CN102414315A - 用于分子生物学应用的包含核酸聚合酶的干燥和稳定的即用组合物 - Google Patents

用于分子生物学应用的包含核酸聚合酶的干燥和稳定的即用组合物 Download PDF

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CN102414315A CN2010800195495A CN201080019549A CN102414315A CN 102414315 A CN102414315 A CN 102414315A CN 2010800195495 A CN2010800195495 A CN 2010800195495A CN 201080019549 A CN201080019549 A CN 201080019549A CN 102414315 A CN102414315 A CN 102414315A
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Abstract

本发明涉及包含核酸聚合酶和纤维二糖的干燥或冻干的组合物，其中所述酶甚至在高达55℃的温度下稳定一段时间。本发明的组合物还可以包含另外的试剂例如盐、对样品中存在的模板DNA具有特异性的引物、探针等和可能的其他稳定化合物。本发明涉及一种可以在容器中制备包含核酸聚合酶和纤维二糖的干燥或冻干的组合物的方法，其中酶被冻干并在加入样品之后即用于分子生物学应用。

Description

用于分子生物学应用的包含核酸聚合酶的干燥和稳定的即用组合物
发明领域
本发明涉及核酸聚合酶的稳定化，且涉及还可用于诊断的目的的包含这样的聚合酶稳定剂的即用反应组合物和试剂盒的制备。
现有技术
核酸的体内和体外合成通过链的准确复制来控制，其中每一个单一核酸链确定完全互补的链中的核苷酸的顺序。DNA复制的具体机制必须通过称为聚合酶的酶家族使用，且通过聚合酶来进行。
从各种有机体纯化的聚合酶通常用于研究和诊断，特别是随着基因扩增的各种系统例如聚合酶链反应的出现(PCR-Mullis等人，美国专利第4,683,195号；第4,683,202号；和第4,800,159号)。
PCR的基本配置由两种合成引物、核酸模板和聚合酶组成。每一种引物与靶核酸中的区互补，或更好是与两个互补的链中的一个互补。
聚合酶明显地是扩增系统的关键性部分，这是由于聚合酶以3’方向按顺序地加入核苷酸，将它们键合至能够通过氢键与模板链结合的靶特异性多核苷酸引物的羟基的能力。
标准扩增混合物可以具有以下组成：dNTP、缓冲液、MgCl2、正向引物、反向引物、Taq聚合酶、DNA和H2O。
反应混合物必须被加热至90-95℃，以使模板DNA的双螺旋变性。在变性步骤之后，将温度降低至50-60℃，以使得引物与互补链退火；聚合酶通过在通常被称为延伸(extension)的步骤中延长所述引物来完成该过程。
PCR反应中使用的酶已经从嗜热生物分离，且因此在高温下是稳定的。然而，即使这些高热稳定的酶也可能由于化学剂、蛋白酶或环境变化而失活。
使用热稳定的酶，如同其他酶一样，常常需要伴随使用变性条件例如高温如对于PCR的情况、具有次优浓度的辅因子和底物的含水混合物和最大酶活性的非最佳的pH。
该情况表明，酶的稳定化是强烈所需的且对于酶的长期保存来说是必需的，尤其是如果连同其他试剂和用于扩增核酸的即用反应混合物一起被包括在含水混合物中。
许多用于稳定聚合酶的技术是已知的且已经被描述在专利和申请中。所述技术包括酶的化学改性、在固相支持体上的固定、适体的使用、酶的基因工程和稳定剂的加入。
已经证明稳定活性的一组物质是表面活性剂，表面活性剂在酶的活性形式和包含它们的水环境之间的界面处起作用。
分子生物学技术中使用的稳定酶的常用方法是通过将每一种酶的液体制剂储存在-20℃下的包含50％甘油和还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇的溶液中。该程序足以保存酶的活性达几个月，且活性损失最小。相比之下，当储存在室温或在+4℃下时，酶活性迅速地损失。
非离子型洗涤剂例如Triton X-100和Tween 20已经被表明稳定DNA聚合酶活性。专利申请EP 776,970A1描述了包括Tween和
Figure BDA0000104780450000022
的非离子型洗涤剂稳定热稳定的DNA聚合酶的活性的用途。已表明低浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)稳定酶活性。
使酶能够容忍长时间暴露于室温或简短暴露于较高温度的保存酶的方法，仍然是对于邮政托运的更容易的和更成本有效的管理和新领域中的利用的唯一的现实限制。酶且尤其是聚合酶，包括衍生自嗜热生物的聚合酶，即通常用于聚合酶链反应(PCR)的聚合酶，至今已经在低于+2-8℃且通常在-20℃的温度下被运输。
在用于保存生物材料的方法中，冷冻干燥至今已经用于保存食品、细胞、生物膜、生物大分子，且甚至是酶。
冷冻干燥方法包括从被冻结的样品除去水，即，在低于室内压力条件下不经过液态蒸发固体的含水组分。
蛋白制剂在被干燥之前通常被冻结以减少由于干燥引起的结构变形。
不完全干燥的冷冻干燥，即还包含低百分比的水的冷冻干燥，比完全干燥的冷冻干燥似乎确保更好的保存，尤其是如果随后在不高于+4-10℃的温度下保存时。然而，甚至在这些条件下，存在少量的酶活性损失。
然而，一些酶例如聚合酶在没有冷冻保护剂下冷冻干燥之后完全失活，与冷冻干燥的类型(干燥或以其他方式)无关。
许多具有冷冻防护活性的物质或添加剂已经用于或被建议用于稳定聚合酶。例如，US 5,614,387和US 5,834,254描述了用于制备用来扩增核酸的稳定的冻干酶组合物的方法和组合物，其中海藻糖和/或聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)用作防冻剂。
已知技术的分析和目前出售的产品表明，保存聚合酶的问题和简化聚合链反应混合物的制备(和因此甚至在实验室环境中PCR反应的标准化)的潜力是时下非常关注的和在连续的开发中。
市售的被称为puRe Taq Ready-To-Go PCR Beads(GE Healthcare)的系统由用于标准PCR扩增的单一剂量的预混合冻干制剂组成。然而，该系统具有用被描述为先导酶(leading enzyme)的特异性Taq聚合酶(puRe Taq聚合酶)来制备的由于其稳定性和纯度的限制。相反，本发明的所建议的方法可以与所有的聚合酶一起使用，因为纤维二糖能够稳定和保护所有的Taq聚合酶，不管是简单的聚合酶还是热启动聚合酶(Hot Start Polymerase)或甚至它们的活性片段例如Klenow。
概述
本发明涉及适合于用适当的溶剂稀释的干燥或冻干的组合物，该组合物包含被稳定为经得起冷冻干燥和在高达55℃的温度下储存的核酸聚合酶，其特征在于，所述组合物具有在0.01至250单位(0,4-10000U/ml)范围内的核酸聚合酶浓度、在50mM(17,115g/L)至500mM(171,15g/L)范围内的浓度的纤维二糖和缓冲液。所述核酸聚合酶是优选地选自由以下组成的组的DNA聚合酶：Taq聚合酶、热启动聚合酶或它们的活性片段。所述组合物还被称为“冻干和即用的扩增混合物”或“Universal Master Mix”。
本发明的另外的方面涉及适合于用适当的溶剂稀释的组合物，该组合物包含被稳定为经得起冷冻干燥和在高达55℃的温度下储存的核酸聚合酶，其特征在于，所述组合物具有在0.01至250单位范围内的核酸聚合酶浓度、在50至500mM范围内的浓度的纤维二糖、缓冲液、dNTP、KCl和MgCl2。
