CN102317472A - 使用环糊精改进核酸扩增反应的特异性、灵敏度和产率 - Google Patents

使用环糊精改进核酸扩增反应的特异性、灵敏度和产率 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用环糊精通过DNA聚合酶进行的体外DNA合成方法。本发明还涉及包含环糊精的方法、组合物和试剂盒以供核酸的扩增。环糊精的使用改善了扩增反应的特异性、灵敏度和/或产率。本发明更具体地涉及包含环糊精的用于进行PCR反应的试剂盒、组合物和方法。

Description

使用环糊精改进核酸扩增反应的特异性、灵敏度和产率
本发明涉及用于核酸扩增的试剂盒、组合物和方法。更具体而言，其涉及改进PCR方法和PCR方法的变型的特异性、灵敏度和产率。
聚合酶链式反应(PCR)是一种广泛用于分子生物学、遗传学、诊断、临床实验室、法医学、环境科学、遗传性研究、亲子鉴定以及多种其他应用的技术。PCR技术的目的是从不可检出量的起始材料扩增靶核酸。
PCR是一种强力且灵敏的DNA扩增技术。PCR通过使用多个循环的三步骤过程指数扩增特定的DNA序列。首先，在高温下使双链DNA模板变性。然后将序列特异性引物退火至相对两条链上目标序列侧翼的位点。热稳定性DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶延伸所述退火的引物，由此将原始DNA序列的量加倍。然后这种新合成的产物成为后续扩增循环的额外模板。将这三个步骤重复20到35个循环，使DNA浓度产生105-109倍的增加。
尽管对于核酸扩增而言PCR方法和PCR相关方法是巨大的成功，仍然需要改进所述反应的特异性、灵敏度和产率以及聚合酶的性能。
一些模板或靶核酸是难以扩增的和/或产生非特异性副产物如引物二聚体或寡聚体以及其他包括结合的引物的双链副产物。如果靶核酸以非常低的浓度存在，不合意的非特异性副产物的产生可能完全阻止对这种靶核酸的扩增。这在诊断试剂盒中可能是导致假阴性结果的棘手问题。
扩增反应的特异性是由引物在不允许非特异性配对的优化温度下特异性退火至核酸靶而提供的。然而，出于各种原因，在进行扩增之前将反应混合物保持在低于理想退火温度的温度下。当反应混合物保持在较低温度时，引物可能不合期望地以非特异性方式结合至非靶核酸。这些副产物能够同靶核酸一起扩增或者能够完全阻止对靶核酸精确和大量的扩增。这导致背景的产生并减少特异性PCR产物的产率。
物理阻断剂如蜡屏障(wax barrier)或蜡珠可以用于以热依赖性方式将反应组分分开。然而，主要的缺点是融化的屏障材料在PCR反应过程中残留在反应混合物中。
常用的改进扩增反应的方法是使用HotStart DNA聚合酶的HotStart PCR。这一技术允许在PCR反应准备过程中抑制或阻断聚合酶活性。通过在PCR循环之前限制聚合酶活性，HotStart PCR减少非特异性扩增并增加PCR产物产率。HotStart PCR常常是通过使用对DNA聚合酶的可逆化学修饰或通过用特异性抗体抑制DNA聚合酶来进行的(EP 0 592 035，EP 0 771 870，EP 0 962 526)。在两种情况下，对DNA聚合酶的抑制都是可逆的，并且通过初始加热步骤来激活DNA聚合酶，所谓的“HotStart”在PCR循环之前进行。然而，这些技术需要使用特别制备的热稳定性DNA聚合酶和加热步骤。
WO2006/119419描述了在hot-start PCR中用于掩蔽试剂的物质，其中所述掩蔽剂是聚内酯基质。需要热起始(hot-start)从所述聚内酯基质释放PCR试剂。
环糊精是环状寡糖，其一直是受到强烈关注的对象，主要是因为它们能够与称作“访客(guest)”的其他分子形成所谓的“包含”复合物。环糊精通常包含能够容纳访客分子的疏水部分的腔。尽管环糊精的外表面为亲水性的，内腔却高度疏水，使它们能够与许多种较小的疏水分子形成包含复合物。所述腔取决于葡萄糖单位数而具有不同的直径。通过与各种分子或分子的部分形成包含复合物，它们能够改变所述访客分子的理化性质。这能够导致访客分子(例如活性药物分子)的溶解度增加，并增加它们的生物利用度。可以封装可溶性差的药物、迅速变质的味道、挥发性香味或有毒分子。环糊精在药品工业中用作控制药物配制剂中活性成分释放的手段。另外，环糊精能够使不稳定的分子稳定并保护它们免受光、温度、氧化、还原和水解的降解或通过降低它们的挥发性而保护它们免遭降解。因此，环糊精在包括药理学、食品工业和美容学在内的广泛领域中得到多种应用。由于环糊精与疏水分子的包含化合物能够穿透身体组织，这可用于在特定条件下释放生物活性化合物。
已经显示了环糊精或环糊精衍生物催化特定的化学反应。
还发现了环糊精在分子生物学中的一些应用。WO91/02040描述了用于标记配体的包含荧光团和环糊精的包含复合物。所述荧光团和环糊精的包含复合物将信号放大。将用这些包含复合物标记的引物用于核酸测序。WO00/37674还描述了在测序反应中使用环糊精来扩增激基缔合物或激基复合物标签的荧光团。
US 5,705,345描述了使用环糊精制备核酸的方法和试剂盒。该文献公开了使用环糊精用于中和DNA修饰或扩增反应中的提取剂。例如，环糊精有效中和SDS和苯酚。
EP 0 762 898描述了用于治疗用途的反义寡核苷酸与环糊精的包含体。WO95/32739描述了用于细胞递送系统的与环糊精复合的寡核苷酸。
在分子生物学中，已将环糊精用于扩增荧光标记以及用于治疗性反义寡核苷酸的递送。
然而，现有技术从未描述或提出过在核酸扩增反应中使用环糊精。
现在本发明令人惊讶地证明环糊精的使用改进了DNA扩增反应如PCR反应和PCR反应的变型的特异性、灵敏度和/或产率。
另外，环糊精还改进等温DNA扩增反应的特异性、灵敏度和/或产率。
在第一个实施方案中，这种改进是通过用环糊精预处理扩增反应的组分之一来获得的，所述组分如热稳定性DNA聚合酶、dNTP或引物。引人注目的是，在另一实施方案中，如果简单地将环糊精加入到进行了核酸扩增的最终反应混合物中，也观察到了扩增反应的改进。
本发明的试剂盒、组合物和方法导致非特异性扩增产物包括引物二聚体的减少，同时改进特异性靶核酸的产率。
本发明的试剂盒、组合物和方法不需要热激活步骤(HotStart)，但是通过根据本发明加入环糊精可进一步改进HotStart PCR技术。
核酸扩增反应的整体效率、灵敏度和特异性得到改进。由于可以简单地向反应混合物加入环糊精，本发明的试剂盒、组合物和方法使医师能够获得很大的灵活性。如果用环糊精对组分之一进行预处理，则该预处理包括简单的与环糊精一起温育。
序列表
SEQ ID No.1：引物FWD NUMB
SEQ ID No.2：引物REV NUMB
SEQ ID No.3：引物HLA-C
SEQ ID No.4：引物HLA-C
SEQ ID No.5：引物FWD t-PA1
SEQ ID No.6：引物REV t-PA1
发明内容
本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其中所述扩增反应在包含至少一种环糊精的最终反应混合物中进行。
在第一种实施方案中，本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤：
a)将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有至少一种环糊精的扩增反应混合物接触；
b)对步骤a)中获得的反应混合物进行扩增反应。
在第二种实施方案中，本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤：
a)将环糊精与至少一种选自热稳定性DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP和引物的组分接触；
b)将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有至少一种来自步骤a)的组分的扩增反应混合物接触；
c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增。
在第三种实施方案中，本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤：
a)将所述样品与环糊精接触以获得样品和环糊精的混合物；
b)将所述样品和环糊精的混合物与扩增反应混合物接触；
c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增反应。
在第四种实施方案中，本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤：
a)将所述样品与扩增反应混合物接触；
b)加入至少一种环糊精；
c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增反应。
优选地，包含在所述反应混合物中的环糊精的浓度为0.1-50mM。
