CN110234696B - 乳液组合物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了乳液组合物。本文还提供了含有一种或多种乳液组合物或用于制备这种乳液组合物的组分的试剂盒。本文还提供了使用这种乳液组合物的方法,例如用于乳液液滴中的靶核酸的扩增。
Description
相关专利申请的交叉参考
本申请要求2017年1月30日提交的美国临时专利申请号62/452,330的优先权,其通过引用纳入本文用于所有目的。
背景技术
微流体工艺通常使用乳液,其包含分散液相的液滴(本文称为“乳液液滴”),该液滴被非混溶的连续液相包围。乳液液滴可用作化学或生物反应的反应容器,用作储存器,和/或用作分离和划分分子,例如化学或生物元件的方法。乳液液滴的群(本文中“群”或“库”互换使用)可由许多不同尺寸的液滴(多分散群)或相对尺寸相同的液滴(单分散群)组成。利用乳液表面上包括聚合物、两亲化合物、表面活性剂等的适当化学物质,可以使液滴“稳定”,这表示当彼此接触时其基本不会混合和合并。这种稳定性可用于制造由不同化学或生物组分组成的群或库,其可储存在大约相同体积的空间中而不会与同一液滴和其他液滴的组分之间发生混合或污染。稳定的乳液液滴的特性可用于进行化学和生物反应、储存和划分的许多应用。
稳定乳液液滴的一种方法是在乳液中包含可交联剂(例如可交联蛋白质)。在液滴产生后,可以处理可交联剂以引发交联,从而在液滴界面处形成固体“外皮”。参见,例如,U.S.2007/0027394和U.S.2007/0217712。然而,这些可交联剂可增加微流体液滴处理装置中表面结垢或堵塞的倾向,并且可抑制液滴合并和/或注射技术。
发明概述
本文描述了稳定的油包水乳液液滴组合物,以及用于形成和使用稳定乳液液滴的方法和组合物,包括但不限于用于分析生物分析物的微流体方法。稳定的油包水乳液液滴组合物通常包括含有环糊精和聚合物的水相,其中水相中至少一部分环糊精和聚合物形成主体-客体复合物。不希望受理论束缚,据信在一些实施方案中,稳定化是由于热可逆水凝胶的主体-客体复合物的形成。热可逆水凝胶在高温下可以是凝胶(gel)相并且在低温下可以是溶液(sol)相。例如,水凝胶可以在PCR退火温度如50℃,PCR延伸温度如72℃,PCR变性温度如95℃,或其中两种或更多种的组合条件下是凝胶。另外或可替代地,水凝胶可以在例如室温或更低温度下是溶液。在一些实施方案中,在油包水的水相中形成的至少一部分主体-客体复合物形成轮烷、准轮烷、聚轮烷或聚准轮烷(polypseudorotaxane)。
一方面,本发明提供一种乳液,其包含油包水乳液液滴,所述液滴包含:水;多个环糊精分子;和多个聚合物分子,其中所述多个聚合物分子中的单个聚合物分子包含疏水部分和/或亲水部分,其中所述液滴的水相包含热可逆水凝胶,并且其中所述液滴存在于连续油相中。在一些情况下,热可逆水凝胶在高于凝胶-溶液转变温度下是水凝胶并且在低于凝胶-溶液转变温度下是液体。在一些实施方案中,热可逆水凝胶在至少约60℃或70℃且不高于约98℃的温度下呈凝胶形式,并且在低于约50℃或30℃并且高于约0℃的温度下为溶液形式。
一方面,本发明提供一种乳液,其包含油包水乳液液滴,所述液滴包含:水;多个环糊精分子;和多个聚合物分子,其中多个聚合物分子中的单个聚合物分子包含疏水部分和/或亲水部分,其中至少一部分环糊精分子和聚合物分子形成多个聚准轮烷复合物,并且其中所述液滴存在于连续的油相中。
一方面,本发明提供一种乳液,其包含油包水乳液液滴,所述液滴包含:水;多个环糊精分子;和多个两亲聚合物分子,其中多个两亲聚合物分子中的单个两亲聚合物分子包含疏水部分和亲水部分,其中至少一部分环糊精分子和两亲聚合物分子形成多个聚准轮烷复合物,并且其中所述液滴存在于连续的油相中。
在一些实施方案中,所述多个环糊精分子中的单个环糊精分子独立地选自:α-环糊精和β-环糊精。在一些实施方案中,所述多个环糊精分子中的单个环糊精分子独立地选自:α-环糊精和γ-环糊精。在一些实施方案中,所述多个环糊精分子中的单个环糊精分子独立地选自:β-环糊精和γ-环糊精。在一些实施方案中,所述多个环糊精分子中的单个环糊精分子的至少一部分独立地包含疏水改性。
在一些实施方案中,所述多个环糊精分子中的单个环糊精分子独立地是式I的化合物:
其中:每个R1独立地选自:疏水基团,亚硫酸根和H,其中疏水基团选自烷基、烯基、炔基、卤代烷基、环烷基、芳基及其任何组合,亚硫酸根是(C1-C6-烷基或亚烷基)-SO3 -基团;n是6、7或8。
在一些实施方案中,乳液包含至少两种结构不同的环糊精分子的混合物。在一些实施方案中,所述至少两种结构不同的环糊精分子独立地为式I的化合物,其中n为6。在一些实施方案中,所述至少两种结构不同的环糊精分子独立地为式I的化合物,其中n为7。在一些实施方案中,所述至少两种结构不同的环糊精分子独立地为式I的化合物,其中n为8。
在一些实施方案中,每个R1独立地为H或羟烷基,其中至少一个R1为羟烷基。在一些实施方案中,每个R1独立地为H或C2-C6羟烷基,其中至少一个R1为C2-C6羟烷基。在一些实施方案中,每个R1独立地是H或C2-C6羟烷基,其中至少一个R1是2-羟丙基。在一些实施方式中,R1是2-羟丙基。在一些实施方案中,环糊精分子是2-羟丙基α-环糊精。
在一些实施方案中,两亲聚合物分子包含嵌段共聚物,其中嵌段共聚物包含亲水嵌段和疏水嵌段。在一些实施方案中,嵌段共聚物是二嵌段共聚物或三嵌段共聚物,或其组合。在一些实施方案中,嵌段共聚物是包含聚乙二醇(PEG)亲水嵌段和疏水嵌段的二嵌段共聚物。
在一些实施方案中,嵌段共聚物是二嵌段共聚物,其包含亲水嵌段和包含聚丙二醇的疏水嵌段。在一些实施方案中,嵌段共聚物是二嵌段共聚物,其包含亲水嵌段和包含胆固醇或其衍生物的疏水嵌段。在一些实施方案中,嵌段共聚物是三嵌段共聚物。在一些实施方案中,三嵌段共聚物是泊洛沙姆。在一些实施方案中,泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
在一些实施方案中,两亲聚合物分子是非离子两亲聚合物分子。在一些实施方案中,两亲聚合物分子是线性两亲聚合物分子。在一些实施方案中,两亲聚合物分子的重均分子量为约2,000g/mol至约70,000g/mol。
在一些实施方案中,液滴包含质量比为约1:4至约4:1的环糊精分子与两亲聚合物分子。在一些实施方案中,液滴包含质量比为约1:1的环糊精分子与两亲聚合物分子。在一些实施方案中,液滴包含浓度为约0.5%至约4%质量/体积(m/v)的环糊精分子。在一些实施方案中,环糊精分子的浓度为约2%m/v。在一些实施方案中,液滴包含浓度为约0.5%至约4%质量/体积(m/v)的两亲聚合物分子。在一些实施方案中,环糊精分子的浓度为约2%m/v。在一些实施方案中,环糊精分子的浓度为约2%,两亲性聚合物分子的浓度为约2%。
