CN105189785A - 用于聚合酶链反应测定的组合物、方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供用于在聚合酶链反应测定诸如微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)测定中检测核酸的方法、设备、系统和组合物。本公开内容提供用于在ddPCR测定中使用嵌入染料检测核酸的方法、设备、系统和组合物。具有至少一种含氟表面活性剂和至少一种非离子型非含氟表面活性剂的双表面活性剂体系可用于微滴产生和核酸检测。

Description

用于聚合酶链反应测定的组合物、方法和系统
交叉引用
本申请要求于2013年3月8提交的美国临时申请第61/775415号的权益，该申请通过引用并入本文。
背景
测定是用于确定样品中组分的存在、量、活性和/或其它性质或特性的研究程序。通常，样品内的感兴趣的组分，例如核酸、酶、病毒、细菌仅为样品的次要成分，并且因此，可能难以检测或定量。
生物测定的实例为聚合酶链反应(PCR)测定。PCR的某些类型可以在特定的设置中是定量的。例如，实时PCR(其通常涉及使用荧光探针监测扩增的进展)可允许定量在样品中的靶核酸，特别是在靶核酸在某种程度上是丰富的情况下。
微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)是用于定量测量绝对DNA浓度的普遍的工具。与从实时PCR反应获得的相对测量相反，ddPCR使得能够绝对测量靶脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)分子。绝对定量在若干种应用中是有利的，例如测量拷贝数变异，检测稀有序列和突变，并分析基因表达反应。
概述
在一方面中，本公开内容提供产生多个微滴的方法。所述方法包括：提供油组合物，所述油组合物包含油和含氟表面活性剂；提供含水组合物，所述含水组合物包含靶核酸、非离子型非含氟表面活性剂(non-ionicnon-fluorosurfactant)和嵌入染料(intercalatingdye)；和使油组合物与含水组合物接触，从而产生悬浮在连续相中的多个微滴。所述含氟表面活性剂可以选自由以下组成的组：
其中A和B中的每个为氧(O)或NR1，其中R1为H或烷基；m1和m2中的每个为从约10至100的数字；n为从约10至60的数字；
其中m3为从约20至50的数字；n2为从约8至30的数字；并且R为H或烷基；和
其中m4为从约20至50的数字；n3和n4中的每个是从约5至25的数字；n5是从约0至3的数字；并且R1和R2中的每个是烷基或H。在某些情况下，含氟表面活性剂可为非离子型。在某些情况下，含氟表面活性剂可包含式I、式II和/或式III的混合物。例如，含氟表面活性剂可以包含式I和式II的混合物。在某些实例中，该混合物还可包含式XI：
其中n为从约10至100的数字。
在某些情况下，含氟表面活性剂可以具有至少约90％(w/w)的纯度。例如，含氟表面活性剂可以包含至少约90％(w/w)的式I和式II的混合物。此外，式I和式II的混合物可为至少约90:10(w/w)的比率。在某些情况下，含氟表面活性剂混合物可包含约0.5％至5％(w/w)的式XI。在某些情况下，油制剂可包含小于约0.5％(w/w)的式XI。
在某些情况下，方法还可以包括热循环多个微滴以扩增靶核酸和检测靶核酸。在某些情况下，含氟表面活性剂可具有式I。A和B中的每个可为O。m1和m2中的每个可为从约20至40，并且n可为从约15至30。例如，m1和m2中的每个可为约35并且n可为约22。在某些情况下，含氟表面活性剂可以包含式I和式II的混合物。在某些情况下，混合物还可以包含式XI。含氟表面活性剂可具有至少约0.5的亲水亲脂平衡值。含氟表面活性剂可具有小于约5.0的亲水亲脂平衡值。含氟表面活性剂可具有在从约0.5至5.0的范围中的亲水亲脂平衡值。例如，含氟表面活性剂可具有约1.5的亲水亲脂平衡值。
非离子型非含氟表面活性剂可为环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物。非离子型非含氟表面活性剂可为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷的三嵌段共聚物。在某些实例中，非离子型非含氟表面活性剂可为例如，非离子型非含氟表面活性剂可为的浓度可在从约0.1％-3.0％(重量百分比)的范围内。
油可包括氟油。氟油可为2-三氟甲基-3-乙氧基十二氟己烷(HFE-7500)或1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-十氟-3-甲氧基-4-(三氟甲基)戊烷(HFE-7300)。嵌入染料可为或连续相可包含油。
多个微滴可为被油包封的含水微滴。在某些情况下，在约5次热循环之后，在含水微滴的水相之外可检测到小于约5％的嵌入染料。在某些情况下，在约10次热循环之后，在含水微滴的水相之外可检测到小于约5％的嵌入染料。在某些情况下，在约20次热循环之后，在含水微滴的水相之外可检测到小于约5％的嵌入染料。在某些情况下，在约50次热循环之后，在含水微滴的水相之外可检测到小于约5％的嵌入染料。在某些情况下，在约100次热循环之后，在含水微滴的水相之外可检测到小于约5％的嵌入染料。
在某些情况下，在约5次热循环之后，在含水微滴的水相之外可检测到小于约10％的嵌入染料。在某些情况下，在约10次热循环之后，在含水微滴的水相之外可检测到小于约10％的嵌入染料。在某些情况下，在约20次热循环之后，在含水微滴的水相之外可检测到小于约10％的嵌入染料。在某些情况下，在约50次热循环之后，在含水微滴的水相之外可检测到小于约10％的嵌入染料。在某些情况下，在约100次热循环之后，在含水微滴的水相之外可检测到小于约10％的嵌入染料。
在热循环之后，多个微滴中的每个平均可包含小于5.5×1012个靶核酸。检测可包括测量来自嵌入染料的荧光。
本公开内容的另一方面提供微滴发生器，所述微滴发生器包括与载体流体源流体连通的第一通道和与样品源流体连通的第二通道。第一通道在交叉点处与第二通道会合。微滴通道与交叉点流体连通。在使用期间，在交叉点处产生的包含一个或更多个微滴的乳液沿着微滴通道流动。载体流体源包含油和含氟表面活性剂。含氟表面活性剂可以选自由以下组成的组：
其中A和B中的每个为氧(O)或NR1，其中R1为H或烷基；m1和m2中的每个为从约10至100的数字；n为从约10至60的数字；
其中m3为从约20至50的数字；n2为从约8至30的数字；R为H或烷基；和
其中m4为从约20至50的数字；n3和n4中的每个为从约5至25的数字；n5为从约0至3的数字；并且R1和R2中的每个为烷基或H。样品源可以包含靶核酸、非离子型非含氟表面活性剂和嵌入染料。在某些情况下，含氟表面活性剂可为非离子型。在某些情况下，含氟表面活性剂可以是式I、式II和/或式III的混合物。例如，含氟表面活性剂可以是式I和式II的混合物。在某些实例中，混合物还可包含式XI：
其中n为从约10至100的数字。
在某些情况下，含氟表面活性剂可以具有至少约90％(w/w)的纯度。例如，含氟表面活性剂可以包含至少90％(w/w)的式I和式II的混合物。此外，式I和式II的混合物可为至少约90:10(w/w)的比率。在某些情况下，含氟表面活性剂混合物可包含约0.5％至5％(w/w)的式XI。在某些情况下，油制剂可包含小于约0.5％(w/w)的式XI。
在另一方面中，本公开内容提供组合物，所述组合物包含含氟表面活性剂、非离子型非含氟表面活性剂和嵌入染料。含氟表面活性剂可选自由以下组成的组：
其中A和B中的每个为氧(O)或NR1，其中R1为H或烷基；m1和m2中的每个为从约10至100的数字；n为从约10至60的数字；
其中m3为从约20至50的数字；n2为从约8至30的数字；R为H或烷基；和
其中m4为从约20至50的数字，n3和n4中的每个为从约5至25的数字，并且n5为从约0至3的数字；并且R1和R2中的每个为H或烷基。在某些情况下，含氟表面活性剂可为非离子型。在某些情况下，含氟表面活性剂可以是式I、式II和/或式III的混合物。例如，含氟表面活性剂可以是式I和式II的混合物。在某些实例中，混合物还可包含式XI。在某些情况下，含氟表面活性剂可以具有至少约90％(w/w)的纯度。例如，含氟表面活性剂可以包含至少90％(w/w)的式I和式II的混合物。此外，式I和式II的混合物可为至少约90:10(w/w)的比率。在某些情况下，含氟表面活性剂混合物可包含约0.5％至5％(w/w)的式XI。在某些情况下，油制剂可包含小于约0.5％(w/w)的式XI。
在另一方面中，本公开内容提供式I的共聚物，其中A和B中的每个为氧(O)或NR1，其中R1为H或烷基；m1和m2中的每个为从约10至100的数字；并且n为从约10至60的数字。在某些情况下，共聚物可具有至少约90％(w/w)的纯度。
在另一方面中，本公开内容提供合成共聚物的方法。该方法包括在草酰氯和催化量的二甲基甲酰胺(DMF)的存在下将全氟聚醚羧酸在第一氟油中的溶液加热以形成酰基氯。接着，在包含第二氟油和醚的溶剂中，可以使酰基氯与聚乙二醇在胺的存在下反应以形成包含含有全氟聚醚的共聚物的产物混合物，其中聚乙二醇的量为酰基氯的约1/2当量。然后，可以将含有全氟聚醚的共聚物从产物混合物中分离。
从以下的详细描述中，本发明的另外的方面和优点对于本领域技术人员将容易是明显的，其中仅示出和描述本公开内容的例证性实施方案。如将意识到的是，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面具有修改，所有这些都不脱离本公开内容。因此，附图和描述在本质上将被视为例证性的、且非限制性的。
通过引用并入
在本说明书中提到所有的出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指示为通过引用并入。
附图简述
本发明的新颖特征在所附的权利要求中被特别地陈述。通过参考以下的详细描述(其陈述例证性实施方案)，将获得本发明的特征和优点的更好的理解，在例证性实施方案中利用本发明的原理和附图，在附图中：
图1是DNA嵌入染料的浸出率对羧酸IV((羧酸XI)被用作代表性实施例)的浓度的依赖性的图示；
图2是根据本公开内容的实施方案在羧酸XI、含氟表面活性剂XII和HFE-7500中的相对于时间的归一化染料响应的图示；
图3例证根据本公开内容的实施方案的用于染料浸出(其中Green作为代表性的DNA嵌入染料)的离子对介导的机制；
图4是根据本公开内容的实施方案的表面活性剂I的工作浓度范围的粗滴定(coarsetitration)的图示；
图5是根据本公开内容的实施方案的类型和浓度对微滴稳定性的影响的图示；
图6是根据本公开内容的实施方案的的浓度对微滴大小的影响的图示；
图7示意性地例证根据本公开内容的实施方案的微滴发生器；
图8A例证在优化的微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)体系中的单个孔的图示，该体系包含作为连续相的在HEF-7500中的2.5mM含氟表面活性剂XII、和作为水相的pH～8.3-8.4的缓冲的0.50-0.75％w/w 使用嵌入染料；
图8B例证根据本公开内容的实施方案的在优化的ddPCR体系中的96孔的图示，该体系包含作为连续相的在HEF-7500中的2.5mM含氟表面活性剂XII、和作为水相的pH～8.3-8.4的缓冲的0.50-0.75％w/w 使用嵌入染料；
图9示出化合物XI的19FNMR光谱；
图10示出化合物XI的13CNMR光谱；
图11示出化合物XI的FTIR光谱；
图12示出用于基于它的19FNMR光谱计算化合物XI的平均分子量的感兴趣的峰；
图13示出化合物XII的19FNMR光谱；
图14示出化合物XII的13CNMR光谱；
图15示出化合物XII的FTIR光谱；
图16A示出化合物XI标准的准一级动力学浸出图；
图16B示出用于计算化合物XII的纯度的校准曲线；
图17例证根据本公开内容的实施方案的在优化的ddPCR体系中的96孔的图示，该体系包含各种含氟表面活性剂混合物，使用嵌入染料。
详述
虽然本发明的各种实施方案在本文中已被示出和描述，但对本领域技术人员明显的是，这些实施方案通过仅实施例的方式被提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下可以想到许多变型、改变和替代。应当理解的是，本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案可在实践本发明中被利用。
本公开内容提供用于在聚合酶链反应测定诸如例如微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)测定中使用核酸嵌入染料的设备、系统、方法和组合物。本公开内容的设备、系统、方法和组合物可被用于与各种类型的核酸一起使用，所述各种类型的核酸例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、及其变体。本公开内容的设备、系统、方法和组合物可以防止、减少或抑制在PCR测定期间嵌入染料从含水微滴浸出到连续相中(本文中也称为“染料浸出”)。通常，本文描述的本公开内容涉及双相表面活性剂体系，其使得能应用除了Taqman探针之外的荧光嵌入染料，以用于在PCR中使用。
在某些实施方案中，双相体系是包含含氟表面活性剂的油相和包含非离子型非含氟表面活性剂的水相。在某些情况下，油是氟油，含氟表面活性剂是式I的三嵌段聚合物，并且水相是式VI的三嵌段聚合物PEG-PPG-PEG的缓冲溶液。在某些情况下，含氟表面活性剂可以是非离子型。在某些情况下，含氟表面活性剂可包含式I、式II和/或式III的混合物。例如，含氟表面活性剂可包含式I和式II的混合物。在某些实施例中，混合物还可包含式XI。