优选地，所述反应混合物包含0.01-0.2单位/μl的热稳定性DNA聚合酶。
优选地，所述反应混合物至少包含样品、环糊精、热稳定性DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP和至少一种引物。
优选地，所述环糊精选自下组：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精和它们的衍生物。
更优选地，所述环糊精选自下组：单丙二胺-β-环糊精、6-O-α-D-麦芽糖基-β环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精和2-羟丙基-β-环糊精。
本发明的另一目的是一种用于改进由DNA聚合酶催化的核酸体外合成的特异性和/或产率的方法，包括将单链核酸与DNA合成反应混合物接触，所述DNA合成反应混合物包含DNA聚合酶、引物、dNTP和至少一种环糊精。
优选地，所述用于改进由DNA聚合酶催化的核酸体外合成的特异性和/或产率的方法，包括使所述引物退火至所述单链核酸并在所述引物的3’端掺入互补的dNTP。
优选地，包含在最终反应混合物中环糊精的浓度为0.5-50mM，所述最终反应混合物包含单链核酸和所述DNA合成反应混合物。
本发明还涉及用于扩增样品中靶核酸的试剂盒，其在同一容器中包含至少一种环糊精和至少一种选自下组的组分：热稳定性DNA聚合酶、用于核酸扩增的反应缓冲液、dNTP和寡核苷酸引物。
在一些实施方案中，所述试剂盒在同一容器中或另外的容器中包含逆转录酶。
发明详述
本发明涉及用于改进通过DNA聚合酶催化的核酸体外合成的特异性、灵敏度和/或产率的方法，其包括将单链核酸与DNA合成反应混合物接触，所述DNA合成反应混合物包含DNA聚合酶、引物、dNTP和至少一种环糊精。测序，以及任何其他涉及引物退火继以使用DNA聚合酶的引物延伸的反应，当在至少一种环糊精存在下进行该反应时均得到改进。
变性、退火和延长/延伸步骤可以重复期望的次数以扩增样品中的靶核酸。因此，在优选的实施方案中，本发明提供使用环糊精扩增核酸的方法。
本发明还涉及包含环糊精的试剂盒和组合物。有利地，本发明提供用于核酸扩增的试剂盒和组合物。这些试剂盒和组合物通常意图用于研究或用于体外诊断应用。
术语“扩增”指增加样品中靶核苷酸序列拷贝数的体外方法。扩增反应通常由允许连续变性、退火和引物延伸循环的多轮重复温度循环组成。然而，等温扩增方法也在本发明的范围内。本发明提供用于进行PCR或PCR反应的变型如等温扩增的方法、组合物和试剂盒。这些方法在文献中描述并且是本领域技术人员熟知的。
通常，PCR反应涉及一系列重复20-35次的热循环，所述循环包括变性步骤、引物退火步骤和延伸/延长步骤。该反应常常以5-100μl的反应体积在小反应管中于热循环仪中进行。变性步骤在大约94℃-95℃的温度使核酸能够完全变性。这一步骤产生单链DNA。引物退火步骤通常在比引物-靶序列DNA双链体的解链温度低大约5℃的温度下进行。在此步寡核苷酸引物特异性结合于单链靶序列。延伸步骤在约72℃进行，但这依赖于所用的DNA聚合酶。例如Taq DNA聚合酶的最佳条件为72℃。在此步DNA聚合酶通过在5’到3’方向上添加dNTP的引物延伸来合成与靶链互补的新DNA链。
本发明涉及DNA或RNA靶核苷酸的扩增。对于RNA靶的扩增，使用逆转录酶来获得DNA模板。
本发明的方法、试剂盒和组合物可用于经典PCR、常规解决方案的DNA/RNA定量(routine solution DNA/RNA quantification)、逆转录酶PCR(一步和两步)、Real-Time PCR(单标记探针，双染料探针，Molecular Beacon探针，Scorpions探针，plexor引物，FRET探针，Padlock探针；仅在与双链DNA结合时发射荧光的dsDNA结合性荧光体(如SYBrGreen染料))、基于核酸序列的扩增(NASBA)、高分辨率DNA熔解曲线分析(HRM)、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、嗜热解旋酶依赖性扩增(tHDA)的实时监测、引物延伸、cDNA末端的快速扩增(RACE)、巢式PCR、免疫聚合酶链式反应(免疫PCR)、牵涉滚环复制(RCA)的方法、芯片上的染色质免疫沉淀(芯片上的ChIP)、使用邻位连接技术用于检测蛋白质、生物分子相互作用和单拷贝病原体的应用以及基于固相的核酸测定法。
本发明的试剂盒、组合物和方法适用于包括靶核酸的扩增和测序的测定法。本发明的试剂盒、组合物和方法特别用于诊断目的，用于基因分型和用于SNP研究。
含有或疑似含有靶核苷酸序列的核酸可以标记或附接至固相支持物如珠或固体表面。也可以将寡核苷酸引物标记或附接于多种支持物包括珠。
在本发明中，反应中环糊精的目的不是扩大标记或标志物的信号，举例而言例如标记的荧光。通常，环糊精不包括任何标记或标志物。在本发明的方法或试剂盒中，将环糊精用于增加扩增反应或DNA合成反应的产率、灵敏度和/或特异性。
本发明的试剂盒、组合物和方法提供用于靶核酸的扩增。
在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒和组合物包含环糊精和至少另一种核酸扩增所需的试剂。本发明还涉及在用于核酸扩增的方法中使用环糊精以改进该反应的产率、特异性和/或灵敏度。
环糊精是一个环式环状寡糖家族。常见的环糊精由5个或更多个通过1-＞4糖苷键连接的α-D-吡喃葡糖苷单位构成。环糊精是技术人员熟知的并且可以例如通过酶转化手段从淀粉产生。令人惊讶的是，环糊精的添加改进核酸扩增反应的特异性、灵敏度和产率。
任何环糊精、修饰的环糊精或它们的任何混合物均可以在本发明的试剂盒、组合物和方法中使用。
α-环糊精(六元糖环分子)、β-环糊精(七糖环分子)、γ-环糊精(八糖环分子)或它们的衍生物是优选的。
α-环糊精、β-环糊精设γ-环糊精的通式在下文显示。这些天然环糊精能够充当支架，在其上可以装配官能基和其它取代基。取代的环糊精或环糊精衍生物可以在本发明的方法、试剂盒和组合物中使用。可以通过用疏水模块或用“效应基团”例如糖或肽对羟基进行的任意取代或官能化来修饰环糊精。修饰的β-环糊精的化学式如下所示，其中R是有机基团。
通式：
Figure BDA0000082906210000071
修饰的β-环糊精，其中R是有机基团：
Figure BDA0000082906210000072
任何环糊精或环糊精衍生物，只要对扩增反应或对核酸合成反应具有期望的效果，均可用于本发明的试剂盒、组合物或方法中。
在α-环糊精中，优选的环糊精包括(2-羟丙基)-α-环糊精和3A-氨基-3A-脱氧-(2AS，3AS)-α-环糊精水合物。
在β-环糊精中，优选的环糊精包括单丙二胺-β-环糊精(6′-(3-氨基-丙胺基)-6′-脱氧-环麦芽七糖)、6-O-α-D-麦芽糖基-β-环糊精、2，6-二-O-甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、(2-羟丙基)-β-环糊精(β环糊精2-羟丙基醚)、3A-氨基-3A-脱氧-(2AS，3AS)-β-环糊精水合物和羟丙基-β-环糊精。
在优选的实施方案中，使用2-羟丙基-β-环糊精，甚至更优选使用取代程度为每个葡萄糖单元0.5至0.7个羟丙基基团的2-羟丙基-β-环糊精。最优选使用取代程度为每个葡萄糖单元0.67个羟丙基基团的2-羟丙基-β-环糊精。
在γ-环糊精中，优选的环糊精包括(2-羟丙基)-γ-环糊精和3A-氨基-3A-脱氧-(2AS，3AS)-γ-环糊精水合物。
用于核酸扩增的试剂或组分，包括寡核苷酸引物、三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)、热稳定性DNA聚合酶和合适的反应缓冲液，在文献中描述并且为本领域普通技术人员所知。
可以在本发明的试剂盒、组合物或方法中使用任何DNA聚合酶。优选热稳定性DNA聚合酶。优选的、可以用于本发明的方法的热稳定性DNA聚合酶包括获得自各种栖热菌属(Thermus)细菌菌种或来自其他微生物来源的聚合酶。
优选的热稳定性DNA聚合酶是从水生栖热菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄栖热菌(Thermus flavus)或激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、沃氏火球菌(Pyrococcuswoseii)和附岸热球菌(Thermococcus litoralis)获得的那些。这些聚合酶优选产生并纯化自含有编码所述DNA聚合酶的基因的重组大肠杆菌。
本发明的试剂盒、组合物和方法也可以使用上至少两种热稳定性DNA聚合酶或热稳定性DNA聚合酶与其他酶的组合，所述其他酶如尿嘧啶-N-糖基化酶、DNA酶或核酸外切酶如3’-5’校正读码核酸外切酶。
这些酶或酶组合对于长的核酸分子的扩增特别有用。