本发明还涉及组合物用于核酸的扩增尤其是用于分子生物学应用的用途，分子生物学应用例如但不限于，PCR、实时PCR、熔解曲线分析、高分辨率熔解曲线分析、测序、定量荧光PCR、多重PCR、全基因组扩增、等温扩增。
本发明还另外涉及用于核酸的扩增的方法，该方法包括以下步骤：
i.在水中或在缓冲液中重构本发明的组合物；
ii加入靶DNA特异性引物；
iii.加入核酸模板；
iv任选地加入选自由以下组成的组的试剂中的一种或多种：KCl、MgCl2、dNTP、至少一种任选地被标记的探针、还原剂和另外的稳定剂。
本发明还提供即用产品，该产品包含根据本发明的干燥或冻干的组合物和用于重构所述组合物的溶剂。
此外，本发明包括用于DNA样品的PCR扩增的试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的组合物和任选的关于聚合酶链反应中的酶的重构和使用的说明书。
本发明的特别优选的实施方式由纤维二糖用于在冷冻干燥和在高达55℃的温度下长期储存期间保存核酸聚合酶的用途组成。
附图描述
图1.在完成冷冻干燥过程之后立即进行的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1-6：用来自公司X的热启动聚合酶制备的冻干和即用的组合物扩增的PCR产物；在冷冻干燥之前的体积：25μl(泳道1-3)或9.1μl(泳道4-6)。泳道7-12：用公司Y的热启动DNA聚合酶制备的冻干和即用混合物获得的扩增产物；在冷冻干燥之前的体积：25μl(泳道7-9)或7.5μl(泳道10-12)。泳道13-15：用获自公司X的聚合酶制备的冻干和即用的扩增混合物获得的PCR产物；在冷冻干燥之前的体积：25μl。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫(Plasmodium spp)18s RNA基因的片段。
图2.在室温下或在37℃下保存三个星期之后的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1-8：用包含公司X的热启动DNA聚合酶的扩增混合物获得的扩增产物；在冷冻干燥之前的体积：25μl(泳道1-4)或9.1μl(泳道5-8)。泳道9-12：用包含公司X的DNA聚合酶的冻干和即用的反应混合物获得的扩增产物；在冷冻干燥之前的体积：25μl。在室温下(泳道1-3、5-7、9-11)或在37℃下(泳道4、8、12)保存三个星期。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
图3.在完成冷冻干燥过程之后立即进行的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。冻干和即用的混合物包含：(i)公司W的反应缓冲液(泳道1-4)、公司X的反应缓冲液(泳道5-8)、公司R的反应缓冲液(泳道9-12)或公司Y的反应缓冲液(泳道13-19)；(ii)获自公司W的热启动DNA聚合酶(泳道1、5、9和13)、获自公司Y的热启动DNA聚合酶(泳道2、6、10、14、17、18和19)、获自公司X的热启动DNA聚合酶(泳道3、7、11和15)或获自公司R的热启动DNA聚合酶(泳道4、8、12和16)。泳道17、18和19的扩增产物用还分别包含0.25％NP-40和0.25％Tween-20、100mM蔗糖和0.25％NP-40、0.25％Tween-20和100mM蔗糖的冻干和即用的混合物获得。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
图4.在室温下保存六个星期之后的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。冻干和即用的混合物分别包含：(i)公司W的反应缓冲液(泳道1-4)、公司X的反应缓冲液(泳道5-8)、公司R的反应缓冲液(泳道9-12)或公司Y的反应缓冲液(泳道13-19)；(ii)获自公司W的热启动DNA聚合酶(泳道1、5、9和13)、获自公司Y的热启动DNA聚合酶(泳道2、6、10、14、17、18和19)、获自公司X的热启动DNA聚合酶(泳道3、7、11和15)或获自公司R的热启动DNA聚合酶(泳道4、8、12和16)。泳道17、18和19的扩增产物用还分别包含0.25％NP-40和0.25％Tween-20、100mM蔗糖和0.25％NP-40、0.25％Tween-20和100mM蔗糖的冻干和即用的混合物获得。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
图5.在完成冷冻干燥过程之后立即进行的包含250mM蔗糖的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。冻干和即用的混合物包含：(i)公司X的反应缓冲液(泳道1、8和9)、公司W的反应缓冲液(泳道2、3、14-17)、公司R的反应缓冲液(泳道4、5、10-13)或公司Y的反应缓冲液(泳道6、7、18-21)；(ii)获自公司X的热启动DNA聚合酶(泳道1-7)或获自公司R的热启动DNA聚合酶(泳道8-21)。在泳道1、2、4、6、8、10、14和18中使用的冻干和即用的混合物中，没有加入物质；在泳道3、5、7、11、15和19的冻干和即用的混合物中，将250mM蔗糖加入反应缓冲液；在泳道9、12、16和20的冻干和即用的混合物中，将250mM蔗糖加入储存缓冲液，而在泳道13、17和21的冻干和即用的混合物中，将250mM蔗糖加入反应缓冲液和储存缓冲液两者中。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
图6.在室温下保存八个星期之后的包含250mM蔗糖的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。
冻干和即用的混合物包含：(i)公司X的反应缓冲液(泳道1、8和9)、公司W的反应缓冲液(泳道2、3、14-17)、公司R的反应缓冲液(泳道4、5、10-13)或公司Y的反应缓冲液(泳道6、7、18-21)；(ii)获自公司X的热启动DNA聚合酶(泳道1-7)或获自公司R的热启动DNA聚合酶(泳道8-21)。在泳道1、2、4、6、8、10、14和18中使用的冻干和即用的混合物中，没有加入物质；在泳道3、5、7、11、15和19的冻干和即用的混合物中，将250mM蔗糖加入反应缓冲液；在泳道9、12、16和20的冻干和即用的混合物中，将250mM蔗糖加入储存缓冲液，而在泳道13、17和21的冻干和即用的混合物中，将250mM蔗糖加入反应缓冲液和储存缓冲液两者。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
图7.在完成冷冻干燥过程之后的包含下面所描述的稳定剂的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。冻干和即用的混合物包含获自公司W(泳道1-5)或获自公司R(泳道6-10)的反应缓冲液和热启动DNA聚合酶。作为稳定剂被加入至冻干和即用的混合物中的是：200mM海藻糖(泳道2和7)、250mM蔗糖(泳道3和8)、200mM麦芽糖(泳道4和9)或0.025％琼脂糖(5和10)。没有将物质加入到泳道1和6中使用的冻干和即用的混合物。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
