CN113351110B - 一种温敏性氟碳表面活性剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氟碳表面活性剂及其制备方法和应用,属于高分子表面活性剂技术领域。本发明的一种氟碳表面活性剂包括“亲氟”组分A和温敏组分B,所述“亲氟”组分A包括碳链长度至少为C8的亲氟链,所述温敏组分B包括聚N‑烷基丙烯酰胺、非线性聚乙二醇基热敏聚合物等热敏组分,通过共价键或非共价键连接。本发明的氟碳表面活性剂可用于制备微滴,在相对较低的温度条件下使微滴保持较好的稳定性,在相对较高的温度条件下能够破乳。本发明的氟碳表面活性剂具有温度可控表面活性能力,有助于外部控制乳液液滴融合等优点。
Description
技术领域
本发明属于高分子表面活性剂技术领域,特别是温敏性氟碳表面活性剂及其制备方法和应用。
背景技术
微液滴在生物医学中应用前景广阔,从细胞和药物的治疗传递到微凝胶的生产。通常可以通过乳液法或微流控技术制备微液滴,然而在制备微液滴后需要按需打破乳液滴,传统的方法往往需要大量的清洗过程,该过程不仅费时耗力,而且可能会造成微凝胶中活性物质失活。表面活性剂通过降低油水界面张力,可以避免微液滴发生融合,甚至可以在加热加压条件下保持液滴系统的稳定。这种过于稳定的表面活性剂往往会使得破乳非常困难。研究报道,可以采用被动策略或主动策略来实现液滴脱乳化(液滴融合)。通过使用外部高交流电压或一对微电极,可以实现主动融合(Ahn K,Agresti J,Chong H,etal.Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow inmicrofluidic channels[J].Applied Physics Letters,2006,88(26):264105;Jia Y,RenY,Hou L,et al.Sequential coalescence enabled two-step microreactions intriple-core double-emulsion droplets triggered by an electric field[J].Small,2017,13(46):1702188.)。或者,可通过液滴界面的光学加热(例如使用聚焦激光)局部改变液滴界面的温度和表面张力,实现融合(Baroud C N,de Saint Vincent M R,Delville JP.An optical toolbox for total control of droplet microfluidics[J].Lab on aChip,2007,7(8):1029-1033;)。还可在特定的波长下,光降解表面活性剂,使其失去表面活性能力(Dunkel P Z,Hayat Z,Barosi A,et al.Photolysis-driven Merging ofMicrodroplets in Microfluidic Chambers[J].Lab on a Chip,2016,16(8):1484-1491;Dunkel P Z,Hayat Z,Barosi A,et al.Photolysis-driven Merging of Microdropletsin Microfluidic Chambers[J].Lab on a Chip,2016,16(8):1484-1491.)。但是这些方法均可能对生物活性物质造成破坏,尤其是造成细胞的裂解,而且这些方法需要复杂的设备,操作不便。此外,还可通过化学诱导的融合方法,例如引入全氟醇类化合物,全氟辛醇、全氟丁醇(Akartuna I,Aubrecht DM,Kodger T E,et al.Chemically induced coalescencein droplet-based microfluidics[J].Lab on A Chip,2014,15(4):1140.)。但此方法需要增加额外的清洗通道、具有潜在的毒性。因此,研究开发一种按需可控的表面活性剂成为当前亟待研究的重要课题。
