素、脱硫生物素-TEG)、硫醇修饰(例如硫醇改性剂C3S-S、二硫醇、硫醇改性剂C6S-S))；荧光团(例如FreedomTM染料、Alexa染料、LI-CORATTOTM染料、罗丹明染料、WellRED染料、6-FAM(叠氮化物)、Texas-X(NHS酯)、640(NHS酯)、Dy 750(NHS酯))；Iowa暗猝灭剂修饰(例如IowaFQ、IowaRQ)；暗猝灭剂修饰(例如Black Hole-1、BlackHole-2、Dabcyl)；间隔子(C3间隔子、PC间隔子、己二醇、间隔子9、间隔子18、1’,2’-二脱氧核糖(dSpacer)；经修饰的碱基(例如2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、5-溴代dU、脱氧尿苷、反向dT、反向二脱氧-T、二脱氧-C、5-甲基dC、脱氧肌苷、SuperSuper锁核酸(LNA)、5-硝基吲哚、2'-O-甲基RNA碱基、羟甲基dC、UNA解锁核酸(例如UNA-A、UNA-U、UNA-C、UNA-G)、异dC(Iso-dC)、异dG(Iso-dG)、氟代C(Fluoro C)、氟代U(Fluoro U)、氟代A(Fluoro A)、氟代G(Fluoro G))；硫代磷酸酯键修饰(例如硫代磷酸化DNA碱基、硫代磷酸化RNA碱基、硫代磷酸化2'O-甲基碱基、硫代磷酸化LNA碱基)；和点击化学修饰。在一些实施方案中，修饰和修饰的碱基包括尿嘧啶碱基、核糖核苷酸碱基、O-甲基RNA碱基、硫代磷酸酯键、3'磷酸基团、间隔碱基(例如C3间隔碱基或其他间隔碱基)。例如，引物可包含一个或多个O-甲基RNA碱基(例如，2'-O-甲基RNA碱基)。2'-O-甲基RNA通常是在tRNA和其他小RNA中发现的RNA的转录后修饰。可直接合成包含2'-O-甲基RNA碱基的引物。例如，这种修饰可以增加RNA:RNA双链体的Tm，并在单链核糖核酸酶和DNase(脱氧核糖核酸酶)的存在下提供稳定性。例如，2'-O-甲基RNA碱基可被包含在引物中，以增加稳定性和对靶序列的结合亲和力。在一些实施方案中，引物可包含一个或多个硫代磷酸酯键(例如硫代磷酸酯键修饰)。硫代磷酸酯(PS)键用硫原子取代引物的磷酸酯主链中的非桥连氧。这种修饰典型地使核苷酸间键联对核酸酶降解具有抗性。例如，可以在引物的5'末端或3'末端的最后约3至5个核苷酸之间引入硫代磷酸酯键，以抑制核酸外切酶降解。在某些情况下，整个引物中包含的硫代磷酸酯键可以帮助减少核酸内切酶的攻击。在一些实施方案中，引物可包含3'磷酸基团。在某些情况下，3'磷酸化可以抑制某些3'-核酸外切酶所导致的降解，并可用于阻断DNA聚合酶所导致的延伸。在一些实施方案中，引物可包含一个或多个间隔碱基(例如，一个或多个C3间隔子)。C3间隔子亚磷酰胺可以在内部或在引物的5'末端掺入。例如，可以在引物的任一端添加多个C3间隔子以引入长的亲水间隔臂，用于连接荧光团或其他侧基。
在一些实施方案中，引物包含DNA碱基。在一些实施方案中，引物包含RNA碱基。在一些实施方案中，引物包含DNA碱基和RNA碱基的混合物。DNA碱基可以是修饰的或未修饰的。RNA碱基可以是修饰的或未修饰的。在一些实施方案中，引物基本上由DNA碱基(例如，修饰的DNA碱基和/或未修饰的DNA碱基)组成。在一些实施方案中，引物由DNA碱基(例如，修饰的DNA碱基和/或未修饰的DNA碱基)组成。在一些实施方案中，引物基本上由未修饰的DNA碱基组成。在一些实施方案中，引物由未修饰的DNA碱基组成。在一些实施方案中，引物基本上由修饰的DNA碱基组成。在一些实施方案中，引物由修饰的DNA碱基组成。在一些实施方案中，引物基本上由RNA碱基(例如，修饰的RNA碱基和/或未修饰的RNA碱基)组成。在一些实施方案中，引物由RNA碱基(例如，修饰的RNA碱基和/或未修饰的RNA碱基)组成。在一些实施方案中，引物基本上由未修饰的RNA碱基组成。在一些实施方案中，引物由未修饰的RNA碱基组成。在一些实施方案中，引物基本上由修饰的RNA碱基组成。在一些实施方案中，引物由修饰的RNA碱基组成。
在一些实施方案中，引物不包含RNA碱基。在一些实施方案中，引物在3'末端不包含RNA碱基。在一些实施方案中，引物在3'末端包含DNA碱基(或修饰的DNA碱基)。在一些实施方案中，引物不是嵌合引物。嵌合引物是包含DNA和RNA碱基的引物。在一些实施方案中，引物是均相引物。在一些实施方案中，引物是均相DNA引物。均相DNA引物可包含未修饰的DNA碱基、修饰的DNA碱基，或修饰的DNA碱基和未修饰的DNA碱基的混合物，并且通常不包含RNA碱基。
在一些实施方案中，引物不包含裂解剂识别位点。例如，本文的引物可以不包含切口酶识别位点。在一些实施方案中，引物不包含尾部。在一些实施方案中，引物不包含含有切口酶识别位点的尾部。
在一些实施方案中，引物序列的全部或部分可以与靶核酸互补或基本上互补。关于序列的基本上互补通常是指将彼此杂交的核苷酸序列。可以改变杂交条件的严格性以容许不同量的序列错配。在一些实施方案中，靶序列和引物序列彼此互补至少75％。例如，靶序列和引物序列可以彼此互补75％或更多、76％或更多、77％或更多、78％或更多、79％或更多、80％或更多、81％或更多、82％或更多、83％或更多、84％或更多、85％或更多、86％或更多、87％或更多、88％或更多、89％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多。
与靶核酸序列基本上互补的引物典型地也与靶核酸序列的互补序列基本相同。也就是说，引物与核酸的反义链基本相同。关于序列的基本上相同通常是指彼此至少75％相同的核苷酸序列。例如，与靶核酸的反义链基本相同的引物可以彼此相同75％或更多、76％或更多、77％或更多、78％或更多、79％或更多、80％或更多、81％或更多、82％或更多、83％或更多、84％或更多、85％或更多、86％或更多、87％或更多、88％或更多、89％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多。用于确定两个核苷酸序列是否基本相同的一种测试是确定共有的相同核苷酸序列的百分比。
在一些实施方案中，引物包含一对引物。一对引物可包括正向引物和反向引物(例如，与靶核酸的有义链和反义链结合的引物)。在一些实施方案中，引物由一对引物(即正向引物和反向引物)组成。因此，在一些实施方案中，使用一对引物进行靶序列的扩增，并且在靶序列的扩增中不包括额外的引物或寡核苷酸(例如，扩增反应组分不包含用于给定靶序列的额外引物对，不包含套式引物，不包含缓冲引物(bumper primer)，不包含除引物外的寡核苷酸，不包含探针等)。在一些实施方案中，引物由一对引物组成，然而，在某些情况下，扩增反应可包括用于扩增不同靶序列的额外的引物对(例如在多重扩增中)。在一些实施方案中，引物由一对引物组成，然而，在某些情况下，扩增反应可包括用于检测过程的额外的引物、寡核苷酸或探针，所述检测过程不被认为是扩增的一部分。
在一些实施方案中，引物成组使用。扩增引物组可包括用于给定靶序列的一对正向引物和反向引物。对于多重扩增，扩增第一靶序列的引物被认为是引物组，并且扩增第二靶序列的引物被认为是不同的引物组。
在一些实施方案中，扩增反应组分包含与样品核酸的第一链(例如，有义链，正链)中的靶序列互补的第一引物(第一寡核苷酸)，和与样品核酸的第二链(例如，反义链，负链)中的靶序列互补的第二引物(第二寡核苷酸)。在一些实施方案中，第一引物(第一寡核苷酸)包含与样品核酸的第一链中的靶序列连续互补的第一多核苷酸，并且第二引物(第二寡核苷酸)包含与样品核酸的第二链中的靶序列连续互补的第二多核苷酸。引物-靶标的连续互补通常是指引物中的核苷酸序列，其中每个碱基依序与靶序列中的相应有序碱基配对，并且在被认为是连续互补的序列内没有缺口、额外序列或未配对碱基。换句话说，连续互补通常是指引物中核苷酸序列的所有连续碱基与靶标中核苷酸序列的相应连续碱基互补。
在一些实施方案中，第一引物(第一寡核苷酸)由与样品核酸的第一链中的靶序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且第二引物(第二寡核苷酸)由与样品核酸的第二链中的靶序列连续互补的第二多核苷酸组成。因此，在一些实施方案中，引物不包括不与靶序列连续互补的任何额外序列(例如，在5'和/或3'末端，或在引物内)，例如，存在于加尾引物或环状引物中的额外序列，和/或提供裂解剂识别位点(例如，切口酶识别位点)的额外序列。在一些实施方案中，扩增反应组分不包含含额外序列(即，除了与靶序列连续互补的序列以外的序列)的引物，例如加尾引物、环状引物、能够形成茎-环结构、发夹结构的引物，和/或提供裂解剂识别位点(例如，切口酶识别位点)的额外序列等。
在一些实施方案中，第一引物(第一寡核苷酸)基本上由与样品核酸的第一链中的靶序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且第二引物(第二寡核苷酸)基本上由与样品核酸的第二链中的靶序列连续互补的第二多核苷酸组成。因此，在一些实施方案中，引物通常不包括不与靶序列连续互补的任何额外序列(例如，在5'和/或3'末端，或在引物内)，例如，存在于加尾引物或环状引物中的额外序列，和/或提供裂解剂识别位点(例如，切口酶识别位点)的额外序列。然而，在此类实施方案中，引物可包含一个或多个额外的碱基(例如，在5'和/或3'末端，或在引物内)，其不向引物添加功能特征。例如，存在于加尾引物或环状引物中的额外序列通常添加功能特征，并且将被排除在此类实施方案中的引物之外。
在某些实施方案中，引物可含有修饰，例如一个或多个肌苷、无碱基位点、锁核酸、小沟结合物、双链体稳定剂(例如，吖啶、亚精胺)、Tm修饰剂或改变引物结合性质的任何修饰剂。在某些实施方案中，引物可含有可检测的分子或实体(例如，荧光团、放射性同位素、比色剂、颗粒、酶等)。
聚合酶
在一些实施方案中，扩增反应组分包含一种或多种聚合酶。聚合酶是能够催化核苷酸的特异性掺入以延伸针对核酸靶序列(例如，引物退火至的核酸靶序列)的引物分子(例如本文所述的扩增引物)的3'羟基末端的蛋白质。聚合酶可包括例如可在高反应温度(例如，高于55摄氏度、高于60摄氏度、高于65摄氏度、高于70摄氏度、高于75摄氏度、高于80摄氏度、高于85摄氏度、高于90摄氏度、高于95摄氏度、高于100摄氏度)下具有活性的嗜热或超嗜热聚合酶。超嗜热聚合酶可称为超嗜热菌聚合酶。具有超嗜热聚合酶活性的聚合酶可被称为具有超嗜热菌聚合酶活性。聚合酶可以具有或可以不具有链置换能力。在一些实施方案中，聚合酶可在单一合成中掺入约1至约50个核苷酸。例如，聚合酶可以在单一合成中掺入约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。在一些实施方案中，聚合酶可在单一合成中掺入20至40个核苷酸。在一些实施方案中，聚合酶可在单一合成中掺入多达50个核苷酸。在一些实施方案中，聚合酶可在单一合成中掺入多达40个核苷酸。在一些实施方案中，聚合酶可在单一合成中掺入多达30个核苷酸。在一些实施方案中，聚合酶可在单一合成中掺入多达20个核苷酸。
在一些实施方案中，扩增反应组分包含一种或多种DNA聚合酶。在一些实施方案中，扩增反应组分包含一种或多种选自以下的DNA聚合酶：9°N DNA聚合酶；9°NmTMDNA聚合酶；TherminatorTMDNA聚合酶；TherminatorTMII DNA聚合酶；TherminatorTMIII DNA聚合酶；TherminatorTMγDNA聚合酶；Bst DNA聚合酶；Bst DNA聚合酶(大片段)；Phi29 DNA聚合酶、DNA聚合酶I(大肠杆菌)、DNA聚合酶I、大(Klenow)片段；Klenow片段(3′-5′外切)；T4 DNA聚合酶；T7 DNA聚合酶；Deep VentRTM(外切)DNA聚合酶；Deep VentRTMDNA聚合酶；DyNAzymeTMEXT DNA；DyNAzymeTMII热启动DNA聚合酶；PhusionTM高保真DNA聚合酶；DNA聚合酶；(外切)DNA聚合酶；RepliPHITMPhi29 DNA聚合酶；rBst DNA聚合酶、大片段(IsoThermTMDNA聚合酶)；MasterAmpTM AmpliThermTM DNA聚合酶；Tag DNA聚合酶；TthDNA聚合酶；Tfl DNA聚合酶；Tgo DNA聚合酶；SP6 DNA聚合酶；Tbr DNA聚合酶；DNA聚合酶Beta；和ThermoPhi DNA聚合酶。
在一些实施方案中，扩增反应组分包含一种或多种超嗜热菌DNA聚合酶。通常，超嗜热菌DNA聚合酶在高温下是热稳定的。例如，超嗜热菌DNA聚合酶可以在95摄氏度下具有约5至10小时的半衰期，并且在100摄氏度下具有约1至3小时的半衰期。在一些实施方案中，扩增反应组分包含一种或多种来自古细菌的超嗜热菌DNA聚合酶。在一些实施方案中，扩增反应组分包含一种或多种来自嗜热球菌属(Thermococcus)的超嗜热菌DNA聚合酶。在一些实施方案中，扩增反应组分包含一种或多种来自热球菌科(Thermococcaceaen)古细菌的超嗜热菌DNA聚合酶。在一些实施方案中，扩增反应组分包含一种或多种来自火球菌属(Pyrococcus)的超嗜热菌DNA聚合酶。在一些实施方案中，扩增反应组分包含一种或多种来自甲烷球菌科(Methanococcaceae)的超嗜热菌DNA聚合酶。在一些实施方案中，扩增反应组分包含一种或多种来自甲烷球菌属(Methanococcus)的超嗜热菌DNA聚合酶。在一些实施方案中，扩增反应组分包含一种或多种来自栖热菌属(Thermus)的超嗜热菌DNA聚合酶。在一些实施方案中，扩增反应组分包含一种或多种来自嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)的超嗜热菌DNA聚合酶。
在一些实施方案中，扩增反应组分包含超嗜热菌DNA聚合酶或其功能片段。功能片段通常保留全长聚合酶的一种或多种功能，例如聚合DNA的能力(例如，在扩增反应中)。在一些情况下，功能片段以全长聚合酶功能水平的至少约50％的水平发挥功能(例如，扩增反应中的DNA聚合)。在一些情况下，功能片段以全长聚合酶功能水平的至少约75％的水平发挥功能(例如，扩增反应中的DNA聚合)。在一些情况下，功能片段以全长聚合酶功能水平的至少约90％的水平发挥功能(例如，扩增反应中的DNA聚合)。在一些情况下，功能片段以全长聚合酶功能水平的至少约95％的水平发挥功能(例如，扩增反应中的DNA聚合)。可以例如使用可检测的核酸扩增方法，例如本文所述的可检测的核酸扩增方法来评估聚合酶活性水平。在一些实施方案中，扩增反应组分包含超嗜热菌DNA聚合酶，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或SEQ ID NO:8的功能片段。在一些实施方案中，扩增反应组分包含超嗜热菌DNA聚合酶，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或SEQ ID NO:9的功能片段。
在一些实施方案中，扩增反应组分包含聚合酶，所述聚合酶包含与超嗜热菌聚合酶或其功能片段(即，包含与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶的在本文中所述的功能片段)至少约90％相同的氨基酸序列。例如，可以通过进行氨基酸序列比对来确定序列同一性程度。在一些实施方案中，扩增反应组分包含含有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段(即，包含与SEQ ID NO:8至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶的在本文中所述的功能片段)。在一些实施方案中，扩增反应组分包含含有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段。在一些实施方案中，扩增反应组分包含含有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约99％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段。在一些实施方案中，扩增反应组分包含含有与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段(即，包含与SEQ ID NO:9至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶的在本文中所述的功能片段)。在一些实施方案中，扩增反应组分包含含有与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段。在一些实施方案中，扩增反应组分包含含有与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约99％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段。
