CN114173746A - 用于稳定乳液的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了涉及在乳液中的分散相分区与连续相之间的界面处形成表面活性剂分子之间的交联键的方法和组合物，以及此类交联乳液的用途。

Description

用于稳定乳液的系统和方法

相关申请的引用

本申请要求2019年6月3日提交的美国临时申请62/856,660的优先权的权益，所述临时申请的内容整体并入本文。

背景技术

由连续相中的分散相的分区组成的乳液体系可用于许多应用。乳液体系的潜在缺点包括分子从一个分区移动到另一个分区、聚结等。

发明内容

在一个方面，本文提供了组合物。

在某些实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含含有尾部和头部的多个第一表面活性剂分子，其中第一表面活性剂分子包含每个表面活性剂分子平均2-10个第一连接部分，其中第一连接部分被配置成(i)在合适条件下互相连接，(ii)在合适条件下与第二连接部分连接，其中第二连接部分附接到包含尾部和头部的第二表面活性剂分子，并且其中第二连接部分与第一连接部分不同，或(iii)在合适的条件下与中间连接部分连接，或它们的组合。第一连接部分附接到第一表面活性剂分子的尾部。另选地，第一连接部分可附接到第一表面活性剂分子的头部。第二连接部分可附接到第二表面活性剂分子的头部。另选地，第二连接部分可附接到第二表面活性剂分子的尾部。在某些实施方案中，连接部分被配置成在合适的条件下形成一个或多个共价键。在某些实施方案中，连接部分被配置成在合适的条件下形成一个或多个非共价键。在某些实施方案中，所述组合物还包含多个第二表面活性剂分子，其中第二表面活性剂分子包含每个表面活性剂分子平均2-10个第二连接部分。在某些实施方案中，第一连接部分和第二连接部分带相反电荷。在某些实施方案中，组合物还包含含有第一表面活性剂分子的连续相。在某些实施方案中，组合物还包含含有第二表面活性剂分子的连续相。在某些实施方案中，组合物还包含分散相；在这些实施方案的一些中，分散相不含第一表面活性剂分子；在这些实施方案的一些中，分散相不含第二表面活性剂分子。在使用中间连接部分的某些实施方案中，分散相含有中间连接部分。在某些实施方案中，所述组合物还包含含有第一表面活性剂分子的分散相。在这些实施方案的某些中，所述组合物还包含连续相。在某些实施方案中，所述组合物还包含含有第二表面活性剂分子的分散相。在这些实施方案的某些中，所述组合物还包含连续相，例如不含第一表面活性剂分子的连续相和/或不含第二表面活性剂分子的连续相。在某些实施方案中，连续相含有中间连接部分。在某些实施方案中，表面活性剂部分包含含有生物素的第一连接部分和含有一个或多个生物素结合部分(诸如链霉亲和素或链霉亲和素衍生物)的中间连接部分。在某些实施方案中，表面活性剂分子在连续相(诸如包括油的连续相)中形成胶束。在某些实施方案中，油是烃油或硅油。在某些实施方案中，油包括氟化油。在某些实施方案中，表面活性剂是含氟表面活性剂。

在某些实施方案中，本文提供了组合物，其包含含有连续相中的分散相的分区的乳液，其中分散相的分区包含含有尾部和头部的多个表面活性剂分子，所述表面活性剂分子位于分区与连续相的界面处以形成表面活性剂分子层，并且其中多个表面活性剂分子互相交联以形成表面活性剂分子的交联网络。在某些实施方案中，表面活性剂分子的交联网络的交联度为20％-100％。在某些实施方案中，通过平均长度为表面活性剂的尾部长度的5％-500％的交联键进行交联。在某些实施方案中，通过平均长度为表面活性剂的头部长度的5％-500％的交联键进行交联。在某些实施方案中，表面活性剂分子在表面活性剂分子的尾部互相交联。在某些实施方案中，表面活性剂分子在表面活性剂分子的头部互相交联。在某些实施方案中，表面活性剂分子的第一部分包含形成部分交联键的第一连接部分，并且其中每个表面活性剂分子的第一连接部分的平均数为2-10。在某些实施方案中，表面活性剂分子的第二部分包含形成部分交联键的第二连接部分(与第一连接部分不同)，并且其中每个表面活性剂分子的第二连接部分的平均数为2-10。在某些实施方案中，表面活性剂分子通过交联键而交联，并且其中交联键的平均长度为1-100nm。在某些实施方案中，分散相包括水相并且连续相包括油，在某些情况下油包括氟化油。在某些实施方案中，表面活性剂包括含氟表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂分子通过非共价键交联。在某些实施方案中，表面活性剂分子通过共价键交联。在某些实施方案中，表面活性剂分子包含通过生物素结合部分交联的生物素部分。在某些实施方案中，生物素结合部分包含链霉亲和素或链霉亲和素衍生物。在某些实施方案中，表面活性剂分子包含每个表面活性剂分子平均2-10个生物素部分。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过染料扩散测试中的染料扩散的减少所测量的，所述染料扩散测试包括诸如如本文所述的染料扩散测定中的一种，例如罗丹明CG(rodamine CG)扩散、试卤灵(resorufin)扩散或荧光素扩散。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过PCR测试(诸如如本文所述的PCR测试)所测量的。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过聚结测定(诸如如本文所述的聚结测定之一)所测量的。

在某些实施方案中，本文中提供了一种组合物，其包含连续相，其中连续相包含多个表面活性剂分子，所述表面活性剂分子包含附接到表面活性剂分子的连接部分，其中所述部分在合适的条件下互相形成交联键。在某些实施方案中，连续相待用于制备乳液。在某些实施方案中，所述部分在连续相中基本上不相互作用而交联。在某些实施方案中，所述部分在合适的条件下形成非共价交联键。在某些实施方案中，所述部分在合适的条件下形成共价交联键。在某些实施方案中，连续相包括油。在某些实施方案中，油是氟化油。在某些实施方案中，氟化油是(3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷)、甲基九氟丁醚、甲基九氟异丁醚、乙基九氟异丁醚、乙基九氟丁醚、(戊烷,1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-十氟-3-甲氧基-4-(三氟甲基-))、异丙醇、(1,2-反式-二氯乙烯)、(丁烷,1,1,1,2,2,3,3,4,4-九氟-4-甲氧基-)、(1,1,1,2,2,4,5,5,5-九氟-4-(三氟甲基)-3-戊酮)、(呋喃,2,3,3,4,4-五氟四氢-5-甲氧基-2,5-双[1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)乙基]-)、包含5至18个碳原子的全氟化合物、聚氯三氟乙烯、(2,2,2-三氟乙醇)、Novec 8200^TM、Novec 71DE^TM、Novec 7100^TM、Novec 7200DL^TM、Novec 7300DL^TM、Novec71IPA^TM、Novec 72FL^TM、Novec7500^TM、Novec 71DA^TM、Novec 7100DL^TM、Novec 7000^TM、Novec 7200^TM、Novec 7300^TM、Novec72DA^TM、Novec 72DE^TM、Novec 649^TM、Novec 73DE^TM、Novec 7700^TM、Novec 612^TM、FC-40^TM、FC-43^TM、FC-70^TM、FC-72^TM、FC-770^TM、FC-3283^TM、FC-3284^TM、PF-5056^TM、PF-5058^TM、卤化碳0.8^TM、卤化碳1.8^TM、卤化碳4.2^TM、卤化碳6.3^TM、卤化碳27^TM、卤化碳56^TM、卤化碳95^TM、卤化碳200^TM、卤化碳400^TM、卤化碳700^TM、卤化碳1000N^TM、Uniflor 4622R^TM、Uniflor 8172^TM、Uniflor8472CP^TM、Uniflor 8512S^TM、Uniflor 8731^TM、Uniflor 8917^TM、Uniflor 8951、TRIFLUNOX3005^TM、TRIFLUNOX 3007^TM、TRIFLUNOX 3015^TM、TRIFLUNOX 3032^TM、TRIFLUNOX 3068^TM、TRIFLUNOX 3150^TM、TRIFLUNOX 3220^TM或TRIFLUNOX 3460^TM或它们的组合。在某些实施方案中，氟化油是(3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷)；(呋喃,2,3,3,4,4-五氟四氢-5-甲氧基-2,5-双[1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)乙基]-)；包含5至18个碳原子的全氟化合物；或它们的组合。在某些实施方案中，表面活性剂包含含氟表面活性剂。在某些实施方案中，含氟表面活性剂包括具有通过醚键、酰胺键或脲键连接的头部和尾部的含氟表面活性剂；具有通过脲键、醚键或酰胺键或它们的组合连接到碳氟化合物部分的聚乙烯部分的含氟表面活性剂。在某些实施方案中，含氟表面活性剂包含通过脲键、酰胺键或醚键连接到碳氟化合物部分的聚乙烯部分。在某些实施方案中，在合适的条件下形成的交联键包括直接交联键。在某些实施方案中，在合适的条件下形成的交联键包括间接交联键。在某些实施方案中，连接部分包含生物素。在某些实施方案中，每个表面活性剂分子包含平均至少2个连接部分。在某些实施方案中，每个表面活性剂分子包含平均至少4个连接部分。在某些实施方案中，表面活性剂分子的连接部分使得当它们在合适的条件下反应时，所得的表面活性剂分子之间的交联键为1-100nm。在某些实施方案中，在合适的条件下在连接部分之间形成的交联键具有20kJ/mol与200kJ/mol之间的键强度。在某些实施方案中，表面活性剂分子的浓度为0.5％重量/体积至2％重量/体积。

在某些实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含在连续相中的分散相的分区的乳液形成中使用的分散相，其中乳液中分区与连续相的界面包含含有交联部分的多个表面活性剂分子，其中分散相包含在合适的条件下引发和/或促进交联部分之间的交联过程的一种或多种组分。在某些实施方案中，分散相不与连续相接触。在某些实施方案中，分散相包括水相。在某些实施方案中，分散相还包含在合适的条件下引发和/或促进非交联过程的一种或多种额外组分。在某些实施方案中，非交联过程包括化学反应。在某些实施方案中，所述组分包含用于进行聚合酶链反应的核酸和组分。在某些实施方案中，交联过程包括共价相互作用。在某些实施方案中，交联过程包括非共价过程。在某些实施方案中，交联过程包括通过一个或多个中间接头部分来连接表面活性剂分子的连接部分，并且其中分散相还包含多个中间接头部分。在某些实施方案中，中间接头部分包含生物素结合部分。在某些实施方案中，生物素结合部分包含亲和素、链霉亲和素、链霉亲和素衍生物或它们的组合。在某些实施方案中，一种或多种组分的浓度为10纳摩尔至10毫摩尔。

在某些实施方案中，本文提供了一种乳液组合物，其包含连续相中的多个分散相的分区，其中(i)分散相分区与连续相之间的界面包含多个表面活性剂分子；(ii)界面的表面活性剂分子通过表面活性剂分子之间的一个或多个连接部分进行交联；(iii)分区中的至少一部分含有在合适的条件下经历产生第二组分的过程的第一组分；并且(iv)连续相包含与第二组分相互作用以产生指示第二组分的存在和/或丰度的信号的报告部分。在某些实施方案中，第一组分和第二组分相同或几乎相同。在某些实施方案中，第一组分是感兴趣的核酸并且第二组分是所述核酸的扩增产物。在某些实施方案中，连接部分具有促进报告分子进入分区的一种或多种特性。

在某些实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含含有尾部和头部的多个第一表面活性剂分子，其中第一表面活性剂分子包含附接到第一表面活性剂分子的第一连接部分，其中第一连接部分被配置成在合适的条件下参与形成第一表面活性剂分子与包含第二连接部分的第二表面活性剂之间的交联键。在某些实施方案中，第一连接部分和第二连接部分具有相同的结构。在某些实施方案中，第一表面活性剂分子包含多个连接部分。在某些实施方案中，第一表面活性剂分子附接到平均2-10个连接部分。在某些实施方案中，第一连接部分附接到表面活性剂分子的尾部。在某些实施方案中，第一连接部分附接到表面活性剂分子的头部。在某些实施方案中，第一连接部分的长度是表面活性剂分子头部长度的5％-500％。在某些实施方案中，第一表面活性剂分子是非离子、阴离子、阳离子或两性离子表面活性剂。在某些实施方案中，第一表面活性剂分子是含氟表面活性剂。在某些实施方案中，连接部分以共价方式附接到表面活性剂分子。在某些实施方案中，连接部分被配置成在合适的条件下与中间部分结合但不与另一个连接部分结合。在某些实施方案中，连接部分包含生物素。在某些实施方案中，中间部分包含生物素结合部分。在某些实施方案中，多个第一表面活性剂分子包含在连续相中。

在某些实施方案中，本文提供了一种试剂盒，其包含：(i)包含在溶液形成中使用的表面活性剂的容器，其中表面活性剂分子包含多个用于与其他表面活性剂分子交联的连接部分；(ii)容纳(i)的容器的包装。

在一个方面，本文提供了方法。

在某些实施方案中，本文提供了在连续相中的分散相的分区的乳液中进行过程的方法，其包括(i)提供连续相中分散相的分区的乳液，其中分散相的分区包含含有尾部和头部的多个表面活性剂分子，所述表面活性剂分子位于分区与连续相的界面处以形成表面活性剂分子层，并且其中多个表面活性剂分子互相交联以形成表面活性剂分子的交联网络；以及(ii)对分区执行所述过程。在某些实施方案中，表面活性剂分子的交联网络的交联度为20％-100％。在某些实施方案中，通过平均长度为表面活性剂的尾部长度或表面活性剂的头部长度的5％-500％的交联键来进行交联。在某些实施方案中，通过平均长度为表面活性剂的头部长度或表面活性剂的头部长度的5％-500％的交联键来进行交联。在某些实施方案中，表面活性剂分子在表面活性剂分子的尾部互相交联。在某些实施方案中，表面活性剂分子在表面活性剂分子的头部互相交联。在某些实施方案中，表面活性剂分子的第一部分包含形成部分交联键的第一连接部分，并且其中每个表面活性剂分子的第一连接部分的平均数为2-10。在某些实施方案中，表面活性剂分子的第二部分包含形成部分交联键的第二连接部分(与第一连接部分不同)，并且其中每个表面活性剂分子的第二连接部分的平均数为2-10。在某些实施方案中，表面活性剂分子通过交联键而交联，并且其中交联键的平均长度为1-100nm。在某些实施方案中，分散相是水相并且连续相是油。在某些实施方案中，油是氟化油。在某些实施方案中，表面活性剂包括含氟表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂分子通过非共价键交联。在某些实施方案中，表面活性剂分子通过共价键交联。在某些实施方案中，表面活性剂分子通过生物素-生物素结合部分相互作用来交联。在某些实施方案中，生物素结合部分包含链霉亲和素或链霉亲和素衍生物。在某些实施方案中，表面活性剂分子包含每个表面活性剂分子平均15、1-10、2-10个生物素部分。在某些实施方案中，所述方法还包括在分区中形成表面活性剂分子的交联网络。在某些实施方案中，通过在其中分散相在连续相中形成多个分区的条件下使包含含有至少一个连接部分的多个表面活性剂分子的连续相与分散相接触，以及在分区形成期间和/或之后提供引发和/或促进形成包含连接部分的交联键以形成表面活性剂分子的交联网络(其中连接部分形成从一个表面活性剂分子到至少一个其他表面活性剂分子的交联键)的条件，已形成表面活性剂分子的交联网络。在某些实施方案中，分散相包含与连接部分接触时引发和/或促进形成包含连接部分的交联键的一种或多种组分。在某些实施方案中，分区暴露于引发和/或促进形成包含连接部分的交联键的外部刺激。在某些实施方案中，所述过程包括化学分析；蛋白质或菌株工程；基于核酸、蛋白质或细胞的测定；分选；分离；或化学和/或生化合成；或它们的组合。在某些实施方案中，所述过程包括核酸测定。在某些实施方案中，所述过程包括聚合酶链反应(PCR)。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过染料扩散测试中的染料扩散的减少所测量的，所述染料扩散测试诸如如本文所述的染料扩散测试中的一种，例如罗丹明CG扩散、试卤灵扩散或荧光素扩散。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过PCR测试(诸如如本文所述的PCR测试)所测量的。

在某些实施方案中，本文提供了一种用于产生连续相中的分散相的分区的乳液的方法，其中分散相的分区包含含有尾部和头部的多个表面活性剂分子，所述表面活性剂分子位于分区与连续相的界面处以形成表面活性剂分子层，所述方法包括(i)使连续相与分散相接触，其中(a)连续相包含含有至少一个连接部分的多个表面活性剂分子，或(b)分散相包含含有至少一个连接部分的多个表面活性剂分子，或(c)在其中分散相在连续相中形成多个分区的条件下的(a)和(b)两者；和(ii)在分区形成期间和/或之后提供引发和/或促进形成包含连接部分的表面活性剂分子之间的交联键的条件，以形成表面活性剂分子的交联网络。在某些实施方案中，连续相包含含有连接部分的表面活性剂分子，而分散相不包含。在某些实施方案中，交联键的连接部分和其他组分(如果存在的话)形成长度为表面活性剂的尾部长度的5％-500％或表面活性剂的头部长度的5％-500％的交联键。在某些实施方案中，表面活性剂分子包含每个表面活性剂分子平均2-10个连接部分。在某些实施方案中，所述条件和/或连接部分的数量使得表面活性剂分子的交联网络的完成度为20％-100％。在某些实施方案中，连接部分附接到表面活性剂分子的尾部并且交联键在表面活性剂分子的尾部之间形成。在某些实施方案中，连接部分附接到表面活性剂分子的头部并且交联键在表面活性剂分子的头部之间形成。在某些实施方案中，分散相包含与连接部分接触时引发和/或促进形成包含连接部分的交联键的一种或多种组分。在某些实施方案中，一种或多种组分包含与表面活性剂连接部分形成一个或多个键的一个或多个中间连接部分。在某些实施方案中，表面活性剂连接部分包含生物素并且中间连接部分包含生物素结合部分。在某些实施方案中，生物素结合部分包含链霉亲和素和/或链霉亲和素衍生物。在某些实施方案中，分区暴露于引发和/或促进形成包含连接部分的交联键的外部刺激。在某些实施方案中，外部刺激包括光。在某些实施方案中，连续相包括油并且分散相包括水相。在某些实施方案中，油包括氟化油。在某些实施方案中，表面活性剂包括含氟表面活性剂。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过染料扩散测试中的染料扩散的减少所测量的，所述染料扩散测试诸如如本文所述的染料扩散测定中的一种，例如罗丹明CG扩散、试卤灵扩散或荧光素扩散。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过PCR测试(诸如如本文所述的PCR测试)所测量的。

在某些实施方案中，本文提供了一种制备包含油连续相中的多个分散水相的分区的乳液的方法，其中分区还包含在分区表面处的表面活性剂分子的交联网络，所述方法包括制备待分散的水相，制备包含经修饰的表面活性剂的油相，其中经修饰的表面活性剂包含尾部和头部并且还包含连接部分；以及将水相和油相混合以形成油中多个水相的分区的乳液，其中经修饰的表面活性剂分子互相形成交联键，以在分区与连续相的界面处形成表面活性剂分子的交联网络。在某些实施方案中，所述混合通过涡旋、移液、注射、摇动批量进行。在某些实施方案中，所述混合通过微流体液滴形成装置进行。在某些实施方案中，所述混合通过微流体T形接头、流动专用接头、反向y接头、多足式接头或它们的组合进行。在某些实施方案中，用于产生乳液的系统嵌入较大的仪器中。在某些实施方案中，仪器是含有样品输送模块、液滴发生器模块、热循环仪模块、检测模块、废物管理模块或它们的组合的仪器。在某些实施方案中，较大的仪器具有嵌入的微流体装置、管道、容器或大桶。在某些实施方案中，仪器包含控制仪器(包括但不限于仪器整体或微流体装置的性能)的相关软件。

在某些实施方案中，本文提供了用于防止包含连续相中的分散相的分区的乳液中的分区聚结的方法，其包括在分区与连续相之间的界面处形成表面活性剂分子的交联网络。在某些实施方案中，分区具有大于1um直径的平均直径。在某些实施方案中，乳液处于高于60℃的温度下。

在某些实施方案中，本文提供了一种用于在微流体装置中传输、热循环、孵育、分选或分析包含连续相中的分散相的分区的乳液的方法，其中液滴包含在分区和连续相的界面处的交联的表面活性剂分子网络。

在某些实施方案中，本文提供了一种在包含连续相中的水相的分区的乳液的分区中执行PCR的方法，其中分区包含交联剂、聚合酶、核苷酸、模板DNA、引物和探针/或DNA结合染料，并且连续相包含含有一个或多个连接部分的表面活性剂分子。

在某些实施方案中，本文提供了一种方法，其包括(i)形成包含连续相中的多个包含分散相的分区的乳液，其中所述分区在与所述连续相的界面处包含含有多个表面活性剂分子的表面活性剂层；(ii)使位于界面处的表面活性剂分子交联以形成交联的表面活性剂网络；(iii)对分区执行过程；和(iv)处理交联的表面活性剂网络以降低交联度。在某些实施方案中，所述方法还包括破开多个分区以释放分区中的分散相。在某些实施方案中，表面活性剂包含含氟表面活性剂，并且连续相包含氟化油。在某些实施方案中，所述过程包括聚合酶链反应。

在某些实施方案中，本文提供了一种执行乳液流动过程的方法，其包括(i)提供包含以下的连续相：(a)连续相，和(b)具有连接部分的表面活性剂分子；(ii)提供与连续相分开的分散相，所述分散相不包含具有连接部分的表面活性剂分子，并且包含引发和/或促进形成表面活性剂分子之间的交联键的一种或多种组分，其中交联键包含连接部分；(iii)使连续相和分散相流入分区发生器，分区发生器生成连续相中的包含分散相的多个分区的乳液，以及(iv)在分区形成期间和/或之后，在包含连接部分的表面活性剂分子之间形成交联键，以在分区与连续相的界面处形成表面活性剂分子的交联网络；以及(v)使乳液流动通过对乳液的分区执行一种或多种操作的加工系统。