在一些实施方案中,液滴还包含热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。在一些实施方案中,液滴还包含核酸。在一些实施方案中,液滴还包含热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。在一些实施方案中,液滴还包含:核酸;和热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶,其中DNA聚合酶与核酸是异源的。
在一些实施方案中,液滴包含三磷酸核苷酸(NTP),三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)或其组合。在一些实施方案中,液滴包含热可逆水凝胶。在一些实施方案中,热可逆水凝胶在约70℃至约98℃的温度下为凝胶形式,并且在低于约50℃且高于约0℃的温度下为溶液形式。在一些实施方案中,热可逆水凝胶在约60℃至约98℃的温度下为凝胶形式,并且在低于约30℃且高于约0℃的温度下为溶液形式。
在一些实施方案中,液滴存在于连续的氟碳油相中。在一些实施方案中,连续氟碳油相包含含氟油和表面活性剂。在一些实施方案中,表面活性剂是含氟表面活性剂。在一些实施方案中,含氟表面活性剂是嵌段共聚物,其包含全氟化聚醚嵌段和聚乙二醇嵌段。在一些实施方案中,含氟表面活性剂包含聚(全氟环氧丙烷)聚醚胺(jeffamine)三嵌段共聚物,聚(全氟环氧丙烷)酰胺三嵌段共聚物,聚(全氟环氧丙烷)PEG二嵌段共聚物,或聚(全氟环氧丙烷)PEG三嵌段共聚物。
在一些实施方案中,含氟油包含甲基九氟丁基醚(HFE-7100)、乙基九氟丁基醚(HFE-7100)、乙基九氟丁基醚(HFE-7200)、2-三氟甲基-3-乙氧基十二-氟己烷(HFE-7500)、1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-十氟-3-甲氧基-4-三氟甲基-戊烷(HFE-7300)、全氟辛基溴化物、全氟萘烷、FC-40、FC-43、FC-70、FC-84、FC-72、RM-82、FC-75、RM-101、或它们的组合。在一些实施方案中,含氟油是HFE-7500。在一些实施方案中,液滴存在于连续的硅油相中。在一些实施方案中,连续硅油相包含硅油和表面活性剂。
在一些实施方案中,在约95℃的温度下将液滴温育至少约1小时后,液滴与环烯烃聚合物表面形成至少约90°的接触角。在一些实施方案中,在约95℃的温度下将液滴温育至少约1小时后,液滴与环烯烃聚合物表面形成至少约115°的接触角。在一些实施方案中,乳液包含至少100或至少1,000个油包水乳液液滴。
另一方面,本发明提供形成前述方面或实施方案中任一项的乳液的方法,该方法包括:在至少一部分环糊精分子和两亲聚合物分子形成多个聚准轮烷复合物的条件下组合连续油相、水溶液、多个环糊精分子和多个两亲聚合物分子,从而形成包含油包水乳液液滴的乳液。在一些实施方案中,水溶液是缓冲水溶液。
另一方面,本发明提供一种使用包含油包水乳液液滴的乳液的方法,该方法包括:提供根据前述乳液方面或实施方案中任一项的乳液;将液滴加热至约50℃至约100℃的温度;将液滴冷却至低于约50℃的温度;并且任选地重复加热和冷却1-50次。在一些实施方案中,在冷却或任选地重复加热和冷却之后,该方法还包括将至少一部分液滴内部注入第二液滴中。在一些实施方案中,液滴包含靶核酸或其扩增子或逆转录产物。在一些实施方案中,第二液滴包含用于检测靶核酸或其扩增子或逆转录产物的存在或不存在的检测试剂。
在一些实施方案中,在冷却或任选地重复加热和冷却之后,该方法还包括将至少一部分液滴内部注入多个第二液滴中。在一些实施方案中,液滴包含靶核酸或其扩增子或逆转录产物。在一些实施方案中,所述多个第二液滴包含用于检测靶核酸或其扩增子或逆转录产物的存在或不存在的检测试剂。在一些实施方案中,检测试剂在用第一液滴的一部分注射的不同第二液滴中是不同的,其中不同的检测试剂检测不同靶核酸或其不同扩增子或逆转录产物的存在或不存在。
在一些实施方案中,乳液包含至少100或至少1,000个油包水乳液液滴,并且该方法包括:提供包含至少100或至少1,000个油包水乳液液滴的乳液;将液滴加热至约50℃至约100℃的温度;将液滴冷却至低于约50℃的温度;并且任选地重复加热和冷却1-50次。在一些实施方案中,在冷却或任选地重复加热和冷却之后,该方法还包括将至少一部分液滴内部注入多个第二液滴中。
附图说明
图1说明了环糊精和聚合物之间的示例性主体-客体复合物,可用于稳定本文所述的油包水乳液液滴。
图2显示了用不同混合比的Pluronic F-68和α-环糊精所形成的超分子水凝胶的液滴稳定能力和PCR相容性。
图3显示了Bio-Rad MonoRAyL热点测序系统中超分子水凝胶的液滴稳定能力。
图4显示了环糊精结构对超分子水凝胶样品浊度的影响。
图5A-C显示了测试本文所述的油包水乳液液滴化学品的结果,其具有所示的各种主体(环糊精)和客体(聚合物)浓度和不同油组合物。
图6显示了由超分子水凝胶制备的PCR主混合物与COP表面的低粘附性。
发明详述
I.导言
发明人发现了提供稳定的油包水乳液液滴的组合物。这些稳定的油包水乳液包含液滴,其中水相含有环糊精和能够与环糊精形成主体-客体复合物的聚合物。液滴中的环糊精和聚合物可在水相、水-油界面或两者中形成热可逆水凝胶。热可逆水凝胶的溶液-凝胶转变温度可通过改变环糊精、环糊精浓度、聚合物、聚合物浓度或其组合来调节。在一些情况下,水相中环糊精和聚合物提供的稳定性通过相容的油相组合物进一步增强。
II.组合物
本文提供的组合物包含环糊精和聚合物的水性混合物。在一些实施方案中,水性混合物提供热可逆水凝胶。在一些实施方案中,组合物包含油包水(W/O)乳液液滴,所述液滴包含水性混合物(例如,包含形成热可逆水凝胶的水性混合物)。在一些情况下,热可逆水凝胶在约30℃至约99℃或更高的温度下呈凝胶形式。在一些情况下,热可逆水凝胶在约40℃至约99℃、约40℃至约95℃或98℃、约45℃至约99℃、约45℃至约95℃或98℃、约50℃至约99℃、约50℃至约95℃或98℃、约60℃至约99℃、约60℃至约95℃或98℃、约70℃至约99℃、约70℃至约98℃、或约70℃至约95℃的温度下呈凝胶形式。
在一些情况下,热可逆水凝胶在低于约70℃且高于约0℃或更低的温度下呈溶液形式。在一些情况下,热可逆水凝胶在约60℃至约4℃、约50℃至约4℃、约45℃至约4℃、约40℃至约4℃、约35℃至约4℃、约30℃至约4℃、约25℃至约4℃、约25℃至约10℃、约25℃至约15℃、或约35℃、约30℃、约25℃、或约20℃呈溶液形式。
如上所述,水性混合物(例如,形成热可逆水凝胶的水性混合物)可包含环糊精和能够与环糊精形成主体-客体复合物的聚合物。在一些实施方案中,环糊精和聚合物的环糊精:聚合物质量比为约0.1:1至约10:1,约0.2:1至约5:1,约1:4至约4:1,约0.3:1至约3:1,约0.5:1至约2:1,或约1:1。在一些实施方案中,环糊精和聚合物的环糊精:聚合物摩尔比为约100:1至约1:1,约50:1至约2:1,约25:1至约3:1,约15:1至约4:1,约10:1至约5:1,或约7:1。在一些实施方案中,环糊精和聚合物的环糊精:聚合物摩尔比为约50:1至约1:1,约40:1至约2:1,约30:1至约3:1,或者从大约20:1到大约4:1。在一些实施方案中,环糊精和聚合物的环糊精:聚合物摩尔比为约5:1,6:1,7:1,8:1,9:1或10:1。
