JP2008079506A - ポリメラーゼ反応安定剤 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明では、ポリメラーゼ反応安定剤を提供することで、ポリメラーゼ反応組成物の安定性を向上させ、シークエンスやポリメラーゼ連鎖反応の結果の信頼度が向上させることを課題とした。
【解決手段】ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質を有効成分として含有することを特徴とするポリメラーゼ反応安定剤と、そのポリメラーゼ反応安定剤を含む反応溶液中でポリメラーゼによる複製反応を行う方法を提供する。
【選択図】 図２

Description

本発明は、ポリメラーゼ反応の安定剤と、その安定剤を用いたポリメラーゼ反応、ポリメラーゼ反応組成物の保存方法に関する。

近年、ポリメラーゼによる複製反応を利用した遺伝子配列の解読（シーケンシング）や核酸増幅（ポリメラーゼ連鎖反応、以下ＰＣＲと称することがある）は生化学、分子生物学および臨床病理分野における研究、検査において必須の技術の一つとなっている。

それらの反応に用いられる組成物の安定性を、保存期間中も維持することは重要である。組成物の中でも特にポリメラーゼは保存に細心の注意を払う必要がある。ポリメラーゼは、複数のアミノ酸がペプチド結合により連なったポリペプチドである。ポリメラーゼがその特性を発現させるためには、ポリメラーゼ固有の三次構造（立体構造）が重要である。しかし、ポリメラーゼの多くは、生体から抽出した状態では不安定で失活し易く、乾燥、高温、凍結、圧力、ｐＨ変化、濃度変化、有機溶剤の添加等の環境的ストレスを加えると、その立体構造が変化し、その特性・活性を不可逆的に消失してしまうことが多い。このような環境変化に対して、ポリメラーゼをいかに安定な状態に保つかが、ポリメラーセを扱う上で、常に課題となる。このような問題点の解決策としては、緩衝溶液中で常に所定の温度にして保存したり、特許文献１に示すようにジオール類やグリセリン等の２価又は３価アルコールを活性安定化剤に用いて保存したりする方法が知られている。しかし、繰り返し凍結融解を繰り返すと失活する問題点がある。

また、一般的に酵素は凍結乾燥した形態で供給されることが多く、凍結乾燥時の酵素の失活、変性を防止する方法について様々な研究がなされている。例えば、グルタミン酸ソーダ、アルブミン、スキムミルク等のアミノ酸又はタンパク質、シュクロース、マルトース等の糖類、グルタチオン、メルカプトエタノール等の還元剤、グリセロール、ソルビトールなどの多価アルコールを添加する方法が一般に知られている。しかしながら、これらの方法は欠点を有する。凍結乾燥では水が除かれるため、再溶解時に、その品質が使用者による試薬の希釈および再構成にゆだねられることとなる。凍結乾燥した酵素試薬の他の欠点としては、凍結乾燥する間の可変性で、不可逆的な不活性化が生じやすい。加えて、凍結乾燥した酵素調製物は、一担再溶解したら安定性は比較的短い。

一部の市販酵素は、高濃度のグリセリン等を共存させて酵素溶液の凝固温度を下げ、例えば−３０℃のような低温下でも凍結しない形態で供給されている。これは凍結による酵素の失活を回避しながら酵素を安定性に有利な低温に保つ方法としては有効であるが、保存形態すなわち高濃度のグリセリン等の存在下では酵素反応が阻害されるため、反応に使用する際に大幅な希釈が必要であり、希釈が酵素の失活を引き起こすため問題である。

ポリメラーセの基質として、リボヌクレオシド三リン酸、デオキシリボヌクレオシド三リン酸およびジデオキシリボヌクレオシド三リン酸等のヌクレオシド三リン酸(NTP)などがある。用途の多くは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)、サイクルシークエンス法およびニックトランスレーション等のＤＮＡおよびＲＮＡを合成または複製する反応 に関与する。デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)の最も重要な用途の一つは、ポリメラーゼ 連鎖反応 (PCR)における使用である。この用途では、とりわけ保存の際にNTP溶液が安定であることが絶対的に必要である。dNTP(特にdATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP)は、通常Na塩またはLi塩として典型的には0.1mol/lの濃度で保存され、この状態で市販されている。通常pH値は生理学的なpH値、即ち約7.0〜7.5である。