在某些实施方案中，本文提供了一种修饰包含尾部和头部的第一表面活性剂分子的方法，其包括将多个第一连接部分附接到第一表面活性剂分子，其中第一连接部分被配置成在合适的条件下参与形成第一表面活性剂分子与包含第二连接部分的第二表面活性剂分子之间的交联键。在某些实施方案中，所述方法包括将平均2-10个第一连接部分附接到第一表面活性剂分子。在某些实施方案中，所述方法包括将多个第一连接部分附接到表面活性剂分子的尾部。在某些实施方案中，所述方法包括将多个第一连接部分附接到表面活性剂分子的头部。在某些实施方案中，第一连接部分的长度为表面活性剂分子的头部长度的5％-500％；在某些实施方案中，第一连接部分的长度为表面活性剂分子的尾部长度的5％-500％。在某些实施方案中，第一表面活性剂分子是非离子、阴离子、阳离子或两性离子表面活性剂。在某些实施方案中，第一表面活性剂分子是含氟表面活性剂。在某些实施方案中，所述方法包括将连接部分以共价方式附接到第一表面活性剂分子。在某些实施方案中，连接部分被配置成在合适的条件下与中间部分结合但不与另一个连接部分结合。在某些实施方案中，连接部分包含生物素。在某些实施方案中，中间部分包含生物素结合部分。

以引用的方式并入

在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度就如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体和单独地指出以引用方式并入一般。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。本发明的特征和优势的更好理解参考阐明利用本发明原则的例示性实施方案的以下详细说明和附图来获得，并且在附图中：

图1示出了将分散相分散入连续相中以形成乳液。

图2示出了两个或更多个分区的聚结的示意图。

图3示出了分子跨分区界面转移的两种模式的示意图。

图4示出了乳液中分子在单独的分区之间转移的示意图。

图5示出了表面活性剂交联的实施方案。

图6示出了不同的交联度；左，完整交联；右，部分交联。

图7示出了嵌入分区界面中的表面活性剂可能在物理几何形状上有所不同。

图8示出了通过修改分区界面的化学特性来控制分子转移的实施方案。

图9示出了通过抑制反胶束形成来减少分子转移的实施方案。

图10示出了通过对表面活性剂网络孔隙度的基于尺寸的限制来控制分子转移的实施方案。

图11示出了不同接头尺寸的影响。

图12示出了交联剂数量对交联程度的影响。

图13示出了表面活性剂部分的头对头交联和尾对尾交联。

图14示出了两种不同表面活性剂分子上的连接部分之间的直接交联。

图15示出了两个表面活性剂部分通过离子键的交联。

图16示出了两个表面活性剂部分之间通过一个或多个中间连接部分的间接交联。

具体实施方式

本文公开了涉及通过促进分区界面处的表面活性剂-表面活性剂相互作用(本文称为交联)来稳定乳液的组合物和方法。表面活性剂交联通过在分区界面形成分子网络，即表面活性剂网络，来赋予乳液增加的稳定性。这种网络包含表面活性剂分子，表面活性剂分子以趋于保持表面活性剂分子缔合和/或减少表面活性剂分子的运动的方式相互作用；在一些情况下，通过使用附接到表面活性剂分子的连接部分来促进缔合，连接部分或直接地＝或通过中间部分相互作用以使表面活性剂分子交联，其中相互作用在一些情况下是共价的并且在其他情况下是非共价的，并且其中相互作用使交联的表面活性剂分子保持缔合。如本文所用，“表面活性剂分子”和“表面活性剂部分”可互换使用，是指单个表面活性剂实体；这种实体可以是单个分子或多于一个分子集合成的多分子复合物。表面活性剂一般而言具有亲水的头部和疏水的尾部；表面活性剂分子之间的交联键可以是头部基团之间的交联键、尾部基团之间的交联键、头对尾的交联键或它们的组合。在某些实施方案中，连续相包括油，诸如氟化油，分散相包括水相，并且表面活性剂包括含氟表面活性剂。分子(表面活性剂)网络能够改变液滴的边界特性，以帮助促进或限制分子进出液滴的运动。本文公开了用于制备乳液、制备表面活性剂以及所得的带有交联的表面活性剂的乳液和其他所得组合物的方法。此外，本文公开了使用所述表面活性剂和带有交联的表面活性剂的乳液的方法以及所述表面活性剂和带有交联的表面活性剂的乳液的用途。此外公开了表面活性剂和表面活性剂的乳液在分区处理系统中的实用性。

本文所述的组合物和方法可与利用表面活性剂的任何合适的乳液体系一起使用。在某些实施方案中，乳液体系是油包水乳液体系，其中水性分散相分散在油连续相中，其中使用表面活性剂来稳定分区界面并且表面活性剂或部分或完全交联，如本文所述。在某些实施方案中，表面活性剂分子包含一个或多个连接部分(在本文中也称为接头部分)，连接部分可在表面活性剂分子之间直接连接在一起(例如在一个表面活性剂上的连接部分与另一个表面活性剂上的连接部分之间以共价连接或非共价连接的方式)，或通过一个或多个连接分子(即中间连接部分)间接连接在一起，其中中间连接(连接)部分(例如分子)与一个表面活性剂分子上的连接部分连接(例如以共价键或非共价键的方式)并且与至少一个其他表面活性剂分子上的连接部分连接(例如以共价键或非共价键方式)。可使用用于将合适的连接部分引入表面活性剂分子的任何合适的方法；在某些情况下，表面活性剂分子已经含有未经修饰的此类部分，而且在其他情况下，表面活性剂分子被修饰成包括一个或多个连接部分(例如通过以共价方式或非共价方式附接连接部分)。方法包括修饰要在水性分散相中使用的表面活性剂分子以包含一个或多个连接部分，并且例如在表面活性剂正在形成或已经形成分区与连续相之间的界面时提供用于交联的条件。

可使用任何合适的方法来交联表面活性剂分子。在形成乳液之前，被配置成交联的表面活性剂分子可存在于连续相、分散相或它们的组合中。在某些情况下，包含连接部分的表面活性剂分子存在于连续相中，例如经修饰的表面活性剂分子存在于连续相中，并且激活、促进或有利于表面活性剂分子上的连接部分之间的连接过程的一种或多种组分(诸如促进表面活性剂上的接头部分之间的连接过程的一种或多种激活组分，或诸如接头分子，即中间接头部分)存在于分散相(诸如水相)中；这些相被放在一起以例如在分区发生器中形成连续相中的分散相(例如水相)的分区的乳液。表面活性剂在分区和连续相的界面处形成层，并且表面活性剂分子通过形成键来交联，例如表面活性剂连接部分之间直接交联或者通过在表面活性剂分子上的接头部分与接头分子(即中间接头部分)之间形成交联键的一个或多个中间接头部分来间接交联。在某些实施方案中，表面活性剂分子被修饰成包含一个或多个，例如平均1-20个、1-15个、1-10个、2-20个、2-15个、2-10个、2-8个、2-6个、3-20个、3-15个、3-10个、3-8个、3-5个、4-20个、4-15个、4-10个、4-8个、5-20个、5-15个、5-10个、5-9个、6-20个、6-15个或6-10个连接部分。每个表面活性剂的连接部分的最佳数量可取决于交联反应的类型以及在一些情况下接头分子(即中间接头部分)的使用。表面活性剂与连接部分之间的附接可以是任何合适类型的附接，例如共价键或非共价键。在某些实施方案中，表面活性剂分子被修饰成包含两个不同的连接部分；一般而言，使用附接的第一连接部分来制备第一组经修饰的表面活性剂分子，并且使用附接的第二连接部分来制备第二组经修饰的表面活性剂分子。可组合第一组和第二组表面活性剂分子来产生含有多个第一和第二经修饰的表面活性剂两者的组合物。此类经修饰的表面活性剂分子可用于，例如第一连接部分的一部分与第二连接部分的一部分反应以产生直接交联键的反应，或第一连接部分的一部分与中间连接部分反应以产生间接交联键的反应。

在某些实施方案中，表面活性剂分子被修饰成包含一个或多个，例如平均1-20个、1-15个、1-10个、2-20个、2-15个、2-10个、2-8个、2-6个、3-20个、3-15个、3-10个、3-8个、3-5个、4-20个、4-15个、4-10个、4-8个、5-20个、5-15个、5-10个、5-9个、6-20个、6-15个或6-10个(例如平均约6个)生物素部分，并且表面活性剂分子通过添加生物素结合部分(例如链霉亲和素或链霉亲和素衍生物，其与生物素部分结合，因此充当中间连接部分)来交联。中间连接部分，例如链霉亲和素，可以在交联之前以任何合适的量存在；例如，可计算涂覆平均分区的整个表面所必需的交联剂的量，并且可以使用该量的某一百分比，例如1％、5％、10％、20％、50％、70％、100％、120％、150％、200％、300％、400％或500％或它们之间的任何范围，在一些情况下针对可能的分区数量进行调整。在某些实施方案中，表面活性剂是含氟表面活性剂。在某些实施方案中，连续相包括油，例如氟化油。

本文公开的组合物和方法可在任何合适的基于乳液的环境中找到有益的应用，所述应用包括但不限于化学分析，蛋白质和菌株工程，基于核酸、蛋白质和细胞的测定、分选或分离，或化学和/或生化合成，例如减少或消除组合药物合成中小分子在分区之间的转移，高通量药物筛选，单细胞分泌的产物的分析，期望的酶的定向进化，合成细胞的构建，或乳液体系的任何其他合适的用途，特别是不期望实体在分区之间移动的用途。为方便起见，可关于聚合酶链反应数字PCR描述组合物和方法，但本领域技术人员将认识到相同或相似的组合物和方法可在任何合适的乳液体系中使用。

液滴微流体(其中液滴充当单个隔室)已实现广泛的应用，包括但不限于数字PCR，高通量筛选，菌株和蛋白质工程，以及细胞、蛋白质和化学分析。一些实例包括但不限于DNA/RNA扩增(Mazutis等人,A.D.Lab Chip,2009,9,2665-2672；Mazutis等人,Anal.Chem.,2009,81(12),4813-4821)、体外转录/翻译(Courtois等人,Chembiochem.,2008,9(3),439-446)、酶催化(Baret等人,Lab Chip,2009,9(13),1850-1858)和基于细胞的测定(Clausell-Tormos等人,Chem.Biol.,2008,15(8),427-437；Brouzes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2009,106(34),14195-14200)。微液滴的微小尺寸(体积范围为1皮升至1毫升)和相对正交性以及与其各自群体中的其他液滴的隔离有助于以极高的通量(>10⁴个样品/秒)和极大降低的试剂消耗来进行筛选和其他过程。

乳液是第一液相(有时称为“分散相”)在与第一液相基本上不混溶的第二液相(有时称为“连续相”)中的悬浮液。在一些实施方案中，通过将分散相分散到一个或多个连续相中来产生乳液。由于每个相应相的分子对该相中的其他分子的亲和力高于对另一相中的分子的亲和力，在稳定剂不存在的情况下，多于一个的分散相分区合并或聚结成更大的组合分区通常在热力学上是有利的。表面活性剂通常在两种基本上不混溶的流体之间的乳液生产中用作此类稳定剂以防止聚结；在一些实施方案中，这两种基本上不混溶的流体是水相和油。结合微流体技术，已经开发了大量应用来生成、调节、改变和传输稳定且均匀尺寸的油包水(WO)和水包油包水(WOW)以及水包油(OW)和油包水包油(OWO)分区(有时称为“液滴”)，旨在扩展或增强基于乳液的应用。在许多情况下，本文提供的方法和组合物将以WO乳液进行描述，但应理解相同的原理和技术可酌情适用于WOW、OW和WO乳液。

在其中连续相或分散相包括油的实施方案中，可使用任何合适的油，诸如烃油、硅油等。在某些实施方案中，使用氟化油，例如用作连续相和/或用于如本文进一步描述的其他流体组分。氟化油可包含(3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷)、甲基九氟丁醚、甲基九氟异丁醚、乙基九氟异丁醚、乙基九氟丁醚、(戊烷,1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-十氟-3-甲氧基-4-(三氟甲基-))、异丙醇、(1,2-反式-二氯乙烯)、(丁烷,1,1,1,2,2,3,3,4,4-九氟-4-甲氧基-)、(1,1,1,2,2,4,5,5,5-九氟-4-(三氟甲基)-3-戊酮)、(呋喃,2,3,3,4,4-五氟四氢-5-甲氧基-2,5-双[1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)乙基]-)、包含5至18个碳原子的全氟化合物、聚氯三氟乙烯、(2,2,2-三氟乙醇)、Novec 8200^TM、Novec71DE^TM、Novec 7100^TM、Novec 7200DL^TM、Novec 7300DL^TM、Novec 71IPA^TM、Novec 72FL^TM、Novec 7500^TM、Novec 71DA^TM、Novec 7100DL^TM、Novec 7000^TM、Novec 7200^TM、Novec 7300^TM、Novec 72DA^TM、Novec 72DE^TM、Novec 649^TM、Novec 73DE^TM、Novec 7700^TM、Novec 612^TM、FC-40^TM、FC-43^TM、FC-70^TM、FC-72^TM、FC-770^TM、FC-3283^TM、FC-3284^TM、PF-5056^TM、PF-5058^TM、卤化碳0.8^TM、卤化碳1.8^TM、卤化碳4.2^TM、卤化碳6.3^TM、卤化碳27^TM、卤化碳56^TM、卤化碳95^TM、卤化碳200^TM、卤化碳400^TM、卤化碳700^TM、卤化碳1000N^TM、Uniflor 4622R^TM、Uniflor 8172^TM、Uniflor 8472CP^TM、Uniflor 8512S^TM、Uniflor 8731^TM、Uniflor 8917^TM、Uniflor 8951、TRIFLUNOX 3005^TM、TRIFLUNOX 3007^TM、TRIFLUNOX 3015^TM、TRIFLUNOX 3032^TM、TRIFLUNOX3068^TM、TRIFLUNOX 3150^TM、TRIFLUNOX 3220^TM或TRIFLUNOX 3460^TM。在某些实施方案中，氟化油包括(3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷)；(呋喃,2,3,3,4,4-五氟四氢-5-甲氧基-2,5-双[1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)乙基]-)和/或包含5至18个碳原子的全氟化合物，并且含氟表面活性剂包含通过脲键、酰胺键或醚键连接到碳氟化合物部分的聚乙烯部分。

适合其各自的油的表面活性剂通常是形成稳定乳液所必需的。由于表面活性剂的非极性端在氟化油中的溶解度低，传统的表面活性剂通常不适用于稳定氟化油中的水相的乳液。此外，与标准体系相比，它们通常对生物分子和细胞有毒，从而导致分区中的活性损失或改变。

已开发出适用于稳定乳液的氟化表面活性剂，这会减少毒性问题。然而，在含氟表面活性剂化学性质的进步已经实现分区稳定性的显著提高的情况下，存在许多应用，其中进一步改良WO和WOW乳液的稳定性可允许新应用的开发。一些实例包括在高剪切力环境中、在高温下、在电场(例如静电或其他电位)存在的情况下和/或伴有通常使分区界面不稳定的特定水相制剂的情况下，处理更大的分区(例如，等效球直径为>5um、>10um、>20um、>30um、>40um、>50um、>60um、>80um、>70um、>100um、>200um、>500um)的能力。此外，需要进一步改进两相之间或界面处的分子的扩散和/或吸附。

因此，在某些实施方案中，表面活性剂是氟化表面活性剂。在某些实施方案中，含氟表面活性剂包含低聚乙二醇、TRIS或聚乙二醇部分。在某些实施方案中，含氟表面活性剂包含碳氟化合物和/或碳氯氟化合物部分。在一些实施方案中，含氟表面活性剂具有通过醚键、酰胺键或脲键连接的头部和尾部。在某些实施方案中，含氟表面活性剂具有通过脲键、醚键或酰胺键连接到碳氟化合物部分的聚乙二醇部分。氟化表面活性剂包括但不限于Picosurf-1、Ran FS-008、FC-4430、FC-4432、FC-4434。在某些情况下，含氟表面活性剂可包含使用脲键、酰胺键或醚键连接到碳氟化合物部分的聚乙烯部分。在其中生物素被用作连接部分的某些实施方案中，示例性含氟表面活性剂(包括生物素)是来自RanBiotechnologies的FS-生物素。参见，例如，美国专利申请公布号20180112036。含氟表面活性剂在氟化油中的浓度可介于0.01％重量/体积至5％重量/体积之间。在某些实施方案中，含氟表面活性剂浓度范围为0.5％至2％重量/体积，诸如0.5％-1.5％。一般而言在本文中，表面活性剂浓度表示为连续相中表面活性剂的百分比，例如，当连续相流入分配器以产生分散相的分区时，连续相中表面活性剂的百分比。

在其中使用氟化油和/或含氟表面活性剂的实施方案中，具有用于加工乳液的氟化的系统表面(例如在加工期间与乳液接触的表面的至少80％、90％、95％或99％)是有利的，以便减少例如分区在表面处的潜在滞留。因此，在某些实施方案中，通道的表面(例如系统中的导管)包含含氟聚合物，至少一个连续相包括氟化油，并且分散相对含氟聚合物表面的亲合力低于氟化油。此处和本文别处，含氟聚合物可以是任何合适的含氟聚合物，诸如聚四氟乙烯(PTFE)、三氟氯乙烯(CTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、全氟烷氧基聚合物(PFA)、氟化乙丙烯(FEP)或它们组合。在一些实施方案中，导管的表面包含亲水材料，至少一个连续相是亲水的，并且分散相是疏水的。在另一个实施方案中，分散相是油。

在某些实施方案中，氟化油包括(3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷)；(呋喃,2,3,3,4,4-五氟四氢-5-甲氧基-2,5-双[1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)乙基]-)和/或包含5至18个碳原子的全氟化合物，并且含氟表面活性剂包含通过脲键、酰胺键或醚键连接到碳氟化合物部分的聚乙烯部分。

在一个实例中，通过考虑分散相的分区的集合来执行数字测定。在此类测定中，感兴趣的分析物在产生时分布在分区中，并且测量每个分区的特性允许确定该分区是否包含最少量的感兴趣的分析物。在一些实施方案/实例中，通过将测量为含有感兴趣的分析物和/或不含感兴趣的分析物和/或含有一定量的感兴趣的分析物的分区数量与分区间分析物的潜在统计分布相关联，可确定原始分析物的特性。在一个实施方案中，所述特性是浓度(诸如摩尔浓度或体积浓度)或浓度的任何其他合适的表达。

聚合酶链反应(PCR)是用于在体外扩增期望的核酸的方法。通过仔细测量扩增速率，可使用标准参考对核酸的初始浓度进行量化。然而，许多因素使初始量的推算复杂化，包括但不限于(1)PCR效率较差、(2)起始模板浓度低、(3)反应终止、以及(4)副产物形成。此外，参考材料与目标核酸之间扩增效率的差异可能使实际浓度的推导有偏差。

例如，使用以微流体方式生成的分区执行的数字PCR(“dPCR”)通过将样品分散成许多较小的反应来改进当前量化DNA模板的PCR实践。利用微流体装置对分散相进行分散，产生体积范围为毫升至飞升的高度均匀尺寸的分区群体。通过将样品分散成足够的分区(其中至少有一个分区无模板)，并行执行隔室化的扩增，然后计算含有模板和不含模板的分区数，可使用泊松统计(Poisson statistics)来计算目标DNA的浓度。由于不需要定量参考，dPCR消除了核酸定量中的主要错误来源。通过增加给定分区内模板的初始体积浓度，dPCR可进一步提高稀有目标检测的精度。例如，当反应被分散成20,000个相同尺寸的分区时，溶液中的1个模板的浓度会增加20,000倍。模板浓度的此类增加可能导致那些稀有DNA片段的化学反应动力学和扩增效率增加。出于同样的原因，稀有目标检测也可从稀有目标与复合背景的比率变化中受益。随着模板浓度的增加，可影响反应的抑制分子的浓度相对降低，从而对那些抑制分子的影响提供附加阻力。

数字测定的准确性取决于，除其他因素外，系统能够生成的分区的数量，乳化的样品的百分比，所得的分区在处理、孵育和分析时的稳定性，以及感兴趣的分区中的水相成分和报告分子的保持性。在一些情况下，报告分子的流入是有益的[Prodanovic等人,2011,Combinatorial Chemistry&High Throughput Screening]。例如，DNA检测分子(诸如嵌入剂)从油相到水相的选择性转移可能是期望的。这种类型的转移可相对地消除由于水相中试剂量有限而导致的检测上限。因此，本文提供的某些实施方案涵盖了增加稳定性并减少分区聚结以及降低或选择性地限制相和/或分区之间的分子扩散的创新。

一般而言，本文提供的组合物和方法可在乳液体系中使用，其中期望减少或消除组分从一个分区到连续相并且通常到另一个分区的运动，和/或调节进出所选组分的分区的运动。不受理论的束缚，认为组分的分区间运动可通过以下发生：聚结，其中两个或更多个分区连接在一起形成更大的分区，从而混合每个分区的内容物；通过反胶束形成和运动；以及通过组分从分区中直接扩散到连续相中，并且通常回到其他分区中。另选地或除此之外，本文提供的用于交联表面活性剂的组合物和方法可使分区与连续相之间的表面活性剂界面更加稳健；因此，分区更能耐受，例如苛刻的反应条件或在交联不存在的情况下使分区不稳定的分区内的组分。

为了稳定乳液以防止聚结，使用表面活性剂来降低界面张力并因此降低吉布斯自由能，提供空间或静电斥力，增加膜排液时间，或增加表面弹性。乳化剂通常是两亲性分子，包含可溶于两相中的每一个的基团。当存在于单一溶剂(水性或油)中时，它们形成胶束结构。在分区形成和分区界面生成时以及分区形成和分区界面生成后的一段时间内，胶束分散并吸附到油水界面。

根据表面活性剂的特定化学性质，表面活性剂可能更易溶于水相或油相。在一些情况下，表面活性剂在任一相中形成胶束，并且在分区界面形成时，胶束解离并且表面活性剂分子将自身嵌入分区界面中。由于表面活性剂是两亲性的并且具有至少两个溶解性相反的基团，尾部和头部基团与其各自的溶剂缔合。这种与界面的缔合导致分区稳定性提高。胶束态与界面态之间达到的各自溶解度平衡可能在分区稳定性和界面完整性方面发挥作用。

通过降低表面活性剂在两相中的一个中的溶解度，可以化学方式加剧聚结。在一些实例中，溶解度的此类降低可通过pH调整或通过添加与表面活性剂、油或水溶液相互作用的化学物质或改变表面活性剂、油或水溶液的化学组成的化学物质来实现。

化学品从连续相到分散相的转移或在连续相中的分区之间的转移可能由表面活性剂在胶束态与界面态之间的动态平衡驱动。

由于在大多数分区应用中，许多促进分区不稳定性的力不容易改变，因此用于提高分区稳定性的新方法将例如增加排液时间并且在高温、机械力(例如剪切力)、电场和/或许多生物技术制剂中存在的化学试剂存在的情况下稳定表面活性剂。

