ITMI20090877A1 - Uso di uno stabilizzante delle polimerasi per la liofilizzazione e la preparazione di kit pronti per l'uso - Google Patents

Uso di uno stabilizzante delle polimerasi per la liofilizzazione e la preparazione di kit pronti per l'uso Download PDF

Info

Publication number
ITMI20090877A1
ITMI20090877A1 IT000877A ITMI20090877A ITMI20090877A1 IT MI20090877 A1 ITMI20090877 A1 IT MI20090877A1 IT 000877 A IT000877 A IT 000877A IT MI20090877 A ITMI20090877 A IT MI20090877A IT MI20090877 A1 ITMI20090877 A1 IT MI20090877A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
dna
lanes
polymerase
ready
amplification
Prior art date
Application number
IT000877A
Other languages
English (en)
Inventor
Luca Ugo De
Maurizio Gramegna
Luigi Roveda
Original Assignee
Sentinel Ch S P A
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to ITMI2009A000877A priority Critical patent/IT1394539B1/it
Application filed by Sentinel Ch S P A filed Critical Sentinel Ch S P A
Priority to EP10724727.2A priority patent/EP2432873B1/en
Priority to JP2012511278A priority patent/JP2012527226A/ja
Priority to PL10724727T priority patent/PL2432873T3/pl
Priority to PCT/EP2010/056877 priority patent/WO2010133628A1/en
Priority to ES10724727.2T priority patent/ES2478890T3/es
Priority to PT107247272T priority patent/PT2432873E/pt
Priority to MX2011011616A priority patent/MX2011011616A/es
Priority to CN2010800195495A priority patent/CN102414315A/zh
Priority to AU2010251184A priority patent/AU2010251184B2/en
Priority to BRPI1014980A priority patent/BRPI1014980A2/pt
Priority to US13/318,835 priority patent/US9273303B2/en
Priority to CA2761059A priority patent/CA2761059C/en
Priority to KR1020117026117A priority patent/KR20120042727A/ko
Publication of ITMI20090877A1 publication Critical patent/ITMI20090877A1/it
Application granted granted Critical
Publication of IT1394539B1 publication Critical patent/IT1394539B1/it