現在の（即ち、市販の）NTP溶液の欠点は、特に、保存または温度ストレス時のNTPの不安定性にある。NTPには、時間の経過とともに分解して対応の二リン酸エステルと一リン酸エステルを形成する傾向がある。そのため、dNTP を保存は困難である。
プライマーなどのオリゴヌクレオチドも凍結保存が推奨されるが、凍結融解の繰り返しは品質を劣化させる。必要に応じて容量分を小分けにして凍結保存し、そのストックを実験を行うことが推奨されている。
特開昭５５−８４３９７号公報

従来、ポリメラーゼを利用した複製反応や連鎖反応に利用される組成物の保存安定性を高めたり、それらの組成物を混合して保存したりすることは困難であった。本発明では、ポリメラーゼ反応安定剤を提供することで、ポリメラーゼ反応組成物の安定性を向上させ、シークエンスやポリメラーゼ連鎖反応の結果の信頼度が向上させることを課題とした。

本発明者は鋭意検討を重ねた結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。

すなわち本発明は、以下の構成からなる。
１．ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質を有効成分として含有することを特徴とするポリメラーゼ反応安定剤。
２． ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質がＤｎａＫ，Ｓｓａ１ｐ，Ｓｓｃ１ｐ，Ｋａｒ２ｐ，ＨＳＰ７０，Ｂｉｐ，ｍＨｓｐ７０およびＨＳＣ７０から選択されることを特徴とする１のポリメラーゼ反応安定剤。
３．ＨＳＰ７０ファミリータンパク質の基質結合ドメインを用いることを特徴とする１又は２のポリメラーゼ反応安定剤。
４．ＤｎａＫタンパク質由来のタンパク質を用いることを特徴とする１〜３のいずれかのポリメラーゼ反応安定剤。
５．ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする１〜４のいずれかのポリメラーゼ反応安定剤。
６．ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする１〜５のいずれかのポリメラーゼ反応安定剤。
７．ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする１〜６のいずれかのポリメラーゼ反応安定剤。
８．ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることを特徴とする１〜７のいずれかのポリメラーゼ反応安定剤。
９．ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したタンパク質を用いることを特徴とする１〜８のいずれかのポリメラーゼ反応安定剤。
１０．ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いることを特徴とする１〜９のいずれかのポリメラーゼ反応安定剤。
１１．ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いることを特徴とする１〜１０のいずれかのポリメラーゼ反応安定剤。
１２．試料中の標的ＤＮＡ分子の複製を行う方法であって、１〜１１のいずれかのポリメラーゼ反応安定剤を含む反応溶液中で、ポリメラーゼによる複製反応を行うことを特徴とする方法。
１３．試料中の標的ＤＮＡ分子の核酸増幅反応を行う方法であって、１〜１１のいずれかのポリメラーゼ反応安定剤を含む反応溶液中で、ポリメラーゼ連鎖反応を行うことを特徴とする方法。
１４．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、１〜１１のいずれかのポリメラーゼ反応安定剤を混合することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ保存方法。
１５．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、請求項１〜１１のいずれかに記載のポリメラーゼ反応安定剤を混合し、さらに凍結させることを特徴とする１４の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ保存方法。
１６．保存中の溶液における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの濃度が、ポリメラーゼ連鎖反応を行う際の１〜５倍であることを特徴とする１４または１５の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ保存方法。

本発明の、ポリメラーゼ反応安定剤により、ポリメラーゼ反応に供される組成物が安定に保存できるため、ポリメラーゼ反応が安定し、シーケンシングやポリメラーゼ連鎖反応の結果の信頼度が向上する。

本発明の「ポリメラーゼ反応安定剤」とは、ポリメラーゼ反応に用いられるポリメラーゼ反応組成物を安定に保存できる安定剤のことである。本発明の「ポリメラーゼ反応安定剤」は、これらのポリメラーゼ反応組成物を安定な状態に保存出来るので、ポリメラーゼ反応組成物の劣化を低減でき、ポリメラーゼ反応を安定化出来る効果がある。本願発明のポリメラーゼ反応安定剤は、ポリメラーゼ反応組成物保存安定剤でもあり、ポリメラーゼ保存安定剤、耐熱性ポリメラーゼ保存安定剤を含有する。