发明内容
鉴于此,本发明的目的是提供了一种氟碳表面活性剂及其制备方法和应用。本发明的氟碳表面活性剂具有温度可控表面活性能力,有助于外部控制微液滴融合的特点。
本发明目的是通过以下方式实现:
一种氟碳表面活性剂,包括“亲氟”组分A和温敏组分B。
基于以上技术方案,进一步地,“亲氟”组分A包括碳链长度至少为C8(即至少8个碳原子)的亲氟链;可以是直链,支链,环状,饱和,不饱和等;包括杂原子(例如氧(例如,二价氧),硫(例如,二价或六价硫),氮(例如,三价氮)等;可以是氟化低聚物或聚合物(即,含氟聚合物);可以包括(全)氟聚醚链,以及可溶于氟碳油的其他氟化聚合物。
基于以上技术方案,进一步地,含氟聚合物包括聚((全)氟环氧乙烷),聚((全)氟环氧丙烷),聚((全)氟环氧丁烷),聚(全(甲基)氟代烷基甲基丙烯酸酯)中的一种或二种以上的聚合物。
基于以上技术方案,进一步地,“亲氟”组分A具有低毒性,低表面张力以及溶解和气体透过性的性质。
基于以上技术方案,进一步地,温敏组分B包括聚N-烷基丙烯酰胺,非线性聚乙二醇基热敏聚合物,聚N-乙烯基烷基酰胺,聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物(PEO–PPO–PEO),聚(乙二醇)-聚(d,l-乳酸)-聚(乙二醇)共聚物(PEG–PLLA/PDLA–PEG)和聚乙二醇-聚乳酸(PEG–PLGA);
基于以上技术方案,进一步地,N-烷基丙烯酰胺包括聚乙烯丙烯酰胺,聚N-异丙基丙烯酰胺,聚N-正丙基丙烯酰胺,聚N-环丙基丙烯酰胺,聚N,N-二乙基丙烯酰胺中的一种或二种以上的聚合物;非线性聚乙二醇基热敏聚合物包括乙二醇甲基丙烯酸甲醚(mEGMA),二(乙二醇)甲基丙烯酸甲醚(mDEGMA),低聚(乙二醇)乙基醚甲基丙烯酸酯(eOEGMAn,n表示不同平均相对分子质量)中的一种或两种以上聚合物;或乙二醇丙烯酸酯甲醚(mEGA),二(乙二醇)乙醚丙烯酸酯(eDEGA),三(乙二醇)乙醚丙烯酸酯(eTEGA),二甘醇甲基醚丙烯酸酯(mDEGA),三(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(mTEGA),低聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(mOEGAn,n表示不同平均相对分子质量)中的一种或两种以上的聚合物。
基于以上技术方案,进一步地,具有不同侧链基团的N-烷基丙烯酰胺包括如下结构:
基于以上技术方案,进一步地,所述非线性聚乙二醇基热敏聚合物包括如下结构:
基于以上技术方案,进一步地,所述氟碳表面活性剂中“亲氟”组分A和温敏组分B的连接方式包括AB、ABA、BAB、(AB)n、A-(B)n或B-(A)n型结构;“亲氟”组分A和温敏组分B通过共价键或非共价键连接。
基于以上技术方案,进一步地,“亲氟”组分A和温敏组分B通过共价键连接。
基于以上技术方案,进一步地,“亲氟”组分A和温敏组分B通过酯键,酰胺键或醚键连接;酰胺键可以在例如带有氨基的聚合的反应中形成;醚键可以在例如使用羟基封端的聚合物的反应中形成。在某些情况下,醚键比酯或酰胺对水解更稳定,可以允许更大范围的适用pH值。
基于以上技术方案,进一步地,“亲氟”组分A和温敏组分B通过以下方式连接:
含羧基的亲氟组分A与含羟基、巯基或胺基的组分B连接;
或/和,含羟基的亲氟组分A与含羧基或含溴的组分B连接;
或/和,含胺基的亲氟组分A与含羧基或含溴的组分B连接。
基于以上技术方案,进一步地,在其他实施方案中,离子键或其他缔合,可用于结合“亲氟”组分A和温敏组分B。