定义

如本文所用，术语“乳液”包括两种不混溶流体的混合物，使得两相中的一个(分散相)形成包含在第二(连续)相内的单独分区。常见的乳液可以是悬浮在水或水相中的油(OW)，或悬浮在油中的水(WO)。其他常见的乳液可以是多重乳液，如水包油包水(WOW)或油包水包油(OWO)。

如本文所用，术语“乳液分层”包括将乳液分隔成两种乳液，其中一种(乳状物)在分散相中比另一种更丰富。乳液分层可能是聚结的前兆。

如本文所用，术语“沉淀”包括分区由于两相之间的密度差异而从乳液中沉降。沉淀可能是聚结的前兆。

如本文所用，术语“絮凝”包括乳液中的分区在不改变表面积的情况下聚集在一起。该术语与聚集可互换。

如本文所用，术语“奥斯特瓦尔德熟化”包括较小分区与较大分区合并以便达到更热力学稳定的状态的现象，其中表面积与面积之比被最小化。

如本文所用，术语“聚结”包括两个或更多个分区的融合以形成更大的分区。

如本文所用，术语“表面活性剂”包括趋于降低溶解所述表面活性剂的液体的表面张力从而帮助稳定乳液的物质。如本文所用，“表面活性剂分子”和“表面活性剂部分”通常是同义词，并且可包括在其结构中具有多于一个分子的表面活性剂。

如本文所用，术语“双子表面活性剂”包括在两个表面活性剂分子之间含有间隔单元的二聚表面活性剂。

如本文所用，术语“氟化的”包括含有一个或多个氟原子的任何基团或物质。一般来讲，基团或物质含有多个氟原子。例如，氟化油是指任何含有氟原子的油，包括但不限于部分氟化烃、全氟化碳、氢氟醚和它们的混合物。

如本文所用，术语“含氟表面活性剂”包括具有至少一个碳氟化合物部分的任何化学表面活性剂。

如本文所用，“交联剂”包括能够连接两个或更多个表面活性剂分子，从而导致在分区界面处形成分子网络的液相之一的组分。

如本文所用，表面活性剂分子(例如在连续相中的分散相的分区的界面处的表面活性剂分子)的“交联”是指在表面活性剂分子之间形成键。键可以是共价的或非共价的，并且在没有表面活性剂分子的修饰的情况下，表面活性剂分子之间通常不会形成键或不会以任何实质性的程度形成键。修饰可包括向表面活性剂分子添加一个或多个连接部分，然后表面活性剂分子直接或间接交联，和/或将表面活性剂分子暴露于适合在表面活性剂分子之间形成交联的条件。一般来讲，除非上下文另有明确说明，否则如本文所用，“交联”是指使用附接到含氟表面活性剂分子的连接部分，而不是使用表面活性剂分子的头部或尾部的修饰。

如本文所用，术语“分散水相”包括可包含一种或多种感兴趣的分析物的水基溶液。在一些实施方案中，分散水相包含至少一种化学试剂并且充当用于至少一种化学反应的离散反应容器。包含分散水相的系统可另外包括可测量至少一种离散反应容器中的至少一种化学反应的特性的检测器。在一些实施方案中，分散水相可包含感兴趣的分析物，并且至少一种化学反应的特性可与感兴趣的分析物的特性相关。在一些实施方案中，测量本质上是数字，因为测量的潜在结果可由离散集表示。在另外的实施方案中，高于或低于阈值的至少一个测量值确定至少一个离散反应容器是否含有感兴趣的分析物。在其他实施方案中，测量本质上是模拟，因为测量的潜在结果由值的连续范围表示。在一些实施方案中，水相可包含如下所述的缓冲剂、盐、分析物、稳定剂、表面活性剂、染料或它们的任何组合。

如本文所用，术语“连续相”包括与分散相基本不混溶的液体，并且分区在分散相分散之前、期间或之后存在于所述连续相中。连续相可指用于将分散相分散为分区的不混溶相或分区在形成后交换成的新的不混溶相。

如本文所用，术语“稳定剂”包括一大类分子，其可包括防腐剂、帮助维持或增强酶的稳定性或活性的分子、帮助抑制或灭活特定类型的酶的分子，例如表面活性剂、金属离子、糖、拥挤剂、DNA酶或RNA酶抑制剂。

如本文所用，术语“稳定性”包括分区界面的维持，其导致液滴破裂和/或聚结的减少和/或分子通过分区界面的扩散的修改(诸如反胶束形成减少)，并且导致分子跨界面的扩散增加或减少；扩散是增加还是减少取决于具体分子和分区界面的性质。

如本文所用，术语“试剂盒”包括旨在一起使用的物品的集合。试剂盒中的物品可互相有效连接也可不互相有效连接。试剂盒可包含例如试剂、缓冲剂、酶、抗体和专门用于此目的的其他组合物。试剂盒还可包含使用说明以及用于数据分析和解释的软件。试剂盒还可包含用作规范标准品的样品。通常，试剂盒中的物品包含在初级容器(诸如小瓶、管、瓶子、盒子或袋子)中。单独的物品可包含在它们自己的、单独的容器中或包含在同一个容器中。试剂盒中的物品或试剂盒的初级容器可组装到次级容器(例如盒子或袋子)中，其任选地被调整用于商业销售，例如用于储存，或通过公共载剂用于运输(诸如邮寄或送货服务)。

图1示出了乳液的形成。分散相液体[101]被分散到连续相液体[102]中。所得乳液含有溶解在连续相[102]的主体液体中的多个分散相分区[103]。每个分区[103]包含部分体积的初始分散相液体并且包含分散相液体与主体连续相液体之间的界面[104]。

分区[103]的横截面直径范围可等于1皮升至1毫升范围内的球形体积，例如1pL-1mL、1pL-100uL、1pL-10uL、1pL-5uL、1pL-1uL、1pL-100nL、1pL-10nL、1pL-1nL、1pL-100pL、1pL-10pL、10pL-1mL、10pL-100uL、10pL-10uL、10pL-5uL、10pL-1uL、10pL-100nL、10pL-10nL、10pL-1nL、10pL-100pL、100pL-1mL、100pL-100uL、100pL-10uL、100pL-5uL、100pL-1uL、100pL-100nL、100pL-10nL、100pL-1nL、1nL-1mL、1nL-100uL、1nL-10uL、1nL-5uL、1nL-1uL、1nL-100nL、1nL-10nL。

分区界面[104]可通过稳定剂(例如表面活性剂)进行稳定。稳定剂可赋予液滴界面物理稳定性，从而减少分区聚结和/或破裂的发生。稳定剂还可赋予界面完整性，从而导致分子跨界面的转移受到控制或减少。

分散相液体[101]可以是亲水液体(例如水性液体)、疏水液体或亲氟液体。根据分散相液体[101]的组分，连续相液体[102]也可以是亲水液体(例如水性液体)、疏水液体或亲氟液体。连续相液体[102]与分散相液体基本上不混溶以形成乳液。

图2是两个或更多个分区[201]的聚结的示意图，所述聚结产生具有与两个或更多个起始分区的组合体积相等的聚结后体积的单个分区[204]。

在分区聚结中，两个或更多个起始分区[201]每个都包含被主体连续相外部包围的分散相液体内部。分区界面[202]存在于分散相和连续相液体的交汇处。两个或更多个起始分区[201]可具有或可不具有通过稳定剂稳定的界面[202]。合适的稳定剂可包括表面活性剂。

在一些情况下，两个或更多个起始分区[201]可进入高接近度和高能量的状态，导致分隔两个或更多个分区[201]的连续相流体完全损失。连续相流体的损失和表面能的存在导致分区界面[202]的不稳定化和两个或更多个分区界面[203]的融合，两个或更多个分区在界面上聚结，形成体积等于两个或更多个初始分区[201]的组合体积的所得的分区[204]。

不受理论的束缚，认为各种现象可导致乳液的物理不稳定：乳液分层、沉淀、絮凝、转相、奥斯特瓦尔德熟化，其中任一项或全部可导致聚结或增加聚结的可能性。不稳定性的机制取决于分区尺寸、尺寸分布、乳化剂的量和类型、两相的互溶性、搅拌、温度和pH。例如，聚结由乳液的高表面自由能(ΔG)引起，高表面自由能在能量上是不利的。因此，体系趋向于减少总界面能(ΔA)，这意味着分区趋于不稳定并回到其未混合状态：ΔG＝γΔA。其中γ代表界面张力，并且体系能量几乎总是正值[McClements,2015,Food Emulsions:Principles,Practices,and Techniques,第三版]。

如图2所示，在一些情况下，随着分区之间的界面膜排液，分区聚结，从而允许完全去除分隔两个或更多个分散相分区的连续相屏障。在此模型中，聚结取决于至少以下两个参数：接触时间和膜排液。当接触时间超过膜排液时间时，意味着两个或更多个分区互相接触的时间足够长以致于所有油从它们之间排出，分区可能会破裂，从而导致聚结。由于分散相与连续相之间的压力差，毛细压力引起膜排液。由膜表面之间的范德华力(van deWaals)、空间和静电相互作用产生的分离压可能会减慢或阻止膜排液。

通过增加体系中的能量或通过温度变化或剪切力迫使分区更紧密接触，可以机械方式加剧聚结。

图3示出了分子跨分区界面[302]转移的两种模式的示意图。分子转移可从分区内部[301]到连续相流体发生或从连续相流体到分区内部[301]发生。在一些情况下，转移可能在两种方向发生，而在一些情况下，转移可能偏向两种转移方向中的一种。在产生可忽略不计的总浓度梯度的足够长的时间段之后，转移可以静态或动态平衡存在。

在第一种情况下，分子转移受扩散控制。溶解在分区内部[301]中的分子[303]可跨分区界面[302]扩散到主体连续相中或者从主体连续相跨分区界面[302]扩散到分区内部[301]中。然后主体连续相[304]中的所得分子可跨分区界面扩散回液滴内部[301]中。

连续相[304]中的分子可转移穿过乳液中任何分区的界面，导致分子在乳液中的分区之间的潜在转移，即，一个分区中的分子可移动到第二个分区。

在第二种情况下，分子转移受以下的控制：主体连续相中的表面活性剂胶束[305]的形成、表面活性剂胶束与分区界面的融合以及回到连续相中的新表面活性剂胶束的产生和释放。胶束是表面活性剂分子的聚集体，在胶束在疏水溶剂中的情况下，表面活性剂分子的头部基团在胶束内部相互作用。

嵌入分区界面[302]中的表面活性剂和嵌入主体连续相液体中的胶束[305]中的表面活性剂在动态平衡中不断交换。在这种动态平衡中，表面活性剂胶束[305]将与分区界面融合，然后胶束中的表面活性剂将自身嵌入分区界面[302]中。由于表面活性剂分子存在固定的表面积，胶束的融合将导致表面活性剂分子在分区界面[302]的某处发生位移。这种位移会导致形成具有相同或不同表面活性剂分子的新表面活性剂胶束[306]。此过程称为反胶束形成。

溶解在分区内部[301]中的分子[303]可在胶束形成时被捕获在新形成的胶束的内部。这些被胶束捕获的分子[307]现在有效地溶解在主体连续相中。然后分子填充的胶束[306]可永久地保持在连续相中或与乳液中的任何合适的分区缔合。

在这种情况下，分子转移不受扩散原理的控制，而是基于尺寸和反胶束形成的相对动力学以及乳液中的表面活性剂浓度。

在一些实施方案中，降低温度、增加连续相粘度并减少分区-分区接近度可降低分子从分区内部转移到外部的效率，或反之亦然。

图4示出了在乳液中的单独分区之间的两种分子转移模式(扩散和胶束形成)的另一个示意图。

在第一种情况下，第一分区包含主体连续相内的一定体积的分散相液体[401]。分区界面[402]存在于分散相液体[401]和主体连续相液体的交汇处。分区界面[402]可通过或可不通过稳定剂(诸如表面活性剂)进行稳定。在同一乳液中，一个或多个额外的分散相分区还存在于主体连续相中。额外的分散相分区还包括分散相内部[405]和第二分区界面[404]。存在于第一分区[403]中的分子可通过或可不通过扩散转移来跨第一分区界面[402]转移至主体连续相液体中。然后转移到主体连续相中的分子可自由地穿过主体连续相。然后在触及第二分区时，连续相分子[403]可转移穿过第二分区的界面[404]并进入第二分区的分散相内部[405]。

在第二种情况下，分子转移受主体连续相中表面活性剂胶束[406]的形成控制。胶束是表面活性剂分子的聚集体，其分散相可溶性基团在胶束内部相互作用。

嵌入分区界面[402]中的表面活性剂和嵌入主体连续相液体中的胶束[406]中的表面活性剂在动态平衡中不断交换。在这种动态平衡中，表面活性剂胶束[406]将与分区界面融合，并且胶束中的表面活性剂将自身嵌入分区界面[402]中。由于表面活性剂分子存在固定的表面积，胶束的融合可导致表面活性剂分子在分区界面[402]的某处发生位移。这种位移将导致形成具有相同或不同表面活性剂分子的新表面活性剂胶束[407]。此过程称为反胶束形成。

溶解在分区内部[401]中的分子[403]可在胶束形成时被捕获在新形成的胶束[407]的内部。这些被胶束捕获的分子[403]现在有效地溶解在主体连续相中。然后分子填充的胶束[403]可永久地保留在连续相中，与第一分区缔合，或者将自身嵌入第二分区的界面[404]中，从而有效地将分子[403]从第一分区释放到第二分区的分散相内部[405]。

通过扩散或反胶束从液滴到液滴的分子转移意味着在很长一段时间内，分子将趋于达到平衡状态。这种类型的分子传输可能对使用分区作为隔离反应容器的能力具有不期望的影响，因为能够通过这些方式转移的分子不再受到其初始分区的限制，并且例如，在一个反应容器分区中生成的可检测标记不一定会与生成它的分区保持缔合。

在一些情况下，降低温度、增加连续相粘度并减少分区-分区接近度可降低分子从分区内部转移到外部的效率，或反之亦然。

图5示出了表面活性剂交联的实施方案。表面活性剂交联是指通过一种或多种以物理方式连接的交联剂的相互作用和/或化学反应在嵌入分区界面中的表面活性剂之间形成连接[501和502]。

表面活性剂通常是两亲性分子，其包含两个或更多个可溶于连续相或分散相流体的连接的部分。在上图中，部分A和部分B是指可溶于相反流体的表面活性剂的基团。例如，如果部分A优先可溶于连续相，那么部分B优先可溶于分散相。例如，如果部分B优先可溶于连续相，那么部分A优先可溶于分散相。

交联可发生在表面活性剂分子的头部(即优先可溶于连续相并与连续相接触的部分)之间、表面活性剂分子的尾部(即优先可溶于分散相并且面对分区内部的部分)之间、表面活性剂分子的其他部分之间或它们的组合。

嵌入分区界面中的表面活性剂分子的交联导致在界面处形成表面活性剂网络，所述表面活性剂网络促进表面活性剂分子在表面的保留，从而与其中表面活性剂颗粒未交联的分区相比，有效增加分区的稳定性。即使在接触时间长、温度高和pH变化的应用中，或者在使其中表面活性剂微粒未交联的分区不稳定的化学品存在的情况下，这也可帮助保留围绕每个分区的连续相膜。交联可以是自发的或诱导的，可使用单组分体系或多组分体系形成，并且交联的程度可从部分到全部变化。在某些实施方案中，与另一种反应物上的另一个交联部分相互作用的表面活性剂上的交联部分是与提供表面活性剂的两亲性质的部分A和部分B分隔的部分，即它们是附加到表面活性剂的头部或尾部的，并且不是头部或尾部的一部分。

图6示出了交联的程度可从部分到全部变化。

在图6a中，已实现全部交联。在本实施方案中，分区[601]包括被表面活性剂分子[602]饱和的分区界面。每个表面活性剂分子通过交联键[603]与至少一个其他表面活性剂分子连接，从而在那些表面活性剂分子之间产生连接。分区界面中的每个表面活性剂分子与其他相邻的表面活性剂分子连接，从而在分区界面处形成全部互连的表面活性剂网络。当分区界面的相邻表面活性剂分子的100％或基本上100％交联在一起时，就发生了全部交联或完全交联。在图6a的情况下，每个表面活性剂分子有5个相邻分子，并且当全部或基本上全部的表面活性剂分子与其全部5个相邻分子键合时，就实现了完全交联。除此之外或另选的，如果表面中的表面活性剂的一部分是荧光的，并且由于未交联的表面活性剂可在表面周围自由移动，那么一旦实现交联，那些荧光表面活性剂将被固定在适当的位置。在FRAP中，将样品上的一个点光漂白，然后观察染料移回该光漂白区域。在反胶束的情况下，可漂白整个液滴，并且如果正在发生反胶束，那么漂白的表面活性剂将离开，然后新的荧光表面活性剂会进来。在一些情况下，与在没有交联的情况下制备的液滴(但其他方面相同)的时间相比，可使用染料移回光漂白点的时间和/或荧光分子移至整个光漂白液滴的时间。在某些实施方案中，表面活性剂网络为1％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％或99％-100％交联的。

在一个单独的实施方案中，已经实现了部分交联。在本实施方案的一个实例中(图6b)，分区[604]包含被表面活性剂分子饱和的分区界面。分区界面中表面活性剂之间的连接数的范围为基于与表面活性剂相邻的表面活性剂分子数的0个连接(0％完全)至最大数的连接(100％完全)。表面活性剂分子可能没有与相邻表面活性剂[605]的连接。可通过相邻表面活性剂的交联来实现表面活性剂网络。然而，在一些情况下，该网络的范围可能不涵盖整个分区界面。这可能在尺寸为例如2个表面活性剂[606]到大于两个表面活性剂的更大的“筏”[607]的表面活性剂“筏”的范围内。

图7示出了嵌入分区界面中的表面活性剂可能在物理几何形状上有所不同。这是表面活性剂几何结构的非限制性列表。

在一个实例中，表面活性剂[702、703和705]是相对线性的分子，具有可溶于连续相或分散相流体的表面活性剂的一部分和可溶于相对流体的表面活性剂的另一部分。一种表面活性剂几何结构可包括具有可溶于分散相的大的部分和可溶于连续相的小的部分的表面活性剂[702]。第二种表面活性剂几何结构可包括具有可溶于分散相的小的部分和可溶于连续相的大的部分的表面活性剂[703]。第三种表面活性剂几何结构可包括可溶于它们各自的相中的相同尺寸的部分[705]。这些部分可大可小。

在第二个实例中，表面活性剂[701和704]是弯曲的分子，具有两个或更多个可溶于连续相或分散相流体的外部区域和可溶于相对相的内部区域。这些表面活性剂可称为双子表面活性剂。一种表面活性剂几何结构可包括具有可溶于分散相的外部部分和可溶于连续相的内部部分的表面活性剂[701]。第二种表面活性剂几何结构可包括具有可溶于分散相的内部部分和可溶于连续相的外部部分的表面活性剂[705]。

任何表面活性剂几何结构均可用于表面活性剂交联。表面活性剂几何结构的组合可用于表面活性剂交联。一般优选的是连接部分附接到表面活性剂分子的将容易接近交联组分或条件的部分；例如连接部分(例如生物素)可附接到表面活性剂分子的亲水头部，并且引发或促进连接部分交联的一种或多种组分(例如中间连接部分，诸如链霉亲和素)可存在于水性分散相中，当分区形成时亲水头部优选地位于水性分散相中。在另一个实例中，连接部分附接到表面活性剂分子的疏水尾部，所述疏水尾部将易于接近例如疏水连续相中的交联组分，使得此类组分位于尾部基团将暴露于的连续相中。例如亲水连续相和疏水分散相的其他组合是显而易见的。

图8示出了通过修改分区界面的化学特性来控制分子转移的实施方案。调节分区界面处的化学性质将选择性地减少具有非互补化学性质的分子跨分区界面的转移。

在一个实例中(图8a)，分区包含分散相内部[801]、连续相外部和高度带电的交联分区界面[802]。具有疏水性质[804]和或亲水性质[803]的分子可表现出不同的跨分区界面的传输。特别地，由于带电交联分区的高度亲水性质，疏水分子极不可能跨过分区界面。亲水分子可或多或少地可能跨过，这取决于它的电荷是全电荷(离子)还是部分电荷(由于组成原子的电负性不同)；在任一种情况下，如果分子的电荷与交联分区的电荷相同，由于静电排斥，分子跨过的可能性将较小，然而如果分子的电荷与交联分区的电荷相反，由于静电吸引，分子跨过的可能性将较大。

在第二个实例中(图8b)，分区包含分散相内部[805]、连续相外部和高度疏水的分区界面[806]。具有疏水性质[804]和或亲水性质[803]的分子可表现出不同的跨分区界面的传输。特别地，与亲水分子相比，疏水分子将优先穿过界面。

图9示出了通过抑制反胶束形成来减少分子转移的实例。在这种情况下，分子转移受主体连续相中表面活性剂胶束[906]的形成控制。胶束是表面活性剂分子的聚集体，其分散相可溶性基团在胶束内部相互作用。

图9a示出了未交联的表面活性剂界面的实例。嵌入分区界面[902]中的表面活性剂和嵌入主体连续相液体中的胶束[904]中的表面活性剂在动态平衡中不断交换。在这种动态平衡中，表面活性剂胶束[904]将与分区界面融合，并且胶束中的表面活性剂将自身嵌入分区界面[902]中。由于表面活性剂分子存在固定的表面积，胶束的融合将导致表面活性剂分子在分区界面[902]的某处发生位移。这种位移将导致形成具有相同或不同表面活性剂分子的新表面活性剂胶束[905]。此过程称为反胶束形成。

溶解在分区内部[901]中的分子[903]可在胶束形成时被捕获在新形成的胶束[905]的内部。这些被胶束捕获的分子[903]现在有效地溶解在主体连续相中。然后分子填充的胶束[905]可永久地保留在连续相中，与第一分区缔合，或者将自身嵌入第二分区的界面中，从而有效地将分子[903]从第一分区释放到第二分区的分散相内部。

通过扩散或反胶束从液滴到液滴的分子转移意味着在很长一段时间内，分子将趋于达到平衡状态。这种类型的分子传输可能对使用分区作为隔离反应容器的能力具有负面影响，因为能够通过这些方式转移的分子不再受到其初始分区的限制，并且在一个反应容器分区中生成的可检测标记不一定会与生成它的分区保持缔合。此外，当分子(例如分区中的反应物)在化学反应中用完时，外部分子向分区中扩散的浓度梯度更大，并可导致分子进一步流入分区。