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Description

USO DI UNO STABILIZZANTE DELLE POLIMERASI PER LA LIOFILIZZAZIONE E LA PREPARAZIONE DI KIT PRONTI PER L’USO
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione à ̈ relativa alla stabilizzazione di enzimi di polimerizzazione degli acidi nucleici ed alla preparazione di miscele di reazione pronte per l’uso contenenti gli stessi utilizzabili anche per scopo diagnostico.
TECNICA ANTERIORE
La sintesi in vivo ed in vitro di acidi nucleici à ̈ regolata attraverso la fedele duplicazione dei filamenti, dove ogni singolo filamento di acido nucleico determina l’ordine dei nucleotidi in un filamento perfettamente complementare. Il meccanismo specifico per la duplicazione del DNA implica l’uso, e sfrutta l’attività, di una famiglia di enzimi chiamati Polimerasi.
Le Polimerasi, purificate da differenti organismi, sono comunemente utilizzate in ricerca ed in diagnostica, in particolare dopo l’avvento di numerosi sistemi di amplificazione genica, quali la Polymerase Chain Reaction (PCR - Mullis et al. U.S. Pat. Nos. 4,683,195; 4,683,202; e 4,800,159).
La configurazione di base della PCR consiste in una coppia di inneschi sintetici, in un acido nucleico stampo e nell’enzima Polimerasi. Ciascun innesco à ̈ complementare ad una regione dell’acido nucleico bersaglio, o meglio ad uno dei due filamenti complementari.
L’enzima Polimerasi à ̈ ovviamente una parte critica dei sistema di amplificazione a motivo della sua capacità di aggiungere sequenzialmente nucleotidi in 3’ e di legarli ad un gruppo idrossilico del primer polinucleotidico, specifico per il bersaglio, in grado di legarsi mediante legami idrogeno con il filamento stampo. La miscela di reazione deve essere riscaldata a 90 - 95° C per denaturare la doppia elica del DNA stampo. Dopo il passaggio di denaturazione la temperatura à ̈ diminuita a 50 - 60°C per permettere l’appaiamento degli inneschi al filamento complementare, successivamente la polimerasi completa il processo allungando tali inneschi in un passaggio comunemente denominato di estensione ( extension ). Gli enzimi utilizzati nelle reazioni di PCR sono stati isolati da organismi termofili e sono pertanto stabili ad alte temperature. Comunque, anche questi enzimi altamente termostabili possono essere inattivati da agenti chimici, proteasi, o cambiamenti ambientali.
L’impiego di enzimi termostabili, così come di altri enzimi, spesso richiede l’impiego concomitante di condizioni denaturanti quali temperature elevate, à ̈ il caso della PCR, miscele acquose con concentrazioni sub-ottimali di cofattori e substrati, ed un pH non ottimale per la massima attività enzimatica.
Tale scenario suggerisce che la stabilizzazione degli enzimi à ̈ fortemente richiesta, e necessaria, per una conservazione a lungo termine degli enzimi, soprattutto se inclusi in miscele acquose unitamente ad altri reagenti e miscele di reazione pronte all’uso per l’amplificazione di acidi nucleici.
Numerose tecniche di stabilizzazione delle polimerasi sono conosciute e sono state descritte in brevetti e domande. Tali tecniche includono modifiche chimiche degli enzimi, immobilizzazioni su supporto solido, uso di aptameri, ingegneria genetica degli enzimi e addizione di agenti stabilizzanti.
Un gruppo di sostanze che ha mostrato un’attività stabilizzante sono i surfattanti che agiscono all'interfaccia tra la forma attiva dell’enzima e l’ambiente acquoso nel quale sono contenuti.
Il metodo abituale per stabilizzare gli enzimi coinvolti nelle tecniche di biologia molecolare à ̈ di conservare una preparazione liquida di ciascun enzima in una soluzione contenente 50% glicerolo addizionata di un agente riducente quale ditiotreitolo (DTT) o β-mercaptoetanolo a -20°C. La procedura à ̈ sufficiente per preservare l’attività enzimatica per molti mesi con una minima perdita di attività. L’attività deN’enzima à ̈ al contrario persa rapidamente quando esso viene conservato a temperatura ambiente o a 4°C.
Detergenti non ionici quali Triton X-100 e Tween 20 hanno mostrato di stabilizzare l’attività delle DNA polimerasi. La domanda EP 776,970 A1 descrive l’uso di detergenti non ionici, compreso Tween 20<®>ed NP-40<®>per stabilizzare l’attività di DNA polimerasi termostabili. Anche il sodio dodecil solfato (SDS) a basse concentrazioni ha dimostrato di stabilizzare l’attività enzimatica.
Metodi per conservare gli enzimi che consentano a questi ultimi di tollerare prolungate esposizioni a temperatura ambiente o limitate esposizioni a temperature più elevate, rappresentano ancor oggi, tuttavia, l’unico vero limite ad una più agevole, nonché più economica gestione delle spedizioni ed utilizzo in nuovi ambiti. Finora, infatti, gli enzimi, in particolare le Polimerasi, comprese quelle provenienti da organismi termofili, ossia quelle solitamente utilizzate per la reazione di polimerizzazione a catena (PCR) sono trasportate a temperature inferiori a 2-8°C, di norma a -20°C.
Tra i metodi di conservazione di materiale biologico, la liofilizzazione à ̈ stata finora utilizzata per conservare cibi, cellule, membrane biologiche, macromolecole biologiche ed anche enzimi.
Il processo di liofilizzazione comporta la rimozione di acqua da un campione congelato, cioà ̈ l’evaporazione della componente acquosa del solido, senza il passaggio allo stato liquido, in condizioni di pressione inferiore a quella ambiente. Le preparazioni di proteine sono normalmente congelate prima di essere essiccate per ridurre le distorsioni strutturali dovute all’essiccamento.
Una liofilizzazione non completamente “asciutta†, che cioà ̈ contiene ancora una piccola percentuale di acqua, sembra garantire una migliore conservazione rispetto ad una completamente essiccata, in particolare se seguita da una conservazione effettuata a temperature non superiori a 4 - 10°C. Anche in queste condizioni, tuttavia, vi à ̈ però una piccola perdita di attività dell’enzima.
Alcuni enzimi, ad esempio le polimerasi, sono invece completamente inattivati dopo liofilizzazione in assenza di un crioprotettore, indipendentemente dal tipo di liofilizzazione (asciutta o meno).
Numerose sostanze o additivi con attività crioprotettrice sono stati utilizzati o anche solo proposti, per la stabilizzazione delle Polimerasi. Ad esempio, i brevetti US 5,614,387 e US 5834,254 descrivono metodi e composizioni per la preparazione di composizioni liofilizzate stabili di enzimi per l’amplificazione di acidi nucleici in cui quali agenti crioprotettivi, sono usati trealosio e/o polivinilpirrolidone (PVP).
L’analisi dell’arte nota e dei prodotti attualmente in commercio rivela che il problema della conservazione degli enzimi di polimerizzazione e la possibilità di semplificare l’allestimento di miscele di reazione di polimerizzazione a catena (e dunque della standardizzazione delle reazioni di PCR anche in ambito di laboratorio) risulti estremamente attuale ed in continua evoluzione.
Nel mercato à ̈ reperibile un sistema denominato puRe Taq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) che consiste in una formulazione liofilizzata pre-miscelata ed in singola dose per amplificazioni standard di PCR. Il sistema ha tuttavia il limite di essere preparato con una specifica Taq Polimerasi (la puRe Taq Polymerase) descritta come enzima leader per stabilità e purezza. Il metodo proposto nella presente invenzione, al contrario, può essere utilizzato con tutte le polimerasi poiché il cellobiosio à ̈ in grado di stabilizzare e proteggere tutte le Taq Polimerasi, siano esse semplici polimerasi o Hot Start polimerasi o, ancora, loro frammenti attivi quali i Klenow.
SOMMARIO
La presente invenzione riguarda una miscela secca o liofilizzata comprendente: un enzima di polimerizzazione degli acidi nucleici e cellobioso, dove l’enzima à ̈ stabile.
Tale enzima di polimerizzazione à ̈ una DNA polimerasi preferibilmente selezionata nel gruppo consistente di: Taq Polimerasi, Hot Start polimerasi o loro frammenti attivi.
La miscela può essere anche in forma pronta per l’uso e comprendente uno o più dei seguenti reagenti: sali, quali KCI, MgCfe, Tris HCI ed inoltre:
i. inneschi di polimerizzazione specifici per un DNA stampo presente in un campione, dNTPs, ed opzionalmente almeno una sonda, anche marcata,
ii. un DNA stampo di controllo, inneschi specifici per l’amplificazione di tale DNA controllo ed opzionalmente almeno una sonda per tale controllo, anche marcata,
iii. ulteriori stabilizzanti selezionati nel gruppo consistente di: surfattanti e/o zuccheri non riducenti Triton-X100, NP40, Tween-20, saccarosio, maltosio, trealosio;
iv. agenti riducenti selezionati nel gruppo consistente di: βmercaptoetanolo, DTT.
L’invenzione riguarda anche un metodo per la preparazione di una miscela secca o liofilizzata comprendente un enzima di polimerizzazione degli acidi nucleici e cellobioso, dove l'enzima à ̈ stabile, comprendente le seguenti fasi:
a) aggiunta di cellobioso in concentrazione finale compresa tra 50 e 500 mM, preferibilmente tra 150 e 250 mM, ad una soluzione contenente una DNA polimerasi, o viceversa;
b) opzionalmente, distribuzione della miscela, anche automaticamente, in aliquote e/o in contenitori adatti,
c) liofilizzazione o essiccazione.
Ulteriori reagenti addizionati prima della liofilizzazione, sono ad es sali quali: KCI, MgCI2e gli ulteriori reagenti sopra indicati.
Fanno inoltre parte dell’invenzione i contenitori (tubo, provetta o micropiastra multipozzetto) comprendenti la miscela dell’invenzione, anche in formato pronto per l’uso in PCR all’aggiunta del campione di DNA o alla ricostituzione in opportuno sistema tampone.
Inoltre l’invenzione comprende kit in cui à ̈ presente la miscela liofilizzata dell’invenzione o i contenitori in cui la miscela liofila à ̈ presente ed opzionalmente istruzioni per la ricostituzione e l’uso dell’enzima in una reazione di polimerizzazione a catena.
Una realizzazione dell’invenzione particolarmente preferita à ̈ costituita da kit diagnostici in cui la miscela liofilizzata comprende anche specifici inneschi per il DNA bersaglio, costituito preferibilmente da DNA di agenti patogeni per l’uomo. DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1. Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, appena dopo aver completato il processo di liofilizzazione. Corsie 1-6: prodotti di PCR amplificati con miscele liofilizzate e pronte all’uso preparate con la polimerasi Hot Start dell’azienda X; volume prima della liofilizzazione: 25 Î1⁄4Ι (corsie 1-3) o 9,1 Î1⁄4Ι (corsie 4-6). Corsie 7-12: prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele liofile e pronte all’uso preparate con la Hot Start DNA polimerasi dell’azienda Y; volume prima della liofilizzazione: 25 Î1⁄4Ι (corsie 7-9) o 7,5 Î1⁄4Î (corsie 10-12). Corsie 13-15: prodotti di PCR ottenuti con miscele di amplificazione liofile e pronte all’uso preparate con una polimerasi ottenuta dall’azienda X; volume prima della liofilizzazione: 25 Î1⁄4Ι.
M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†, Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 2. Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, dopo una conservazione a temperatura ambiente o a 37°C per tre settimane. Corsie 1-8: prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele di amplificazione contenenti Hot Start DNA polimerasi dell’azienda X; volume prima della liofilizzazione: 25 Î1⁄4Ι (corsie 1-4) o 9,1 Î1⁄4Ι (corsie 5-8). Corsie 9-12: prodotti di amplificazione ottenuti con miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti DNA polimerasi dell’azienda X; volume prima della liofilizzazione: 25 Î1⁄4Ι. Conservazione per tre settimane a temperatura ambiente (corsie 1-3, 5-7, 9-11) o a 37°C (corsie 4, 8, 12).
M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†, Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 3. Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, appena dopo aver completato il processo dì liofilizzazione. Le miscele liofile pronte all’uso contengono: (i) tamponi di reazione dell’azienda W (corsie 1-4), dell’azienda X (corsie 5-8), dell’azienda R (corsie 9-12) o dell’azienda Y (corsie 13-19); (ii) Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda W (corsie 1, 5, 9 e 13), dall’azienda Y (corsie 2, 6, 10 , 14, 17, 18 e 19), dall’azienda X (corsie 3, 7, 11 e 15) o dall’azienda R (corsie 4, 8, 12 e 16). I prodotti di amplificazione delle corsie 17, 18 e 19 sono stati ottenuti con miscele liofilizzate e pronte all’uso contenenti anche, rispettivamente, 0,25% NP-40 e 0,25% Tween-20, 100 mM saccarosio e 0,25% NP-40, 0,25% Tween-20 e 100mM saccarosio.