图8.在室温下或在37℃下保存一个星期之后的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。冻干和即用的混合物包含获自公司W(泳道1-5)或获自公司R(泳道6-10)的反应缓冲液和热启动DNA聚合酶。作为稳定剂被加入至冻干和即用的混合物中的是：200mM海藻糖(泳道2和7)、250mM蔗糖(泳道3和8)、200mM麦芽糖(泳道4和9)或0.025％琼脂糖(5和10)。没有将物质加入到泳道1和6中使用的冻干和即用的混合物。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
图9.在完成冷冻干燥过程之后立即进行的包含稳定剂的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。冻干和即用的混合物包含获自公司W(泳道1-5)或获自公司R(泳道6-10)的反应缓冲液和热启动DNA聚合酶。被加入至冻干和即用的混合物中的是：250mM海藻糖(泳道2和7)、6.6％右旋糖(泳道3和8)、200mM纤维二糖(泳道4和9)或6.6％支链淀粉(5和10)。没有将物质加入到泳道1和6中使用的冻干和即用的混合物。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
图10.在37℃下保存一个星期之后的包含稳定剂的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。冻干和即用的混合物包含获自公司W(泳道1-5)或获自公司R(泳道6-10)的反应缓冲液和热启动DNA聚合酶。被加入至冻干和即用的混合物中的是：250mM海藻糖(泳道2和7)、6.6％右旋糖(泳道3和8)、200mM纤维二糖(泳道4和9)或6.6％支链淀粉(5和10)。没有将物质加入到泳道1和6中使用的冻干和即用的混合物。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
图11.在完成冷冻干燥过程之后立即进行的包含纤维二糖的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。冻干和即用的混合物包含获自公司W(泳道1-5)或获自公司R(泳道6-10)的反应缓冲液和热启动DNA聚合酶。被加入至冻干和即用的混合物中的是：250mM海藻糖(泳道2和7)、6.6％右旋糖(泳道3和8)、200mM纤维二糖(泳道4和9)或6.6％支链淀粉(5和10)。没有将物质加入到泳道1和6中使用的冻干和即用的混合物。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
图12.在37℃下保存两个星期之后的包含纤维二糖的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。冻干和即用的混合物包含获自公司R的反应缓冲液和热启动DNA聚合酶(泳道1-13)。将不同浓度(mM)的纤维二糖加入冻干和即用的混合物：0(泳道1)、50(泳道2)、100(泳道3)、150(泳道4)、200(泳道5)、250(泳道6)、300(泳道7)、350(泳道8)、400(泳道9)、450(泳道10)、500(泳道11)、600(泳道12)、700(泳道13)。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
图13.在完成冷冻干燥过程之后立即进行的包含纤维二糖或海藻糖的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。冻干和即用的混合物包含获自公司R的反应缓冲液和热启动DNA聚合酶(泳道1-16)。被加入至冻干和即用的混合物中的是：100mM纤维二糖(泳道1-5)、200mM纤维二糖(泳道6-10)或200mM海藻糖(泳道12-16)。没有将物质加入到泳道11中使用的冻干和即用的混合物。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
图14.在37℃下保存两个星期之后的包含纤维二糖或海藻糖的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。冻干和即用的混合物包含获自公司R的反应缓冲液和热启动DNA聚合酶(泳道1-15)。被加入至冻干和即用的混合物中的是：100mM纤维二糖(泳道1-5)、200mM纤维二糖(泳道6-10)或200mM海藻糖(泳道11-15)。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
图15.在55℃下保存：24小时(泳道1和6)、48小时(泳道2和7)、72小时(泳道3和8)、96小时或一个星期(泳道5和10)之后的包含纤维二糖或海藻糖的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。冻干和即用的混合物包含获自公司R的反应缓冲液和热启动DNA聚合酶(泳道1-10)。
M：分子量标记物“BenchTop PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp；疟原虫18s RNA基因的片段。
在所有的图中，“M”对应于Promega公司的分子量标记物“Bench TopPCR标记物”的泳道；所述标记物的片段从50bp至1000bp变化。
图16.用冻干和即用的扩增混合物和用参考方法获得的野生型(wt)DNA对照样品(C1)、未知的DNA样品(C2)、突变体DNA对照样品(C3)以及无模板对照(N)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图16a.在扩增产物的纯化程序之前的结果。
图16b.在扩增产物的纯化程序之后的结果。
图17.直接测序结果。
图17a.用冻干和即用的扩增混合物获得的野生型和突变体序列扩增产物的直接测序结果。
图17b.用参考方法获得的野生型和突变体序列扩增产物的直接测序结果。
图18.PCR和实时PCR
图18a(i).用冻干和即用的扩增混合物获得的野生型(wt)DNA对照样品(C1)、未知的DNA样品(C2)、突变体DNA对照样品(C3)以及无模板对照(N)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图18a(ii).用冻干和即用的扩增混合物获得的实时PCR起始曲线(take off curve)；
图18a(iii).用冻干和即用的扩增混合物获得的实时PCR定量比较结果。
图18b(i).用参考方法获得的野生型(wt)DNA对照样品(C1)、未知的DNA样品(C2)、突变体DNA对照样品(C3)和无模板对照(N)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图18b(ii).用参考方法获得的实时PCR起始曲线；
图18b(iii).用参考方法获得的实时PCR定量比较结果。
图19a.用冻干和即用的扩增混合物获得的熔解曲线分析结果；
图19b.用参考方法获得的熔解曲线分析结果。
图20a.用冻干和即用的扩增混合物获得的高分辨率熔解曲线分析(HRM)结果；
图20b.用参考方法获得的高分辨率熔解曲线分析(HRM)结果。
图21a.用冻干和即用的扩增混合物获得的定量荧光(QF)酶蛋白色层图(pherogram)结果；
图21b.用参考方法获得的定量荧光(QF)酶蛋白色层图结果。
发明详述
定义