在一方面中，本公开内容提供获得高纯度的含氟表面活性剂的合成方法。在微滴产生、热循环和微滴询问工作流程(dropletinterrogationworkflow)期间，这些高纯度的含氟表面活性剂可允许足够量的嵌入染料保持在微滴中。本文获得的高纯度的含氟表面活性剂还可以利于染料浸出现象的机制的更好或以其他方式改进的理解。
染料浸出背后的机制的意外实现，加上用于生产高纯度含氟表面活性剂的方法，提供对ddPCR测定的关键缺点的系统化解决方案。包含本文描述的连续相和水相的特定组合的微乳液提供非离子型稳定化微滴以用于在ddPCR测定中应用DNA嵌入染料。
制造含氟表面活性剂的方法
在一方面中，本公开内容提供合成含有全氟聚醚的含氟表面活性剂的方法。方案1示出本公开内容的代表性含氟表面活性剂XII和示例性羧酸XI起始物料。
用于形成含有全氟聚醚的含氟表面活性剂的方法包括：(a)在草酰氯的存在下加热全氟聚醚羧酸在氟油中的溶液以形成酰基氯，比如全氟聚醚酰基氯；(b)使酰基氯与聚乙二醇反应以形成包含含有全氟聚醚的含氟表面活性剂的产物混合物；和(c)从产物混合物中分离含有全氟聚醚的含氟表面活性剂，以提供含氟表面活性剂产品。这些合成操作在关于作为代表性实施例的含氟表面活性剂X的方案2(见下文)中概括。
操作1
可以使用各种试剂来实现全氟聚醚羧酸起始物料向全氟聚醚酰基氯的转化。在某些情况下，通过用草酰氯(C2O2Cl2)处理全氟聚醚羧酸来实现这种转化。在其他情况下，可通过全氟聚醚羧酸与亚硫酰氯(SOCl2)反应来实现这种转化。在又其他情况下，五氯化磷((PCl5)或三氯化磷(PCl3)被用来完成这种转变。在某些情况下，羧酸起始物料向相应的酰基氯的转化通过与四氯化碳和三苯基膦(PPh3)的反应来实现。在某些情况下，通过与三聚氯氰(C3N3Cl3)的反应来实现该转变。
在某些情况下，用于将羧酸起始物料转化为酰基氯产物的试剂的量为在约0.1当量(当量)至100当量、或约1.0当量到10.0当量的范围内。在某些情况下，所用的试剂的量为在约1.0当量-2.0当量、约1.0当量-3.0当量、约1.0当量-4.0当量、约1.0当量-5.0当量、约1.0当量-6.0当量、约1.0当量-7.0当量、约1.0当量-8.0当量、约1.0当量-9.0当量、约2.0当量-3.0当量、约2.0当量-4.0当量、约2.0当量-5.0当量、约2.0当量-6.0当量、约2.0当量-7.0当量、约2.0当量-8.0当量、约2.0当量-9.0当量、约2.0当量-10.0当量、约3.0当量-4.0当量、约3.0当量-5.0当量、约3.0当量-6.0当量、约3.0当量-7.0当量、约3.0当量-8.0当量、约3.0当量-9.0当量、约3.0当量-10.0当量、约4.0当量-5.0当量、约4.0当量-6.0当量、约4.0当量-7.0当量、约4.0当量-8.0当量、约4.0当量-9.0当量、约4.0当量-10.0当量、约5.0当量-6.0当量、约5.0当量-7.0当量、约5.0当量-8.0当量、约5.0当量-9.0当量、约5.0当量-10.0当量、约6.0当量-7.0当量、约6.0当量-8.0当量、约6.0当量-9.0当量、约6.0当量-10.0当量、约7.0当量-8.0当量、约7.0当量-9.0当量、约7.0当量-10.0当量、约8.0当量-9.0当量、约8.0当量-10.0当量、或约9.0当量-10.0当量的范围中。在某些情况下，所用的试剂的量为至少约1.0当量、约1.5当量、约2.0当量、约2.5当量、约3.0当量、约3.5当量、约4.0当量、约4.5当量、约5.0当量、约5.5当量、约6.0当量、约6.5当量、约7.0当量、约7.5当量、约8.0当量、约8.5当量、约9.0当量、约9.5当量、或约10.0当量。在某些情况下，羧酸向酰基氯的转化可通过用约5.0当量的草酰氯处理来实现。
在某些情况下，羧酸向相应的酰基氯的转化在氟溶剂中实施。在某些情况下，溶剂是全氟烷基醚。在某些情况下，全氟烷基醚是甲基九氟丁基醚(HFE-7100)、1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-十氟-3-甲氧基-4-(三氟甲基)戊烷(HFE-7300)或3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷(HFE-7500)。
在某些情况下，羧酸向酰基氯的转化还通过添加反应催化剂来促进。在某些情况下，催化剂是相对于反应物小量使用的物质，其增加或以其他方式修改反应的速率而在过程中没有被明显地消耗。在某些情况下，酰基氯的形成通过与亚硫酰氯或草酰氯反应来实现，并且添加二甲基甲酰胺(DMF)作为反应催化剂。在某些情况下，所使用的催化剂的量为在约0.001当量-10当量或约0.01当量至1.0当量的范围内。在某些情况下，所使用的催化剂的量为在约0.01当量-0.10当量、约0.01当量-0.20当量、约0.01当量-0.30当量、约0.01当量-0.40当量、约0.01当量-0.50当量、约0.01当量-0.60当量、约0.01当量-0.70当量、约0.01当量-0.80当量、约0.01当量-0.90当量、约0.1当量-0.20当量、约0.1当量-0.30当量、约0.1当量-0.4当量、约0.1当量-0.5当量、约0.1当量-0.6当量、约0.1当量-0.7当量、约0.1当量-0.8当量、约0.1当量-0.9当量、约0.1当量-1.0当量、约0.2当量-0.3当量、约0.2当量-0.4当量、约0.2当量-0.5当量、约0.2当量-0.6当量、约0.2当量-0.7当量、约0.2当量-0.8当量、约0.2当量-0.9当量、约0.2当量-1.0当量、约0.3当量-0.4当量、约0.3当量-0.5当量、约0.3当量-0.6当量、约0.3当量-0.7当量、约0.3当量-0.8当量、约0.3当量-0.9当量、约0.3当量-1.0当量、约0.4当量-0.5当量、约0.4当量-0.6当量、约0.4当量-0.7当量、约0.4当量-0.8当量、约0.4当量-0.9当量、约0.4当量-1.0当量、约0.5当量-0.6当量、约0.5当量-0.7当量、约0.5当量-0.8当量、约0.5当量-0.9当量、约0.5当量-1.0当量、约0.6当量-0.7当量、约0.6当量-0.8当量、约0.6当量-0.9当量、约0.6当量-1.0当量、约0.7当量-0.8当量、约0.7当量-0.9当量、约0.7当量-1.0当量、约0.8当量-0.9当量、约0.8当量-1.0当量或约0.9当量-1.0当量的范围内。在某些情况下，所使用的催化剂的量为在约0.01当量-0.02当量、约0.01当量-0.03当量、约0.01当量-0.04当量、约0.01当量-0.05当量、约0.01当量-0.06当量、约0.01当量-0.07当量、约0.01当量-0.08当量或约0.01当量-0.09当量的范围内。在某些情况下，羧酸向酰氯的转化通过在HFE-7100中用约5.0当量的草酰氯处理来实现，并且通过添加约0.05当量的DMF来促进。
在某些情况下，酰基氯的形成在室温下实现。作为替代方案，反应在升高的温度下进行。在某些情况下，反应通过在约40℃-80℃范围内的温度下加热或回流反应混合物来进行。在某些情况下，反应在约40℃-45℃、约40℃-50℃、约40℃-55℃、约40℃-60℃、约40℃-65℃、约40℃-70℃、约40℃-75℃、约40℃-80℃、约50℃-55℃、约50℃-60℃、约50℃-65℃、约50℃-70℃、约50℃-75℃、约50℃-80℃、约60℃-65℃、约60℃-70℃、约60℃-75℃、约60℃-80℃、约70℃-75℃、约70℃-80℃或约75℃-80℃的范围内的温度下进行。在某些情况下，反应温度为约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃。
用于将羧酸起始物料转化为相应的酰基氯中间体的反应时间为在约0.5小时(h)-12h的范围内。在某些情况下，允许反应运行持续约1h-12h、约2h-12h、约3h-12h、约4h-12h、约5h-12h、约6h-12h、约7h-12h、约8h-12h、约9h-12h、约0.5h-11h、约1h-11h、约2h-11h、约3h-11h、约4h-11h、约5h-11h、约6h-11h、约7h-11h、约8h-11h、约9h-11h、约10h-11h、约0.5h-10h、约1h-10h、约2h-10h、约3h-10h、约4h-10h、约5h-10h、约6h-10h、约7h-10h、约8h-10h、约9h-10h、约0.5h-9h、约1h-9h、约2h-9h、约3h-9h、约4h-9h、约5h-9h、约6h-9h、约7h-9h、约8h-9h、约0.5h-8h、约1h-8h、约2h-8h、约3h-8h、约4h-8h、约5h-8h、约6h-8h、约7h-8h、0.5h-7h、约1h-7h、约2h-7h、约3h-7h、约4h-7h、约5h-7h、约6h-7h、约0.5h-6h、约1h-6h、约2h-6h、约3h-6h、约4h-6h、约5h-6h、约0.5h-5h、约1h-5h、约2h-5h、约3h-5h、约4h-5h、约0.5h-4h、约1h-4h、约2h-4h、约3h-4h、约0.5h-3h、约1h-3h、约2h-3h、约0.5h-2h、约1h-2h或约0.5h-1h的时间段。在某些情况下，允许反应运行持续约1h、约2h、约3h、约4h、约5h、约6h、约7h、约8h、约9h、约10h、约11h或约12h的时间段。
在某些实施例中，羧酸向酰基氯的转化通过在HFE-7100中与约5.0当量的草酰氯和作为催化剂的约0.05当量的DMF在约60℃下反应约4小时来实现。
在某些情况下，酰基氯的形成在惰性气氛下进行以保证酰基氯产品V不逆转回到羧酸起始物料IV。在某些情况下，惰性气氛通过用惰性气体吹扫反应烧瓶获得。在某些情况下，惰性气体是氮气或氩气。
在某些情况下，羧酸向酰基氯的转化通过在HFE-7100中与约5.0当量的草酰氯和作为催化剂的约0.05当量的DMF在约60℃下在氮气气氛下反应约4小时来实现。
从这个反应中得到的酰基氯可以在其被制备后立即或很快用于下一操作中以防止任何降解或水解回到羧酸起始物料。在某些情况下，在用于下一操作之前，酰基氯被储存持续约5分钟(min)-12小时(“h”)的时间段。在某些情况下，在用于下一操作之前，酰基氯被储存持续30min-12h、约1h-12h、约1h-12h、约2h-12h、约3h-12h、约4h-12h、约5h-12h、约6h-12h、约7h-12h、约8h-12h、约9h-12h、约10h-12h、约11h-12h、约5min-11h、30min-11h、约1h-11h、约1h-11h、约2h-11h、约3h-11h、约4h-11h、约5h-11h、约6h-11h、约7h-11h、约8h-11h、约9h-11h、约10h-11h、约5min-10h、30min-10h、约1h-10h、约2h-10h、约3h-10h、约4h-10h、约5h-10h、约6h-10h、约7h-10h、约8h-10h、约9h-10h、约5min-9h、30min-9h、约1h-9h、约2h-9h、约3h-9h、约4h-9h、约5h-9h、约6h-9h、约7h-9h、约8h-9h、5min-8h、30min-8h、约1h-8h、约2h-8h、约3h-8h、约4h-8h、约5h-8h、约6h-8h、约7h-8h、5min-7h、30min-7h、约1h-7h、约2h-7h、约3h-7h、约4h-7h、约5h-7h、约6h-7h、约5min-6h、30min-6h、约1h-6h、约2h-6h、约3h-6h、约4h-6h、约5h-6h、约5min-5h、30min-5h、约1h-5h、约2h-5h、约3h-5h、约4h-5h、约5min-4h、30min-4h、约1h-4h、约2h-4h、约3h-4h、约5min-3h、30min-3h、约1h-3h、约2h-3h、约5min-2h、30min-2h、约1h-2h、约5min-1h或约30min-1h的时间段。在某些情况下，在下一操作中使用之前，酰基氯被储存持续约5min、约10min、约15min、约20min、约25min、约30min、约35min、约40min、约45min、约50min、约55min、约1.0h、约1.5h、约2.0h、约2.5h、约3.0h、约3.5h、约4.0h、约4.5h、约5.0h、约5.5h,约6.0h、约6.5h、约7.0h、约7.5h、约8.0h、约8.5h、约9.0h、约9.5h、约10.0h、约10.5h、约11.0h、约11.5h、或约12h的时间段。
操作2
在形成全氟聚醚酰基氯后，全氟聚醚酰基氯可偶联到聚乙二醇(PEG)上以形成含有全氟聚醚的含氟表面活性剂。在某些情况下，在有机碱的存在下，酰基氯与PEG的偶联可以通过酰基氯与PEG的反应来实现。在某些实施例中，至少约0.1当量、约0.2当量、约0.3当量、约0.4当量、约0.5当量、约0.6当量、约0.7当量、约0.8当量、约0.9当量、约1当量、约2当量、约3当量、约4当量、约5当量或约10当量的PEG被使用。在某些情况下，有机碱是叔胺。在实施例中，胺是三乙胺。在另一实施例中，胺是二异丙基乙胺。在某些情况下，所使用的胺的量为在1.0当量-5.0当量的范围内。在某些情况下，所使用的胺的量为在约1.0当量-2.0当量、约1.0当量-2.5当量、约1.0当量-3.0当量、约1.0当量-3.5当量、约1.0当量-4.0当量、约1.0当量-4.5当量、约1.0当量-5.0当量、约1.5当量-2.0当量、约1.5当量-2.5当量、约1.5当量-3.0当量、约1.5当量-3.5当量、约1.5当量-4.0当量、约1.5当量-4.5当量、约1.5当量-5.0当量、约2.0当量-2.5当量、约2.0当量-3.0当量、约2.0当量-3.5当量、约2.0当量-4.0当量、约2.0当量-4.5当量、约2.0当量-5.0当量、约2.5当量-3.0当量、约2.5当量-3.5当量、约2.5当量-4.0当量、约2.5当量-4.5当量、约2.5当量-5.0当量、约3.0当量-4.0当量、约3.0当量-4.5当量、约3.0当量-5.0当量、约3.5当量-4.0当量、约3.5当量-4.5当量、约3.5当量-5.0当量、约4.0当量-4.5当量、约4.0当量-4.5当量、约4.0当量-4.0当量或约4.5当量-5.0当量的范围内。在某些情况下，所使用的胺的量为至少约1.0当量、约1.5当量、约2.0当量、约2.5当量、约3.0当量、约3.5当量、约4.0当量、约4.5当量或约5.0当量。在某些实施例中，约2.0当量的三乙胺被使用。