M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†, Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 4. Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, dopo una conservazione a temperatura ambiente per sei settimane. Le miscele liofile pronte all’uso contengono rispettivamente: (i) tamponi di reazione dell’azienda W (corsie 1-4), dell’azienda X (corsie 5-8), dell’aziendà R (corsie 9-12) o dell'azienda Y (corsie 13-19); (ii) Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda W (corsie 1, 5, 9 e 13), dall’azienda Y (corsie 2, 6, 10 , 14, 17, 18 e 19), dall’azienda X (corsie 3, 7, 11 e 15) o dall’azienda R (corsie 4, 8, 12 e 16). I prodotti di amplificazione delle corsie 17, 18 e 19 sono stati ottenuti con miscele liofilizzate e pronte all’uso contenenti anche, rispettivamente, 0,25% NP-40 e 0,25% Tween-20, 100 mM saccarosio e 0,25% NP-40, 0,25% Tween-20 e 100 mM saccarosio.
M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†, Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 5. Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti 250 mM saccarosio, appena dopo aver completato il processo di liofilizzazione. Le miscele liofile e pronte all’uso contengono: (i) tamponi di reazione dell’azienda X (corsie 1, 8 e 9), dell’azienda W (corsie 2, 3, 14-17), dell’azienda R (corsie 4, 5, 10-13) o dell’azienda Y (corsie 6, 7, 18-21); (ii) Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda X (corsie 1-7) o dall’azienda R (corsie 8-21). Nelle miscele liofile e pronte all’uso utilizzate nelle corsie 1, 2, 4, 6, 8, 10, 14 e 18 non à ̈ stata aggiunta nessuna sostanza; in quelle delle corsie 3, 5, 7, 1,1 15 e 19 à ̈ stato aggiunto 250 mM saccarosio nel tampone di reazione; in quelle delle corsie 9, 12, 16 e 20 à ̈ stato aggiunto 250 mM saccarosio nel tampone di conservazione, mentre in quelle delle corsie 13, 17 e 21 à ̈ stato aggiunto 250 mM saccarosio sia nel tampone di reazione che in quello di conservazione. M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†, Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 6. Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, contenenti 250 mM saccarosio, dopo una conservazione a temperatura ambiente per otto settimane.
Le miscele liofile e pronte all’uso contengono: (i) tamponi di reazione dell’azienda X (corsie 1, 8 e 9), dell’azienda W (corsie 2, 3, 14-17), dell’azienda R (corsie 4, 5, 10-13) o dell’azienda Y (corsie 6, 7, 18-21); (ii) Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda X (corsie 1-7) o dall’azienda R (corsie 8-21). Nelle miscele liofile e pronte all’uso utilizzate nelle corsie 1, 2, 4, 6, 8, 10, 14 e 18 non à ̈ stata aggiunta nessuna sostanza; in quelle delle corsie 3, 5, 7, 1,1 15 e 19 à ̈ stato aggiunto 250 mM saccarosio nel tampone di reazione; in quelle delle corsie 9, 12, 16 e 20 à ̈ stato aggiunto 250 mM saccarosio nel tampone di conservazione, mentre in quelle delle corsie 13, 17 e 21 à ̈ stato aggiunto 250 mM saccarosio sia nel tampone di reazione che in quello di conservazione. M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†, Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 7. Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, contenenti gli stabilizzanti descritti di seguito, dopo il completamento del processo di liofilizzazione. Le miscele liofile e pronte all’uso contengono tamponi di reazione e gli enzimi Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda W (corsie 1-5) o dall’azienda R (corsie 6-10). Nelle miscele liofile e pronte all’uso à ̈ stato aggiunto quale stabilizzante: 200mM trealosio (corsie 2 e 7), 250mM saccarosio (corsie 3 e 8), 200mM maltosio (corsie 4 e 9) o 0,025% agarosio (5 e 10). Nelle miscele liofile e pronte all’uso utilizzate nelle corsie 1 e 6 non à ̈ stata aggiunta alcuna sostanza.
M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†, Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 8. Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, dopo aver effettuato una conservazione a 37°C per una settimana. Le miscele liofile e pronte all’uso contengono tamponi di reazione e Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda W (corsie 1-5) o dall’azienda R (corsie 6-10). Nelle miscele liofile e pronte all’uso à ̈ stato aggiunto: 200mM trealosio (corsie 2 e 7), 250mM saccarosio (corsie 3 e 8), 200mM maltosio (corsie 4 e 9) o 0,025% agarosio (5 e 10). Nelle miscele liofile e pronte all’uso utilizzate nelle corsie 1 e 6 non à ̈ stata aggiunta nessuna sostanza.
M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers", Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 9. Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, contenenti stabilizzanti, appena dopo aver completato il processo di liofilizzazione. Le miscele liofile e pronte all’uso contengono tamponi di reazione e Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda W (corsie 1-5) o dall’azienda R (corsie 6-10). Nelle miscele liofile e pronte all’uso à ̈ stato aggiunto: 250mM trealosio (corsie 2 e 7), 6,6% destrosio (corsie 3 e 8), 200mM cellobiosio (corsie 4 e 9) o 6,6% amilopectina (5 e 10). Nelle miscele liofile e pronte all’uso utilizzate nelle corsie 1 e 6 non à ̈ stata aggiunta nessuna sostanza.
M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†, Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 10. Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, contenenti stabilizzanti, dopo una conservazione a 37°C per una settimana. Le miscele liofile e pronte all’uso contengono tamponi di reazione e Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda W (corsie 1-5) o dall’azienda R (corsie 6-10). Nelle miscele liofile e pronte all’uso à ̈ stato aggiunto: 250mM trealosio (corsie 2 e 7), 6,6% destrosio (corsie 3 e 8), 200mM cellobiosio (corsie 4 e 9) o 6,6% amilopectina (5 e 10). Nelle miscele liofile e pronte all’uso utilizzate nelle corsie 1 e 6 non à ̈ stata aggiunta nessuna sostanza.
M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†, Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 11. Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, contenenti Cellobiosio, appena dopo aver completato il processo di liofilizzazione. Le miscele liofile e pronte all’uso contengono tamponi di reazione e Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda W (corsie 1-5) o dall’azienda R (corsie 6-10). Nelle miscele liofile e pronte all’uso à ̈ stato aggiunto: 250mM trealosio (corsie 2 e 7), 6,6% destrosio (corsie 3 e 8), 200mM cellobiosio (corsie 4 e 9) o 6,6% amilopectina (5 e 10). Nelle miscele liofile e pronte all’uso utilizzate nelle corsie 1 e 6 non à ̈ stata aggiunta nessuna sostanza.
M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers", Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 12. Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, contenenti Cellobiosio, dopo una conservazione a 37°C per due settimane. Le miscele liofile e pronte all’uso contengono tamponi di reazione e Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda R (corsie 1-13). Nelle miscele liofile e pronte all’uso à ̈ stato aggiunto cellobiosio in diverse concentrazioni (mM): 0 (corsia 1), 50 (corsia 2), 100 (corsia 3), 150 (corsia 4), 200 (corsia 5), 250 (corsia 6), 300 (corsia 7), 350 (corsia 8), 400 (corsia 9), 450 (corsia 10), 500 (corsia 11), 600 (corsia 12), 700 (corsia 13).
M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers", Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 13: Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, contenenti Cellobiosio o trealosio, appena dopo aver completato il processo di liofilizzazione. Le miscele liofile e pronte all’uso contengono tamponi di reazione e Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda R (corsie 1-16). Nelle miscele liofile e pronte all’uso à ̈ stato aggiunto: 100mM cellobiosio (corsie 1-5), 200mM cellobiosio (corsie 6-10) o 200mM trealosio (corsie 12-16). Nella miscela liofila e pronta all’uso utilizzata nelle corsia 11 non à ̈ stata aggiunta nessuna sostanza.
M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†, Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 14: Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, contenenti Cellobiosio o trealosio, dopo una conservazione a 37°C per due settimane. Le miscele liofile e pronte all’uso contengono tamponi di reazione e Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda R (corsie 1-15). Nelle miscele liofile e pronte all’uso à ̈ stato aggiunto: 100mM cellobiosio (corsie 1-5), 200mM cellobiosio (corsie 6-10) o 200mM trealosio (corsie 11-15).
M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†, Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp.
Figura 15: Pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, contenenti Cellobiosio o trealosio, dopo una conservazione a 55°C per: 24 ore (corsie 1 e 6), 48 ore (corsie 2 e 7), 72 ore (corsie 3 e 8), 96 ore o una settimana (corsie 5 e 10). Le miscele liofile e pronte all’uso contengono tamponi di reazione e Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda R (corsie 1-10).
M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†, Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp..
In tutte le figure “M†corrisponde alla corsia del marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†dell’azienda Promega; i frammenti di tale marcatore variano da 50bp a 10OObp.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Definizioni.
Per agevolare la comprensione dell’invenzione, alcuni termini sono definiti di seguito.
Con “agente stabilizzante†si intende un agente che, quando aggiunto ad un materiale biologicamente attivo, può prevenire o ritardare la perdita di attività nel tempo se paragonata ad una conservazione del materiale in assenza di agente stabilizzante.
Il termine “polimerasi†si riferisce ad un enzima o a suoi frammenti attivi in grado di sintetizzare filamenti di acido nucleico (RNA o DNA) a partire da un DNA stampo e dalla disponibilità di ribonucleosidi trifosfato o desossinucleosidi trifosfato.
Il termine “attività polimerasica†si riferisce all’abilità di un enzima di sintetizzare filamenti di acido nucleico (RNA o DNA) a partire da ribonucleosidi trifosfati o desossinucleosidi trifosfato.
I termini: “tampone {buffer)" o “agenti tamponanti ( buffering agents )" si riferiscono a sostanze o preparazioni che, quando aggiunte ad una soluzione, conferiscono ad essa resistenza ai cambiamenti di pH.
II termina “agente riducente†si riferisce ad un donatore di elettroni, cioà ̈ ad un materiale che dona elettroni ad un secondo materiale per ridurre lo stato ossidativo di uno o più degli atomi del secondo materiale.
Il termine “soluzione†si riferisce ad una miscela, sia esse acquosa o non acquosa. Il termine “soluzione tampone" si riferisce ad una soluzione contenente un agente tamponante.
Il termine “tampone di reazione ( reaction buffer)" si riferisce ad una soluzione tampone nella quale à ̈ sviluppata una reazione enzimatica.
Il termine “tampone di conservazione ( Storage buffer )" si riferisce ad una soluzione tampone nella quale à ̈ conservato un enzima.
Il termine “stampo†si riferisce ad un acido nucleico originato da un campione biologico che viene analizzato per la presenza del “bersaglio†.
Il termine “bersaglio†si riferisce, quando utilizzato in riferimento alla tecnica di PCR, alla regione dell’acido nucleico riconosciuta dagli inneschi specifici utilizzati per la reazione di amplificazione. Nel caso di reazione PCR per uso diagnostico il DNA bersaglio à ̈ costituito dall’acido nucleico dell’agente patogeno.
Il termine “primers" o inneschi si riferisce a degli oligonucleotidi sintetici che sono in grado di agire da punto di innesco della sintesi quando utilizzati in condizioni nelle quali una sintesi di acido nucleico à ̈ indotta (presenza di nucleotidi e polimerasi).
Il termine dNTPs (deossinucleosidi trifosfati) si riferisce ad una miscela equimolare di deossiadenosina, deossitimidina, deossiguanosina e deossicitidina in cui à ̈ generalmente indicata la concentrazione di ciascuno dei deossinucleosidi trifosfati. Il termine “prodotto di PCR†o “frammento amplificato†, si riferisce ad un frammento di DNA, generalmente a doppia elica, risultato di due o più cicli di PCR, cioà ̈ di polimerizzazione a catena, successivi ai passaggi di denaturazione della catena di DNA stampo, appaiamento su di essa degli inneschi specifici ( annealing ) ed estensione ( extension ) o allungamento della catena complementare al DNA stampo, a partire dallOH terminale dell’innesco.
Descrizione dettagliata
La presente invenzione riguarda l’uso del disaccaride cellobiosio per stabilizzare gli enzimi di polimerizzazione degli acidi nucleici, in particolare le DNA polimerasi, Hot Start DNA polimerasi, RNA polimerasi o loro frammenti attivi, durante la liofilizzazione (o l’essiccamento) ed in questa forma conservarli nel tempo.
L’invenzione pertanto riguarda, in un suo aspetto preferito, una miscela essiccata o liofilizzata comprendente: una DNA o RNA polimerasi e cellobioso in quantità compresa tra 50 e 500 mM e caratterizzata dal fatto che l’enzima à ̈ stabile a temperatura ambiente o inferiore a 55°C.
La miscela essiccata o liofilizzata à ̈ ottenuta per liofilizzazione (o essiccamento) da una miscela liquida o congelata, in cui il cellobioso à ̈ in concentrazione compresa tra 50 e 500 mM o preferibilmente compreso tra 150 e 250 mM ed in cui l’enzima à ̈ presente in quantità di almeno 1-5 IU o preferibilmente di almeno 2-3 IU. Il cellobioso utilizzato per la liofilizzazione à ̈ preferibilmente di grado analitico.