为了利于理解本发明，在下面定义了一些术语。
术语“稳定剂”意指相比于在没有稳定剂下保存材料，当被加入至生物学上活性材料时可以防止或延迟活性随时间损失的剂。
术语“聚合酶”是指能够从DNA模板和可用的核糖核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸合成核酸链(RNA或DNA)的酶或其活性片段。
术语“聚合酶活性”是指酶由核糖核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸开始合成核酸链(RNA或DNA)的能力。
术语：“缓冲液”或“缓冲剂”是指当被加入至溶液时给予该溶液对pH变化的抵抗性的物质或制剂。
术语“还原剂”是指电子供体，即，将电子贡献给第二物质以还原第二物质的原子中的一个或多个的氧化态的物质。
术语“溶液”是指含水的或非含水的混合物。
术语“缓冲溶液”是指包含缓冲剂的溶液。
术语“反应缓冲液”是指在其中进行酶反应的缓冲溶液。
术语“储存缓冲液”是指在其中保存酶的缓冲溶液。
术语“模板”是指分析“靶”的存在的起源于生物样品的核酸。
术语“靶”是指当根据分子生物学技术使用时，被用于扩增反应的特异性引物识别的核酸的区。在用于诊断用途的PCR的情况下，靶DNA由病原体的核酸组成。
术语“引物”或触发剂是指当在诱导核酸合成的条件(存在核苷酸和聚合酶)下使用时能够作为合成的触发剂的合成的寡核苷酸。
术语dNTP(脱氧核苷三磷酸)是指脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷的混合物，其中指出了脱氧核苷三磷酸中的每一种的浓度。
术语“PCR产物”或“扩增片段”是指由以下步骤的两个或更多个PCR循环，即链聚合，产生的通常双螺旋的DNA片段：模板DNA链的变性、其与特异性引物的退火和与模板DNA互补的链由引物的OH末端开始的延伸或延长。
详细描述
本发明涉及二糖纤维二糖用于在冷冻干燥(或干燥)期间稳定核酸聚合酶尤其是DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、RNA聚合酶或它们的活性片段和长时间地以该形式保存它们的用途。
在一个优选的方面，本发明涉及适合于用适当的溶剂稀释的干燥或冻干的组合物，该组合物包含被稳定为经得起冷冻干燥和在高达55℃的温度下的储存的核酸聚合酶，其特征在于，所述组合物具有在0.01至250单位的范围内的核酸聚合酶浓度、在50mM(17,115g/L)至500mM(171,15g/L)范围内的浓度的纤维二糖和缓冲液，其中缓冲液优选地是Tris HCl。所述核酸聚合酶是优选地选自由以下组成的组的DNA聚合酶：Taq聚合酶、热启动聚合酶或它们的活性片段。
所述组合物还被称为“冻干和即用的扩增混合物”或“Universal MasterMix”。
干燥或冻干的组合物通过从液体或冻结混合物冷冻干燥(或干燥)来获得，其中纤维二糖的浓度包括在50mM和500mM之间或包括在150mM(51,345g/L)和250mM(85,575g/L)之间或优选地为250mM，且其中核酸聚合酶浓度在0.01至250单位的范围内或优选地为至少2单位。用于冷冻干燥的纤维二糖优选地具有分析等级。
在一个优选的方面，本发明涉及适合于用适当的溶剂稀释的组合物，该组合物包含被稳定为经得起冷冻干燥和在高达55℃的温度下的储存的核酸聚合酶，其特征在于，所述组合物具有在0.01至250单位的范围内的核酸聚合酶浓度、在50至500mM范围内的浓度的纤维二糖、缓冲液、dNTP、KCl和MgCl2，其中缓冲液优选地是Tris HCl。
根据一个实施方式，组合物优选地包含PCR中即用形式的酶，甚至更优选地以下试剂中的至少一种：
i.稳定剂，其选自由以下组成的组：表面活性剂、离子型洗涤剂或非离子型洗涤剂例如NP40、Tween 20或Triton-X100和/或非还原糖例如：右旋糖、蔗糖、海藻糖；
ii还原剂，其选自由以下组成的组：β-巯基乙醇、DTT或硫酸铵；
iii.至少一种探针，其任选地被标记。
任选地，当冻干组合物用于实时PCR时，该冻干组合物可以包含可以用例如荧光基团标记的探针，所述探针选自由以下组成的组：TaqMan探针
Figure BDA0000104780450000141
分子
Figure BDA0000104780450000142
Scorpions探针
Figure BDA0000104780450000143
HiBeacon探针或可用于实时PCR的其他探针。
当在水中或在包含DNA的缓冲系统中重构本发明的组合物时，纤维二糖的浓度包括在50mM和500mM之间，或包括在150mM和250mM之间或优选地为250mM，且在该浓度下其不会干扰基因扩增反应。
甚至更优选地，组合物由即用的冻干或干燥制剂组成，该冻干或干燥制剂包含在优选的实施方式中描述的所有试剂且被预先制备，在单一容器例如管或微板(microplate)中或大批地重构之后立即用于基因扩增。
本发明还涉及组合物用于可以自动化方式进行的核酸的扩增尤其是用于分子生物学应用的用途，分子生物学应用例如但不限于，PCR、实时PCR、熔解曲线分析、高分辨率熔解曲线分析、测序、定量荧光PCR、多重PCR、全基因组扩增、等温扩增。
本发明还提供即用产品，该产品包含根据本发明的干燥或冻干的组合物和用于重构所述组合物的溶剂。
根据本发明制备的冻干组合物导致由该冻干组合物进行的PCR过程的相当大的简化，因而使得污染问题能够被预防，但主要提供关于反应所需要的核酸体积的相当大的灵活性，且因此测试稳健性显著增加。该最后方面在法学上(forensic science)是特别令人感兴趣的，因为更大体积的核酸可以与冻干组合物一起使用。
此外，包含聚合酶的组合物的室温稳定性的相当大的增加意味着，对兽医和人类诊断领域以及食品分析领域特别关注的应用变成可能，尤其是如果在非装备精良的设施中进行时。这些用途因此是特别优选的。组合物在高达55℃的温度下储存的稳定性的增加还提供了装运和储存的更大的灵活性。
本发明还进一步涉及用于核酸的扩增的方法，该方法包括以下步骤：
v.在水中或在缓冲液中重构本发明的组合物；
vi.加入靶DNA特异性引物；
vii加入核酸模板；
viii.任选地加入选自由以下组成的组的试剂中的一种或多种：KCl、MgCl2、dNTP、至少一种任选地被标记的探针、还原剂和另外的稳定剂。
本发明的另外的方面涉及一种用于制备包含在室温下稳定的聚合酶，优选地DNA聚合酶，且甚至更优选地Taq聚合酶或还更优选地热启动聚合酶的干燥或冻干的组合物的方法，该方法基本上由以下来表征：根据被定义为“最低限度(minimal)”的方案将所述酶(或所述多种酶)与在50mM和500mM之间，优选地在150mM和250mM之间的浓度的纤维二糖混合在可以由例如Tris-HCl组成的冷冻干燥和储存缓冲液中，且优选地在迅速冻结之后使该溶液经历冷冻干燥或干燥。
加入至少1-5IU的量的酶：最低限度方法还提供在冷冻干燥之前优选地选自由KCl、MgCl2组成的组的盐的加入。
本发明的优点之一是，借助于纤维二糖稳定的系统来适应来自不同制造公司的所有DNA聚合酶。
此外，纤维二糖通过由纤维素开始的酶促水解系统来生产，所述纤维二糖是由植物源的葡萄糖(糖)的长链组成的分子。植物源保证没有源自于细菌污染的可能的核酸污染物，当如在海藻糖的情况下，生产包括将细菌培养物用于其合成时，细菌污染是可能的。
存在将一种或多种酶和单独的或与其他组分一起的稳定剂(纤维二糖)混合的许多系统，这些系统都可适用。例如，将包含溶解的酶的溶液与稳定剂一起加入的方法，或将包含酶的溶液与包含稳定剂的第二溶液混合的方法，或将酶溶解在包含稳定剂的溶液中的方法以及将包含酶和稳定剂两者的溶液作为液体或冻干形式保存的另一种方法。