基于以上技术方案,进一步地,在其他实施方案中,涉及反应性较强的物质,例如异氰酸酯(形成氨基甲酸酯键),或者是两亲的前体,例如具有酸,腈或酰卤头基的碳氟化合物,可与温敏组分B偶联,生成酯和酰胺。可以使用各种试剂来活化羧基(例如BOP)。
基于以上技术方案,进一步地,本文所述的表面活性剂合成包括但不限于在合适的溶剂混合物中将“亲氟”组分A偶联至温敏组分B。可以选择使用偶联反应的溶剂溶解“亲氟”组分A和温敏组分B,以提供偶联反应所需的迁移率。在一些实验中,甲基九氟丁基醚(3M,HFE 7100)和THF的混合物显示出良好的结果。合适溶剂包括但不限于HFE 7100(3M)和二氯甲烷或氟氯烃。
基于以上技术方案,进一步地,所述的氟碳表面活性剂具有结构式I所示结构:
其中,n和m为正整数,n≤100,m≤100。
基于以上技术方案,进一步地,上述温敏性氟碳表面活性剂为一种新的全氟聚醚类氟碳表面活性剂,可用于微凝胶制备,可控液滴融合的特性。
本发明另一方面提供上述的氟碳表面活性剂的制备方法,通过活化反应获得活化的“亲氟”组分A,然后与温敏组分B偶联;或者,通过活化反应获得活化的温敏组分B,然后与“亲氟”组分A偶联。
基于以上技术方案,进一步地,所述氟碳表面活性剂的制备方法主要包括如下步骤:
(1)酰化:将结构式II所示的全氟聚醚羧酸通过活化反应得到式III所示的酰化全氟聚醚,
其中,n为正整数,n≤100;
(2)反应:将步骤(1)得到的酰化全氟聚醚与聚N-异丙基丙烯酰胺反应,得到式I所示的温敏性氟碳表面活性剂。
基于以上技术方案,进一步地,所述(1)酰化的具体步骤为将结构式II所示的全氟聚醚羧酸溶于反应溶剂中,在惰性气保护条下,加入酰氯试剂,在25-200℃的条件下进行酰化反应6h-48h。
基于以上技术方案,进一步地,所述(1)酰化步骤中,所述酰氯试剂与所述结构式II所示的全氟聚醚羧酸的摩尔比为1:1~1:50。
基于以上技术方案,进一步地,所述(1)酰化步骤中,所述全氟聚醚羧酸的浓度为0.01~5g/mL。
基于以上技术方案,进一步地,所述的酰氯试剂包括乙二酰氯、亚硫酰氯。
基于以上技术方案,进一步地,所述(1)酰化步骤中,所述反应溶剂包括氢氟醚(HFE7100或HFE7500),具有溶解性好,易控的优点。
基于以上技术方案,进一步地,所述(1)酰化步骤中,酰化反应结束后,通过减压蒸发除去溶剂和剩余的酰氯试剂。
基于以上技术方案,进一步地,所述(2)反应的具体步骤为将步骤(1)得到的酰化全氟聚醚溶于反应溶剂中,在惰性气保护条下,加入聚N-异丙基丙烯酰胺,在25-200℃的条件下反应6h-48h,离心或过滤除去未反应的聚N-异丙基丙烯酰胺,减压蒸发除去反应溶剂,即得结构式I所示的温敏性氟碳表面活性剂。
基于以上技术方案,进一步地,所述反应溶剂包括氢氟醚(HFE7100或HFE7500)、三氟甲苯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二甲基亚砜中的一种或二种以上的混合溶剂。
基于以上技术方案,进一步地,所述(2)反应步骤中,所述聚N-异丙基丙烯酰胺的加入量为结构式III所示的酰化全氟聚醚质量的0.01倍-50倍。将聚N-异丙基丙烯酰胺与酰化全氟聚醚按照该比例配合反应,得到的温敏性氟碳表面活性剂具有较好的表面活性。
基于以上技术方案,进一步地,所述(2)反应步骤中,所述酰化全氟聚醚的浓度为0.01~5g/mL。
本法明另一方面还提供了一种液滴生成油,包括质量百分浓度为0.01%-50%的上述温敏性氟碳表面活性剂,所述液滴生成油的液滴生成及破乳过程,具有较好的效果。
本发明另一方面还提供了上述的温敏性氟碳表面活性剂在微凝胶制备过程中的应用。
基于以上技术方案,进一步地,将上述温敏性氟碳表面活性剂应用于微凝胶的制备,可以通过改变温度控制液滴生成和破乳过程。