通过表面活性剂分子的物理连接来抑制反胶束形成可有效地减少或消除通过这种过程的分子转移(图9b)。在这种情况下，分区包含分散相内部[907]、分区界面[909]、界面的表面活性剂之间的交联[908]以及溶解在分散相内部[907]中的分子[903]。由于表面活性剂已在分区界面处形成了表面活性剂网络，因此溶解于连续相的表面活性剂胶束[904]由于空间限制不可将自身嵌入分区界面中，并且来自分区界面的胶束不可形成新的胶束并进入连续相，因为它们被其相邻的连接的表面活性剂以物理方式限制在分区界面上。

图10示出了通过对表面活性剂网络孔隙度的基于尺寸的限制来控制分子转移的实例。在本实例中，交联的表面活性剂网络的特定几何结构产生了具有限定孔隙度的网络，其充当受控的分子转移的分子筛。

分区[1001]包含分散相内部、连续相外部、分区界面、嵌入界面中的表面活性剂[1002]、相邻表面活性剂之间的交联键[1003]以及基于表面活性剂交联键的化学和物理特性的限定尺寸的孔[1004]。在本实例中，体积适合穿过那些孔[1004]的分子[1005]可基于扩散原理进入和离开分区。体积不适合穿过孔[1004]的分子[1006]不可进入或离开分区。

图11示出了不同接头尺寸(即交联剂长度)的影响。

交联剂尺寸(即长度)范围可从小到大(即从短到长)。因此，交联剂长度可改变分区界面处的交联的特性。长度太短的交联剂[1101]不可有效地触及相邻的表面活性剂分子，从而导致抑制交联键的形成。长度过长的交联剂[1103]可与更多的表面活性剂分子交联，从而产生松散的表面活性剂网络。

因此，对于特定的交联应用，可将交联剂长度调整为合适的尺寸[1102]。在某些实施方案中，交联剂长度(例如通过连接每个分子上的连接部分而形成的两个表面活性剂分子之间的最终连接的长度，在一些情况下所述连接是直接连接而在一些情况下是通过中间连接部分的间接连接)被选择成表面活性剂的头部基团的最长尺寸或表面活性剂的尾部基团的最长尺寸的0.1-100倍、0.1-50倍、0.1-30倍、0.1-20倍、0.1-10倍、0.1-5倍、0.1-3倍、1-100倍、1-50倍、1-30倍、1-20倍、1-10倍、1-5倍或1-3倍。一般来讲，在本文中，“头部基团”是指表面活性剂的亲水部分，而“尾部基团”是指疏水部分。为简化术语，此命名用于亲水连续相中的疏水分散相分区(亲水头部基团从分区向外朝向连续相，疏水尾部基团向内朝向疏水分散相)和疏水连续相中的亲水分散相分区(亲水头部基团从分区向内朝向分区内的亲水分散相，疏水尾部基团向外朝向疏水连续相)。在某些实施方案中，交联剂的长度为0.1-100nm、0.1-50nm、0.1-30nm、0.1-20nm、0.1-10nm、0.1-5nm、0.1-3nm、1-100nm、1-50nm、1-30nm、1-20nm、1-10nm、1-5nm或1-3nm。

图12示出了交联剂数量(即每个表面活性剂分子的连接部分数量)对交联程度的影响。在表面活性剂不含交联剂(即不含连接部分)的情况下，不可形成表面活性剂连接。参见图12a。在表面活性剂带有单个交联剂(即单个连接部分[1201])的情况下，可连接最多两个相邻的表面活性剂。参见图12b。在表面活性剂带有多于一个交联剂[1202]的情况下，多个相邻的表面活性剂可在整个分区界面交联。参见图12c。

图13示出了表面活性剂部分的头对头交联和尾对尾交联；部分A是表面活性剂的头部基团，而部分B是尾部基团。图13a示出了通过交联剂(1301)的头对头交联；图13b示出了通过交联剂(1302)的尾对尾交联。

图14示出了两种不同表面活性剂分子上的连接部分之间的直接交联。图14a示出了每个表面活性剂部分(1402和1403)上的相同连接部分(1401)，其中表面活性剂部分1402和1403可相同或不同。图14b示出了第一表面活性剂部分1405上的第一连接部分1404和第二表面活性剂部分1407上的第二连接部分1406，其中第一和第二连接部分不同并且其中第一和第二表面活性剂部分可相同或不同。两个连接部分之间的附接可以是共价的或非共价的。

图15示出了两个表面活性剂部分通过离子键的交联。在一些情况下，表面活性剂部分1501和1502的头部基团(部分A)具有相反的电荷。在一些情况下，表面活性剂部分1503和1504的尾部基团(部分B)具有相反的电荷。电荷可按原样存在于表面活性剂部分中，或者可通过将一个或多个带电基团附接到表面活性剂来产生和/或增强电荷。

图16示出了两个表面活性剂部分之间通过一个或多个中间连接部分的间接交联。图16a示出了第一表面活性剂部分1603和第二表面活性剂部分1604，它们可相同或不同，其中连接部分1601通过中间连接部分1602间接交联。图16b示出了第一表面活性剂部分1608，其中第一连接部分1605通过中间连接部分1607附接到第二表面活性剂部分1609的第二连接部分1606。图16c示出了第一表面活性剂部分1612和第二表面活性剂部分1613，每个都具有连接部分1610，其中多个中间部分1611与连接部分1610附接。图16d示出了中间连接部分1616，其被配置成附接到多个表面活性剂连接部分；在本实例中，存在具有第一连接部分的第一表面活性剂部分1614、具有第二连接部分的第二表面活性剂部分1615、具有第三连接部分的第三表面活性剂部分1616、具有第四连接部分的第四表面活性剂部分1617，其中第一、第二、第三和第四表面活性剂部分通过它们各自的连接部分与中间连接部分1616的附接而交联。第一、第二、第三和第四表面活性剂部分可相同，或者它们中的一个或多个可与其他表面活性剂部分不同，或者它们的任何组合。第一、第二、第三和第四连接部分可相同，或者它们中的一个或多个可与其他连接部分不同，或者它们的任何组合。

无论分区是汇聚到某种类型的容器中还是在流体通路内部保持运动，一般来讲，本文所公开的组合物和方法的目的是通过加强分区界面来提高乳液中分区的稳定性。这种稳定性的增加可导致分区聚结减少。另选地或除此之外，增加的稳定性抑制分子流出分散相并流入连续相、从连续相流入分散相或从一个分区流到另一个分区。来自连续相或进入连续相或者从分区到分区的分散成分交换可能是不期望的，因为它会影响或模糊每个分区中特定分析物的测量。在一些情况下，本文公开的组合物和方法可帮助实现特定类型的分子在分区之间、从连续相到分散相和/或从分散相到连续相的选择性传输。在一些情况下，来自连续相或进入连续相或者从分区到分区的分散成分交换是期望的，例如它可改进每个液滴中特定分析物的测量。

本文公开了通过在表面活性剂分子在分区界面处形成之后和/或在界面形成期间交联表面活性剂分子来提高分区稳定性的组合物和方法。表面活性剂的交联在每个分区周围形成表面活性剂网络，以促进表面活性剂分子在表面的保留，从而增加分区稳定性(与表面活性剂颗粒未交联的分区相比)。即使在接触时间长、温度高和pH变化的应用中，或者在使其中表面活性剂微粒未交联的分区不稳定的化学品存在的情况下，这也帮助保留围绕每个分区的连续相膜。交联可以是自发的或诱导的，可使用单组分体系或多组分体系形成，并且交联的程度可从部分到全部变化。

一般来讲，表面活性剂分子之间的交联键在分区形成期间和/或之后形成，例如在液滴发生器处形成。具有附接的连接部分和/或具有适合交联的一个或多个部分的表面活性剂可在分区形成之前存在于分散相、连续相或两者中。在某些实施方案中，具有附接的连接部分的表面活性剂在分区形成之前基本上全部处于连续相中，并且为方便起见，本实施方案将描述所述过程，但应当理解所有组合都涵盖在本文提供的方法和组合物中。用于稳定分散相分区的表面活性剂可在分区形成之前存在于连续相中，例如具有附接的连接部分的表面活性剂分子。在分区形成之前，分散相可作为程序化乳液存在，即作为被连续相层包围的相对大的分散相团存在，其中在界面处具有表面活性剂分子层。参见，例如，美国专利申请公布号20200030794。在某些实施方案中，程序化乳液的表面活性剂未交联。因此，用于稳定连续相中的分散相分区的表面活性剂可形成在连续相中形成的分区中的表面活性剂之间形成交联键的基础。具有交联表面活性剂的连续相合分散相最初是分开的。当分散相的分区在连续相中形成以产生乳液时，表面活性剂界面在(完全或基本完全)由连续相中的表面活性剂分子组成的分区上形成。分区形成期间和/或形成之后的条件使得由连续相供应的表面活性剂分子上的连接部分在表面活性剂分子之间形成交联键。可以如本文所述的多种方式引发和/或促进交联键的形成。

在某些实施方案中，连续相含有具有用于形成交联的表面活性剂网络的连接部分的表面活性剂分子的条件使得不形成或基本上不形成交联键，而表面活性剂在与分散相分开的连续相中。另选地，条件可使得形成交联键，但是交联键具有的结构使得当表面活性剂与分散相接触时，交联键可断裂并重新形成。在某些实施方案中，在乳液形成时改变条件(例如光交联)以促进交联键的形成。在一些情况下，具有不同连接部分的不同表面活性剂可在连续相中分离，例如单独地加入到连续相中。尽管在连续相中的表面活性剂胶束之间会存在一些迁移，但分区形成之前的添加时间和/或连续相的条件可使得这种迁移最小化。

可以任何合适的方式诱导和/或促进在分区形成期间和/或之后形成交联键。在某些实施方案中，分散相含有一种或多种组分和/或建立一种或多种条件，所述组分和/或条件诱导和/或促进交联键(直接或间接)形成；在某些实施方案中，所述组分和/或条件在连续相中不可存在或基本上不可存在和/或不可在分区形成之前存在。例如，在某些实施方案中，分散相含有引发单独的表面活性剂的连接部分之间的反应以形成直接交联键的一种或多种组分。例如，如下所述，一些表面活性剂分子可具有为叠氮化物的第一连接部分，而其他表面活性剂分子可具有为炔烃的第二连接部分。表面活性剂分子存在于连续相中，但直到表面活性剂分子遇到分散相时才会形成交联，所述分散相含有诱导和/或促进铜炔-叠氮环加成或无铜炔-叠氮环加成所必需的组分。在某些实施方案中，分散相含有一个或多个中间连接部分，所述中间连接部分能够与表面活性剂分子的连接部分形成键以在表面活性剂之间形成间接交联键。在一些情况下，分散相和/或连续相中存在促进在一个或多个中间连接部分与表面活性剂连接部分之间形成键的一种或多种组分。中间连接部分的一个实例是生物素结合部分，诸如链霉亲和素。这种部分可存在于分散相中，而连续相含有表面活性剂分子，其中生物素作为连接部分附接在所述表面活性剂分子上。在分区形成时，生物素结合中间连接部分与附接到表面活性剂分子的生物素相互作用以在表面活性剂连接部分和中间连接部分之间产生交联键，以产生表面活性剂交联键网络。在一些情况下，通过外部方法改变条件以诱导和/或促进在连接部分之间和/或在连接部分与中间部分之间形成键。一个实例是使用光活化的交联键，其中直到连接部分暴露于适当的光，交联才会发生或基本上发生。在一些情况下，存在于分散相中的条件可引发和/或促进在连接部分之间形成键。例如，分散相的pH可使得连接部分中的离子形成是有利的，并且连接部分之间的离子相互作用键合所述部分。

在某些实施方案中，不同的表面活性剂分子已经附接了相同的连接部分。在某些实施方案中，第一表面活性剂分子附接有第一连接部分，并且第二表面活性剂分子附接有第二连接部分，其中第一连接部分和第二连接部分不同。在某些实施方案中，交联是直接的，即表面活性剂连接部分互相之间形成键；在某些实施方案中，交联是间接的，即表面活性剂连接部分与一个或多个中间部分形成键。在后一种情况下，可在某些实施方案中使用单个中间部分，并且可在其他实施方案中使用多个中间部分。连接键可以是共价的或非共价的。

连接部分可附接到表面活性剂分子的亲水部分或极性部分(在本文中也称为头部或头部基团)或附接到表面活性剂分子的疏水部分或非极性部分(在本文中也称为尾部或尾部基团)，或它们的组合。

存在许多用于交联表面活性剂分子的方法，包括但不限于机械啮合、离子相互作用、化学交联、光交联和配体结合相互作用。

离子相互作用

在某些实施方案中，使用包含具有至少两种不同离子性质的表面活性剂分子的混合物。第一表面活性剂包含正电荷区域，而第二表面活性剂包含负电荷区域。一般来讲，带电区域将位于头部基团上。当表面活性剂分子在液滴界面处缔合时，带相反电荷的区域在液滴界面处形成聚电解质网络。液滴界面处的聚电解质网络中包括的表面活性剂分子的数量部分取决于带电区域的长度和那些区域可能与之相互作用的不同表面活性剂分子的数量。可通过向头部基团添加基团来赋予电荷，或者由未经修饰的头部基团的性质来赋予电荷；在任一种情况下，连接部分都可被认为是电荷和/或带电基团本身。

在某些实施方案中，使用具有带有高正电荷或负电荷的水性部分的单个表面活性剂。交联通过反离子在水相中发生，从而在分区界面处的表面活性剂分子之间形成盐桥网络。

化学/光交联

在某些实施方案中，使用化学或光活化的交联剂以化学方式可实现多个表面活性剂(例如含氟表面活性剂)之间的交联，所述交联剂可与表面活性剂(例如含氟表面活性剂)连接或游离在主要与连接到表面活性剂分子的部分反应的溶液中。

可通过任何合适的化学反应来产生两个或更多个表面活性剂之间(例如表面活性剂连接部分之间，或交联剂与表面活性剂之间，例如中间连接部分与表面活性剂连接部分之间)的共价相互作用。本文公开的组合物和方法可导致使用一种或多种可用的化学策略来形成导致分区稳定性提高的表面活性剂网络。化学策略包括但不限于涉及以下官能团的反应：NHS酯、马来酰亚胺、方形烷(squarane)、炔-叠氮化物点击化学或类似方法以及生物缀合反应(包括氨基酸(诸如赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)与反应性基团之间的反应，如在Koniev,O.,Wagner,A,Chem.Soc.Rev.,44,5495(2015)中所详述的)。在一些实施方案中，这些化学反应在生物学上是相容的。

在某些实施方案中，通过使用胺反应性化学反应在两个或更多个不同的表面活性剂分子之间执行交联。一个实例是通过生成具有由带有可接触水的胺官能团的pluronic-(聚氧-烃嵌段共聚物)或jeffamine-家族(氨基聚乙二醇嵌段共聚物)聚合物组成的水性部分的第一表面活性剂和生成具有由PEG家族聚合物组成的水性部分的第二表面活性剂。参见，例如，美国专利申请公布号20180112036。通过用NHS酯官能团修饰第二表面活性剂并将第二表面活性剂与第一表面活性剂在水性环境中结合，NHS酯官能部分与存在于第一表面活性剂中的胺基团形成共价连接。

在某些实施方案中，通过DNA交联机制可执行表面活性剂之间的交联。通过将短的互补寡核苷酸连接到表面活性剂分子，可使用链间交联剂来交联两个或更多个寡核苷酸片段，从而有效地交联其附接的表面活性剂。交联剂可在液滴形成之前附接到寡核苷酸或者可游离在水相中，并且可在分区形成之后与表面活性剂反应。在某些实施方案中，单链寡核苷酸嵌入剂连接到第一表面活性剂。通过将短寡核苷酸连接到第二表面活性剂并将两种表面活性剂在分区界面中结合在一起，两个表面活性剂分子将连接，从而在分区界面处形成分子网络。在某些实施方案中，产生的表面活性剂具有与其连接的单链或双链寡核苷酸。通过包括多官能交联剂(像双官能或三官能交联剂)，表面活性剂在分区形成时交联。可在这些和其他实施方案中使用任何合适的寡核苷酸交联剂。寡核苷酸交联剂的实例包括但不限于5F-203、4'-氨基甲基三氧沙林、8-甲氧基补骨脂素、当归素(Angelicin)、双官能醛、卡铂(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、苯丁酸氮芥、白叶藤碱(Cryptolepine)、环磷酰胺、福莫司汀(Fotemustine)、美法仑(Melphalan)、丝裂霉素C、米托蒽醌(Mitoxantrone)、亚硝酸、丙卡巴肼(Procarbazine)、补骨脂素、S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-羧酸叔丁酯、苏消安(Treosulfan)、三氧沙林(Trioxsalen)。

在某些实施方案中，通过肽-表面活性剂交联机制可执行表面活性剂之间的交联。通过将肽连接到第一表面活性剂并将肽反应性基团连接到第二表面活性剂，反应时表面活性剂分子将共价交联。在某些实施方案中，将肽连接到表面活性剂，并且可使用多官能肽间交联剂来交联一个或多个肽。交联剂可在分区形成之前附接到肽，或者游离在分散相(例如水相)中并且在分区形成之后与表面活性剂连接的肽反应。

在某些实施方案中，可用巯基基团来修饰表面活性剂的水性部分，所述巯基基团在进入氧化环境时通过二硫键形成表面活性剂间交联键。

在某些实施方案中，第一表面活性剂可被修饰成具有一个或多个炔烃官能团，并且第二表面活性剂可被修饰成具有一个或多个叠氮化物官能团。在液滴分区后进入水性环境时，表面活性剂可使用铜炔-叠氮环加成或无铜炔-叠氮环加成(“点击”)化学反应进行交联。

在某些实施方案中，多官能炔交联剂或叠氮化物交联剂可位于水相中，在分区形成时与带有互补性化学性质的表面活性剂分子反应。

在光交联中，如本领域中已知的，表面活性剂分子上的连接部分含有光反应性元素，当暴露于适当的光时，所述光反应性元素与另一种元素(例如另一种光反应性元素)形成键，所述另一种元素可在另一个表面活性剂连接部分上或在中间连接部分上。在某些实施方案中，光反应元素附接到肽接头，所述肽接头附接到表面活性剂分子；通过出于期望的效果选择适当的氨基酸残基，使用此类接头允许控制交联键长度(例如通过控制肽中氨基酸残基的数量)和/或交联键疏水性或亲水性(包括电荷)。这在使用肽接头的任何实施方案中一般都是正确的。合适的光反应性元素在本领域中是已知的，并且包括但不限于芳基叠氮化物、叠氮基-甲基-香豆素、二苯甲酮、蒽醌、某些重氮化合物、双吖丙啶(Diazirine)和补骨脂素衍生物。激活交联的光可以是任何合适的光，诸如可见光或UV光。

配体结合

在一些实施方案中，交联通过一种或多种配体-受体相互作用来实现。配体或受体可连接到表面活性剂，或者多官能受体或配体可存在于分散相中，或者两者。

可使用配体和受体的任何合适的组合。配体结合实例可包括但不限于肽-肽相互作用、肽-蛋白质相互作用、肽-小分子相互作用、肽-寡核苷酸相互作用、蛋白质-小分子相互作用、蛋白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用。

这些的实例包括但不限于断裂内含肽、spy catcher-spy标签、链霉亲和素-strep标签、抗体-表位(像myc和抗myc、FLAG和抗flag等)核酸发夹和连接、his标签-镍或钴、肝素-肝素结合蛋白、聚N-乙酰基葡糖胺-麦胚凝集素、MBP-麦芽糖或直链淀粉。

在一些实施方案中，交联通过一个或多个生物素部分与表面活性剂的缀合来实现，并且一个或多个表面活性剂的后续交联在水相中通过生物素结合部分(例如链霉亲和素)-生物素相互作用来实现。当使用链霉亲和素时，其多价性质使其能够连接至多4个表面活性剂分子。

可使用任何合适的生物素结合部分。在某些实施方案中，使用链霉亲和素或链霉亲和素衍生物。链霉亲和素是众所周知的和研究过的生物素结合部分。链霉亲和素是对生物素表现出相当大的亲和力的蛋白质，是在多个原核和真核生物过程中起作用的244道尔顿辅因子。链霉亲和素和其他生物素结合蛋白(包括亲和素及其衍生物)能够结合至多四个生物素分子。链霉亲和素衍生物可被设计成具有0、1、2、3或4个生物素结合位点。已产生工程化形式的链霉亲和素，其表现出慢10倍的解离速度，慢2倍的缔合速度以及更高的热稳定性和机械稳定性[Chivers,2010,Nature Methods]。

链霉亲和素与生物素(K_a＝10¹⁵M^-1)的高度特异性相互作用是生物测定中的有用工具。蛋白质-配体复合物表现出极高的稳定性，包括对有机溶剂、变性剂、洗涤剂、蛋白水解酶的抗性，以及对极端温度(例如>100℃)和pH(例如4-11)的抗性。

加工159残基全长蛋白的N和C末端以产生更短的“核心”链霉亲和素，其通常由残基13-139组成；N和C末端的去除对高生物素结合亲和力是必需的。链霉亲和素单体的二级结构由八条反平行的β链组成，所述β链折叠产生反平行的β桶三级结构。生物素结合位点位于每个β桶的一端。四个相同的链霉亲和素单体(即四个相同的β桶)缔合以产生链霉亲和素的四聚体四级结构。每个桶中的生物素结合位点由桶内部的残基以及来自相邻亚基的保守Trp120组成。这样，每个亚基都有助于相邻亚基上的结合位点，因此四聚体也可被认为是官能性二聚体的二聚体。

链霉亲和素-生物素复合物的多个晶体结构解释了出色亲和力的起源。第一，结合口袋与生物素之间存在高度的形状互补性。第二，当在结合位点中时，存在与生物素形成的氢键的广泛网络。存在直接与结合位点中的残基形成的八个氢键(所谓的氢键的“第一壳”)，其涉及残基Asn23、Tyr43、Ser27、Ser45、Asn49、Ser88、Thr90和Asp128。还存在氢键的“第二壳”，其涉及与第一壳的残基相互作用的残基。然而，链霉亲和素-生物素亲和力超过了由单独氢键合相互作用预测的亲和力，表明了另一种有助于高亲和力的机制。生物素结合口袋是疏水的，并且当在口袋中时，生物素有许多范德华力介导的接触和疏水相互作用，这也被认为是高亲和力的原因。特别地，口袋内衬有保守的色氨酸残基。最后，生物素结合伴有连接B链3和4(L3/4)的柔性环的稳定化，柔性环在结合的生物素上闭合，表现得像结合口袋上的“盖子”并且有助于极慢的生物素解离速度。