根据本领域专家已知的标准进行冷冻干燥。用于冷冻干燥的可能的方案的实例如下：
长时间的冷冻干燥方案：
·从+20℃至-40℃的梯度，在5分钟内
·-40℃，3小时
·从-40℃至-10℃的梯度，在30分钟内
·-10℃，4小时
·从-10℃至+10℃的梯度，在15分钟内
·+10℃，2小时
·从+10℃至+30℃的梯度，在15分钟内
·+30℃，4-8小时。
冷冻干燥可以根据以下较短的方案来进行，由于所涉及的体积小，这也可适用。用于冷冻干燥的可能的方案的实例如下：
短时间的冷冻干燥方案：
·从+20℃至-40℃的梯度，在5min内
·-40℃，30min
·从-40℃至-10℃的梯度，在15min内
·-10℃，30min
·从-10℃至+10℃的梯度，在15min内
·+10℃，60min
·从+10℃至+30℃的梯度，在15min内
·+30℃，60min。
当酶未被储存在甘油中时，特别指定短的冻结-干燥方案，而无论酶是否被储存在甘油中，都可以使用长的冻结-干燥方案。
在另外的和优选的实施方式中，尤其是对于诊断用途，本发明涉及一种用于制备冷冻干燥聚合酶的即用形式的组合物的方法，该方法包括以下步骤：
-根据被定义为“最低限度的”方案，将酶与包括在50和500mM之间，优选地在150和250mM之间的浓度的纤维二糖(或反之亦然)混合在可以由例如Tris-HCl组成的冷冻干燥和储存缓冲液中，
-加入优选地选自由以下组成的组的盐：KCl、Tris-HCl、MgCl2，
-任选地加入以下物质：
○dNTP，
○引物，优选地对样品中存在的靶DNA具有特异性的至少一种5’引物(正向)和一种3’引物(反向)，
○任选地加入选自由以下组成的组的另外的稳定剂：离子型洗涤剂或非离子型洗涤剂例如NP40、Tween-20和/或非还原糖例如：右旋糖、蔗糖、海藻糖、或诸如DTT或β-巯基乙醇的还原剂，
-优选地在迅速冻结之后如上所指出的冷冻干燥(或干燥)，和保存该形式的酶。
该方法还可以包括在冷冻干燥之前加入聚合链反应的对照DNA和特异性引物。
术语稳定剂意指洗涤剂(或表面活性剂)例如：NP-40(烷基酚乙氧基化物)、Tween-20(山梨聚糖-聚氧乙基化物单月桂酸酯)或Triton-X100或其类似物，以及非还原糖例如右旋糖、蔗糖、海藻糖。
另外的试剂可以被单独地加入或被预混合在反应混合物中，例如来自制造商的与酶一起被供应的另外的试剂，是比用于聚合反应的最终浓度浓缩n倍(通常x10)。
可以即用的冻干形式的酶可以被维持在室温下达若干月。
这一形式的酶的冷冻干燥和稳定性，可能地加上用于随后的聚合酶链反应的特异性试剂，使得能够制备包括在用缓冲液或用水重构之后被使用的干燥和即用的形式的混合物的容器(管、试管或微板)，该缓冲液或水可能地包含样品中的将被扩增的DNA/RNA模板(如果存在的话)。
该方面因此能够使用于包括诊断用途的本发明的所有用途的随后的扩增反应标准化。
此外，冷冻干燥和保存方案适合于传统PCR和实时PCR的链扩增反应两者，并因此用于定量类型用途和定性类型用途两者。
本发明的优点之一是，所使用的稳定剂(纤维二糖)对酶的冷冻干燥和保存两者有效，而已知领域的稳定剂通常用于一个目的或另一个目的。虽然可与用于该目的的其他分子相容，但是纤维二糖的使用使得其他“稳定”分子对于多个阶段不是必须的。此外，因为纤维二糖比海藻糖更不可溶，所以还预期其吸湿性更差，且因此能够给予冻干产物优良的贮存期限。
此外，本发明包括用于DNA样品的PCR扩增的试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的组合物和任选的关于聚合酶链反应中的酶的重构和使用的说明书。
本发明的一个特别优选的实施方式由纤维二糖在冻结-干燥和在高达55℃的温度下长期储存期间保存核酸聚合酶的用途组成。
用于单一反应的所述冻干组合物在最少体积的几μl(2-50，优选地5-30)中重构之后适用于扩增至少1ng的DNA样品。
还可以直接地在包含样品的DNA的缓冲液中重构冻干物(lyophilisate)。即用形式的冻干组合物中或在酶重构之后立即被加入的反应混合物中的各种试剂的浓度，必须是使得对于通过PCR的DNA扩增来说，在用合适体积的水或缓冲液重构组合物之后是最佳的，即，优选地，其中KCl的浓度在20和150mM之间，MgCl2的浓度在0.5和5mM之间，用于聚合反应和靶DNA的扩增的特异性引物的浓度在0.05和0.2mM之间，且dNTP的浓度在50和200mM之间。包含冻干形式的酶的这样的试剂盒，可以维持在室温下。
本发明的另一个方面涉及纤维二糖在冻结-干燥和在高达55℃的温度下储存期间保存DNA聚合酶，优选地热启动DNA聚合酶的用途。
如上所述，酶的冷冻干燥和酶的甚至以单一剂量或大批的即用反应混合物的形式的稳定性，允许链扩增反应条件更加标准化。因此，通过本发明变成可能的本发明组合物和冷冻干燥方法的优选用途，涉及具体地用于确定生物流体或组织中寄生体的存在的诊断试剂盒的制备。因此，特别优选用于DNA样品中的所述病原体的诊断鉴定的即用形式的冻干或干燥组合物，该组合物除了酶和纤维二糖以及上文定义的试剂(例如，盐和dNTP)之外，还包含疟原虫的靶DNA的特异性引物(对于物种恶性疟原虫(falciparum)、三日疟原虫(malariae)、间日疟原虫(vivax)和卵形疟原虫(ovale)中的每一种为一对)，该特异性引物优选地被设计在18sRNA的保守区，或利什曼原虫(Leishmania)的靶DNA的特异性引物，引物优选地被设计在18sRNA的保守区，或另外的弓形体(Toxoplasma)的靶DNA的特异性引物，引物优选地被设计在高度重复区HRE。
每一种即用形式的冻干组合物还包含优选地对应于通常在参考系统中表达的基因例如优选地人类β-珠蛋白基因的引物对的内部扩增对照和任选的用于扩增的对照DNA模板。
优选地存在于以即用的形式生产的组合物中的另外的组分是：在重构之后包括在20和150mM之间的最终浓度的KCl和在0.05-5mM之间的MgCl2、优选地在5-20mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、任选的0.05-0.2mM的浓度的用于在样品中检测需要存在的DNA的扩增的特异性引物，和包括在50和200mM之间的浓度的dNTP。
本文在一些具体的非限制性实施例中描述本发明的实施。
实验部分
材料
方法.在不另外和单独指出的情况下，实验部分中描述的冷冻干燥组合物通常包含在适当的时间加入的以下具体的试剂：DNA聚合酶(在1至5单位的范围内)、由制造商供应的反应缓冲液、MgCl2、dNTP和引物。
特定地，在本发明给出的实施例中，反应混合物包含用于扩增DNA中的两个区的引物：1)被设计在疟原虫的18s核糖体RNA基因(靶DNA)中的240bp(碱基对)片段，2)被设计在人类β-珠蛋白基因中、用作内部扩增对照(DNA对照)的268bp片段；盐和dNTP。
在冷冻干燥之后，通过硅胶方法从对恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)呈阳性的外周血提取的约10ng(纳克)基因组DNA被加入至冻干混合物，并用无菌蒸馏水使最终的体积达到25μl(微升)。
在94℃初始变性2分钟之后，进行由变性(94℃，2分钟)、退火(55℃，30秒)和延伸(72℃，45秒)组成的扩增循环。为了完成反应，进行40次如前所述的循环。
所使用的冷冻干燥方案之一由以下组成：
·从+20℃至-40℃的梯度，在5分钟内
