JP5731113B2 - 反応化合物と安定化ポリメラーゼの乾燥組成物 - Google Patents
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Description
a) 反応化合物の液体混合物であって、プライマー、ヌクレオチド、Taq DNAポリメラーゼ及び第一安定化分子を含んで成る液体混合物を準備する工程、及び
b) 前記液体混合物の周囲の圧力を減少させることで、前記液体混合物を乾燥する工程、
を含んで成り、
ここで、前記反応化合物の乾燥組成物は水溶液中で可溶であり、工程a)における前記反応化合物の乾燥組成物は、第二安定化分子として、アプタマーを更に含んで成ることを特徴とする、方法である。
a) 水溶液を添加することで本発明の反応化合物の乾燥組成物を再溶解する工程、及び
b) 再溶解された反応化合物を含んで成る水溶液を用いてサーモサイクリングプロトコールを実施する工程、
を含んで成る方法である。
本発明の第一の態様は、反応化合物の保存可能な乾燥組成物を提供する方法であって、前記方法が
a) 反応化合物の液体混合物であって、プライマー、ヌクレオチド、Taq DNAポリメラーゼ及び第一安定化分子を含んで成る液体混合物を準備する工程、及び
b) 前記液体混合物の周囲の圧力を減少させることで、前記液体混合物を乾燥する工程、
を含んで成り、
ここで、前記反応化合物の乾燥組成物は水溶液中で可溶であり、工程a)における前記反応化合物の乾燥組成物は、第二安定化分子として、アプタマーを更に含んで成ることを特徴とする、方法である。
一本鎖ハイブリダイゼーションプローブは、2つの成分で標識される。第一の成分が適当な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーは、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従い、第二の成分、いわゆるクエンチャーへと移動される。PCR反応のアニーリング工程の間、ハイブリダイゼーションプローブは標的DNAに結合し、そしてその後の伸長段階の間にTaqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、励起した蛍光成分及びクエンチャーは、空間的に互いに分離され、その結果、第一成分の蛍光放射を測定することができる(US 5,210,015, US 5,538,848, US 5,487,972, US 5,804,375)。
これらのハイブリダイゼーションプローブは、第一の成分及びクエンチャーでも標識され、当該標識は、好ましくは当該プローブの両末端に位置する。プローブの二次構造の結果として、両成分は溶液中空間的に近傍にある。標的核酸にハイブリダイゼーションした後、両成分は互いに分離し、その結果、適当な波長光による励起の後、第一成分の蛍光放射を測定することができる(US5,118,801)。
このフォーマットは、同時に使用され、且つ増幅された標的核酸の同一の鎖の隣接部位に対して相補的である2つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブによって特徴付けられる。両プローブは、異なる蛍光成分で標識される。適当な波長光で励起されると、第一成分は、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従い、吸収したエネルギーを第二の成分へと移動させ、その結果、両ハイブリダイゼーションプローブが検出すべき標的分子の隣接部位と結合する場合に第二成分の蛍光放出を測定できるようになる。あるいは、FRETアクセプター成分の蛍光の増大をモニタリングするために、ハイブリダイゼーションイベントの定量的な測定として、FRETドナー成分の蛍光の増大をモニタリングすることもできる(WO 97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714)。
a) 水溶液を添加することで本発明の反応化合物の乾燥組成物を再溶解する工程、及び
b) 再溶解された反応化合物を含んで成る水溶液を用いてサーモサイクリングプロトコールを実施する工程、
を含んで成る方法である。
Taq DNAポリメラーゼの安定性
本実施例は、アプタマー無しのTaq DNAポリメラーゼの液体混合物の結果を要約する。保存及び再溶解後のDNAポリメラーゼのPCR性能を、2種類の異なるパラメーターを用いて、検出ミックスを使用して又は使用せずに(プライマーとプローブを使用又は不使用)分析した。液体混合物を200mbarにて16時間乾燥しそして37℃で1週間保存した後、再溶解した。対照として乾燥しない液体混合物も使用した(以降は参照液体と称する)。
・ 95℃で5分
・ 95℃で10秒、60℃で30秒、72℃で1秒(45回)
・ 40℃で10秒。