La miscela comprende preferibilmente almeno un sale, preferibilmente selezionato nel gruppo consistente di: KCI, Tris-HCI, MgCI2, ed inoltre, secondo una realizzazione dell’enzima in formato pronto per l’uso in PCR, ancor più preferibilmente almeno uno dei seguenti reagenti:
i) dNTPs,
ii) inneschi di polimerizzazione per il DNA bersaglio (presente nel campione), preferibilmente almeno un innesco 5’ ( forward ) ed un innesco 3’ (reverse),
iii) inneschi adatti per l'amplificazione di un DNA di controllo, iv) ulteriori stabilizzanti selezionati nel gruppo consistente di:
detergenti ionici o non-ionici quali ad es. NP40, Tween 20 o Triton-X100 e/o nel gruppo degli zuccheri non riducenti, quali ad esempio: destrosio, saccarosio, trealosio,
v) opzionalmente, agenti riducenti o ammonio solfato.
La miscela può comprendere anche lo stesso DNA controllo costituito ad esempio da un frammento di DNA che si vuole amplificare contemporaneamente al DNA bersaglio durante la reazione di amplificazione come controllo positivo di amplificazione.
Opzionalmente, quando realizzata per la PCR Real-Time, la miscela liofilizzata può comprendere sonde, anche marcate, ad es. con gruppi fluorescenti scelti nel gruppo consistente di: TaqMan probes®, Molecular Beacons®, Scorpions probes®, HiBeacon probes®, o altre sonde utilizzabili per Real-Time PCR.
Il campione di DNA controllo può essere un gene contenuto nel campione di DNA e diverso dal DNA bersaglio, ad esempio il gene per la beta-globina umana presente in un campione di DNA derivato da sangue periferico insieme con il DNA bersaglio, oppure un frammento di DNA comprendente il gene della Beta Globina o parte di esso; in tal caso gli inneschi sono inneschi complementari al 5’ ed al 3’ del frammento di DNA controllo e di sequenza corrispondente.
Quando la miscela dell’invenzione viene ricostituita in acqua o in un sistema tampone contenente DNA, il cellobioso risulta in concentrazione compresa tra 50 e 500 mM, preferibilmente tra 150 e 250 mM, ed in tale concentrazione non interferisce con la reazione di amplificazione genica.
Ancor più preferibilmente la miscela consiste in preparazioni liofilizzate o essiccate pronte all’uso, contenenti tutti i reagenti descritti nella realizzazione preferita e predisposte per l’amplificazione genica direttamente dopo ricostituzione nel singolo contenitore, quale ad esempio tubo o micropiastra o in bulk.
Le miscele liofilizzate preparate secondo l’invenzione portano ad una notevole semplificazione della procedura di PCR realizzata a partire da esse e consentono quindi la prevenzione dei problemi legati a contaminazione, e soprattutto una notevole flessibilità relativa ai volumi di acido nucleico necessari per la reazione, con un conseguente notevole incremento della robustezza dei test.
Il notevole incremento della stabilità a temperatura ambiente della miscela contenente la polimerasi rende inoltre possibili applicazioni di particolare interesse nel campo della diagnostica sia veterinaria che umana e nel campo dell’analisi degli alimenti, soprattutto se e qualora effettuate in strutture non particolarmente attrezzate. Tali utilizzi risultano quindi particolarmente preferiti.
Secondo un ulteriore aspetto l’invenzione riguarda un metodo di preparazione di una miscela liofilizzata o essiccata contenente una polimerasi stabile a temperatura ambiente, preferibilmente una DNA polimerasi, ancor più preferibilmente una Taq Polimerasi o ancor più preferibilmente una Hot Start Polimerasi, caratterizzato essenzialmente dal miscelare tale enzima (o tali enzimi) con il cellobioso in concentrazione compresa tra 50 e 500 mM, preferibilmente tra 150 e 250 mM, in un tampone di liofilizzazione e conservazione che può essere costituito ad es. da Tris-HCI, secondo un protocollo definito “minimo†e sottoporre a liofilizzazione o essiccamento, preferibilmente dopo un congelamento veloce, la soluzione.
L’enzima à ̈ aggiunto in quantità di almeno 1-5 IU: il metodo minimo prevede l'aggiunta anche di un sale, preferibilmente selezionato nel gruppo consistente di: KCI, Tris-HCI, MgCI2, prima della liofilizzazione.
Uno dei vantaggi della presente invenzione à ̈ che il sistema di stabilizzazione attraverso il cellobioso si adatta a tutte le DNA polimerasi delle varie case produttrici.
Inoltre il cellobioso viene prodotto attraverso un sistema di idrolisi enzimatica a partire da cellulosa, molecola costituita da lunghe catene di glucosio (zucchero) di origine vegetale. L’origine vegetale garantisce l’assenza di possibili contaminanti di acidi nucleici provenienti da contaminazioni batteriche sempre possibili quando, come nel caso del trealosio, la produzione passa attraverso l’impiego di colture batteriche per la sintesi dello stesso.
I sistemi per miscelare l’enzima, o gli enzimi, e lo stabilizzante (il cellobioso) da solo o con gli altri componenti, sono molteplici e tutti applicabili. Per esempio un metodo in cui una soluzione contenente l’enzima disciolto sia addizionata con lo stabilizzante, oppure un metodo in cui una soluzione contenente l’enzima sia miscelata ad una seconda soluzione contenente lo stabilizzante, oppure un metodo in cui l’enzima sia disciolto in una soluzione contenente lo stabilizzante ed ancora un metodo in cui una soluzione contenente sia l’enzima sia lo stabilizzante sia conservata liquida o liofilizzata.
La liofilizzazione à ̈ effettuata secondo criteri conosciuti al tecnico del ramo. L’esempio di un possibile protocollo di liofilizzazione à ̈ il seguente:
• Rampa da 20°C a -40°C in 5 minuti
• -40°C per 3 ore
• Rampa da -40°C a -10°C in 30 minuti
• -10°C per4 ore
• Rampa da -10°C a 10°C in 15 minuti
• 10°C per 2 ore
• Rampa da 10°C a 30°C in 15 minuti
• 30°C per 4-8 ore.
In una sua ulteriore e preferita realizzazione, in particolare per l’uso diagnostico, l’invenzione riguarda un metodo per la preparazione della miscela per la liofilizzazione di una polimerasi in forma “pronta per l’uso†, che comprende le seguenti fasi:
- miscelazione dell’enzima al cellobioso in concentrazione compresa tra 50 e 500 mM, preferibilmente tra 150 e 250 mM, o viceversa, in un tampone di liofilizzazione e conservazione che può essere costituito ad es. da Tris-HCI, secondo un protocollo definito “minimo†, - aggiunta di sali, preferibilmente selezionati nel gruppo consistente di:
KCI, Tris-HCI, MgCI2,
- aggiunta opzionale di:
o dNTPs,
o inneschi di polimerizzazione, preferibilmente almeno un innesco 5’ ( forward) ed un innesco 3’ ( reverse ) specifici per il DNA bersaglio presente nel campione,
o opzionalmente aggiunta di un ulteriore stabilizzante selezionato nel gruppo consistente di: surfattanti ionici o non ionici, quali ad es. NP40, Tween-20 e/o zuccheri non riducenti, quali ad esempio: destrosio, saccarosio, trealosio, o di un agente riducente, ad esempio DTT o β-mercaptoetanolo, - liofilizzazione (o essiccamento) secondo quanto visto sopra preferibilmente dopo un congelamento veloce, e conservazione deN’enzima in questa forma.
Il metodo può comprendere l'aggiunta anche di un DNA di controllo per la reazione di polimerizzazione a catena e specifici inneschi, prima della liofilizzazione.
Per stabilizzanti, si intendono sia detergenti (o surfattanti) quali ad esempio: NP-40 (alchil-fenolo etossilato), Tween-20 (sorbitan-poliossietilato monolaureato) o Triton-X100 o loro analoghi, che zuccheri non riducenti quali ad es. destrosio, saccarosio, trealosio.
Gli ulteriori reagenti possono essere addizionati singolarmente o essere premiscelati in una miscela di reazione, quale quella che viene fornita dal produttore insieme con l’enzima, n volte più concentrata (in genere 10X) rispetto alla concentrazione finale utile per la reazione di polimerizzazione.
L’enzima in forma liofilizzata, anche pronta per l’uso, può essere mantenuto a temperatura ambiente per diverse settimane.
La liofilizzazione e la stabilità deH’enzima in questa forma, anche in combinazione con reagenti specifici per la successiva reazione di polimerizzazione a catena, consentono la preparazione di contenitori (tubo, provetta o micropiastra) comprendenti la miscela in forma essiccata e pronta per l’uso dopo ricostituzione con un tampone o con acqua, anche contenente il DNA/RNA stampo presente nel campione e che, se presente, deve essere amplificato.
Tale aspetto consente perciò la standardizzazione delle reazioni di amplificazione successive e l’uso diagnostico della presente invenzione.
Inoltre, i protocolli di liofilizzazione e conservazione sono adatti sia a reazioni di amplificazione a catena mediante PCR classica, che Real-Time e quindi ad utilizzi sia di natura quantitativa che qualitativa.
Uno dei vantaggi della presente invenzione à ̈ che lo stabilizzante utilizzato (cellobioso) risulta efficace sia per la liofilizzazione che per la conservazione dell’enzima, mentre in genere gli stabilizzanti dell’arte nota sono utilizzati o per l’uno o per l’altro scopo, e quindi l’uso del cellobioso, pur essendo compatibile con altre molecole utilizzate allo scopo, rende non necessario l’uso di altre molecole “stabilizzatrici†per le diverse fasi. Inoltre, poiché il cellobiosio à ̈ meno solubile del trealosio, à ̈ prevedibile che sia anche meno igroscopico e che quindi possa conferire una maggiore shelf-life al prodotto liofilizzato.
Rappresenta un’ulteriore realizzazione dell’invenzione, un kit per l’amplificazione di DNA mediante PCR, costituito da una confezione comprendente almeno uno dei seguenti prodotti, a loro volta presenti in un contenitore: una miscela liofilizzata contenente una polimerasi in quantità di almeno 1-5 IU, preferibilmente almeno 2 IU e cellobioso in concentrazione compresa tra 50 e 500 mM, più preferibilmente in concentrazione compresa tra 150-250 mM ed ulteriori reagenti essenziali per il funzionamento deH’enzima, quali i sali: KCI, MgCI2, un liquido per la ricostituzione del tampone di reazione, preferibilmente un sistema tampone quale Tris HCI, ed eventuali ulteriori reagenti aggiuntivi non compresi nella miscela liofilizzata (come ad esempio: dNTPs, altri sali, agenti riducenti, ulteriori stabilizzanti, inneschi specifici per il campione, DNA stampo controllo ed inneschi per l'amplificazione del DNA controllo, come sopra elencati) ed istruzioni per la ricostituzione e l’uso della miscela pronta.
Tale miscela liofilizzata per singola reazione, à ̈ prevista amplificare un campione di DNA di almeno 1 ng, dopo ricostituzione in un volume minimo di pochi Î1⁄4Ι (2-50, preferibilmente 5-30).
La ricostituzione del liofilizzato può avvenire anche direttamente in un tampone contenente il DNA del campione. La concentrazione dei vari reagenti nella miscela liofilizzata in forma pronta per l’uso o nelle mix di reazione da addizionare successivamente alla ricostituzione dell’enzima, dovrà essere tale per cui, dopo ricostituzione della miscela con acqua o tampone nel volume adatto, questa risulti ottimale per l’amplificazione mediante PCR del DNA e quindi in cui preferibilmente KCI sarà in concentrazione compresa tra 20-150 mM, MgCI2in concentrazione compresa tra 0,5-5 mM, inneschi specifici per la reazione di polimerizzazione e l'amplificazione del DNA bersaglio, in concentrazione 0,05-0,2 mM e dNTPs in concentrazione compresa tra 50-200 mM. Un tale kit, contenente l’enzima in forma liofilizzata, può essere mantenuto a temperatura ambiente.
Una ulteriore realizzazione dell’invenzione à ̈ rappresentata da un kit per la liofilizzazione e la conservazione di una DNA Polimerasi in presenza di cellobioso, dove l’enzima à ̈ in quantità a partire da 1-5 IU, preferibilmente 2-3 IU per singolo campione. Preferibilmente l’enzima à ̈ una Hot-Start polimerasi.
Il kit può comprendere: cellobioso, preferibilmente in forma cristallina e pre-pesato per una concentrazione finale compresa tra 50 e 500 mM, preferibilmente tra 150 e 250 mM al quale viene aggiunto l’enzima, generalmente in forma liquida ed opzionalmente, una mix di reazione precostituita, come sopra descritta, tale per cui dopo ricostituzione con acqua o con un tampone acquoso, preferibilmente contenente anche il DNA del campione, le concentrazioni siano quelle sopra specificate, il kit può ulteriormente contenere le istruzioni per la liofilizzazione di una forma stabile di Polimerasi con uno dei protocolli di liofilizzazione sopra ricordati.
Secondo un ulteriore aspetto l’invenzione riguarda l’uso del cellobioso per la liofilizzazione e la conservazione a lungo termine di una DNA polimerasi, preferibilmente di una Hot Start DNA Polimerasi.