在一些实施方案中,水性混合物(例如,W/O乳液液滴的水相)中环糊精的浓度为约0.1%至约10%质量/体积(m/v),约0.2%至约8%m/v,约0.3%至约5%m/v,约0.5%至约4%m/v,约1%至约3%m/v,或约2%m/v。在一些情况下,水性混合物(例如,W/O乳液液滴的水相)中环糊精的浓度为约0.5%,1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%或10%m/v。在某些情况下,水性混合物(例如W/O乳液液滴的水相)含有浓度为2%m/v的环糊精。
在一些实施方案中,水性混合物(例如,W/O乳液液滴的水相)中聚合物(例如,两亲聚合物,共聚物,两亲共聚物,或均聚物,如下文进一步描述)的浓度为约0.1%至约10%质量/体积(m/v),约0.2%至约8%m/v,约0.3%至约5%m/v,约0.5%至约4%m/v,约1%至约3%m/v,或约2%m/v。在一些情况下,水性混合物(例如,W/O乳液液滴的水相)中聚合物的浓度为约0.5%,1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%或10%m/v。在某些情况下,水性混合物含有浓度为2%m/v的聚合物。
如本文所述的液滴可以在油包水乳液(W/O)中形成。通过选择环糊精和聚合物组分的适当参数,可以优化W/O乳液液滴或W/O乳液液滴的水相以减少或消除微流体表面污垢。在一些实施方案中,选择W/O乳液液滴的水相以通过降低或最小化微流体表面的水滴接触角的热诱导变化来减少或消除表面结垢。
在一个示例性实施方案中,提供疏水性环烯烃聚合物(COP)表面,在表面上放置体积为约1μL的纯水滴。可以预期,通过测角仪测定,清洁且无污染的疏水性COP表面具有约、至少或至少约90°,95°,100°,110°或115°的接触角。接触角通常在室温或接近室温下确定。已经确定COP表面是疏水的和未污染的,可以从COP表面除去水,然后在各种条件下与测试组合物接触以确定该组合物是否耐COP表面污垢。
例如,然后可以使COP表面与W/O乳液液滴组合物的一种或多种或所有组分接触。在一些情况下,在合适的温度下(例如,至少37℃,40℃,50℃,65℃,75℃和/或不超过100℃),例如,如本文所述的W/O乳液液滴的水相与COP表面接触合适的时间段(例如,10分钟,30分钟,1小时,3小时或更长时间,或10-30分钟,或10-45分钟)。通常,选择温度以接近聚合酶链反应(PCR)变性温度(例如,90℃,95℃或98℃)。在针对乳液液滴组合物组分进行测试之后,可以清洁和干燥COP表面,并如上所述针对1μL纯水滴进行测试,以确定是否已经发生表面污垢。如上所述,接触角通常在室温或接近室温下确定。此外,初始水滴和最终水滴的条件(例如,温度,湿度,压力等)通常选择为相同或基本相同。与初始纯水滴相比,接触角的变化(例如,降低)为约、小于或小于约15%,10%,5%或1%,表明没有表面污垢。通常,变化越小,表面污垢程度越低。相反,大于15%,20%,25%,30%,35%,40%或45%的变化可表明表面结垢。通常,变化越大,表面污垢的程度越高。
另外或替代地,当清洁COP表面的性质被充分表征时,在测试乳液组合物/组分之前用纯水滴的初始对照测试是不必要的。因此,如上所述在与水相接触后,水滴接触角为、至少、或至少约90°,95°,100°,110°或115°,可表明没有表面污垢。相反,小于约90°,80°,70°,60°或50°的水滴接触角可指示表面结垢。通常,接触角越小,表面污垢越大。
在一些实施方式中,W/O乳液液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如,在一些实施方式中,这些液滴在平均直径方面基本均匀。例如,在一些实施方式中,群体中至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的液滴在群体的平均液体尺寸(直径)的正负5%内。在一些实施方式中,液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中,液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米,或小于约25微米。在一些实施方式中,液滴在形状和/或大小方面基本均匀。
在一些实施方式中,生成的液滴在体积上基本均匀。例如,液滴体积的标准偏差可以低于约1皮升、5皮升、10皮升、100皮升、1nL或低于约10nL。在一些情况中,液滴体积的标准偏差可低于平均液滴体积的约10-25%。在一些实施方式中,液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL、约50nL或约100nL。
在一些实施方式中,W/O乳液中液滴的数量为、或至少为约100;1,000;5,000;10,000;25,000;50,000;100,000;1x106;或1x107。在一些实施方式中,液滴的数量为约100至约1x107、约1,000至约1x107、约1,000至约1x106、约10,000至约1x107、约10,000至约1x106、约10,000至约1x105、约20,000至约1x106、或约20,000至约1x105。
液滴可含有一种或多种生物分析物。生物分析物可包括但不限于:细胞(例如,单细胞生物或来自多细胞生物的细胞),病毒,蛋白质,核酸(例如RNA或DNA,或其组合)等。
液滴可含有用于检测生物分析物的试剂,包括但不限于:蛋白质,例如荧光蛋白和/或抗体,或酶,例如聚合酶、过氧化物酶、荧光素酶和/或磷酸酶。在一些情况下,液滴含有一种或多种用于核酸检测和/或扩增的试剂(例如,热稳定DNA或RNA依赖性DNA聚合酶,或其组合,dNTP,缓冲液,盐,二价阳离子,荧光染料,荧光染料-标记的核酸等)。在一些情况下,本文所述的多个液滴含有多种不同的荧光染料、或荧光染料浓度、或其组合。使用不同的荧光染料和/或荧光染料浓度可以提供高度多重分析。
A.环糊精
本文所述的油包水(W/O)乳液液滴可含有环糊精(例如,环糊精分子的单一化学物质,尽管是许多拷贝)或不同环糊精的混合物。环糊精是一类天然存在的环状低聚糖,含有六个(α-环糊精),七个(β-环糊精)或八个(γ-环糊精)D-吡喃葡萄糖单元。本文描述了用于提供稳定的W/O乳液液滴的各种合适的环糊精组合物。此外,应理解,在一些情况下,可以取代不同的环糊精组合物或其混合物以进一步优化W/O乳液液滴稳定性。
如上所述,本文所述的W/O乳液液滴可含有不同环糊精的混合物。W/O乳液液滴的水相中的不同环糊精的混合物可以是无规改性的环糊精(例如,无规甲基化,无规甲基丙烯酸化、或无规羟丙基化)的形式,或无规改性的环糊精的混合物。或者,不同环糊精的混合物可以是经化学确定改性的(即,非无规改性的)或未改性的环糊精的混合物的形式,或经化学确定改性的和未改性的环糊精的混合物的形式。作为另一种选择,不同环糊精的混合物可以是一种或多种无规改性的环糊精与一种或多种经化学确定改性或未改性的环糊精的混合物形式。如本文所用,除非另有说明,否则提及经改性的环糊精或特定种类的经改性的环糊精(例如,羟丙基β-环糊精)是指完全改性的环糊精。