另外，本发明的试剂盒、组合物和方法可以使用所谓的HotStart DNA聚合酶，所述HotStart DNA聚合酶已经通过例如化学处理或通过特异性单克隆抗体而可逆地失活。这些DNA聚合酶需要在90℃-95℃进行5-10分钟的初始热激活步骤。
一些试剂或组分可以作为浓缩储液提供，在制备扩增反应混合物用于进行反应时将所述浓缩储液稀释。组分也可以以干固体的形式提供，意图将其重悬于水中或适当的缓冲液中以制备储液。
术语“反应缓冲液”指在其中进行酶促核酸扩增的缓冲性溶液。所述反应缓冲液可以作为浓缩储液提供，通常为2x、5x或10x浓度。在本发明中，所述反应缓冲液可以含有在用于核酸扩增的缓冲液中使用的任何已知化学品。例如，所述溶液可以含有Tris以供进行缓冲。反应缓冲液通常还含有一价阳离子(KCl)、二价阳离子(MgCl2、MgSO4)和非离子洗涤剂(TritonX-100、Tween 20、NP40)。所述缓冲液也可以含有提高PCR产率的试剂，比如举例而言(NH4)2SO4、海藻糖、DMSO、BSA、甘油、MgCl2、EDTA、甜菜碱等。所述反应缓冲液也可以含有任何热稳定性DNA聚合酶所需的辅助因子。这些试剂可以在同一容器中提供或在分开的容器中提供。
例如，标准10X PCR缓冲液可以包含：150-750mM Tris-HCl pH 8-8.8、50-200nM(NH4)2SO4、100-500mM KCl、0-20mM MgCl2、0.1％Tween-20和0.01％明胶。
术语“储存缓冲液”指将酶如热稳定性DNA聚合酶储存于其中的缓冲性溶液。这种缓冲性溶液可以使酶能够在-20℃或在4℃储存数周或数月。通常，所述储存缓冲液含有甘油以供在-20℃储存酶。
例如标准1x储存(缓冲液)可以包含Tris 20mM、EDTA 0.1mM、KCl100mM、DTT 1-10mM、Nonidet P40 0.50％、Tween-20 0.10-0.50％、甘油0-50％、磷酸钾(k-phospate)10mM、Triton X-100 0.10％、PMSF 0.5mM和IgepalCA-630 0.50％。
dNTP包括dATP、dCTP、dTTP和dGTP。本发明的试剂盒、组合物和方法也可以使用经修饰的或经标记的dNTP或核苷。dNTP可以作为预混合的dATP、dCTP、dTTP和dGTP的平衡储液提供。例如预混合的dNTP是2’-脱氧-腺苷-5’-三磷酸、2’-脱氧-胞苷-5’-三磷酸、2’-脱氧-鸟苷-5’-三磷酸、2’-脱氧-胸苷-5’-三磷酸各5mM的水溶液。
本发明的试剂盒、组合物和方法也可以使用dUTP。例如预混合的dNTP/dUTP溶液含有dATP、dCTP、dGTP各5mM和10mM 2’-脱氧-鸟苷-5’-三磷酸(dUTP)。
术语“引物”指具有或含有与靶核酸互补的序列的寡核苷酸或其衍生物。所述引物与变性的靶核酸通过碱基配对杂交以起始由DNA聚合酶催化的延伸反应。本发明的试剂盒、组合物和方法优选使用至少两种寡核苷酸引物，所述引物在靶核酸侧翼并与核酸的相对链杂交。本发明的试剂盒、组合物和方法也可以使用标记的或修饰的寡核苷酸。
术语“扩增反应混合物”指包含进行反应所需的组分中的一些或全部但不含样品的溶液。这种扩增反应混合物通常称作“MasterMix”。MasterMix由进行反应所需的组分中的一些或全部组成，但不含样品。MasterMix通常包含反应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP和dGTP的平衡混合物、热稳定性DNA聚合酶和引物。
术语“反应混合物”或“最终反应混合物”指包含包括样品在内的进行反应所需的全部组分的溶液。所述反应混合物通常通过将确定体积的扩增反应混合物与确定体积的样品混合来制备。所述最终反应混合物包含含有或疑似含有靶核酸的样品和扩增反应混合物二者。所述最终反应混合物通常含有5-100μl的体积。
PCR反应或更概括而言扩增反应也可以在dsDNA结合性荧光体存在下进行，所述dsDNA结合性荧光体仅在与双链DNA结合时发出荧光(如SYBrGreen染料)。这对于实时PCR应用或定量PCR特别有用。
术语“样品”指含有或疑似含有靶核酸的任何固体或液体材料。所述样品可以是纯化的核酸、生物样品如组织样品、生物流体样品或细胞样品。所述样品可以例如是血液、尿液、血清或唾液。所述样品可以含有人、植物、动物、细菌或病毒来源的固体或液体材料。
用于核酸扩增的反应组分通常商品化为包含至少一种或多种进行靶核酸扩增所必需的试剂/组分的试剂盒。
本发明的第一个目的是一种改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其中所述扩增反应在包含至少一种环糊精的反应混合物中进行。
本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有环糊精的扩增反应混合物接触的步骤。
可以将所述环糊精和其他核酸扩增所需的试剂/组分分别加入样品以构成在其中进行扩增的最终反应混合物。或者，可以将环糊精与用于核酸扩增的其他组分预混合，然后再将其与样品接触以进行扩增反应。或者，可以在加入其他用于核酸扩增的组分之前将样品与环糊精接触。
在另一实施方案中，将环糊精用于预处理核酸扩增组分。可以用环糊精预处理热稳定性DNA聚合酶、寡核苷酸引物或dNTP。将经预处理的组分用于制备含有环糊精的扩增反应混合物或用于直接制备含有环糊精的最终反应混合物。
本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤：
a)将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有至少一种环糊精扩增反应混合物接触；
b)对步骤a)中获得的最终反应混合物进行扩增反应。
本发明还涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤：
a)将环糊精与至少一种选自热稳定性DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP和引物的组分接触；
b)将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有至少一种来自步骤a)的组分的扩增反应混合物接触；
c)对步骤b)中获得的最终反应混合物进行扩增反应。
本发明还涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤：
a)将所述样品与环糊精接触以获得样品和环糊精的混合物；
b)将所述样品和环糊精的混合物与扩增反应混合物接触；
c)对步骤b)中获得的最终反应混合物进行扩增反应。
本发明还涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤：
a)将所述样品与扩增反应混合物接触；
b)加入至少一种环糊精；
c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增反应。
在根据本发明的方法中，由样品和扩增反应混合物组成的所述反应混合物中环糊精的浓度优选包括0.1至50mM，更优选0.5至50mM。优选在0.1、0.5、1、2、4、5mM至10、15、20、25、30、40和50mM。环糊精的适当浓度可以依赖于根据本发明的方法中使用的环糊精。如本申请所述的方法可以用于评价使扩增方法的灵敏度、特异性和/或产率得到改进的环糊精的最佳浓度。
在优选的实施方案中，环糊精选自下组：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精和它们的衍生物。还更优选地，环糊精选自下组：单丙二胺-β-环糊精、6-O-α-D-麦芽糖基-β环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精和2-羟丙基-β-环糊精。
热稳定性DNA聚合酶的浓度是可能决定核酸扩增方法的灵敏度、特异性和产率的另一因素。在一个优选的实施方案中，包含样品和扩增反应混合物的所述最终反应混合物包含0.01、0.02、0.03、0.04单位/μl至0.05、0.075、0.1和0.2单位/μl的热稳定性DNA聚合酶。将一个单位定义为在72℃在30分钟内向酸性不溶材料掺入10nmol dNTP所需的酶量。
根据本发明的方法可以进一步包括加热步骤以将核酸变性和/或激活“Hot Start”DNA聚合酶。如果所述热稳定性DNA聚合酶通过化学修饰或通过单克隆抗体进行了可逆失活，则需要这一额外步骤。
有利地，本发明的方法不需要在95℃的加热步骤/激活步骤。
在根据本发明的方法中，所述扩增反应混合物可以包含经环糊精预处理的热稳定性DNA聚合酶。
在本发明的方法中，所述扩增反应混合物可以包含经环糊精预处理的dNTP。
在本发明的方法中，所述扩增反应混合物可以包含经环糊精预处理的至少一种引物。
用环糊精预处理扩增反应混合物的试剂/组分通过将所述组分与足够浓度的环糊精温育来进行。这种温育可以在室温或优选在4℃进行。温育一小时通常足以获得环糊精对所述试剂的充分预处理。
