CN101768616B - 含稳定聚合酶的反应化合物的干组合物 - Google Patents
含稳定聚合酶的反应化合物的干组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101768616B CN101768616B CN200910263837.4A CN200910263837A CN101768616B CN 101768616 B CN101768616 B CN 101768616B CN 200910263837 A CN200910263837 A CN 200910263837A CN 101768616 B CN101768616 B CN 101768616B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- reaction
- liquid mixture
- dry composition
- aptamers
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
Abstract
本发明提供获得反应化合物干组合物的方法，该方法在某一储存时间后重新溶解时维持化合物的生物活性。优选干组合物包含聚合酶并且干组合物对于重新溶解后的PCR扩增是可用的。
Description
发明背景
极少生物反应化合物以溶解形式在任何长的时间内保持稳定，尤其在室温下储存更是如此。因此，过去进行了大量评价增强干燥形式生物反应化合物储存能力可能性的研究。
基于在干反应化合物领域的大量现有技术文献，本领域技术人员确信为了确保例如聚合酶在重新溶解时的生物活性，使用至少一种稳定添加剂是必不可少的。
WO 2008/36544描述了为提供干组合物的所谓填充材料的应用，所述填充材料是例如：糖类(如FICOLLTM、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、松三糖、DEXTRANTM或甘露醇)、蛋白质(如BSA、明胶或胶原)以及聚合物(如PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP))。在US 5,098,893、US5,200,399和US 5,240,843中进一步描述了用于稳定生物试剂的玻璃形成的填充材料。在US 3,300,474中公开的填充材料FICOLLTM是共聚物。
此外，液体反应混合物的干燥方法在大多数情况下本质上是非常复杂的，因此干燥程序有很高的要求而且昂贵。在文献中，冻干(US5,593,824)或真空干燥(US 5,565,318)用于干燥糖类聚合物基质中的生物材料。冷冻干燥法即冻干是在很多现有技术文献中公开的充分建立的蛋白质储藏技术(例如Passot，S.，等，Pharmaceutical Developmentand Technology 12(2007)543-553；Carpenter，J.F.，等，PharmaceuticalResearch 14(8)(1997)969-975；Schwegman，J.J.，等，PharmaceuticalDevelopment and Technology 10(2005)151-173)。
在US 7,407,747中描述了包含Taq聚合酶遗传修饰的用于测序的不同反应混合物干燥条件的选择。所使用的干燥程序是冻干、在没有另外加热下的离心真空蒸发浓缩(speedvac)、在另外加热下的离心真空蒸发浓缩和室温风干。对该专利内的反应混合物进行了有关各种冷冻保护剂如海藻糖、蔗糖、葡萄糖和三甲胺-N-氧化物(TMANO)的试验。此外，还进行了在没有任何冷冻保护剂下的实验，但没有公开关于那些反应混合物稳定性随时间变化的数据。仅报道了含有海藻糖和牛血清白蛋白(BSA)的反应混合物长达8周的良好稳定性。
此外，US 7,407,747公开了使用各种测序混合物中的聚合酶的实验，所述测序混合物包含缓冲液、核苷酸、含荧光标记的核苷酸和引物的各种组成。尚没有公开是否可干燥并储存用于实时PCR扩增的混合物(即含有缓冲液、核酸、引物和检测探针的混合物)中的聚合酶而不影响聚合酶的PCR活性。
本发明提供了干燥实时PCR混合物内Taq DNA聚合酶的方法，而所获得的干组合物可被储存但不影响Taq DNA聚合酶的PCR性能。
发明概述
提供含有聚合酶的反应化合物的干组合物是一个复杂的问题，特别是在以下情况：意欲将所述干组合物储存一定时间并且所述干组合物随后的重新溶解必须尽可能不影响PCR应用的聚合酶活性。
在干燥含不同组分的液体溶液过程中，所述组分的浓度会不断增加，致使其性质彻底改变，而液体溶液的确切性能取决于各组分和干燥程序。技术人员认识到的是，例如高盐浓度将使蛋白质失去稳定性，缓冲液在高浓度下性能将改变，导致产生极端的pH值。
如上文所述，本领域技术人员了解可加入到含有聚合酶的溶液中以增强聚合酶在干燥过程中的稳定性的某些化合物。此外，如果某种聚合酶的混合物的组分会改变，那么本领域技术人员将不能预料可得到该聚合酶的相同干燥效果。
例如，US 7,407,747公开了可在由以下物质组成的混合物中干燥Taq聚合酶：缓冲液、核苷酸、BSA和海藻糖，并且公开了所述聚合物可保持活性长达8周。
开发了本发明的方法以提供PCR应用的聚合酶干组合物，所述组合物不仅包含缓冲剂和核苷酸，而且还包含另外的组分(即引物乃至引物和探针)，以构成完整的检测混合物。
业已认识的是，可将含有聚合酶、核苷酸和稳定分子的液体混合物进行干燥和储存而不影响聚合酶的活性，但如果将额外的引物加到液体混合物中，则会使聚合酶的活性丧失。更详细地说，如果在干燥程序之后直接进行重新溶解，则由于引物的加入而使PCR性能丧失。
本发明解决了增加Taq聚合酶稳定性致使所干燥的液体混合物可包含附加的引物这一技术问题。
令人意想不到的是，发现将适配体加入液体溶液增强了Taq聚合酶的稳定性，其中所述稳定化不仅对于干燥而且对于干燥混合物的储存都是足够好的。
因此，本发明的一个方面是制备可储存的反应化合物干组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供反应化合物的液体混合物，所述液体混合物包含引物、核苷酸、Taq DNA聚合酶和第一稳定分子，和