在某些情况下，全氟聚醚酰基氯与PEG的偶联在氟溶剂中实现。在某些情况下，溶剂是全氟烷基醚。在某些情况下，全氟烷基醚是甲基九氟丁基醚(HFE-7100)、1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-十氟-3-甲氧基-4-(三氟甲基)戊烷(HFE-7300)或3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷(HFE-7500)。在某些情况下，氟溶剂与第二非氟溶剂混合。在某些情况下，第二非氟溶剂是有机醚溶剂。在某些情况下，第二溶剂是乙醚、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、甲基四氢呋喃和二氧六环。
在某些情况下，氟溶剂与第二非氟溶剂的比率为在约10：1至约1:10的范围内。在某些情况下，氟溶剂与第二非氟溶剂的比率为约10:1至约1：1。在某些情况下，氟溶剂与第二非氟溶剂的比率为至少约10:1、至少约9:1、至少约8:1、至少约7:1、至少约6:1、至少约5:1、至少约4:1、至少约3:1、至少约2:1或至少约1:1。在某些情况下，氟溶剂与第二非氟溶剂的比率为约1:1至约1:10。在某些情况下，氟溶剂与第二非氟溶剂的比率为至少约1:2、至少约1:3、至少约1:4、至少约1:5、至少约1:6、至少约1:7、至少约1:8、至少约1:9或至少约1:10。在某些实施例中，酰基氯中间体与0.5当量的PEG的偶联在HFE-7100和THF的2:1的混合物中进行。
在某些情况下，全氟聚醚酰基氯和PEG的偶联在室温下完成。作为替代方案，该偶联反应可以在升高的温度下进行。在某些情况下，该反应通过在约40℃-80℃的范围内的温度下加热或回流反应混合物来进行。在某些情况下，反应在约40℃-45℃、约40℃-50℃、约40℃-55℃、约40℃-60℃、约40℃-65℃、约40℃-70℃、约40℃-75℃、约40℃-80℃、约50℃-55℃、约50℃-60℃、约50℃-65℃、约50℃-70℃、约50℃-75℃、约50℃-80℃、约60℃-65℃、约60℃-70℃、约60℃-75℃、约60℃-80℃、约70℃-75℃、约70℃-80℃或约75℃-80℃的范围内的温度下进行。在某些情况下，反应温度为约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃，约65℃、约70℃、约75℃或约80℃。
用于偶联酰基氯和PEG的反应时间可为从约0.1h至100h或约1h至50h。在某些情况下，允许反应运行持续约5h-50h、10h-50h、15h-50h、20h-50h、25h-50h、30h-50h、35h-50h、40h-50h、45h-50h、5h-40h、10h-40h、15h-40h、20h-40h、25h-40h、30h-40h、35h-40h、40h-40h、5h-30h、10h-30h、15h-30h、20h-30h、25h-30h、5h-20h、10h-20h、15h-20h或5h-10h。
在某些情况下，酰基氯中间体与半当量的PEG的偶联在HFE-7100和THF的约2:1的混合物中在约2.0当量的三乙胺下在约60℃下在约18h中实现。
在形成包含含有全氟聚醚的含氟表面活性剂的产物混合物(或粗制产物)后，含有全氟聚醚的含氟表面活性剂可以从粗制产物中分离以得到较高纯度的含有全氟聚醚的含氟表面活性剂产品。在某些情况下，含氟表面活性剂产品的纯化可以通过将粗制产物转移至分液漏斗中并将其溶解到氟溶剂中来进行。氟溶剂可为HFE-7100、HFE-7300或HFE-7500。在将粗制产物溶解在氟溶剂中期间，未反应的PEG和胺的HCl盐(例如为NEt3·HCl，如果使用三乙胺作为碱)可以沉淀出来并漂浮到分液漏斗的顶部。这些被滤出，并且氟溶剂随后被除去以获得高纯度的含氟表面活性剂。
在某些情况下，可允许在氟溶剂中的粗制产物溶液静置持续约30min-24h的时间段以允许所有未反应的PEG和胺的HCl盐沉淀出来。在某些情况下，在过滤之前，可允许在氟溶剂中的粗制产物溶液静置持续约5min-12h的时间段。在某些情况下，在被用于下一操作(例如，分离)之前，可允许在氟溶剂中的粗制产物溶液静置持续约30min-12h、约1h-12h、约1h-12h、约2h-12h、约3h-12h、约4h-12h、约5h-12h、约6h-12h、约7h-12h、约8h-12h、约9h-12h、约10h-12h、约11h-12h、约5min-11h、30min-11h、约1h-11h、约1h-11h、约2h-11h、约3h-11h、约4h-11h、约5h-11h、约6h-11h、约7h-11h、约8h-11h、约9h-11h、约10h-11h、约5min-10h、30min-10h、约1h-10h、约2h-10h、约3h-10h、约4h-10h、约5h-10h、约6h-10h、约7h-10h、约8h-10h、约9h-10h、约5min-9h、30min-9h、约1h-9h、约2h-9h、约3h-9h、约4h-9h、约5h-9h、约6h-9h、约7h-9h、约8h-9h、5minh-8h、30minh-8h、约1h-8h、约2h-8h、约3h-8h、约4h-8h、约5h-8h、约6h-8h、约7h-8h、5min-7h、30min-7h、约1h-7h、约2h-7h、约3h-7h、约4h-7h、约5h-7h、约6h-7h、约5min-6h、30min-6h、约1h-6h、约2h-6h、约3h-6h、约4h-6h、约5h-6h、约5min-5h、30min-5h、约1h-5h、约2h-5h、约3h-5h、约4h-5h、约5min-4h、30min-4h、约1h-4h、约2h-4h、约3h-4h、约5min-3h、30min-3h、约1h-3h、约2h-3h、约5min-2h、30min-2h、约1h-2h、约5min-1h或约30min-1h的时间段。在某些情况下，在过滤之前，可允许在氟溶剂中的粗制产物溶液静置持续约5min、约10min、约15min、约20min、约25min、约30min、约35min、约40min、约45min、约50min、约55min、约1.0h、约1.5h、约2.0h、约2.5h、约3.0h、约3.5h、约4.0h、约4.5h、约5.0h、约5.5h、约6.0h、约6.5h、约7.0h、约7.5h、约8.0h、约8.5h、约9.0h、约9.5h、约10.0h、约10.5h、约11.0h、约11.5h或约12h的时间段。在某些另外的情况下，可允许在氟溶剂中的粗制产物溶液静置持续约13h、约14h、约15h、约16h、约17h、约18h、约19h、约20h、约21h、约22h、约23h或约24h的时间段。
可以通过多种分析技术测定含氟表面活性剂的纯度，所述分析技术包括但不限于19FNMR、1HNMR、13CNMR、FTIR、元素分析和多种荧光技术。
特别感兴趣的是在产物I(～157ppm)的13C光谱中的归因于羰基碳(C＝O)的共振，当与存在于羧酸起始物料(～162ppm)中的羧酸的羰基碳相比时该共振已经经历显著的上行场位移。在纯化产物的13CNMR光谱中，在约存在于157±2ppm处的相对弱的共振可被认定为两个酯键的羰基碳(C＝O)，而在162±2ppm处观察到的归因于羧酸起始物料IV的羰基碳(COOH)的共振必须从光谱中离开。
染料浸出
在ddPCR体系中，由于嵌入染料从微滴(水相)内浸出到连续(或油)相中，常用的DNA嵌入染料的使用目前是困难的。在某些情形下，随时间观察到在微滴荧光中的降低的响应，而背景荧光增加。在ddPCR反应中，使得能够利用DNA嵌入染料同时最小化染料浸出的体系可以有利地使得能够方便和经济地使用ddPCR测定。因此，本文所认识到的是对能够应用荧光DNA染料以用于在ddPCR测定中使用的双相体系的需求。
本公开内容提供在ddPCR测定中使用DNA嵌入染料期间观察到的用于染料浸出现象的机制。嵌入染料的从水相微滴到连续相的这种迁移通常已经被描述为胶束介导的转运或被动扩散。申请人已认识到染料浸出可能意外地归因于在表面活性剂的合成期间存在残留的羧酸材料。在不受理论束缚的情况下，在ddPCR测定中使用的大多数含氟表面活性剂从羧酸封端的起始物料合成。羧酸起始物料向相应的酯、酰胺或可选择的羰基化合物的低效转化可导致未转化的羧酸作为杂质存在于含氟表面活性剂中。如图1所描绘，染料浸出的量被发现随着在含氟表面活性剂中的未反应的羧酸杂质的量增加。
对于本公开内容的某些高纯度的含氟表面活性剂组合物，羧酸杂质被减少或不存在，并且染料浸出被最小化(图2)。这些结果可指出染料浸出的可选择机制，使得染料浸出的量取决于存在于含氟表面活性剂中的羧酸杂质的量。用于染料浸出的新机制在图3中示意性地例证。
在某些情况下，在ddPCR反应开始时，羧酸杂质存在于连续相或油相中，然而DNA嵌入染料存在于水相中。在微滴产生后，羧酸化合物进入水相，其在水相中去质子化。然后所得的羧酸根离子与阳离子嵌入染料成离子对，并且然后中性羧酸盐/染料络合物跨越相界迁移到氟相内。这导致观察到的微滴荧光随时间降低的相对响应，而背景荧光随时间增加。成离子对的方法可以是“主动”转运机制，这在某些情况下可以是有利的，超过任何胶束介导的转运。例如，离子对机制还可解释高的染料浸出速率，其中染料的显著量在恰好若干分钟内从水相中损失。
含氟表面活性剂
表面活性剂可被表征为能够减少在其中溶解的液体的表面张力和/或与另一相的界面张力的表面活性的试剂。表面活性剂可包含亲水性部分和疏水性部分两者，这两者可共同赋予表面活性剂双重的亲水-疏水特性。含氟表面活性剂或氟化表面活性剂是具有多个氟原子的有机氟化学化合物。它们可以是多氟化或全氟化的。在某些情况下，含氟表面活性剂可以是非离子型的。
本公开内容的一方面提供式I的氟表面活性剂，式I的表面活性剂是三嵌段共聚物，所述三嵌段共聚物包含在两端共价地连接至聚六氟环氧丙烷(PFPE)的聚乙二醇(PEG)聚合物。在实施例中，在两端的在PEG嵌段和PFPE嵌段之间的共价键是酰胺键(A和B是氮)。在另一实施例中，PEG嵌段和两个PFPE嵌段之间的连接是通过酯键(A和B是氧)。在另一实施例中，PEG嵌段可在一端通过酰胺键并且在另一端通过酯键连接到PFPE嵌段(A是氧，B是氮；或A是氮，B是氧)。
PFPE链和PEG嵌段的长度在确定含氟表面活性剂的性质中可以是重要的。在本公开内容的某些方面中，m1和m2两者独立地在约10-100的范围内。在某些情况下，m1和m2两者独立地在约10-20、约10-30、约10-40、约10-50、约10-60、约10-70、约10-80、约10-90、约20-30、约20-40、约20-50；约20-60、约20-70、约20-80、约20-90、约20-100、约30-40、约30-50、约30-60、约30-70、约30-80、约30-90、约30-100、约40-50、约40-60、约40-70、约40-80、约40-90、约40-100、约50-60、约50-70、约50-80、约50-90、约50-100、约60-70、约60-80、约60-90、约60-100、约70-80、约70-90、约70-100、约80-90、约80-100或约90-100的范围内。在某些情况下，m1在约10-20、约10-30、约10-40、约10-50、约10-60、约10-70、约10-80、约10-90、约20-30、约20-40、约20-50；约20-60、约20-70、约20-80、约20-90、约20-100、约30-40、约30-50、30-60、约30-70、约30-80、约30-90、约30-100、约40-50、约40-60、约40-70、约40-80、约40-90、约40-100、约50-60、约50-70、约50-80、约50-90、约50-100、约60-70、约60-80、约60-90、约60-100、约70-80、约70-90、约70-100、约80-90、约80-100、或约90-100的范围内。在某些情况下，m2在约10-20、约10-30、约10-40、约10-50、约10-60、约10-70、约10-80、约10-90、约20-30、约20-40、约20-50、约20-60、约20-70、约20-80、约20-90、约20-100、约30-40、约30-50、约30-60、约30-70、约30-80、约30-90、约30-100、约40-50、约40-60、约40-70、约40-80、约40-90、约40-100、约50-60、约50-70、约50-80、约50-90、约50-100、约60-70、约60-80、约60-90、约60-100、约70-80、约70-90、约70-100、约80-90、约80-100或约90-100的范围内。
本公开内容中的‘n’值可在约10-60的范围内。在某些情况下，‘n’值在约10-20、约10-30、约10-40、约10-50、约15-20、约15-30、约15-40、约15-50、约15-60、约20-30、约20-40、约20-50、约20-60、约25-30、约25-40、约25-50、约25-60、约30-40、约30-50、约30-60、约35-40、约35-50、约35-60、约40-50、约40-60、约45-50、约45-60、约50-50、约55-60的范围内。在某些实施方案中，m1和m2中的每个为约35并且‘n’为约22。