在一些实施方案中,W/O液滴含有两种或更多种不同的环糊精。在某些情况下,W/O液滴含有、或含有至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30种不同的环糊精。在一些情况下,W/O液滴含有1至2、1至5、1至10、1至20、1至30、2至5、2至10、2至20,2至30、5至10、5至20、5至30、10至20或10至30种不同的环糊精。
环糊精或其混合物可以是或含有经改性的(例如,无规或非无规改性的)或未经改性的α-环糊精,β-环糊精或γ-环糊精,或其混合物。环糊精或其混合物可以是或含有经改性的(例如,无规或非无规改性的)或未经改性的α-环糊精,β-环糊精,或经改性的(例如,无规或非无规改性的)或未经改性的α-环糊精和β-环糊精的混合物。环糊精或其混合物可以是或含有经改性的(例如,无规或非无规改性的)或未经改性的α-环糊精,γ-环糊精,或经改性的(例如,无规或非无规改性的)或未经改性的α-环糊精和γ-环糊精的混合物。环糊精或其混合物可以是或含有经改性的(例如,无规或非无规改性的)或未经改性的β-环糊精,γ-环糊精,或经改性的(例如,无规或非无规改性的)或未经改性的β-环糊精和γ-环糊精的混合物。
改性的环糊精包括含有一个或多个疏水改性的环糊精。这种疏水改性包括但不限于:甲基,乙基,丙基,异丙基,羟丙基,丁基,C1-C6或C2-C6烷基或亚烷基,C1-C6或C2-C6羟烷基,C1-C6或C2-C6羟烷基丙烯酸酯,或C1-C6或C2-C6羟烷基甲基丙烯酸酯。另外或替代地,经改性的环糊精可含有一种或多种亲水改性,例如C1-C6-烷基或亚烷基或C2-C6烷基或亚烷基-SO3 -。
在一些实施方案中,环糊精或环糊精的混合物是式I的化合物或式I的化合物的混合物:
其中:每个R1独立地选自:疏水基团,亚硫酸根和H;并且n为6,7或8。在一些情况下,疏水基团选自:烷基(例如C1-C6或C2-C6烷基)、烯基(例如C1-C6或C2-C6烯基)、炔基(例如C1-C6或C2-C6炔基)、卤代烷基(例如C1-C6或C2-C6卤代烷基)、环烷基(例如,C1-C6或C2-C6环烷基)、芳基(例如C6芳基)以及它们的任意组合。在一些情况下,疏水基团选自:羟烷基(例如C1-C6或C2-C6烷基)、烷基(例如C1-C6或C2-C6烷基)、烯基(例如C1-C6或C2-C6烯基)、炔基(例如C1-C6或C2-C6炔基)、卤代烷基(例如C1-C6或C2-C6卤代烷基)、环烷基(例如C1-C6或C2-C6环烷基)、芳基(例如C6芳基)以及它们的任意组合。在一些情况下,亚硫酸根是(C1-C6-烷基或亚烷基)-SO3 -基团或(C2-C6-烷基或亚烷基)-SO3 -基团。
在一些情况下,乳液(例如,乳液的水相)含有式I的环糊精化合物或含有式I的环糊精化合物的混合物,其中n为6。在一些情况下,乳液(例如,乳液的水相)含有式I的环糊精化合物或含有式I的环糊精化合物的混合物,其中n为7。在一些情况下,乳液(例如,乳液的水相)含有式I的环糊精化合物或含有式I的环糊精化合物的混合物,其中n为8。
在一些情况下,乳液包含式I的至少两种结构不同的环糊精分子(例如,2至5、2至20或2至30种)的混合物,其中n为6。在一些情况下,乳液包含式I的至少两种结构不同的环糊精分子(例如,2至5、2至20或2至30种)的混合物,其中n为7。在一些情况下,乳液包含式I的至少两种结构不同的环糊精分子(例如,2至5、2至20或2至30种)的混合物,其中n为8。
在一些情况下,每个R1独立地为H或羟烷基,其中至少一个R1为羟烷基。在一些情况下,每个R1独立地为H或C2-C6羟烷基,其中至少一个R1为C2-C6羟烷基。在一些情况下,每个R1独立地是H或C2-C6羟烷基,其中至少一个R1是2-羟丙基。在一些情况下,至少两个R1是2-烷丙基。在一些情况下,至少三个,至少四个或至少五个R1是2-羟丙基。在某些情况下,n为7或8,并且至少6个R1为2-羟丙基。在某些情况下,n为8,并且至少7个R1为2-羟丙基。在一些情况下,每个R1是2-羟丙基。
在一些情况下,W/O乳液液滴中的环糊精组分是或包含2-羟丙基α-环糊精。在一些情况下,W/O乳液液滴中的环糊精组分是或包含2-羟丙基β-环糊精。在一些情况下,W/O乳液液滴中的环糊精组分是或包含2-羟丙基γ-环糊精。
另外的环糊精包括但不限于:U.S.2005/0025023;美国2009/0012042;WO 2015/042759;美国专利5,241,059;美国专利5,173,481中描述的那些以及它们的混合物。
B.聚合物
本文所述的油包水(W/O)乳液液滴还含有线性或支化、取代或未取代的聚合物或不同聚合物的混合物,其能够与液滴中的环糊精形成主体-客体复合物。在一些实施方案中,聚合物是线性聚合物。在一些情况下,聚合物是支化聚合物,例如树枝状大分子或星形聚合物。在一些情况下,聚合物的数均分子量或重均分子量为约2,000,约2,000至约70,000,或约7,000至约10,000。在一些情况下,聚合物的数均分子量或重均分子量为约10kDa至约40kDa,约15kDa至约40kDa,约10kDa至约70kDa,或约150kD至约260kDa。
在一些情况下,聚合物是疏水聚合物(例如,与平均分子量为8000的线性聚(乙二醇)(CAS 25322-68-3)相比是疏水的(例如,Sigma-Aldrich产品号P5413))。在一些情况下,聚合物是亲水聚合物,例如聚(乙二醇)(PEG)聚合物。在一些实施方案中,聚合物是线性或支化PEG聚合物。在一些情况下,聚合物是PEG聚合物,例如参见Macromolecules 1990,23,2821;Macromolecules 1993,26,5698;Carbohydr.Res.1998,305,127;或Advanced DrugDelivery Reviews 60(2008)1000–1017。
在一个示例性实施方案中,PEG聚合物是星形聚(乙二醇)(sPEG)。例如,PEG聚合物可以是如Langmuir 2003,19,9680-9683中所述的sPEG。作为另一个例子,PEG聚合物可以是具有3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,或24或更多臂的sPEG。作为另一个实例,PEG聚合物可以是具有4至24,10至24,4至20,10至20,4至15,或10至15个臂的sPEG。在一些情况下,sPEG的数均分子量或重均分子量为约2,000,约2,000至约70,000,或约7,000至约10,000。在一些情况下,sPEG的数均分子量或重均分子量为约10kDa至约40kDa,约15kDa至约40kDa,约10kDa至约70kDa,或约150kDa至约260kDa。可用于本发明的示例性sPEG聚合物包括但不限于可从NEKTAR获得的那些(参见可从www.sejinbio.co.kr/Catalogue/Nektar获得的3臂,4臂和8臂sPEG),和/或Macromolecules,2002,35(5),第1980–1983页;或Macromolecules,2008,41,1766-1773中描述的那些。