b)通过降低所述液体混合物周围的压力来干燥所述液体混合物，
其中所述反应化合物干组合物在水溶液中是可溶性的，其特征在于步骤a)中所述反应化合物的液体混合物进一步包含作为第二稳定分子的适配体。
在本发明全文中，短语“干组合物”用于强调溶剂的量，优选水溶剂下降至5％重量以下。
短语“可储存的干组合物”在本发明全文中意指所述干组合物必须可储存至少一周，优选至少4周，更优选8周以上而不影响聚合酶的活性。
本发明中的“稳定分子”是在含有所述聚合酶水溶液的干燥过程中，提高聚合酶对其PCR活性丧失的抗性的分子。
本发明的另一方面是含有引物、核苷酸、Taq DNA聚合酶、第一稳定分子和作为第二稳定分子的适配体的反应化合物的干组合物，所述干组合物提供了室温储存至少一周后重新溶解时的PCR活性。
还有本发明的另一方面是实施PCR扩增的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过加入水溶液重新溶解本发明的反应化合物干组合物，和
b)用含有重新溶解的反应化合物的水溶液实施热循环方案。
发明详述
本发明的一个方面是提供反应化合物的可储存干组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供反应化合物的液体混合物，所述液体混合物包含引物、核苷酸、Taq DNA聚合酶和第一稳定分子，和
b)通过降低所述液体混合物周围的压力干燥所述液体混合物，
其中所述反应化合物的干组合物在水溶液中是可溶性的，其特征在于步骤a)中所述反应化合物的液体混合物进一步包含作为第二稳定分子的适配体。
可从几类分子中选出用于Taq DNA聚合酶的第一稳定分子。
本发明优选的方法是其中所述第一稳定分子是蛋白质，优选所述的稳定分子是酪蛋白和BSA的方法。
本发明另一个优选的方法是其中所述第一稳定分子是糖类，优选所述稳定分子是海藻糖或甘露醇的方法，。
本发明又一个优选的方法是其中所述第一稳定分子是合成聚合物，优选所述稳定分子是PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的方法。
本发明令人意想不到的发现是，另一类分子，即适配体类能够为聚合酶提供稳定作用。已知适配体在溶液中与聚合酶结合，并将所谓的“热启动”特征附加到聚合酶中(例如US 5,475,096和US 5,270,163)。简言之，短的寡核苷酸(适配体)与聚合酶结合致使聚合酶活性被阻断。如果在PCR扩增的热循环方案中温度升高到某一阈值以上，适配体则将释放聚合酶并启动聚合酶活性。因此，在“热启动”PCR中，利用与聚合酶结合的适配体可阻碍不合乎需要的聚合酶低温活性，直到反应温度达到足以实施引物退火的高严格性。
如上文所述，可干燥、储存并重新溶解含有缓冲剂、核苷酸和第一稳定分子的混合物中的Taq DNA聚合酶而不影响聚合酶活性，但向混合物加入引物之后，聚合酶活性在干燥之后直接丧失。只有在将适配体加入到溶液之后，聚合酶活性才可重新恢复。
在不受理论的束缚下，预期引物3’端的羟基至少影响提供PCR活性的聚合酶的那些氨基酸。通过另外的实验(数据未显示)来检验该理论，其中用磷酸化的引物来代替引物，并分析了干燥后的PCR活性。结果表明磷酸化的引物不影响聚合酶，并且无需额外的适配体即可干燥反应化合物的液体混合物。
在Taq DNA聚合酶的情况下，可将包含缓冲剂、核苷酸和例如作为稳定分子的酪蛋白的混合物进行干燥、储存和重新溶解而不影响聚合酶的稳定性(见实施例)。将引物加入混合物之后，PCR性能在干燥后直接丧失(数据未显示，实施例仅显示储存后的结果)。因此，由于在液体混合物中引物的加入，增加了对稳定用于干燥的Taq聚合酶的需要。
另外的实验显示，在没有第一稳定分子下，适配体不能提供足够的稳定性以维持聚合酶的活性(数据未显示)。因此，第一稳定分子与适配体的结合能够使包含缓冲剂、核苷酸和引物的混合物中的TaqDNA聚合酶的干燥和储存成为可能。
在本发明的一个优选方法中，所述适配体是具有序列SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：10的适配体。
在不受理论的束缚下，预期由于适配体附着在Taq DNA聚合酶上的能力，其增强了聚合酶对高盐浓度、极端pH值和引物羟基的抗性。
在本发明另一个优选的方法中，所述反应化合物的液体混合物是包含镁盐的缓冲水溶液。
在本发明更优选的方法中，用Tris或Hepes对所述反应化合物的液体混合物进行缓冲。
在本发明另一个更优选的方法中，所述反应化合物的液体混合物进一步包含氯化钾。
对于本发明方法的步骤b)中的干燥程序，若干工作流程是合适的。一般而言，本领域技术人员认识的是，干燥液体混合物所需的时间与所述液体混合物周围的压力相关。在本发明中认可的是，压力不应(至少不应在一个步骤内)降至非常小的压力值。如果压力差太大，那么液体混合物与含混合物的容器会接触不良，致使不能再实现完全的重新溶解。
在本发明一个优选的方法中，步骤b)中所述液体混合物周围的压力下降至低于600mbar，优选低于400mbar，更优选200mbar。
在本发明一个更优选的方法中，维持所述减少的压力至少6小时，优选至少10小时，最优选16小时。
基于实验室操作的合宜性，优选在200mbar下储存液体混合物过夜。
为了减少制备干组合物所需的时间，可在两个步骤内完成本发明方法中的干燥步骤b)，即第一步用相对高的压力随后第二步用较低的压力。
在本发明另一个优选的方法中，在步骤b)的第二部分进一步降低压力，所述进一步降低的压力低于200mbar，优选低于100mbar，最优选50mbar。
在本发明又一个优选的方法中，所述进一步降低的压力维持至少1小时，优选至少3小时，最优选4小时。
优选的2步干燥流程包括第一步在200mbar下10小时，随后第二步在50mbar下4小时。
在本发明又一个优选的方法中，步骤b)中所述的干燥在室温下进行。
在本发明中，结果表明将温度调节到某个高值或低值并不影响重新溶解时的PCR活性。因此，优选在室温下进行干燥。