基于以上技术方案,进一步地,所述温敏性氟碳表面活性剂用于活性物质,如缓冲剂,盐,营养物,治疗剂,药物,激素,抗体,镇痛药,抗凝血剂,抗炎化合物,抗微生物组合物,细胞因子,生长因子,干扰素,脂质,寡核苷酸聚合物,多糖,多肽,蛋白酶抑制剂,细胞,核酸,RNA,DNA,血管收缩剂或血管扩张剂,维生素,矿物质或稳定剂等包埋及温度可控释放。
基于以上技术方案,进一步地,所述温敏性氟碳表面活性剂用于含细胞微凝胶的制备。
基于以上技术方案,进一步地,所述温敏性氟碳表面活性剂用于微凝胶的连续化制备。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下:
1.本发明制备的温敏性氟碳表面活性剂,为一种新的全氟聚醚类氟碳表面活性剂,可作为表面活性剂制备微液滴,从而获得微凝胶,在相对较低的温度条件下(小于20℃),能够使微滴保持较好的稳定性,在相对较高的温度条件下(大于25℃),能够破乳。
2.本发明的温敏性氟碳表面活性剂的制备方法,为创新的制备工艺,具有合成路线简单,操作简便,物料成本低,不需要复杂的设备,使用的溶剂环境友好,便于工业放大生产。
3.本发明的温敏性氟碳表面活性剂在制备微液滴和微凝胶应用方面,具有温度可控按需释放的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例,下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为原料PFPE-COOH和温敏性氟碳表面活性剂红外图谱。
图2为原料PFPE-COOH和温敏性氟碳表面活性剂核磁共振图谱。
图3为实施例2中制备微液滴的流程示意图。
图4为实施例2所述的流体聚焦微通道结构示意图及所生产的微液滴图。
图5为实施例2中,4℃和37℃条件下,0.5%温敏氟碳表面活性剂形成的液滴稳定及破乳图。
图6为实施例2中,37℃条件下,0.5%温敏氟碳表面活性剂形成的液滴破乳的微观图。
图7为实施例3中制备微凝胶的流程示意图。
图8为实施例4中制备的载细胞微凝胶的死活细胞染色图。
图9为实施例4中制备的载细胞微凝胶的死活细胞染色量化数据,其中,contro(+)为细胞培养板中培养的细胞,control(-)为两步法生产的载细胞微凝胶细胞死活统计。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明,但本发明的实施方式不限于此,显而易见地,下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例,对于本领域技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
实施例1
一种温敏性氟碳表面活性剂,通过如下合成路线制备获得:
所述温敏性氟碳表面活性剂的制备方法主要包括如下步骤:
⑴酰化:首先称取具有羧基的全氟聚醚(PFPE-COOH)22.5g(杜邦,Krytoxl57FSH,平均分子量为6500)溶于60ml的溶剂氟油(3M,Novec7100)中,然后加入2.5ml乙二酰氯,在氮气保护下,65℃加热回流反应48h;当反应混合物冷却到室温后,用旋转蒸发仪蒸馏浓缩,得到酰化全氟聚醚(PFPE-COC1),通过抽真空除去溶剂和过量的乙二酰氯;
(2)反应:将步骤(1)得到的PFPE-COCl溶于30ml的Novec7100和二氯甲烷混合溶剂中(Novec7100:二氯甲烷体积比=1:2),在氮气保护下,加入2.4g氨封端的聚N-异丙基丙烯酰胺(average Mn=5500,sigma),在常温条件下反应24-48h;离心除去过量的氨封端的聚N-异丙基丙烯酰胺,所得混合物再于旋转蒸发仪上浓缩,然后抽真空即可得到淡黄色油状物,即温敏性氟碳表面活性剂。