Come sopra ricordato, la liofilizzazione deH’enzima e la sua stabilità anche in forma di mix di reazione pronta per l’uso, sia in dosi singole che in bulk, consente una maggiore standardizzazione delle condizioni della reazione di amplificazione a catena. Pertanto un uso preferito della miscela dell’invenzione e del procedimento di liofilizzazione reso possibile dalla presente invenzione, riguarda la preparazione di kit diagnostici, in particolare per determinare la presenza di agenti parassitari nei fluidi o tessuti biologici. Particolarmente preferite sono quindi miscele liofilizzate o essiccate in forma pronta per l’uso, comprendenti oltre all’enzima ed al cellobioso, ed ai reagenti sopra definiti (ad es. sali e dNTPs) inneschi specifici per il DNA bersaglio di Plasmodium (una coppia per ciascuna delle specie falciparum, malariae, vivax e ovale ) preferibilmente disegnati nella regione conservata 18sRNA, oppure di Leishmania, con prìmers preferibilmente disegnati nelle regione conservata 18sRNA oppure di Toxoplasma, con primers preferibilmente disegnati nella regione altamente ripetitiva HRE, per la rilevazione diagnostica di tali agenti patogeni in un campione di DNA.
Ciascuna miscela liofilizzata, nel formato pronto per l’uso, comprende anche un controllo interno di amplificazione preferibilmente corrispondente ad una coppia di inneschi di un gene normalmente espresso nel sistema di riferimento, ad esempio preferibilmente il gene della beta globina umana ed opzionalmente, un DNA stampo di controllo per l'amplificazione.
Componenti aggiuntivi preferibilmente presenti nella miscela realizzata nel formato pronto per l’uso sono: KCI in concentrazione finale dopo ricostituzione compresa tra 20-150 mM, MgCI20.5-5 mM, preferibilmente in un tampone 5-20 mM Tris-HCI (pH 8.0), opzionalmente inneschi specifici per l'amplificazione del DNA del quale si intende rilevare la presenza nel campione, in concentrazione 0.05-0.2 mM, e dNTPs in concentrazione compresa tra 50-200 mM.
La realizzazione dell’invenzione à ̈ qui descritta in alcuni esempi specifici che non ne costituiscono però alcuna limitazione.
PARTE SPERIMENTALE
Materiali
Metodi Le miscele di liofilizzazione descritte nella Parte Sperimentale contengono generalmente, dove non indicato diversamente ed a parte i reagenti specifici aggiunti di volta in volta: una DNA polimerasi (in un range da 1 a 5 unità), il tampone di reazione fornito dalla casa produttrice ( reaction buffer), MgCI2, dNTPs e primers.
In particolare, negli esempi riportati per questa invenzione, la miscela di reazione contiene primers per l'amplificazione di due regioni di DNA: 1) un frammento di 240 bp (base pairs) disegnato nel gene del 18S RNA ribosomiale di Plasmodium spp. (DNA bersaglio), 2) un frammento di 268 bp disegnato nel gene della βglobina umana, utilizzato come controllo interno di amplificazione (DNA controllo), sali e dNTPS.
Dopo la liofilizzazione, circa 10 ng (nanogrammi) di DNA genomico estratto con il metodo della silica gel a partire da sangue periferico positivo per Plasmodium falciparum à ̈ stato aggiunto alla miscela liofilizzata ed il volume finale portato a 25 Î1⁄4Ι (microlitri) con acqua distillata sterile.
Dopo una denaturazione iniziale a 94°C per 2 minuti, sono stati realizzati cicli di amplificazione consistenti in denaturazione (94°C per 2’), annealing (55°C per 30†) ed extension (72°C per 45†). Per completare la reazione sono stati realizzati 40 cicli come sopra descritti.
Uno dei protocolli di liofilizzazione utilizzati, consiste in:
• Rampa da 20°C a -40°C in 5 minuti
• -40°C per 3 ore
• Rampa da -40°C a -10°C in 30 minuti
• -10°C per4 ore
• Rampa da -10°C a 10°C in 15 minuti
• 10°C per 2 ore
• Rampa da 10°C a 30°C in 15 minuti
• 30°C per 4-8 ore.
Esempio 1. Comparazione tra DNA polimerasi e Hot Start DNA polimerasi Al fine di identificare il tipo di DNA polimerasi che mantiene una buona attività polimerasica dopo il processo di liofilizzazione, abbiamo comparato una DNA polimerasi commerciale con due Hot Start DNA polimerasi reperite da due differenti aziende produttrici.
Nella figura 1, le corsie dalla 1 alla 6 mostrano prodotti di PCR amplificati con miscele liofilizzate e pronte all’uso preparate con la polimerasi Hot Start dell’azienda X; in particolare i volumi di reazione prima della liofilizzazione corrispondono a 25 Î1⁄4Ι per le corsie da 1 a 3, e 9,1 Î1⁄4Ι per le corsie da 4 a 6. Le corsie dalla 7 alla 12 corrispondono a prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele liofile e pronte all’uso preparate con la Hot Start DNA polimerasi dell’azienda Y; in particolare i volumi di reazione prima della liofilizzazione corrispondono a 25 Î1⁄4Ι per le corsie da 7 a 9, e 7,5 Î1⁄4Ι per le corsie da 10 a 12. Le corsie dalla 13 alla 15 corrispondono a prodotti di PCR ottenuti con miscele di amplificazione liofile e pronte all’uso preparate con una polimerasi ottenuta dall’azienda X; i volumi di reazione sono pari a 25 Î1⁄4Î .
Nessuno stabilizzante à ̈ stato aggiunto alla miscela di reazione prima della liofilizzazione.
Come mostrato in figura 1 dove i prodotti di amplificazione sono stati analizzati subito dopo il processo di liofilizzazione, nelle corsie da 7 a 12 si può verificare come la miscela contenente la Hot Start DNA polimerasi ottenuta dall’azienda Y non consente l’amplificazione dei due prodotti di amplificazione attesi, mentre entrambe le polimerasi, la Hot Start e la non-Hot Start (rispettivamente da 1 a 6 e da 13 a 15) ottenute dall’azienda X mantengono un'attività polimerasica dopo liofilizzazione.
L’azienda X include nel proprio reaction buffer sostanze che aumentano fisicamente la densità della soluzione, e che vengono definite solamente e genericamente stabilizers.
Al fine di valutare la stabilità termica di miscele liofilizzate e pronte all’uso per PCR, preparate con le polimerasi ottenute dall’azienda X, si sono conservate le stesse miscele a temperatura ambiente ed a 37°C per 3 settimane.
Nella fotografia 2 sono mostrati i prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele di amplificazione contenenti Hot Start DNA polimerasi dell’azienda X; in particolare i volumi finali prima della liofilizzazione delle miscele utilizzate per la PCR corrispondono a 25 Î1⁄4Ι per le corsie da 1 a 4 ed a 9,1 Î1⁄4Ι per le corsie da 5 a 8. Nelle corsie da 9 a 12 sono mostrati i prodotti di amplificazione ottenuti con miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti DNA polimerasi dell’azienda X; i volumi di reazione prima della liofilizzazione corrispondono a 25 Î1⁄4Ι. Tali miscele di reazione liofilizzate sono state conservate a temperatura ambiente (corsie da 1 a 3, da 5 a 7, da 9 a 11) o a 37°C (corsie 4, 8 e 12) per 3 settimane dopo la liofilizzazione.
Come mostrato in fotografia, dopo 3 settimane a temperatura ambiente, i prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele contenenti Hot Start DNA polimerasi (corsìe da 1 a 3 e da 5 a 7) risultano più intense rispetto a quelle ottenute con la semplice DNA polimerasi (corsie da 9 a 11). Inoltre, la Hot Start DNA polimerasi non porta alla formazione di dimeri di primers, al contrario dell’altra polimerasi. Per concludere, dopo 3 settimane di conservazione a 37°C, la Hot Start DNA polimerasi ha mantenuto la sua attività enzimatica (corsie 4 e 8), mentre la DNA polimerasi semplice no (corsia 12).
Pertanto, risulta chiaramente determinato che: 1) l’impiego di stabilizzanti à ̈ determinante per preservare l’attività enzimatica della DNA polimerasi durante il processo di liofilizzazione 2) la Hot Start DNA polimerasi à ̈ più adatta della normale DNA polimerasi per l’efficienza di amplificazione, ma non per il processo di liofilizzazione, in quanto entrambe le categorie di DNA polimerasi manifestano un comportamento simile, cioà ̈ necessitano di stabilizzanti per la liofilizazione . Infine, in questo esperimento, sono anche stati testati 2 differenti volumi prima del passaggio di liofilizzazione (25 e 9,1 Î1⁄4Ι) senza evidenziare alcun cambiamento nei risultati.
Esempio 2. Comparazione tra differenti Hot Start DNA polimerasi.
Nel seguente esperimento sono state preparate miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti Hot Start DNA polimerasi ottenute da 4 differenti aziende (W, X, R, Y), ciascuna in combinazione con i loro 4 tamponi di reazioni o con l'aggiunta di stabilizzanti quali NP-40, Tween 20 e saccarosio, per un numero totale di 19 combinazioni.
Nelle figure 3 e 4 , le corsie da 1 a 4, da 5 a 8, da 9 a 12 e da 13 a 19, rappresentano prodotti amplificati mediante PCR utilizzando miscele liofile pronte all’uso contenenti rispettivamente tamponi di reazione ottenuti dalle aziende W, X, R o Y. Nelle stesse figure, le corsie 1, 5, 9 e 13 corrispondono a prodotti di amplificazione ottenuti con miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda W; le corsie 2, 6, 10 , 14, 17, 18 e 19 corrispondono a prodotti di amplificazione ottenuti con miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda Y; le corsie 3, 7, 11 e 15, corrispondono a prodotti di amplificazione ottenuti con miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda X; le corsie 4, 8, 12 e 16 corrispondono a prodotti di amplificazione ottenuti con miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda R. Nelle figure 3 e 4, le corsie 17, 18 e 19 corrispondono a prodotti di amplificazione ottenuti con miscele liofilizzate e pronte all’uso contenenti anche rispettivamente 0,25% NP-40 e 0,25% Tween-20, 100 mM saccarosio e 0,25% NP-40, 0,25% Tween-20 e 100mM saccarosio.
I prodotti di PCR presentati in figura 3 sono stati amplificati mediante l’impiego di miscele liofilizzate e pronte all’uso subito dopo aver completato il protocollo di liofilizzazione. Al contrario, in figura 4 sono presentati i risultati delle stesse miscele conservate a temperatura ambiente per 6 settimane.
Come evidenziato in figura 3, le miscele contenenti il tampone di reazione dell’azienda X, controllate appena dopo la liofilizzazione, hanno mantenuto l’attività enzimatica di 3 su 4 polimerasi, mentre, per la quarta, l’attività à ̈ stata solo parzialmente mantenuta.
Le miscele preparate con il tampone di reazione delle aziende W o R hanno conservato l’attività di 1 su 4 polimerasi. Infine, in presenza di tampone di reazione ottenuto dall’azienda Y, non abbiamo osservato alcuna amplificazione corrispondente ai due frammenti attesi; solo in presenza di 100 mM saccarosio si può osservare una residua attività enzimatica. Inoltre, le miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, sono state conservate a temperatura ambiente per 6 settimane, prima di effettuare una amplificazione mediante PCR. Come mostrato in figura 4, solo le miscele liofilizzate preparate con il tampone di reazione dell’azienda X sono state in grado di conservare l’attività enzimatica di tre su quattro Hot Start DNA polimerasi utilizzate.
Tali risultati rinforzano l’importanza di includere uno stabilizzante nella miscela di reazione per PCR durante il processo di liofilizzazione al fine di preservare l’attività enzimatica delle polimerasi.
Esempio 3. Stabilità delle miscele liofilizzate e pronte all’uso per PCR, contenenti 250 mM saccarosio.
Al fine di valutare il miglioramento della stabilità delle miscele di reazione per PCR liofilizzate, à ̈ stato inizialmente valutato l’effetto della presenza di 250 mM saccarosio nel tampone di conservazione, nel tampone di reazione o in entrambi. Sono state valutate due differenti Hot Start DNA polimerasi ottenute da due differenti aziende.
Nelle figure 5 e 6, le corsie da 1 a 7 e le corsie da 8 a 21 rappresentano prodotti di amplificazione ottenuti con miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti, rispettivamente, Hot Start DNA polimerasi ottenute dalle aziende X o R. Nelle figure 5 e 6, le corsie 1 , 8 e 9 corrispondono a prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso preparate con il tampone di reazione dell’azienda X; le corsie 2 e 3 e le corsie da 14 a 17, corrispondono a prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso preparate con il tampone di reazione dell’azienda W; le corsie 4 e 5 e le corsie da 10 a 13, corrispondono a prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso preparate con il tampone di reazione dell’azienda R; le corsie 6 e 7 e le corsie da 18 a 21, corrispondono a prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso preparate con il tampone di reazione dell’azienda Y. Nelle figure 5 e 6, le corsie 3, 5, 7, 11, 15 e 19, rappresentano prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso preparate aggiungendo 250 mM saccarosio nel tampone di reazione; le corsie 9, 12, 16 e 20, rappresentano prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso preparate aggiungendo 250 mM saccarosio nel tampone di conservazione; le corsie 13, 17 e 21, rappresentano prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso preparate aggiungendo 250 mM saccarosio nel tampone di reazione ed in quello di conservazione.
I prodotti di amplificazione presentati in figura 5 sono stati amplificati con le miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso utilizzate subito dopo aver completato il processo di liofilizzazione mentre i risultati della figura 6 riproducono quelli della figura 5, ma dopo una conservazione delle miscele liofilizzate e pronte all’uso per 8 settimane a temperatura ambiente.