本発明で安定化できる「ポリメラーゼ反応組成物」とは、標的核酸、酵素、緩衝剤、金属イオン、ポリメラーゼ基質、プライマーなどのことをいう。これらのポリメラーゼ反応組成物は混合された状態であっても良いし、必要により分割された状態であっても良い。例えば、それぞれの構成要素ごとに分割し、本発明のポリメラーゼ反応安定剤と混合し安定化させても良いし、いくつかの構成要素ごとに混合し安定化させても良い。例えば、酵素、緩衝剤、金属イオン、ポリメラーゼ基質及びプライマーとポリメラーゼ反応安定剤を混合し保存しておき、その他の構成要素、例えば標的核酸をポリメラーゼ反応時に混合してもよい。ポリメラーゼ反応組成物としては、上記に標的核酸、酵素、緩衝剤、金属イオン、プライマーなどを例示したが、本発明はこれらに限定されない。本発明の効果を損なわない範囲であれば、他の組成物が存在していても構わない。他の組成物として、界面活性剤などがあげられる。また、必要に応じて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体が含まれていてもよい。抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。

本発明の「ポリメラーゼ反応」とは、ポリメラーゼを利用した複製反応や連鎖反応を示す。複製反応の代表的なものはシーケンシング、連鎖反応の代表的なものはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。本発明のポリメラーゼ反応安定剤は、特にＰＣＲに用いられるポリメラーゼ反応組成物に有効である。臨床検査用途では安定した結果が求められるので、本発明の「ポリメラーゼ反応安定剤」は優れた効果を発揮できる。

「標的核酸」は、検体からの核酸抽出物であっても良いが、ポジティブコントロールやネガティブコントロールなどに用いられる核酸であっても良い。また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどであっても良い。
標的核酸は、例えば、バクテリア、動物または植物組織、個体細胞由来の溶解物などのあらゆる材料から調製することができる。該試料溶液の調製法は特に限定されないが、例えば、患者の血液、組織から、既知の方法により調製してもよい。代表的なものとして、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ 第７２巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第７巻、第１５１３〜１５２３頁、１９７９年）等の液相で行う方法がある。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ 第７６−２巻、第６１５〜６１９頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。その他の方法としてはシリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 第２８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特開平２−２８９５９６号公報）が挙げられる。
また、市販のＤＮＡ合成機などを使って、通常使用される方法によりポジティブコントロールやネガティブコントロール用の標的核酸を作製しても良い。

「酵素」とは、ポリメラーゼであれば、特に限定されない。たとえば、PolＩ型ＤＮＡポリメラーゼであってもよいし、α型と呼ばれるＤＮＡポリメラーゼであってもよい。ＰＣＲに用いられる耐熱性ポリメラーゼであってもよく、例示するならば、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、TliまたはVENTポリメラーゼ、PfuまたはDEEPVENTポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tfl/Tubポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、DYNAZYMEポリメラーゼ、Tneポリメラーゼ、Tmaポリメラーゼ、Tspポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなどがあげられる。また、これらの酵素のうち、複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するものであってもよい。さらに、複数種類のＤＮＡポリメラーゼを混合して用いることもできる。本発明のポリメラーゼ反応安定剤と混合されるＤＮＡポリメラーゼ濃度は、好ましくは0.1〜100ユニット/ｍｌの濃度で、さらに好ましくは、1〜50ユニット/ｍｌ、特に好ましくは5〜30ユニット/ｍｌがよいが特に限定はされない。本発明のポリメラーゼ反応安定剤は、これらの酵素の保存安定性を高める効果がある。特に、耐熱性ポリメラーゼでなくともよい。

「緩衝剤」としては、それぞれのポリメラーゼの特性に合わせて最適な緩衝剤を選択すればよい。たとえば、緩衝液としては、トリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが用いられるが、具体的には、１０〜２００mMの各種バッファー（ｐＨ７．５〜９（at 25℃））が例示できる。好ましくはトリスがよい。より好ましいｐＨは、８〜９がよい。

「金属イオン」としては、２価金属イオンおよび／または１価金属イオンであればよい。マグネシウムイオンやマンガンイオンのような２価のイオンの濃度は、反応段階で０．５〜２ｍＭ、及び例えばナトリウムイオン及び／又はカリウムイオンのような１価のイオンの濃度は、反応の段階で１０〜１００ｍＭ程度となるようにすればよい。