与链霉亲和素相比，亲和素与链霉亲和素共享约30％的序列同一性，但二级、三级和四级结构几乎完全相同。与链霉亲和素相比，亲和素是糖基化的，带正电荷，具有伪催化活性(它可以增强生物素与硝基苯基之间的酯键的碱性水解)并且具有更高的聚集趋势。此外，链霉亲和素是更好的生物素-缀合物结合剂；尽管亲和素对游离的、未缀合的生物素具有更高的亲和力，但当生物素与另一个分子缀合时，亲和素的结合亲和力低于链霉亲和素。因为链霉亲和素缺乏任何碳水化合物修饰并且具有近中性的pI，所以链霉亲和素具有非特异性结合比亲和素低得多的优势。

在某些实施方案中，可使用分体式受体(split receptor)，它们在与其预期配体结合时重新形成。一个实例包括分支上的一半的金属螯合剂，使得数个分支聚集在一起以螯合金属离子。这可通过许多方法实现，包括但不限于杂交需要金属离子(如铜)的带有修饰的碱基对的核酸。

两部分交联

在另一个实施方案中，使用分体式表面活性剂，其在分区界面形成完整的表面活性剂时稳定分区。在本实施方案中，分体式表面活性剂的一部分可溶于连续相，而分体式表面活性剂的第二部分可溶于分散相(例如水相)。第一表面活性剂部分含有反应性部分，并且第二表面活性剂部分含有互补的反应性部分。在分区形成时，连续相表面活性剂部分和分散相表面活性剂部分可相互作用并化学反应，从而形成完整的表面活性剂。分体式表面活性剂可具有三个或更多个部分，每个部分的一个或多个可溶于连续相，而一个或多个也可溶于分散相(例如水相)。分体式表面活性剂的每个部分都含有反应性部分，使得所述部分的紧密接近导致形成完整的表面活性剂。在某些实施方案中，完整的表面活性剂的形成还含有用于使用上述交联方法中的任一种进行交联的功能性部分，即连接部分。完整的表面活性剂的形成激活交联或允许激活交联，从而导致在分区界面处形成互相连接的完整形成的表面活性剂的网络。

交联特性

分区界面处的交联网络的完整性和强度取决于附接到表面活性剂的交联剂的物理参数。这些包括(1)一种或多种交联剂之间的相互作用强度，(2)相对交联度，即表面活性剂-表面活性剂相互作用的数量，其范围可以是从表面活性剂网络的0％到100％，(3)表面活性剂与交联剂之间的间隔臂的长度，例如交联键的长度，以及(4)附接到每个表面活性剂的交联剂(例如连接部分)的数量和附接到每个表面活性剂的交联剂(例如连接部分)数量的多分散性。

互相作用强度：两个的交联表面活性剂之间相互作用的相对强度将决定分区界面处的网络的整体强度。离子晶格能通常在600-4000kJ/mol的范围内(有些甚至更高)，单键的共价键解离能通常在150-400kJ/mol之间，氢键解离能范围通常为4-21kJ/mol，范德华解离能范围为1-4kJ/mol。离子网络的较高的键解离能是由于离子晶格的形成。生物相关的交联剂的键解离能包括：H–H：436kJ/mol、H–C：415kJ/mol、H–N：390kJ/mol、H–O：464kJ/mol、H–F：569kJ/mol、H–Si：395kJ/mol、H–P：320kJ/mol、H–S：340kJ/mol、H–Cl：432kJ/mol、H–Br：370kJ/mol、H–I：295kJ/mol、C–C：345kJ/mol、C＝C：611kJ/mol、C≡C：837kJ/mol、C–N：290kJ/mol、C＝N：615kJ/mol、C≡N：891kJ/mol、C–O：350kJ/mol、C＝O：741kJ/mol、C≡O：1080kJ/mol、C–F：439kJ/mol、C–Si：360kJ/mol、C–P：265kJ/mol、C–S：260kJ/mol、C–Cl：330kJ/mol、C–Br：275kJ/mol、C–I：240kJ/mol、N–N：160kJ/mol、N＝N：418kJ/mol、N≡N：946kJ/mol、N–O：200kJ/mol、N–F：270kJ/mol、N–P：210kJ/mol、N–Cl：200kJ/mol、N–Br：245kJ/mol、O–O：140kJ/mol、O＝O：498kJ/mol、O–F：160kJ/mol、O-Si：370kJ/mol、O-P：350kJ/mol、O-Cl：205kJ/mol、O-I：200kJ/mol、F-F：160kJ/mol、F-Si：540kJ/mol、F–P：489kJ/mol、F–S：285kJ/mol、F–Cl：255kJ/mol、F–Br：235kJ/mol、Si–Si：230kJ/mol、Si–P：215kJ/mol、Si–S：225kJ/mol、Si–Cl：359kJ/mol、Si–Br：290kJ/mol、Si–I：215kJ/mol、P–P：215kJ/mol、P–S：230kJ/mol、P–Cl：330kJ/mol、P–Br：270kJ/mol、P–I：215kJ/mol、S–S：215kJ/mol、S–Cl：250kJ/mol、S–Br：215kJ/mol、Cl–Cl：243kJ/mol、Cl–Br：220kJ/mol、Cl–I：210kJ/mol、Br–Br：190kJ/mol、Br–I：180kJ/mol、I–I：150kJ/mol、亲和素-生物素：9-100kJ/mol。因此，使用较高解离能形成键的交联剂将产生分区界面处的结构更坚固的网络。在某些实施方案中，如本文提供的交联的表面活性剂网络的交联键的强度为1-4000、1-1000、1-500、20-4000、20-1000、20-500、50-4000、50-1000、50-500

交联度：交联度是分区界面处的网络强度的重要因素。交联度可以取0与100％之间的任何值，网络强度一般随着交联度的增加而增加。交联度可以任何合适的方式表示。例如，在表面活性剂分子体系中，将存在最大可能数量的交联键(例如，如果表面活性剂分子具有平均4个连接部分，每个连接部分只能形成一个交联键，那么每个表面活性剂分子可平均产生最多4个交联键)和最小数量的交联键(零)，并且交联度可表示为最大值的百分比(例如，在上文的实例中，如果每个表面活性剂分子在最大可能的4个交联键中平均产生3个交联键，那么交联度为75％)。然而，如本文别处所述，一般来讲，表面活性剂分子的相邻表面活性剂交联的百分比是更有用的比较，即如果相邻的表面活性剂都未交联，则交联度为0％。如果每个表面活性剂的全部相邻表面活性剂都是交联的，则交联度为100％。可以任何合适的方式确定交联度，例如，通过基于用于将部分附接到表面活性剂分子的试剂的浓度和可能的反应完全度的化学计量计算来确定每个表面活性剂的连接部分的平均数，确定分区界面处的每个表面活性剂的相邻表面活性剂的平均数，以及确定中间连接部分与连接部分的化学计量比(如果适用)以及部分之间的连接相互作用的效率。例如，可使用对表面活性剂10倍过量的生物素和60％的反应效率，用附接的生物素来制备表面活性剂，使得每个表面活性剂的生物素的平均数数为6。表面活性剂分子可形成网络，其中相邻表面活性剂的平均数为5，并且可存在对分区中的表面活性剂的平均数10倍过量的链霉亲和素。因为链霉亲和素-生物素相互作用非常有效，所以可假设结合效率为100％，并且由于连接部分和中间连接部分两者都过量存在，因此在这种情况下交联度将被计算为100％。也可使用如本文别处所述的FRAP测量。在某些实施方案中，交联度为1-100％、2-100％、5-100％、10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、95-100％、98-100％或99-100％，或至少5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％或它们之间的任何范围

交联键长度：由于间隔臂将决定表面活性剂分子与其交联剂之间的物理距离，例如，总体上是连接部分的长度以及两个交联的表面活性剂之间的距离，长度可以是交联效率和强度的重要变量。间隔臂太短可能在空间上减少交联剂进入待交联的表面活性剂上的反应性部分，可能通过不允许每个表面活性剂的交联剂足够接近以发生反应来减少表面活性剂-表面活性剂相互作用的程度，或者可能允许两个表面活性剂交联，同时限制与三个或更多个表面活性剂交联的能力，从而限制液滴界面处表面活性剂网络的程度。虽然过长的交联剂可允许高度的表面活性剂网络，但过长的交联剂也可能产生未提高分区界面的稳定性的松散和/或松软的网络。在一些实施方案中，根据特定应用中稳定的液滴尺寸范围来定制间隔臂的长度。一般来讲，可通过将每个表面活性剂分子上的连接部分的长度相加并减去任何重叠长度(例如，在互补寡核苷酸的情况下，将退火的互补序列的长度)并加上使用的任何中间连接部分的长度来计算平均交联键长度。连接部分的长度可以是任何合适的长度，诸如表面活性剂的头部基团的最长尺寸的0.1-100倍、0.1-50倍、0.1-30倍、0.1-20倍、0.1-10倍、0.1-5倍、0.1-3倍、0.1-2倍、0.1-1倍、0.1-0.5倍、0.1-0.3倍、1-100倍、1-50倍、1-30倍、1-20倍、1-10倍、1-5倍、1-3倍或1-2倍，或表面活性剂的尾部基团的最长尺寸或表面活性剂的头部基团的最长尺寸的0.1-100倍、0.1-50倍、0.1-30倍、0.1-20倍、0.1-10倍、0.1-5倍、0.1-3倍、0.1-2倍、0.1-1倍、0.1-0.5倍、0.1-0.3倍、1-100倍、1-50倍、1-30倍、1-20倍、1-10倍、1-5倍、1-3倍或1-2倍。在某些实施方案中，交联剂的长度为0.1-100nm、0.1-50nm、0.1-30nm、0.1-20nm、0.1-10nm、0.1-5nm、0.1-3nm、0.1-1nm、0.1-0.5nm、1-100nm、1-50nm、1-30nm、1-20nm、1-10nm、1-5nm或1-3nm。

每个表面活性剂的连接部分数量：每个表面活性剂分子的交联剂的数量(例如每个表面活性剂的连接部分的数量)是决定表面活性剂网络中获得的交联度的一个因素。例如，每个表面活性剂仅带有一个交联剂(例如连接部分)的均相表面活性剂将能够与另一个表面活性剂分子形成最多1个相互作用，然而具有两个或更多个交联剂(例如连接部分)的表面活性剂可与1个或多个额外的表面活性剂形成交联键。例如，用单个生物素部分修饰的表面活性剂分子能够与一个链霉亲和素分子连接，并且由于链霉亲和素蛋白的四聚体性质，单个表面活性剂然后可与最多3个额外的表面活性剂分子连接。用两个或更多个生物素部分修饰的表面活性剂分子可与一个或多个链霉亲和素蛋白相互作用，每个链霉亲和素蛋白可与最多3个相似或不同的表面活性剂分子相互作用。应当理解，为了实现高交联度，每个表面活性剂的连接部分的数量应该接近、等于或超过分区界面处的表面活性剂的相邻表面活性剂的平均数。例如，如果相邻表面活性剂的平均数为五，那么为了实现100％的交联度，每个表面活性剂应该具有至少5个连接部分。可由连接部分附接期间的连接部分与表面活性剂分子的化学计量比和连接条件的效率来计算每个表面活性剂的连接部分的数量。例如，如果使用表面活性剂分子10倍过量的连接部分并且附接效率为70％，则每个表面活性剂分子的连接部分的平均数可取为7。每个表面活性剂分子的连接部分的平均数可以是任何合适的数字，诸如2-20、2-15、2-12、2-10、2-8、2-6、2-4、3-20、3-15、3-12、3-10、3-8、3-6、4-20、4-15、4-12、4-10、4-8、4-6、5-20、5-15、5-12、5-10、5-8或5-7；或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或它们之间的任何范围。

交联的表面活性剂网络的稳定性

在所有实施方案中，所得的交联的表面活性剂(例如含氟表面活性剂)导致液滴界面的稳定化。

根据用于液滴界面稳定化的特定化学性质，生成的壳(例如交联的表面活性剂网络)可能会或可能不会减少小分子和/或大分子扩散到分散相(例如水相)与连续相(例如油相)之间(例如通过直接扩散和/或通过反胶束形成)，促进两相之间的气体交换，或促进分子吸附到界面。另选地或除此之外，可减少或消除分区的聚结。

这可以多种方式表现出来，包括但不限于通过破坏反胶束形成来减少分区界面处的表面活性剂保留、产生高度亲水(例如带电)的分区界面、产生高度疏水的液滴界面、它们的一些组合、和/或生成具有限定孔隙度的交联的表面活性剂网络。在分区界面处使用交联的表面活性剂分子的网络可允许使用各种部分(特别是在分区内部使用)，否则各种部分可能无法使用或者只能以低浓度使用。这些部分包括来自组织、血液、植物材料、微生物细胞的溶解产物成分；药物及其前体或衍生物；毒理学剂；生长培养基成分；生物生产底物、中间体或产物；代谢中间体；脂质；诱导剂；抗生素；洗涤剂；拥挤剂；酶底物、产物或抑制剂、报告分子或它们的任何组合。

根据特定的表面活性剂化学性质，表面活性剂通常可溶于连续相中或胶束态的分散相中。在分区界面形成时，胶束解离并且表面活性剂分子将自身嵌入分区界面。由于表面活性剂是两亲性的并且具有至少两个溶解性相反的基团，尾部和头部基团与其各自的溶剂缔合。胶束态与界面之间达到的溶解度平衡是动态过程，其存在于分区界面中的表面活性剂分子和以胶束态溶解于溶剂中的表面活性剂的不断交换中。分区界面与胶束之间的这种表面活性剂的交换称为反胶束形成。在反胶束形成期间，可溶于分散相的分子可被有效地包裹在胶束中，从而使所述分子溶解在连续相中。这些“装载”的胶束可永久保留在连续相中，可在生成它的相同分区的分区界面中重新形成，或者在单独的分区中重新形成。虽然分散相分子不完全可溶于连续相，但是携带分散相分子的胶束从分区到分区的转移也使分子能够在分区之间转移。可通过分区界面处的表面活性剂交联来抵消这种现象。由于表面活性剂分子在分区界面处以物理方式连接，使用这种机制有效地减少或者甚至消除或基本上消除反胶束形成，从而减少或消除或基本上消除液滴之间的分散相分子的转移。减少的程度取决于表面活性剂交联的程度。

另选地，调节分区界面处的化学性质将选择性地减少具有非互补化学性质的分子跨分区界面的转移。例如，高度亲水(例如带电)的分区界面的生成将限制疏水分子跨界面的转移，并且一般来讲还限制具有相同电荷或部分电荷的部分的转移并且潜在地增加具有相反电荷或部分电荷的部分的转移。另选地，高度疏水的界面的生成将限制亲水分子跨界面的转移。

另选地，在液滴界面处精确地生成具有限定孔隙度的交联表面活性剂网络将基于跨分区界面的尺寸选择性地减少分子的转移。例如，表面活性剂网络中1kD的标称孔隙度将选择性地限制大于1kD的分子的转移，而表面活性剂网络中10kD的标称孔隙度将选择性地限制大于10kD的分子的转移。

表现出小分子扩散减少、高气体扩散和减缓的分子到界面的吸附的表面活性剂(例如含氟表面活性剂)交联化学性质可证明在许多应用(包括但不限于细胞、蛋白质和核酸测定)中的高实用性。

表现出小分子扩散减少、低气体扩散和减缓的分子吸附的表面活性剂(例如含氟表面活性剂)交联化学性质将证明在许多应用(包括但不限于细胞、蛋白质和核酸测定)中的高实用性。在本文提供的方法和组合物中可使用任何合适的适合交联的表面活性剂。示例性表面活性剂包括非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性离子表面活性剂；在某些实施方案中，表面活性剂包含一种或多种含氟表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性种类包括直链烷基苯磺酸盐(LAS)、醇醚硫酸盐(AES)、仲烷烃磺酸盐(SAS)和醇硫酸盐(AS)。阴离子表面活性剂基团的实例包括磺酸盐、醇硫酸盐、烷基苯磺酸盐、磷酸酯和羧酸盐。在某些实施方案中，表面活性剂是阴离子含氟表面活性剂，诸如全氟壬酸盐或全氟辛酸盐，或任何其他合适的阴离子含氟表面活性剂。示例性阳离子表面活性剂包括伯胺、仲胺或叔胺；在某些实施方案中，阳离子表面活性剂是季铵，诸如CTAB、CPC、BAC、BZT或DODAB。在两性离子表面活性剂中，阳离子部分可基于伯胺、仲胺或叔胺或季铵阳离子。阴离子部分可包括磺酸盐、羧酸盐、磷酸盐等；在某些实施方案中，两性离子表面活性剂包括具有胺或铵的磷酸根阴离子，诸如磷脂，例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和鞘磷脂。非离子表面活性剂在其附接到疏水尾部基团的亲水头部中可具有例如共价键合的非离子氧基团。

示例性含氟表面活性剂包含低聚乙二醇、TRIS或聚乙二醇部分。在某些实施方案中，含氟表面活性剂包含碳氟化合物和/或碳氯氟化合物部分。在一些实施方案中，含氟表面活性剂具有通过醚键、酰胺键或脲键连接的头部和尾部。在某些实施方案中，含氟表面活性剂具有通过脲键、醚键或酰胺键连接到碳氟化合物部分的聚乙二醇部分。氟化表面活性剂包括但不限于Picosurf-1、Ran FS-008、FC-4430、FC-4432、FC-4434。在某些情况下，含氟表面活性剂可包含通过脲键、酰胺键或醚键连接到碳氟化合物部分的聚乙烯部分。在其中生物素被用作连接部分的某些实施方案中，示例性含氟表面活性剂(包括生物素)是来自Ran Biotechnologies的FS-生物素。参见，例如，美国专利申请公布号20180112036。

在本文提供的方法和组合物中可使用任何合适的连续相。在某些实施方案中，连续相包括油；在某些实施方案中，油是氟化油。示例性油包括本文别处所述的油。示例性氟化油包括本文别处所述的氟化油。

另选地或除此之外，分区界面处的交联的表面活性剂网络可减少或消除分区的聚结。

评估交联的表面活性剂网络的稳定性。一般来讲，提高的稳定性将减少组分通过扩散、反胶束形成和/或聚结从一个分区到另一个分区的移动，且/或可提高用乳液进行的过程的效率和/或准确性。聚结还减少分区的总数。在某些实施方案中，与未交联的相同乳液相比(例如用没有附接的连接部分的表面活性剂分子制备的乳液和/或未使用完成连接过程的必需组分和/或条件制备的乳液)，本文提供的用于形成交联的表面活性剂网络的方法和组合物可增加乳液的稳定性。

可以任何合适的方式评估稳定性。

在某些实施方案中，在限定条件和时间的孵育之后，通过可检测物质(诸如染料分子)从含有分子的分区到不含分子的分区的移动来评估稳定性。可选择具有特定尺寸、亲水性(例如电荷)、疏水性或它们的组合的物质。例如，可在分区的群体中提供小的水溶性染料，然后可使用在混合两个群体之后对染料随后向不含染料的分区群体的转移的评估。示例性染料包括罗丹明CG，其通常具有非常快的交换速率(大约为几分钟)；试卤灵，具有中等的交换速率(大约几小时)；荧光素，具有慢交换速率(大约几天)。

示例性条件可以是在相同条件下产生两个分区群体，一个群体含有适当浓度(例如2uM)的期望染料，并且另一群体不含染料，然后将两个群体等量混合(例如在Eppendorf管中)。可使用任何合适的方法(诸如在Guner等人,Controlling molecular transport inminimal emulsions,Nat Comm DOI 10.1038/natcomms10392,2016中所述的方法)来产生这两个群体。在某些实施方案中，使用Dropworks PCR系统，其中液滴发生器从系统的其余部分取下，并且将适当的染料、表面活性剂、分散相和连续相送入液滴发生器，例如从20uL样品分成例如20,000、25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；或50,000个或它们之间的任何范围的液滴，并且按照与PCR测定相同的条件形成单独体积的空液滴(无染料)和含染料液滴，然后将两个群体组合。然后在合适的条件下孵育组合的群体；可期望在升高的温度(例如在约50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃或它们之间的任何范围)下孵育所述群体。根据所使用的染料来选择适当的孵育持续时间。对于具有快交换速率的染料，例如罗丹明CG，几分钟(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20、15、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分钟)的孵育时间可能是适当的。对于具有中等交换速率的染料，例如试卤灵，更长的孵育时间(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20、15、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分钟或2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6小时)可能是适当的(取决于温度)。对于具有长交换速率的染料，例如荧光素，甚至更长的孵育时间(例如0.5、1、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、24、30、36、42、48、72或96小时)可能是适当的(同样取决于温度)。在适当的时间点，可通过显微镜对群体进行成像，并且可使用例如Leics软件的谱线轮廓工具来评估无染料液滴的荧光强度。时间0的群体的非染料群体的随机选择的部分(例如10、20、30、50或100个随机选择的分区)的平均荧光值可假设为背景值，并且可将其与第1、2或3天中的一天或多天的荧光值进行比较。可对交联的分区相对于未交联的分区进行测试。如果把给定时间点的未交联分区的荧光值取为100％，则交联分区的稳定性可表示为与未交联分区相比(如交联样品中的荧光降低所反映的)扩散的减少，例如，如果未交联分区的荧光是平均100个单位，并且交联分区的荧光是40个单位，则扩散的减少为60％。稳定性的增加可表示为特定染料分子的％扩散减少。在某些实施方案中，如通过诸如本文所述的染料扩散测定所确定的，本文提供的方法和组合物可导致液滴稳定性增加至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或它们之间的任何范围。