本公开内容的另一方面提供式II的高纯度的含氟表面活性剂。表面活性剂II为PEG和PFPE的二嵌段共聚物。m3值代表PFPE嵌段的长度，在约10-100的范围内。在某些方面中，m3为在约10-20、约10-30、约10-40、约10-50、约10-60、约10-70、约10-80、约10-90、约20-30、约20-40、约20-50；约20-60、约20-70、约20-80、约20-90、约20-100、约30-40、约30-50、约30-60、约30-70、约30-80、约30-90、约30-100、约40-50、约40-60、约40-70、约40-80、约40-90、约40-100、约50-60、约50-70、约50-80、约50-90、约50-100、约60-70、约60-80、约60-90、约60-100、约70-80、约70-90、约70-100、约80-90、约80-100或约90-100的范围内。PEG单元的长度‘n’为在约10-60的范围内。在某些情况下，‘n’值在约10-20、约10-30、约10-40、约10-50、约15-20、约15-30、约15-40、约15-50、约15-60、约20-30、约20-40、约20-50、约20-60、约25-30、约25-40、约25-50、约25-60、约30-40、约30-50、约30-60、约35-40、约35-50、约35-60、约40-50、约40-60、约45-50、约45-60、约50-50或约55-60的范围内。PEG嵌段、-OR的末端可为羟基(即-OH)、烷氧基或胺，-也就是说R可为氢、烷基或胺。
本公开内容的另一方面提供式III的高纯度的含氟表面活性剂。式III的表面活性剂是三嵌段共聚物，其中两个单元的PEG(相同或不同的长度)和一个单元的PFPE由磷酸盐连接基(PO4)连接。PFPE链的长度m4为在约10-100的范围内。在某些情况下，m4为在约10-20、约10-30、约10-40、约10-50、约10-60、约10-70、约10-80、约10-90、约20-30、约20-40、约20-50；约20-60、约20-70、约20-80、约20-90、约20-100、约30-40、约30-50、约30-60、约30-70、约30-80、约30-90、约30-100、约40-50、约40-60、约40-70、约40-80、约40-90、约40-100、约50-60、约50-70、约50-80、约50-90、约50-100、约60-70、约60-80、约60-90、约60-100、约70-80、约70-90、约70-100、约80-90、约80-100或约90-100的范围内。两个PEG单元的长度n3和n4独立地为在约10-60的范围内。在某些情况下，n3和n4独立地为在约10-20、约10-30、约10-40、约10-50、约15-20、约15-30、约15-40、约15-50、约15-60、约20-30、约20-40、约20-50、约20-60、约25-30、约25-40、约25-50、约25-60、约30-40、约30-50、约30-60、约35-40、约35-50、约35-60、约40-50、约40-60、约45-50、约45-60、约50-50或约55-60的范围内。在某些情况下，n3在约10-20、约10-30、约10-40、约10-50、约15-20、约15-30、约15-40、15-50、约15-60、约20-30、约20-40、约20-50、约20-60、约25-30、约25-40、约25-50、约25-60、约30-40、约30-50、约30-60、约35-40、约35-50、约35-60、约40-50、约40-60、约45-50、约45-60、约50-50或约55-60的范围内。在某些情况下，n4在约10-20、约10-30、约10-40、约10-50、约15-20、约15-30、约15-40、约15-50、约15-60、约20-30、约20-40、约20-50、约20-60、约25-30、约25-40、约25-50、约25-60、约30-40、约30-50、约30-60、约35-40、约35-50、约35-60、约40-50、约40-60、约45-50、约45-60、约50-50或约55-60的范围内。CH2间隔基的长度(n5)可以为0、1、2或3个碳。
在某些情况下，含氟表面活性剂可包含式I、式II和/或式III的混合物。在某些情况下，含氟表面活性剂可包含式I和式II的混合物。在某些实施例中，含氟表面活性剂可以包含至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或约99.9％(w/w)的式I和式II的混合物。例如，含氟表面活性剂可包含至少约80％、约90％或95％(w/w)的式I和式II的混合物。
此外，式I和式II的混合物可在大于约1:199、约1:99、约2:98、约3:97、约4:96、约5:95、约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约96:4、约97:3、约98:2、约99:1或约199:1(w/w)的比率中。例如，式I和式II的混合物可在大于约80:20、约90:10或约95:5(w/w)的比率中。
可选择地，式I和式II的混合物可在小于约1:199、约1:99、约2:98、约3:97、约4:96、约5:95、约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约96:4、约97:3、约98:2、约99:1、或约199:1(w/w)的比率中。例如，式I和式II的混合物可在小于约80:20、约90:10或约95:5(w/w)的比率中。
在某些情况下，含氟表面活性剂混合物还可包含式XI：
其中n可以是约10至100、约10至80、约15至80、约15至50或约20至50。
例如，含氟表面活性剂混合物可包含约0.1％至50％、约0.1％至20％、约0.2％至20％、约0.2％至10％、约0.5％至10％、约0.5％至5％或约1％至5％(w/w)的式XI。
此外，含氟表面活性剂混合物可包含约大于约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％(w/w)的式XI。例如，含氟表面活性剂混合物可包含约大于约0.1％、约0.5％、约1％、约2％或约5％(w/w)的式XI。
可选择地，含氟表面活性剂混合物可包含约小于约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％(w/w)的式XI。例如，含氟表面活性剂混合物可包含约小于约1％、约2％、约5％、约10％或约20％(w/w)的式XI。
在某些情况下，油制剂可包含小于约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％(w/w)的式XI。例如，油制剂可包含约小于约1％、约2％、约5％、约10％或约20％(w/w)的式XI。
在其他情况下，油制剂可包含大于约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％(w/w)的式XI。例如，油制剂可包含约大于约0.1％、约0.5％、约1％、约2％或约5％(w/w)的式XI。
表面活性剂可根据亲水亲脂平衡(HLB)值来表征，其可被定义为化合物的亲水性部分的分子量(MW)与化合物的总MW的比率。HLB可通过改变分子的疏水性部分(PFPE)和亲水性部分(PEG)的长度/MW来控制。含氟表面活性剂的HLB可在将表面活性剂“锚定”到含水微滴中发挥关键作用。例如并且不受理论束缚，减少特定的PEGMW可导致由于在微滴边界处的表面活性剂的增加的交换速率的热不稳定性，然而增加优化的PEGMW可导致不均匀的、多分散的微滴群体的产生。此外，减少特定的PFPE分子量(MW)可导致由于聚结(较低密度的亲氟性刷网络(fluorophilicbrushnetwork))的热稳定性的损失。通常，全氟聚醚链越长(较高的分子量)，体系对热诱导的微滴聚结的抗性越大。在某些实施方案中，全氟聚醚链的MW为至少约3000、至少约4000、至少约5000、至少约6000、至少约7000、至少约8000、至少约9000或至少约10000。在某些其他实施方案中，全氟聚醚链的MW为约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000或约10000。
在当前公开内容的某些方面中，含氟表面活性剂的HLB值在约0-20的范围内。在某些情况下，非离子型表面活性剂的HLB值在从约0-10、约0-20、约5-10、约5-15、约5-20或约10-20的范围内。在某些另外的方面中，含氟表面活性剂的HLB值为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20。
通常，本公开内容中获得的含氟表面活性剂为高纯度的含氟表面活性剂，并且可以成功地用于用嵌入染料的ddPCR测定中，同时避免染料浸出。在某些情况下，含氟表面活性剂可以为大于约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约85.5％、约86％、约86.5％、约87％、约87.5％、约88％、约88.5％、约89％、约89.5％、约90％、约90.5％、约91.5％、约92％、约92.5％、约93％、约93.5％、约94％、约94.5％、约95％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％或约99.5％重量百分比(w/w)纯的。在某些实施例中，含氟表面活性剂为大于约90％重量百分比(w/w)纯的。例如，含氟表面活性剂可包含至少90％(w/w)的式I和式II的混合物。在某些情况下，含氟表面活性剂的重量百分比纯度为在约90％-91％w/w、约90％-92％w/w、约90％-93％w/w、约90％-94％w/w、约90％-95％w/w、约90％-96％w/w、约90％-97％w/w、约90％-98％w/w、约90％-99％w/w、约91％-92％w/w、约91％-93％w/w、约91％-94％w/w、约91％-95％w/w、约91％-96％w/w、约91％-97％w/w、约91％-98％w/w、91％-99％w/w、约92％-93％w/w、约92％-94％w/w、约92％-95％w/w、约92％-96％w/w、约92％-97％w/w、约92％-98％w/w、约92％-99％w/w、约93％-94％w/w、约93％-95％w/w、约93％-96％w/w、约93％-97％w/w、约93％-98％w/w、约93％-99％w/w、约94％-95％w/w、约94％-96％w/w、约94％-97％w/w、约94％-98％w/w或约94％-99％w/w的范围内。在某些情况下，含氟表面活性剂为大于约95％(重量百分比)纯的。例如，含氟表面活性剂可以包含至少95％(w/w)的式I和式II的混合物。在某些情况下，含氟表面活性剂的重量百分比纯度在约95％-96％w/w、约95％-97％w/w、约95％-98％w/w、约95％-99％w/w、约96％-97％w/w、约96％-98％w/w、约96％-99％w/w、约97％-98％w/w、约97％-99％w/w、或约98％-99％w/w的范围内。在某些情况下，含氟表面活性剂可以具有约90％w/w、约91％w/w、约92％w/w、约93％w/w、约94％w/w、约95％w/w、约96％w/w、约97％w/w、约98％w/w或约99％w/w的重量百分比纯度。
含氟表面活性剂的浓度对微滴稳定性可以是重要的。在某些情况下，含氟表面活性剂的浓度可在0.1-10.0mM(毫摩尔)的范围内。在某些实施方案中，含氟表面活性剂的浓度在约0.1mM-1.0mM、约0.1mM-2.0mM、约0.1mM-3.0mM、约0.1mM-4.0mM、约0.1mM-5.0mM、约0.1mM-6.0mM、约0.1mM-7.0mM、约0.1mM-8.0mM、约0.1mM-9.0mM、约0.5mM-1.0mM、约0.5mM-2.0mM、约0.5mM-3.0mM、约0.5mM-4.0mM、约0.5mM-5.0mM、约0.5mM-6.0mM、约0.5mM-7.0mM、约0.5mM-8.0mM、约0.5mM-9.0mM、约0.5mM-10.0mM、约1.0mM-2.0mM、约1.0mM-3.0mM、约1.0mM-4.0mM、约1.0mM-5.0mM、约1.0mM-6.0mM、约1.0mM-7.0mM、约1.0mM-8.0mM、约1.0mM-9.0mM、约1.0mM-10.0mM、约1.5mM-2.0mM、约1.5mM-3.0mM、约1.5mM-4.0mM、约1.5mM-5.0mM、约1.5mM-6.0mM、约1.5mM-7.0mM、约1.5mM-8.0mM、约1.5mM-9.0mM、约1.5mM-10.0mM、约2.0mM-3.0mM、约2.0mM-4.0mM、约2.0mM-5.0mM、约2.0mM-6.0mM、约2.0mM-7.0mM、约2.0mM-8.0mM、约2.0mM-9.0mM、约2.0mM-10.0mM、约2.5mM-3.0mM、约2.5mM-4.0mM、约2.5mM-5.0mM、约2.5mM-6.0mM、约2.5mM-7.0mM、约2.5mM-8.0mM、约2.5mM-9.0mM、约2.5mM-10.0mM、约3.0mM-4.0mM、约3.0mM-5.0mM、约3.0mM-6.0mM、约3.0mM-7.0mM、约3.0mM-8.0mM、约3.0mM-9.0mM、约3.0mM-10.0mM、约3.5mM-4.0mM、约3.5mM-5.0mM、约3.5mM-6.0mM、约3.5mM-7.0mM、约3.5mM-8.0mM、约3.5mM-9.0mM、约3.5mM-10.0mM、约4.0mM-5.0mM、约4.0mM-6.0mM、约4.0mM-7.0mM、约4.0mM-8.0mM、约4.0mM-9.0mM、约4.0mM-10.0mM、约4.5mM-5.0mM、约4.5mM-6.0mM、约4.5mM-7.0mM、约4.5mM-8.0mM、约4.5mM-9.0mM、约4.5mM-10.0mM、约5.0mM-6.0mM、约5.0mM-7.0mM、约5.0mM-8.0mM、约5.0mM-9.0mM、约5.0mM-10.0mM、约5.5mM-6.0mM、约5.5mM-7.0mM、约5.5mM-8.0mM、约5.5mM-9.0mM、约5.5mM-10.0mM、约6.0mM-7.0mM、约6.0mM-8.0mM、约6.0mM-9.0mM、约6.0mM-10.0mM、约6.5mM-7.0mM、约6.5mM-8.0mM、约6.5mM-9.0mM、约6.5mM-10.0mM、约7.0mM-8.0mM、约7.0mM-9.0mM、约7.0mM-10.0mM、约7.5mM-8.0mM、约7.5mM-9.0mM、约7.5mM-10.0mM、约8.0mM-9.0mM、约8.0mM-10.0mM、约8.5mM-9.0mM、约8.5mM-10.0mM、约9.0mM-10.0mM或约9.5mM-10.0mM的范围内。在某些其他实施方案中，含氟表面活性剂的浓度为约0.5mM、约1.0mM、约1.5mM、约2.0mM、约2.5mM、约3.0mM、约3.5mM、约4.0mM、约4.5mM、约,5.0mM、约5.5mM、约6.0mM、约6.5mM、约7.0mM、约7.5mM、约8.0mM、约8.5mM、约9.0mM或约9.5mM。