「ポリメラーゼ基質」とは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸であり、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰなどでよく、これらの混合物であるｄＮＴＰであってもよい。これらの濃度は特に限定されないが、反応段階で個々の基質が０．０１〜２ｍＭ、好ましくは０．０５〜１ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜０．５ｍＭがよい。また、シーケンシングなどに用いるために、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸であるｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＵＴＰなどが適宜含まれていてもよい。

「プライマー」は、ポリメラーセによる複製のトリガーとなる性質を有していれば特に限定はされないし、通常のオリゴヌクレオチドであっても良い。オリゴヌクレオチドは、例えば、市販のＤＮＡシンセサイザーを用いて、ホスホアミダイト法にて、合成することが出来る。合成はマニュアルに従い合成し、オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃で一夜実施すればよい。オリゴヌクレオチドの精製はＯＰＣカラムなどを用いて行えばよい。もしくはＤＮＡ合成受託会社に依頼してもよい。
プライマーの濃度は、０．０１〜５００ｎｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは０．０５〜５０ｎｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜１０ｎｍｏｌ／ｍｌ程度である。

本発明の「ポリメラーゼ反応安定剤」は、ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質を有効成分として含有することを特徴としている。ポリメラーゼ反応安定剤は、ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質以外に、ポリメラーゼ反応に影響を及ぼさない範囲で、他の安定化剤を含んでいても良い。例えば、アミノ酸又はタンパク質、糖類、還元剤多価アルコールなどを含んでいても良い。例えば、アミノ酸又はタンパク質としては、グルタミン酸ソーダ、アルブミン、スキムミルク等、糖としてはシュクロース、マルトース等、還元剤としてはグルタチオン、メルカプトエタノール等、多価アルコールとしてはグリセロール、ソルビトールなどが含まれていても良い。また、界面活性剤などが含まれていても良い。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤がよく、好ましくＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０などが例示される。界面活性剤は、反応段階、すなわち、ポリメラーゼ反応時に、０．０００１〜１％になるように含まれていてもよく、好ましくは０．００１〜０．１％がよい。

本発明の「ポリメラーゼ反応安定剤」は、分子シャペロンとして知られているＤｎａＫ，Ｓｓａ１ｐ，Ｓｓｃ１ｐ，Ｋａｒ２ｐ，ＨＳＰ７０，Ｂｉｐ，ｍＨｓｐ７０およびＨＳＣ７０などから構成される、いわゆる「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を用いるポリメラーゼ反応安定剤に関する。

なかでも、大腸菌のヒートショックタンパク質の一種であるＨＳＰ７０（ＤｎａＫ）の基質結合ドメインが好適に用いられる。このタンパク質は６３８アミノ酸から構成され、１〜３８５番目のアミノ酸より構成される「ＡＴＰａｓｅ（ＡＴＰ結合）ドメイン」と３８６〜６３８番目のアミノ酸より構成される「基質結合ドメイン」からなっている（図１）。配列番号１にＤｎａＫのタンパク質の配列を示す。このタンパク質（ＤｎａＫ３８４−６０７）は、既にＮＭＲ解析で構造が明らかとなっており、２つの構造的な領域（ドメイン）、すなわちＮ末端側のβシート領域（ドメイン）とＣ末端側のαへリックス領域（ドメイン）からなっていることが分かっている。また、配列のＮ末端側の親水／疎水率が０．５であり、Ｃ末端側では０．８９で、その差は０．３９と高い値を示すことが計算によって明らかにされた。このタンパク質（ＤｎａＫ３８４−６０７）がポリメラーゼ反応組成物の安定能向上に際して有用なものである。

本発明では、ＨＳＰ７０ファミリータンパク質由来のタンパク質が好ましく用いられ、更に好ましくは大腸菌のＤｎａＫタンパク質由来のタンパク質が用いられる。また、好ましくは、ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質の基質結合ドメインが好ましく用いられ、更に好ましくは大腸菌のＡＴＰａｓｅドメインを除去したＤｎａＫタンパク質の基質結合ドメインが用いられる。