为了给实时PCR提供完整的干组合物，还必须在反应化合物的液体混合物中加入检测探针。在本发明中证实，在反应化合物的液体混合物中加入检测探针不影响重新溶解时的PCR活性。请注意如果液体混合物包含检测探针但不含引物，那么即使没有适配体，Taq DNA聚合酶仍维持其重新溶解时的PCR活性(数据未显示)。
在本发明一个优选的方法中，所述反应化合物的液体混合物进一步包含检测探针。
在本发明更优选的方法中，所述检测探针是荧光标记探针，优选杂交探针或水解探针。
因为实时PCR通常是基于荧光检测而实施的，所以优选使用荧光标记探针。三种主要的探针模式简要介绍如下。
a)水解探针模式(模式)：
用两种组分对单链的杂交探针进行标记。当用合适波长的光激发第一组分时，根据荧光共振能量转移原理，所吸收的能量转移至第二组分(即所谓的猝灭剂)。在PCR反应的退火步骤中，杂交探针结合到靶DNA上并在随后的延伸阶段中被Taq聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性降解。结果被激发的荧光组分和猝灭剂在空间上彼此分离，因而可测量到第一组分的荧光发射(US 5,210,015、US 5,538,848、US 5,487,972、US 5,804,375)。
b)分子信标(Molecular Beacon)：
还是用第一组分和猝灭剂对这些杂交探针进行标记，优选标记物位于探针的两端。作为探针二级结构的结果，两种组分在溶液中都是空间相邻的。在与靶核酸杂交之后，两种组分都彼此分离以至于在用合适波长的光激发之后，可测量到第一组分的荧光发射(US 5,118,801)。
c)FRET杂交探针：
该模式的特征在于：同时使用了两种单链的杂交探针并且它们与所扩增靶核酸的同一条链的邻近位点互补。两种探针用不同的荧光组分来标记。当用合适波长的光激发时，根据荧光共振能量转移原理，第一组分将所吸收的能量转移给第二组分，以至于当两种杂交探针与被检测靶分子的邻近位置结合时，可以测量第二组分的荧光发射。作为监测FRET受体组分荧光增加的选择，还可监测FRET供体组分的荧光下降来作为杂交事件的定量测定(WO 97/46707；WO 97/46712；WO 97/46714)。
在大多数PCR应用中，需要结合对照机制以评价如此的PCR扩增是否确实有效。一般而言，这是用掺入到样本中的模板DNA(内部对照)或用单独的容器内的模板DNA(外部对照)来实施的。在本发明的全文中，这两种备选方式统称为短语“阳性对照”。
在本发明优选的方法中，所述反应化合物的液体混合物进一步包含模板DNA。
在本发明更优选的方法中，将所述模板DNA用作阳性对照。
如上文所述，本发明内的实验提示核酸3’端的羟基影响Taq DNA聚合酶。因此，加到液体混合物中的模板DNA还可对重新溶解后的PCR性能产生不良影响。但是，可能基于模板DNA浓度比正常引物浓度低得多的原因，经鉴定表明在液体混合物中加入模板DNA不影响重新溶解后的PCR性能。
在本发明更优选的方法中，所述模板DNA是环状质粒。
这种环状质粒没有任何3’羟基，因此甚至可进一步减少羟基的不良影响。
本发明的另一方面是包含引物、核苷酸、Taq DNA聚合酶、第一稳定分子和作为第二稳定分子的适配体的反应化合物干组合物，所述干组合物提供室温储存至少一周后重新溶解时的PCR活性。
在本发明更优选的反应化合物干组合物中，在室温储存至少4周、更优选至少8周之后重新溶解时提供所述PCR活性。
进行了若干评价长期稳定性的实验，例如包含带适配体NTQ12-46A(SEQ ID NO：9)的Taq DNA聚合酶以及引物和探针的反应化合物干组合物提供了室温下储存8周后重新溶解时的PCR活性(数据未显示)。
本发明优选的反应化合物干组合物是进一步包含检测探针的干组合物。
在本发明更优选的反应化合物干组合物中，所述检测探针是荧光标记探针，优选杂交探针或水解探针。
本发明另外优选的反应化合物干组合物是以下干组合物，其中所述第一稳定分子是蛋白质，优选所述稳定分子是酪蛋白或BSA。
本发明还优选的反应化合物干组合物是以下干组合物，其中所述第一稳定分子是糖类，优选所述稳定分子是海藻糖或甘露醇。
本发明还优选的反应化合物干组合物是以下干组合物，其中所述第一稳定分子是合成的聚合物，优选所述稳定分子是PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
在本发明另外优选的反应化合物干组合物中，所述适配体是具有序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的适配体。
在本发明还优选的反应化合物干组合物中，所述反应化合物液体混合物进一步包含模板DNA。
在本发明更优选的反应化合物干组合物中，所述模板DNA是阳性对照。
在本发明另外更优选的反应化合物干组合物中，所述模板DNA是环状质粒。
本发明的另一方面是实施PCR扩增的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过加入水溶液重新溶解本发明反应化合物的干组合物，以及
b)用包含重新溶解的反应化合物的水溶液实施热循环方案。
无需特殊的辅助手段，通过简单地加入水溶液便可重新溶解本发明反应化合物的干组合物。但是为了帮助溶解并减少溶解时间，可优选施用机械刺激(mechanical stimulation)。
在本发明优选的实施PCR扩增的方法中，通过振荡混合物来帮助在步骤b)中所述的重新溶解。
在本发明另外优选的实施PCR扩增的方法中，通过旋涡振荡混合物来帮助在步骤b)中所述的重新溶解。
因为只需要加水到所述反应化合物干组合物中，所以在本发明范围内可有两种实施PCR扩增的备选方案。在第一种备选方案中，用水溶液对干组合物进行重新溶解，然后加入含有被分析靶核酸的样品。在第二种备选方案中(优选的备选方案)，直接用含有被扩增靶核酸的水溶液重新溶解干组合物。
在本发明优选的方法中，所述水溶液包含通过热循环方案进行扩增的靶核酸。
提供以下实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，其实际范围在所附的权利要求书中阐述。应该理解的是，可对所阐述的方法进行不离背本发明精神的修改。