Come messo in risalto nella figura 5, la presenza di 250 mM saccarosio nel tampone di reazione e non in quello di conservazione à ̈ essenziale per mantenere l’attività enzimatica durante e dopo il processo di liofilizzazione. Dopo 8 settimane di conservazione a temperatura ambiente, solo nella metà dei casi (5 su 10) à ̈ possibile conservare una attività enzimatica (figura 6).
In conseguenza, si può concludere che il saccarosio ha una azione protettiva nei confronti dell’attività enzimatica, ma non à ̈ efficace per la conservazione a lungo termine.
Esempio 4. Stabilità delle miscele di reazione liofilizzate preparate con differenti sostanze stabilizzanti.
Al fine di comparare la stabilità termica delle miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti differenti stabilizzanti, sono stati impiegati elementi quali disaccaridi, polisaccaridi o carboidrati aggiungendoli nelle miscele di amplificazione preparate come descritto nell’introduzione.
Nelle figure 7 e 8, le corsie da 1 a 5 e le corsie da 6 a 10, rappresentano prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti, rispettivamente, Hot Start DNA polimerasi ottenute dalle aziende W o R. Nelle figure 7 e 8, le corsie 1 e 6, 2 e 7, 3 e 8, 4 e 9 e 5 e 10 corrispondono alle miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti rispettivamente: nessun stabilizzante, 200 mM trealosio, 250 mM saccarosio, 200 mM maltosio e 0,025% agarosio.
I prodotti di amplificazione mostrati nella figura 7 sono stati ottenuti con le miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso utilizzate subito dopo il completamento del processo di liofilizzazione mentre i risultati presentati in figura 8 riproducono quelli della figura 7 dopo una conservazione delle miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso a 37°C per una settimana.
E’ stata inizialmente valutata, impiegando due differenti Hot Start DNA polimerasi ottenute da due differenti aziende, la presenza nelle miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso di 250 mM saccarosio, 200 mM trealosio, 200 mM maltosio e 0,025% agarosio. Come evidenziato in figura 7, la presenza di trealosio, saccarosio e maltosio (corsie 2 e 7, 3 e 8 e 4 e 9 rispettivamente) nelle miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso, consente la conservazione dell’attività enzimatica di entrambi gli enzimi, anche se l’azione sembra essere meno efficace sull’enzima ottenuto dall’azienda R (corsie 7, 8 e 9); questo à ̈ particolarmente evidente per il saccarosio (corsia 8). Non si à ̈ evidenziata alcuna banda di amplificazione nel caso dell’agarosio (figura 7, corsie 5 e 10). Inoltre, le miscele liofilizzate e pronte all’uso, sono state conservate a 37°C per una settimana prima di essere processate mediante PCR. Le miscele liofilizzate contenenti 200 mM trealosio hanno mantenuto intatta l’attività enzimatica di entrambe le Hot Start DNA polimerasi (figura 8, corsie 2 e 7), mentre non l’hanno mantenuta quelle con 250 mM saccarosio e 0,025% agarosio (figura 8, corsie 3 e 8, 5 e 10 rispettivamente).
Il maltosio 200 mM ha mantenuto l’attività di una polimerasi (figura 8, corsia 9), ma solo parzialmente dell’altra (figura 8, corsia 4).
Successivamente à ̈ stata valutata sulle stesse due polimerasi l’azione di 250 mM trealosio, 6,6% destrosio, 200 mM cellobiosio (Fluka Analytical 22150 D-(+)-Cellobiose) e 6,6% amilopectina aggiunte nelle miscele di reazione prima di essere liofilizzate.
Nelle figure 9 e 10, la corsie da 1 a 5, e le corsie da 6 a 10, rappresentano i prodotti di amplificazione ottenuti con le miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso preparate con le Hot Start DNA polimerasi ottenute rispettivamente dalle aziende W o R. Nelle figure 9 e 10, le corsie 1 e 6, 2 e 7, 3 e 8, 4 e 9 e 5 e 10, corrispondono a miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti: nessun stabilizzante, 250 mM trealosio, 6,6% destrosio, 200 mM cellobiosio o 6,6% amilopectina, rispettivamente. I risultati della figura 9 corrispondono alle miscele liofilizzate processate subito dopo aver completato il processo di liofilizzazione, mentre i risultati presentati in figura 10 corrispondono a miscele di reazione con le stesse caratteristiche preparate contemporaneamente alle precedenti, ma conservate a 37°C per una settimana.
Come mostrato in figura 9, l’introduzione di trealosio e cellobiosio nelle miscele di reazione liofilizzate ha preservato l’attività enzimatica di entrambe le Hot Start DNA polimerasi (corsie 2 e 7, 4 e 9 rispettivamente), mentre il destrosio e l’amilopectina hanno protetto solo uno dei due enzimi (corsie 3 e 8, 5 e 10 rispettivamente). Inoltre, miscele di reazione con le stesse caratteristiche preparate contemporaneamente alle precedenti, sono state conservate per una settimana a 37°C prima di essere processate mediante PCR. Le miscele di reazione liofilizzate contenenti 250 mM trealosio e 200 mM cellobiosio come stabilizzanti, hanno protetto l’attività enzimatica di entrambe le polimerasi (figura 10, corsie 2 e 7, 4 e 9, rispettivamente), mentre 6,6% destrosio e 6,6% amilopectina non l’hanno preservata (figura 10, corsie 3 e 8, 5 e 10 rispettivamente).
Sono state ulteriormente valutate 0,5% albumina, 2% albumina, 3% lattosio senza ottenere risultati paragonabili a quelli ottenuti con trealosio e cellobiosio.
In conseguenza, Ã ̈ chiaramente dimostrato come solo il cellobiosio ed il trealosio forniscano protezione alle DNA polimerasi .
Esempio 5. Valutazione della concentrazione di cellobiosio ottimale per la stabilizzazione delle miscele liofilizzate.
Al fine di identificare la concentrazione di cellobiosio maggiormente efficace nella preservazione dell’attività enzimatica delle DNA polimerasi, sono state preparate miscele di reazione liofilizzate pronte all’uso, come descritto nell’introduzione, addizionate con concentrazioni crescenti di cellobiosio.
Le concentrazione analizzate partono da 0 fino a 700 mM cellobiosio.
Nelle figure 11 e 12, le corsie da 1 a 13 rappresentano prodotti di amplificazione ottenuti con miscele di reazione liofilizzate addizionate con cellobiosio ad una concentrazione di, rispettivamente: 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600 e 700 mM.
I prodotti di amplificazione della figura 11 sono stati ottenuti utilizzando le miscele di reazione liofilizzate subito dopo aver completato il processo di liofilizzazione, mentre i risultati della figura 12 corrispondono a miscele di reazione con le stesse caratteristiche preparate contemporaneamente alle precedenti, ma conservate a 37°C per due settimane.
Come mostrato nelle figure 11 e 12, la concentrazione di cellobiosio che meglio preserva l’attività enzimatica delle polimerasi si colloca nel range da 150 a 250 mM, anche dopo una conservazione a 37°C per una settimana (figura 12).
In conseguenza, à ̈ stato dimostrato che il cellobiosio fornisce la miglior stabilità a miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso nell’intervallo di concentrazioni tra 150 e 250 mM.
Esempio 6. Valutazione della stabilità nel tempo delle miscele liofilizzate e pronte all’uso contenenti trealosio o cellobiosio come stabilizzanti.
Al fine di identificare la stabilità nel tempo delle miscele liofilizzate e pronte all’uso contenenti trealosio o cellobiosio, sono state preparate miscele di reazione liofilizzate pronte all’uso, come descritto nell’introduzione, ma addizionate con 200 mM cellobiosio e 200 mM trealosio. Le miscele sono state liofilizzate prima di essere sottoposte ad amplificazione mediante PCR.
Nella figura 13, le corsie da 1 a 5, da 6 a 10, 11, da 12 a 16 corrispondono alle miscele addizionate con 100 mM cellobiosio, 200 mM cellobiosio, nessun stabilizzante e 200 mM trealosio rispettivamente.
I prodotti di amplificazione presentati in figura 13 sono stati ottenuti con le miscele di reazione liofilizzate subito dopo aver completato il processo di liofilizzazione, mentre i risultati della figura 14 corrispondono a miscele di reazione con le stesse caratteristiche preparate contemporaneamente alle precedenti, ma conservate a 37°C per due settimane.
Nella figura 14, le corsìe da 1 a 5, da 6 a 10, da 11 a 15 corrispondono alle miscele liofilizzate contenenti 100 mM cellobiosio, 200 mM cellobiosio o 200 mM trealosio rispettivamente. I prodotti di amplificazione mostrati in figura 15 sono stati ottenuti con le miscele di reazione liofilizzate conservate a 55°c rispettivamente a: 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore ed una settimana (corsie 1, 6 e 11; 2, 7 e 12; 3, 8 e 13; 4, 9 e 14; 5, 10 e 15 rispettivamente).
Nella figura 15, le corsie da 1 a 5 rappresentano il pattern elettroforetico su gel di agarosio di miscele di amplificazione liofilizzate e pronte all’uso, contenenti cellobiosio o trealosio, dopo una conservazione a 55°C per 24 ore (corsie 1 e 6), 48 ore (corsie 2 e 7), 72 ore (corsie 3 e 8), 96 ore o una settimana (corsie 5 e 10).
Le miscele liofile e pronte all’uso contengono tamponi di reazione e Hot Start DNA polimerasi ottenute dall’azienda R (corsie 1-10). M: marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†, Promega.
Prodotti di PCR: 268bp: frammento del gene della beta-globina umana; 240bp: frammento del gene del 18s RNA di Plasmodium spp..
In tutte le figure “M†corrisponde alla corsia del marcatore di pesi molecolari “BenchTop PCR Markers†dell’azienda Promega; i frammenti di tale marcatore variano da 50bp a 1000bp.
Come mostrato in figura 13, gli stabilizzanti presenti nelle miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso di questo esempio conservano ottimamente l’attività delle polimerasi. Le miscele di reazione liofilizzate sono anche state conservate a 37°C per una settimana prima di essere processate con PCR.
Anche dopo essere sottoposte a questo stress, le polimerasi presenti nelle miscele di reazione liofilizzate e pronte all’uso contenenti 200 mM cellobiosio (figura 14, corsie da 6 a 10), hanno mantenuto intatta la loro attività enzimatica, così come in quelle addizionate di 200 mM trealosio (figura 14, corsie da 11 a 15). Dopo due settimane di conservazione a 37°C, il 200 mM cellobiosio (figura 14, corsie da 6 a 10) ed il 200 mM trealosio (figura 14, corsie da 11 a 15) gli enzimi mantengono la loro attività.
Infine, miscele di reazione con le stesse caratteristiche e preparate contemporaneamente alle precedenti sono state conservate a 55°C per 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore ed una settimana (figura 15), e poi sottoposti ad amplificazione mediante PCR.
L’uso di trealosio come stabilizzante (figura 15, corsie da 6 a 10), riesce a proteggere l’attività enzimatica delle Hot Start polimerasi, anche dopo stress a 55°C. Trattamenti prolungati a 55°C (48 ore, 72 e 96 ore) danneggiano parzialmente l’attività dell’enzima (figura 15, corsie 2,3 e 4 rispettivamente).
Tuttavia, le miscele liofilizzate e pronte all’uso contenenti 200 mM cellobiosio hanno la stessa stabilità di miscele contenenti 200 mM trealosio. Possiamo pertanto asserire che il cellobiosio, come stabilizzante, ha le stesse proprietà del trealosio, anche se rispetto ad esso presenta i vantaggi sopra ricordati tra i quali che viene prodotto attraverso un sistema di idrolisi enzimatica a partire da cellulosa, molecola costituita da lunghe catene di glucosio (zucchero) di origine vegetale. L’origine vegetale garantisce l’assenza di possibili contaminanti di acidi nucleici provenienti da contaminazioni batteriche sempre possibili quando, come nel caso del trealosio, la produzione passa attraverso l’impiego di colture batteriche per la sintesi dello stesso.
Esempio 7. Impiego dello stabilizzante cellobiosio per la costituzione di miscele pronte all’uso per kit diagnostici nel settore della parassitologia. Il cellobiosio à ̈ stato utilizzato come stabilizzante dell’enzima DNA polimerasi Hot Start nella preparazione di miscele pronte all’uso e liofile idonee per la costituzione di kit diagnostici nel settore della parassitologia.
In particolare à ̈ stata predisposta per ognuno dei parassiti indagati una miscela di reazione finale contenente:
10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 50 mM KCI, 0,25 Î1⁄4Îœ primer forward, 0,25 Î1⁄4Îœ primer reverse, 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCI2e 2 Unità di Taq Polimerasi.
Gli inneschi o primers per il Plasmodium (una coppia per ciascuna delle specie falciparum, malariae, vivax e ovale) sono stati disegnati nella regione conservata 18sRNA. I primers per Leishmania sono stati disegnati nelle regione conservata 18sRNA. I primers per il Toxoplasma sono stati disegnati nella regione altamente ripetitiva HRE.
Tutte le miscele preparate contengono un controllo interno corrispondente ad una coppia di primers disegnati nelle sequenze del gene della beta globina umana. Ciascun primer, nelle diverse configurazioni, à ̈ fornito con concentrazione pari a 0,25 Î1⁄4Îœ.