本発明に用いるＨＳＰ７０ファミリーに属するタンパク質としては、特に指定はないが、大腸菌のＤｎａＫ、酵母細胞質に存在する Ｓｓａ１ｐ、酵母ミトコンドリアに存在する Ｓｓｃ１ｐ、酵母小胞体に存在するＫａｒ２ｐ、哺乳類細胞質に存在するＨＳＰ７０，哺乳類小胞体に存在する Ｂｉｐ、哺乳類ミトコンドリアに存在する ｍＨｓｐ７０ および熱ショックの有無に関わらず恒常的に発現しているＨＳＰ７０のホモログであるＨＳＣ７０などから選択される。ＨＳＰ７０ファミリーには数多くのホモログが知られており、上に挙げたものはそのうちの一部であり、上に列挙した以外のホモログにも同様の効果が期待できることは容易に予想可能である。

また、ＤｎａＫのβシート構造部分に変異を加えて、βシート部分の疎水性を向上させることにより、ポリメラーゼ反応組成物の安定能のより優れたタンパク質を得ることができる。すなわち、（１）βシートのＮ末端の一部を除去することで、βシートのより疎水的な部分を露出させる（βシート構造を破壊して疎水性を向上させる）、（２）βシート上の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する、というものである。その結果、βシート構造のＮ末端部分を除去したＤｎａＫ４１９−６０７と、βシート上の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したＤｎａＫ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ，Ｄ４８１Ｖ）にポリメラーゼ反応組成物の安定能の顕著な向上を認めることができる。特に、ＤｎａＫ ４１９−６０７に顕著なポリメラーゼ反応組成物の安定能の向上を認めることが出来る。すなわち、疎水性ドメインの構造が変化することで、疎水性ドメインの疎水性が変化し、疎水性ドメインの疎水性を向上させることが、ポリメラーゼ反応組成物の安定能の向上につながるものと考えられる。

本発明においては、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とするポリメラーゼ反応組成物の安定能の向上したＤｎａＫタンパク質がより好ましい。また、本発明は少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とするポリメラーゼ反応組成物の安定能の向上したＤｎａＫタンパク質であることが好ましい。特に好ましくは、ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質である。

また、本発明においては、ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したタンパク質を用いてもよい。更に詳しくは、ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したポリメラーゼの安定能の向上したタンパク質である。また更に好ましくは、ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質が使用される。

本発明に用いるタンパク質もしくはタンパク質フラグメントは、本発明の効果を損なわない範囲内であればヒスチジンタグなどのタグを有していても良い。さらに、本発明の効果を損なわない範囲内であれば一般的に知られていないタグや、任意のアミノ酸配列を付加しても良い。

本タンパク質の発現方法は特に限定されないが、原核生物を用いて発現させる方法が好ましく、さらには、大腸菌を用いて発現させる方法がさらに好ましい。また、発現ベクターに関しても特に限定はされず、一般的に発現に使用されているものであればよい。

本発明に用いるＨＳＰ７０ファミリーに属するタンパク質としては、特に限定はされないが、大腸菌のＤｎａＫ，酵母細胞質に存在するＳｓａ１ｐ，酵母ミトコンドリアに存在するＳｓｃ１ｐ，酵母小胞体に存在するＫａｒ２ｐ，哺乳類細胞質に存在するＨＳＰ７０，哺乳類小胞体に存在するＢｉｐ，哺乳類ミトコンドリアに存在するｍＨｓｐ７０および熱ショックの有無に関わらず恒常的に発現しているＨＳＰ７０のホモログであるＨＳＣ７０などが例示される。ＨＳＰ７０ファミリーには数多くのホモログが知られており、上に挙げたものはそのうちの一部であり、上に列挙した以外のホモログであってもよい。

本発明に用いるＨＳＰ７０フラグメントはＡＴＰａｓｅドメインを除去されているのがよいが、場合により十分なポリメラーゼ反応組成物の安定能を示すならば、ＡＴＰａｓｅドメインの全領域が除去されていなくてもよい。例えば、ＡＴＰａｓｅドメインは、ＤｎａＫではＣ末端側の１−３８３の領域を指し、そのＡＴＰａｓｅ活性を失う程度にＡＴＰａｓｅドメインの一部を除去していれば、本発明におけるＨＳＰ７０フラグメントに含まれる。例えば、ＤｎａＫにおいては３８４−６３８のフラグメントも使用することができる。

なお、本発明に使用する安定化剤は、国際公開第２００５／００３１５５号パンフレットに記載の方法によって得られたものを使用することも出来る。

本発明において、ポリメラーゼ反応安定剤の添加したとき濃度は、０．００１〜２０ｍｇ／ｍｌ程度が好ましく、好ましくは０．０１〜２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌである。本発明のポリメラーゼ反応安定剤は、ポリメラーゼ反応を阻害しないこともひとつの特性であるので、前述の範囲外においても、本発明の効果を損なわないのであれば、適宜、濃度を調整できる。