油相
在本公开内容中所用的油相或连续相为与水不混溶的任何液体化合物或液体化合物的混合物。所使用的油可以是或可以包括硅油、矿物油、烃油、氟碳油、植物油或其组合以及其他中的至少一种。任何其他合适的组分也可存在于油相中，比如至少一种表面活性剂、试剂、其他添加剂、防腐剂、颗粒或其任何组合。
在某些情况下，油为氟化油。氟化油可以是任何氟化的有机化合物。在某些情况下，氟化油为全氟化碳，比如全氟辛烷或全氟己烷。在某些情况下，含氟化合物为部分氟化的烃，比如1,1,1-三氟辛烷或1,1,1,2,2-五氟癸烷。氟化有机物可为直链的、环状的或杂环的。除了碳和氟之外，氟化的有机化合物还可含有氢、氧、氮、硫、氯、溴原子。
在某些情况下，氟化油为全氟烷基醚，如作为NOVECTMHFE-7100工程流体出售的甲基九氟异丁基醚。在某些情况下，含氟化合物为作为NOVECTMHFE-7500工程流体出售的3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷。在某些情况下，含氟化合物为作为NOVECTMHFE-7500工程流体出售的3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷。在某些情况下，含氟化合物可为作为NOVECTMHFE-7300工程流体出售的1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-十氟-3-甲氧基-4-三氟甲基-戊烷。
在本公开内容的方法中，含氟表面活性剂主要存在油相中。在某些情况下，至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的含氟表面活性剂存在油相中。
水相
水相可为与水相混溶的任何液体。即水相可以是当与水在室温下混合时形成稳定的单相溶液的任何液体。在某些实施方案中，水相可包含一种或更多种生理学上可接受的试剂和/或溶剂等。水相的某些非限制性实例包括水、DMF、DMSO、甲醇或乙醇。
在某些情况下，水相可为缓冲溶液。缓冲溶液可包括TRIS和KCl。在某些情况下，Tris的浓度为约、大于约、或小于约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、50mM、80mM、160mM或200mM。在某些情况下，氯化钾的浓度可为约、大于约、或小于约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约80mM、约100mM、约200mM。缓冲溶液可包含约160mMTris和约40mMKCl。在某些情况下，在约、大于约、或小于约1.0mM、约2.0mM、约3.0mM、约4.0mM或约5.0mM的浓度下，将氯化镁(MgCl2)添加到扩增反应中。
在某些情况下，缓冲水相的pH在约7.0-10.0的范围内。在某些情况下，水相的pH在约7.5-10.0、约8.0-10.0、约8.5-10.0、约9.0-10.0、约9.5-10.0、约7.0-9.5、约7.5-9.5、约8.0-9.5、约8.5-9.5、约9.0-9.5、约7.0-9.0、约7.5-9.0、约8.0-9.0、约8.5-9.0、约7.0-8.5、约7.5-8.5、约8-8.5、约7.0-8.0或约7.5-8.0的范围内。在某些情况下，水溶液的pH为约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、约9.0、约9.1、约9.2、约9.3、约9.4、约9.5、约9.6、约9.7、约9.8、约9.9或约10。
非离子型非含氟表面活性剂
本公开内容的水相还包含非离子型非含氟表面活性剂。表面活性剂是能够降低它在其中存在的液体的表面张力的表面活性物质。表面活性剂，也可以或可选择地可以被描述为洗涤剂和/或润湿剂，可以包含亲水性部分和疏水性部分两者，这两者可共同赋予表面活性剂双重的亲水-疏水特性。在某些情况下，表面活性剂可根据相对于其疏水性的其亲水性被表征。在某些实施方案中，非离子型非含氟表面活性剂为聚亚烷基氧化物嵌段共聚物表面活性剂。特别有用的是具有通式[PPGn-PEGm]的聚丙二醇(H-(O-CH(CH3)-CH2)n-OH，PPG)和聚乙二醇(H-(O-CH2-CH2)n-OH，PEG)的嵌段共聚物。
非离子型非含氟表面活性剂可以是二、三、四、五或甚至更高的PEG和PPG的嵌段聚合物。在某些情况下，非离子型非含氟表面活性剂是具有通式(PEG-PPG)x的常规交替的PEG和PPG单元的交替共聚物，其中x是在约10-100的范围内。在某些情况下，x是在约10-20、约10-30、约10-40、约10-50、约10-60、约10-70、约10-80、约10-90、约20-30、约20-40、约20-50、约20-60、约20-70、约20-80、约20-90、约20-100、约30-40、约30-50、约30-60、约30-70、约30-80、约30-90、约30-100、约40-50、约40-60、约40-70、约40-80、约40-90、约40-100、约50-60、约50-70、约50-80、约50-90、约50-100、约60-70、约60-80、约60-90、约60-100、约70-80、约70-90、约70-100、约80-90、约80-100或约90-100的范围内。在某些情况下，非离子型非含氟表面活性剂是具有以无规序列附接的单体PEG和PPG嵌段的PEG和PPG的无规共聚物。
在某些情况下，PEG和PPG嵌段共聚物的分子量在约4,000道尔顿(“Da”)-25,000Da的范围内。在某些情况下，非离子型非含氟表面活性剂的分子量在约10,000Da-25000Da、约15,000Da-25,000Da、约20,000Da-25,000Da、约4,000Da-20,000Da、约10,000Da-20000Da、约15,000Da-20,000Da、约4,000Da-15,000Da、约10,000Da-15,000Da或约4,000Da-10,000Da的范围内。在某些情况下，非离子型非含氟表面活性剂的分子量为约4,000Da、4,500Da、约5,000Da、约5,500Da、约6,000Da、约6,500Da、约7,000Da、约7,500Da、约8,000Da、约8,500Da、约9,000Da、约9,500Da、约10,000Da、约10,500Da、约11,000Da、约11,500Da、约12,000Da、约12,500Da、约13,000Da、约13,500Da、约14,000Da、约14,500Da、约15,000Da、约15,500Da、约16,000Da、约16,500Da、约17,000Da、约17,500Da、约18,000Da、约18,500Da、约19,000Da、约19,500Da、约20,000Da、约20,500Da、约21,000Da、约21,500Da、约22,000Da、约22,500Da、约23,000Da、约23,500Da、约24,000Da、约24,500Da或约25,000Da。
在某些情况下，非离子型非含氟表面活性剂为聚环氧丙烷和聚环氧乙烷的三嵌段共聚物(方案3，式VI，见下文)，其以商品名出售(BASF公司的注册商标，也以非专有名称“泊洛沙姆”已知)。这些共聚物由被PEG的两个亲水性链侧接的PPG的中央疏水性链组成(PEG-PPG-PEG)。具有不同长度的单独的PEG和PPG单位的嵌段共聚物通过不同的亲水亲脂平衡值(HLB)表征。在某些实施方案中，表面活性剂是 或(a＝101，b＝56)。
在本公开内容的另一实施方案中，非离子型非含氟表面活性剂为(ShellChemicalCo.的注册商标)。的一般结构包含亲水性聚乙烯链和芳香烃亲脂性基团(方案3，式VII，见下文)。在某些情况下，非离子型非含氟表面活性剂为
在本公开内容的另外的实施方案中，非离子型非含氟表面活性剂可为其他的聚乙二醇衍生物，包括(UnionCarbideCorp.的注册商标)。的一般结构包含亲水性聚乙烯链和芳香烃亲脂性基团(方案3，式VIII，见下文)组成。在某些情况下，非离子型非含氟表面活性剂为(x＝1.5avg)、(x＝3avg)、(x＝4.5avg)、(x＝9.5avg)、(x＝12avg)、(x＝7.5avg)、(x＝16avg)、(x＝30avg)、 (x＝35avg)、或(x＝1.5avg)。
在本公开内容的另外的实施方案中，非离子型非含氟表面活性剂是脱水山梨醇单月桂酸酯的聚氧乙烯衍生物(方案3，式IX，见下文)，其作为(UniquemaAmericasLLC的注册商标)是可商购的。在某些情况下，非离子型非含氟表面活性剂是(R＝CH2(CH2)9CH3))、(R＝CH2(CH2)13CH3)、(R＝CH2(CH2)15CH3)或(R＝(CH2)7CH＝CH(CH2)8。
非离子型非含氟表面活性剂的浓度可在约0.1-5.0％重量百分比的范围内。在某些实施方案中，非离子型非含氟表面活性剂的浓度小于约1.5％重量比重量(“w/w”)。在某些情况下，的浓度小于约1.4％w/w、约1.3％w/w、约1.2％w/w、约1.1％w/w、约1.0％w/w、约0.9％w/w、约0.8％w/w、约0.7％w/w、约0.6％w/w、约0.5％w/w、约0.4％w/w、约0.3％w/w、约0.2％w/w或约0.1％w/w。在某些实施方案中，浓度为在约0.50％w/w-1.5％w/w的范围内。在某些实施方案中，浓度为在约0.50％w/w-0.60％w/w、约0.50％w/w-0.65％w/w、约0.50％w/w-0.70％w/w、约0.55％w/w-0.60％w/w、约0.55％w/w-0.65％w/w、约0.55％w/w-0.70％w/w、约0.55％w/w-0.75％w/w、约0.60％w/w-0.65％w/w、约0.60％w/w-0.70％w/w、约0.60％w/w-0.75％w/w、约0.65％w/w-0.70％w/w、约0.65％w/w-0.75％w/w或约0.70％w/w-0.75％w/w的范围内。在某些另外的实施方案中，可以调节非离子型非含氟表面活性剂的浓度以优化微滴稳定性和微滴大小而不抑制PCR测定。
在某些实施方案中，含氟表面活性剂的浓度为在约1.0-6.0mM的范围内并且非离子型非含氟表面活性剂的浓度为在约0.1％-3.0％重量百分比的范围内。在另外的实施方案中，含氟表面活性剂具有式I的结构和约2.5mM的浓度，并且非离子型非含氟表面活性剂为并且具有约0.5％w/w-1.5％w/w的浓度。在某些情况下，含氟表面活性剂具有式I的结构和约2.5mM的浓度，并且非离子型非含氟表面活性剂为 并且具有约0.50％w/w-0.60％w/w、约0.50％w/w-0.65％w/w、约0.50％w/w-0.70％w/w、约0.55％w/w-0.60％w/w、约0.55％w/w-0.65％w/w、约0.55％w/w-0.70％w/w、约0.55％w/w-0.75％w/w、约0.60％w/w-0.65％w/w、约0.60％w/w-0.70％w/w、约0.60％w/w-0.75％w/w、约0.65％w/w-0.70％w/w、约0.65％w/w-0.75％w/w或约0.70％w/w-0.75％w/w的浓度。
在本发明的方法中，非离子型非含氟表面活性剂基本存在水相中。在某些情况下，至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的非离子型非含氟表面活性剂存在含水微滴的水相中。
嵌入染料
嵌入染料通常是插入在DNA双螺旋中的堆叠碱基对之间的具有平面结构的芳香族阳离子，即提供染料分子的环境依赖性的荧光增强并产生相对于溶液中的游离染料的荧光信号的大的提高的布置。信号增强提供成比例的响应，允许直接定量的DNA测量。本公开内容的优选的嵌入染料包括荧光染料。该染料可为花青或非花青嵌入染料。在某些情况下，嵌入染料是花青染料。在某些情况下，花青染料可为ThiazoleOrange、(例如SybrGreenI、SyberGreenII、SybrGold、SYBRDX)、OilGreen、CyQuantGR、SYTOXGreen、SYTO9、SYTO10、SYTO17、SYBR14、OxazileYellow、ThiazoneOrange、SYTO、TOTO、YOYO、BOBO和POPO。在某些情况下，该染料为非花青染料。在某些情况下，非花青染料为并五苯、蒽、萘、二茂铁、甲基紫精、三吗啉基铵、普罗匹定(例如碘化丙啶)或另外的芳族或杂芳族衍生物。在某些情况下，该嵌入染料可为
其他添加剂