在某些情况下,聚合物是聚己内酯聚合物,例如Macromolecules,2000,33,4472-4477;或Macromolecules,2003,36,2742-2747中描述的聚己内酯。在某些情况下,聚合物是聚(丙二醇)聚合物,例如J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,1990,1322;或M.Macromolecules,1995,28,8406中描述的聚丙二醇。在一些情况下,聚合物是聚(甲基乙烯基醚)聚合物,例如Chem.Lett.1993,237;或Bull.Chem.Soc.Jpn.,1998,71,535中描述的聚(甲基乙烯基醚)聚合物。在某些情况下,聚合物是低聚乙烯聚合物,例如Bull.Chem.Soc.Jpn.1994,67,2808中描述的低聚乙烯聚合物。
在某些情况下,聚合物是聚异丁烯聚合物,例如Macromolecules,1993,26,5267;或Macromolecules,1996,29,5611中描述的聚异丁烯聚合物。在一些情况下,聚合物是聚乳酸聚合物,例如Macromolecules,2003,36,2742-2747中描述的聚乳酸聚合物。在一些情况下,聚合物是聚(羟基丁酸酯)聚合物,例如Macromolecules,2002,35(8),pp 3126–3132;Macromolecules,2002,35(9),pp 3778–3780;或Biomacromolecules,2003 11月-12月;4(6):1865-7中描述的聚(羟基丁酸酯)聚合物。在一些情况下,聚合物是聚(四氢呋喃)聚合物,例如Macromolecules,1999,32(21),pp 7202–7207;J.Phys.Chem.B,2003,107(1),pp14–19;或Polymer,第45卷,第6期,2004年3月,第1777–1785页中描述的聚(四氢呋喃)聚合物。在某些情况下,聚合物是胆固醇或其衍生物的聚合物,例如Biomacromolecules,2014Jun 9;15(6):2206-17;或Macromol.Chem.Phys.,2014 215:163–170中描述的那些。如本文所述,前述聚合物可以是均聚物或共嵌段聚合物。在一些情况下,前述聚合物的一种或多种单体组分适合作为嵌段共聚物的单体或聚合物嵌段,例如,如下文进一步描述。
在一些情况下,聚合物是具有疏水部分和亲水部分的两亲聚合物。两亲聚合物可以是非离子两亲聚合物(例如,非离子两亲共聚物)。在一些情况下,聚合物是嵌段共聚物(例如,二嵌段,三嵌段,四嵌段或五嵌段共聚物)。在一些情况下,两亲聚合物是嵌段共聚物(例如,二嵌段,三嵌段,四嵌段或五嵌段共聚物)。两亲嵌段共聚物通常具有至少一个亲水嵌段和至少一个疏水嵌段。示例性亲水嵌段包括但不限于:乙二醇,己内酯,乳酸等。示例性疏水嵌段包括:丙二醇,羟基丁酸酯,四氢呋喃,异丁烯,乙烯,甲基乙烯基醚,胆固醇,胆固醇衍生物等。
在一些情况下,共聚物的亲水和/或疏水嵌段是单体嵌段。含有两亲性嵌段共聚物的示例性单体是[乙二醇-丙二醇]n,其中n是整数(例如,2至10,000)。或者,共聚物的亲水和/或疏水嵌段是聚合物嵌段。含有两亲嵌段共聚物的示例性聚合物嵌段包括:[乙二醇]x-[丙二醇]y,其中x和y是整数,并且可以是相同或不同的(即聚乙二醇-聚丙二醇)。含有两亲性嵌段共聚物的另一种示例性聚合物嵌段是[乙二醇]x-[丙二醇]y-[乙二醇]z,其中x和y是整数,并且可以相同或不同(即聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇)。
在一些情况下,两亲性嵌段共聚物是三嵌段共聚物,例如泊洛沙姆。泊洛沙姆是(A-B-A)三嵌段共聚物,其含有聚氧丙烯核心嵌段(B)和两侧的聚氧乙烯嵌段(A)。泊洛沙姆通常由三位数编号系统表示。前两位数x 100给出聚氧丙烯核心的近似分子量,最后一位数x 10给出聚氧乙烯含量百分比。在一些实施方案中,泊洛沙姆是泊洛沙姆或泊洛沙姆的混合物,由通式描述:
HO(C2H4O)a’—[C3H6O]b—(C2H4O)a
其中a'和a可以相同或不同,各自为整数,使得由(C2H4O)表示的亲水部分占共聚物重量的约60%至90%,例如共聚物重量的70%至90%;并且b是整数,使得由(C3H6O)6表示的疏水物(即共聚物的聚氧丙烯部分)具有约950至4000道尔顿(Da)的分子量,例如约1,200至3,500Da,例如,1,200至2,300Da,1,500至2,100Da,1,400至2,000Da,或1,700至1,900Da。例如,亲水部分的分子量可以在5,000和15,000Da之间。具有上述通式的示例性泊洛沙姆包括:a或a'是5-150的整数并且b是15-75的整数的泊洛沙姆,例如a是70-105的整数并且b是15-75的整数的泊洛沙姆。示例性泊洛沙姆包括但不限于:泊洛沙姆188,泊洛沙姆184,泊洛沙姆182,泊洛沙姆181,泊洛沙姆124,泊洛沙姆407,泊洛沙姆331和泊洛沙姆338。
在一些实施方案中,环糊精:聚合物主体-客体复合物的聚合物组分是两种或更多种前述聚合物或其混合物的混合物。
可以选择环糊精和/或聚合物以形成轮烷。如本文所用,术语“轮烷”是指环糊精和聚合物复合物中聚合物螺旋穿过环糊精的中心核并且通过在螺旋环糊精分子两侧的聚合物末端处的庞大头基的存在而阻碍动力学解离。可以选择环糊精和/或聚合物以形成准轮烷。如本文所用,术语“准轮烷”是指环糊精和聚合物复合物中聚合物螺旋穿过环糊精的中心核并且由于螺旋环糊精分子两侧的聚合物末端处不存在庞大头基而相对动力学自由地解离。可以通过环糊精和聚合物之间的疏水非共价相互作用来稳定准轮烷复合物。此外,由于没有稳定的庞大头基,准轮烷复合物可以比轮烷复合物更加温度敏感。在一些情况下,可利用疏水效应或其他非共价相互作用的温度依赖性形成准轮烷复合物,其在相对高的温度下形成准轮烷复合物而相对低的温度下发生解离。在一些实施方案中,该效果可提供热可逆水凝胶,其在低温下具有溶液形式而在高温下具有凝胶形式,如本文所述。
可以选择环糊精和/或聚合物以形成聚轮烷。如本文所用,术语“聚轮烷”是指环糊精和聚合物复合物中聚合物分子螺旋穿过多个环糊精分子的中心核并且通过聚合物末端处庞大头基的存在而阻碍动力学解离。可以选择环糊精和/或聚合物以形成聚准轮烷。如本文所用,术语“准轮烷”是指环糊精和聚合物复合物中聚合物螺旋穿过多个环糊精分子的中心核并且由于螺旋环糊精分子两侧的聚合物末端处不存在庞大头基而相对动力学自由地解离。可以通过环糊精和聚合物之间的疏水非共价相互作用来稳定聚准轮烷复合物。此外,由于没有稳定的庞大头基,聚准轮烷复合物可以比聚轮烷复合物更加温度敏感。在一些情况下,可利用疏水效应或其他非共价相互作用的温度依赖性形成聚准轮烷复合物,其在相对高的温度下形成聚准轮烷复合物而相对低的温度下发生解离。在一些实施方案中,该效果可提供热可逆水凝胶,其在低温下具有溶液形式而在高温下具有凝胶形式,如本文所述。