·-40℃，3小时
·从-40℃至-10℃的梯度，在30分钟内
·-10℃，4小时
·从-10℃至+10℃的梯度，在15分钟内
·+10℃，2小时
·从+10℃至+30℃的梯度，在15分钟内
·+30℃，4-8小时。
实施例1.在DNA聚合酶和热启动聚合酶之间的比较
为了鉴别在冷冻干燥过程之后维持良好的聚合酶活性的DNA聚合酶的类型，我们比较了商业DNA聚合酶和可从两个不同的制造商得到的两种热启动DNA聚合酶。
在图1中，泳道1至6示出用获自公司X的热启动聚合酶制备的冻干和即用混合物扩增的PCR产物；特定地，在冷冻干燥之前的反应体积，对于泳道1至3，对应于25μl，和对于泳道4至6，对应于9.1μl。泳道7至12对应于用获自公司Y的热启动DNA聚合酶制备的冻干和即用混合物获得的扩增产物；特定地，在冷冻干燥之前的反应体积，对于泳道7至9，对应于25μl，和对于泳道10至12，对应于7.5μl。泳道13至15对应于用获自公司X的聚合酶制备的冻干和即用的扩增混合物获得的PCR产物；反应体积是25μl。
在冷冻干燥之前，没有将稳定剂加入至反应混合物。
如图1所示的，在冷冻干燥过程之后立即分析扩增产物，从泳道7至12可以看出，包含获自公司Y的热启动DNA聚合酶的混合物不能实现两种预期扩增产物的扩增，然而获自公司X的热启动聚合酶和非热启动聚合酶两者(分别地1至6和13至15)在冷冻干燥之后维持了它们的聚合酶活性。
公司X在其自己的反应缓冲液中包括物理地增加溶液密度的物质，它们被单独地和一般地被定义为稳定剂。
为了评估用于PCR的用获自公司X的聚合酶制备的冻干和即用的混合物的热稳定性，将相同的混合物在室温下和在37℃下保存3个星期。
照片2示出用包含公司X的热启动DNA聚合酶的扩增混合物获得的扩增产物；特定地，在冷冻干燥用于PCR的混合物之前的最终体积，对于泳道1至4，对应于25μl，和对于泳道5至8，对应于9.1μl。泳道9至12示出用包含来自公司X的DNA聚合酶的冻干和即用的反应混合物获得的扩增产物；在冷冻干燥之前的反应体积对应于25μl。在冷冻干燥之后将所述冻干反应混合物在室温下(泳道1至3、5至7、9至11)或在37℃下(泳道4、8和12)保存3个星期。
如照片中所示的，在室温下3个星期之后，用包含热启动DNA聚合酶的混合物获得的扩增产物(泳道1至3和5至7)证明比用简单的DNA聚合酶获得的那些(泳道9至11)强度更大。此外，热启动DNA聚合酶不会导致引物二聚体的形成，这与其他聚合酶相反。
最后，在37℃下3个星期的保存之后，热启动DNA聚合酶维持其酶活性(泳道4和8)，而简单的DNA聚合酶不能维持其酶活性(泳道12)。
因此，绝对肯定的是：1)稳定剂的使用对于在冷冻干燥过程期间保存DNA聚合酶的酶活性是关键的，2)对于扩增效率，热启动DNA聚合酶比正常DNA聚合酶更适合，但对于冷冻干燥过程不是这样，因为两种类别的DNA聚合酶展示相似的行为，即，它们需要冷冻干燥的稳定剂。
最后，在该实验中，在冷冻干燥步骤之前测试2种不同的体积(25μl和9.1μl)，而在结果上没有注意到任何变化。
实施例2.在不同的热启动DNA DNA聚合酶之间的比较
在以下实验中，制备包含获自4个不同公司(W、X、R、Y)的热启动DNA聚合酶的冻干和即用的扩增混合物，每一个与它们的4种反应缓冲液或与加入的稳定剂例如NP-40、Tween-20和蔗糖组合，总计19种组合。
在图3和图4中，泳道1至4、5至8、9至12和13至19表示使用分别包含获自公司W、X、R或Y的反应缓冲液的冻干的即用混合物通过PCR扩增的产物。在相同的图中，泳道1、5、9和13对应于用包含获自公司W的热启动DNA聚合酶的冻干和即用的扩增混合物获得的扩增产物；泳道2、6、10、14、17、18和19对应于用包含获自公司Y的热启动DNA聚合酶的冻干和即用的扩增混合物获得的扩增产物；泳道3、7、11和15对应于用包含获自公司X的热启动DNA聚合酶的冻干和即用的扩增混合物获得的扩增产物；泳道4、8、12和16对应于用包含获自公司R的热启动DNA聚合酶的冻干和即用的扩增混合物获得的扩增产物。在图3和图4中，泳道17、18和19对应于用还分别包含0.25％NP-40和0.25％Tween-20、100mM蔗糖和0.25％NP-40、0.25％Tween-20和100mM蔗糖的冻干和即用的混合物获得的扩增产物。
图3中呈现的PCR产物在完成冷冻干燥方案之后立即使用冻干和即用的混合物来扩增。相比之下，图4示出在室温下保存6个月的相同混合物的结果。
如图3中清楚地示出的，在冷冻干燥之后就被监测的包含公司X的反应缓冲液的混合物维持了4种聚合酶中的3种的酶活性，然而，对于第四种聚合酶，活性仅部分地被维持。
用公司W或R的反应缓冲液制备的混合物保存4种聚合酶中的1种的活性。最后，在获自公司Y的反应缓冲液的存在下，没有看到对应于两种预期片段的扩增；在100mM蔗糖的存在下仅可以看到残余的酶活性。此外，在进行通过PCR扩增之前，将冻干和即用的扩增混合物在室温下保存6个星期。如图4所示的，只有用公司X的反应缓冲液制备的冻干混合物能够保存所使用的四种热启动DNA聚合酶中的三种的酶活性。
这些结果强调了在冷冻干燥过程期间将稳定剂包括在PCR反应混合物中以便保存聚合酶的酶活性的重要性。
实施例3.用于PCR的包含250mM蔗糖的冻干和即用的组合物的稳定性
为了评估冻干PCR反应混合物的稳定性的改进，初步评估250mM蔗糖在储存缓冲液中、在反应缓冲液中或在两者中存在的影响。评估获自两个不同的公司的两种不同的热启动DNA聚合酶。
在图5和图6中，泳道1至7和泳道8至21表示用分别包含获自公司X或R的热启动DNA聚合酶的冻干和即用的反应混合物获得的扩增产物。在图5和图6中，泳道1、8和9对应于用公司X的反应缓冲液制备的冻干和即用的反应混合物获得的扩增产物；泳道2和3和泳道14至17对应于用公司W的反应缓冲液制备的冻干和即用的反应混合物获得的扩增产物；泳道4和5和泳道10至13对应于用公司R的反应缓冲液制备的冻干和即用的反应混合物获得的扩增产物；泳道6和7和泳道18至21对应于用公司Y的反应缓冲液制备的冻干和即用的反应混合物获得的扩增产物。在图5和图6中，泳道3、5、7、11、15和19表示用通过将250mM蔗糖加入至反应缓冲液中制备的冻干和即用的反应混合物获得的扩增产物；泳道9、12、16和20表示用通过将250mM蔗糖加入至储存缓冲液中制备的冻干和即用的反应混合物获得的扩增产物；泳道13、17和21表示用通过将250mM蔗糖加入至反应缓冲液和储存缓冲液中制备的冻干和即用的反应混合物获得的扩增产物。
图5中示出的扩增产物用在完成冷冻干燥过程之后立即被利用的冻干和即用的反应混合物来扩增，而图6的结果与图5的结果相同，但是在将冻干和即用的混合物在室温下保存8个星期之后。
如图5中显著的，在反应缓冲液中但不在储存缓冲液中存在250mM蔗糖对于在冷冻干燥过程期间和在冷冻干燥过程之后维持酶活性是必不可少的。在室温下保存8个星期之后，酶活性的保存仅在半数情况(10个中的5个)下是可能的(图6)。
因此，可以推断出，蔗糖对酶活性具有保护作用，虽然其对于长期保存来说并不有效。
实施例4.用不同的稳定物质制备的冻干组合物的稳定性
为了比较包含不同的稳定剂的冻干和即用的扩增混合物的热稳定性，利用诸如二糖、多糖或碳水化合物的成分，它们被加入至如在引言所描述地制备的扩增混合物中。
在图7和图8中，泳道1至5和泳道6至10表示用分别包含获自公司W或R的热启动DNA聚合酶的冻干和即用的扩增混合物获得的扩增产物。在图7和图8中，泳道1和6、2和7、3和8、4和9、以及5和10对应于分别包含以下物质的冻干和即用的扩增混合物：无稳定剂；200mM海藻糖、250mM蔗糖、200mM麦芽糖和0.025％琼脂糖。