在一些实施方案中，聚合酶可具有逆转录能力。在此类情况下，扩增反应可以例如在单个步骤中扩增RNA靶而不使用单独的逆转录酶。具有逆转录酶能力的聚合酶的非限制性实例包括Bst(大片段)、9°N DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶、TherminatorTM、TherminatorTMII等。在一些实施方案中，扩增反应组分包含一种或多种单独的逆转录酶。在一些实施方案中，在扩增反应中可包括一种以上的聚合酶。例如，扩增反应可包括具有逆转录酶活性的聚合酶和不具有逆转录酶活性的第二聚合酶。
在一些实施方案中，在扩增期间使用一种或多种具有核酸外切酶活性的聚合酶。在一些实施方案中，在扩增期间使用一种或多种不具有核酸外切酶活性的聚合酶。在一些实施方案中，在扩增期间使用一种或多种具有低核酸外切酶活性的聚合酶。在某些情况下，不具有核酸外切酶活性或具有低核酸外切酶活性的聚合酶包含降低或消除聚合酶核酸外切酶活性的一种或多种修饰(例如氨基酸取代)。与未修饰的聚合酶相比，具有低核酸外切酶活性的被修饰的聚合酶可具有10％或更少的核酸外切酶活性。例如，与未修饰的聚合酶相比，具有低核酸外切酶活性的被修饰的聚合酶可具有小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的核酸外切酶活性。在一些实施方案中，聚合酶不具有5'至3'核酸外切酶活性或具有低的5'至3'核酸外切酶活性。在一些实施方案中，聚合酶不具有3'至5'核酸外切酶活性或具有低的3'至5'核酸外切酶活性。在一些实施方案中，聚合酶不具有单链依赖性核酸外切酶活性或具有低的单链依赖性核酸外切酶活性。在一些实施方案中，聚合酶不具有双链依赖性核酸外切酶活性或具有低的双链依赖性核酸外切酶活性。可以降低或消除聚合酶的核酸外切酶活性的某些修饰的非限制性实例包括在SEQ ID NO:8的141位和/或143位和/或458位处或者对应于SEQ ID NO:8的141位和/或143位和/或458位的位置处的一个或多个氨基酸取代。例如，可以通过进行氨基酸序列比对来鉴定对应于SEQ IDNO:8中的位置的氨基酸位置。在一些情况下，修饰包括将141位的天然氨基酸取代为丙氨酸。在某些情况下，修饰包括D141A。在一些情况下，修饰包括将143位的天然氨基酸取代为丙氨酸。在某些情况下，修饰包括E143A。在一些情况下，修饰包括将第143位的天然氨基酸取代为天冬氨酸。在某些情况下，修改包括E143D。在一些情况下，修饰包括将位置485处的天然氨基酸取代为亮氨酸。在某些情况下，修饰包括A485L。在某些情况下，修饰包括D141A、E143A和A485L。
检测和定量
本文描述的方法可以进一步包括检测和/或定量核酸扩增产物。可以通过任何合适的检测和/或定量方法检测和/或定量扩增产物，所述方法包括例如本文所述的任何检测方法或定量方法。检测和/或定量方法的非限制性实例包括分子信标(例如，实时、终点)、侧向流动、荧光共振能量转移(FRET)、荧光偏振(FP)、表面捕获、5'至3'核酸外切酶水解探针(例如，TAQMAN)、嵌入/结合染料、吸光度方法(例如比色、浊度)、电泳(例如凝胶电泳、毛细管电泳)、质谱、核酸测序、数字扩增、引物延伸方法(例如iPLEXTM)、来自Affymetrix的分子倒置探针(MIP)技术、限制性片段长度多态性(RFLP分析)、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)分析、甲基化特异性PCR(MSPCR)、焦磷酸测序分析、acycloprime分析、反向斑点印迹、GeneChip微阵列、动态等位基因特异性杂交(DASH)、肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)探针、AlphaScreen、SNPstream、遗传比特分析(genetic bit analysis，GBA)、多重微测序、SNaPshot、GOOD测定、微阵列miniseq、阵列引物延伸(APEX)、微阵列引物延伸、Tag阵列、编码微球(Coded microspheres)、模板指导掺入(TDI)、比色寡核苷酸连接测定(OLA)、序列编码的OLA、微阵列连接、连接酶链式反应、锁式探针(padlock probe)、侵入物测定、使用至少一种探针进行杂交、使用至少一种荧光标记的探针进行杂交、克隆和测序、使用杂交探针和定量实时聚合酶链式反应(QRT-PCR)、纳米孔测序、芯片及其组合。在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用实时检测方法(即，在扩增过程中检测和/或连续监测产物)。在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用终点检测方法(即，在完成或停止扩增过程之后检测产物)。核酸检测方法还可以使用直接掺入到靶序列中或直接掺入到含有靶标的互补序列的探针中的被标记核苷酸。此类标记本质上可以是放射性和/或荧光的，并且可以以本文讨论的任何方式分解。在一些实施方案中，可以使用下文描述的某些检测方法实现核酸扩增产物的定量。在某些情况下，检测方法可以与测量信号强度和/或产生(或参考)标准曲线和/或查找表结合使用，以用于定量核酸扩增产物。
在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用分子信标技术。术语分子信标通常是指可检测的分子，其中分子的可检测性质在某些条件下是可检测的，从而使分子能够作为特异性和信息性信号起作用。可检测性质的非限制性实例包括光学性质(例如荧光)、电性质、磁性质、化学性质和通过已知尺寸的开口的时间或速度。用于检测核酸分子的分子信标可以是例如在一端含有荧光团而在另一端含有猝灭染料的发夹状寡核苷酸。发夹的环可以含有与靶序列互补的探针序列，并且通过对位于探针序列任一侧的互补臂序列进行退火来形成茎。荧光团和猝灭分子可以在每个臂的相对末端共价连接。在阻止寡核苷酸与其互补靶杂交的条件下或当分子信标在溶液中游离时，荧光和猝灭分子彼此接近，从而防止荧光共振能量转移(FRET)。当分子信标遇到靶分子(例如，核酸扩增产物)时，可发生杂交，并且环结构转变为稳定的更刚性构象，导致荧光团和猝灭剂分子分离，从而产生荧光(Tyagi等人Nature Biotechnology 14:March 1996,303-308)。由于探针的特异性，荧光的产生通常仅归因于预期的扩增产物的合成。在一些情况下，分子信标探针序列与扩增产物中的序列杂交，所述扩增产物中的序列与靶核酸中的序列相同或互补。在一些情况下，分子信标探针序列与扩增产物中的序列杂交，所述扩增产物中的序列与靶核酸中的序列不相同或不互补(例如，与通过加尾扩增引物或连接而添加至扩增产物的序列杂交)。
分子信标是高度特异性的并且可以辨别单核苷酸多态性。分子信标也可以用不同颜色的荧光团和不同的靶序列合成，使得能够在同一反应中同时检测几种产物(例如，在多重反应中)。对于定量扩增过程，分子信标可以在每个扩增循环后特异性结合扩增的靶标，并且因为非杂交的分子信标是暗的，所以不必分离探针-靶标杂交体以定量测定扩增产物的量。得到的信号与扩增产物的量成比例。使用分子信标的检测可以实时进行或作为终点检测方法进行。在某些情况下，可以针对每个引物/探针组优化某些反应条件以确保准确度和精确度。
在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用侧向流动。侧向流动的使用典型地包括使用侧向流动装置。这些装置通常包括固相流体可渗透的流动路径，流体通过毛细管力流过所述流动路径。示例性装置包括但不限于试纸测定和具有各种适当涂层的薄层色谱板。在流动路径上固定用于样品的各种结合试剂、用于样品的结合配偶体或涉及用于样品的结合配偶体的缀合物和信号产生系统。可以以几种方式实现检测，包括例如酶检测、纳米颗粒检测、比色检测和荧光检测。酶检测可涉及酶标记的探针，其与侧向流动装置表面上的互补核酸靶标杂交。可以用合适的标志物处理所得复合物以产生可读信号。纳米颗粒检测涉及可以使用胶体金、乳胶和/或顺磁性纳米颗粒的珠技术。在一个实例中，珠子可以与抗生物素抗体缀合。靶序列可以直接生物素化，或靶序列可以与序列特异性生物素化探针杂交。金和乳胶产生肉眼可见的比色信号，并且顺磁颗粒当在磁场中激发时产生非视觉信号，并且可由专业读者解释。也可以使用基于荧光的侧向流动检测方法，包括例如双荧光素和生物素标记的寡核苷酸探针方法、利用由嵌入晶体中的镧系元素构成的上转换磷光体报道分子的UPT-N ALP(Corstjens等人,Clinical Chemistry,47:10,1885-1893,2001)，以及使用量子点。
可以在侧向流动装置上捕获核酸。捕获手段可包括抗体依赖性方法和抗体非依赖性方法。抗体依赖性捕获通常包括抗体捕获线和与靶标互补的序列的标记探针。抗体非依赖性捕获通常使用两个结合配偶体之间的非共价相互作用，例如，生物素化探针和链霉亲和素线之间的高亲和力和不可逆键联。捕获探针可以直接固定在侧向流动膜上。抗体依赖性方法和抗体非依赖性方法均可用于例如检测多重反应中产生的扩增产物。
在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用荧光共振能量转移(FRET)。FRET是以下两种发色团之间的能量转移机制：供体和受体分子。简而言之，供体荧光团分子在特定的激发波长下被激发。当供体分子返回其基态时随后的来自供体分子的发射可以通过长程偶极-偶极相互作用将激发能量转移到受体分子。可以监测受体分子的发射强度，并且所述发射强度是以下各项的函数：供体和受体之间的距离、供体发射光谱和受体吸收光谱的重叠以及供体发射偶极矩和受体吸收偶极矩的取向。FRET可用于定量分子动力学，例如，在如针对分子信标所述的DNA-DNA相互作用中。为了监测特定产物的产生，探针可以在一端用供体分子标记，在另一端用受体分子标记。探针-靶标杂交引起供体和受体的距离或取向的变化，并观察到FRET变化。
在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用荧光偏振(FP)。荧光偏振技术通常基于以下原理：当被线性偏振光激发时，荧光标记的化合物将发射具有与其旋转速率成反比的偏振度的荧光。因此，当例如具有荧光标记的分子(例如示踪剂-核酸缀合物)被线性偏振光激发时，发射的光保持高度偏振，因为荧光团在吸收和发射光的时间之间被限制旋转。当游离示踪剂化合物(即，未与核酸结合)被线性偏振光激发时，其旋转比相应的示踪剂-核酸缀合物快得多，并且分子更随机取向，因此发射的光被去极化。因此，荧光偏振提供了一种用于测量扩增反应中产生的示踪剂-核酸缀合物的量的定量手段。
在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用表面捕获。这可以通过将特异性寡核苷酸固定到表面，从而产生既高度灵敏又具有选择性的生物传感器来实现。可以使用的示例性表面包括金和碳，并且表面捕获方法可以使用多种共价或非共价偶联方法将探针附着到表面。可以通过多种方法监测靶核酸的后续检测。
在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用5'至3'核酸外切酶水解探针(例如TAQMAN)。例如，TAQMAN探针是可以增加定量扩增方法(例如定量PCR)的特异性的水解探针。TAQMAN探针原理依赖于1)Taq聚合酶在与互补靶序列杂交期间裂解双重标记的探针的5'至3'核酸外切酶活性和2)基于荧光团的检测。得到的荧光信号允许定量测量在扩增的指数阶段期间扩增产物的积累，并且TAQMAN探针可以显著增加检测的特异性。
在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用嵌入染料和/或结合染料。在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用特异性地染色核酸的染料。例如，嵌入染料在与DNA或RNA结合后表现出增强的荧光。染料可以包括嵌入DNA或RNA的荧光团，并且可以包括例如82、吖啶橙、溴化乙锭、Hoechst染料、碘化丙锭、I(不对称花青染料)、II、TOTO(噻唑橙二聚体)和YOYO(唑黄二聚体)。当与各种检测方法结合使用时，染料提供增加核酸检测灵敏度的机会。例如，溴化乙锭可用于凝胶电泳之后琼脂糖凝胶中的DNA染色；碘化丙啶和Hoechst 33258可用于流式细胞术中以测定细胞的DNA倍性；Green 1可用于通过毛细管电泳和激光诱导荧光检测的双链DNA分析中；并且可用于在匹配离子对多核苷酸层析之后增强双链DNA的检测。
在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用吸光度方法(例如比色、浊度)。在一些情况下，例如，核酸的检测和/或定量可以通过将吸光度(例如，260nm下的UV吸光度测量)直接转换为浓度来实现。可以使用Beer Lambert定律将核酸的直接测量转换为浓度，该定律使用测量的路径长度和消光系数将吸光度与浓度相关联。在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用比色检测方法。可以使用任何合适的比色检测，并且非限制性实例包括使用纳米颗粒(例如，金属纳米颗粒、改性纳米颗粒、未改性的纳米颗粒)和/或肽核酸(PNA)探针的测定。例如，某些基于金纳米颗粒的方法典型地依赖于靶识别和纳米颗粒聚集之间的定量结合，这反过来会导致纳米颗粒溶液的光子性质(例如，颜色)的变化。
在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用电泳(例如，凝胶电泳、毛细管电泳)。凝胶电泳包括使用电动势通过基质(通常是交联聚合物)分离核酸，所述电动势拉动分子通过基质。分子以不同的速率穿过基质，导致产物之间的分离，这些产物可通过多种方法可视化和解释，所述方法包括但不限于：放射自显影、磷光成像和核酸螯合染料染色。毛细管凝胶电泳(CGE)是传统凝胶电泳和液相色谱的组合，其在窄孔毛细管中使用诸如聚丙烯酰胺的介质，以产生快速、高效的核酸分子分离，高达单碱基分辨率。CGE可以与激光诱导荧光(LIF)检测结合，其中可以检测到少至6个染色DNA分子。CGE/LIF检测通常包括使用荧光DNA嵌入染料，其包括溴化乙锭、YOYO和Green1，并且还可以包括使用荧光DNA衍生物，其中荧光染料与DNA共价结合。可以使用这种方法同时鉴定几种不同的靶序列(例如，来自多重反应的产物)。
在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用质谱法。质谱法是一种可用于确定核酸的结构和数量的分析技术，并且可用于提供复杂混合物的快速分析。扩增后，样品可以被电离，所产生的离子根据它们的质荷比在电场和/或磁场中分离，并且检测器测量离子的质荷比(Crain,P.F.和McCloskey,J.A.,Current Opinion in Biotechnology 9:25-34(1998))。质谱法包括例如MALDI、MALDI-TOF或电喷雾。这些方法可以与气相色谱(GC/MS)和液相色谱(LC/MS)组合。由于高速信号采集和固体表面自动分析，质谱法(例如，基质辅助激光解吸/电离质谱法(MALDI MS))可以是高通量的。
在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用核酸测序。可以测定扩增产物的完整序列或部分序列，并且可以将测定的核苷酸序列称为读段。例如，在一些实施方案中，可以直接分析线性扩增产物而无需进一步扩增(例如，通过使用单分子测序方法)。在某些实施方案中，可以对线性扩增产物进行进一步扩增，然后进行分析(例如，使用通过连接的测序或焦磷酸测序方法)。读段可以接受不同类型的序列分析。可以使用任何合适的测序方法来检测，并且在一些情况下，测定通过本文所述的扩增方法产生的可检测产物的量。测序方法的非限制性实例包括单端测序、配对末端测序、基于可逆终止子的测序、通过连接的测序、焦磷酸测序、通过合成的测序、单分子测序、多重测序，固相单核苷酸测序和纳米孔测序。
在一些实施方案中，检测核酸扩增产物包括使用数字扩增(例如数字PCR)。数字PCR例如利用单分子水平上的核酸(DNA、cDNA或RNA)扩增，并提供用于定量低拷贝数核酸的高度灵敏的方法。用于核酸的数字扩增和分析的系统是可获得的(例如，Corporation)。
试剂盒
如本文所述，试剂盒可包含例如一种或多种聚合酶和一种或多种引物，和任选地一种或多种逆转录酶。在扩增一个靶标的情况下，试剂盒中可包括一对引物(正向和反向)。在扩增多个靶序列的情况下，试剂盒中可包括多个引物对。试剂盒可以包括对照多核苷酸，并且在扩增多个靶序列的情况下，试剂盒中可以包括多个对照多核苷酸。