附图说明
图1用Taq聚合酶和酪蛋白进行的Eamst质粒扩增
图2用Taq聚合酶和酪蛋白进行的Wsebi质粒扩增
图3用Taq聚合酶和BSA进行的Eamst质粒扩增
图4用Taq聚合酶和BSA进行的Wsebi质粒扩增
图5用Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和酪蛋白进行的Eamst质粒扩增
图6用Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和酪蛋白进行的Wsebi质粒扩增
图7用Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和BSA进行的Eamst质粒扩增
图8用Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和BSA进行的Wsebi质粒扩增
图9用Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和酪蛋白进行的Wsebi质粒扩增
图10用Taq聚合酶、21-41-P适配体和酪蛋白进行的Wsebi质粒扩增
图11用Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和酪蛋白进行的Eamst质粒扩增
图12用Taq聚合酶、21-41-P适配体和酪蛋白进行的Eamst质粒扩增
图13用干燥的质粒DNA、Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和酪蛋白进行的Eamst质粒扩增
图14用干燥的质粒DNA、Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和酪蛋白进行的Wsebi质粒扩增
实施例1
Taq DNA聚合酶的稳定性
该实施例概述了在不含适配体下Taq DNA聚合酶的液体混合物的效果。使用两种不同的参数，在含和不含检测混合物(detection mix)(含或不含引物和探针)下分析了储存并重新溶解后聚合酶的PCR性能。重新溶解之前将液体混合物于200mbar下干燥16小时，并在37℃下储存1周。还使用了未干燥的液体混合物作为对照(以下称为液体参照)。
在384孔微量滴定板(Roche Diagnostic GmbH)的孔中提供所有混合物，重新溶解之后在480(Roche Diagnostic GmbH)上使用以下运行方案来实施PCR运行。
-5分钟95℃
-10秒钟95℃，30秒钟60℃，1秒钟72℃(45x)
-10秒钟40℃
含酪蛋白的Mastermix：
60mM Tris/HCl pH 8,3，60mM KCl，6,4mM MgCl2，0,4mMdATP，0,4mM dCTP，0,4mM dGTP，1,2mM dUTP，1mg/mL酪蛋白和0,3U/μl Taq DNA聚合酶(无甘油)。
含BSA的Mastermix：
60mM Tris/HCl pH 8,3，60mM KCl，6,4mM MgCl2，0,4mMdATP，0,4mM dCTP，0,4mM dGTP，1,2mM dUTP，1mg/ml BSA和0,3U/μl Taq DNA聚合酶(无甘油)。
qPCR Eamst Detection Mix：
10mM Tris pH 8,3，0,05％Brij，7,1μM正向引物(SEQ ID NO：1)，7,1μM反向引物(SEQ ID NO：2)和0,6μM Fam-Tamra探针(SEQ IDNO：3)。
qPCR Wsebi Detection Mix：
10mM Tris pH 8,3，0,05％Brij，7,1μM正向引物(SEQ ID NO：4)，7,1μM反向引物(SEQ ID NO：5)和0,6μM Fam-Tamra探针(SEQ IDNO：6)。
在微量滴定板上制备和干燥下列混合物，将每种混合物以3个重复置于所述微量滴定板上：
对于随后的PCR扩增，按照以下移液方案通过加入溶液重新溶解干组合物。在PCR运行之前将液体参照移液至微量滴定板的空孔中。以4x10e4拷贝/μl的浓度对质粒进行移液。
结果：
本实施例的PCR扩增曲线概述于图1-4中，其中不含检测混合物(detection mix)的曲线用“1”标号，含检测混合物的曲线用“2”标号，液体参照曲线用“3”标号。此外，下表概述了由图1-4的曲线所获得的PCR值。
该实施例清楚地显示，在不含检测混合物下干燥的Taq DNA聚合酶的性能等同于在液体参照中的Taq DNA聚合酶的性能。在另一方面，如果在含检测混合物下干燥Taq DNA聚合酶，则重新溶解后的PCR性能不再是可接受的。
对于Wsebi参数，在含检测混合物下进行干燥的情况下，根本没有可检测到的扩增。对于Eamst参数，相似的交点仍然是可检测到的，但荧光值不再是可接受的。
实施例2
含适配体NTQ12-46A的Taq DNA聚合酶的稳定性
该实施例概述了含适配体NTQ12-46A(SEQ ID NO：9)的Taq DNA聚合酶的液体混合物的效果。在该实施例中，含附着的适配体的TaqDNA聚合酶命名为AptaTaq DNA聚合酶NTQ 12-46A。
使用两种不同的参数，在含和不含检测混合物(detection mix)(含或不含引物和探针)下分析了储存并重新溶解后聚合酶的PCR性能。重新溶解之前将液体混合物于200mbar下干燥16小时，并在37℃下储存1周。还使用了未干燥的液体混合物作为对照(以下称为液体参照)。
在384孔微量滴定板(Roche Diagnostic GmbH)的孔中提供所有混合物，重新溶解之后在480(Roche Diagnostic GmbH)上使用以下运行方案来实施PCR运行：
-5分钟95℃
-10秒钟95℃，30秒钟60℃，1秒钟72℃(45x)
-10秒钟40℃
含酪蛋白的Mastermix：