Claims (15)

  1. RIVENDICAZIONI 1.Una miscela essiccata o liofilizzata comprendente: un enzima di polimerizzazione degli acidi nucleici e cellobioso e caratterizzata dal fatto che l’enzima à ̈ stabile.
  2. 2. La miscela secondo la rivendicazione 1 dove tale enzima di polimerizzazione degli acidi nucleici à ̈ una DNA polimerasi.
  3. 3. La miscela secondo le rivendicazioni 1-2 dove tale DNA polimerasi à ̈ selezionata nel gruppo consistente di: Taq Polimerasi, Hot Start polimerasi o loro frammenti attivi.
  4. 4. La miscela secondo le rivendicazioni 1-3 comprendente inoltre almeno uno dei seguenti sali: KCI, MgCI2, Tris HCI.
  5. 5. La miscela secondo le rivendicazioni 1-4 comprendente inoltre uno o più dei seguenti componenti (i-iv): i. inneschi di polimerizzazione specifici per un DNA bersaglio, dNTPs, ed opzionalmente almeno una sonda, anche marcata, ii. un DNA stampo di controllo, inneschi specifici per l'amplificazione di tale DNA controllo ed opzionalmente almeno una sonda per tale controllo, anche marcata, iii. ulteriori stabilizzanti selezionati nel gruppo consistente di: surfattanti e/o zuccheri non riducenti Triton-X100, NP40, Tween-20, saccarosio, maltosio, trealosio; iv. agenti riducenti selezionati nel gruppo consistente di: βmercaptoetanolo, DTT.
  6. 6. Un metodo per la preparazione di una miscela secondo le rivendicazioni 1-5 che comprende le seguenti fasi: a) aggiunta di cellobioso in concentrazione finale compresa tra 50 e 500 mM, preferibilmente tra 150 e 250 mM, ad una soluzione contenente una DNA polimerasi, o viceversa; b) opzionalmente, distribuzione della miscela, anche automaticamente, in aliquote e/o in contenitori adatti, c) liofilizzazione o essiccazione.
  7. 7. Il metodo secondo la rivendicazione 6 comprendente l'aggiunta al punto a) di sali selezionati nel gruppo di: KCI, MgCI2, Tris-HCI e di almeno uno dei seguenti reagenti: i. inneschi di polimerizzazione specifici per un DNA bersaglio presente in un campione, dNTPs, ed opzionalmente almeno una sonda, anche marcata, ii. un DNA stampo di controllo, inneschi specifici per l'amplificazione di tale DNA controllo ed opzionalmente almeno una sonda per tale controllo, anche marcata, iii. ulteriori stabilizzanti selezionati nel gruppo consistente di: surfattanti e/o zuccheri non riducenti Triton-X100, NP40, Tween-20, saccarosio, maltosio, trealosio, iv. agenti riducenti selezionati nel gruppo consistente di: βmercaptoetanolo, DTT.
  8. 8. Il metodo secondo le rivendicazioni 6-7 comprendente inoltre un passaggio di conservazione d) a temperatura inferiore a 40<D>C, o preferibilmente a temperatura ambiente.
  9. 9. Il metodo secondo le rivendicazioni 6-8 dove la DNA polimerasi à ̈ selezionata nel gruppo consistente di: Taq Polimerasi, Hot Start polimerasi o loro frammenti attivi.
  10. 10. Contenitore (tubo, provetta o micropiastra multipozzetto) comprendente la miscela secondo le rivendicazioni 1-5.
  11. 11. Contenitore secondo la rivendicazione 10, dove la miscela di reazione PCR à ̈ pronta per l’uso all'aggiunta del campione di DNA.
  12. 12. Kit per l’amplificazione a catena mediante PCR di un campione di DNA comprendente la miscela secondo le rivendicazioni 1-5 oppure un contenitore per la miscela secondo le rivendicazioni 10-11 ed opzionalmente istruzioni per la ricostituzione e l’uso dell’enzima in una reazione di polimerizzazione a catena.
  13. 13. Kit per la liofilizzazione e la conservazione di una polimerasi degli acidi nucleici comprendente una confezione di uno o più dei seguenti prodotti, a loro volta presenti in un contenitore: cellobioso pronto per la diluizione ad una concentrazione finale compresa tra 50 e 500 mM, una polimerasi dove tale polimerasi à ̈ una DNA polimerasi, ancor più preferibilmente una Taq polimerasi o preferibilmente una Hot Start polimerasi, sali scelti tra: KCI, MgCI2, Tris-HCI ed opzionalmente almeno uno dei seguenti reagenti: - dNTPs, - un opportuno tampone di reazione per la reazione di amplificazione del DNA a catena - inneschi di polimerizzazione specifici per un DNA stampo presente in un campione ed opzionalmente una sonda anche marcata, per il DNA stampo del campione, - un DNA stampo di controllo, inneschi specifici per l'amplificazione di tale DNA controllo ed opzionalmente una sonda anche marcata per tale controllo, - ulteriori stabilizzanti selezionati nel gruppo consistente di: surfattanti e/o zuccheri non riducenti Triton-X100, NP40, Tween-20, saccarosio, maltosio, trealosio, agenti riducenti selezionati nel gruppo consistente di: β-mercaptoetanolo, DTT.
  14. 14.Uso del cellobioso per la liofilizzazione e la conservazione a lungo termine di una DNA polimerasi.
  15. 15. Uso secondo la rivendicazione 14 in un sistema di amplificazione del DNA mediante polimerizzazione a catena per scopi diagnostici. (SM/lm)
ITMI2009A000877A 2009-05-19 2009-05-19 Uso di uno stabilizzante delle polimerasi per la liofilizzazione e la preparazione di kit pronti per l'uso IT1394539B1 (it)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITMI2009A000877A IT1394539B1 (it) 2009-05-19 2009-05-19 Uso di uno stabilizzante delle polimerasi per la liofilizzazione e la preparazione di kit pronti per l'uso
CN2010800195495A CN102414315A (zh) 2009-05-19 2010-05-19 用于分子生物学应用的包含核酸聚合酶的干燥和稳定的即用组合物
PL10724727T PL2432873T3 (pl) 2009-05-19 2010-05-19 Suszona i stabilizowana kompozycja gotowa do użycia zawierająca enzymy do polimeryzacji kwasu nukleinowego do zastosowań biologii molekularnej
PCT/EP2010/056877 WO2010133628A1 (en) 2009-05-19 2010-05-19 A dried and stabilized ready-to-use composition containing nucleic acid polymerization enzymes for molecular biology applications
ES10724727.2T ES2478890T3 (es) 2009-05-19 2010-05-19 Composición lista para usar seca y estabilizada que contiene enzimas de polimerización de ácidos nucleicos para aplicaciones en biología molecular
PT107247272T PT2432873E (pt) 2009-05-19 2010-05-19 Composição seca e estabilizada pronta a usar contendo enzimas de polimerização de ácido nucleico para aplicações em biologia molecular
EP10724727.2A EP2432873B1 (en) 2009-05-19 2010-05-19 A dried and stabilized ready-to-use composition containing nucleic acid polymerization enzymes for molecular biology applications
JP2012511278A JP2012527226A (ja) 2009-05-19 2010-05-19 分子生物学的用途のための、核酸重合酵素を含有してなる、乾燥及び安定化したすぐ使用できる組成物
AU2010251184A AU2010251184B2 (en) 2009-05-19 2010-05-19 A dried and stabilized ready-to-use composition containing nucleic acid polymerization enzymes for molecular biology applications
BRPI1014980A BRPI1014980A2 (pt) 2009-05-19 2010-05-19 composição seca e estabilizada, pronta para uso, contendo enzimas de polimerização de ácido nucléico para aplicações de biologia molecular
US13/318,835 US9273303B2 (en) 2009-05-19 2010-05-19 Dried and stabilized ready-to-use composition containing nucleic acid polymerization enzymes for molecular biology applications
CA2761059A CA2761059C (en) 2009-05-19 2010-05-19 A dried and stabilized ready-to-use composition containing nucleic acid polymerization enzymes for molecular biology applications
KR1020117026117A KR20120042727A (ko) 2009-05-19 2010-05-19 분자생물학 적용을 위한 핵산 중합 효소를 포함하는 건조되고 안정화된 즉시사용가능한 조성물
MX2011011616A MX2011011616A (es) 2009-05-19 2010-05-19 Composicion seca y estabilizada lista para el uso que contiene enzimas de polimerizacion de acido nucleico para aplicaciones de biologia molecular.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITMI2009A000877A IT1394539B1 (it) 2009-05-19 2009-05-19 Uso di uno stabilizzante delle polimerasi per la liofilizzazione e la preparazione di kit pronti per l'uso