图7中示出的扩增产物在完成冷冻干燥过程之后立即用冻干和即用的扩增混合物来获得，而图8中示出的结果与图7的结果相同，但在将冻干和即用的反应混合物在37℃下保存一个星期之后。
250mM蔗糖、200mM海藻糖、200mM麦芽糖和0.025％琼脂糖在冻干和即用的反应混合物中的存在最初通过使用获自两个不同公司的两种不同的热启动DNA聚合酶来评估。如图7中显著的，海藻糖、蔗糖和麦芽糖(分别地泳道2和7、3和8以及4和9)在冻干和即用的反应混合物中的存在使得两种酶的酶活性被保存，虽然该作用好像不如对获自公司R的酶(泳道7、8和9)有效；这对于蔗糖(泳道8)是特别明显的。对于琼脂糖，没有记录到扩增带(图7，泳道5和10)。此外，在通过PCR处理之前，冻干和即用的混合物在37℃下被保存一个星期。包含200mM海藻糖的冻干混合物维持了两种热启动DNA聚合酶(图8，泳道2和7)的完整酶活性，而具有250mM蔗糖和0.025％琼脂糖的那些冻干混合物则没有(图8，分别地泳道3和8、5和10)。
200mM的麦芽糖维持一种聚合酶的活性(图8，泳道9)，但仅部分地维持其他聚合酶的活性。
然后在相同的两种聚合酶上评估在被冻干之前被加入至反应混合物中的250mM海藻糖、6.6％右旋糖、200mM纤维二糖(Fluka Analytical22150D-(+)-纤维二糖)和6.6％支链淀粉的作用。
在图9和图10中，泳道1至5和泳道6至10表示用分别获自公司W或R的热启动DNA聚合酶制备的冻干和即用的反应混合物获得的扩增产物。在图9和图10中，泳道1和6、2和7、3和8、4和9、5和10对应于分别包含以下物质的冻干和即用的反应混合物：无稳定剂、250mM海藻糖、6.6％右旋糖、200mM纤维二糖或6.6％支链淀粉。图9中的结果对应于在已经完成冷冻干燥过程之后立即被处理的冻干混合物，而图10中示出的结果对应于与先前的反应混合物相同的时间被制备但在37℃下被保存一个星期的具有相同特征的反应混合物。
如图9所示的，将海藻糖和纤维二糖引入冻干反应混合物中保存了两种热启动DNA聚合酶的酶活性(分别地泳道2和7、4和9)，而右旋糖和支链淀粉仅保护两种酶中的一种(分别地泳道3和8、5和10)。此外，具有相同的特征和在与先前的反应混合物相同的时间被制备的反应混合物在通过PCR处理之前，在37℃下被保存一个星期。包含作为稳定剂的250mM海藻糖和200mM纤维二糖的冻干反应混合物保护两种聚合酶的酶活性(图10，分别地泳道2和7、4和9)，而6.6％右旋糖和6.6％支链淀粉不保存两种聚合酶的酶活性(图10，分别地泳道3和8、5和10)。
此外，还评估0.5％白蛋白、2％白蛋白和3％乳糖，但没有获得与用海藻糖和纤维二糖得到的那些结果相当的结果。
因此，清楚地证明，只有纤维二糖和海藻糖对DNA聚合酶提供保护。
实施例5.评估用于稳定冻干组合物的纤维二糖的最佳浓度
为了鉴别保存DNA聚合酶的酶活性的最有效的纤维二糖浓度，如引言中所描述地制备包含增加浓度的纤维二糖的冻干和即用的反应混合物。
纤维二糖的分析的浓度范围是0至700mM。
在图11和图12中，泳道1至13表示用分别包含以以下浓度加入的纤维二糖的冻干反应混合物获得的扩增产物：0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600和700mM。
图11的扩增产物通过在完成冷冻干燥过程之后立即使用冻干反应混合物来获得，而图12的结果对应于具有相同的特征且在与先前的反应混合物相同的时间被制备但在37℃下被保存两个星期的反应混合物。
如图11和图12中所示的，最好地保存聚合酶的酶活性的纤维二糖浓度在150至250mM的范围内，甚至在37℃下保存一个星期之后(图12)。
因此，证明了纤维二糖在150至250mM的浓度范围内向冻干和即用的反应混合物提供最好的稳定性。
实施例6.评估包含作为稳定剂的海藻糖或纤维二糖的冻干和即用的组合物的时间稳定性
为了鉴别包含海藻糖或纤维二糖的冻干和即用的混合物的时间稳定性，如引言中所描述地制备冻干的即用的反应混合物，但加入200mM纤维二糖或200mM海藻糖。混合物在经历通过PCR扩增之前被冻干。
在图13中，泳道1至5、6至10、11以及12至16对应于分别包含100mM纤维二糖、200mM纤维二糖、无稳定剂和200mM海藻糖的混合物。
图13中示出的扩增产物在完成冷冻干燥过程之后立即用冻干反应混合物获得，而图14的结果对应于具有相同的特征且在与先前的反应混合物相同的时间被制备但在37℃下被保存两个星期的反应混合物。
在图14中，泳道1至5、6至10、11至15对应于分别包含100mM纤维二糖、200mM纤维二糖或200mM海藻糖的冻干混合物。图15中示出的扩增产物用在55℃下分别被保存以下时间的冻干反应混合物获得：24小时、48小时、72小时、96小时和一个星期(分别地，泳道1、6和11；2、7和12；3、8和13；4、9和14；5、10和15)。
在图15中，泳道1至5表示在55℃下保存24小时(泳道1和6)、48小时(泳道2和7)、72小时(泳道3和8)、96小时或一个星期(泳道5和10)之后的包含纤维二糖或海藻糖的冻干和即用的扩增混合物的琼脂糖凝胶电泳图。冻干和即用的混合物包含获自公司R的反应缓冲液和热启动DNA聚合酶(泳道1-10)。M：分子量标记物“Bench Top PCR标记物”，Promega。
PCR产物：268bp：人类β-珠蛋白基因的片段；240bp：疟原虫18s RNA基因的片段。
在所有图中，“M”对应于Promega公司的分子量标记物“Bench TopPCR标记物”的泳道；所述标记物的片段从50bp至1000bp变化。
如图13中所示的，存在于该实施例的冻干和即用的反应混合物中的稳定剂非常好地保存聚合酶活性。在用PCR处理之前，冻干反应混合物还在37℃下被保存一个星期。
甚至在暴露于该应激之后，存在于包含200mM纤维二糖(图14，泳道6至10)的冻干和即用的反应混合物中的聚合酶维持它们的完整酶活性，与加入200mM海藻糖(图14，泳道11至15)的那些一样。与200mM纤维二糖(图14，泳道6至10)或200mM海藻糖(图14，泳道11至15)在37℃下保存两个星期之后，酶维持它们的活性。
最后，具有相同的特征和在与先前的反应混合物相同的时间被制备反应混合物在55℃下被保存24小时、48小时、72小时、96小时和一个星期(图15)，然后经历PCR扩增。
使用海藻糖作为稳定剂(图15，泳道6至10)能够保护热启动DNA聚合酶的酶活性，甚至在55℃的应激之后。在55℃下延长处理(48小时、72小时和96小时)部分地损害酶活性(图15，分别地泳道2、3和4)。
然而，包含200mM纤维二糖的冻干和即用的混合物具有与包含200mM海藻糖的混合物相同的稳定性。我们因此可以断言，作为稳定剂，纤维二糖具有与海藻糖相同的性质，但是与海藻糖相比，纤维二糖具有前述优点，包括从纤维素通过酶水解系统来生产，所述纤维素是由植物源的长葡萄糖(糖)链组成的分子。植物源确保没有源自于细菌污染的可能的核酸污染物，当如在海藻糖生产的情况下，细菌培养物用于合成它时，细菌污染是可能的。
实施例7.纤维二糖稳定剂形成用于寄生虫学领域中的诊断试剂盒的即用组合物的用途
在适合于形成寄生虫学领域中的诊断试剂盒的即用和冻干混合物的制备中，纤维二糖用作热启动DNA聚合酶的稳定剂。
特定地，对于所研究的寄生虫的每一种，预先制备包含以下物质的最终反应混合物：
10mM Tris-HCl(pH 8.0)、50mM KCl、0.25μM正向引物、0.25μM反向引物、0.2mM dNTP、1.5mM MgCl2和2单位的Taq聚合酶。