在某些实施方案中，通过测量聚结可评估分区的稳定性。可使用任何合适的方法(诸如在Guner等人,Controlling molecular transport in minimal emulsions,NatComm DOI 10.1038/natcomms10392,2016中所述的方法)来产生用于这种测定的液滴。在某些实施方案中，使用Dropworks PCR系统，其中液滴发生器从系统的其余部分取下，然后将适当的表面活性剂、分散相和连续相送入液滴发生器并获得一定体积的液滴，例如从20uL样品分成例如20,000、25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000个或它们之间的任何范围的液滴。如果产生了单分散的分区群体(例如大多数或基本上所有分区都在相对较小的尺寸范围(例如液滴的直径范围)内的群体)，相对直接的聚结测试是在使乳液经受一些标准条件之后在各个时间点使乳液可视化，并通过确定体积已增加至分区初始体积的至少2倍的分区的相对百分比来确定聚结的相对量。只要液滴足够可见使得可确定尺寸(直径)或者可确定相对直径，就可以如染料测量所述的那样产生乳液，不同之处是不必组合两个群体。因此，在时间0时，融合分区的百分比可能较低(例如0或接近0)，然后在随后的时间它可增加到10％、20％、50％或高于50％。应当理解，每个融合分区代表至少2个未融合分区，但为简单起见，可在每个时间点通过计数视野中的融合分区，计数分区总数，将前者除以后者并乘以100来测量百分比。与其他测试一样，可将交联分区的性能与未交联的相同分区进行比较。在一些情况下，这仅通过去除交联剂(例如链霉亲和素)或交联刺激(例如光)的存在就可实现；在其他情况下，更广泛的修饰可能是必需的，但一般来讲，与交联分区相比，期望的是尽可能少地修饰未交联的分区。聚结的示例性测试是在单独的群体中形成交联分区和未交联分区，优选但不必同时，在时间0成像分区以确定初始聚结，然后将分区保持在有利于聚结的条件下(例如在诸如40℃、50℃、60℃、70℃、80℃或90℃的升高的温度下)，并且在一个或多个时间点(诸如在10、20、30、40、50和/或60分钟，和/或1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9和/或10小时)通过目视检查(例如显微镜检查)来确定聚结，并将聚结表示为百分比。在某些情况下，可添加搅拌，只要两个群体之间的搅拌程度相同即可。交联分区的稳定性可表示为与未交联分区相比聚结的减少。例如，如果两组乳液都以0聚结开始，并且在1小时时未交联乳液表现出80％聚结(例如如上定义)，并且交联乳液表现出20％聚结，则与未交联乳液相比，交联乳液增加的稳定性可表示为75％(在制定条件下聚结的减少)。在某些实施方案中，如通过诸如本段中所述的聚结测定所确定的，本文提供的方法和组合物可导致液滴的稳定性增加至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或它们之间的任何范围。

另一种可使用的用于聚结的测定是制备具有表面活性剂交联的液滴群体和没有表面活性剂交联的另一个群体，并使这两个群体(例如在液滴将在PCR测定中经受的条件下)运行通过感兴趣的加工系统(例如PCR系统，诸如Dropworks PCR系统)。如果使用可估计液滴体积的检测器，则可通过将样品体积除以平均液滴体积来估计在例如液滴发生器处产生的液滴的初始数量，例如，可以假设产生平均体积为0.57nL的液滴的20uL样品最初产生了约35,000个液滴。可计数通过检测器的液滴数量，并且此数量与初始数量的差值代表聚结的液滴；另选地或除此之外，可使用在检测器处测量的液滴体积来确定哪些液滴代表聚结的液滴，其中具有2倍预期体积或更大体积的液滴被认为是聚结的。从这些数字可确定交联相对于未交联的聚结的百分比，并将其进行比较。在此测定中，以百分比表示的聚结减少可对应于稳定性的增加。在某些实施方案中，如通过诸如本段中所述的聚结测定所确定的，本文提供的方法和组合物可导致液滴的稳定性增加至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或它们之间的任何范围。

可使用分区稳定性的其他测试，特别是模拟或再现可使用分区的条件的测试。例如，可在数字PCR系统中(所述系统在正常操作下由含有感兴趣的核酸的样品产生例如数万个液滴，其中材料的浓度和液滴形成条件使得大多数液滴(例如至少90％、95％、99％或99.9％的液滴)含有一种感兴趣的核酸或不含感兴趣的核酸)，可比较受控的运行，其中唯一的区别是一个或多个运行中有表面活性剂网络交联，而一个或多个其他运行中没有交联。例如，可在测试样品中组合已知量的第一测试寡核苷酸和第二测试寡核苷酸。两种测试寡核苷酸的摩尔量可相同或基本上相同或可不同；在某些实施方案中，每种的量是相同的或基本上相同的。所述样品还含有引物、缓冲剂、酶和PCR的任何其他必需组分；存在对第一寡核苷酸的扩增产物特异的第一荧光标记，并且存在对第二寡核苷酸的扩增产物特异的第二荧光标记；两种标记不同，并且在可检测到不同的波长下发出荧光。

测试样品被传输到液滴生成系统，诸如用于产生用于染料转移和聚结测试的液滴的所述Dropworks系统；然而，在这种情况下，系统流体地连接到PCR系统的主体(例如热循环仪和检测器)。对于测试样品的第一等分试样，通过将测试样品(水性分散相)流入液滴发生器中的第一入口，并且将包含表面活性剂(未处理以产生交联的表面活性剂网络)的连续相(例如油，诸如氟化油)流入液滴发生器中的第二入口来生成液滴；在液滴发生器内部，第一和第二入口相交，并且形成连续相中的样品液滴。应当理解，在其中分散相包含引发或促进交联以产生交联的表面活性剂网络的组分的实施方案中，不包括这些组分；相似地，如果液滴暴露于引发或促进交联的一种或多种条件，则那些条件不存在。液滴在单分散乳液中形成，例如从20uL样品分成例如20,000、25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；或50,000个或它们之间的任何范围的液滴，并且样品的浓度、流速和其他相关因素使得大多数液滴(例如至少90％、95％、99％、99.5％、99.9％、99.95％或99.99％的液滴)仅含有第一测试寡核苷酸中的一种，仅含有第二测试寡核苷酸中的一种，或不含两者中的任一种。第一和第二测试寡核苷酸可以是任何合适的长度，诸如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、55、57、60、62、65、67、70、75、80、85、90、95、100、110、120、150、170、200或250个或它们之间的任何范围的核苷酸，并且虽然一般来讲长度应该是相似或相同的，但长度也可以是相同或不同的。寡核苷酸可使用任何合适的序列，只要两个序列在扩增和检测时可互相区分即可。然后将液滴团块递送通过PCR系统，例如，递送到热循环仪然后到检测器。在一些情况下，热循环仪处的导管直径增加，从而减慢流速。检测器可以是能够检测单个液滴并区分所使用的两种不同荧光标记的任何检测器。优选地，检测器还能够确定液滴的体积以确定在液滴发生器与检测器之间聚结的液滴的百分比。确定不含扩增的寡核苷酸的液滴的总数、仅含有扩增的第一寡核苷酸的液滴的总数、仅含有扩增的第二寡核苷酸的液滴的总数以及含有扩增的第一和第二寡核苷酸两者的液滴的总数。在可检测液滴体积或与体积相关的量的检测器中，可确定聚结液滴的数量，其体积将为nX，其中n是已聚结的液滴数量并且X是未聚结液滴的体积。可将不含寡核苷酸的或仅含有第一寡核苷酸的扩增产物的或仅含有第二寡核苷酸的扩增产物的这些液滴的数量与含有扩增的第一和第二寡核苷酸两者的液滴数量相加；应当理解，含有两者的聚结液滴的数量已在上一步中计算过，因此不应再次相加。将后者的数量除以总液滴数并乘以100的值取为经受转移的液滴的百分比，即对于绝大多数此类液滴，两种寡核苷酸都存在或被扩增，因为它们中的一种从其初始液滴转移到检测到的液滴。对相同的样品运行相同的测试，不同之处在于这一次连续相中的表面活性剂和/或分散相中的组分和/或条件液滴在形成期间和/或之后暴露以产生待测试的交联表面活性剂网络。执行相同的计算来确定经受转移的液滴的第二个百分比。第一个百分比(未交联)可除以第二个数字(交联)以得到交联有效性的定量指示。例如，在使用生物素作为附接到表面活性剂分子的连接部分和使用链霉亲和素作为交联生物素的中间部分的系统中，运行包含寡核苷酸1和寡核苷酸2的第一轮运行，其中连续相中的表面活性剂没有附接的生物素部分并且分散相不含链霉亲和素。液滴发生器中产生20,000个液滴，并且将所述液滴运行通过热循环仪并到达检测器。检测器检测到18,000个无寡核苷酸的液滴；800个仅有寡核苷酸1的液滴；800个仅有寡核苷酸2的液滴；和400个具有寡核苷酸1和寡核苷酸2两者的液滴。此外，检测器检测到150个体积是正常液滴体积的至少两倍的液滴，其中50个含有寡核苷酸1和寡核苷酸2两者。转移“事件”的百分比为(400+(150-50))/20,000x100，或500/20,000x100＝2.5％。然后运行包含寡核苷酸1和寡核苷酸2的第二轮运行，其中连续相中的表面活性剂确实具有附接的生物素部分，并且分散相确实含有链霉亲和素。产生了20,000个液滴，并且检测器检测到18,000个无寡核苷酸的液滴；990个仅有寡核苷酸1的液滴；990个仅有寡核苷酸2的液滴；和20个具有寡核苷酸1和寡核苷酸2两者的液滴。此外，检测器检测到15个体积是正常液滴体积的至少两倍的液滴，其中5个含有寡核苷酸1和寡核苷酸2两者。转移“事件”的百分比为(20+(15-5))/20,000x100，或25/20,000x100＝0.125％。在这种情况下，可以认为液滴之间的转移已经改进了95％。应当理解，此数字不一定反映发生的所有转移过程(例如，寡核苷酸1转移到空液滴，或寡核苷酸1转移到另一个具有寡核苷酸1的液滴等)；然而，它可用作在PCR系统中保持液滴内容物离散方面的改进的适当指示。在某些实施方案中，可改进所述计算以考虑使得单个液滴中有2个相同寡核苷酸的寡核苷酸转移，前提条件是检测器具有足够的检测此类液滴之间的荧光强度差异的能力。在某些实施方案中，如通过诸如本段中所述的聚结测定所确定的，本文提供的方法和组合物可导致液滴的稳定性增加至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或它们之间的任何范围。

因此，在某些实施方案中，本文提供了一种增加乳液中的分区稳定性的方法，其中乳液包含在连续相中的多个分散相分区，并且其中分区包含在分区中的分散相与连续相之间的界面处的表面活性剂部分，所述方法包括在界面处产生表面活性剂部分的交联的表面活性剂网络，其中通过染料扩散测定(诸如如本文所述的测定)来评估稳定性的增加，并且其中表面活性剂网络稳定性，如染料扩散的减少所反映的，增加了至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、或100％或它们之间的任何值范围，例如增加了至少50％，诸如至少80％，在一些情况下至少90％。可使用任何合适的用于交联的方法，诸如如本文所述的方法。

在某些实施方案中，本文提供了一种增加乳液中的分区稳定性的方法，其中乳液包含在连续相中的多个分散相分区，并且其中分区包含在分区中的分散相与连续相之间的界面处的表面活性剂部分，所述方法包括在界面处产生表面活性剂部分的交联的表面活性剂网络，其中通过聚结测定(诸如如本文所述的测定)来评估稳定性的增加，并且其中表面活性剂网络稳定性，如聚结的减少所反映的，增加了至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、或100％或它们之间的任何值范围，例如增加了至少50％(诸如至少80％，在一些情况下至少90％)。可使用任何合适的用于交联的方法，诸如如本文所述的方法。

在某些实施方案中，本文提供了一种增加乳液中的分区稳定性的方法，其中乳液包含在连续相中的多个分散相分区，并且其中分区包含在分区中的分散相与连续相之间的界面处的表面活性剂部分，所述方法包括在界面处产生表面活性剂部分的交联的表面活性剂网络，其中通过PCR测定(诸如如本文所述的测定)来评估稳定性的增加，并且其中表面活性剂网络稳定性，如指示分区之间的串扰的PCR事件的减少所反映的，增加了至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、或100％或它们之间的任何值范围，例如增加了至少50％(诸如至少80％，在一些情况下至少90％)。可使用任何合适的用于交联的方法，诸如如本文所述的方法。

用于使交联的表面活性剂网络不稳定的方法

根据用于交联表面活性剂的特定化学性质，可使用多种不同的方法在使用后打破液滴(分区)，例如，当下游分析需要回收液滴内容物时。这可通过任何合适的方法完成，例如以化学方式或以机械方式。

在一个实施方案中，向乳液中添加破坏剂以破坏蛋白质交联剂，这导致后续的乳液解构。在一些实施方案中，酸、碱和/或过氧化物也可用于网络解构。在一个优选的实施方案中，氯仿用于网络解构。

在一个单独的实施方案中，可切割接头可用于在使用后打破液滴。可切割接头可选自由以下组成的组：酶促可切割接头、亲核试剂/碱敏感接头、还原敏感接头、光可切割接头、亲电子试剂/酸敏感接头和氧化敏感接头，例如，如在Leriche等人Bioorg.Med.Chem.20,571(2012)中所说明的。可切割接头的其他实例可在West等人,Current Drug Discovery Technologies,2,123(2005)中找到。

在一些实施方案中，可使用机械方法来破坏分区界面处的网络，包括但不限于冷冻、机械破裂、超声处理、加热和渗透压冲击。

在某些实施方案中，可使用特定的交联剂降解分子，包括但不限于针对基于核酸的交联剂的核酸酶和/或针对基于蛋白质的交联剂的蛋白酶。

水性添加剂

根据分区界面的稳健性，表面活性剂稳定的液滴可在一种或多种添加剂存在的情况下保持稳定。由于交联的表面活性剂网络产生的稳定性增加，具有交联的表面活性剂网络的分区与它们的未交联的替代物相比可耐受更高水平和/或不同组合的添加剂。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同分区相比，包含交联的表面活性剂网络的分区可耐受至少10％、20％、30％、40％、50％、70％、100％、150％、200％、500％、或1000％或它们之间的任何范围的量(例如浓度)的一种或多种添加剂。“耐受”额外的添加剂一般意指，与具有相同组成(不同之处在没有无交联的表面活性剂网络)的分区和/或含有它们的乳液相比，具有交联的表面活性剂网络的分区和/或含有它们的乳液对于它们的预期用途具有至少一样好的性能，或具有至少10％、20％、50％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、99.5％或99.9％一样好的性能，并且在一些情况下具有更好的性能。可通过任何合适的方式评价性能，诸如对于测定(例如PCR)，使用一个或多个已知浓度的对照样品，然后比较具有交联的分区相对于未交联的分区的结果的准确性和/或精度。

水相可含有一种或多种缓冲化合物。生物缓冲剂的常见实例包括但不限于tris、磷酸盐、柠檬酸盐等。

水相可含有一种或多种盐。

水相可含有一种或多种碳水化合物，包括但不限于以下列表：琼脂、琼脂糖、阿洛糖(Allose)、直链淀粉、阿拉伯糖(Arabinose)、阿拉伯糖醇(Arabitol)、羧甲基纤维素、纤维素、甲壳质、壳聚糖、软骨素、环糊精、右旋糖酐(Dextran)、糊精、右旋糖、吡喃葡糖基蔗糖(Erlose)、赤藓醇、赤藓糖、呋喃果糖、果糖、半乳甘露聚糖、半乳糖、葡聚糖(Glucan)、吡喃葡萄糖、葡糖胺、葡萄糖、糖原、糖胺聚糖、古洛糖(Gulose)、肝素、己糖醇、吡喃己糖、艾杜糖醇(Iditol)、肌醇、异麦芽糖醇、蔗果三糖(Kestose)、乳糖醇、乳糖、凝集素、松三糖、麦芽糖醇、麦芽糖糊精、麦芽糖、麦芽酮糖、甘露糖醇、甘露糖、松三糖、潘糖(Panose)、果胶、聚蔗糖、栎醇(Quercitol)、棉子糖、鼠李糖、核糖醇、呋喃核糖、核糖、核酮糖、芦丁糖(Rutinose)、山梨醇、淀粉、三氯蔗糖、蔗糖、塔格糖(Tagatose)、塔罗糖醇(Talitol)、苏糖醇(Threitol)、苏糖(Threose)、海藻糖、松二糖、木聚糖、木糖醇、木糖。

水相可含有一种或多种蛋白酶抑制剂，其可靶向天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和胰蛋白酶。

水相可含有一种或多种抗微生物剂。

水相可含有一种或多种拥挤剂，包括但不限于以下列表：1,2-丙二醇、羧甲基纤维素、乙二醇、甘油、PEG 200、PEG300、PEG 400、PEG 600、PEG 1000、PEG 1300、PEG 1600、PEG1450、PEG 1500、PEG 2000、PEG 3000、PEG 2050、PEG 3350、PEG 4000、PEG 4600、PEG 6000、PEG 8000、PEG 10000、PEG 12000、PEG 20000、PEG 35000、PEG 40000、PEG 108000、PEG218000、PEG 510000、PEG 90M、聚蔗糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇。

水相可含有一种或多种洗涤剂。洗涤剂可以是离子的或非离子的。

水相可含有一种或多种核苷酸或核苷酸的衍生物，包括但不限于以下列表：5-氟乳清酸(5-FOA)、腺嘌呤、腺苷、腺苷二磷酸、腺苷一磷酸、腺苷三磷酸、胞苷、胞苷二磷酸、胞苷一磷酸、胞苷三磷酸、胞嘧啶、脱氧腺苷、脱氧腺苷二磷酸、脱氧腺苷一磷酸、脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷、脱氧胞苷二磷酸、脱氧胞苷一磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷、脱氧鸟苷二磷酸、脱氧鸟苷一磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、鸟嘌呤、鸟苷、鸟苷二磷酸、鸟苷一磷酸、鸟苷三磷酸、次黄嘌呤、肌醇、胸苷、胸苷二磷酸、胸苷一磷酸、胸苷三磷酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶、尿苷、尿苷二磷酸、尿苷一磷酸、尿苷三磷酸。水相可含有一种或多种合成核苷酸衍生物。

水相可含有一种或多种氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸衍生的肽。

水相可含有一种或多种维生素。

水相可含有用于微生物的生长、繁殖或诱导、死亡或分析的一种或多种培养基添加剂。

可用于本文所述方法的聚合酶能够催化核苷酸的并入以延伸与目标核酸分子结合的寡核苷酸的3'羟基末端。此类聚合酶包括能够扩增和/或链置换的聚合酶。聚合酶可能带有或缺乏5'-3'外切酶活性。在其他实施方案中，聚合酶还具有逆转录酶活性(例如Bst(大片段)、Therminator、Therminator II)。示例性聚合酶包括但不限于BST(大片段)、DNA聚合酶I(大肠杆菌)、DNA聚合酶I、大(Klenow)片段、Klenow片段(3'-5'exo-)、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Deep VentR.(exo-)DNA聚合酶、Deep VentR DNA聚合酶、DyNAzyme、高保真DNA聚合酶、Therminator、Therminator II DNA聚合酶、AmpliTherm DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tgo DNA聚合酶、SP6 DNA聚合酶、Thr DNA聚合酶。可在本方法的反应中使用逆转录酶(RT)的以下非限制性实例以提高检测RNA序列时的性能：OmniScript、SensiScript、MonsterScript、Transcriptor、HIV RT、SuperScript III、ThermoScript、Thermo-X、ImProm II。RNA聚合酶的以下非限制性实例包括但不限于T3、T7、SP6、大肠杆菌RNA pol、RNA pol II和mtRNA pol。

可在本文所述方法中使用的缺口酶包括但不限于Nt.BspQI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.Bpu10I和Nt.Bpu10I。

其他化学添加剂包括导致pH或离子强度变化的那些添加剂。其他生物添加剂包括活的或死的生物体或其溶解物，包括但不限于病毒、细菌、真菌、古细菌、植物和哺乳动物细胞。MgCl2浓度和KCl浓度对于PCR是重要的，并且在一些实施方案中可调节MgCl2浓度和KCl浓度。诸如像triton-x100的清洁剂以及高蛋白质浓度会有所帮助。

组合物和方法

在某些实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含多个第一表面活性剂分子，所述第一表面活性剂分子已被修饰成在合适的条件下与第二表面活性剂分子交联。表面活性剂分子具有尾部和头部。修饰可采用连接到第一和/或第二表面活性剂分子的连接部分(例如多个连接部分)的形式，其中所述连接部分被配置成在合适的条件下与其自身(例如第一和第二连接部分相同)形成交联键，或者与另一个连接部分(例如第一和第二连接部分不同)形成交联键，或者与中间连接部分(例如与第一和第二连接部分之一或两者连接的中间连接部分)形成交联键。在某些实施方案中，第一和第二表面活性剂分子包含相同的表面活性剂类型，例如在结构上相同。在某些实施方案中，第一和第二表面活性剂分子包含不同的表面活性剂类型，例如在结构上不同。组合物的第一和/或第二表面活性剂分子可附接到任何合适的平均数量的连接部分，例如1-20个、1-15个、1-10个、2-20个、2-15个、2-10个、2-8个、2-6个、3-20个、3-15个、3-10个、3-8个、3-5个、4-20个、4-15个、4-10个、4-8个、5-20个、5-15个、5-10个、5-9个、6-20个、6-15个或6-10个连接部分，例如2-20个，诸如2-10个，在一些情况下3-10个。连接部分可通过任何合适的附接方法(诸如共价键或非共价键)附接到表面活性剂分子的任何合适的部分(诸如头部或尾部)。连接部分的长度可以是任何合适的长度，诸如表面活性剂的头部基团的最长尺寸的0.1-100倍、0.1-50倍、0.1-30倍、0.1-20倍、0.1-10倍、0.1-5倍、0.1-3倍、0.1-2倍、0.1-1倍、0.1-0.5倍、0.1-0.3倍、1-100倍、1-50倍、1-30倍、1-20倍、1-10倍、1-5倍、1-3倍或1-2倍，或表面活性剂的尾部基团的最长尺寸的0.1-100倍、0.1-50倍、0.1-30倍、0.1-20倍、0.1-10倍、0.1-5倍、0.1-3倍、0.1-2倍、0.1-1倍、0.1-0.5倍、0.1-0.3倍、1-100倍、1-50倍、1-30倍、1-20倍、1-10倍、1-5倍、1-3倍或1-2倍。在某些实施方案中，交联剂的长度为0.1-100nm、0.1-50nm、0.1-30nm、0.1-20nm、0.1-10nm、0.1-5nm、0.1-3nm、0.1-1nm、0.1-0.5nm、1-100nm、1-50nm、1-30nm、1-20nm、1-10nm、1-5nm或1-3nm。表面活性剂可以是任何合适的表面活性剂，诸如非离子、阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂包括含氟表面活性剂。在某些实施方案中，含氟表面活性剂具有通过醚键、酰胺键或脲键连接的头部和尾部；含氟表面活性剂具有通过脲键、醚键或酰胺键或它们的组合连接到碳氟化合物部分的聚乙烯部分。在某些实施方案中，含氟表面活性剂包含通过脲键、酰胺键或醚键连接到碳氟化合物部分的聚乙烯部分。在某些实施方案中，连接部分被配置成与中间部分结合但不与另一个连接部分结合。在某些实施方案中，连接部分是形成共价键的连接部分。在某些实施方案中，连接部分是形成非共价键的部分。合适的连接部分包括如本文所述的任何连接部分。在某些实施方案中，连接部分是生物素。在某些实施方案中，中间部分是生物素结合基团，诸如链霉亲和素或链霉亲和素衍生物。多个表面活性剂分子可包含在连续相中。组合物还可包含连续相，诸如疏水连续相；在某些实施方案中，第一表面活性剂分子包含在第一连续相中，例如作为胶束；在某些实施方案中，第二表面活性剂分子包含在第二连续相中，例如作为胶束，其中第一连续相和第二连续相可相同或不同。连续相可以是油，诸如氟化油。合适的油和氟化油如本文别处所述。组合物还可包含分散相；在某些实施方案中，分散相不含第一表面活性剂分子；在某些实施方案中，分散相不含第二表面活性剂分子。在某些实施方案中，分散相包含中间部分；在其中连接部分是生物素的情况下，中间部分可以是生物素结合部分，诸如链霉亲和素或链霉亲和素衍生物。