试剂盒还可以包含一种或多种组分于许多单独器皿、腔室、容器、小包、管、小瓶、微量滴定板等中，或者组分可以在这类容器中以各种组合而组合。试剂盒的组分可以例如存在于一个或多个容器中。在一些实施方案中，所有组分都在一个容器中提供。在一些实施方案中，酶(例如，聚合酶和/或逆转录酶)可以在与引物分开的容器中提供。例如，可以将组分冻干，冷冻干燥或置于稳定的缓冲液中。在一个实施例中，聚合酶和/或逆转录酶在单个容器中以冻干形式存在，并且引物在不同的容器中冻干，冷冻干燥或处在缓冲液中。在一些实施方案中，聚合酶和/或逆转录酶和引物以冻干形式存在于单个容器中。
试剂盒可以进一步包含例如反应中使用的dNTP，或用于反应的经修饰的核苷酸、容器、比色皿或其他容器，或用于使冻干组分再水化的一小瓶水或缓冲液。所用缓冲液可以例如适合于聚合酶和引物退火活性两者。
试剂盒还可以包含用于执行本文描述的一种或多种方法的说明书和/或本文描述的一种或多种组分的说明。说明书和/或说明可以是印刷形式，并且可以包含在试剂盒插页中。试剂盒还可以包含提供这些说明书或说明的互联网位置的书面说明。
试剂盒可以进一步包含用于检测方法的试剂，例如用于FRET、侧向流动装置、试纸、荧光染料、胶体金颗粒、胶乳颗粒、分子信标或聚苯乙烯珠粒的试剂。
实施例
以下阐述的实施例说明了某些实施方案，并且不限制技术。
实施例1：通过等温扩增技术检测沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
在该实施例中，使用等温扩增技术检测来自沙眼衣原体的核酸。
实时检测衣原体基因组DNA
测试了用荧光DNA染料检测衣原体基因组DNA的实时测定。在该测定中，使用SYTO82，其是在与核酸结合时表现出明亮的橙色荧光的橙色荧光核酸染色剂。用25℃的20mMTris-HCl pH 8.8、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、4mM MgSO4、0.1％X-100、1mM DTT、2μMSYTO 82、0.25mM dNTP和每次反应1个单位的改性9Degrees North(9°NmTM)DNA聚合酶(NewEngland BioLabs,Ipswich,MA)制备主混合物溶液。9°NmTMDNA聚合酶的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO:9。使用靶向7,500个碱基对的沙眼衣原体隐蔽质粒DNA内的特异性序列的引物组，其包括11个核苷酸的正向引物(即Ct_F11:5’-GGCTTATGGAG-3’(SEQ ID NO:1))和10个核苷酸的反向引物(即Ct_R10:5’-ATACCGCTTA-3’(SEQ ID NO:2))。设计该测定以产生22个碱基的DNA产物，其包括一个碱基的间隔子。间隔子是引物的3'末端之间的核苷酸，并且该核苷酸不存在于任一引物序列中。引物各自以500nM的最终浓度使用，并与衣原体基因组DNA的2000个拷贝混合，或与作为无靶对照(NTC)的Tris-EDTA缓冲液(TE)混合。在某些情况下，dH2O用作NTC。将引物混合物置于与主混合溶液分开的反应孔中。将测定组分在65℃孵育2分钟，然后合并以引发等温反应。等温扩增反应的结果如图1所示。
电喷雾电离质谱(ESI-MS)确认来自等温扩增反应的特异性产物的生成
通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)测试由上述等温扩增反应产生的扩增产物，以验证测定的特异性。上述引物各自以500nM的最终浓度使用，并与衣原体基因组DNA的20,000个拷贝混合，或与作为无靶对照(NTC)的Tris-EDTA缓冲液(TE)混合。在某些情况下，dH2O用作NTC。在上述条件下，在65℃下将衣原体基因组DNA扩增10分钟。扩增后，用Tris-EGTA(最终20mM Tris-EGTA，pH 8.5)使反应失活。然后在ESI-MS分析之前将反应脱盐并冻干。
如图2所示，ESI-MS结果证实来自基因组DNA的等温扩增的主要产物是特异性22碱基产物(即22碱基正向产物和22碱基反向产物)。相比之下，NTC反应产生的非特异性产物的强度远低于特异性产物的强度。
衣原体基因组DNA检测的检出限(LOD)
使用等温扩增测定法测试衣原体基因组DNA检测的灵敏度。在该方法下，在不对称扩增条件下使用10核苷酸引物测定用于终点分子信标检测。用25℃的20mM Tris-HCl pH8.8、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、4mM MgSO4、0.1％X-100、1mM DTT、0.25mM dNTP和每次反应1个单位的改性9Degrees North(9°NmTM)DNA聚合酶(New England BioLabs,Ipswich,MA)制备主混合物溶液。使用靶向7,500个碱基对的沙眼衣原体隐蔽质粒DNA内的特异性序列的引物组，其包括10个核苷酸的正向引物(即Ct_F10:5’-GCTTATGGAG-3’(SEQID NO:3))和10个核苷酸的反向引物(即Ct_R10:5’-ATACCGCTTA-3’(SEQ ID NO:2))。设计该测定以产生21个碱基的DNA产物，其包括一个碱基的间隔子。该间隔子是引物的3'末端之间的核苷酸，并且该核苷酸不存在于任一引物序列中。将引物(即750nM正向引物和200nM反向引物)与作为NTC的TE或不同量的衣原体基因组DNA(即20个拷贝、200个拷贝、1,000个拷贝、2,000个拷贝)混合并置于与主混合溶液分开的反应孔中。在某些情况下，dH2O用作NTC。将测定组分在65℃孵育2分钟，然后合并以引发等温反应。反应在65℃下进行10分钟，然后通过置于冰上并加入EGTA使其失活。然后将含有与21碱基特异性正向产物互补的20碱基序列的分子信标(即Ct FP MB5.18:Fam-CTGGCTACCGCTTAACTCCATAAGCCAG-3BHQ1(SEQ ID NO:4))加入每个反应孔中。通过分子信标的终点荧光读数检测反应产物。如图3所示，使用分子信标的终点检测，该等温反应可以在65℃下在10分钟内将衣原体基因组DNA的20个拷贝扩增至可检测水平。
通过分子信标的衣原体基因组DNA的实时检测
用于实时检测衣原体基因组DNA的另一种方法是使用分子信标进行检测。在该方法下，在不对称扩增条件下的10核苷酸引物测定用于实时分子信标检测，其中dH2O或TE用作无靶对照(NTC)。用25℃的20mM Tris-HCl pH 8.8、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、4mM MgSO4、0.1％X-100、50nM fMB2 3PS(分子信标)、0.25mM dNTP和每次反应1个单位的改性9Degrees North(9°NmTM)DNA聚合酶(New England BioLabs,Ipswich,MA)制备主混合物。主混合物包括分子信标(即Ct_3PSMB.2:Fam-ccgcgagccttATACCGCTTAACTCg*c*g*g-IBFQ(SEQID NO:7))，其含有与正向产物的一部分互补的14碱基序列(14碱基序列以大写字母展示)。用*标记的核苷酸是经硫代磷酸酯修饰的DNA碱基。使用靶向7,500个碱基对的沙眼衣原体隐蔽质粒DNA内的特异性序列的引物组，其包括10个核苷酸的正向引物(即Ct_F10+2:5’-AGGCTTATGG-3’(SEQ ID NO:5))和10个核苷酸的反向引物(即Ct_R10-2:5’-TTATACCGCT-3’(SEQ ID NO:6))。设计该测定以产生25个碱基的DNA产物，其包括5个碱基的间隔子。间隔子包括每个引物的3'末端之间的5个核苷酸，并且这5个核苷酸不存在于任一引物序列中。将引物(即750nM正向引物和200nM反向引物)与作为NTC的TE或衣原体基因组DNA的20,000个拷贝在反应孔中组合。在某些情况下，dH2O用作NTC。将所有组分在65℃下孵育2分钟，然后合并以开始在65℃下进行的等温反应。通过分子信标的实时荧光读数在不同时间点检测反应产物，如图4所示。
实施例2：序列的实例
以下提供某些核苷酸和氨基酸序列的非限制性实例。
*表示经硫代磷酸酯修饰的DNA碱基
实施例3：实施方案的实施例
以下阐述的实施例说明了某些实施方案，并且不限制技术。
A1.一种扩增核酸的方法，其包括：
在等温扩增条件下使非变性样品核酸与包含以下物质的组分接触：
a)至少一种寡核苷酸，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和
b)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物。
A1.1一种扩增核酸的方法，其包括：
在等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下组分接触：
a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和
b)由超嗜热菌聚合酶或包含与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶组成的酶组分，
从而产生核酸扩增产物。
A1.2一种扩增核酸的方法，其包括：
在等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下组分接触：
a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和
b)由i)超嗜热菌聚合酶活性和任选地ii)逆转录酶活性组成的酶活性，
从而产生核酸扩增产物。
A1.3实施方案A1.2的方法，其中所述酶活性由i)超嗜热菌聚合酶活性和ii)逆转录酶活性组成。
A2.实施方案A1至A1.3中任一项的方法，其中所述方法不包括在扩增之前或期间使所述样品核酸变性。
A3.实施方案A1至A2中任一项的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与核酸内切酶接触。
A4.实施方案A1至A3中任一项的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与解旋剂接触。
A5.实施方案A1至A4中任一项的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与解旋酶接触。
A5.1实施方案A1至A5中任一项的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与重组酶接触。
A5.2实施方案A1至A5.1中任一项的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与单链DNA结合蛋白接触。
A6.实施方案A1至A5.2中任一项的方法，其中所述样品核酸在扩增之前未经修饰。
A7.实施方案A6的方法，其中未修饰的样品核酸是来自破碎细胞。
A8.实施方案A1至A7中任一项的方法，其中所述样品核酸包含DNA。
A9.实施方案A8的方法，其中所述样品核酸包含基因组DNA。
A10.实施方案A1至A7中任一项的方法，其中所述样品核酸包含RNA。
A11.实施方案A10的方法，其中所述样品核酸包含病毒RNA。
A12.实施方案A10的方法，其中所述样品核酸包含细菌RNA。
A13.实施方案A1至A12中任一项的方法，其中所述样品核酸包含单链核酸。
A14.实施方案A1至A12中任一项的方法，其中所述样品核酸包含双链核酸，所述双链核酸包含第一链和第二链。
A15.实施方案A1至A14中任一项的方法，其中所述至少一种寡核苷酸包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。
A16.实施方案A1至A14中任一项的方法，其中所述至少一种寡核苷酸由第一寡核苷酸和第二寡核苷酸组成。
A16.1实施方案A15或A16的方法，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含8至16个碱基。
A17.实施方案A15、A16或A16.1的方法，其中所述第一寡核苷酸包含与所述样品核酸的所述第一链中的靶序列互补的第一多核苷酸，并且所述第二寡核苷酸包含与所述样品核酸的所述第二链中的靶序列互补的第二多核苷酸。
A18.实施方案A15、A16或A16.1的方法，其中所述第一寡核苷酸包含与所述样品核酸的所述第一链中的靶序列连续互补的第一多核苷酸，并且所述第二寡核苷酸包含与所述样品核酸的所述第二链中的靶序列连续互补的第二多核苷酸。
A19.实施方案A15、A16或A16.1的方法，其中所述第一寡核苷酸由与所述样品核酸的所述第一链中的靶序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述样品核酸的所述第二链中的靶序列连续互补的第二多核苷酸组成。
A20.实施方案A1至A19中任一项的方法，其中样品核酸在扩增之前从受试者获得。
A21.实施方案A1至A20中任一项的方法，其中扩增未经纯化的样品核酸。
A22.实施方案A1至A20中任一项的方法，其中扩增经纯化的样品核酸。
A23.实施方案A1至A20中任一项的方法，其还包括在扩增之前纯化样品核酸。
A24.实施方案A1至A23中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由超嗜热菌聚合酶或其功能片段提供。
A25.实施方案A1至A23中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
A26.实施方案A1至A23中任一项的方法，其中超嗜热菌聚合酶活性由古细菌超嗜热菌聚合酶或其功能片段提供。
A27.实施方案A1至A26中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含SEQID NO:8的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
A28.实施方案A1至A26中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
A28.1实施方案A1至A28中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由具有低核酸外切酶活性的聚合酶提供。
A28.2实施方案A1至A28中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由不具有核酸外切酶活性的聚合酶提供。
A29.实施方案A1至A28.2中任一项的方法，其中所述扩增在约55摄氏度至约75摄氏度的恒定温度下进行。
A30.实施方案A1至A28.2中任一项的方法，其中所述扩增在约55摄氏度至约65摄氏度的恒定温度下进行。
A31.实施方案A1至A28.2中任一项的方法，其中所述扩增在约65摄氏度的恒定温度下进行。
A32.实施方案A1至A28.2中任一项的方法，其中所述扩增在约60摄氏度的恒定温度下进行。
A33.实施方案A1至A32中任一项的方法，其中所述核酸扩增产物可在10分钟或更短时间内检测到。
A34.实施方案A1至A33中任一项的方法，其中所述核酸扩增产物包含与所述样品核酸中的靶序列连续互补或基本上相同的多核苷酸。
A35.实施方案A1至A33中任一项的方法，其中所述核酸扩增产物由与所述样品核酸中的靶序列连续互补或基本上相同的多核苷酸组成。
A36.实施方案A1至A35中任一项的方法，其中所述核酸扩增产物为约20至40个碱基长。
A37.实施方案A16至A36中任一项的方法，其中所述核酸扩增产物包含i)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，ii)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和iii)间隔子序列，其中所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列。
A38.实施方案A16至A36中任一项的方法，其中所述核酸扩增产物由以下序列组成：i)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，ii)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和iii)间隔子序列，其中所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列。
A39.实施方案A37或A38的方法，其中所述间隔子序列包含1至10个碱基。
A40.实施方案A37或A38的方法，其中所述间隔子序列包含1至5个碱基。
A41.实施方案A37至A40中任一项的方法，其中所述间隔子序列不与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸互补或相同，并且不与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸互补或相同。
A42.实施方案A37至A41中任一项的方法，其中所述间隔子序列与所述样品核酸中的靶序列的一部分连续互补或基本上相同。