C.油相
W/O乳液液滴存在于连续油相中。通常,连续油相含有含氟油、硅油或其组合。适合用作连续油相或连续油相的含氟油的非限制性实例包括:甲基九氟丁基醚(HFE-7100),乙基九氟丁基醚(HFE-7200),2-三氟甲基-3-乙氧基十二-氟己烷(HFE-7500),1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-十氟-3-甲氧基-4-三氟甲基-戊烷(HFE-7300),全氟辛基溴化物,全氟萘烷,FC-40,FC-43,FC-70,FC-770,FC-84,FC-72,RM-82,FC-75,RM-101或其组合。
连续油相还可含有表面活性剂,例如含氟表面活性剂。在一些情况下,含氟表面活性剂是全氟化的或是含有全氟化嵌段的嵌段共聚物。适用于连续油相的示例性含氟表面活性剂包括但不限于:Krytox含氟表面活性剂,例如Krytox FSH(Krytox FSH 157),美国专利9,012,390中描述的含氟表面活性剂,及其混合物。连续油相中的表面活性剂的浓度可为约0.01%至约5%,约0.1%至约4%,约0.5%至约3%,约1%至约3%,或约2%(w/w)。在一些实施方案中,油相包含离子含氟表面活性剂。。在一些实施方案中,离子含氟表面活性剂是Amryium Krytox(Krytox-AS),Krytox FSH的铵盐,或Krytox FSH的吗啉代衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0%(w/w)。在一些实施方式中,Krytox-AS的浓度是约1.8%。在一些实施方式中,Krytox-AS的浓度是约1.62%。Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度可以是约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0%(w/w)。在一些实施方式中,Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.8%。在一些实施方式中,Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.62%。
在一些实施方式中,该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘度或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸醇。在一些实施方式中,1H,1H,2H,2H-全氟癸醇添加至约0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.25%、1.50%、1.75%、2.0%、2.25%、2.5%、2.75%或3.0%(w/w)的浓度。在一些实施方式中,1H,1H,2H,2H-全氟癸醇添加至约0.18%(w/w)的浓度。
III.方法
本文描述了制备一种或多种前述W/O乳液液滴组合物的方法。通常,该方法包括将三种或更多种水相组分(例如,水、环糊精和聚合物)组合以形成水性反应混合物,然后将水性反应混合物与一种或多种油相组分(例如,含氟油和/或硅油和任选的含氟表面活性剂)组合以形成乳液预混物。可以使用本领域已知的方法乳化预混物以形成多个W/O乳液液滴。例如,可以对乳液预混物进行超声处理,涡旋,共混或其组合以形成W/O乳液液滴。或者,可以使用直接产生多个W/O乳液液滴的方法将水性反应混合物和油相组分组合而无需介入的乳液预混合物。例如,通过将多个液滴大小体积的水性反应混合物注入连续油相中,微流体装置可用于在连续油相中产生乳液液滴。
作为另一种替代方案,W/O乳液液滴可以通过以下方式产生:在至少一部分的环糊精分子和聚合物分子形成多个主体-客体复合物(例如,轮烷、准轮烷、聚轮烷或聚准轮烷复合物)的条件下,将连续油相(例如,基础油和任选的含氟表面活性剂)、水溶液(例如水或缓冲的水)、多个环糊精分子和多个(例如,两亲)聚合物分子组合,从而形成包含油包水乳液液滴的乳液。如上所述,组合形成乳液可以大批量进行(例如,通过超声处理,涡旋,共混或其组合)或通过将多个液滴大小体积的水性反应混合物注入连续油相中进行。在一些情况下,水相的一种或多种组分、连续相的一种或多种组分或它们的组合不包括在乳化过程中,而是在稍后的时间添加,例如通过将组分注入液滴中,或通过合并液滴。将组分注入或合并到液滴或多个液滴中的方法、组合物、装置和系统包括但不限于:U.S.2015/0209785;U.S.2016/0131675;U.S.2015/0321163;U.S.2013/0344485;U.S.2015/0024945;U.S.2015/0045258;U.S.2015/0065396;U.S.2016/0001289;和U.S.2016/0045914中描述的那些;其中每一个被全文纳入本文出于任何和所有目的,包括但不限于液滴组合物,液滴方法,以及用于制备和/或使用液滴分析生物分析物(例如核酸)的装置和系统。
本文还描述了使用含有W/O乳液液滴(例如,多个W/O乳液液滴)的W/O乳液的方法。在一些实施方案中,乳液液滴用于微流体装置中。另外或替代地,液滴可以用在配置成执行批量分析的装置中。例如,可以将多个W/O乳液液滴引入PCR管(例如,0.2mL PCR管)中并在热循环仪中热循环以例如扩增和/或检测核酸。在一些实施方案中,然后可以在微流体装置中分析乳液液滴。或者,乳液液滴可以热循环和分析,或在微流体装置中产生、热循环和分析。
在一个实施方案中,本文描述了使用W/O乳液液滴的方法,包括提供含有W/O乳液液滴的乳液;将液滴加热至约50℃至约100℃的温度;将液滴冷却至低于约50℃的温度;和任选地重复加热和冷却1-500,1-250,1-100,1-50,1-40,10-500,10-250,10-100,10-40,20-500,20-250,20-100,20-50,或20-40次。在一些情况下,该方法包括加热至核酸变性温度(例如,约95℃,98℃或99℃),冷却至核酸引物杂交和/或聚合温度(例如,约50℃,60℃,65℃,68℃,70℃或72℃),任选地加热至核酸引物聚合温度;和任选地重复变性、杂交/聚合和任选的聚合温度1-500,1-250,1-100,1-50,1-40,10-500,10-250,10-100,10-40,20-500,20-250,20-100,20-50,或20-40次。
在一些实施方案中,至少100或至少1,000,或更多W/O乳液液滴经热循环,例如,如本文所述。在一些实施方案中,在冷却或重复加热和冷却W/O乳液液滴之后,该方法还包括将至少一部分液滴内部注入多个第二液滴(例如,含有检测试剂的第二液滴)。