或者，可以使用环糊精来制备要加入样品的扩增反应混合物或制备最终反应混合物以供进行反应。
在一个优选的实施方案中，所述扩增反应混合物包含环糊精、热稳定性DAN聚合酶、反应缓冲液、dNTP和寡核苷酸引物。
用于靶核酸扩增的方法在文献中描述并且为本领域技术人员所知。PCR是用于核酸扩增的标准技术但PCR方法的变型也可用于根据本发明的方法。
本发明的方法可以进一步包括在94-95℃进行的初始变性步骤以供核酸的初始和完全变性。加热步骤通常要1、2、3或5-10分钟。这种初始步骤也可以充当用于HotStart DNA聚合酶的加热激活步骤。
本发明的试剂盒、组合物和方法改进核酸扩增反应的特异性、灵敏度和/或产率。其他已知的方法可以与本发明组合使用以进一步改进反应。一些试剂如DMSO、BSA、甘油、海藻糖、甜菜碱据报道可改进反应。进一步的改进可以通过使用所谓的HotStart DNA聚合酶来获得。
本发明还涉及含有环糊精和至少一种用于核酸扩增的试剂的组合物。本发明的组合物可以是一旦加入样品便可即刻用于进行反应的扩增反应混合物。或者，如果根据本发明的组合物包含酶，其可以是浓缩储液或浓缩储存溶液的形式。
本发明提供用于通过DNA聚合酶催化的体外DNA合成的包含环糊精和至少一种选自下组的组分的组合物：DNA聚合酶、用于体外DNA合成的反应缓冲液、dNTP和引物。
本发明还涵盖用于样品中靶核酸扩增的组合物，其包含环糊精和至少一种选自下组的组分：热稳定性DNA聚合酶、用于核酸扩增的反应缓冲液、dNTP和寡核苷酸引物。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含环糊精和热稳定性DNA聚合酶。
优选地，根据本发明的组合物包含环糊精、热稳定性DNA聚合酶和储存缓冲液。所述储存缓冲液适用于在4℃或-20℃储存热稳定性DNA聚合酶。
概括而言，为了改进核酸扩增的产率、灵敏度和/或特异性，优选以充分的浓度提供环糊精。本发明还涉及包含环糊精和至少一种dNTP的组合物。优选地，所述组合物包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP的平衡混合物。例如所述组合物是包含dNTP的平衡预混物和环糊精的浓缩储液。或者，所述组合物可以包含dATP、dCTP、dGTP、dUTP和环糊精。
另外，本发明涉及包含环糊精和用于核酸扩增的反应缓冲液的组合物。
在另一实施方案中，所述组合物包含环糊精和至少一种引物。优选地，所述组合物包含环糊精和在靶核酸的5’和3’端与相对链杂交的至少两种引物。
在一个优选的实施方案中，所述组合物包含环糊精、热稳定性DNA聚合酶、dNTP和用于核酸扩增的反应缓冲液。
所述组合物可以进一步包含含有靶核酸或疑似含有靶核酸的样品。
在所述组合物中，更具体而言在由样品和扩增反应混合物组成的所述最终反应混合物中，环糊精的浓度优选包括0.1至50mM，更优选0.5至50mM。优选在0.1、0.5、1、2、4、5mM至10、15、20、25、30、40和50mM。
在所述组合物中，更具体而言在由样品和扩增反应混合物组成的所述最终反应混合物中，热稳定性DNA聚合酶的量优选包括0.01、0.02、0.03、0.04单位/μl至0.05、0.075、0.1和0.2单位/μl。
在另一实施方案中，所述组合物是用于扩增样品中靶核酸序列的试剂盒的一部分。
本发明的另一个目的是试剂盒，其在相同或分开的容器中包含环糊精和至少一种选自下组的组分：DNA聚合酶、用于体外DNA合成的反应缓冲液、dNTP和引物。优选地，所述试剂盒用于核酸扩增。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及试剂盒，其在相同或分开的容器中包含环糊精和至少一种选自下组的组分：热稳定性DNA聚合酶、用于核酸扩增的反应缓冲液、dNTP和寡核苷酸引物。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及用于样品中靶核酸扩增的试剂盒，其在同一容器中包含至少一种环糊精和至少一种选自下组的组分：热稳定性DNA聚合酶、用于核酸扩增的反应缓冲液、dNTP和寡核苷酸引物。
在本发明的试剂盒中，将不同的试剂在分开的容器中提供或作为包含几种组分的预混物提供。所述组分可以作为浓缩储液提供，所述浓缩储液在核酸扩增之前必需经混合和稀释。所述组分还可以以意图在水中或在合适的缓冲液中重悬的脱水的、冻干的或任何其他干固体形式提供。
所述试剂盒可进一步包含用于DNA聚合酶的任何辅助因子。
所述试剂盒还可包含dsDNA结合性荧光体，其仅当与双链DNA结合时发出荧光(如SYBRGreen)。
在第一实施方案中，根据本发明的试剂盒在同一容器中包含环糊精和热稳定性DNA聚合酶。
优选地，根据本发明的试剂盒在同一容器中包含环糊精、热稳定性DNA聚合酶和储存缓冲液。所述储存缓冲液特别意图用于且适于热稳定性DNA聚合酶的储存。
保持在含有环糊精的储存缓冲液中的热稳定性DNA聚合酶通常在进行核酸扩增之前进行稀释。
在第二实施方案中，根据本发明的试剂盒在同一容器中包含环糊精和至少一种dNTP。优选地，所述容器包含环糊精以及dATP、dCTP、dGTP和dTTP的平衡浓缩预混物。在核酸扩增前稀释这种含有环糊精的dNTP预混物。或者，所述容器包含环糊精以及dATP、dCTP、dGTP和dUTP的混合物。
在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒在同一容器中包含环糊精和用于核酸扩增的反应缓冲液。优选地，所述容器含有浓缩的反应缓冲液和环糊精。将这种储液稀释以制备扩增反应混合物和在其中进行核酸扩增的最终反应混合物。
在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒在同一容器中包含环糊精和至少一种引物。优选地，所述容器可以包含环糊精和在待扩增的靶核酸序列的5’和3’端与相对链杂交的至少两种或更多种引物。
在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒在同一容器中包含环糊精、仅当与双链DNA结合时发出荧光的dsDNA结合性荧光体。
在另一实施方案中，所述试剂盒在同一容器中包含与靶核酸杂交的标记的探针和环糊精。
本发明的试剂盒提供用于DNA和RNA二者的扩增。因此，本发明的试剂盒还可包含逆转录酶。将所述逆转录酶或RNA依赖性DNA聚合酶用于从RNA模板合成cDNA；之后扩增所得的cDNA。优选的逆转录酶包括Mu-MLV逆转录酶和AMV逆转录酶。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒提供用于等温扩增。所述试剂盒因此可包含解旋酶。
在本发明的试剂盒中，所述环糊精可以作为浓缩储液在单独的容器中提供或作为与其他组分或试剂的混合物提供。在一个优选的实施方案中，最终反应混合物中环糊精的终浓度优选包括0.1至50mM，更优选0.5至50mM，并且还更优选0.1、0.5、1、2、4、5mM至10、15、20、25、30、40和50mM。
根据本发明的试剂盒可以含有溶液或干固体形式的环糊精，所述干固体形式用于在水中或合适的缓冲液中重悬。环糊精可以作为与其他组分的预混物或浓缩储液提供。所述试剂盒也可包含用于制备具有合适浓度环糊精的扩增反应混合物的说明。环糊精可以直接添加至用于制备扩增反应混合物的其他试剂。或者，可以使用环糊精预处理反应组分之一，例如热稳定性DNA聚合酶、dNTP或寡核苷酸引物。在另一实施方案中，可以将环糊精添加至含有或疑似含有所述靶核酸的样品。
优选地，在扩增反应混合物中使用提供良好特异性、产率和灵敏度的适量的热稳定性DNA聚合酶。优选地，最终反应混合物中热稳定性DNA聚合酶的量包括0.01、0.02、0.03、0.04单位/μl至0.05、0.075、0.1和0.2单位/μl。
本发明的试剂盒上通常可以不包含核酸扩增所需的全部组分。一些组分如引物和样品可以由试剂盒的最终用户提供。
本发明的试剂盒也可包含内部阳性对照(IPC)。所述内部阳性对照包含引物和/或特异性探针和对照DNA模板。这种IPC也可以含有环糊精。
本发明还涉及试剂盒的用途，所述试剂盒包含环糊精和在同一容器或在别的容器中的至少一种用于核酸扩增的试剂。
附图说明
图1：测试Taq聚合酶+SA1(环糊精)
1：10ng gDNA，Taq R-POL-P01 1x+SA1 4mM；2：0ng gDNA，TaqR-POL-P01 1x+SA1 4mM；3：10ng gDNA，Taq R-POL-P01稀释10x+SA14mM；4：0ng gDNA，Taq R-POL-P01稀释10x+SA1 4mM；5：10ng gDNA，Taq R-POL-P01 1x+dH2O；6：0ng gDNA，Taq R-POL-P01 1x+dH2O；7：10nggDNA，Taq R-POL-P01稀释10x+dH2O；8：0ng gDNA，Taq R-POL-P01稀释10x+dH2O；9：10ng gDNA，GoldStar+SA14mM；10：0ng gDNA，GoldStar+SA1 4mM；11：10ng gDNA，GoldStar+dH2O；12：0ng gDNA，GoldStar+dH2O；L：用于小片段的Smart Ladder。