本発明のポリメラーゼ反応安定剤の添加により保存したときの安定性が向上する。その効果は、本発明のポリメラーゼ反応安定剤による保存容器表面への各ポリメラーゼ反応組成物の付着の防止効果、反応組成物同士のアグリゲーションの防止効果及び分解防止効果によるものと推定される。保存安定性は、室温以下（２５℃以下）の液状でもある程度効果はあるが、好ましくは０℃以下の凍結状態がよい。溶液の組成によっては０℃で凍結しない可能性があるため、保存温度はより好ましくは−８℃以下がよく、さらに好ましくは−１６℃以下がよい。凍結温度の下限は、特に制限はない。なぜならば、全てのポリメラーゼ反応組成物は温度が低ければ保存安定性は高くなるからである。また、本発明のポリメラーゼ反応安定剤とともに保存することで、凍結融解による安定性が各段に向上する。このことは、予想さえされないことであった。

本発明のポリメラーゼ反応安定剤の添加により凍結融解による安定性が各段に向上することを利用して、ポリメラーゼ反応を行う際の組成に近い形態で溶液を保存することが可能である。一例として、本発明のポリメラーゼ反応安定剤を含み、かつ標的核酸を除いたポリメラーゼ反応組成物を凍結保存しておけば、使用する前に該組成物を融解し、標的核酸を添加するだけで簡便にポリメラーゼ反応を行うことができる。このような簡便性は、生化学、分子生物学および臨床病理分野における研究、検査において特に重要である。保存中の溶液におけるポリメラーゼの濃度は任意に設定することができるが、簡便性の観点からポリメラーゼ連鎖反応を行う際の１〜１０倍であることが好ましく、１〜５倍であることがより好ましい。ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるポリメラーゼの濃度は、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼであれば、通常、全容量２５μｌあたり０．４Ｕなので、具体的には、２５μｌあたり０．４〜４．０Ｕの濃度、より好ましくは２５μｌあたり０．４〜２．０Ｕの濃度で保存するのがよいが、本発明の効果を損なわない限り、特に限定はされない。

以下に本発明のポリメラーゼ反応安定剤の好ましい使用方法を説明するが、特にこれに限定されるものではない。また、ポリメラーゼ連鎖反応を中心に説明するが、最近のシーケンシング手法にはポリメラーゼ連鎖反応を用いる方法もあり、シーケンシングにも十分応用可能である。
保存溶液中のポリメラーゼ反応組成物の濃度をつぎのように設定する。
標的核酸を含む溶液１μｌとポリメラーゼ反応組成物を含む保存溶液２４μｌを混合したときに、全容量２５μｌ中に含まれるポリメラーゼ反応組成物の濃度が下記のようになるよう保存溶液を混合しておく。
緩衝剤：80mM Tris-HCl(pH8.0)
１価金属イオン：10mM KCl
２価金属イオン：１．２mM ＭｇSO₄
界面活性剤：0.002% TritonX-100
dNTP（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ） 各0.2mM
本発明のポリメラーゼ反応安定剤０．１ｍｇ／ｍｌ
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ０．４Ｕ
フォワードプライマー５pmol
リバースプライマー５pmol
保存溶液２４μｌをＰＣＲ用の反応チューブに分注し、各チューブを−３０℃にて凍結保存しておく。必要時に、標的核酸を含む溶液１μｌを添加し、全容量２５μｌとし、ＰＣＲを行う。ＰＣＲは、通常の温度サイクルを実施すればよい。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。

実施例１ ポリメラーゼ反応組成物安定性試験
（１）評価用プライマーの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号４および５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ４、５と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）等）に依頼した。

（２）ポリメラーゼ反応組成物の調製
以下の試薬を含む２５μｌ溶液ＡおよびＢをそれぞれ４サンプル分調製した。

溶液Ａ：ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液（ＤｎａＫ非添加）
オリゴ４ １０ｐｍｏｌ、
オリゴ５ ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液 ２．５μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ １．２μｌ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．４Ｕ。