本文还提供了一种组合物，其含有连续相中的包含头部和尾部的多个第一表面活性剂分子，其中第一表面活性剂分子具有至少一个附接的第一连接部分。在一些情况下，表面活性剂分子具有多个附接的连接部分，例如2-20个、2-15个、2-10个、2-8个、2-6个、3-20个、3-15个、3-10个、3-8个、3-5个、4-20个、4-15个、4-10个、4-8个、5-20个、5-15个、5-10个、5-9个、6-20个、6-15个或6-10个连接部分，例如2-20个，诸如2-10个，在一些情况下3-10个。在一些情况下，附接是共价的。在一些情况下，附接是非共价的。在一些情况下，连接部分附接到第一表面活性剂的尾部。在一些情况下，连接部分连接到表面活性剂分子的头部。连接部分被配置成在合适的条件下互相连接，在一些情况下以共价方式连接，在其他情况下以非共价方式连接；与不同于第一连接部分的第二连接部分连接，在一些情况下以共价方式连接，在其他情况下以非共价方式连接；与中间连接部分连接，在一些情况下以共价方式连接，在其他情况下以非共价方式连接；或它们的任何组合。在某些实施方案中，组合物还包含多个第二表面活性剂分子，其中第二表面活性剂分子包含平均例如2-20个、2-15个、2-10个、2-8个、2-6个、3-20个、3-15个、3-10个、3-8个、3-5个、4-20个、4-15个、4-10个、4-8个、5-20个、5-15个、5-10个、5-9个、6-20个、6-15个或6-10个连接部分，例如2-20个，诸如2-10个，在一些情况下3-10个。在一些情况下，附接是共价的。在一些情况下，附接是非共价的。在一些情况下，第一连接部分和第二连接部分带相反电荷。组合物还可包含分散相。在一些情况下，分散相不含第一和/或第二表面活性剂分子。在一些情况下，分散相含有第一和/或第二表面活性剂分子。在一些情况下，分散相含有引发或促进第一连接部分之间、第一连接部分与中间连接部分之间、第一连接部分与第二连接部分之间或它们的组合的连接的一种或多种组分。在其中第一连接部分是例如生物素的实施方案中，分散相可含有例如生物素结合部分，诸如如本文所述的生物素结合部分中的一种，诸如链霉亲和素或链霉亲和素衍生物。

在某些实施方案中，本文提供了一种乳液，其包含连续相中的分散相分区，其中分散相的分区包含含有尾部和头部的多个表面活性剂分子，所述表面活性剂分子位于分区与连续相的界面处以形成表面活性剂分子层，并且其中多个表面活性剂分子互相交联以形成表面活性剂分子的交联网络。在某些实施方案中，交联度为1％-100％、2％-100％、5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、98％-100％或99％-100％，或至少5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％或它们之间的任何范围，例如20％-100，诸如40％-100％，在一些情况下60％-100％。可通过任何合适长度的交联键来进行交联，所述长度例如表面活性剂的头部基团的最长尺寸的0.1-100倍、0.1-50倍、0.1-30倍、0.1-20倍、0.1-10倍、0.1-5倍、0.1-3倍、0.1-2倍、0.1-1倍、0.1-0.5倍、0.1-0.3倍、1-100倍、1-50倍、1-30倍、1-20倍、1-10倍、1-5倍、1-3倍或1-2倍，或表面活性剂的尾部基团的最长尺寸或表面活性剂的头部基团的最长尺寸的0.1-100倍、0.1-50倍、0.1-30倍、0.1-20倍、0.1-10倍、0.1-5倍、0.1-3倍、0.1-2倍、0.1-1倍、0.1-0.5倍、0.1-0.3倍、1-100倍、1-50倍、1-30倍、1-20倍、1-10倍、1-5倍、1-3倍或1-2倍。在某些实施方案中，交联键的长度为0.1-100nm、0.1-50nm、0.1-30nm、0.1-20nm、0.1-10nm、0.1-5nm、0.1-3nm、0.1-1nm、0.1-0.5nm、1-100nm、1-50nm、1-30nm、1-20nm、1-10nm、1-5nm或1-3nm。表面活性剂分子可以是头对头交联的、尾对尾交联的或头对尾交联的。在某些实施方案中，表面活性剂分子包含相同的(即具有相同结构的)连接部分。在某些实施方案中，表面活性剂分子的某些部分包含与表面活性剂分子的其他部分中的连接部分不同的(即具有不同结构的)连接部分。除此之外或另选地，所有表面活性剂分子可以是相同的，即具有相同的结构，或者表面活性剂分子可包含具有2、3、4、5种或多于5种不同结构的分子的部分。在某些实施方案中，表面活性剂分子的第一部分包含形成部分交联键的第一连接部分，并且表面活性剂分子的第二部分包含形成部分交联键的第二连接部分(与第一连接部分相同或不同)。表面活性剂分子上连接部分的平均数可以为1-20个、1-15个、1-10个、2-20个、2-15个、2-10个、2-8个、2-6个、3-20个、3-15个、3-10个、3-8个、3-5个、4-20个、4-15个、4-10个、4-8个、5-20个、5-15个、5-10个、5-9个、6-20个、6-15个或6-10个，例如2-20个，诸如2-10个，在一些情况下3-10个。在某些实施方案中，连续相包括油，诸如如本文所述的氟化油。在某些实施方案中，分散相包括水相。在某些实施方案中，表面活性剂包括如本文所述的氟化表面活性剂。交联可以是共价的、非共价的或它们的组合。在某些实施方案中，表面活性剂分子包含一个或多个附接的生物素部分，并且交联是通过生物素结合中间部分(例如链霉亲和素或链霉亲和素衍生物)进行的。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过染料扩散测试(诸如如本文所述的染料扩散测试)中的染料扩散的减少所测量的。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过PCR测试(诸如如本文所述的PCR测试)所测量的。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过聚结测定(诸如如本文所述的聚结测定)所测量的。

在某些实施方案中，本文提供了在分区的乳液中进行过程的方法，其中分区在其表面处包含表面活性剂分子的交联网络。因此，本文提供了在连续相中的分散相的分区的乳液中进行过程的方法，其包括(i)提供连续相中分散相的分区的乳液，其中分散相的分区包含含有尾部和头部的多个表面活性剂分子，所述表面活性剂分子位于分区与连续相的界面处以形成表面活性剂分子层，并且其中多个表面活性剂分子互相交联以形成表面活性剂分子的交联网络；以及(ii)对分区执行所述过程。在某些实施方案中，交联度为1％-100％、2％-100％、5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、98％-100％或99％-100％，或至少5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％或它们之间的任何范围，例如20％-100，诸如40％-100％，在一些情况下60％-100％。可通过任何合适长度的交联键来进行交联，所述长度例如表面活性剂的头部基团的最长尺寸的0.1-100倍、0.1-50倍、0.1-30倍、0.1-20倍、0.1-10倍、0.1-5倍、0.1-3倍、0.1-2倍、0.1-1倍、0.1-0.5倍、0.1-0.3倍、1-100倍、1-50倍、1-30倍、1-20倍、1-10倍、1-5倍、1-3倍或1-2倍，或表面活性剂的尾部基团的最长尺寸或表面活性剂的头部基团的最长尺寸的0.1-100倍、0.1-50倍、0.1-30倍、0.1-20倍、0.1-10倍、0.1-5倍、0.1-3倍、0.1-2倍、0.1-1倍、0.1-0.5倍、0.1-0.3倍、1-100倍、1-50倍、1-30倍、1-20倍、1-10倍、1-5倍、1-3倍或1-2倍。在某些实施方案中，交联键的长度为0.1-100nm、0.1-50nm、0.1-30nm、0.1-20nm、0.1-10nm、0.1-5nm、0.1-3nm、0.1-1nm、0.1-0.5nm、1-100nm、1-50nm、1-30nm、1-20nm、1-10nm、1-5nm或1-3nm。表面活性剂分子可以是头对头交联的、尾对尾交联的或头对尾交联的。在某些实施方案中，表面活性剂分子包含相同的(即具有相同结构的)连接部分。在某些实施方案中，表面活性剂分子的某些部分包含与表面活性剂分子的其他部分中的连接部分不同的(即具有不同结构的)连接部分。除此之外或另选地，所有表面活性剂分子可以是相同的，即具有相同的结构，或者表面活性剂分子可包含具有2、3、4、5种或多于5种不同结构的分子的部分。在某些实施方案中，表面活性剂分子的第一部分包含形成部分交联键的第一连接部分，并且表面活性剂分子的第二部分包含形成部分交联键的第二连接部分(与第一连接部分相同或不同)。表面活性剂分子上连接部分的平均数可以为1-20个、1-15个、1-10个、2-20个、2-15个、2-10个、2-8个、2-6个、3-20个、3-15个、3-10个、3-8个、3-5个、4-20个、4-15个、4-10个、4-8个、5-20个、5-15个、5-10个、5-9个、6-20个、6-15个或6-10个，例如2-20个，诸如2-10个，在一些情况下3-10个。在某些实施方案中，连续相包括油，诸如如本文所述的氟化油。在某些实施方案中，分散相包括水相。在某些实施方案中，表面活性剂包括如本文所述的氟化表面活性剂。交联可以是共价的、非共价的或它们的组合。在某些实施方案中，表面活性剂分子包含一个或多个附接的生物素部分，并且交联是通过生物素结合中间部分(例如链霉亲和素或链霉亲和素衍生物)进行的。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过染料扩散测试(诸如如本文所述的染料扩散测试)中的染料扩散的减少所测量的。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过PCR测试(诸如如本文所述的PCR测试)所测量的。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过聚结测定(诸如如本文所述的聚结测定)所测量的。所述方法还可包括形成交联的表面活性剂网络，例如通过如本文所述的方法。在某些实施方案中，通过在其中分散相在连续相中形成多个分区的条件下使包含含有至少一个连接部分的多个表面活性剂分子的连续相与分散相接触，以及在分区形成期间和/或之后提供引发和/或促进形成包含连接部分的交联键以形成表面活性剂分子的交联网络(其中连接部分形成从一个表面活性剂分子到至少一个其他表面活性剂分子的交联键)的条件，形成或已形成表面活性剂分子的交联网络。在某些实施方案中，所述条件包括使连接部分与分散相中引发和/或促进交联反应的一种或多种组分接触。在某些实施方案中，连接部分是生物素并且分散相含有生物素结合部分，例如链霉亲和素或链霉亲和素衍生物。所述过程可以是任何合适的过程，诸如数字PCR，高通量筛选，菌株和蛋白质工程，以及细胞、蛋白质和化学分析。在某些实施方案中，所述过程是数字PCR。在某些实施方案中，所述过程还包括破开多个分区以例如释放分区中的分散相，例如破开至少5％、10％、20％、50％、70％、80％、90％、95％或99％的分区或它们之间的任何范围。打破分区的方法可如本文所述。

在某些实施方案中，本文提供了用于产生连续相中的分散相的分区的乳液的方法，其中所述分区在与连续相的界面处包含表面活性剂分子的交联网络。在某些实施方案中，本文提供了一种用于产生连续相中的分散相的分区的乳液的方法，其中分散相的分区包含含有尾部和头部的多个表面活性剂分子，所述表面活性剂分子位于分区与连续相的界面处以形成表面活性剂分子层，所述方法包括(i)使连续相与分散相接触，其中(a)连续相包含含有至少一个连接部分的多个表面活性剂分子，或(b)分散相包含含有至少一个连接部分的多个表面活性剂分子，或(c)在其中分散相在连续相中形成多个分区的条件下的(a)和(b)两者；和(ii)在分区形成期间和/或之后提供引发和/或促进形成包含连接部分的表面活性剂分子之间的交联键的条件，以形成表面活性剂分子的交联网络。在某些实施方案中，连续相含有具有附接的连接部分的表面活性剂分子而分散相不含；在某些实施方案中，分散相含有具有附接的连接部分的表面活性剂分子而连续相不含；在某些实施方案中，连续相含有具有第一附接的连接部分的第一表面活性剂，而分散相含有具有第二附接的连接部分的第二表面活性剂，其中第一和第二表面活性剂可相同或不同，且/或第一和第二连接部分可相同或不同。在某些实施方案中，继续所述过程，直到交联度为1％-100％、2％-100％、5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、95％-100％、98％-100％或99％-100％，或至少5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％或它们之间的任何范围，例如20％-100，诸如40％-100％，在一些情况下60％-100％。形成的交联键可以是任何合适的长度，例如表面活性剂的头部基团的最长尺寸的0.1-100倍、0.1-50倍、0.1-30倍、0.1-20倍、0.1-10倍、0.1-5倍、0.1-3倍、0.1-2倍、0.1-1倍、0.1-0.5倍、0.1-0.3倍、1-100倍、1-50倍、1-30倍、1-20倍、1-10倍、1-5倍、1-3倍或1-2倍，或表面活性剂的尾部基团的最长尺寸或表面活性剂的头部基团的最长尺寸的0.1-100倍、0.1-50倍、0.1-30倍、0.1-20倍、0.1-10倍、0.1-5倍、0.1-3倍、0.1-2倍、0.1-1倍、0.1-0.5倍、0.1-0.3倍、1-100倍、1-50倍、1-30倍、1-20倍、1-10倍、1-5倍、1-3倍或1-2倍。在某些实施方案中，交联键的长度为0.1-100nm、0.1-50nm、0.1-30nm、0.1-20nm、0.1-10nm、0.1-5nm、0.1-3nm、0.1-1nm、0.1-0.5nm、1-100nm、1-50nm、1-30nm、1-20nm、1-10nm、1-5nm或1-3nm。表面活性剂分子可以是头对头交联的、尾对尾交联的或头对尾交联的。表面活性剂分子上连接部分的平均数可以为1-20个、1-15个、1-10个、2-20个、2-15个、2-10个、2-8个、2-6个、3-20个、3-15个、3-10个、3-8个、3-5个、4-20个、4-15个、4-10个、4-8个、5-20个、5-15个、5-10个、5-9个、6-20个、6-15个或6-10个，例如2-20个，诸如2-10个，在一些情况下3-10个。在某些实施方案中，连续相包括油，诸如如本文所述的氟化油。在某些实施方案中，分散相包括水相。在某些实施方案中，表面活性剂包括如本文所述的氟化表面活性剂。在某些实施方案中，分散相包含与连接部分接触时引发和/或促进形成包含连接部分的交联键的一种或多种组分。在某些实施方案中，诸如当连接部分包含生物素并且中间部分包含生物素结合部分(诸如链霉亲和素或链霉亲和素衍生物)时，所述一种或多种组分包含与表面活性剂连接部分形成一个或多个键的一种或多种中间连接部分。在某些实施方案中，表面活性剂包括如本文所述的氟化表面活性剂。交联可以是共价的、非共价的或它们的组合。交联键可以是头对头交联键、尾对尾交联键或头对尾交联键。在分区形成期间和/或之后，将分区暴露于引发和/或促进形成包含连接部分的交联键的外部刺激，诸如光。在某些实施方案中，表面活性剂分子包含一个或多个附接的生物素部分，并且交联是通过生物素结合中间部分(例如链霉亲和素或链霉亲和素衍生物)进行的。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，通过所述方法产生的表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过染料扩散测试(诸如如本文所述的染料扩散测试)中的染料扩散的减少所测量的。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，通过所述方法产生的表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过PCR测试(诸如如本文所述的PCR测试)所测量的。在某些实施方案中，与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，通过所述方法产生的表面活性剂分子的交联网络使乳液中分区的稳定性增加了至少20％，如通过聚结测定(诸如如本文所述的聚结测定)所测量的。

在某些实施方案中，本文提供了一种制备包含油连续相中的多个分散水相的分区的乳液的方法，其中分区还包含在分区表面处的表面活性剂分子的交联网络，所述方法包括制备待分散的水相，制备包含经修饰的表面活性剂的油相，其中经修饰的表面活性剂包含尾部和头部并且还包含连接部分；以及将水相和油相混合以形成油中多个水相的分区的乳液，其中经修饰的表面活性剂分子互相形成交联键，以在分区与连续相的界面处形成表面活性剂分子的交联网络。所述混合可通过涡旋、移液、注射、摇动等批量进行，或在可以是碰撞型装置的微流体液滴形成装置(诸如T形接头液滴发生装置)中进行成；在某些实施方案中，所述混合通过微流体T形接头、流动专用接头、反向y接头、多足式接头或它们的组合进行。在某些实施方案中，用于产生乳液的系统嵌入较大的仪器中，诸如含有样品输送模块、液滴发生器模块、热循环仪模块、检测模块、废物管理模块或它们的组合的仪器。较大的仪器可具有嵌入的微流体装置、管道、容器或大桶。仪器可包含控制仪器(包括但不限于仪器整体或微流体装置的性能)的相关软件。

本文还提供了试剂盒。试剂盒可包含含有用于形成乳液的多个第一表面活性剂分子的第一容器(其中第一表面活性剂分子包含用于与其他表面活性剂分子直接或间接交联的多个第一连接部分)和容纳第一容器的包装。试剂盒还可包含含有引发或促进第一容器的表面活性剂的连接部分之间的交联反应的一种或多种组分的第二容器和容纳第二容器的包装。试剂盒可含有第三容器(其含有包含第二连接部分的多个第二表面活性剂分子)和所述容器的包装。试剂盒还可包含使用说明。

尽管本文已示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见的是，此类实施方案仅作为实例提供。本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换而不偏离本发明。应当理解的是，可以在实践本发明时采用在本文中描述的本发明的实施方案的各种替代方案。所意图的是，以下权利要求限定本发明的范围以及由此涵盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。

Claims (170)

1.一种组合物，其包含含有尾部和头部的多个第一表面活性剂分子，其中所述第一表面活性剂分子包含每个表面活性剂分子平均2-10个第一连接部分，其中所述第一连接部分被配置成

(i)在合适的条件下互相连接，

(ii)在合适的条件下与第二连接部分连接，其中所述第二连接部分附接到包含尾部和头部的第二表面活性剂分子，并且其中所述第二连接部分与所述第一连接部分不同，或

(iii)在合适的条件下与中间连接部分连接，或它们的组合。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一连接部分附接到所述第一表面活性剂分子的所述尾部。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一连接部分附接到所述第一表面活性剂分子的所述头部。

4.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二连接部分附接到所述第二表面活性剂分子的所述头部。

5.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述第二连接部分附接到所述第二表面活性剂分子的所述尾部。

6.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述连接部分被配置成在合适的条件下形成一个或多个共价键。

7.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述连接部分被配置成在合适的条件下形成一个或多个非共价键。

8.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含多个所述第二表面活性剂分子，其中所述第二表面活性剂分子包含每个表面活性剂分子平均2-10个所述第二连接部分。

9.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一连接部分和第二连接部分带相反电荷。

10.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含

含有所述第一表面活性剂分子的连续相。

11.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含含有所述第二表面活性剂分子的连续相。

12.如权利要求10或11所述的组合物，其还包含分散相。

13.如权利要求12所述的组合物，其中所述分散相不含所述第一表面活性剂分子。

14.如权利要求12或13所述的组合物，其中所述分散相不含所述第二表面活性剂分子。

15.如权利要求12所述的组合物，其中所述分散相含有所述中间连接部分。

16.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含含有所述第一表面活性剂分子的分散相。

17.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含含有所述第二表面活性剂分子的分散相。

18.如权利要求16或17所述的组合物，其还包含连续相。

19.如权利要求18所述的组合物，其中所述连续相不含所述第一表面活性剂分子。

20.如权利要求18所述的组合物，其中所述连续相不含所述第二表面活性剂分子。

21.如权利要求18所述的组合物，其中所述连续相含有所述中间连接部分。

22.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂部分包含含有生物素的所述第一连接部分和包含一个或多个生物素结合部分的所述中间连接部分。

23.如权利要求22所述的组合物，其中所述生物素结合部分包含链霉亲和素或链霉亲和素衍生物。

24.如权利要求6-23中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂分子在所述连续相中形成胶束。

25.如权利要求6-24中任一项所述的组合物，其中所述连续相包括油。

26.如权利要求25所述的组合物，其中所述油包括烃油或硅油。

27.如权利要求25所述的组合物，其中所述油包括氟化油。

28.如权利要求1所述的组合物，其中所述表面活性剂是含氟表面活性剂。

29.一种组合物，其包含含有连续相中的分散相的分区的乳液，其中所述分散相的所述分区包含含有尾部和头部的多个表面活性剂分子，所述多个表面活性剂分子位于所述分区与所述连续相的界面处以形成表面活性剂分子层，并且其中所述多个表面活性剂分子互相交联以形成表面活性剂分子的交联网络。

30.如权利要求29所述的组合物，其中所述表面活性剂分子的交联网络的交联度为20％-100％。

31.如权利要求29或30的组合物，其中所述交联通过平均长度为所述表面活性剂的所述尾部长度的5％-500％的交联键来进行。

32.如权利要求中29-31中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂分子在所述表面活性剂分子的所述尾部处互相交联。

33.如权利要求29-31中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂分子在所述表面活性剂分子的所述头部处互相交联。

34.如权利要求29-33中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂分子的第一部分包含形成部分所述交联键的第一连接部分，并且其中每个表面活性剂分子的第一连接部分的平均数为2-10。

35.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂分子的第二部分包含形成部分所述交联键的、与所述第一连接部分不同的第二连接部分，并且其中每个表面活性剂分子的第二连接部分的平均数为2-10。

36.如权利要求29-35中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂分子通过交联键进行交联，其中所述交联键的平均长度为1-100nm。