图2：用HLA-C引物测试Taq+SA1(环糊精)
L：Smart Ladder；1：2ng gDNA，TAQ，无SA1；2：NTC，TAQ，无SA1；3：2ng gDNA，TAQ+SA1 4mM终浓度；4：NTC，TAQ+SA1 4mM终浓度；
图3：Ignatov等中通过PCR扩增的HLA-C
图4：使用含SA1(环糊精)和SAR(环糊精)的Taq聚合酶制备物的测试
L.Smart Ladder
1.Taq R-Pol-P01与10ng gDNA；2.Taq R-Pol-P01与1ng gDNA；3.NTC与Taq R-Pol-P01；4.在9mM SA1存在下的Taq R-Pol-P01与10ng gDNA；5.在9mM SA1存在下的Taq R-Pol-P01与1ng gDNA；6.在9mM SA1存在下的NTC与Taq R-Pol-P01；7.在9mM SAR存在下的Taq R-Pol-P01与10ng gDNA；8.在9mM SAR存在下的Taq R-Pol-P01与1ng gDNA；9.在9mM SAR存在下的NTC与Taq R-Pol-P01；10.HotGoldStar与10ng gDNA；11.HotGoldStar与1ng gDNA；12.NTC与HotGoldStar
1.Taq R-Pol-P01与10ng gDNA；2.Taq R-Pol-P01与1ng gDNA；3.NTC与Taq R-Pol-P01；4.在9mM SA1存在下的Taq R-Pol-P01与10ng gDNA；5.在9mM SA1存在下的Taq R-Pol-P01与1ng gDNA；6.在9mM SA1存在下的NTC与Taq R-Pol-P01；7.在9mM SAR存在下的Taq R-Pol-P01与10ng gDNA；8.在9mM SAR存在下的Taq R-Pol-P01与1ng gDNA；9.在9mM SAR存在下的NTC与Taq R-Pol-P01；10HotGoldStar与10ng gDNA；11.HotGoldStar与1ng gDNA；12.NTC与HotGoldStar。
图5：在使用不同Taq聚合酶的PCR中测试SAR
L.Smart Ladder SF
1-7.Taq Pol R-Pol-P01与10ng gDNA，无SaR
2-8.Taq Pol R-Pol-P01与1ng gDNA，无SaR
3-9.NTC与Taq Pol R-Pol-P01，无S aR
4-10.Taq Pol R-Pol-P01与10ng gDNA，在9mM SaR存在下
5-11.Taq Pol R-Pol-P01与1ng gDNA，在9mM SaR存在下
6-12.NTC与Taq Pol R-Pol-P01，在9mM SaR存在下
13-19.EGT GoldStar与10ng gDNA，无SaR
14-20.EGT GoldStar与1ng gDNA，无SaR
15-21.NTC与EGT GoldStar，无SaR
16-22.EGT GoldStar与10ng gDNA，在9mM SaR存在下
17-23.EGT GoldStar与1ng gDNA，在9mM SaR存在下
18-24.NTC与EGT GoldStar，在9mM SaR存在下
图6：在使用不同Taq聚合酶的PCR中测试SAR
L.Smart Ladder SF
1-7.EGT HotGoldStar与10ng gDNA，无SaR
2-8.EGT HotGoldStar与1ng gDNA，无SaR
3-9.NTC与EGT HotGoldStar，无SaR
4-10.EGT HotGoldStar与10ng gDNA，在9mM SaR存在下
5-11.EGT HotGoldStar与1ng gDNA，在9mM SaR存在下
6-12.NTC与EGT HotGoldStar，在9mM SaR存在下
13-19.Roche FastStart与10ng gDNA，无SaR
14-20.Roche FastStart与1ng gDNA，无SaR
15-21.NTC与Roche FastStart，无SaR
16-22.Roche FastStart与10ng gDNA，在9mM SaR存在下
17-23.Roche FastStart与1ng gDNA，在9mM SaR存在下
18-24.NTC与Roche FastStart，在9mM SaR存在下
图7：测试：dNTP+SA1&缓冲液+SA1
A(未修饰的Taq R-POL-P07-GoldStar Cycling)
1.人gDNA 10ng-Numb
2.人gDNA 1ng-Numb
3.NTC-Numb
B.(未修饰的Taq R-POL-P07-HotGoldStar Cycling)
4.人gDNA 10ng-Numb
5.人gDNA 1ng-Numb
6.NTC-Numb
C.(dNTP+SA1 10mM于最终反应中-GoldStar Cycling)
1.人gDNA 10ng-Numb
2.人gDNA 1ng-Numb
3.NTC-Numb
D.(dNTP+SA1 10mM于最终反应中-HotGoldStar Cycling)
4.人gDNA 10ng-Numb
5.人gDNA 1ng-Numb
6.NTC-Numb
E.(缓冲液反应物+SA1 10mM最终-GoldStar Cycling)
1.人gDNA 10ng-Numb
2.人gDNA 1ng-Numb
3.NTC-Numb
F.(缓冲液反应物+SA1 10mM最终-HotGoldStar Cycling)
4.人gDNA 10ng-Numb
5.人gDNA 1ng-Numb
6.NTC-Numb
G.(HotGoldStar-GoldStar Cycling)
1.人gDNA 10ng-Numb
2.人gDNA 1ng-Numb
3.NTC-Numb
H.(HotGoldStar-HotGoldStar Cycling)
4.人gDNA 10ng-Numb
5.人gDNA 1ng-Numb
6.NTC-Numb
图8：测试：dNTP+SA1&缓冲液+SA1
A(未修饰的Taq R-POL-P07-GoldStar Cycling)
1.人gDNA 10ng-tPA1
2.人gDNA 1ng-tPA1
3.NTC-tPA1
B.(未修饰的R-POL-P07-HotGoldStar Cycling)
4.人gDNA 10ng-tPA1
5.人gDNA 1ng-tPA1
6.NTC-tPA1
C.(dNTP+SA1 10mM于最终反应中-GoldStar Cycling)
1.人gDNA 10ng-tPA1
2.人gDNA 1ng-tPA1
3.NTC-tPA1
D.(dNTP+SA1 10mM于最终反应中-HotGoldStar Cycling)
4.人gDNA 10ng-tPA1
5.人gDNA 1ng-tPA1
6.NTC-tPA1
E.(缓冲液反应物+SA1 10mM最终-GoldStar Cycling)
1.人gDNA 10ng-tPA1
2.人gDNA 1ng-tPA1
3.NTC-tPA1
F.(缓冲液反应物+SA1 10mM最终-HotGoldStar Cycling)
4.人gDNA 10ng-tPA1
5.人gDNA 1ng-tPA1
6.NTC-tPA1
G.(HotGoldStar-GoldStar Cycling)
1.人gDNA 10ng-tPA1
2.人gDNA 1ng-tPA1
3.NTC-tPA1
H.(HotGoldStar-HotGoldStar Cycling)
4.人gDNA 10ng-tPA1
5.人gDNA 1ng-tPA1
6.NTC-tPA1
图9：无初始加热步骤的PCR：使用Taq PO8，Taq PO8+6mM环糊精和Hot GoldStar的扩增
实施例
实施例1：基因、引物和特异性PCR产物
1.NUMB
引物序列：Numb
引物FWD：gag gtt cct aca ggc acc tgc cca g
引物REV：caa aat cac ccc tca cag tac tct g
这些引物的所述三个碱基能够杂交在一起并在低温下得到引物二聚体。
NCBI参考：
所述靶在NCBI数据库中标识为NT_026437.11(序列位置：54742877至54743182)。
扩增子长度：306bp
2.HLA-C
HLA-C和PCR片段记载于“K.B.Ignatov，A.I.Miroshnikov，V.M.Kramarov，Russian Journal of Bioorganic Chemistty，2003，vol.29(4)，368-371.”