该申请文件中任何文献的引用或鉴定并非承认这类文献是本发明的现有技术。虽然通过阐述和举例的方式详细描述了上述发明以清晰理解,但本发明技术人员应理解可在所附权利要求书范围内实施某些改变和修改。此外,本文提供的各参考文献通过引用全文纳入本文,就如同各参考文献单独通过引用纳入本文。当即时应用和本文提供的参考之间存在冲突时,即时应用占主导地位。
实施例
用泊洛沙姆:环糊精乳液稳定液滴
用各种混合比例的α-环糊精测试泊洛沙姆Pluronic F-68,以鉴定形成合适的热可逆主体-客体复合物(参见例如图1)和/或例如热可逆超分子水凝胶的组合物。在该实验中,将Pluronic F-68和α-环糊精加入到包含KRAS扩增子、DNA聚合酶、引物和dNTP的缓冲水性PCR主混合物中,终浓度分别为(8%m/v+2%m/v)和(1%m/v+1%m/v)。通过具有85μm喷嘴的微流体流聚焦装置产生含有PCR主混合物的液滴。油相包含HFE7500和2%w/w Krytox-Jeffamine-Krytox基三嵌段共聚物作为氟相表面活性剂。在产生后,将包含70-90μL液滴和30-10μL油的液滴-油混合物转移至200μL PCR管,总体积为100μL/管,然后在Bio-RadMyCyclerTM热循环仪上热循环。
在热循环之后,目视检查液滴大量液滴(图2a,2d)和在Bio-Rad ZOETM荧光细胞成像仪(图2b)上捕获任何聚结实例。图2a,2b,2d证明用超分子水凝胶稳定的液滴是高度单分散的,在热循环后具有最小的聚结。
通过与1:1体积比的1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇混合来破碎液滴用于凝胶电泳分析。凝胶电泳证明超分子水凝胶添加剂与PCR相容(图2c,2e)。
Bio-Rad MonoRAyL热点测序系统上超分子水凝胶的液滴稳定能力
在该实验中,将Pluronic F-68和2-羟丙基-α-环糊精加入到包含KRAS扩增子、DNA聚合酶、引物和dNTP的缓冲水性PCR主混合物中,终浓度为2%m/v+2%m/v。产生含有PCR主混合物的液滴并用Bio-Rad MonoRAyL热点测序系统进行热循环。图3显示芯片上热循环后的高度单分散液滴。
超分子水凝胶样品浊度对环糊精分子结构的依赖性
在该实验中,分别用2%Pluronic F-68+2%α-环糊精和2%Pluronic F-68+2%2-羟丙基-α-环糊精制备水性PCR主混合物,并将主混合物溶液储存在4℃两周。由α-环糊精制备的样品(顶部图像)显示在长期储存时浊度增加,而由2-羟丙基-α-环糊精制备的样品(底部图像)仍然保持澄清。
不同浓度的Pluronic F-68和2-羟丙基-A-环糊精和不同油相表面活性剂形成的超分子水凝胶的液滴稳定性和PCR相容性
在该实验中,将Pluronic F-68和2-羟丙基-α-环糊精加入到包含KRAS扩增子、DNA聚合酶、引物和dNTP的缓冲水性PCR主混合物中,终浓度分别为(0.5%m/v+0.5%m/v),(1%m/v+1%m/v),(2%m/v+2%m/v)和(4%m/v+4%m/v)。通过具有85μm喷嘴的微流体流聚焦装置产生含有PCR主混合物的液滴。油相包含HFE7500,2%w/w Krytox-PEG基二嵌段共聚物作为氟相表面活性剂。在产生后,将包含70-90μL液滴和30-10μL油的液滴-油混合物转移至200μL PCR管,总体积为100μL/管,然后在Bio-Rad MyCyclerTM热循环仪上热循环。PCR后,目测检查大量乳液。图5a显示用不同浓度的超分子水凝胶制备的乳液在热循环后保持良好的稳定性。通过与1:1体积比的1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇混合来破碎液滴用于凝胶电泳分析。凝胶电泳证明超分子水凝胶添加剂在测试浓度范围内与PCR相容(图5b)。
类似地,将Pluronic F-68和2-羟丙基-α-环糊精加入到包含KRAS扩增子、DNA聚合酶、引物和dNTP的缓冲水性PCR主混合物中,终浓度为2%m/v+2%m/v。通过具有85μm喷嘴的微流体流聚焦装置产生含有PCR主混合物的液滴。油相包含HFE7500以及2%w/w不同类型的氟相表面活性剂:1.Krytox-PEG-Krytox基具有酰胺键的三嵌段共聚物;2.Krytox-PEG基具有酯键的二嵌段共聚物;3.Krytox-PEG-Krytox基具有酯键的三嵌段共聚物;4.Krytox-Jeffamine-Krytox基具有酰胺键的三嵌段共聚物。在产生后,将包含70-90μL液滴和30-10μL油的液滴-油混合物转移至200μL PCR管,总体积为100μL/管,然后在Bio-Rad MyCyclerTM热循环仪上热循环。PCR后,目测检查大量乳液。图5c显示用超分子水凝胶制备的乳液对不同类型的氟相表面活性剂表现出良好的热稳定性。制备没有超分子水凝胶的液滴作为阴性对照,并且它们在热循环后显示出严重的聚结。
超分子水凝胶制备的PCR主混合物对COP表面的低粘附性表现出对表面污垢的抗性
在该实验中,将Pluronic F-68和2-羟丙基-α-环糊精加入到包含KRAS扩增子、DNA聚合酶、引物和dNTP的缓冲水性PCR主混合物中,终浓度为2%m/v+2%m/v。制备不含超分子凝胶但含有0.1mg/mlBSA的主混合物作为阴性对照。将疏水涂覆的COP样品的小斑块浸入主混合物中,并在95℃下在密封小瓶中加热。测量COP斑块的接触角以捕获任何样品与表面的粘附。图6显示在超分子水凝胶主混合物中在95℃温育5小时后COP的接触角保持相同,表明样品与表面的粘附最小。相反,暴露于0.1mg/ml BSA主混合物的COP斑块显示出接触角的快速降低,表明表面上显著的样品粘附。
Claims (63)
1.一种包含油包水乳液液滴的乳液,所述液滴包含:
水;
多个环糊精分子;和
多个两亲聚合物分子,其中所述多个两亲聚合物分子的单个两亲聚合物分子包含疏水部分和亲水部分,
-其中至少一部分的环糊精分子和两亲聚合物分子形成多个聚准轮烷复合物,
-其中所述液滴存在于连续的油相中,以及
-其中所述液滴包含质量比为1:4至4:1的环糊精分子与两亲聚合物分子。
2.如权利要求1所述的乳液,其中,所述多个环糊精分子中的单个环糊精分子独立地选自:α-环糊精和β-环糊精。
3.如权利要求1所述的乳液,其中,所述多个环糊精分子中的单个环糊精分子独立地选自:α-环糊精和γ-环糊精。
4.如权利要求1所述的乳液,其中,所述多个环糊精分子中的单个环糊精分子独立地选自:β-环糊精和γ-环糊精。
5.如权利要求1所述的乳液,其中,所述多个环糊精分子中的单个环糊精分子的至少一部分独立地包含疏水改性。
7.如权利要求6所述的乳液,其中,所述乳液包含至少两种结构不同的环糊精分子的混合物。
8.如权利要求7所述的乳液,其中,所述至少两种结构不同的环糊精分子独立地为式I的化合物,其中n为6。
9.如权利要求7所述的乳液,其中,所述至少两种结构不同的环糊精分子独立地为式I的化合物,其中n为7。
10.如权利要求7所述的乳液,其中,所述至少两种结构不同的环糊精分子独立地为式I的化合物,其中n为8。
11.如权利要求6所述的乳液,其中,每个R1独立地为H或羟烷基,其中至少一个R1为羟烷基。