将原料PFPE-COOH和上述制备的温敏性氟碳表面活性剂PFPE-NIPAM通过红外光谱(红外图谱如图1所示)和核磁共振(核磁图谱如图2所示)进行表征,从图1中可以对于原料PFPE,在1773cm-1处可以观察到PFPE羧基的特征峰。PFPE转化为PFPE酸氯化物后,在1805cm-1(C=O拉伸)和878cm-1(C-Cl拉伸)处出现了新的峰。PFPE与聚(n-异丙基丙烯酰胺)偶联后,在1756cm-1处出现酰胺键形成峰(C=O伸缩)。在合成的表面活性剂中还出现了1648cm-1(C=O拉伸)、1540cm-1(N-H平面弯曲)、1933和1978cm-1(CH2拉伸)和1450cm-1(CH3不对称弯曲)的pNIPAM特征峰。通过19FNMR进一步分析了PFPE-NIPAM表面活性剂的分子结构(如图2所示)。-133.30ppm处的峰值代表PFPE羧基碳原子上的氟吸收振动。在-131.46ppm处的峰值为-CF2组,离羧酸头基较远。PFPE的羧基端与pNIPAM的胺基共价结合形成酰胺键时,氟吸收振动峰由-133.30转移到-132.27ppm。这些结果证实了双嵌段表面活性剂PFPE-NIPAM的合成。
实施例2
将本发明所制备的温敏性氟碳表面活性剂加入油相中,通过如图3所示的微流控装置制备微凝胶,微流控装置包括:①第一输入通道,输入海藻酸预聚体溶液,②第二输入通道,输入含酸、表面活性剂的油相,③为输出通道。所述微通道内壁表面进行疏水处理。
将荧光素标记的海藻酸钠溶于含酚红的细胞培养基配置得海藻酸钠含量1%(w/v),作为油包水乳液的水相,进入①第一输入通道。将温敏性氟碳表面活性剂和醋酸加入氟化油Novec HFE7100中得到的混合溶液,作为油包水乳液体系的油相,进入②第二输入通道。上述油相中温敏性氟碳表面活性剂为0.5%(v/v)。将上述水相溶液和油相通过分别从第一和第二输入口注入流体聚焦微通道中,油相将水相剪切成尺寸分布均一的油包水单乳液液滴,如图4所示。所收集的液滴在4℃条件下,保持液滴稳定;当温度升至37℃时,液滴破裂合并,如图5所示。用荧光显微镜观察,在微观条件下,液滴随着时间的变化如图6所示。以上证实温敏性氟碳表面活性剂可以实现液滴稳定和破乳。
实施例3
将本发明所制备的温敏性氟碳表面活性剂加入油相中,通过一种微流控装置制备微凝胶,微流控装置如图7所示,包括①第一输入通道,输入海藻酸预聚体溶液,②第二输入通道,输入含酸、表面活性剂的油相,③第三输入通道,输入纯水或缓冲液;④为输出通道。所述微通道内壁表面进行疏水处理。
将荧光素标记的海藻酸钠溶于去离子水配置得海藻酸钠含量为1%(w/v),随后加入最终浓度为50mM乙二胺四乙酸钙(Ca-EDTA)的螯合物水溶液;以上述配置的凝胶预聚体溶液作为油包水乳液的水相,进入①第一输入通道。将温敏性氟碳表面活性剂和醋酸加入氟化油Novec HFE7100中得到的混合溶液,作为油包水乳液体系的油相,进入②第二输入通道。上述油相中温敏性氟碳表面活性剂为0.5%(v/v),醋酸的浓度为1‰(v/v)。配置25mM,pH=7.4的HEPES缓冲液(37℃)作为第二水相,进入③第三输入通道。
将上述水相溶液和油相通过分别从第一和第二输入口注入流体聚焦微通道G中,油相将水相剪切成尺寸分布均一的油包水单乳液液滴。其中第一水相流速为100μL/h,油相流速为1000μL/h。在⑤交联通道中,油相中的醋酸进入水相液滴中,使得液滴中pH降低,从而使与EDTA螯合的钙离子不稳定,释放到预聚液中,与海藻酸分子链交联形成凝胶。此时由于表面活性剂具有稳定作用,使得微乳液滴中形成的微凝胶颗粒稳定的分散在油相中。随后上述混合液经过通道W时,由③第三输入口引入的缓冲液使乳液整体温度升高,通道中缓冲液流速为1000μL/h。最后直接收集水油相混合流体,由于温度升高,表面活性剂不再稳定,从而使得微凝胶从油相中分离释放到水相中。此方法无需引入化学试剂进行破乳,能够实现一步法生物活性物质的包埋。
对比例1