A43.实施方案A1至A42中任一项的方法，其还包括检测所述核酸扩增产物。
A44.实施方案A43的方法，其中检测所述核酸扩增产物是在所述样品核酸与所述提供超嗜热菌聚合酶活性的组分和所述至少一种寡核苷酸接触后的10分钟或更短时间内进行的。
A45.实施方案A43或A44的方法，其中检测所述核酸扩增产物包括使用实时检测方法。
A46.实施方案A43、A44或A45的方法，其中检测所述核酸扩增产物包括检测荧光信号。
A47.实施方案A46的方法，其中所述荧光信号是来自分子信标。
A48.实施方案A1至A47中任一项的方法，其还包括使所述核酸扩增产物与信号生成寡核苷酸接触，所述信号生成寡核苷酸包含i)与所述扩增产物中的序列互补的多核苷酸，和ii)荧光团和猝灭剂。
A49.实施方案A1至A47中任一项的方法，其中所述至少一种寡核苷酸中的一种或多种包含与所述样品核酸中杂交至信号生成寡核苷酸的序列不互补的多核苷酸，并且其中所述方法还包括将所述扩增产物与包含荧光团和猝灭剂的信号生成寡核苷酸接触。
A50.实施方案A1至A49中任一项的方法，其中所述方法是在单一反应体积中进行。
A51.实施方案A1至A50中任一项的方法，其中所述方法在单一反应容器中进行。
A52.实施方案A1至A51中任一项的方法，其包括多重扩增。
B1.一种加工核酸的方法，其包括：
扩增核酸，其中所述扩增基本上由在等温扩增条件下将非变性样品核酸与以下物质接触组成：
a)至少一种寡核苷酸，所述至少一种寡核苷酸包含与样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和
b)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物。
B2.一种加工核酸的方法，其包括：
扩增核酸，其中所述扩增基本上由在等温扩增条件下将非变性样品核酸与以下物质接触组成：
a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和
b)由超嗜热菌聚合酶或包含与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶组成的酶组分，
从而产生核酸扩增产物。
B3.一种加工核酸的方法，其包括：
扩增核酸，其中所述扩增基本上由在等温扩增条件下将非变性样品核酸与以下物质接触组成：
a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和
b)由i)超嗜热菌聚合酶活性和任选地ii)逆转录酶活性组成的酶活性，
从而产生核酸扩增产物。
B4.实施方案B3的方法，其中所述酶活性由i)超嗜热菌聚合酶活性和ii)逆转录酶活性组成。
B5.一种加工核酸的方法，其包括：
扩增核酸，其中所述扩增由在等温扩增条件下将非变性样品核酸与以下物质接触组成：
a)至少一种寡核苷酸，所述至少一种寡核苷酸包含与样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和
b)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物。
B6.一种加工核酸的方法，其包括：
扩增核酸，其中所述扩增由在等温扩增条件下将非变性样品核酸与以下物质接触组成：
a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和
b)由超嗜热菌聚合酶或包含与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶组成的酶组分，
从而产生核酸扩增产物。
B7.一种加工核酸的方法，其包括：
扩增核酸，其中所述扩增由在等温扩增条件下将非变性样品核酸与以下物质接触组成：
a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和
b)由i)超嗜热菌聚合酶活性和任选地ii)逆转录酶活性组成的酶活性，
从而产生核酸扩增产物。
B8.实施方案B7的方法，其中所述酶活性由i)超嗜热菌聚合酶活性和ii)逆转录酶活性组成。
B9.实施方案B1至B8中任一项的方法，其中所述样品核酸在扩增之前未经修饰。
B10.实施方案B9的方法，其中未修饰的样品核酸是来自破碎细胞。
B11.实施方案B1至B10中任一项的方法，其中所述样品核酸包含DNA。
B12.实施方案B11的方法，其中所述样品核酸包含基因组DNA。
B13.实施方案B1至B10中任一项的方法，其中所述样品核酸包含RNA。
B14.实施方案B13的方法，其中所述样品核酸包含病毒RNA。
B15.实施方案B13的方法，其中所述样品核酸包含细菌RNA。
B16.实施方案B1至B15中任一项的方法，其中所述样品核酸包含单链核酸。
B17.实施方案B1至B15中任一项的方法，其中所述样品核酸包含双链核酸，所述双链核酸包含第一链和第二链。
B18.实施方案B1至B17中任一项的方法，其中所述至少一种寡核苷酸包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。
B19.实施方案B1至B17中任一项的方法，其中所述至少一种寡核苷酸由第一寡核苷酸和第二寡核苷酸组成。
B19.1实施方案B18或B19的方法，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含8至16个碱基。
B20.实施方案B18、B19或B19.1的方法，其中所述第一寡核苷酸包含与所述样品核酸的第一链中的靶序列互补的第一多核苷酸，并且所述第二寡核苷酸包含与所述样品核酸的第二链中的靶序列互补的第二多核苷酸。
B21.实施方案B18、B19或B19.1的方法，其中所述第一寡核苷酸包含与所述样品核酸的第一链中的靶序列连续互补的第一多核苷酸，并且所述第二寡核苷酸包含与所述样品核酸的第二链中的靶序列连续互补的第二多核苷酸。
B22.实施方案B18、B19或B19.1的方法，其中所述第一寡核苷酸由与所述样品核酸的所述第一链中的靶序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述样品核酸的所述第二链中的靶序列连续互补的第二多核苷酸组成。
B23.实施方案B1至B22中任一项的方法，其中样品核酸在扩增之前从受试者获得。
B24.实施方案B1至B22中任一项的方法，其中扩增未经纯化的样品核酸。
B25.实施方案B1至B22中任一项的方法，其中扩增经纯化的样品核酸。
B26.实施方案B1至B22中任一项的方法，其还包括在扩增之前纯化样品核酸。
B27.实施方案B1至B26中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由超嗜热菌聚合酶或其功能片段提供。
B28.实施方案B1至B26中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
B29.实施方案B1至B26中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由古细菌超嗜热菌聚合酶或其功能片段提供。
B30.实施方案B1至B29中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含SEQID NO:8的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
B31.实施方案B1至B29中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
B31.1实施方案B1至B31中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由具有低核酸外切酶活性的聚合酶提供。
B32.2实施方案B1至B31中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由不具有核酸外切酶活性的聚合酶提供。
B32.实施方案B1至B31.2中任一项的方法，其中所述扩增在约55摄氏度至约75摄氏度的恒定温度下进行。
B33.实施方案B1至B31.2中任一项的方法，其中所述扩增在约55摄氏度至约65摄氏度的恒定温度下进行。
B34.实施方案B1至B31.2中任一项的方法，其中所述扩增在约65摄氏度的恒定温度下进行。
B35.实施方案B1至B31.2中任一项的方法，其中所述扩增在约60摄氏度的恒定温度下进行。
B36.实施方案B1至B35中任一项的方法，其中所述核酸扩增产物在10分钟或更短时间内是可检测的。
B37.实施方案B1至B36中任一项的方法，其中所述核酸扩增产物包含与所述样品核酸中的靶序列连续互补或基本上相同的多核苷酸。
B38.实施方案B1至B36中任一项的方法，其中所述核酸扩增产物由与所述样品核酸中的靶序列连续互补或基本上相同的多核苷酸组成。
B39.实施方案B1至B38中任一项的方法，其中所述核酸扩增产物为约20至40个碱基长。
B40.实施方案B20至B39中任一项的方法，其中所述核酸扩增产物包含i)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，ii)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和iii)间隔子序列，其中所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列。
B41.实施方案B20至B39中任一项的方法，其中所述核酸扩增产物由以下序列组成：i)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，ii)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和iii)间隔子序列，其中所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列。
B42.实施方案B40或B41的方法，其中所述间隔子序列包含1至10个碱基。
B43.实施方案B40或B41的方法，其中所述间隔子序列包含1至5个碱基。
B44.实施方案B40至B43中任一项的方法，其中所述间隔子序列不与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸互补或相同，并且不与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸互补或相同。
B45.实施方案B40至B44中任一项的方法，其中所述间隔子序列与所述样品核酸中的靶序列的一部分连续互补或基本上相同。
B46.实施方案B1至B45中任一项的方法，其还包括检测所述核酸扩增产物。
B47.实施方案B46的方法，其中检测所述核酸扩增产物是在所述样品核酸与所述提供超嗜热菌聚合酶活性的组分和所述至少一种寡核苷酸接触后的10分钟或更短时间内进行的。
B48.实施方案B46或B47的方法，其中检测所述核酸扩增产物包括使用实时检测方法。
B49.实施方案B46、B47或B48的方法，其中检测所述核酸扩增产物包括检测荧光信号。
B50.实施方案B49的方法，其中所述荧光信号是来自分子信标。
B51.实施方案B1至B50中任一项的方法，其还包括使所述核酸扩增产物与信号生成寡核苷酸接触，所述信号生成寡核苷酸包含i)与所述扩增产物中的序列互补的多核苷酸，和ii)荧光团和猝灭剂。
B52.实施方案B1至B50中任一项的方法，其中所述至少一种寡核苷酸中的一种或多种包含与所述样品核酸中杂交至信号生成寡核苷酸的序列不互补的多核苷酸，并且其中所述方法还包括将所述扩增产物与包含荧光团和猝灭剂的所述信号生成寡核苷酸接触。
B53.实施方案B1至B52中任一项的方法，其中所述方法在单一反应体积中进行。
B54.实施方案B1至B53中任一项的方法，其中所述方法在单一反应容器中进行。
B55.实施方案B1至B54中任一项的方法，其包括多重扩增。
C1.一种确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的方法，其包括：
a)扩增所述样品核酸中的靶序列，其中：
所述靶序列包含第一链和第二链，所述第一链和第二链彼此互补，并且所述扩增包括在无解旋酶的等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触：
i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包含与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸，并且所述第二寡核苷酸包含与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸；和
ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物，其中所述核酸扩增产物包含1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列，和
所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；和
b)检测所述核酸扩增产物，其中检测所述核酸扩增产物包括使用实时检测方法，并且在所述样品核酸与(a)(i)和(a)(ii)接触后10分钟或更短时间内进行，从而确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量。
C1.1实施方案C1的方法，其中所述第一寡核苷酸基本上由与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸基本上由与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成；和/或所述核酸扩增产物基本上由以下序列组成：1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列。
C1.2实施方案C1的方法，其中所述第一寡核苷酸由与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成；和/或所述核酸扩增产物由以下序列组成：1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列。
C1.3一种确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的方法，其包括：
a)扩增所述样品核酸中的靶序列，其中：
所述靶序列包含第一链和第二链，所述第一链和第二链彼此互补，并且所述扩增包括在无解旋酶的等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触：
i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸由与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成；和
ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物，其中所述核酸扩增产物由以下序列组成：1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列，和
所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；和
b)检测所述核酸扩增产物，其中检测所述核酸扩增产物包括使用实时检测方法，并且在所述样品核酸与(a)(i)和(a)(ii)接触后10分钟或更短时间内进行，从而确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量。
C1.4实施方案C1至C1.3中任一项的方法，其中所述扩增包括在无解旋酶和无重组酶的等温扩增条件下接触非变性样品核酸。
C2.实施方案C1至C1.4中任一项的方法，其中所述至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分包含超嗜热菌聚合酶或其功能片段，或包含含有与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段。
C3.实施方案C1至C1.4中任一项的方法，其中所述至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分由超嗜热菌聚合酶或其功能片段组成，或由含有与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段组成。
C4.实施方案C1至C3中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由古细菌超嗜热菌聚合酶或其功能片段提供。