12.如权利要求11所述的乳液,其中,每个R1独立地为H或C2-C6羟烷基,其中至少一个R1为C2-C6羟烷基。
13.如权利要求11所述的乳液,其中,每个R1独立地为H或C2-C6羟烷基,其中至少一个R1为2-羟丙基。
14.如权利要求11所述的乳液,其中,R1是2-羟丙基。
15.如权利要求14所述的乳液,其中,所述环糊精分子是2-羟丙基α-环糊精。
16.如权利要求1所述的乳液,其中,两亲聚合物分子包含嵌段共聚物,其中嵌段共聚物包含亲水嵌段和疏水嵌段。
17.如权利要求16所述的乳液,其中,所述嵌段共聚物是二嵌段共聚物或三嵌段共聚物、或其组合。
18.如权利要求17所述的乳液,其中,所述嵌段共聚物是包含聚乙二醇(PEG)亲水嵌段和疏水嵌段的二嵌段共聚物。
19.如权利要求17所述的乳液,其中,所述嵌段共聚物是包含亲水嵌段和含聚丙二醇的疏水嵌段的二嵌段共聚物。
20.如权利要求17所述的乳液,其中,所述嵌段共聚物是包含亲水嵌段和含胆固醇或其衍生物的疏水嵌段的二嵌段共聚物。
21.如权利要求17所述的乳液,其中,所述嵌段共聚物是三嵌段共聚物。
22.如权利要求21所述的乳液,其中,所述三嵌段共聚物是泊洛沙姆。
23.如权利要求22所述的乳液,其中,所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
24.如权利要求1所述的乳液,其中,所述两亲聚合物分子是非离子两亲聚合物分子。
25.如权利要求1所述的乳液,其中,所述两亲聚合物分子是线性两亲聚合物分子。
26.如权利要求1所述的乳液,其中,所述两亲聚合物分子的重均分子量为2,000g/mol至70,000g/mol。
27.如权利要求1所述的乳液,其中,所述液滴包含质量比为1:1的环糊精分子与两亲聚合物分子。
28.如权利要求1所述的乳液,其中,所述液滴包含浓度为0.5%至4%质量/体积(m/v)的环糊精分子。
29.如权利要求28所述的乳液,其中,所述环糊精分子的浓度为2%m/v。
30.如权利要求1所述的乳液,其中,所述液滴包含浓度为0.5%至4%质量/体积(m/v)的两亲聚合物分子。
31.如权利要求30所述的乳液,其中,所述两亲聚合物分子的浓度为2%m/v。
32.如权利要求27所述的乳液,其中,所述环糊精分子的浓度为2%m/v,所述两亲聚合物分子的浓度为2%m/v。
33.如权利要求1所述的乳液,其中,所述液滴还包含热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。
34.如权利要求1所述的乳液,其中,所述液滴还包含核酸。
35.如权利要求34所述的乳液,其中,所述液滴还包含热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。
36.如权利要求1所述的乳液,其中,所述液滴还包含:
核酸;和
热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶,其中所述DNA聚合酶与所述核酸是异源的。
37.如权利要求1所述的乳液,其中,所述液滴包含三磷酸核苷酸(NTP)、三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)或其组合。
38.如权利要求1所述的乳液,其中,所述液滴还包含热可逆水凝胶。
39.如权利要求38所述的乳液,其中,所述热可逆水凝胶在70℃至98℃的温度下为凝胶形式,并且在低于50℃且高于0℃的温度下为溶液形式。
40.如权利要求38所述的乳液,其中,所述热可逆水凝胶在60℃至98℃的温度下为凝胶形式,并且在低于30℃且高于0℃的温度下为溶液形式。
41.如权利要求1所述的乳液,其中,所述液滴存在于连续的氟碳油相中。
42.如权利要求41所述的乳液,其中,所述连续的氟碳油相包含含氟油和表面活性剂。
43.如权利要求42所述的乳液,其中,所述表面活性剂是含氟表面活性剂。
44.如权利要求43所述的乳液,其中,所述含氟表面活性剂是包含全氟化聚醚嵌段和聚乙二醇嵌段的嵌段共聚物。
45.如权利要求43所述的乳液,其中,所述含氟表面活性剂包含聚(全氟环氧丙烷)PEG二嵌段共聚物。
46.如权利要求42所述的乳液,其中,所述含氟油包含甲基九氟丁基醚(HFE-7100)、乙基九氟丁基醚(HFE-7200)、2-三氟甲基-3-乙氧基十二-氟己烷(HFE-7500)、1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-十氟-3-甲氧基-4-三氟甲基-戊烷(HFE-7300)、全氟辛基溴化物、全氟萘烷、FC-40、FC-43、FC-70、FC-84、FC-72、RM-82、FC-75、RM-101、或它们的组合。
47.如权利要求46所述的乳液,其中,所述含氟油是HFE-7500。
48.如权利要求1所述的乳液,其中,所述液滴存在于连续的硅油相中。
49.如权利要求48所述的乳液,其中,所述连续的硅油相包含硅油和表面活性剂。
50.如权利要求1所述的乳液,其中,在95℃的温度下将液滴温育至少1小时后,所述液滴与环烯烃聚合物表面形成至少90°的接触角。
51.如权利要求50所述的乳液,其中,在95℃的温度下将液滴温育至少1小时后,所述液滴与环烯烃聚合物表面形成至少115°的接触角。
52.如权利要求1所述的乳液,其中,所述乳液包含至少100个油包水乳液液滴。
53.如权利要求52所述的乳液,其中,所述乳液包含至少1,000g个油包水乳液液滴。
54.一种形成如权利要求1-53中任一项所述的乳液的方法,所述方法包括:
在至少一部分的环糊精分子和两亲聚合物分子形成多个聚准轮烷复合物的条件下组合连续油相、水溶液、多个环糊精分子和多个两亲聚合物分子,从而形成包含油包水乳液液滴的乳液。
55.如权利要求54所述的方法,其中,所述水溶液是缓冲水溶液。
56.一种使用包含油包水乳液液滴的乳液的方法,所述方法包括:
提供如权利要求1-53中任一项所述的乳液;
将液滴加热至50℃至100℃的温度;
将液滴冷却至低于50℃的温度;和
任选地重复加热和冷却1-50次。
57.如权利要求56所述的方法,其中,在冷却或任选地重复加热和冷却之后,所述方法还包括将至少一部分液滴内部注入第二液滴。
58.如权利要求57所述的方法,其中,所述液滴包含靶核酸或其扩增子或逆转录产物。
59.如权利要求58所述的方法,其中,第二液滴包含用于检测靶核酸或其扩增子或逆转录产物的存在或不存在的检测试剂。
60.如权利要求57所述的方法,其中,在冷却或任选地重复加热和冷却之后,所述方法还包括将至少一部分液滴内部注入多个第二液滴。
61.如权利要求60所述的方法,其中,所述液滴包含靶核酸或其扩增子或逆转录产物。
62.如权利要求61所述的方法,其中,所述多个第二液滴包含用于检测靶核酸或其扩增子或逆转录产物的存在或不存在的检测试剂。
63.如权利要求62所述的方法,其中,所述检测试剂在不同第二液滴中是不同的,其中不同的检测试剂检测不同靶核酸或其不同扩增子或逆转录产物的存在或不存在。
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