60mM Tris/HCl pH 8,3，60mM KCl，6,4mM MgCl2，0,4mMdATP，0,4mM dCTP，0,4mM dGTP，1,2mM dUTP，1g/L酪蛋白和0,3U/μl AptaTaq DNA聚合酶(无甘油；0,65pmol适配体(NTQ 12-46A；SEQ ID NO：9)/1U Taq DNA聚合酶)。
含BSA的Mastermix：
60mM Tris/HCl pH 8,3，60mM KCl，6,4mM MgCl2，0,4mMdATP，0,4mM dCTP，0,4mM dGTP，1,2mM dUTP，1mg/ml BSA和0,3U/μl AptaTaq DNA聚合酶(无甘油；0,65pmol适配体(NTQ 12-46A；SEQ ID NO：9)/1U Taq DNA聚合酶)。
qPCR Eamst Detection Mix和qPCR Wsebi Detection Mix：
这些检测混合物与实施例1中的相同。
在微量滴定板上制备和干燥下列混合物，将每种混合物以3个重复置于所述微量滴定板上：
对于随后的PCR扩增，按照以下移液方案通过加入溶液重新溶解干组合物。在PCR运行之前将液体参照移液至微量滴定板的空孔中。以4x10e4拷贝/μl的浓度对质粒进行移液。
结果：
本实施例的PCR扩增曲线概述于图5-8中，其中在不含检测混合物下干燥后的曲线用“1”标号，在含检测混合物下干燥后的曲线用“2”标号，液体参照(未干燥)的曲线用“3”标号。此外，下表概述了由图5-8的曲线所获得的PCR值。
为了证实适配体的稳定化性质，需要将图5-8的扩增曲线与图1-4比较，更准确地讲是图5与图1比较，图6与图2比较，图7与图3比较，图8与图4比较。很显然图1-4显示显著下降的干燥后扩增曲线，而图5-8显示仅有轻微改变的干燥后扩增曲线。
该实施例清楚地显示，在含或不含检测混合物下干燥的AptaTaqDNA聚合酶NTQ12-46A的性能在干组合物重新溶解后仍然是可以接受的。
实施例3
含适配体NTQ12-46A与含适配体21-42-P的Taq DNA聚合酶的比较
在该实施例中，将含适配体NTQ12-46A(SEQ ID NO：9)的TaqDNA聚合酶与含适配体21-42-P(SEQ ID NO：10)的Taq DNA聚合酶的液体混合物的PCR性能进行比较。在该实施例中，含附着的适配体的Taq DNA聚合酶分别命名为AptaTaq DNA聚合酶NTQ 12-46A和AptaTaq DNA聚合酶21-42-P。
使用两种不同的参数，在含检测混合物(含引物和探针)下分析了储存并重新溶解后含上述两种适配体的聚合酶的PCR性能。重新溶解之前将液体混合物于200mbar下干燥16小时，并在37℃下储存1周。还使用了未干燥的液体混合物作为对照(以下称为液体参照)。
在384孔微量滴定板(Roche Diagnostic GmbH)的孔中提供所有混合物，重新溶解之后在480(Roche Diagnostic GmbH)上使用以下运行方案来实施PCR运行：
-5分钟95℃
-10秒钟95℃，30秒钟60℃，1秒钟72℃(45x)
-10秒钟40℃
含酪蛋白+适配体NTQ21-46A的Mastermix：
60mM Tris/HCl pH 8,3，60mM KCl，6,4mM MgCl2，0,4mMdATP，0,4mM dCTP，0,4mM dGTP，1,2mM dUTP，1g/L酪蛋白和0,3U/μl AptaTaq DNA聚合酶(无甘油；0,65pmol适配体NTQ 12-46A(SEQID NO：9)/1U Taq DNA聚合酶)。
含酪蛋白+适配体21-42-P的Mastermix：
60mM Tris/HCl pH 8,3，60mM KCl，6,4mM MgCl2，0,4mMdATP，0,4mM dCTP，0,4mM dGTP，1,2mM dUTP，1g/L酪蛋白，0,8U/μl AptaTaq DNA聚合酶(无甘油；0,5μM适配体21-42-P(SEQ IDNO：10)。
qPCR Eamst Detection Mix和qPCR Wsebi Detection Mix：
这些检测混合物与实施例1中的相同。
在微量滴定板上制备和干燥下列混合物，将每种混合物以3个重复置于所述微量滴定板上：
对于随后的PCR扩增，按照以下移液方案通过加入溶液重新溶解对应每种适配体的干组合物。在PCR运行之前将液体参照移液至微量滴定板的空孔中。以4x10e4拷贝/μl的浓度对质粒进行移液。
结果：
图9-12概述了该实施例的PCR扩增曲线，其中在含检测混合物下干燥后的曲线用“1”标号，液体参照(未干燥)曲线用“2”标号。此外，下表概述了由图9-12的曲线获得的PCR值。
再次，为了证实适配体的稳定化性质，需要将图9-12的扩增曲线与图1-4的相比较，显然图1-4显示了干燥后显著下降的扩增曲线，而图9-12显示了仅轻微改变的干燥后曲线。
该实施例清楚地显示，在含检测混合物下干燥的AptaTaq DNA聚合酶NTQ12-46A与AptaTaq DNA聚合酶21-41-P的性能在干组合物重新溶解后是相当的。
实施例4
在含质粒DNA下干燥的Apta Taq DNA聚合酶NTQ12-46A
在本实施例中，将含AptaTaq DNA聚合酶NTQ12-46A、两种不同参数的质粒和各自的检测混合物的液体混合物进行干燥，并将储存并重新溶解后的PCR性能与不含所述质粒的液体混合物进行比较。重新溶解之前将液体混合物于200mbar下干燥16小时，并在37℃下储存1周。还使用未干燥的液体混合物作为对照(以下称为液体参照)。在384孔微量滴定板(Roche Diagnostic GmbH)的孔中提供所有混合物，重新溶解之后在480(Roche Diagnostic GmbH)上使用以下运行方案来实施PCR运行：
-5分钟95℃
-10秒钟95℃，30秒钟60℃，1秒钟72℃(45x)
-10秒钟40℃
Master mix和两种检测混合物均与在实施例2中的相同。
在微量滴定板上制备和干燥下列混合物，将每种混合物以3个重复置于所述微量滴定板上。以4x10e4拷贝/μl的浓度对质粒进行移液。
对于随后的PCR扩增，按照以下移液方案通过加入溶液重新溶解对应每种混合物的干组合物。在PCR运行之前将液体参照移液至微量滴定板的空孔中。