C5.实施方案C1至C4中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含SEQID NO:8的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
C6.实施方案C1至C4中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含与SEQID NO:8的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
C6.1实施方案C1至C6中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由具有低核酸外切酶活性的聚合酶提供。
C6.2实施方案C1至C6中任一项的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由不具有核酸外切酶活性的聚合酶提供。
C7.实施方案C1至C6.2中任一项的方法，其中部分(a)(ii)进一步包含至少一种提供逆转录酶活性的组分。
C8.实施方案C1至C6.2中任一项的方法，其中所述至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分进一步提供逆转录酶活性。
C8.1实施方案C1至C8中任一项的方法，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含8至16个碱基。
C9.实施方案C1至C8.1中任一项的方法，其中所述方法不包括在扩增之前或期间使所述样品核酸变性。
C10.实施方案C1至C9中任一项的方法，其中所述样品核酸在扩增之前、期间或之后不与核酸内切酶接触。
C10.1实施方案C1至C10中任一项的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与重组酶接触。
C10.2实施方案C1至C10.1中任一项的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与单链DNA结合蛋白接触。
C11.实施方案C1至C10.2中任一项的方法，其中所述样品核酸在扩增之前未经修饰。
C12.实施方案C11的方法，其中未修饰的样品核酸是来自破碎细胞。
C13.实施方案C1至C12中任一项的方法，其中所述样品核酸包含DNA。
C14.实施方案C13的方法，其中所述样品核酸包含基因组DNA。
C15.实施方案C1至C12中任一项的方法，其中所述样品核酸包含RNA。
C16.实施方案C15的方法，其中所述样品核酸包含病毒RNA。
C17.实施方案C15的方法，其中所述样品核酸包含细菌RNA。
C18.实施方案C1至C17中任一项的方法，其中所述样品核酸包含单链核酸。
C19.实施方案C1至C17中任一项的方法，其中所述样品核酸包含双链核酸。
C20.实施方案C1至C19中任一项的方法，其中样品核酸在扩增之前从受试者获得。
C20.1实施方案C1至C20中任一项的方法，其中扩增未经纯化的样品核酸。
C20.2实施方案C1至C20中任一项的方法，其中扩增经纯化的样品核酸。
C21.实施方案C1至C20.2中任一项的方法，其还包括在扩增之前纯化样品核酸。
C22.实施方案C1至C21中任一项的方法，其中所述扩增在约55摄氏度至约75摄氏度的恒定温度下进行。
C23.实施方案C1至C21中任一项的方法，其中所述扩增在约55摄氏度至约65摄氏度的恒定温度下进行。
C24.实施方案C1至C21中任一项的方法，其中所述扩增在约65摄氏度的恒定温度下进行。
C25.实施方案C1至C21中任一项的方法，其中所述扩增在约60摄氏度的恒定温度下进行。
C26.实施方案C1至C25中任一项的方法，其中所述核酸扩增产物为约20至40个碱基长。
C27.实施方案C1至C26中任一项的方法，其中所述间隔子序列包含1至5个碱基。
C28.实施方案C1至C27中任一项的方法，其中所述间隔子序列不与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸互补或相同，并且不与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸互补或相同。
C29.实施方案C1至C28中任一项的方法，其中所述间隔子序列与所述样品核酸中的靶序列的一部分连续互补或基本上相同。
C30.实施方案C1至C28中任一项的方法，其中检测所述核酸扩增产物包括检测荧光信号。
C31.实施方案C30的方法，其中所述荧光信号来自分子信标。
C32.实施方案C1至C31中任一项的方法，其还包括使所述核酸扩增产物与信号生成寡核苷酸接触，所述信号生成寡核苷酸包含i)与所述扩增产物中的序列互补的多核苷酸，和ii)荧光团和猝灭剂。
C33.实施方案C1至C32中任一项的方法，其中所述方法在单一反应体积中进行。
C34.实施方案C1至C33中任一项的方法，其中所述方法在单一反应容器中进行。
C35.实施方案C1至C34中任一项的方法，其包括多重扩增。
D1.一种用于确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的试剂盒，其包括：
a)用于在无解旋酶的等温扩增条件下扩增所述样品核酸中的靶序列的组分，所述组分包含：
i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包含与所述靶序列的第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸，并且所述第二寡核苷酸包含与所述靶序列的第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸，所述靶序列的所述第一链和第二链彼此互补；和
ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分；和
b)至少一种为核酸扩增产物提供实时检测活性的组分。
D1.1实施方案D1的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸基本上由与所述靶序列的第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸基本上由与所述靶序列的第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成。
D1.2实施方案D1的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸由与所述靶序列的第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述靶序列的第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成。
D1.3一种用于确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的试剂盒，其包括：
a)用于在无解旋酶的等温扩增条件下扩增所述样品核酸中的靶序列的组分，所述组分包含：
i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸由与所述靶序列的第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述靶序列的第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成，其中所述靶序列的所述第一链和第二链彼此互补；和
ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分；和
b)至少一种为核酸扩增产物提供实时检测活性的组分。
D1.4实施方案D1至D1.3中任一项的试剂盒，其中所述样品核酸在无解旋酶和无重组酶的等温扩增条件下扩增。
D2.实施方案D1至D1.4中任一项的试剂盒，其中所述至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分包含超嗜热菌聚合酶或其功能片段，或包含含有与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段。
D3.实施方案D1至D1.4中任一项的试剂盒，其中所述至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分由超嗜热菌聚合酶或其功能片段组成，或由含有与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段组成。
D4.实施方案D1至D3中任一项的试剂盒，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由古细菌超嗜热菌聚合酶或其功能片段提供。
D5.实施方案D1至D4中任一项的试剂盒，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含SEQID NO:8的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
D6.实施方案D1至D4中任一项的试剂盒，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由含有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
D7.实施方案D1至D6中任一项的试剂盒，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由具有低核酸外切酶活性的聚合酶提供。
D8.实施方案D1至D6中任一项的试剂盒，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由不具有核酸外切酶活性的聚合酶提供。
D9.实施方案D1至D8中任一项的试剂盒，其中部分(a)(ii)进一步包含至少一种提供逆转录酶活性的组分。
D10.实施方案D1至D8中任一项的试剂盒，其中所述至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分进一步提供逆转录酶活性。
D11.实施方案D1至D10中任一项的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含8至16个碱基。
D12.实施方案D1至D11中任一项的试剂盒，其中所述实时检测活性由分子信标提供。
D13.实施方案D1至D12中任一项的试剂盒，其进一步包含用于实施用于确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的方法的说明书，所述方法包括：
a)扩增所述样品核酸中的靶序列，其中：
所述靶序列包含第一链和第二链，
所述第一链和第二链彼此互补，
并且所述扩增包括在无解旋酶的等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触：
i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包含与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸，并且所述第二寡核苷酸包含与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸；和
ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物，其中所述核酸扩增产物包含1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列，和
所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；和
b)检测所述核酸扩增产物，其中检测所述核酸扩增产物包括使用实时检测方法，并且在所述样品核酸与(a)(i)和(a)(ii)接触后10分钟或更短时间内进行，从而确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量。
D13.1实施方案D13的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸基本上由与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸基本上由与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成；和/或所述核酸扩增产物基本上由以下序列组成：1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列。
D13.2实施方案D13的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸由与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成；和/或所述核酸扩增产物由以下序列组成：1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列。
D13.3实施方案D1至D12中任一项的试剂盒，其进一步包含用于实施用于确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的方法的说明书，所述方法包括：
a)扩增所述样品核酸中的靶序列，其中：
所述靶序列包含第一链和第二链，
所述第一链和第二链彼此互补，
并且所述扩增包括在无解旋酶的等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触：
i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸由与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成；和
ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物，其中所述核酸扩增产物由以下序列组成：1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列，和
所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；和
b)检测所述核酸扩增产物，其中检测所述核酸扩增产物包括使用实时检测方法，并且在所述样品核酸与(a)(i)和(a)(ii)接触后10分钟或更短时间内进行，从而确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量。
D14.实施方案D13至D13.3中任一项的试剂盒，其中所述方法不包括在扩增之前或期间使所述样品核酸变性。
D15.实施方案D13至D14中任一项的试剂盒，其中所述样品核酸在扩增之前、期间或之后不与核酸内切酶接触。
D16.实施方案D13至D15中任一项的试剂盒，其中所述样品核酸在扩增之前未经修饰。
D17.实施方案D16的试剂盒，其中所述未修饰的样品核酸是来自破碎细胞。
D18.实施方案D13至D15中任一项的试剂盒，其中所述样品核酸包含DNA。
D19.实施方案D18的试剂盒，其中所述样品核酸包含基因组DNA。
D20.实施方案D13至D15中任一项的试剂盒，其中所述样品核酸包含RNA。
D21.实施方案D20的试剂盒，其中所述样品核酸包含病毒RNA。
D22.实施方案D20的试剂盒，其中所述样品核酸包含细菌RNA。
D23.实施方案D13至D22中任一项的试剂盒，其中所述样品核酸包含单链核酸。
D24.实施方案D13至D22中任一项的试剂盒，其中所述样品核酸包含双链核酸。
D25.实施方案D13至D24中任一项的试剂盒，其中样品核酸在扩增之前从受试者获得。
D26.实施方案D13至D25中任一项的试剂盒，其中扩增未经纯化的样品核酸。
D27.实施方案D13至D25中任一项的试剂盒，其中扩增经纯化的样品核酸。
D28.实施方案D13至D27中任一项的试剂盒，其中所述方法还包括在扩增之前纯化样品核酸。
D29.实施方案D13至D28中任一项的试剂盒，其中所述扩增在约55摄氏度至约75摄氏度的恒定温度下进行。
D30.实施方案D13至D28中任一项的试剂盒，其中所述扩增在约55摄氏度至约65摄氏度的恒定温度下进行。
D31.实施方案D13至D28中任一项的试剂盒，其中所述扩增在约65摄氏度的恒定温度下进行。
D32.实施方案D13至D28中任一项的试剂盒，其中所述扩增在约60摄氏度的恒定温度下进行。
D33.实施方案D13至D32中任一项的试剂盒，其中所述核酸扩增产物为约20至40个碱基长。
D34.实施方案D13至D33中任一项的试剂盒，其中所述间隔子序列包含1至5个碱基。