相较实例1同样使用如图7所示微通道制备凝胶,①通输入道中水相流速与组成均不变;②输入通道中油相组分表面活性剂为全氟醚-聚乙二醇-全氟醚嵌段共聚物,浓度为1%(v/v),其他成分不变,流速不变。③通道为第二油相,组分为20%(v/v)1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇的Novec HFE7100混合液,通入流速为1000μL/h。①输入通道与②输入通道中的水油相在流体聚焦微通道中形成尺寸分布均一的油包水单相乳液液滴;在⑤通道中,发生交联后在液滴中形成微凝胶。随后上述混合液经过通道W时,③通道中的1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇将稳定水油界面的全氟醚-聚乙二醇-全氟醚嵌段共聚物表面活性剂替换后,由于其不稳定,使水油界面不再稳定。最后由④输出通道输出进入含缓冲液的容器中,此时微凝胶由于其亲水性自发进入水相,完成微凝胶与油相的分离。
由实施例1和对比例1可以看出,对比文件1需要添加1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇进行破乳,增加了额外的试剂,需要大量的清洗过程,该过程费时耗力,本发明制备的温敏性氟碳表面活性剂可实现芯片内乳化及温度可控的破乳分离,显著减少操作步骤和原料消耗。
实施例4
细胞培养:以人骨髓间充质干细胞培养(MSCs)为例,培养基为α-MEM,10%胎牛血清(FBS,Gibco)组成,培养条件:37℃,95%相对湿度与5%CO2。每两天后更换一次细胞培养基。使用时,首先磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞表面的蛋白,然后加入5mL胰蛋白酶/EDTA溶液孵育5分钟,将细胞悬浮液离心后分散于培养基中备用。
将RGD-海藻酸钠溶于α-MEM培养基中,并与上述细胞悬液共混,配制的水凝胶预聚液中RGD-海藻酸钠含量为1%(w/v),乙二胺四乙酸钙(Ca-EDTA)浓度为50mM,细胞浓度为3×106个/mL,以上配制的预聚体溶液作为第一水相。将用温敏性表面活性剂与醋酸加入Novec HFE7100后作为油相,油相中表面活性剂浓度为0.5%(v/v),醋酸浓度为1‰(v/v)。将25mM,pH=7.4的HEPES缓冲液(37℃)作为第二水相,对体系内过量的酸进行中和,并能够使温敏性表面活性不稳定发生破乳,释放包埋有细胞的微凝胶。
使用如图7所示的微通道制备载细胞微凝胶,其中,①第一输入通道,输入海藻酸预聚体溶液,②第二输入通道,输入含酸、表面活性剂的油相,③第三输入通道,输入纯水或缓冲液;④为输出通道。所述微通道内壁表面进行疏水处理。将上述水相溶液和油相通过分别从第一和第二输入口注入流体聚焦微通道G中,油相将水相剪切成尺寸分布均一的油包水单乳液液滴。其中第一水相流速为100μL/h,油相流速为1000μL/h。在⑤交联通道中,油相中的醋酸进入水相液滴中,使得液滴中pH降低,从而使与EDTA螯合的钙离子不稳定,释放到预聚液中,与海藻酸分子链交联形成包埋细胞的微凝胶。此时由于表面活性剂具有稳定作用,使得微乳液滴中形成的微凝胶颗粒稳定的分散在油相中。随后上述混合液经过通道W时,由③第三输入口引入的缓冲液使乳液整体温度升高,通道中缓冲液流速为1000μL/h。最后直接收集水油相混合流体,由于温度升高,表面活性剂不再稳定,从而使得微凝胶从油相中分离释放到水相中。使用与第二水相相同配比的HEPES缓冲液接收制得的两相混合流体,以进一步降低酸含量。此方法无需引入化学试剂进行破乳,能够实现一步法生物活性物质的包埋。