60 mM Tris/HCl pH 8.3, 60 mM KCl, 6.4 mM MgCl2, 0.4 mM dATP, 0.4 mM dCTP, 0.4mM dGTP, 1.2 mM dUTP, 1 mg/mL カゼイン及び0.3 U/μL Taq DNAポリメラーゼ(グリセロール不含有)。
60 mM Tris/HCl pH 8.3, 60 mM KCl, 6.4 mM MgCl2, 0.4 mM dATP, 0.4 mM dCTP, 0.4 mM dGTP, 1.2 mM dUTP, 1 mg/mL BSA及び0.3 U/μL Taq DNAポリメラーゼ(グリセロール不含有)。
10 mM Tris pH 8.3, 0.05%Brij, 7.1 μM正プライマー(配列番号1), 7.1μM逆プライマー(配列番号2)及び0.6μM Fam-Tamraプローブ(配列番号3)。
10 mM Tris pH 8.3, 0.05%Brij, 7.1μM正プライマー(配列番号4),7.1μM逆プライマー(配列番号5)及び0.6μM Fam-Tamraプローブ(配列番号6)。
本実施例のPCR増幅曲線は図1〜図4に要約され、それらの図中では検出ミックスを使用しない曲線は“1”と表示され、検出ミックスを使用した曲線は“2”と表示され、そして参照液体の曲線は“3”と表示される。更に、次の表は図1〜4の曲線から得られたPCR値を要約する。
アプタマーNTQ12-46Aを有するTaq DNAポリメラーゼの安定性
本実施例は、アプタマーNTQ12-46A(配列番号9)を有するTaq DNAポリメラーゼの液体混合物の結果を要約する。アプタマーが結合しているTaq DNAポリメラーゼを、本実施例を通してAptaTaq DNAポリメラーゼNTQ12-46Aと称する。
・ 95℃で5分
・ 95℃で10秒、60℃で30秒及び72℃で1秒(45×)
・ 40℃で10秒。
60 mM Tris/HCl pH 8.3, 60 mM KCl, 6.4 mM MgCl2, 0.4 mM dATP, 0.4 mM dCTP, 0.4mM dGTP, 1.2 mM dUTP, 1 g/L カゼイン及び0.3 U/μL AptaTaq DNAポリメラーゼ〔グリセロール不含有;0.65ピコモルのアプタマー(NTQ12-46A;配列番号9)/1UのTaq DNAポリメラーゼ〕。
60 mM Tris/HCl pH 8.3, 60 mM KCl, 6.4 mM MgCl2, 0.4 mM dATP, 0.4 mM dCTP, 0.4 mM dGTP, 1.2 mM dUTP, 1 mg/mL BSA及び0.3 U/μL AptaTaq DNAポリメラーゼ〔グリセロール不含有;0.65ピコモルのアプタマー(NTQ12-46A;配列番号9)/1UのTaq DNAポリメラーゼ〕。
これらの検出ミックスは実施例1のものと同一である。
本実施例のPCR増幅曲線は図5〜図8に要約され、それらの図中では検出ミックス無しの曲線は“1”と表示され、検出ミックス無しの曲線は“2”と表示され、そして参照液体の曲線は“3”と表示される。更に、次の表は図5〜8の曲線から得られたPCR値を要約する。
アプタマーNTQ12-46Aを有するTaq DNAポリメラーゼとアプタマー21-42-Pを有するTaq DNAポリメラーゼとの比較
本実施例では、アプタマーNTQ12-46A(配列番号9)を有するTaq DNAポリメラーゼの液体混合物のPCR性能を、アプタマー21-42-P(配列番号10)を有するものと比較する。本実施例を通して、アプタマーを有するTaq DNAポリメラーゼをそれぞれAptaTaq DNAポリメラーゼ NTQ12-46A及びAptaTaq DNAポリメラーゼ 21-42-Pと称する。
・ 95℃で5分
・ 95℃で10秒、60℃で30秒、72℃で1秒(45回)
・ 40℃で10秒。
60 mM Tris/HCl pH 8.3, 60 mM KCl, 6.4 mM MgCl2, 0.4 mM dATP, 0.4 mM dCTP, 0.4mM dGTP, 1.2 mM dUTP, 1 g/L カゼイン及び0.3 U/μL AptaTaq DNAポリメラーゼ〔グリセロール不含有;0.65ピコモルのアプタマーNTQ12-46A(配列番号9)/1UのTaq DNAポリメラーゼ〕。
60 mM Tris/HCl pH 8.3, 60 mM KCl, 6.4 mM MgCl2, 0.4 mM dATP, 0.4 mM dCTP, 0.4 mM dGTP, 1.2 mM dUTP, 1 g/L カゼイン,0.8 U /μL AptaTaq DNAポリメラーゼ〔グリセロール不含有;0.5μMのアプタマー21-42-P(配列番号10)〕。
qPCR Eamst検出ミックス及びqPCR Wsebi検出ミックス:
これらの検出ミックスは実施例1のものと同一である。