引物序列：HLA-C
引物3：gca agg att aca tcg ccc tga acg ag
引物4：cat cat agc ggt gac cac agc tcc aa
难以扩增的模板和非常长的PCR产物
NCBI参考：
所述靶在NCBI数据库中标识为NT_07592.14。
扩增子长度：
1230bp
3.t-PA1
引物序列：t-PA1
引物FWD：aga cag tac agc cag cct ca
引物REV1：gac ttc aaa ttt ctg ctc ctc
在PCR过程中，在一些条件下，这些引物能够产生引物二聚体的形成。
NCBI参考：
所述靶在NCBI数据库中标识为NT_007995.14。
扩增子长度：374bp
实施例2：测试Taq聚合酶+SA1(环糊精)
gDNA：人基因组DNA，Roche
引物：Numb；扩增子＝306bp
GoldStar+来自Eurogentec的试剂盒Ref：ME-0064-05(5U/μl)
Taq聚合酶：R-POL-P01(自制Taq)
2X储存缓冲液：
-Tris 40mM；pH 8
-EDTA 0.2mM
-KCl 0.2M
-DTT 2mM
-Nonidet P40 1％(v/v)
-Tween-20 1％
环糊精：SA1
C45H78N2O34+2HCl：单丙二胺-β-环糊精*或6′-(3-氨基-丙基氨基)-6′-脱氧-环麦芽七糖(Chlorohydrated形式)。
1.DNA制备物
gDNA制备物
  样品   储液浓度[ng/μl]   稀释成具有10ng/μl的工作浓度
  人gDNA   200   1μl gDNA储液+19μl H2O PCR级
对于测试，加入1μl/25μl的反应
对于NTC(阴性对照)，加入1μl的H2O PCR级/25μl的反应
2.聚合酶制备物
·Taq R-POL-P01+SA1
a.不稀释的Taq
30μl Taq+30μl SA1 200mM
在4℃振荡并温育1小时
b.10x稀释的Taq
3μl Taq+27μl储存缓冲液2X+30μl SA1 200mM
在4℃振荡并温育1小时
·单独的Taq R-POL-P01
c.不稀释的Taq
5μl Taq+5μl H2O
d.10x稀释的Taq
1μl Taq+9μl储存缓冲液2X+10μl H2O
·GoldStar(5U/μl)+SA1
1.25μl GoldStar+3.75μl储存缓冲液2X+5μl SA1 200mM
在4℃振荡并温育1小时
0.625U/μl
·单独的GoldStar(5U/μl)
1.25μl GoldStar+3.75μl储存缓冲液2X+5μl H2O
0.625U/μl
对于测试和NTC，加入1μl的酶/25μl反应
3.Mastermix制备物
  组分   样品  在25μl中的终浓度
 10x反应缓冲液   77.5μl   1x
 dNTP 5mM   31μl   200μM
 引物F 25μM   6.2μl   200nM
 引物R 25μM   6.2μl   200nM
 MgCl2 25mM   62μl   2mM
 gDNA   (31μl)   10ng/孔
 聚合酶   (31μl)
  H2O   530.1μl
  终体积   775μl
加入23μl的Mastermix/25μl反应
4.加热条件
热循环仪条件
95℃10分钟
35个循环：95℃10秒
60℃5秒
72℃30秒
72℃5分钟
4℃∞
将15μl上样到凝胶上(3μl的蓝色染料+12μl的模板)
5.结果
对Taq聚合酶+SA1的测试结果示于图1。
6.结论
使用Taq聚合酶(1x)和SA1，从Numb基因扩增了特异性产物但也形成了引物二聚体。
使用不含SA1的Taq聚合酶(1x)，未从Numb扩增特异性产物但扩增了引物二聚体。
使用Taq聚合酶(稀释10x)和SA1，从Numb扩增了特异性产物但未形成引物二聚体。
使用不含SA1的Taq聚合酶(稀释10x)，仅扩增了引物二聚体。
使用GoldStar+SA1，从Numb基因扩增了特异性产物且未形成引物二聚体。
使用不含SA1的GoldStar，扩增了引物二聚体。
对这些结果的一种解释：当将Taq聚合酶稀释1x时，与SA1相比TAQ是过量的。当将Taq聚合酶稀释10x时，SA1能够与所有Taq聚合酶分子相互作用，并且其效果遍及整个反应。
SA1增加PCR反应的特异性并减少引物二聚体的形成。
实施例3：使用HLA-C引物测试Taq+SA1(环糊精)
1.材料
酶：自制taq：Taq R-POL-P01
引物HLA-C_P3和P4：更难以扩增的模板和长片段
环糊精：SA1
C45H78N2O34+2HCl单丙二胺-β-环糊精/6′-(3-氨基-丙基氨基)-6′-脱氧-环麦芽七糖(Chlorohydrated形式)
2.Taq聚合酶制备物
在Mastermix之前直接制备Taq对照
  Taq R-POL-P01   H2O PCR级   储存缓冲液2x
  1μl   10μl   9μl
Figure BDA0000082906210000241
1μl/25μl的反应
Taq+SA1
在4℃振荡并温育1小时
  Taq R-POL-P01   SA1 200mM   储存缓冲液2x
  1μl   10μl   9μl
Figure BDA0000082906210000242
1μl/25μl的反应
3.DNA制备物
gDNA制备物
  样品   储液浓度[ng/μl]   稀释成具有1ng/μl的工作浓度
  人gDNA   200   1μl gDNA储液+199μl H2O PCR级
对于测试，加入2μl/25μl的反应
对于NTC，加入2μl的H2O PCR级/25μl的反应
4.Mastermix制备物
对照-Taq+最终4mM的SA1
 组分  体积(μl)   终浓度
 gDNA  (16)   2ng/反应
 10x反应缓冲液  20   1x
 dNTP 5mM  8   200μM
 Taq R-POL-P01  (8)
 MgCl2 25mM  16   2mM
 引物HLA-C_P3 10μM  8   400nM
 引物HLA-C_P4 10μM  8   400nM
 H2O PCR级  116
 终体积  200
加入22μl/25μl的反应
5.循环
95℃3分钟
35个循环：94℃30秒
58℃30秒
72℃100秒
72℃5分钟
4℃∞
6.结果
PCR结果示于图2。
用Aida的定量示于下文。
Figure BDA0000082906210000251
7.结论
使用未修饰的Taq聚合酶的PCR反应显示来自HLA-C的特异性片段但是也形成了引物二聚体和非特异性产物。
另一方面，Taq-环糊精制备物增加对特异性PCR片段的扩增并强烈减少非特异性产物(无引物二聚体)。
使用这两种引物扩增HLA-C已经由Ignatov K.B.等，Russian Journal ofBioorganic Chemistry，29(4)，2003，368-371”(参见图3)描述。
使用Hot-start方法(参见第2点)。
在凝胶上始终可见非特异性片段。
实施例4：使用具有SA1(环糊精)和SAR(环糊精)的Taq聚合酶制备物 的测试
使用引物Numb和HLA-C的PCR
1.目的
使用以PCR中9mM终浓度的SA1和SAR制备的Taq的比较测试。
2.材料
酶：Taq R-Pol-P01(自制)和HotGoldStar(Eurogentec Ref.ME-0073-05)
环糊精：
SA1：6-(3-氨基-丙基氨基)-6-脱氧-环麦芽七糖/单丙二胺-β-环糊精，MW：1264.02g/mol
SAR：6-O-α-D-麦芽糖基-β-环糊精，MW：1459.27g/mol，
引物：Numb，扩增子＝306bp
HLA-C，扩增子＝1230bp
3.Taq和SA1制备物
对照
  Taq R-POL-P01   储存缓冲液2x
  2μl   18μl
SA1
SA1250mM：将SA1储液500mM用H2O稀释2x并储存在-20℃。将这种SA1储液500mM重悬在2x储存缓冲液。
→混合9μl H2O PCR级+9μl SA1 500mM并加入2μl EGT Taq Pol。
Figure BDA0000082906210000261
将SA1+Taq聚合酶振荡并在4℃温育15分钟。加入1μl/25μl PCR反应物。
SAR
SAR 250mM：称取0.0408g SAR，加入56μl 2x储存缓冲液并涡旋振荡以获得500mM的终浓度→SAR在所述溶液中未溶解。
再次加入56μl 2x储存缓冲液并涡旋振荡→SAR完全溶解，终浓度为250mM。
将SAR+Taq聚合酶振荡并在4℃温育15分钟。加入1μl/25μl PCR反应物。
4.gDNA制备物