传统的两步法生产载细胞微凝胶,通过如图3所示的微流控装置制备微凝胶,微流控装置包括:①第一输入通道,输入海藻酸预聚体溶液,②第二输入通道,输入含酸、表面活性剂的油相,③为输出通道。所述微通道内壁表面进行疏水处理。①通输入道中水相流速与组成均与上述实施例4中相同;②输入通道中油相组分表面活性剂为全氟醚-聚乙二醇-全氟醚嵌段共聚物,浓度为1%(v/v),其他成分不变,流速不变。①输入通道与②输入通道中的水油相在流体聚焦微通道中形成尺寸分布均一的油包水单相乳液液滴;在③通道中,发生交联后在液滴中形成载细胞微凝胶。收集30分钟后,添加1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇进行破乳。然后加入HEPES缓冲液清洗,离心收集,重复此步骤3次,最后得到载细胞微凝胶。
通过使用死活细胞荧光染色(LIVE/DEAD)对温敏性制备体系的细胞毒性进行考察。在载细胞微凝胶培养液中加入2mM钙黄绿素(标记活细胞,绿色)和4mM碘化丙啶(标记死细胞,红色),15分钟后,激光共聚焦扫描显微镜观察,结果如图8和图9所示。采用表面活性剂时,细胞存活率均大于90%,与常规二维培养细胞存活率相当,明显高于传统两步法生产的载细胞微凝胶。证明该表面活性剂具有非常好的生物相容性,能够实现一步法制备载细胞微凝胶。
实施例5
将海藻酸钠溶于α-MEM培养基中,并与人骨髓间充质干细胞悬液共混,配置得海藻酸钠含量为1%(w/v),细胞浓度为107个/ml的海藻酸溶液。以上配制预聚体溶液作为第一水相。使用加入温敏性表面活性剂的Novec HFE7100作为油相,上述油相中温敏性表面活性剂浓度为1%(v/v)。
使用如图3所示的微通道制备微凝胶,其中①第一输入通道输入第一水相溶液,②第二输入通道输入上述油相,③输出通道。所述微通道内壁表面均进行疏水处理。其中,第一水相流速为100μL/h,油相流速为1000μL/h。按照上述参数以及材料配比,以实施例2的方式制备载细胞微液滴。制得的两相混合流体使用与清洗相相同配比的α-MEM培养基HEPES缓冲液接收。在20℃,孵育12h后,升高温度至37℃,收集人骨髓间充质干细胞聚集体。
本发明的液滴可以用作人骨髓间充质干细胞聚集体(cell aggregates orspheroids)制备模板。微流控技术是一种由微通道组成的技术平台,用于操纵少量具有独特性质和功能的适合于生物研究的试剂。利用微流体特别是基于液滴的微流体形成、培养和收获间充质干细胞聚集体及其在干细胞生物学、组织工程和药物筛选等方面的应用研究进展。但是细胞聚集体的获取往往需要复杂得步骤。利用本发明的温敏性氟碳表面活性剂,可以通过控制温度,方便的释放微模板里面成型的细胞聚集体。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (5)
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)的具体步骤为将结构式II所示的全氟聚醚羧酸溶于反应溶剂中,在惰性气保护条件下,加入酰氯试剂,在25-200℃的条件下进行酰化反应6h-48h;
所述酰氯试剂与全氟聚醚羧酸的摩尔比为1:1~1:50;
所述全氟聚醚羧酸的浓度为0.01~5g/mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)的具体步骤为将步骤(1)得到的酰化全氟聚醚溶于反应溶剂中,在惰性气保护条件下,加入结构式IV所示的氨封端聚N-异丙基丙烯酰胺,在25-200℃的条件下反应6h-48h,离心或过滤除去未反应的氨封端聚N-异丙基丙烯酰胺,减压蒸发除去反应溶剂,即得结构式I所示的温敏性氟碳表面活性剂;
所述反应溶剂为氢氟醚、三氟甲苯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二甲基亚砜中的一种或二种以上的混合溶剂;
所述氨封端聚N-异丙基丙烯酰胺的加入量为酰化全氟聚醚质量的0.01倍-50倍;
所述酰化全氟聚醚的浓度为0.01~5g/mL。
5.权利要求1所述的氟碳表面活性剂在微液滴或/和微凝胶制备中的应用。
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