在某些实施方案中，扩增反应还可包括一种或更多种添加剂，包括但不限于非特异性背景/阻断核酸(例如，鲑鱼精子DNA)、生物防腐剂(例如叠氮化钠)、PCR增强剂(例如甜菜碱、海藻糖等)和抑制剂(如RNA酶抑制剂)。一种或更多种添加剂可包括例如2-吡咯烷酮、乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、B-羟乙基吡咯烷酮(HEP)、丙酰胺、NN-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基甲酰胺(MMP)、NN-二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、N-甲基乙酰胺(MMA)、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇、甜菜碱、四甲基氯化铵(TMAC)、7-脱氮-2'-脱氧鸟苷、牛血清白蛋白(BSA)、T4基因32蛋白或甘油。
设备和系统
在另一个方面中，本公开内容提供微滴产生系统，包括：(a)与载体流体源流体连通的第一通道，其中载体流体源包含油和含氟表面活性剂，并且其中含氟表面活性剂选自通式I、II和/或III；(b)与样品源流体连通的第二通道，其中样品源包含靶核酸、非离子型表面活性剂和嵌入染料；(c)微滴通道；和(d)微滴源；其中第一通道在交叉点处与第二通道会合；交叉点接收来自样品源的样品和来自载体流体源的载体流体，并产生乳化微滴；并且乳化微滴沿着微滴通道流到微滴源中。
图7示出微滴产生系统100的示意图，所述微滴产生系统100包括与样品通道110流体连通的样品源105，和与载体流体通道流体连通的载体流体源115。样品通道110和载体流体通道115在交叉点或微滴产生点125处会合。在操作期间，包含来自载流体源115的油和含氟表面活性剂的载体流体被引导通过载体流体通道120到交叉点125处。来自包含靶核酸、非离子型表面活性剂和嵌入染料的样品源105的样品，也被引导通过样品通道到交叉点，其中样品分配产生将水相包含在油相中的微滴。因此，形成的微滴在微滴通道130中从交叉点125流动到用于保持微滴的微滴源135。
在某些情形下，系统包括与流体流动路径流体连通的检测组件。检测组件可位于沿着交叉点和收集源之间的检测通道的至少一部分。检测组件可以被配置为在流体流动路径中检测来自微滴的信号，例如在流经检测通道时。检测组件可包括对光的选择频率敏感的光学传感器或其他电子检测器。例如，传感器可适于检测荧光发射。在某些情况下，检测组件可包括激发源，例如在流体中适于诱导荧光的光源。可提供一个或更多个光学元件(例如，反射镜、透镜)以将从流体发射的光引导到检测组件，和/或将来自光源的光引导到流体。
在某些实施方案中，系统包括用于促进微滴从交叉点流动到收集源的压力源。压力源可为可操作地耦合到载体流体源和/或样品源的正压力源，或可操作地耦合到流体流动路径的负压力(即真空)源，比如通过收集源的方式。负压力源可为泵送系统。
微滴产生系统100可包括微滴检测器。在某些实施例中，微滴检测器与微滴通道130流体地分离，但在形成后，将微滴转移到微滴检测器以用于微滴检测和样品定量。在其他实施例中，微滴检测器与微滴通道130流体连通。例如，微滴检测器可位于沿微滴通道130处。例如微滴检测器的各种特征、部件和用途可如在Colston等人的美国专利公布第2010/0173394号(“Droplet-basedassysystem”)中所描述，其通过引用完全并入本文。
核酸检测的方法
本发明的另一个方面提供检测核酸的方法。该方法包括：(a)提供含有含氟表面活性剂的油组合物，其中含氟表面活性剂选自由式I、II和III组成的组；(b)提供含有靶核酸、非离子型表面活性剂和嵌入染料的含水组合物；(c)使(a)的油组合物与(b)的含水组合物接触，从而产生悬浮在连续相中的多个微滴；(d)热循环多个微滴以扩增靶核酸；和(e)检测靶核酸。
通过这个方法产生的多个微滴可为被油相包封的含水微滴。该包封可提供微滴和/或在微滴内的染料浓度的增强的稳定性。
在某些实施方案中，在含水微滴的水相之外检测到小于约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的总嵌入染料。在某些情况下，检测可在约5次热循环之后、约10次热循环之后、约15次热循环之后、约20次热循环之后、约30次热循环之后、约40次热循环之后、约50次热循环之后、约60次热循环之后、约70次热循环之后、约80次热循环之后、约90次热循环之后、约100次热循环之后、约120次热循环之后、约150次热循环之后、约200次热循环之后、约300次热循环之后、约400次热循环之后、约500次热循环之后或甚至更多的热循环之后。
在某些实施方案中，在含水微滴的水相之外可以检测到小于约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的特定嵌入染料(例如)。在某些情况下，检测可以是在约5次热循环之后、约10次热循环之后、约15次热循环之后、约20次热循环之后、约30次热循环之后、约40次热循环之后、约50次热循环之后、约60次热循环之后、约70次热循环之后、约80次热循环之后、约90次热循环之后、约100次热循环之后、约120次热循环之后、约150次热循环之后、约200次热循环之后、约300次热循环之后、约400次热循环之后、约500次热循环之后或甚至更多的热循环之后。
在热循环之前，多个微滴中的每个可以单独地包含0个靶核酸、1个靶核酸、2个靶核酸、3个靶核酸、4个靶核酸、5个靶核酸、6个靶核酸、7个靶核酸、8个靶核酸、9个靶核酸、10个靶核酸、11个靶核酸、12个靶核酸、13个靶核酸、14个靶核酸或15个靶核酸。在热循环之后，多个微滴中的每个可以包含约15X1040个靶核酸、约14X1040个靶核酸、约13X1040个靶核酸、约12X1040个靶核酸、约11X1040个靶核酸、约10X1040个靶核酸、约9X1040个靶核酸、约8X1040个靶核酸、约7X1040个靶核酸、约6X1040个靶核酸、约5X1040个靶核酸、约4X1040个靶核酸、约3X1040个靶核酸、约2X1040个靶核酸、约1X1040个靶核酸或0个靶核酸。
在热循环之前，每个微滴中存在的靶核酸拷贝的平均数可在每个微滴约0.00005-5个靶核酸的范围内。在某些情况下，在热循环之前，每个微滴中存在的靶核酸的平均数为每个微滴约0.0001-5个靶核酸、每个微滴约0.001-5个靶核酸、每个微滴约0.01-5个靶核酸、每个微滴约0.1-5个靶核酸、或每个微滴约1-5个靶核酸。此外，在热循环之后，每个微滴的靶核酸的平均数可为小于每个微滴约5.5X106个靶核酸、每个微滴约5.5X107个靶核酸、每个微滴约5.5X108个靶核酸、每个微滴约5.5X109个靶核酸、每个微滴约5.5X1011个靶核酸或每个微滴约5.5X1012个靶核酸，每个微滴。在某些实施方案中，检测包括测量来自嵌入染料的荧光。
PCR核酸扩增可依赖于热循环(即，加热和冷却的交替循环)以实现连续几轮复制。在实施例中，在DNA解链期间，将在DNA双螺旋中的双股分离(例如，在高温下)。然后，每股可被用作(例如，在较低的温度下)在通过DNA聚合酶的DNA合成中的模板以选择性地扩增靶DNA。
可通过在两个或更多个温度设定点(比如较高的解链(变性)温度和较低的退火/延伸温度)之间、或在三个或更多个的温度设定点(比如较高的解链温度、较低的退火温度和中间延伸温度以及其他)之间的热循环来进行PCR。PCR可用热稳定聚合酶来进行。热稳定DNA聚合酶的某些非限制性实例包括TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、Vent聚合酶、S-Tbr聚合酶、Tth聚合酶或其组合。
PCR产物的检测可使用荧光技术来完成。DNA嵌入染料在结合于DNA后呈现出增加的荧光，并可提供存在于反应体积中的DNA的量的定量读数。由于DNA的这种量随着反应过程增加，荧光强度增加。荧光检测可使用各种检测器设备来获得，所述检测器设备配备有产生可由荧光染料吸收的激发光的模块以及检测由荧光染料发射的光的模块。在某些实施方案中，可检测大量的微滴。例如，样品可被分配到放置在检测器中的管中，所述检测器测量来自管的大量荧光。在某些实施方案中，一个或更多个微滴可被分配到板的一个或更多个孔中，所述板例如96孔板，并且可使用荧光板读数器来检测单独孔的荧光。
实施例
实施例1
图1-图2示出染料浸出响应依赖于羧酸XI的浓度。
1ml等分的SYBRGreen水溶液(最终浓度＝0.5X)被覆盖在含有已知浓度的羧酸XI(0.01mM–0.10mM)的1mlHFE-7500溶液上。以1分钟的间隔采取1μl等份的含水SYBRGreen溶液以用于使用NanoDrop紫外/可见分光光度计(ThermoScientific)在528nm处通过UV-Vis光谱学的询问。然后，将UV-Vis响应归一化，绘制为时间(分钟)对于每个浓度的函数。图1清楚地指示SYBRGreen从水相到氟相的浸出速率与存在于氟化油(HFE-7500)中的羧酸XI的浓度成比例。染料浸出的速率随着羧酸XI的浓度而增加。
以与上述类似的方式进行第二次实验。在这种情况下，第一溶液包含在HFE-7500中的以2.5mM浓度的羧酸XI，第二溶液包含在HFE-7500中的以2.5mM浓度的含氟表面活性剂XII，而第三溶液是纯HFE-7500(用作对照)。图2清楚地图示对于纯HFE-7500和含有2.5mM的含氟表面活性剂XII的溶液，SYBRGreen染料保留水相内。相对的UV-Vis响应在两种情况下随时间推移保持恒定，这与随时间显著地降低的含2.5mM的羧酸XI的HFE-7500溶液形成鲜明对比。
实施例2
图4示出Bis-Krytox157FSH-PEG1000(XII)提供使氟油包水微滴在大范围的浓度上稳定，并与含水表面活性剂一起使用时最佳浓度是2.5mM。
在这个实验中，含氟表面活性剂XII的用于足够微滴稳定化所需的浓度范围通过功能测试研究。在HFE-7500中制备含氟表面活性剂XII的各种溶液，浓度范围从1.0×10-5–0.1M。在缓冲的含水ddPCR预混液(mastermix)中含有1cpd金黄色葡萄球菌(S.Aureus)模板、引物、DNA聚合酶和 的测定微滴，使用QX100TM微滴发生器(Bio-Rad)通过标准方法从每个含氟表面活性剂溶液(4孔，或反应，每浓度)产生。将微滴转移到96孔PCR板中，然后使用标准ddPCR热循环方案在C1000TouchTM热循环仪(Bio-Rad)上循环。然后使用修改的QX100TM微滴读数器询问微滴的每个孔以计数阳性(高荧光强度)和阴性(低荧光强度)微滴。图4指示含氟表面活性剂XII在HFE-7500中的宽的工作浓度范围1.0×10-2–2.5×10-5M。在浓度低于或高于这些值时，微滴完整性受到损害，如由“rain”(偏离振幅的信号)的大量增加和阳性和阴性微滴群体的合并所证明。
实施例3
图5示出类型和浓度对微滴稳定性的影响。
在这个实验中，通过在一系列浓度下添加各种类型的Pluronic到微滴的水相中研究的微滴稳定作用。所研究的类型包括F-38、F-68和F-98，典型的浓度为0.5–5.0％w/w。制备含有1X引物和指定浓度和类型的的缓冲水溶液。使用QX100TM微滴发生器(Bio-Rad)通过标准方法，使用在HFE-7500(每类型和浓度4孔)中的以2.5mM浓度的含氟表面活性剂XII产生含有各种水溶液的微滴。将微滴转移到96孔PCR板，然后使用标准ddPCR热循环方案在C1000TouchTM热循环仪(Bio-Rad)上循环。然后使用修改的QX100TM微滴读数器询问每个孔的微滴，以使用各种微滴质量度量标准评估微滴完整性。图5表明随着的MW从F-38到F-98增加(同时保持恒定的HLB)，微滴对热降解/聚结的稳定性也增加。
实施例4
图7示出浓度对微滴大小的影响。
该实验涉及在从0.50-1.50％w/w的含水预混液中的的滴定以确定在微滴产生之后，浓度对所测量的微滴大小的影响。制备含有引物和特定浓度的的缓冲水溶液。使用QX100TM微滴发生器(Bio-Rad)通过标准方法，使用在HFE-7500(每Pluronic浓度8孔)中的以2.5mM浓度的含氟表面活性剂XII产生含有各种水溶液的微滴。所产生的微滴从出口孔除去，然后通过显微镜在显微镜载玻片上定尺寸。图7清楚地指示随着的浓度增加，所产生微滴的平均半径减小。
实施例5
图8A和8B示出在ddPCR测定中，使用染料和微乳液(微滴)，所述微乳液包含连续相(2.5mMBis-Krytox157FSH-PEG1000,XII)和水相(050-0.75％w/w缓冲的,pH～8.3–8.4)的组合。
这个实验涉及在优化的表面活性剂条件(在HFE-7500中的2.5mM含氟表面活性剂XII，在缓冲的含水ddPCR预混液中的0.50％w/w的)下，使用染料进行ddPCR测定。使用QX100TM微滴发生器(Bio-Rad)通过标准方法，使用优化的微滴产生油(在HFE-7500中的2.5mM含氟表面活性剂XII)，产生在缓冲的含水ddPCR预混液中含有1cpd.金黄色葡萄球菌模板、引物、DNA聚合酶、1XEvaGreen和0.50％w/w的测定微滴(48孔/反应)。将微滴转移到96孔PCR板，然后使用标准ddPCR热循环方案在C1000TouchTM热循环仪(Bio-Rad)上循环。然后使用修改的QX100TM微滴读数器询问每个孔的微滴，以计数阳性(高荧光强度)和阴性(低荧光强度)微滴。图8A展示用于单个孔/反应的ddPCR数据，示出阳性和阴性微滴之间的清楚分离。图8B展示用于组合的48孔/反应的ddPCR数据，再次例证不同的阳性和阴性带。在这种情况下，还清楚的是嵌入染料未浸出，因为正振幅随着微滴询问所采取的时间(～1.5小时)保持恒定。
实施例6
方案4示出用于制备含氟表面活性剂I的合成路线的实例。
溶剂制备
甲苯
将甲苯(125ml)经CaH2和固体Na薄片干燥至少24小时，然后在使用之前新鲜蒸馏。在干燥期间，将二苯甲酮添加到甲苯中以充当指示剂，在蒸馏之前，甲苯是黑色、鲜明的、蓝色/紫色的颜色。可选择地，如果可用，直接将甲苯从无水溶剂分配器中分配。
HFE-7100
将HFE-7100(500ml)经CaH2干燥至少24小时，然后在使用之前新鲜蒸馏。可选择地，如果可用，直接将HFE-7100从无水溶剂分配器中分配。