  样品   储液浓度[ng/μl]  稀释成具有5ng/μl的工作浓度
  人gDNA   200  2μl gDNA储液+78μl H2O PCR级
  样品   储液浓度[ng/μl]   稀释成具有0.5ng/μl的工作浓度
  人gDNA   5   6μl gDNA储液+54μl H2O PCR级
对于测试，加入2μl/25μl反应。
对于NTC，加入2μl H2O PCR级/25μl反应。
5.MasterMix制备物
在室温制备(x 8)
Figure BDA0000082906210000272
Figure BDA0000082906210000281
每孔加入23μl Mastermix
使用引物Numb和HLA-C的条件：
-含EGT Taq Pol的MasterMix，
-含EGT Taq Pol的MasterMix，在SA1存在下(1∶1混合)
-含EGT Taq Pol的MasterMix，在SAR存在下(1∶1混合)
-含Hot GoldStar的MasterMix
6.热循环仪条件(对于HotGoldStar)
95℃10分钟
35个循环：95℃10秒
60℃10秒
72℃30秒
72℃5分钟
4℃∞
7.结果
所述PCR反应的结果示于图4。
在1％琼脂糖凝胶上进行QC。
用Aida的定量示于下文
Figure BDA0000082906210000282
Figure BDA0000082906210000291
8.结论
在HotStar循环条件中，用于Taq聚合酶制备物的这两种不同的环糊精对PCR结果产生了相同的积极效果：更具特异性的反应和更高产率。
实施例5：在使用不同Taq聚合酶的PCR中测试SAR
1.目的
在PCR反应中以9mM终浓度存在或不存在SAR(环糊精)时测试下述聚合酶：HotGoldStar、GoldStar、Taq聚合酶R-Pol-P01和FastStart Taq DNA聚合酶(来自Roche)。
2.材料
酶：Taq聚合酶R-Pol-P01(自制)
来自Eurogentec的5U/μl的HotGoldStar(参考编号：ME-0073-05)
来自Eurogentec的5U/μl的GoldStar(参考编号：ME-0064-05)
来自Roche的5U/μl的FastStart Taq DNA聚合酶(参考编号：12032902001)
10x反应缓冲液，与Taq POL R-Pol-P01和GoldStar一起使用：
750mM Tris/HCl pH 8.8(在25℃)，200mM(NH4)2SO4，0.1％tween-20
10x反应缓冲液，与HotGoldStar一起使用：
150mM Tris/HCl pH 8(在25℃)，500mM KCl，0.1％tween-20
10x PCR反应缓冲液(来自Roche)，与FastStart一起使用：
500mM Tris/HCl，100mM KCl，50mM(NH4)2SO4，pH 8.3(在25℃)
SAR：6-O-α-D-麦芽糖基-β-环糊精，MW：1459.27g/mol
引物：Numb，扩增子＝306bp
3.Taq聚合酶和SAR制备物
对照(无SAR的Taq聚合酶)
  Taq聚合酶   储存缓冲液2x
  2μl EGT Taq Pol.   18μl
  2μl HotGoldStar   18μl
  2μl GoldStar   18μl
  2μl FastStart DNA Pol.(Roche)   18μl
含SAR的Taq聚合酶
250mM的SAR储液
  Taq聚合酶   储存缓冲液2x中的SAR
  2μl EGT Taq Pol.   18μl储存缓冲液2x中的SAR，250mM
  2μl HotGoldStar   18μl储存缓冲液2x中的SAR，200mM
  2μl GoldStar   18μl储存缓冲液2x中的SAR，200mM
  2μl FastStart DNA Pol.(Roche)   18μl储存缓冲液2x中的SAR，200mM
将SAR+Taq聚合酶振荡并在4℃温育15分钟
4.gDNA制备物
  样品   储液浓度[ng/μl]  稀释成具有5ng/μl的工作浓度
  人gDNA   200  2μl gDNA储液+78μl H2O PCR级
  样品   储液浓度[ng/μl]  稀释成具有0.5ng/μl的工作浓度
  人gDNA   5  6μl gDNA储液+54μl H2O PCR级
对于测试，加入2μl/25μl反应物
对于NTC，加入2μl的H2O PCR级/25μl反应物
5.MasterMix制备物
在RT制备(x 8)
Figure BDA0000082906210000311
每孔加入23μl Mastermix
使用引物Numb和HLA-C的条件：
-含EGT Taq Pol不含SAR的MasterMix
-含EGT Taq Pol含SAR的MasterMix
-含GoldStar不含SAR的MasterMix
-含GoldStar含SAR的MasterMix
-含HotGoldStar不含SAR的MasterMix
-含HotGoldStar含SAR的MasterMix
-含fastStart Taq DNA聚合酶不含SAR的MasterMix
-含fastStart Taq DNA聚合酶含SAR的MasterMix
6.热循环仪条件
循环A-
95℃10分钟
35个循环：95℃10秒
60℃10秒
72℃30秒
72℃5分钟
4℃∞
循环B-
95℃3分钟
35个循环：95℃10秒
60℃10秒
72℃30秒
72℃5分钟
4℃∞
7.结果
在1％琼脂糖凝胶上进行QC(质量控制)。
使用Numb引物扩增(扩增子大小＝306bp)
参见结果图5和图6
使用Aida的定量示于下文
Figure BDA0000082906210000321
Figure BDA0000082906210000331
使用Aida的定量示于下文
Figure BDA0000082906210000332
Figure BDA0000082906210000341
8.结论
测试的4种含有环糊精SAR的Taq聚合酶制备物在PCR反应中得到了非常好的结果。
来自Eurogentec的Taq聚合酶R-pol-P01和GoldStar：
-在SAR存在下，所述两种Taq从Numb扩增了特异性PCR片段。
-能够观察到在使用SAR时引物二聚体消失。
-使用循环B(95℃3min)比循环A(95℃10min)时特异性条带更强。
来自Eurogentec的HotGoldStar：
-酶未被循环B(95℃3分钟)激活
-使用循环A(95℃10分钟)，在SaR存在下条带更强。
-在SaR存在下获得较少的引物二聚体
Roehe FastStart：
-使用循环A和B，在SaR存在下条带更强。
-在SaR存在下获得了较少的引物二聚体
实施例6：测试：dNTP+SA1&缓冲液+SA1
实验目的：测试在PCR反应中向dNTP或向缓冲液加入SA1并使用未修饰的Taq(不含SA1的Taq聚合酶)。
1.Master mix制备物
酶：
自制Taq(R-POL-P07)
来自Eurogentec的HotGoldStar(参考编号：ME-0073-05)
环糊精：SA1
C45H78N2O34+2HCl单丙二胺-β-环糊精/6′-(3-氨基-丙基氨基)-6′-脱氧-环麦芽七糖(Chlorohydrated形式)
待测试的DNA：人gDNA
引物：NUMB和tPA1
对于Taq R-POL-P07、HotGoldStar Taq在RT(x 8)制备
每孔加入23μl Mastermix
对于Taq EGT1+含SA1的dNTP在RT(x 8)制备
Figure BDA0000082906210000352
Figure BDA0000082906210000361
每孔加入23μl Mastermix
对于SA1直接在缓冲液中在RT(x 8)制备
Figure BDA0000082906210000362
每孔加入23μl Mastermix
2.不含SA1的Taq
SA1：500mM，新鲜制备的。
569μl水中0.3602克的SA1。
对照为未修饰的Taq
  Taq R-POL-P07   储存缓冲液2x   甘油
  3μl   117μl   120μl
含SA1的dNTP制备物
  dNTP   SA1 0.25M水溶液   dNTP中的SA1浓度
  100μl   100μl   0.125M
将dNTP与SA1在4℃温育1小时
3.gDNA制备物
  样品   储液浓度[ng/μl]   稀释成具有5ng/μl的工作浓度
  人gDNA   200   2μl gDNA储液+78μl H2O PCR级
  样品   储液浓度[ng/μl]   稀释成具有0.5ng/μl的工作浓度