疟原虫的触发剂或引物(对于物种恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫和卵形疟原虫中的每一种为一对)被设计在18sRNA的保守区。利什曼原虫的引物被设计在18sRNA的保守区。弓形体的引物被设计在高度重复区HRE。
所有制备的混合物包含对应于被设计在人类β-珠蛋白基因序列中的引物对的内部对照。
在多种配置中的每一种引物以0.25μM的浓度被供应。
实施例8.DNA扩增和直接测序性能的比较
扩增的野生型(wt)DNA对照样品(C1)、未知的DNA样品(C2)、突变体DNA对照样品(C3)和无模板对照(N)的琼脂糖凝胶电泳图。
进行DNA扩增以比较用冻干和即用的扩增混合物获得的PCR产物和用参考方法获得的那些PCR产物。
向冻干和即用的扩增组合物加入以下组分：
参考方法具有以下组成：
Figure BDA0000104780450000282
Figure BDA0000104780450000291
两种系统的PCR收率相当。通过在2％琼脂糖凝胶上电泳分析扩增产物(图16a)。
在测序分析之前，使用MultiScreen HTS真空歧管系统(Millipore)来纯化每一种PCR产物。相比于用参考方法获得的PCR产物，对于使用Universal Master Mix获得的PCR产物进行更短的时间的纯化程序。冻结-干燥形式保证高品质的PCR产物，消除了可以扰乱和延迟纯化步骤的常规添加剂的存在，生成足够量的用于随后测序分析的扩增产物(图16b)。
结果表明，冻干和即用的扩增混合物(Universal Master Mix)对于扩增反应和随后的测序分析是理想的(图17)。
实施例9.在荧光染料存在下的实时PCR、熔解曲线分析和高分辨率熔解曲线分析(HRM)性能的比较
冻干和即用的扩增混合物(Universal Master Mix)的性能通过使用RotorGene 6000(Corbett Life Science)来评估。该仪器允许在同一分析会话中3种不同的应用：在荧光双链特异性染料(EvaGreen，Biotium)存在下的实时PCR、熔解曲线分析和高分辨率熔解曲线分析。对于每一种应用，比较冻干和即用的扩增混合物(Universal Master Mix)与参考方法。
对于3种应用中的每一种，示出野生型DNA对照样品(C1)、未知的DNA样品(C2)、带有A＞G置换的突变体DNA样品(C3)和无模板对照(N)的结果。
显示出相似的扩增效率
扩增分析和实时PCR起始(take off)值的结果表明，冻干和即用的扩增混合物(Universal Master Mix)对于PCR和对于实时PCR是理想的。
当使用冻干和即用的扩增混合物(Universal Master Mix)和参考方法时，熔解分析提供明确定义的熔解温度(T熔解)的鉴别。特定地，在89℃下鉴别用冻干和即用的扩增混合物(Universal Master Mix)获得的样品的T熔解，而在87℃下确定用参考方法获得的样品的T熔解。此外，用冻干和即用的扩增混合物(Universal Master Mix)获得的熔解曲线允许在不同的样品之间完全的重叠；对用参考方法获得的熔解曲线，未观察到该情况。
熔解曲线分析的结果和高分辨率熔解曲线分析的结果表明，冻干和即用的扩增混合物(Universal Master Mix)对于在两种应用中使用是理想的。
实施例10.定量荧光(QF)PCR中的性能的比较
特别是对于最普通的常染色体和性染色体非整倍性的产前诊断，在QFPCR中评估用冻干和即用的扩增混合物(Universal Master Mix)获得的性能和结果并将它们与用参考方法获得的那些性能和结果进行比较。QF PCR分析包括扩增、检测和分析染色体特异性DNA微卫星。荧光标记的标记物特异性引物用于单个标记物的PCR扩增，且每一种标记物的复制数量表示染色体的复制数量。可以使用自动基因分析仪来分析和量化所得到的PCR产物。
QF PCR方案：
Figure BDA0000104780450000301
组合物
引物组7,5μl
DNA   50ng
H2O   至25μl。
使用软件GeneMarker分析QF PCR产物。扩增产物中的每一种的峰高和峰面积比的分析表明，冻干和即用的扩增混合物(Universal Master Mix)对于在定量荧光中使用是理想的。

Claims (15)

1.一种适合于用适当的溶剂稀释的干燥或冻干的组合物，包含被稳定为经得起冷冻干燥和在高达55℃的温度下的储存的核酸聚合酶，其特征在于，所述组合物具有在0.01至250单位的范围内的核酸聚合酶浓度、在50mM(17,115g/L)至500mM(171,15g/L)范围内的浓度的纤维二糖和缓冲液。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述核酸聚合酶是选自由以下组成的组的DNA聚合酶：Taq聚合酶、热启动聚合酶或其活性片段。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，包含250mM纤维二糖和2单位的核酸聚合酶。
4.一种适合于用适当的溶剂稀释的组合物，包含被稳定为经得起冷冻干燥和在高达55℃的温度下的储存的核酸聚合酶，其特征在于，所述组合物具有在0.01至250单位的范围内的核酸聚合酶浓度、在50mM至500mM范围内的浓度的纤维二糖、缓冲液、dNTP、KCl和MgCl2。
5.根据权利要求1或4所述的组合物，其中所述缓冲液是Tris HCl。
6.根据权利要求4所述的组合物，还包含以下组分(i-iii)中的一种或多种：
i.稳定剂，其选自由以下组成的组：表面活性剂和/或非还原糖；
ii还原剂，其选自由以下组成的组：β-巯基乙醇、DTT；
iii.至少一种探针，其任选地被标记。
7.根据权利要求1或4所述的组合物用于核酸的扩增的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述扩增方法以自动化的方式进行。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的用途，用于进行PCR、实时PCR、熔解曲线分析、高分辨率熔解曲线分析、测序、定量荧光PCR、多重PCR、全基因组扩增或等温扩增。
10.一种用于核酸的扩增的方法，包括以下步骤：
a.在水中或在缓冲液中重构根据权利要求1所述的组合物；
b.加入靶DNA特异性引物；
c.加入核酸模板；
d.加入选自由以下组成的组的试剂中的一种或多种：KCl、MgCl2、dNTP、至少一种任选地被标记的探针、还原剂和另外的稳定剂。
11.一种用于核酸的扩增的方法，包括以下步骤：
a.在水中或在缓冲液中重构根据权利要求4所述的组合物；
b.加入靶DNA特异性引物；
c.加入核酸模板；
d.任选地加入至少一种任选地被标记的探针、还原剂和另外的稳定剂。
12.一种即用产品，包含：
a.根据权利要求1或4中任一项所述的干燥或冻干的组合物；
b.用于重构所述组合物的溶剂。
13.一种用于DNA样品的PCR扩增的试剂盒，包含根据权利要求1或4所述的组合物和任选的关于聚合酶链反应中的酶的重构和使用的说明书。
14.纤维二糖在冷冻干燥和在高达55℃的温度下长期储存期间保存核酸聚合酶的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述核酸聚合酶是DNA聚合酶。
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