四氢呋喃(THF)
将THF(125ml)经CaH2和固体Na薄片干燥至少24小时，然后在使用之前新鲜蒸馏。在干燥期间，将二苯甲酮添加到THF中以充当指示剂，在蒸馏之前，THF必须是黑色、鲜明的、蓝色/紫色的颜色。可选择地，如果可用，直接将THF从无水溶剂分配器中分配。
试剂制备
在使用之前，通过19FNMR确定每个新的羧酸XI批号的MW。在干燥甲苯(125ml)中溶解PEG(1000)，然后在减压(<10毫巴)下在60℃下蒸发至干以通过共沸蒸馏(在使用之前立即)除去任何痕量的H2O。使用由Sigma-Aldrich公司供应的草酰氯、二甲基甲酰胺和三乙胺。为了确保草酰氯和三乙胺的无水完整性，草酰氯和三乙胺两者皆在使用之前新鲜购买。如果它们在使用之前已经被打开多于一个月，试剂不用于制造。
合成方法
将羧酸XI(300.0克(g),49.63毫摩尔(mmol))和二甲基甲酰胺(0.192毫升(ml)，2.48mmol)添加到配备有磁力搅拌棒的1000ml的圆底烧瓶(RBF)中。用N2(或Ar)吹扫RBF，用橡胶隔片塞住RBF，用N2(或Ar)填充的气球加顶，并且然后通过注射器添加新鲜蒸馏的HFE-7100(250ml)。用橡胶隔片和N2(或Ar)填充的气球加顶的回流冷凝器被附接到RBF，然后在搅拌(～650转每分钟(rpm))下将内容物加热(砂浴被设定在90℃)5分钟，之后通过注射器缓慢添加草酰氯(21ml，245mmol)。澄清的溶液变为澄清的浅黄色，并产生大量的气体(小心！)，用未加盖的针(19号)和手动排气橡胶隔片(如果需要)解除过量的压力。在回流下搅拌10分钟后，溶液再次起泡沫，产生大量气体，并变成乳白色。在回流下另外的5分钟搅拌后，溶液回到不透明的浅黄色。在回流下另外的15分钟搅拌后溶液变成澄清的浅黄色。
将此溶液在回流下(60℃)搅拌持续总计4小时，在此时间期间，溶液变成澄清的橙色并且含有少量的悬浮固体棕色颗粒。允许该溶液冷却至室温，并且然后在减压(<10毫巴)下在60℃下除去过量的溶剂和草酰氯，以给出作为含有悬浮棕色颗粒的橙色油的粗制的酰基氯。
通过注射器将新鲜蒸馏的HFE-7100(250ml)添加到在1000mlRBF中的粗制酰基氯(其用橡胶隔片和N2(或Ar)填充的气球加盖)中。然后在N2(或Ar)下，在60℃(砂浴被设定在90℃)下在搅拌(～650rpm)下将该溶液回流5分钟，之后通过注射器(或双尖针，或适当的输送线)添加在干燥THF(125ml)中的PEG(24.8g，24.8mmol)和三乙胺(14ml，100mmol)的溶液。注意：反应混合物立即冒烟并且由于大量白色沉淀(NEt3·HCl)形成变成乳白色。
将此反应混合物在66℃(砂浴被设定为90℃)下在N2(或Ar)下在搅拌(～650rpm)下回流约18小时，在此时间期间，反应混合物变成褐色，并且少量棕色/黑色沉淀附着在RBF的壁上。允许反应混合物冷却至RT，然后在减压(<10毫巴)下在60℃下除去过量的溶剂和三乙胺以给出作为橙色/褐色半固体的粗制的式I。将粗制产物溶解在HFE-7100(1750ml)中，然后添加到2000ml的分液漏斗中，允许该溶液静置过夜(固体杂质漂浮到HFE-7100的顶部)。在真空下将氟相以～500ml部分缓慢地通过烧结的布氏漏斗(孔隙度4-8μm)过滤并收集在1000ml的梨形蒸发烧瓶中。在每次收集之后，将溶剂在60℃下在减压下蒸发。用另外的HFE-7100(250ml)洗涤存在于2000ml的分液漏斗中的剩下的淡褐色固体残留物。允许该溶液静置过夜。然后将溶液以～500ml部分缓慢地通过烧结的布氏漏斗(孔隙度4-8μm)过滤并收集在1000ml的梨形蒸发烧瓶中。在每次收集之后，将溶剂在60℃下在减压下蒸发。将残留物与之前的氟提取物合并，然后在减压(<10毫巴)下在70℃下蒸发至干以得到作为非常粘稠的橙色/棕色浆的式I(323.9g，25.02mmol)。
实施例7
含氟表面活性剂XII的表征
羧酸XI的NMR光谱
在50℃下，用总计128次扫描‘洁净(neat)’地收集被用于合成的特定批次的起始羧酸XI的19FNMR光谱。羧酸的典型的19FNMR光谱被示出在图9中。基于19FNMR光谱计算羧酸XI的实际平均分子量(MW)。计算出的平均MW应在5500-6500原子质量单位(amu)内。
从19FNMR光谱的MW计算的实例被示出在图12中。CF 2–CF3信号被“容易地”识别并且用可靠的积分(～-131ppm)很好地解析。为了计算MW范围，CF 2–CF3(～-131ppm)信号的积分与来自重复单体单元(～-145ppm和～-81ppm)的信号的积分相比较以确定n。
三个积分被归一化，使得CF 2–CF3信号等于2.00：
因此：1.11×1.80＝2.00，18.43×1.80＝33.21，和100.00×1.80＝180.18
因此：n＝[Int(CF-CF2)/1]/[Int(CF 2-CF3)/2]例如n＝(33.21/1)/(2.00/2)＝33.21
或
n＝[Int((CF 2-CF+CF 3-CF-CF2)-2)/5]/[Int(CF 2-CF3)/2]例如n＝((180.18-2)/5)/(2.00/2)＝35.64
在‘n’被确定后，将重复单体和末端单元的MW加在一起：
MW(羧酸XI)＝MW(C2F4COOH)+[nxMW(C3F6O)]+MW(C3F7O)
＝145.03+[nx(166.02)]+185.02
因此：MW(羧酸XI)＝145.03+(33.21x166.02)+185.02＝5843.57
或＝145.03+(35.64x166.02)+185.02＝6247.00
因此：平均MW(羧酸XI)＝(5843.57+6247.00)/2＝6045.29
含氟表面活性剂XII的NMR光谱
通过将1g产品溶解在0.2ml六氟苯(C6F6)中制备用于19F和13CNMR分析的含氟表面活性剂XII的样品。将约0.7ml该溶液转移至标准NMR管(5mm×180mm)以填充管至约5cm的深度。用总计128次扫描在50℃下‘洁净’地收集19F光谱，在50℃下连续扫描约2小时‘洁净’地收集13C光谱。
含氟表面活性剂XII的典型19F和13C光谱分别被示出在图13和14中。在含氟表面活性剂XII的13CNMR光谱中特别感兴趣的是归因于在约157ppm处的羰基碳(C＝O)的共振。当与在羧酸起始物料XI的13CNMR光谱中的在约162ppm处的相应的羰基碳的共振相比时，此共振已经经历显著的上行场位移(图10)。
在高纯度含氟表面活性剂XII的13CNMR光谱中，在157±2ppm处出现归因于两个酯键的羰基碳(C＝O)的相对较弱的共振，而不存在在162±2ppm处观察到的归因于羧酸XI的羰基碳(COOH)的共振。
ATR-FTIR
这种定性技术用于证实羧酸XI起始物料的羰基碳转化为在含氟表面活性剂XII中形成的两个酯键。使用安装铂ATR模块的BrukerTensor27IR分光光度计进行这种分析。在收集背景光谱后，将一小滴含氟表面活性剂XII样品涂抹遍及ATR晶体，并用以下参数收集样品的光谱；分辨率＝4，扫描次数＝32，和波长范围＝4000至500cm-1。
与C＝O伸缩相关联的峰被发现在约1784±6cm-1处存在最大出现，这指示羧酸XI转化为期望的含氟表面活性剂XII。
荧光
普通的定量技术在室内开发以确定作为杂质留在含氟表面活性剂XII产物中的羧酸XI起始物料的剩下的量，并确定含氟表面活性剂XII的百分比纯度。
100ml的1.000mM的羧酸XI的储备溶液在100ml容量瓶中制备。根据下表1中指示的体积，从储备溶液制备九个后续标准物(最终的浓度范围为1.000mM至0.010mM)。25ml的SYBR绿在去离子H2O中的10X溶液也可以在25ml容量瓶中制备。
通过下式求出1.000mM储备物所需的羧酸XI的量。
以克的质量(羧酸XI)＝0.001M×0.1L×由19FNMR分析所确定的羧酸XI的实际MW。
表1.制备的羧酸XI的储备溶液
VarianCaryEclipse荧光分光光度计仪器用于本分析，并将温度设定为20℃。将2ml羧酸XI的0.010M储备溶液转移到清洁的3ml石英比色杯中，在其上仔细地覆盖1mlSYBR10X储备溶液。然后使用VarianCaryEclipse荧光分光光度计(AgilentTechnologies,Inc.)在～542nm下在20℃下经过一段时间(～1小时)收集这个样品的氟相的荧光光谱。
对制备的另外9个标准物和含有作为纯度的未知量的酸XI的2.5mM溶液的含氟表面活性剂XII重复上述步骤。在每次运行之间，石英比色管彻底地用70％EtOH溶液和HFE-7500漂洗并使用压缩空气干燥。
上述溶液中的每个的动力学浸出图被拟合为如下所示的等式1以确定每个标准物和未知的含氟表面活性剂XII样品的准一级动力学速率常数(k)(图16A)。k对标准物的浓度的标绘图被获得以构建图16B所示的校准曲线。
等式1：[B]＝[B]οe-k[A]οt
其中：[B]＝荧光强度[B]°＝在t＝0处的荧光强度
e＝自然对数k＝速率常数
[A]°＝1t＝时间
从校准曲线确定在2.5mM含氟表面活性剂XII样品中的羧酸XI的未知浓度。例如在图16B中，7.25×10-4sec-1的准一级动力学速率常数对应于羧酸XI的约0.42mM浓度。使用下式确定合成的含氟表面活性剂的纯度：
在1L2.5mMXII中的含氟表面活性剂的表面活性剂的理论质量
＝浓度(M)×体积(L)×MW(XII)
＝0.0025(M)×1(L)×13054
＝32.64g
在1L2.5mMXII中的羧酸XI的实际质量：
＝浓度(μM)(从校准曲线)×体积(L)×MW(XI)
＝(0.42(MM)/1000)×1(L)×6045＝2.54g
在1L2.5mMXII中的含氟表面活性剂的实际质量
＝含氟表面活性剂XII的理论质量(g)-羧酸XI的计算的质量(g)
＝32.64(g)-2.54(g)
＝30.10(g)
含氟表面活性剂XII的纯度(％w/w)
＝含氟表面活性剂XII的实际质量(g)×100
含氟表面活性剂XII的理论质量(g)1
＝(30.10(g)/32.64(g))×(100/1)
＝92.2％w/w
元素分析
进行关于元素C、H和F的分析，并且每种分析以一式两份进行。基于起始物料的平均分子量计算元素C、H和F的理论分子式和百分比组成。记录元素结果并与理论元素组成相比较。理论元素组成和实际元素分析结果之间的差异小于0.5％。来自含氟表面活性剂XII的元素分析的代表性数据，平均分子式＝C260H90O95F430，在表2中列表显示。
表2.含氟表面活性剂XII的元素分析
注：如果F含量超过30％，则O含量不能确定。
实施例8含氟表面活性剂混合物的分析
图17示出在ddPCR测定中，包括各种含氟表面活性剂混合物的染料和微乳液(微滴)的分析。
该实验涉及在各种表面活性剂条件下使用染料进行ddPCR测定，其中：A＝式I；B＝式I+5mol％式XI+5mol％式II；C＝式I+10mol％式XI+10mol％式II；D＝式I+20mol％式XI+20mol％式II；E＝式I+50mol％式XI+50mol％式II。使用QX200TM微滴发生器(Bio-Rad)通过标准方法使用优化的微滴产生油(在HFE-7500中的2.5mM含氟表面活性剂XII)，产生在缓冲的含水ddPCR预混液中含有1cpd.金黄色葡萄球菌模板、引物、DNA聚合酶、1XEvaGreen和0.50％w/w的测定微滴(96孔/反应)。将微滴转移到96孔PCR板，然后使用标准ddPCR热循环方案在C1000TouchTM热循环仪(Bio-Rad)上循环。然后使用QX200TM微滴读数器询问每个孔的微滴以计数阳性(高荧光强度)和阴性(低荧光强度)微滴。图17展示组合的96孔/反应的ddPCR数据，例证不同的阳性和阴性带。在窗口A中看到的尖峰指示大型超级簇群微滴，其在添加不同量的式II和式XI后减少。
虽然本发明的示例性实施例和实施方案已经在本文中示出和描述，但将对本领域技术人员明显的是这些实施例和实施方案通过仅实例的方式提供。本领域技术人员现在将会想到许多变型、改变和替换而不脱离本发明。应当理解的是，本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案可在实践本发明中利用。意图的是，以下的权利要求界定本发明的范围并且由此包括在这些权利要求和其等同物的范围内的方法和结构。

Claims (109)

1.一种产生多个微滴的方法，包括：
a)提供油组合物，所述油组合物包含油和含氟表面活性剂，其中所述含氟表面活性剂选自由以下组成的组：
式I，
其中A和B中的每个为氧(O)或NR1，其中R1为H或烷基；m1和m2中的每个为从约10至100的数字；n为从约10至60的数字；
式II，
其中m3为从约20至50的数字；n2为从约8至30的数字；并且R为H或烷基；和
式III，
其中m4为从约20至50的数字；n3和n4中的每个为从约5至25的数字；n5为从约0至3的数字；并且R1和R2中的每个为烷基或H；
b)提供含水组合物，所述含水组合物包含靶核酸、非离子型非含氟表面活性剂和嵌入染料；和
c)使a)的所述油组合物与b)的所述含水组合物接触，从而产生悬浮在连续相中的多个微滴。
2.如权利要求1所述的方法，还包括：
a)热循环所述多个微滴以扩增所述靶核酸；和
b)检测所述靶核酸。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述含氟表面活性剂为式I。
4.如权利要求3所述的方法，其中A和B中的每个为O。
5.如权利要求4所述的方法，其中m1和m2各自为从约20至40，并且n为从约15至30。
6.如权利要求5所述的方法，其中m1和m2中的每个为约35并且n为约22。
7.如权利要求3所述的方法，其中所述含氟表面活性剂具有至少约0.5的亲水亲脂平衡值。
8.如权利要求3所述的方法，其中所述含氟表面活性剂具有小于约5.0的亲水亲脂平衡值。
9.如权利要求3所述的方法，其中所述含氟表面活性剂具有从约0.5至5.0范围的亲水亲脂平衡值。