37.如权利要求29-36中任一项所述的组合物，其中所述分散相包括水相并且所述连续相包括油。

38.如权利要求37所述的组合物，其中所述油包括氟化油。

39.如权利要求29-38中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂包括含氟表面活性剂。

40.如权利要求29-39中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂分子通过非共价键进行交联。

41.如权利要求29-39中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂分子通过共价键进行交联。

42.如权利要求29-40中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂分子包含生物素部分并且通过生物素结合部分进行交联。

43.如权利要求42所述的组合物，其中所述生物素结合部分包含链霉亲和素或链霉亲和素衍生物。

44.如权利要求43所述的组合物，其中所述表面活性剂分子包含每个表面活性剂分子平均2-10个生物素部分。

45.如权利要求29-44中任一项所述的组合物，其中与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，所述表面活性剂分子的交联网络使所述乳液中所述分区的稳定性增加了至少20％，如通过染料扩散测试中的染料扩散的减少所测量的。

46.如权利要求29-45中任一项所述的组合物，其中与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，所述表面活性剂分子的交联网络使所述乳液中所述分区的稳定性增加了至少20％，如通过PCR测试所测量的。

47.如权利要求29-46中任一项所述的组合物，其中与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，所述表面活性剂分子的交联网络使所述乳液中所述分区的稳定性增加了至少20％，如通过聚结测定所测量的。

48.一种在连续相中的分散相的分区的乳液中进行过程的方法，其包括

(i)提供所述连续相中的分散相的分区的乳液，其中所述分散相的所述分区包含含有尾部和头部的多个表面活性剂分子，所述多个表面活性剂分子位于所述分区与所述连续相的界面处以形成表面活性剂分子层，并且其中所述多个表面活性剂分子互相交联以形成表面活性剂分子的交联网络；以及

(ii)对所述分区执行所述过程。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述表面活性剂分子的交联网络的交联度为20％-100％。

50.如权利要求48或49所述的方法，其中所述交联通过平均长度为所述表面活性剂的所述尾部长度的5％-500％的交联键来进行。

51.如权利要求48-50中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂分子在所述表面活性剂分子的所述尾部处互相交联。

52.如权利要求48-50中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂分子在所述表面活性剂分子的头部处互相交联。

53.如权利要求48-52中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂分子的第一部分包含形成部分所述交联键的第一连接部分，并且其中每个表面活性剂分子的第一连接部分的平均数为2-10。

54.如权利要求48-53中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂分子的第二部分包含形成部分所述交联键的、与所述第一连接部分不同的第二连接部分，并且其中每个表面活性剂分子的第二连接部分的平均数为2-10。

55.如权利要求48-54中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂分子通过交联键进行交联，并且其中所述交联键的平均长度为1-100nm。

56.如权利要求48-55中任一项所述的方法，其中所述分散相是水相并且所述连续相是油。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述油是氟化油。

58.如权利要求48-57中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂包括含氟表面活性剂。

59.如权利要求48-58中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂分子通过非共价键进行交联。

60.如权利要求48-58中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂分子通过共价键进行交联。

61.如权利要求59所述的方法，其中所述表面活性剂分子通过生物素-生物素结合部分相互作用进行交联。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述生物素结合部分包括链霉亲和素或链霉亲和素衍生物。

63.如权利要求61所述的方法，其中所述表面活性剂分子包含每个表面活性剂分子平均2-10个生物素部分。

64.如权利要求48-63中任一项所述的方法，其还包括在所述分区中形成所述表面活性剂分子的交联网络。

65.如权利要求48-64中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂分子的交联网络已通过以下形成：在其中所述分散相在所述连续相中形成多个分区的条件下使包含含有至少一个连接部分的多个表面活性剂分子的连续相与分散相接触，以及在所述分区形成期间和/或之后提供引发和/或促进形成包含所述连接部分的交联键以形成表面活性剂分子的交联网络的条件，其中所述连接部分形成从一个表面活性剂分子到至少一个其他表面活性剂分子的交联键。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述分散相包含在与所述连接部分接触时引发和/或促进形成包含所述连接部分的交联键的一种或多种组分。

67.如权利要求65所述的方法，其中所述分区暴露于引发和/或促进形成包含所述连接部分的交联键的外部刺激。

68.如权利要求48-67中任一项所述的方法，其中所述过程包括化学分析；蛋白质或菌株工程；基于核酸、蛋白质或细胞的测定；分选；分离；或化学和/或生化合成；或它们的组合。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述过程包括核酸测定。

70.如权利要求69所述的方法，其中所述过程包括聚合酶链反应(PCR)。

71.如权利要求48-70中任一项所述的方法，其中与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，所述表面活性剂分子的交联网络使所述乳液中所述分区的稳定性增加了至少20％，如通过染料扩散测试中的染料扩散的减少所测量的。

72.如权利要求48-71中任一项所述的方法，其中与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，所述表面活性剂分子的交联网络使所述乳液中所述分区的稳定性增加了至少20％，如通过PCR测试所测量的。

73.一种用于产生连续相中的分散相的分区的乳液的方法，其中所述分散相的所述分区包含含有尾部和头部的多个表面活性剂分子，所述多个表面活性剂分子位于所述分区与所述连续相的界面处以形成表面活性剂分子层，所述方法包括

(i)在其中所述分散相在所述连续相中形成多个分区的条件下使连续相与分散相接触，其中

(a)所述连续相包含含有至少一个连接部分的多个表面活性剂分子，或

(b)所述分散相包含含有至少一个连接部分的多个表面活性剂分子，或

(c)(a)和(b)两者；

和

(ii)在所述分区形成期间和/或之后提供引发和/或促进形成包含所述连接部分的表面活性剂分子之间的交联键的条件，以形成表面活性剂分子的交联网络。

74.如权利要求73所述的方法，其中所述连续相包含含有连接部分的表面活性剂分子，而所述分散相不包含含有连接部分的表面活性剂分子。

75.如权利要求73或74所述的方法，其中所述连接部分和所述交联键的其他组分，如果存在，形成长度为所述表面活性剂的所述尾部长度的5％-500％的交联键。

76.如权利要求73-75中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂分子包含每个表面活性剂分子平均2-10个连接部分。

77.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其中所述条件和/或连接部分数量使得所述表面活性剂分子的交联网络的完成度为20％-100％。

78.如权利要求73-77中任一项所述的方法，其中所述连接部分附接到所述表面活性剂分子的所述尾部，并且所述交联键在所述表面活性剂分子的所述尾部之间形成。

79.如权利要求73-77中任一项所述的方法，其中所述连接部分附接到所述表面活性剂分子的所述头部，并且所述交联键在所述表面活性剂分子的所述头部之间形成。

80.如权利要求73-79中任一项所述的方法，其中所述分散相包含在与所述连接部分接触时引发和/或促进形成包含所述连接部分的交联键的一种或多种组分。

81.如权利要求60所述的方法，其中所述一种或多种组分包含与所述表面活性剂连接部分形成一个或多个键的一个或多个中间连接部分。

82.如权利要求81所述的方法，其中所述表面活性剂连接部分包含生物素，并且所述中间连接部分包含生物素结合部分。

83.如权利要求82所述的方法，其中所述生物素结合部分包括链霉亲和素和/或链霉亲和素衍生物。

84.如权利要求73-83中任一项所述的方法，其中所述分区暴露于引发和/或促进形成包含所述连接部分的交联键的外部刺激。

85.如权利要求84所述的方法，其中所述外部刺激包括光。

86.如权利要求73-85中任一项所述的方法，其中所述连续相包括油并且所述分散相包括水相。

87.如权利要求86所述的方法，其中所述油包括氟化油。

88.如权利要求73-87中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂包括含氟表面活性剂。

89.如权利要求73-88中任一项所述的方法，其中与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，所述表面活性剂分子的交联网络使所述乳液中所述分区的稳定性增加了至少20％，如通过染料扩散测试中的染料扩散的减少所测量的。

90.如权利要求73-89中任一项所述的方法，其中与没有交联的表面活性剂网络的相同乳液相比，所述表面活性剂分子的交联网络使所述乳液中所述分区的稳定性增加了至少20％，如通过PCR测试所测量的。

91.一种制备包含油连续相中的多个分散水相的分区的乳液的方法，其中所述分区还包含在所述分区表面处的表面活性剂分子的交联网络，所述方法包括制备待分散的水相，制备包含经修饰的表面活性剂的油相，其中所述经修饰的表面活性剂包含尾部和头部并且还包含连接部分；以及将所述水相和所述油相混合以形成所述油中多个所述水相的分区的乳液，其中所述经修饰的表面活性剂分子互相形成交联键，以在所述分区与所述连续相的界面处形成表面活性剂分子的交联网络。

92.如权利要求91所述的方法，其中所述混合通过涡旋、移液、注射、摇动批量完成。

93.如权利要求91所述的方法，其中所述混合通过微流体液滴形成装置进行。

94.如权利要求93所述的方法，其中所述混合通过微流体T形接头、流动专用接头、反向y接头、多足式接头或它们的组合进行。

95.如权利要求91-94中任一项所述的方法，其中用于产生所述乳液的系统嵌入较大的仪器中。

96.如权利要求95所述的方法，其中所述仪器是含有样品输送模块、液滴发生器模块、热循环仪模块、检测模块、废物管理模块或它们的组合的仪器。

97.如权利要求95所述的方法，其中所述较大的仪器具有嵌入的微流体装置、管道、容器或大桶。

98.如权利要求95所述的方法，其中所述仪器包含控制所述仪器的相关软件，所述控制包括但不限于控制所述仪器整体或所述微流体装置的性能。

99.一种用于防止包含连续相中的分散相的分区的乳液中的分区聚结的方法，其包括在所述分区与所述连续相之间的界面处形成表面活性剂分子的交联网络。

100.如权利要求99所述的方法，其中所述分区的直径为平均直径大于1um、5um、10um、20um、30um、40um、50um、60um、70um或80um，诸如大于10um。

101.如权利要求98或99所述的方法，其中所述乳液处于高于30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃或90℃，诸如高于70℃的温度下。

102.一种用于在微流体装置中传输、热循环、孵育、分选或分析包含连续相中的分散相的分区的乳液的方法，其中所述液滴包含在所述分区和所述连续相的界面处的交联的表面活性剂分子网络。

103.一种在包含连续相中的水相的分区的乳液的分区中执行PCR的方法，其中所述分区包含交联剂、聚合酶、核苷酸、模板DNA、引物和探针/或DNA结合染料，并且所述连续相包含含有一个或多个连接部分的表面活性剂分子。

104.一种方法，其包括

(i)形成包含连续相中的多个包含分散相的分区的乳液，其中所述分区在与所述连续相的界面处包含含有多个表面活性剂分子的表面活性剂层；

(ii)在所述界面处交联表面活性剂分子以形成交联的表面活性剂网络；

(iii)对所述分区执行过程；以及

(iv)处理所述交联的表面活性剂网络以降低交联度。

105.如权利要求104所述的方法，其还包括破开多个所述分区以释放所述分区中的分散相。

106.如权利要求104或105所述的方法，其中所述表面活性剂包括含氟表面活性剂并且所述连续相包括氟化油。

107.如权利要求104-106中任一项所述的方法，其中所述过程包括聚合酶链反应。

108.一种组合物，其包含连续相，其中所述连续相包含多个表面活性剂分子，所述多个表面活性剂分子包含附接到所述表面活性剂分子的连接部分，其中所述部分在合适的条件下互相形成交联键。

109.如权利要求108所述的组合物，其中所述连续相待用于制备乳液

110.如权利要求108或109所述的组合物，其中所述部分在所述连续相中基本上不相互作用而交联。

111.如权利要求108-110中任一项所述的组合物，其中所述部分在合适的条件下形成非共价交联键。

112.如权利要求108-111中任一项所述的组合物，其中所述部分在合适的条件下形成共价交联键。

113.如权利要求108-112中任一项所述的组合物，其中所述连续相包括油。

114.如权利要求113所述的组合物，其中所述油是氟化油。

115.如权利要求114的组合物，其中所述氟化油是(3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷)、甲基九氟丁醚、甲基九氟异丁醚、乙基九氟异丁醚、乙基九氟丁醚、(戊烷,1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-十氟-3-甲氧基-4-(三氟甲基-))、异丙醇、(1,2-反式-二氯乙烯)、(丁烷,1,1,1,2,2,3,3,4,4-九氟-4-甲氧基-)、(1,1,1,2,2,4,5,5,5-九氟-4-(三氟甲基)-3-戊酮)、(呋喃,2,3,3,4,4-五氟四氢-5-甲氧基-2,5-双[1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)乙基]-)、包含5至18个碳原子的全氟化合物、聚氯三氟乙烯、(2,2,2-三氟乙醇)、Novec 8200^TM、Novec 71DE^TM、Novec 7100^TM、Novec 7200DL^TM、Novec 7300DL^TM、Novec71IPA^TM、Novec 72FL^TM、Novec 7500^TM、Novec 71DA^TM、Novec 7100DL^TM、Novec 7000^TM、Novec7200^TM、Novec 7300^TM、Novec 72DA^TM、Novec 72DE^TM、Novec 649^TM、Novec 73DE^TM、Novec7700^TM、Novec 612^TM、FC-40^TM、FC-43^TM、FC-70^TM、FC-72^TM、FC-770^TM、FC-3283^TM、FC-3284^TM、PF-5056^TM、PF-5058^TM、卤化碳0.8^TM、卤化碳1.8^TM、卤化碳4.2^TM、卤化碳6.3^TM、卤化碳27^TM、卤化碳56^TM、卤化碳95^TM、卤化碳200^TM、卤化碳400^TM、卤化碳700^TM、卤化碳1000N^TM、Uniflor 4622R^TM、Uniflor 8172^TM、Uniflor 8472CP^TM、Uniflor 8512S^TM、Uniflor 8731^TM、Uniflor 8917^TM、Uniflor 8951、TRIFLUNOX 3005^TM、TRIFLUNOX 3007^TM、TRIFLUNOX 3015^TM、TRIFLUNOX3032^TM、TRIFLUNOX 3068^TM、TRIFLUNOX 3150^TM、TRIFLUNOX 3220^TM或TRIFLUNOX 3460^TM或它们的组合。

116.如权利要求114所述的组合物，其中所述氟化油包含(3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷)；(呋喃,2,3,3,4,4-五氟四氢-5-甲氧基-2,5-双[1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)乙基]-)；包含5至18个碳原子的全氟化合物；或它们的组合。

117.如权利要求108-116中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂包括含氟表面活性剂。

118.如权利要求117所述的组合物，其中所述含氟表面活性剂包括具有通过醚键、酰胺键或脲键连接的头部和尾部的含氟表面活性剂；具有通过脲键、醚键或酰胺键或它们的组合连接到碳氟化合物部分的聚乙烯部分的含氟表面活性剂。

119.如权利要求117所述的组合物，其中所述含氟表面活性剂包含通过脲键、酰胺键或醚键连接至碳氟化合物部分的聚乙烯部分。

120.如权利要求108-119中任一项所述的组合物，其中在合适条件下形成的所述交联键包括直接交联键。

121.如权利要求108-119中任一项所述的组合物，其中在合适条件下形成的所述交联键包括间接交联键。

122.如权利要求121所述的组合物，其中所述连接部分包含生物素。

123.如权利要求108-122中任一项所述的组合物，其中每个表面活性剂分子包含平均至少2个连接部分。

124.如权利要求108-122中任一项所述的组合物，其中每个表面活性剂分子包含平均至少4个连接部分。

125.如权利要求108-124中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂分子的所述连接部分使得当它们在合适条件下反应时，所得的表面活性剂分子之间的交联键为1-100nm。

126.如权利要求108-125中任一项所述的组合物，其中在合适条件下在连接部分之间形成的所述交联键具有20kJ/mol与200kJ/mol之间的键强度。

127.如权利要求108-126中任一项所述的组合物，其中所述连续相中的表面活性剂分子的浓度为0.5％至2％重量/体积。

128.一种组合物，其包含在连续相中的分散相的分区的乳液形成中使用的所述分散相，其中所述乳液中所述分区与所述连续相的界面包含含有交联部分的多个表面活性剂分子，其中所述分散相包含在合适的条件下引发和/或促进所述交联部分之间的交联过程的一种或多种组分。

129.如权利要求128所述的组合物，其中所述分散相不与连续相接触。

130.如权利要求128或129所述的组合物，其中所述分散相包括水相。

131.如权利要求128-130中任一项所述的组合物，其中所述分散相还包含在合适条件下引发和/或促进非交联过程的一种或多种额外组分。

132.如权利要求131所述的组合物，其中所述非交联过程包括化学反应。

133.如权利要求132所述的组合物，其中所述组分包含用于进行聚合酶链反应的核酸和组分。

134.如权利要求128-133中任一项所述的组合物，其中所述交联过程包括共价相互作用。

135.如权利要求128-134中任一项所述的组合物，其中所述交联过程包括非共价过程。

136.如权利要求128-135中任一项所述的组合物，其中所述交联过程包括通过一个或多个中间接头部分来连接所述连接表面活性剂分子的连接部分，并且其中所述分散相还包含多个所述中间接头部分。

137.如权利要求136所述的组合物，其中所述中间接头部分包含生物素结合部分。

138.如权利要求137所述的组合物，其中所述生物素结合部分包含亲和素、链霉亲和素、链霉亲和素衍生物或它们的组合。

139.如权利要求128-138中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种组分的浓度为每种组分10纳摩尔至10毫摩尔。

140.一种乳液组合物，其包含连续相中的多个分散相的分区，其中

(i)所述分散相分区与所述连续相之间的界面包含多个表面活性剂分子；

(ii)所述界面的所述表面活性剂分子通过表面活性剂分子之间的一个或多个连接部分进行交联；

(iii)所述分区中的至少一部分含有第一组分，所述第一组分在合适的条件下经历产生第二组分的过程；并且

(iv)所述连续相包含与所述第二组分相互作用以产生指示所述第二组分的存在和/或丰度的信号的报告部分。

141.如权利要求140所述的组合物，其中所述第一组分和第二组分相同或几乎相同。

142.如权利要求140或141所述的组合物，其中所述第一组分是感兴趣的核酸，并且所述第二组分是所述核酸的扩增产物。

143.如权利要求140-142中任一项所述的组合物，其中所述连接部分具有促进所述报告分子进入所述分区的一种或多种特性。

144.一种执行乳液流动过程的方法，其包括

(i)提供连续相，其包含

(a)连续相，和

(b)具有连接部分的表面活性剂分子

(ii)提供与连续相分开的分散相，所述分散相不包含具有连接部分的表面活性剂分子，并且包含引发和/或促进形成表面活性剂分子之间的交联键的一种或多种组分，其中所述交联键包含所述连接部分；

(iii)使所述连续相和所述分散相流入分区发生器，所述分区发生器生成所述连续相中的包含所述分散相的多个分区的乳液，以及

(iv)在分区形成期间和/或之后，在包含所述连接部分的表面活性剂分子之间形成交联键，以在所述分区与连续相的界面处形成表面活性剂分子的交联网络；以及

(iii)使所述乳液流动通过对所述乳液的所述分区执行一种或多种操作的加工系统。

145.一种组合物，其包含含有尾部和头部的多个第一表面活性剂分子，其中所述第一表面活性剂分子包含附接到所述第一表面活性剂分子的第一连接部分，其中所述第一连接部分被配置成在合适的条件下参与形成所述第一表面活性剂分子与包含第二连接部分的第二表面活性剂之间的交联键。

146.如权利要求145所述的组合物，其中所述第一连接部分和第二连接部分具有相同的结构。

147.如权利要求145或146所述的组合物，其中所述第一表面活性剂分子包含多个连接部分。

148.如权利要求147所述的组合物，其中所述第一表面活性剂分子附接到平均2-10个连接部分。

149.如权利要求145-148中任一项所述的组合物，其中所述第一连接部分附接到所述表面活性剂分子的所述尾部。

150.如权利要求145-148中任一项所述的组合物，其中所述第一连接部分附接到所述表面活性剂分子的所述头部。

151.如权利要求145-150中任一项所述的组合物，其中所述第一连接部分的长度是所述表面活性剂分子的所述头部长度的5％-500％。

152.如权利要求145-151中任一项所述的组合物，其中所述第一表面活性剂分子是非离子、阴离子、阳离子或两性离子表面活性剂。

153.如权利要求145-151中任一项所述的组合物，其中所述第一表面活性剂分子是含氟表面活性剂。

154.如权利要求145-153中任一项所述的组合物，其中所述连接部分以共价方式附接到所述表面活性剂分子。

155.如权利要求145-154中任一项所述的组合物，其中所述连接部分被配置成在合适的条件下与中间部分结合但不与另一个连接部分结合。

156.如权利要求155所述的组合物，其中所述连接部分包含生物素。

157.如权利要求155所述的组合物，其中所述中间部分包含生物素结合部分。

158.如权利要求145-157中任一项所述的组合物，其中所述多个第一表面活性剂分子包含在连续相中。

159.一种修饰包含尾部和头部的第一表面活性剂分子的方法，其包括将多个第一连接部分附接到所述第一表面活性剂分子，其中所述第一连接部分被配置成在合适的条件下参与形成所述第一表面活性剂分子与包含第二连接部分的第二表面活性剂分子之间的交联键。

160.如权利要求159所述的方法，其包括将平均2-10个所述第一连接部分附接到所述第一表面活性剂分子。

161.如权利要求159或160所述的方法，其包括将所述多个第一连接部分附接到所述表面活性剂分子的所述尾部。

162.如权利要求159或160所述的方法，其包括将所述多个第一连接部分附接到所述表面活性剂分子的所述头部。

163.如权利要求159-162中任一项所述的方法，其中所述第一连接部分的长度是所述表面活性剂分子的所述头部长度的5％-500％。

164.如权利要求159-163中任一项所述的方法，其中所述第一表面活性剂分子是非离子、阴离子、阳离子或两性离子表面活性剂。

165.如权利要求159-163中任一项所述的方法，其中所述第一表面活性剂分子是含氟表面活性剂。

166.如权利要求159-165中任一项所述的方法，其包括将所述连接部分以共价方式附接到所述第一表面活性剂分子。

167.如权利要求159-166中任一项所述的方法，其中所述连接部分被配置成在合适的条件下与中间部分结合但不与另一个连接部分结合。

168.如权利要求167所述的方法，其中所述连接部分包含生物素。

169.如权利要求168所述的方法，其中所述中间部分包含生物素结合部分。

170.一种试剂盒，其包含

(i)包含用于形成乳液的多个表面活性剂分子的容器，其中所述表面活性剂分子包含用于与其他表面活性剂分子交联的多个连接部分；

(ii)容纳(i)中的所述容器的包装。

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