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ITMI20090877A1 true ITMI20090877A1 (it) 2010-11-20
IT1394539B1 IT1394539B1 (it) 2012-07-05

Family

ID=41527695

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ITMI2009A000877A IT1394539B1 (it) 2009-05-19 2009-05-19 Uso di uno stabilizzante delle polimerasi per la liofilizzazione e la preparazione di kit pronti per l'uso

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9273303B2 (it)
EP (1) EP2432873B1 (it)
JP (1) JP2012527226A (it)
KR (1) KR20120042727A (it)
CN (1) CN102414315A (it)
AU (1) AU2010251184B2 (it)
BR (1) BRPI1014980A2 (it)
CA (1) CA2761059C (it)
ES (1) ES2478890T3 (it)
IT (1) IT1394539B1 (it)
MX (1) MX2011011616A (it)
PL (1) PL2432873T3 (it)
PT (1) PT2432873E (it)
WO (1) WO2010133628A1 (it)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014042150A1 (ja) * 2012-09-13 2014-03-20 深江化成株式会社 保存方法及び保存容器
CN103849548A (zh) * 2012-12-03 2014-06-11 三星电子株式会社 用于扩增核酸的试剂容器及其制备方法、存储试剂的方法和用于核酸分析的微流体系统
US9309501B2 (en) 2012-12-24 2016-04-12 Industrial Technology Research Institute Isolated DNA polymerases, kits and applications thereof
EP3194629A4 (en) * 2014-09-17 2018-03-07 Theranos, Inc. Diagnostic methods and compositions
US9856524B2 (en) * 2014-12-04 2018-01-02 Shaofeng Ding Lyophilized integrated composition for storage and manipulation of pyrophosphorolysis activated polymerization
US9868944B2 (en) * 2014-12-19 2018-01-16 Roche Molecular Systems, Inc. Reaction mixtures
WO2016129951A1 (en) * 2015-02-13 2016-08-18 Seegene, Inc. Method for lyophilization of composition for multilple target nucleic acid sequence amplification reaction
JP2022060807A (ja) * 2020-10-05 2022-04-15 キヤノンメディカルシステムズ株式会社 乾燥試薬、試薬キット、乾燥試薬の製造方法、分析方法及び核酸増幅方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5834254A (en) * 1995-02-10 1998-11-10 Gen-Probe Incorporated Stabilized enzyme compositions for nucleic acid amplification
US20040182719A1 (en) * 2001-08-24 2004-09-23 Purvis Duncan Ross Methods for producing highly sensitive potentiometric sensors

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1230300A (en) * 1983-06-06 1987-12-15 Michael K. Hoskins Stabilized isoenzyme control product
US4806343A (en) 1986-03-13 1989-02-21 University Of Southwestern Louisiana Cryogenic protectant for proteins
CA1338457C (en) 1986-08-22 1996-07-16 Henry A. Erlich Purified thermostable enzyme
GB8826429D0 (en) * 1988-11-11 1988-12-14 Univ Leeds Ind Service Ltd Enzyme stabilisation systems
US5593824A (en) * 1994-09-02 1997-01-14 Pharmacia Biotech, Inc. Biological reagent spheres
CN1335395A (zh) * 2001-09-04 2002-02-13 湖南尤特尔生化有限公司 高活性纤维素酶组合物及其制备方法
US7407747B2 (en) * 2002-10-15 2008-08-05 Applera Corporation Method for drying dye-terminator sequencing reagents
US20060099567A1 (en) 2004-04-08 2006-05-11 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
AU2006227965B2 (en) * 2005-03-15 2013-01-31 Bp Corporation North America Inc. Cellulases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2007028611A2 (en) * 2005-09-09 2007-03-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for biomass production using a microorganism with a disrupted glucose-dehydrogenase gene (gms 01)

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5834254A (en) * 1995-02-10 1998-11-10 Gen-Probe Incorporated Stabilized enzyme compositions for nucleic acid amplification
US20040182719A1 (en) * 2001-08-24 2004-09-23 Purvis Duncan Ross Methods for producing highly sensitive potentiometric sensors

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
REDWAY K F AND LAPAGE S P ET AL: "Effect of Carbohydrates and Related Compounds on the Long-Term Preservation of Freeze-Dried Bacteria", CRYOBIOLOGY, ACADEMIC PRESS INC, US, vol. 11, 1 January 1974 (1974-01-01), pages 73 - 79, XP002991568, ISSN: 0011-2240 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2432873B1 (en) 2014-04-23
AU2010251184B2 (en) 2014-05-29
CN102414315A (zh) 2012-04-11
JP2012527226A (ja) 2012-11-08
KR20120042727A (ko) 2012-05-03
AU2010251184A1 (en) 2011-11-24
AU2010251184A2 (en) 2011-12-01
EP2432873A1 (en) 2012-03-28
WO2010133628A1 (en) 2010-11-25
US20120064536A1 (en) 2012-03-15
US9273303B2 (en) 2016-03-01
BRPI1014980A2 (pt) 2015-10-27
IT1394539B1 (it) 2012-07-05
CA2761059A1 (en) 2010-11-25
ES2478890T3 (es) 2014-07-23
CA2761059C (en) 2018-10-30
PL2432873T3 (pl) 2014-10-31
MX2011011616A (es) 2012-01-12
PT2432873E (pt) 2014-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ITMI20090877A1 (it) Uso di uno stabilizzante delle polimerasi per la liofilizzazione e la preparazione di kit pronti per l&#39;uso
Mitchell et al. Ice-recrystallization inhibiting polymers protect proteins against freeze-stress and enable glycerol-free cryostorage
US11649512B2 (en) Freeze-dried composition
US20100196904A1 (en) Ambient temperature stable kits for molecular diagnostics
WO2014055936A1 (en) Preservation of biological materials in non-aqueous fluid media
US20140113294A1 (en) Direct nucleic acid amplification kit, reagent and method
JP2010142229A (ja) 反応化合物と安定化ポリメラーゼの乾燥組成物
JP5608998B2 (ja) 保存安定性に優れた核酸増幅検出試薬キット
KR102624588B1 (ko) 플랩 엔도뉴클레아제를 함유하는 건조 조성물
CA3123402A1 (en) Matrices and methods for storage and stabilization of biological samples comprising viral rna
JP5608997B2 (ja) 保存安定性に優れた核酸増幅検出試薬キット
KR20140110138A (ko) 교차오염 억제용 ｕｄｇ를 함유한 중합효소연쇄반응액의 동결건조물
US20110250598A1 (en) Detergent free polymerases
WO2023142130A1 (zh) 改进的酶小球在目标核酸检测中的应用
JP2008079506A (ja) ポリメラーゼ反応安定剤
WO2009113070A1 (en) Freeze-free method for storage of polypeptides