溶液Ｂ：ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液（ＤｎａＫ添加）
オリゴ４ １０ｐｍｏｌ、
オリゴ５ ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液 ２．５μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ １．２μｌ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．４Ｕ、
１ｍｇ／ｍｌ ＤｎａＫ（４１９−６０７） ２．５μｌ。

（３）ポリメラーゼ反応組成物の凍結融解
溶液ＡおよびＢを−３０℃で凍結させて室温（２５℃）で融解する操作を２０回繰り返した。

（４）ポリメラーゼ反応
凍結融解した溶液ＡおよびＢの各４サンプル分に、標的核酸としてそれぞれ１０の６乗コピー、１０の５乗コピー、１０の４乗コピー、１０の３乗コピーのｐＵＣ１８ＤＮＡ（東洋紡製）を添加し、パーキンエルマー社のＤＮＡサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００）を用いて、以下のサイクル条件で反応を行った。

サイクル条件
９５℃・５分
９４℃・１５秒、
６０℃・３０秒、
６８℃・３０秒（３５サイクル）
２５℃・１５分。

（５）アガロースゲル電気泳動による検出
反応後の反応液５μｌを３％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射下での蛍光を検出した。アガロース電気泳動で得られた写真を図２に示す。電気泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、６０分間にて行った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、検出されたＤＮＡ断片の鎖長を比較する際の参考とした。

（６）結果
図２から明らかなように、ポリメラーゼ反応組成物を２０回凍結融解すると、本発明のポリメラーゼ反応安定剤の一例であるＤｎａＫ（４１９−６０７）を添加しない場合には、１０の６乗コピーより少量の標的核酸は検出できないが、ＤｎａＫ（４１９−６０７）を添加すると１０の３乗コピーの標的核酸を検出することが可能であり、本発明のポリメラーゼ反応安定剤の添加によりポリメラーゼ反応組成物が安定化されることが示された。

本発明の、ポリメラーゼ反応安定剤により、ポリメラーゼ反応に供される組成物が安定に保存できるため、従来よりもポリメラーゼ反応が安定し、シークエンスやポリメラーゼ連鎖反応の結果の信頼度が向上することからも、産業界に大きく寄与することが期待される。

大腸菌ＤｎａＫタンパク質の概要を示す図である。 ＤｎａＫ（４１９−６０７）添加または無添加によるポリメラーゼ反応組成物の保存安定性の相違

Claims (16)

1. ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質を有効成分として含有することを特徴とするポリメラーゼ反応安定剤。
2. ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質がＤｎａＫ，Ｓｓａ１ｐ，Ｓｓｃ１ｐ，Ｋａｒ２ｐ，ＨＳＰ７０，Ｂｉｐ，ｍＨｓｐ７０およびＨＳＣ７０から選択されることを特徴とする請求項１に記載のポリメラーゼ反応安定剤。
3. ＨＳＰ７０ファミリータンパク質の基質結合ドメインを用いることを特徴とする請求項１又は２に記載のポリメラーゼ反応安定剤。
4. ＤｎａＫタンパク質由来のタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のポリメラーゼ反応安定剤。
5. ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のポリメラーゼ反応安定剤。
6. ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のポリメラーゼ反応安定剤。
7. ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のポリメラーゼ反応安定剤。
8. ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のポリメラーゼ反応安定剤。
9. ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のポリメラーゼ反応安定剤。
10. ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のポリメラーゼ反応安定剤。
11. ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のポリメラーゼ反応安定剤。
12. 試料中の標的ＤＮＡ分子の複製を行う方法であって、請求項１〜１１のいずれかに記載のポリメラーゼ反応安定剤を含む反応溶液中で、ポリメラーゼによる複製反応を行うことを特徴とする方法。
13. 試料中の標的ＤＮＡ分子の核酸増幅反応を行う方法であって、請求項１〜１１のいずれかに記載のポリメラーゼ反応安定剤を含む反応溶液中で、ポリメラーゼ連鎖反応を行うことを特徴とする方法。
14. 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、請求項１〜１１のいずれかに記載のポリメラーゼ反応安定剤を混合することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ保存方法。
15. 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、請求項１〜１１のいずれかに記載のポリメラーゼ反応安定剤を混合し、さらに凍結させることを特徴とする請求項１４に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ保存方法。
16. 保存中の溶液における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの濃度が、ポリメラーゼ連鎖反応を行う際の１〜１０倍であることを特徴とする請求項１４または１５に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ保存方法。