D35.实施方案D13至D34中任一项的试剂盒，其中所述间隔子序列不与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸互补或相同，并且不与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸互补或相同。
D36.实施方案D13至D35中任一项的试剂盒，其中所述间隔子序列与所述样品核酸中的靶序列的一部分连续互补或基本上相同。
D37.实施方案D13至D36中任一项的试剂盒，其中检测所述核酸扩增产物包括检测荧光信号。
D38.实施方案D37的试剂盒，其中所述荧光信号是来自分子信标。
D39.实施方案D13至D38中任一项的试剂盒，其中所述方法还包括使所述核酸扩增产物与信号生成寡核苷酸接触，所述信号生成寡核苷酸包含i)与所述扩增产物中的序列互补的多核苷酸，和ii)荧光团和猝灭剂。
D40.实施方案D13至D39中任一项的试剂盒，其中所述方法在单一反应体积中进行。
D41.实施方案D13至D40中任一项的试剂盒，其中所述方法在单一反应容器中进行。
D42.实施方案D13至D41中任一项所述的试剂盒，其中所述方法包括多重扩增。
***
本文引用的每篇专利、专利申请、出版物和文献的全部内容通过引用并入本文。对上述专利、专利申请、出版物和文献的引用并不是承认任何前述内容是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。对它们的引用并不表示搜索相关公开内容。关于文献的日期或内容的所有陈述均基于可获得的信息，而不是承认它们的准确性或正确性。
在不脱离本技术的基本方面的情况下，可以对前述内容进行修改。尽管已经参考一个或多个具体实施方案相当详细地描述了本技术，但是本领域普通技术人员将认识到可以对在本申请中具体公开的实施方案进行改变，然而这些修改和改进都在本技术的范围和精神内。
本文中说明性地描述的技术可适当地在没有本文未具体公开的任何要素的情况下实施。因此，例如，在本文中的每种情况下，术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一个可以用其他两个术语中的任何一个替换。已经使用的术语和表达用作描述的术语而不构成限制，并且这些术语和表达的使用不排除所示和所描述的特征或其部分的任何等同物，并且各种修改在所要求保护的技术的范围内是可能的。术语“a/an(一)”可指其修饰的要素中的一种或多种(例如“一种试剂”可指一种或多种试剂)，除非在上下文中明确描述了一种所述要素或超过一种所述要素。本文中使用的术语“约”是指基础参数的10％以内的值(即，加或减10％)，并且在一串值的开始使用术语“约”修饰每个值(即，“约1、2和3”是指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量可包括90克和110克之间的重量。此外，当在本文中描述值的列表(例如，约50％、60％、70％、80％、85％或86％)时，该列表包括其所有中间值和其分数值(例如，54％、85.4％)。因此，应该理解，尽管已经通过代表性实施方案和任选特征具体公开了本技术，但是本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在这项技术的范围内。
在随后的权利要求中阐述了本技术的某些实施方案。
序列表
<110> 纳特诊断公司
<120> 等温扩增组分和工艺
<130> NAT-1001-PC
<140>
<141>
<150> 15/090,405
<151> 2016-04-04
<160> 12
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 1
ggcttatgga g 11
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 2
ataccgctta 10
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 3
gcttatggag 10
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 4
ctggctaccg cttaactcca taagccag 28
<210> 5
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 5
aggcttatgg 10
<210> 6
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 6
ttataccgct 10
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(29)
<223> /备注="硫代磷酸酯键"
<400> 7
ccgcgagcct tataccgctt aactcgcgg 29
<210> 8
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成衍生的嗜热球菌属（Thermococcus sp.）菌株9degrees N-7多肽"
<400> 8
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Val Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg
20 25 30
Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile
35 40 45
Glu Asp Val Lys Lys Val Thr Ala Lys Arg His Gly Thr Val Val Lys
50 55 60
Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile
65 70 75 80
Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Asn His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile
85 90 95
Arg Asp Arg Ile Arg Ala His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
115 120 125
Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Thr Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr
130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg Val Val Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu
210 215 220
Glu Leu Gly Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu
275 280 285
Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Gln Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly
290 295 300
Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr
305 310 315 320
Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Asn Glu Leu Ala
355 360 365
Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gly Gly Tyr
370 375 380
Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Asp Asn Ile
385 390 395 400
Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His
405 410 415
Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp
420 425 430
Val Ala Pro Glu Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe
435 440 445
Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys
450 455 460
Arg Lys Met Lys Ala Thr Val Asp Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu Asp
465 470 475 480
Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr
485 490 495
Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser
500 505 510
Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Met Val Ile Arg Glu Leu
515 520 525
Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Leu
530 535 540
His Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala
545 550 555 560
Lys Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu
565 570 575
Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Val Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys
580 585 590
Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu
595 600 605
Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala
610 615 620
Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val
625 630 635 640
Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro
645 650 655
Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Arg Asp
660 665 670
Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala
675 680 685
Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu
690 695 700
Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Ala Asp Glu Phe
705 710 715 720
Asp Pro Thr Lys His Arg Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln
725 730 735
Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Arg Lys
740 745 750
Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Lys Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp
755 760 765
Leu Lys Val Lys Gly Lys Lys
770 775
<210> 9
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成衍生的嗜热球菌属菌株9 degrees N-7多肽"
<400> 9
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Val Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg
20 25 30
Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile
35 40 45
Glu Asp Val Lys Lys Val Thr Ala Lys Arg His Gly Thr Val Val Lys
50 55 60
Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile
65 70 75 80
Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Asn His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile
85 90 95
Arg Asp Arg Ile Arg Ala His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
115 120 125
Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Thr Met Leu Ala Phe Asp Ile Asp Thr
130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg Val Val Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu
210 215 220
Glu Leu Gly Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
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260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu
275 280 285
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290 295 300
Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr
305 310 315 320
Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Asn Glu Leu Ala
355 360 365
Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gly Gly Tyr
370 375 380
Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Asp Asn Ile
385 390 395 400
Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His
405 410 415
Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp
420 425 430
Val Ala Pro Glu Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe
435 440 445
Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys
450 455 460
Arg Lys Met Lys Ala Thr Val Asp Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu Asp
465 470 475 480
Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr
485 490 495
Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser
500 505 510
Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Met Val Ile Arg Glu Leu
515 520 525
Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Leu
530 535 540
His Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala
545 550 555 560
Lys Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu
565 570 575
Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Val Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys
580 585 590
Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu
595 600 605
Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala
610 615 620
Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val
625 630 635 640
Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro
645 650 655
Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Arg Asp
660 665 670
Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala
675 680 685
Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu
690 695 700
Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Ala Asp Glu Phe
705 710 715 720
Asp Pro Thr Lys His Arg Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln
725 730 735
Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Arg Lys
740 745 750
Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Lys Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp
755 760 765
Leu Lys Val Lys Gly Lys Lys
770 775
<210> 10
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 10
atgcatgcat gc 12
<210> 11
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 11
gcatgcatgc at 12
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 12
atgcataaaa aagcatgc 18

Claims (133)

1.一种确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的方法，其包括：
a)扩增所述样品核酸中的靶序列，其中：
所述靶序列包含第一链和第二链，
所述第一链和第二链彼此互补，并且
所述扩增包括在无裂解剂、无解旋酶和无重组酶的等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触：
i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中：
所述第一寡核苷酸由与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，和
所述第二寡核苷酸由与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成；和
ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物，其中：
所述核酸扩增产物由以下物质组成：1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列；和
所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；和
b)检测所述核酸扩增产物，其中检测所述核酸扩增产物包括使用实时检测方法，并且在所述样品核酸与(a)(i)和(a)(ii)接触后10分钟或更短时间内进行，从而确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由超嗜热菌聚合酶或其功能片段提供，或由包含与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供，或由包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由具有低核酸外切酶活性或不具有核酸外切酶活性的聚合酶提供。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中部分(a)(ii)进一步包含至少一种提供逆转录酶活性的组分。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分进一步提供逆转录酶活性。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法不包括在扩增之前或期间使所述样品核酸变性。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与单链DNA结合蛋白接触。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中扩增未经纯化的样品核酸。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述扩增在约55摄氏度至约75摄氏度的恒定温度下进行。
11.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述扩增在约65摄氏度的恒定温度下进行。
12.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述扩增在约60摄氏度的恒定温度下进行。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自为约8至16个碱基长。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述核酸扩增产物为约20至40个碱基长。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述间隔子序列包含1至5个碱基，并与所述样品核酸中的所述靶序列的一部分连续互补或基本上相同。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中检测所述核酸扩增产物包括检测荧光信号。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述荧光信号来自分子信标。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其进一步包括使所述核酸扩增产物与信号生成寡核苷酸接触，所述信号生成寡核苷酸包含i)与所述扩增产物中的序列互补的多核苷酸，和ii)荧光团和猝灭剂。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述方法在单一反应容器中进行。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其包括多重扩增。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述扩增包括在无裂解剂、无解旋酶和无重组酶的等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触：
i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中：
所述第一寡核苷酸由与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，和
所述第二寡核苷酸由与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成；和
ii)由提供超嗜热菌聚合酶活性的组分组成的酶组分。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸由第一多核苷酸组成，所述第一多核苷酸由DNA碱基、修饰的DNA碱基、或DNA碱基和修饰的DNA碱基组成；并且所述第二寡核苷酸由第二多核苷酸组成，所述第二多核苷酸由DNA碱基、修饰的DNA碱基、或DNA碱基和修饰的DNA碱基组成。
23.一种扩增核酸的方法，其包括：
在等温扩增条件下使非变性样品核酸与包含以下物质的组分接触：
a)至少一种寡核苷酸，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和
b)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物。
24.一种扩增核酸的方法，其包括：
在等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触：
a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和
b)由超嗜热菌聚合酶组成或由包含与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶组成的酶组分，
从而产生核酸扩增产物。
25.一种扩增核酸的方法，其包括：
在等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触：
a)包含至少一种寡核苷酸的非酶组分，所述至少一种寡核苷酸包含与所述样品核酸中的靶序列互补的多核苷酸，和
b)由i)超嗜热菌聚合酶活性和任选地ii)逆转录酶活性组成的酶活性，
从而产生核酸扩增产物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述酶活性由i)超嗜热菌聚合酶活性和ii)逆转录酶活性组成。
27.如权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所述方法不包括在扩增之前或期间使所述样品核酸变性。
28.如权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与核酸内切酶接触。
29.如权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与解旋剂接触。
30.如权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与解旋酶接触。
31.如权利要求23至30中任一项所述的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与重组酶接触。
32.如权利要求23至31中任一项所述的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与单链DNA结合蛋白接触。
33.如权利要求23至32中任一项所述的方法，其中所述样品核酸在扩增之前未经修饰。
34.如权利要求33所述的方法，其中未经修饰的样品核酸来自破碎细胞。
35.如权利要求23至34中任一项所述的方法，其中所述样品核酸包含DNA。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述样品核酸包含基因组DNA。
37.如权利要求23至34中任一项所述的方法，其中所述样品核酸包含RNA。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述样品核酸包含病毒RNA。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述样品核酸包含细菌RNA。
40.如权利要求23至39中任一项所述的方法，其中所述样品核酸包含单链核酸。
41.如权利要求23至39中任一项所述的方法，其中所述样品核酸包含双链核酸，所述双链核酸包含第一链和第二链。
42.如权利要求23至41中任一项所述的方法，其中所述至少一种寡核苷酸包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。
43.如权利要求23至41中任一项所述的方法，其中所述至少一种寡核苷酸由第一寡核苷酸和第二寡核苷酸组成。
44.如权利要求42或43所述的方法，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含8至16个碱基。
45.如权利要求42、43或44所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含与所述样品核酸的所述第一链中的靶序列互补的第一多核苷酸，并且所述第二寡核苷酸包含与所述样品核酸的所述第二链中的靶序列互补的第二多核苷酸。
46.如权利要求42、43或44所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含与所述样品核酸的所述第一链中的靶序列连续互补的第一多核苷酸，并且所述第二寡核苷酸包含与所述样品核酸的所述第二链中的靶序列连续互补的第二多核苷酸。
47.如权利要求42、43或44所述的方法，其中所述第一寡核苷酸由与所述样品核酸的所述第一链中的靶序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述样品核酸的所述第二链中的靶序列连续互补的第二多核苷酸组成。
48.如权利要求23至47中任一项所述的方法，其中样品核酸在扩增之前从受试者获得。
49.如权利要求23至48中任一项所述的方法，其中扩增未经纯化的样品核酸。
50.如权利要求23至48中任一项所述的方法，其中扩增经纯化的样品核酸。
51.如权利要求23至48中任一项所述的方法，其进一步包括在扩增之前纯化样品核酸。
52.如权利要求23至51中任一项所述的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由超嗜热菌聚合酶或其功能片段提供。
53.如权利要求23至51中任一项所述的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
54.如权利要求23至51中任一项所述的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由古细菌超嗜热菌聚合酶或其功能片段提供。
55.如权利要求23至54中任一项所述的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含SEQID NO:8的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
56.如权利要求23至54中任一项所述的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
57.如权利要求23至56中任一项所述的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由具有低核酸外切酶活性的聚合酶提供。
58.如权利要求23至56中任一项所述的方法，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由不具有核酸外切酶活性的聚合酶提供。
59.如权利要求23至58中任一项所述的方法，其中所述扩增在约55摄氏度至约75摄氏度的恒定温度下进行。
60.如权利要求23至58中任一项所述的方法，其中所述扩增在约55摄氏度至约65摄氏度的恒定温度下进行。
61.如权利要求23至58中任一项所述的方法，其中所述扩增在约65摄氏度的恒定温度下进行。
62.如权利要求23至58中任一项所述的方法，其中所述扩增在约60摄氏度的恒定温度下进行。