本実施例のPCR増幅曲線は図9〜図12に要約され、それらの図中、検出ミックスを使用した乾燥後の曲線は“1”と表示され、そして参照液体の曲線(乾燥せず)は“2”と表示される。更に、次の表は図9〜12の曲線から得られたPCR値を要約する。
プラスミドDNAと共に乾燥したAptaTaq DNAポリメラーゼNTQ12-46A
本実施例では、AptaTaq DNAポリメラーゼ NTQ12-46A、2つの異なるパラメーターのプラスミドDNA及び各々の検出ミックスを含む液体混合物を乾燥し、そして保存及び再溶解後のPCR性能を、前記プラスミドを含まない液体混合物と比較した。液体混合物を200mbarにて16時間乾燥しそして37℃で1週間保存した後、再溶解した。対照として乾燥しない液体混合物も使用した(下記では参照液体と称する)。全ての混合物を384マイクロタイタープレート(Roche Diagnostic GmbH)のウェル中に入れ、再溶解後に次の反応プロトコールを使ってLightCycler(登録商標)480(Roche Diagnostic GmbH)上でPCR反応を実施した。
・ 95℃で5分
・ 95℃で10秒、60℃で30秒、72℃で1秒(45回)
・ 40℃で10秒。
本実施例のPCR増幅曲線は図13〜図14に要約され、それらの図中、プラスミド無しで乾燥した後の曲線は“1”と表示され、プラスミドと共に乾燥した後の曲線は“2”と表示され、そして参照液体の曲線(乾燥せず)は“3”と表示される。更に、次の表は図13〜14の曲線から得られたPCR値を要約する。
Claims (15)
- 反応化合物の保存可能な乾燥組成物を製造する方法であって、
a) 反応化合物の液体混合物であって、プライマー、ヌクレオチド、Taq DNAポリメラーゼ及び第一安定化分子を含んで成る液体混合物を準備する工程、及び
b) 前記液体混合物の周囲の圧力を減少させることで、前記液体混合物を乾燥する工程、
を含んで成り、
ここで、前記反応化合物の乾燥組成物は水溶液中で可溶であり、工程a)における前記反応化合物の液体混合物は、第二安定化分子として、アプタマーを更に含んで成り、当該アプタマーがTaqポリメラーゼに結合する能力を有し、前記第一安定化分子がカゼイン又はBSAであることを特徴とする、方法。 - 前記アプタマーが、配列番号9又は配列番号10の配列を有するアプタマーである、請求項1に記載の方法。
- 前記反応化合物の液体混合物が、マグネシウム塩を含んで成る緩衝水溶液である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記液体混合物の周囲の圧力が、工程b)において、600mbar未満に減少される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記圧力が400mbar未満に減少される、請求項4に記載の方法。
- 前記圧力が200mbar未満に減少される、請求項4に記載の方法。
- 工程b)の前記乾燥が室温で実施される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応化合物の液体混合物が更に検出プローブを含んで成る、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出プローブが蛍光標識プローブである、請求項8に記載の方法。
- 前記反応化合物の液体混合物が更に鋳型DNAを含んで成る、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- プライマー、ヌクレオチド、Taq DNAポリメラーゼ、第一安定化分子、及び第二安定化分子としてのアプタマーを含んで成る反応化合物の乾燥組成物であって、第一安定化分子がカゼイン又はBSAであり、アプタマーが、TaqDNAポリメラーゼに結合する能力を有し、かつ当該乾燥組成物が、室温で少なくとも1週間保存した後、再溶解の際にPCR活性を提供し、ここで当該反応化合物の乾燥組成物が水溶液に溶解性である、乾燥組成物。
- 前記反応化合物の乾燥組成物が更に検出プローブを含んで成る、請求項11に記載の反応化合物の乾燥組成物。
- 前記アプタマーが配列番号9又は配列番号10の配列を有するアプタマーである、請求項11又は12に記載の反応化合物の乾燥組成物。
- PCR増幅を実施するための方法であって、
a) 水溶液を添加することで請求項11〜13のいずれか1項に記載の反応化合物の乾燥組成物を再溶解する工程、及び
b) 再溶解された反応化合物を含んで成る水溶液を用いてサーモサイクリングプロトコールを実施する工程、
を含んで成る方法。 - 前記水溶液が、サーモサイクリングプロトコールによって増幅されるべき標的核酸を含んで成る、請求項14に記載の方法。
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