10.如权利要求3所述的方法，其中所述含氟表面活性剂具有约1.5的亲水亲脂平衡值。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中所述非离子型非含氟表面活性剂是环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述非离子型非含氟表面活性剂是聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷的三嵌段共聚物。
13.如权利要求1或2所述的方法，其中所述非离子型非含氟表面活性剂是
14.如权利要求1或2所述的方法，其中所述非离子型非含氟表面活性剂是
15.如权利要求14所述的方法，其中所述的浓度在从约0.1％-3.0％(重量百分比)的范围内。
16.如权利要求1或2所述的方法，其中所述油包括氟油。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述氟油为2-三氟甲基-3-乙氧基十二氟己烷(HFE-7500)或1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-十氟-3-甲氧基-4-(三氟甲基)戊烷(HFE-7300)。
18.如权利要求1或2所述的方法，其中所述嵌入染料是或
19.如权利要求1或2所述的方法，其中所述连续相包含所述油。
20.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多个微滴为被所述油包封的含水微滴。
21.如权利要求20所述的方法，其中在约5次热循环之后，在所述含水微滴的水相之外检测到小于约5％的所述嵌入染料。
22.如权利要求20所述的方法，其中在约10次热循环之后，在所述含水微滴的水相之外检测到小于约5％的所述嵌入染料。
23.如权利要求20所述的方法，其中在约20次热循环之后，在所述含水微滴的水相之外检测到小于约5％的所述嵌入染料。
24.如权利要求20所述的方法，其中在约50次热循环之后，在所述含水微滴的水相之外检测到小于约5％的所述嵌入染料。
25.如权利要求20所述的方法，其中在约100次热循环之后，在所述含水微滴的水相之外检测到小于约5％的所述嵌入染料。
26.如权利要求20所述的方法，其中在约5次热循环之后，在所述含水微滴的水相之外检测到小于约10％的所述嵌入染料。
27.如权利要求20所述的方法，其中在约10次热循环之后，在所述含水微滴的水相之外检测到小于约10％的所述嵌入染料。
28.如权利要求20所述的方法，其中在约20次热循环之后，在所述含水微滴的水相之外检测到小于约10％的所述嵌入染料。
29.如权利要求20所述的方法，其中在约50次热循环之后，在所述含水微滴的水相之外检测到小于约10％的所述嵌入染料。
30.如权利要求20所述的方法，其中在约100次热循环之后，在所述含水微滴的水相之外检测到小于约10％的所述嵌入染料。
31.如权利要求1或2所述的方法，其中在热循环之后，所述多个微滴中的每个平均包含小于5.5×1012个靶核酸。
32.如权利要求2所述的方法，其中所述检测包括测量来自所述嵌入染料的荧光。
33.一种微滴发生器，包括：
a)第一通道，其与载体流体源流体连通，其中所述载体流体源包含油和含氟表面活性剂，并且其中所述含氟表面活性剂选自由以下组成的组：
式I，
其中A和B中的每个为氧(O)或NR1，其中R1为H或烷基；m1和m2中的每个为从约10至100的数字；n为从约10至60的数字；
式II，
其中m3为从约20至50的数字；n2为从约8至30的数字；R为H或烷基；和
式III，
其中m4为从约20至50的数字；n3和n4中的每个为从约5至25的数字；n5为从约0至3的数字；并且R1和R2中的每个为烷基或H；
b)第二通道，其与样品源流体连通，其中所述样品源包含靶核酸、非离子型非含氟表面活性剂和嵌入染料；和
c)微滴通道；
其中，所述第一通道在交叉点处与所述第二通道会合。
34.如权利要求33所述的微滴发生器，还包括微滴储器，所述微滴储器通过所述微滴通道与所述交叉点流体连通。
35.如权利要求33所述的微滴发生器，其中所述含氟表面活性剂为式I。
36.如权利要求34所述的微滴发生器，其中A和B中的每个为O。
37.如权利要求33或36所述的微滴发生器，其中m1和m2中的每个为从约20至40，且n为从约15至30。
38.如权利要求37所述的微滴发生器，其中m1和m2中的每个为约35且n为约22。
39.如权利要求33所述的微滴发生器，其中所述非离子型非含氟表面活性剂为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷的三嵌段共聚物。
40.如权利要求33所述的微滴发生器，其中每个微滴含有约一个靶核酸。
41.一种组合物，包含：
a)含氟表面活性剂，其选自由以下组成的组：
式I,
其中，A和B中的每个为氧(O)或NR1，其中R1为H或烷基；m1和m2中的每个为从约10至100的数字；n为从约10至60的数字；
式II，
其中m3为从约20至50的数字；n2为从约8至30的数字；R为H或烷基；和
式III，
其中m4为从约20至50的数字，n3和n4中的每个为从约5至25的数字，并且n5为从约0至3的数字；并且R1和R2中的每个为H或烷基；
b)非离子型非含氟表面活性剂；和
c)嵌入染料。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述含氟表面活性剂为式I。
43.如权利要求42所述的组合物，其中A和B中的每个为O。
44.如权利要求43所述的组合物，其中m1和m2中的每个为从约20至40，且n为从约15至30。
45.如权利要求44所述的组合物，其中m1和m2中的每个为约35，且n为约22。
46.如权利要求41所述的组合物，其中所述非离子型非含氟表面活性剂为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷的三嵌段共聚物。
47.如权利要求46所述的组合物，其中所述非离子型非含氟表面活性剂为
48.如权利要求47所述的组合物，其中所述非离子型非含氟表面活性剂为
49.如权利要求48所述的组合物，其中的浓度为从约0.1％至3.0％(重量百分比)。
50.如权利要求41所述的组合物，其中所述含氟表面活性剂为式I，并且所述非离子型非含氟表面活性剂为
51.如权利要求41所述的组合物，其中所述组合物包含被油相包封的含水微滴。
52.如权利要求51所述的组合物，其中所述油为氟油。
53.如权利要求51所述的组合物，其中所述含氟表面活性剂的至少约90％存在于所述油相中。
54.如权利要求51所述的组合物，其中所述含氟表面活性剂的至少约95％存在于所述油相中。
55.如权利要求51所述的组合物，其中所述含氟表面活性剂的至少约90％存在于所述含水微滴的水相中。
56.如权利要求51所述的组合物，其中所述非离子型含氟表面活性剂的至少约95％存在于所述含水微滴的水相中。
57.一种式I的共聚物，
式I，
其中A和B中的每个为氧(O)或NR1，其中R1为H或烷基；
m1和m2中的每个为从约10至100的数字；
n为从约10至60的数字；并且
所述共聚物具有至少约90％(w/w)的纯度。
58.如权利要求57所述的共聚物，其中A和B为O。
59.如权利要求57或58所述的共聚物，其中所述纯度为至少约95％(w/w)。
60.如权利要求58所述的共聚物，其中m1和m2中的每个为从约20至40。
61.如权利要求58所述的共聚物，其中n为从约15至30。
62.如权利要求59所述的共聚物，其中n为约20，并且m1和m2中的每个为约35。
63.一种式I的共聚物，
式I，
其中A和B中的每个为氧(O)或NR1；
R1为H或烷基；
m1和m2中的每个为从约10至100的数字；并且
n为从约11至60的数字。
64.如权利要求63所述的共聚物，其中A和B为O。
65.如权利要求63或64所述的共聚物，其中所述共聚物具有至少约90％(w/w)的纯度。
66.如权利要求63或64所述的共聚物，其中所述共聚物具有至少约95％(w/w)的纯度。
67.如权利要求63或64所述的共聚物，其中m1和m2中的每个为从约20至40。
68.一种合成共聚物的方法，包括：
a)在草酰氯和催化量的二甲基甲酰胺(DMF)的存在下，加热全氟聚醚羧酸在第一氟油中的溶液以形成酰基氯；
b)在包含第二氟油和醚的溶剂中，使所述酰基氯与聚乙二醇在胺的存下反应以形成包含含有全氟聚醚的共聚物的产物混合物，其中所述聚乙二醇的量为所述酰基氯的约1/2当量；和
c)将所述含有全氟聚醚的共聚物从所述产物混合物中分离。
69.如权利要求68所述的方法，其中使用约5当量的草酰氯。
70.如权利要求68所述的方法，其中所述第一氟油为HFE-7100。
71.如权利要求68所述的方法，其中将在a)中的反应混合物在约60℃下加热至少约1小时。
72.如权利要求71所述的方法，其中将在a)中的所述反应混合物在约60℃下加热至少约4小时。
73.如权利要求72所述的方法，其中在b)中的所述胺为三乙胺。
74.如权利要求68所述的方法，其中所述第二氟油为HFE-7100并且所述醚溶剂为四氢呋喃。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述HFE-7100与所述四氢呋喃的体积比为至少约2:1。
76.如权利要求68所述的方法，其中c)的所述分离包括：(1)除去所述溶剂以提供粗制产物；和(2)将所述粗制产物与第三氟油混合。
77.如权利要求76所述的方法，其中b)还包括形成胺盐酸盐，并且其中c)的所述分离还包括通过过滤除去所述胺盐酸盐。
78.如权利要求68所述的方法，其中b)还包括将所述聚乙二醇一次添加到所述酰基氯。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述第一氟油、第二氟油和第三氟油为HFE-7100。
80.如权利要求68所述的方法，其中所述全氟聚醚羧酸具有以下的结构：
其中m1为从约20至40的数字。
81.一种根据权利要求68所述的方法合成的高纯度的含有全氟聚醚的共聚物，其中所述含有全氟聚醚的共聚物具有至少90％(w/w)的纯度。
82.一种根据权利要求68所述的方法合成的高纯度的含有全氟聚醚的共聚物，其中所述含有全氟聚醚的共聚物具有至少95％(w/w)的纯度。
83.如权利要求82所述的高纯度的含有全氟聚醚的共聚物，其中所述共聚物具有以下的结构：
式I，
其中A和B中的每个为氧(O)或NR1，其中R1为H或烷基；
m1和m2中的每个为从约10至100的数字；并且
n为从约11-60的数字。
84.如权利要求83所述的高纯度的含有全氟聚醚的共聚物，其中m1和m2中的每个为约35，并且n为约22。
85.如权利要求1所述的方法，其中所述含氟表面活性剂包含式I、式II和/或式III的混合物。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述含氟表面活性剂包含式I和式II的混合物。
87.如权利要求85或86所述的方法，其中所述混合物还包含式XI：
其中n为从约10至100的数字。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述混合物包含约0.5％至5％(w/w)的式XI。
89.如权利要求1所述的方法，其中所述油制剂包含小于约0.5％(w/w)的式XI。
90.如权利要求1所述的方法，其中所述含氟表面活性剂具有至少约90％(w/w)的纯度。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述含氟表面活性剂包含至少90％(w/w)的式I和式II的混合物。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述式I和式II的混合物为至少约90:10(w/w)的比率。
93.如权利要求33所述的微滴发生器，其中所述含氟表面活性剂包含式I、式II和/或式III的混合物。
94.如权利要求93所述的微滴发生器，其中所述含氟表面活性剂包含式I和式II的混合物。
95.如权利要求93或94所述的微滴发生器，其中所述混合物还包含式XI：
其中n为从约10至100的数字。
96.如权利要求95所述的微滴发生器，其中所述混合物包含约0.5％至5％(w/w)的式XI。
97.如权利要求33所述的微滴发生器，其中所述油制剂包含小于约0.5％(w/w)的式XI。
98.如权利要求33所述的微滴发生器，其中所述含氟表面活性剂具有至少约90％(w/w)的纯度。
99.如权利要求98所述的微滴发生器，其中所述含氟表面活性剂包含至少90％(w/w)的式I和式II的混合物。
100.如权利要求99所述的微滴发生器，其中所述式I和式II的混合物为至少约90:10(w/w)的比率。
101.如权利要求41所述的组合物，其中所述含氟表面活性剂包含式I、式II和/或式III的混合物。
102.如权利要求101所述的组合物，其中所述含氟表面活性剂包含式I和式II的混合物。
103.如权利要求101或权利要求102所述的组合物，其中所述混合物还包含式XI：
其中n为从约10至100的数字。
104.如权利要求103所述的组合物，其中所述混合物包含约0.5％至5％(w/w)的式XI。
105.如权利要求41所述的组合物，其中所述油制剂包含小于约0.5％(w/w)的式XI。
106.如权利要求41所述的组合物，其中所述含氟表面活性剂具有至少约90％(w/w)的纯度。
107.如权利要求106所述的组合物，其中所述含氟表面活性剂包含至少90％(w/w)的式I和式II的混合物。
108.如权利要求107所述的组合物，其中所述式I和式II的混合物为至少约90:10(w/w)的比率。
109.如权利要求50所述的组合物，其中所述含氟表面活性剂还包含式II和/或式XI。
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