63.如权利要求23至62中任一项所述的方法，其中所述核酸扩增产物可在10分钟或更短时间内检测到。
64.如权利要求23至63中任一项所述的方法，其中所述核酸扩增产物包含与所述样品核酸中的靶序列连续互补或基本上相同的多核苷酸。
65.如权利要求23至63中任一项所述的方法，其中所述核酸扩增产物由与所述样品核酸中的靶序列连续互补或基本上相同的多核苷酸组成。
66.如权利要求23至65中任一项所述的方法，其中所述核酸扩增产物为约20至40个碱基长。
67.如权利要求43至66中任一项所述的方法，其中所述核酸扩增产物包含i)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，ii)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和iii)间隔子序列，其中所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列。
68.如权利要求43至66中任一项所述的方法，其中所述核酸扩增产物由以下序列组成：i)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，ii)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和iii)间隔子序列，其中所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列。
69.如权利要求67或68所述的方法，其中所述间隔子序列包含1至10个碱基。
70.如权利要求67或68所述的方法，其中所述间隔子序列包含1至5个碱基。
71.如权利要求67至70中任一项所述的方法，其中所述间隔子序列不与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸互补或相同，并且不与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸互补或相同。
72.如权利要求67至71中任一项所述的方法，其中所述间隔子序列与所述样品核酸中的靶序列的一部分连续互补或基本上相同。
73.如权利要求23至72中任一项所述的方法，其进一步包括检测所述核酸扩增产物。
74.如权利要求73所述的方法，其中检测所述核酸扩增产物是在所述样品核酸与所述提供超嗜热菌聚合酶活性的组分和所述至少一种寡核苷酸接触后的10分钟或更短时间内进行的。
75.如权利要求73或74所述的方法，其中检测所述核酸扩增产物包括使用实时检测方法。
76.如权利要求73、74或75所述的方法，其中检测所述核酸扩增产物包括检测荧光信号。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述荧光信号来自分子信标。
78.如权利要求23至77中任一项所述的方法，其进一步包括使所述核酸扩增产物与信号生成寡核苷酸接触，所述信号生成寡核苷酸包含i)与所述扩增产物中的序列互补的多核苷酸，和ii)荧光团和猝灭剂。
79.如权利要求23至78中任一项所述的方法，其中所述至少一种寡核苷酸中的一种或多种包含与所述样品核酸中杂交至信号生成寡核苷酸的序列不互补的多核苷酸，并且其中所述方法进一步包括使所述扩增产物与包含荧光团和猝灭剂的信号生成寡核苷酸接触。
80.如权利要求23至79中任一项所述的方法，其中所述方法在单一反应体积中进行。
81.如权利要求23至80中任一项所述的方法，其中所述方法在单一反应容器中进行。
82.如权利要求23至81中任一项所述的方法，其包括多重扩增。
83.如权利要求23至82中任一项所述的方法，其中所述样品核酸在扩增之前或期间不与裂解剂接触。
84.一种用于确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的试剂盒，其包含：
a)用于在无解旋酶的等温扩增条件下扩增所述样品核酸中的靶序列的组分，所述组分包含：
i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包含与所述靶序列的第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸，并且所述第二寡核苷酸包含与所述靶序列的第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸，所述靶序列的所述第一链和第二链彼此互补；和
ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分；和
b)至少一种为核酸扩增产物提供实时检测活性的组分。
85.如权利要求84所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸基本上由与所述靶序列的第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸基本上由与所述靶序列的第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成。
86.如权利要求84所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸由与所述靶序列的第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述靶序列的第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成。
87.一种用于确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的试剂盒，其包括：
a)用于在无解旋酶的等温扩增条件下扩增所述样品核酸中的靶序列的组分，所述组分包含：
i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸由与所述靶序列的第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述靶序列的第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成，其中所述靶序列的所述第一链和第二链彼此互补；和
ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分；和
b)至少一种为核酸扩增产物提供实时检测活性的组分。
88.如权利要求84至87中任一项所述的试剂盒，其中所述样品核酸在无解旋酶和无重组酶的等温扩增条件下扩增。
89.如权利要求84至87中任一项所述的试剂盒，其中所述样品核酸在无解旋酶、无重组酶和无裂解剂的等温扩增条件下扩增。
90.如权利要求84至89中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分包含超嗜热菌聚合酶或其功能片段，或包含含有与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段。
91.如权利要求84至89中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分由超嗜热菌聚合酶或其功能片段组成，或由包含与超嗜热菌聚合酶至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段组成。
92.如权利要求84至91中任一项所述的试剂盒，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由古细菌超嗜热菌聚合酶或其功能片段提供。
93.如权利要求84至92中任一项所述的试剂盒，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
94.如权利要求84至92中任一项所述的试剂盒，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列的聚合酶或其功能片段提供。
95.如权利要求84至94中任一项所述的试剂盒，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由具有低核酸外切酶活性的聚合酶提供。
96.如权利要求84至94中任一项所述的试剂盒，其中所述超嗜热菌聚合酶活性由不具有核酸外切酶活性的聚合酶提供。
97.如权利要求84至96中任一项所述的试剂盒，其中部分(a)(ii)进一步包含至少一种提供逆转录酶活性的组分。
98.如权利要求84至96中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分进一步提供逆转录酶活性。
99.如权利要求84至98中任一项所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含8至16个碱基。
100.如权利要求84至99中任一项所述的试剂盒，其中所述实时检测活性由分子信标提供。
101.如权利要求84至100中任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于实施用于确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的方法的说明书，所述方法包括：
a)扩增所述样品核酸中的靶序列，其中：
所述靶序列包含第一链和第二链，
所述第一链和第二链彼此互补，
并且所述扩增包括在无解旋酶的等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触：
i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包含与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸，并且所述第二寡核苷酸包含与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸；和
ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物，其中所述核酸扩增产物包含1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列，和
所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；和
b)检测所述核酸扩增产物，其中检测所述核酸扩增产物包括使用实时检测方法，并且在所述样品核酸与(a)(i)和(a)(ii)接触后10分钟或更短时间内进行，从而确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量。
102.如权利要求101所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸基本上由与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸基本上由与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成；和/或所述核酸扩增产物基本上由以下序列组成：1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列。
103.如权利要求101所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸由与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成；和/或所述核酸扩增产物由以下序列组成：1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列。
104.如权利要求84至100中任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于实施用于确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量的方法的说明书，所述方法包括：
a)扩增所述样品核酸中的靶序列，其中：
所述靶序列包含第一链和第二链，
所述第一链和第二链彼此互补，
并且所述扩增包括在无解旋酶的等温扩增条件下使非变性样品核酸与以下物质接触：
i)第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸由与所述第一链中的序列连续互补的第一多核苷酸组成，并且所述第二寡核苷酸由与所述第二链中的序列连续互补的第二多核苷酸组成；和
ii)至少一种提供超嗜热菌聚合酶活性的组分，从而产生核酸扩增产物，其中所述核酸扩增产物由以下序列组成：1)与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸连续互补或基本上相同的第一核苷酸序列，2)与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸连续互补或基本上相同的第二核苷酸序列，和3)包含1至10个碱基的间隔子序列，和
所述间隔子序列的侧翼是所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；和
b)检测所述核酸扩增产物，其中检测所述核酸扩增产物包括使用实时检测方法，并且在所述样品核酸与(a)(i)和(a)(ii)接触后10分钟或更短时间内进行，从而确定样品核酸中靶序列的存在、不存在或量。
105.如权利要求101至104中任一项所述的试剂盒，其中所述方法不包括在扩增之前或期间使所述样品核酸变性。
106.如权利要求101至105中任一项所述的试剂盒，其中所述样品核酸在扩增之前、期间或之后不与核酸内切酶接触。
107.如权利要求101至106中任一项所述的试剂盒，其中所述样品核酸在扩增之前未经修饰。
108.如权利要求107所述的试剂盒，其中未经修饰的样品核酸来自破碎细胞。
109.如权利要求101至108中任一项所述的试剂盒，其中所述样品核酸包含DNA。
110.如权利要求109所述的试剂盒，其中所述样品核酸包含基因组DNA。
111.如权利要求101至108中任一项所述的试剂盒，其中所述样品核酸包含RNA。
112.如权利要求111所述的试剂盒，其中所述样品核酸包含病毒RNA。
113.如权利要求111所述的试剂盒，其中所述样品核酸包含细菌RNA。
114.如权利要求101至113中任一项所述的试剂盒，其中所述样品核酸包含单链核酸。
115.如权利要求101至113中任一项所述的试剂盒，其中所述样品核酸包含双链核酸。
116.如权利要求101至115中任一项所述的试剂盒，其中样品核酸在扩增之前从受试者获得。
117.如权利要求101至116中任一项所述的试剂盒，其中扩增未经纯化的样品核酸。
118.如权利要求101至116中任一项所述的试剂盒，其中扩增经纯化的样品核酸。
119.如权利要求101至118中任一项所述的试剂盒，其中所述方法进一步包括在扩增之前纯化样品核酸。
120.如权利要求101至119中任一项所述的试剂盒，其中所述扩增在约55摄氏度至约75摄氏度的恒定温度下进行。
121.如权利要求101至119中任一项所述的试剂盒，其中所述扩增在约55摄氏度至约65摄氏度的恒定温度下进行。
122.如权利要求101至119中任一项所述的试剂盒，其中所述扩增在约65摄氏度的恒定温度下进行。
123.如权利要求101至119中任一项所述的试剂盒，其中所述扩增在约60摄氏度的恒定温度下进行。
124.如权利要求101至123中任一项所述的试剂盒，其中所述核酸扩增产物为约20至40个碱基长。
125.如权利要求101至124中任一项所述的试剂盒，其中所述间隔子序列包含1至5个碱基。
126.如权利要求101至125中任一项所述的试剂盒，其中所述间隔子序列不与所述第一寡核苷酸的所述第一多核苷酸互补或相同，并且不与所述第二寡核苷酸的所述第二多核苷酸互补或相同。
127.如权利要求101至126中任一项所述的试剂盒，其中所述间隔子序列与所述样品核酸中的靶序列的一部分连续互补或基本上相同。
128.如权利要求101至127中任一项所述的试剂盒，其中检测所述核酸扩增产物包括检测荧光信号。
129.如权利要求128所述的试剂盒，其中所述荧光信号来自分子信标。
130.如权利要求101至129中任一项所述的试剂盒，其中所述方法进一步包括使所述核酸扩增产物与信号生成寡核苷酸接触，所述信号生成寡核苷酸包含i)与所述扩增产物中的序列互补的多核苷酸，和ii)荧光团和猝灭剂。
131.如权利要求101至130中任一项所述的试剂盒，其中所述方法在单一反应体积中进行。
132.如权利要求101至131中任一项所述的试剂盒，其中所述方法在单一反应容器中进行。
133.如权利要求101至132中任一项所述的试剂盒，其中所述方法包括多重扩增。
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