  人gDNA   5   6μl gDNA储液+54μl H2O PCR级
4.热循环仪条件(GenAmp PCR System 9700)
GoldStar循环
95℃3分钟(或对于HotGoldStar循环95℃10分钟)
35个循环：95℃10秒
60℃20秒
72℃30秒
72℃10分钟
4℃∞
ABI 9700
5.结果
结果：琼脂糖凝胶电泳1％(参见图7和8)
使用Aida的定量示于下文
Figure BDA0000082906210000382
Figure BDA0000082906210000391
6.结论
●在dNTP中存在SA1时(在最终反应中为10mM)，观察到了对Numb的良好扩增和极少量引物二聚体(使用未经修饰的Taq R-POL-P07，在dNTP中不含SA1，扩增不佳且有大量引物二聚体)。
●在反应缓冲液中存在SA1时(在最终反应中为10mM)，观察到了对Numb的良好扩增，但与使用SA1-dNTP制备物获得的结果相比引物二聚体稍多。
●使用HotGoldStar(在HotGoldStar循环中)，观察到对Numb和tPA1的良好扩增。
●关于t-PA1扩增，当在dNTP或反应缓冲液中加入SA1时没有引物二聚体。
向dNTP加入环糊精或者甚至直接向PCR缓冲液加入环糊精，改善了该PCR反应的效率，特异性片段得到扩增并且没有引物二聚体的形成(或者比不用环糊精时获得的少得多)。
实施例7：无初始加热步骤的PCR反应
目的：使用TAQ聚合酶、TAQ+SA13和HotGoldStar DNA聚合酶进行没有95℃的初始加热步骤的PCR反应。
材料：
酶：
-自制taq：TaqR-Pol-P08
-5U/μl的HotGoldStar(Eurogentec，参考编号：ME-0073-01)
SA13：羟丙基-β-环糊精
引物：Numb，扩增子＝306bp
18S，扩增子＝121bp
t-PA1，扩增子＝374bp
Taq P08制备物：
Taq P08储液稀释20x至储存缓冲液中。
  溶液   Taq R-POL-P08稀释20x   含SA的储存缓冲液2x
  无SA   2.5μl   25μl储存缓冲液2x
  SA136mM终浓度   2.5μl   (300mM的SA13)25μl
○将SA+Taq聚合酶振荡并在4℃温育1小时。
○每25μl的PCR反应物加入1μl的酶
gDNA制备物：
Mastermix制备物：
在RT制备
Figure BDA0000082906210000402
加入23μl/25μl反应物
循环：
PCR直接以循环开始(无激活步骤)：
35个循环：95℃10秒
60℃10秒
72℃30秒
72℃5分钟
4℃∞
对于Taq P08没有95℃3分钟的初始激活步骤，并且
对于HotGodStar没有95℃10分钟的初始激活步骤
结论
HotGoldStar Taq聚合酶在PCR循环之前需要95℃的激活步骤。没有这步激活步骤，使用HotGoldStar对特定基因没有扩增。
即使去掉初始加热步骤，使用未修饰的TAQ聚合酶并使用TAQ-环糊精制备物观察到了对特定基因的扩增。向TAQ聚合酶加入环糊精，改善了该PCR反应的效率和灵敏度，特异性片段得到扩增并且与不用环糊精所获得的相比引物二聚体少得多。
参考文献
K.B.Ignatov，等，Russian Journal of Bioorganic Chemistry，2003，vol.29(4)，368-371
专利文献
EP 0 592 035
EP 0 771 870
EP 0 96 2526
WO91/02040
WO00/37674
EP 0 762 898
WO 95/32739
US 5,705,345
WO2006/119419
Figure IDA0000082906270000011
Figure IDA0000082906270000021

Claims (16)

1.一种用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其特征在于所述扩增反应在包含至少一种环糊精的反应混合物中进行。
2.根据权利要求1的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤：
a)将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有至少一种环糊精的扩增反应混合物接触；
b)对步骤a)中获得的反应混合物进行扩增反应。
3.根据权利要求1的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤：
a)将环糊精与至少一种选自热稳定性DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP和引物的组分接触；
b)将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有至少一种来自步骤a)的组分的扩增反应混合物接触；
c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增反应。
4.根据权利要求1的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤：
a)将所述样品与环糊精接触以获得样品和环糊精的混合物；
b)将所述样品和环糊精的混合物与扩增反应混合物接触；
c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增反应。
5.根据权利要求1的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤：
a)将所述样品与扩增反应混合物接触；
b)加入至少一种环糊精；
c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增反应。
6.根据权利要求1-5中任一项的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其中包含在所述反应混合物中的环糊精的浓度为0.1-50mM。
7.根据权利要求1-6中任一项的用于改进样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其中所述反应混合物包含0.01-0.2单位/μl的热稳定性DNA聚合酶。
8.根据权利要求1-7中任一项的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其中所述反应混合物至少包含样品、环糊精、热稳定性DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP和至少一种引物。
9.根据权利要求1-8中任一项的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其中所述环糊精选自下组：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精和它们的衍生物。
10.根据权利要求1-9中任一项的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其中所述环糊精选自下组：单丙二胺-β-环糊精(monopropanediamino-β-cyclodextrin)、6-O-α-D-麦芽糖基-β环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精和2-羟丙基-β-环糊精。
11.一种用于改进由DNA聚合酶催化的核酸体外合成的特异性和/或产率的方法，包括将单链核酸与DNA合成反应混合物接触，所述DNA合成反应混合物包含DNA聚合酶、引物、dNTP和至少一种环糊精。
12.根据权利要求11的用于改进由DNA聚合酶催化的核酸体外合成的特异性和/或产率的方法，包括使所述引物退火至所述单链核酸并在所述引物的3’端掺入互补的dNTP。
13.根据权利要求9-12中任一项的用于改进由DNA聚合酶催化的核酸体外合成的特异性和/或产率的方法，其中包含在最终反应混合物中环糊精的浓度为0.1-50mM，所述最终反应混合物包含单链核酸和所述DNA合成反应混合物。
14.一种用于扩增样品中靶核酸的试剂盒，其在同一容器中包含至少一种环糊精和至少一种选自下组的组分：热稳定性DNA聚合酶、用于核酸扩增的反应缓冲液、dNTP和寡核苷酸引物。
15.根据权利要求14的用于扩增样品中靶核酸的试剂盒，其在同一容器中或另外的容器中还包含逆转录酶。
16.一种用于扩增样品中靶核酸的组合物，其包含环糊精、热稳定性DNA聚合酶和储存缓冲液。
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