结果：
图13-14概述了该实施例的PCR扩增曲线，其中在不含质粒下干燥后的曲线用“1”标号，在含质粒下干燥后的曲线用“2”标号，液体参照曲线(未干燥)用“3”标号。此外，下表概述了由图13-14的曲线获得的PCR值。
该实施例清楚地显示，即使在干燥之前将质粒加入液体混合物中，在干组合物的储存和重新溶解后AptaTaq DNA聚合酶NTQ12-46A的性能也是不受影响的。
序列表
<110>罗赫诊断器材股份有限公司
霍夫曼-拉罗奇有限公司
<120>含稳定聚合酶的反应化合物的干组合物
<130>25614 FT
<150>EP08022082
<151>2008-12-19
<160>10
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>正向引物Eamst
<400>1
gtggcggcac catgtct 17
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>反向引物Eamst
<400>2
ctggttaaaa agattggttg cga 23
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Fam-Tamra探针Eamst
<400>3
cagctggacc tacgggagcg gg 22
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>正向引物Wsebi
<400>4
ggcttagtga atccttcgga g 21
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>反向引物Wsebi
<400>5
gtttacccaa ctttgcagtc ca 22
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Fam-Tamra探针Wsebi
<400>6
tgtgccgttg ccggctcaaa tag 23
<210>7
<211>3227
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Eamst质粒
<400>7
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatagatc ctgaggatcg gggtgataaa tcagtctgcg ccacatcggg ggaaacaaaa 240
tggcgcgaga tctaaaaaaa aaggctccaa aaggagcctt tcgcgctacc aggtaacgcg 300
ccactccgac gggattaacg agtgccgtaa acgacgatgg ttttaccgtg tgcggagatc 360
aggttctgat cctcgagcat cttaagaatt cgtcccacgg tttgtctaga gcagccgaca 420
atctgggtgg cggcaccatg tctggtcctc gagcgtatgg ggctttgtca cccgctcccg 480
taggtccagc tggcagctag cctcgcaacc aatcttttta accagccaat ttcctgacgg 540
gtaattttga tttgcatgcc gtccgggtga gtcatagcgt ctggttgttt tgccagattc 600
agcagagtct gtgcaatgcg gccgctgacg tcgaggaacg ccaggttgcc cactttctca 660
ctagtgacct gcagccggcg cgccatctgt gcagacaaac gcatcaggat atccggattt 720
acctgaatca attggcgaaa ttttttgtac gaaatttcag ccacttcaca ggcggttttc 780
gcacgtaccc atgcgctacg ttcctggccc tcttcaaaca ggcccagttc gccaataaaa 840
tcaccctgat tcagatagga gaggatcatt tctttaccct cttcgtcttt gatcagcact 900
gccacagagc ctttaacgat gtagtacagc gtttccgctt tttcaccctg gtgaataagc 960
gtgctcttgg atgggtactt atgaatgtgg caatgagaca agaaccattc gagagtagga 1020
tccgtttgag gtttaccaag taccataaga tccttaaatt tttattatct agctagatga 1080
taatattata tcaagaattg tacctgaaag caaataaatt ttttatctgg cttaactatg 1140
cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 1200
gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 1260
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 1320
ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 1380
ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 1440
atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 1500
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 1560
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 1620
ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 1680
ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 1740
acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 1800
gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 1860
ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 1920
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 1980
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 2040
ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 2100
agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 2160
ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 2220
gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 2280
catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 2340
cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 2400
cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 2460
gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 2520
tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 2580
gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 2640
tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 2700
gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 2760
gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 2820
taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 2880
tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 2940
ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 3000
taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 3060
tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 3120
aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgctaagaaa ccattattat 3180
catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 3227
<210>8
<211>3200
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Wasabi质粒
<400>8
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatagatc ctgaggatcg gggtgataaa tcagtctgcg ccacatcggg ggaaacaaaa 240
tggcgcgaga tctaaaaaaa aaggctccaa aaggagcctt tcgcgctacc aggtaacgcg 300
ccactccgac gggattaacg agtgccgtaa acgacgatgg ttttaccgtg tgcggagatc 360
aggttctgat cctcgagcat cttaagaatt cgtcccacgg tttgtctaga gcagccgaca 420
atctgggttt acccaacttt gcagtccaaa tgtgccgttg ccggctcaaa tagaccactc 480
cgaaggattc actaagcccc aatttcctga cgggtaattt tgatttgcat gccgtccggg 540
tgagtcatag cgtctggttg ttttgccaga ttcagcagag tctgtgcaat gcggccgctg 600
acgtcgagga acgccaggtt gcccactttc tcactagtga cctgcagccg gcgcgccatc 660
tgtgcagaca aacgcatcag gatatccgga tttacctgaa tcaattggcg aaattttttg 720
tacgaaattt cagccacttc acaggcggtt ttcgcacgta cccatgcgct acgttcctgg 780
ccctcttcaa acaggcccag ttcgccaata aaatcaccct gattcagata ggagaggatc 840
atttctttac cctcttcgtc tttgatcagc actgccacag agcctttaac gatgtagtac 900
agcgtttccg ctttttcacc ctggtgaata agcgtgctct tggatgggta cttatgaatg 960
tggcaatgag acaagaacca ttcgagagta ggatccgttt gaggtttacc aagtaccata 1020
agatccttaa atttttatta tctagctaga tgataatatt atatcaagaa ttgtacctga 1080
aagcaaataa attttttatc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag 1140
tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc 1200
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 1260
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 1320
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 1380
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 1440
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 1500
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 1560
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 1620
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 1680
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 1740
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 1800
ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 1860
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 1920
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 1980
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 2040
tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 2100
ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 2160
gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 2220
tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 2280
cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 2340
ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 2400
gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 2460
caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 2520
gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 2580
ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 2640
tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 2700
caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 2760
tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 2820
cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 2880
ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 2940
aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 3000
tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 3060
gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 3120
gaaaagtgcc acctgctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg 3180
tatcacgagg ccctttcgtc 3200
<210>9
<211>46
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>适配体NTQ12-46A
<400>9
cgatcatctc agaacattct tagcgttttg ttcttgtgta tgatcg 46
<210>10
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>适配体21-42-P
<400>10
gatcatctca gaacattctt agcgttttgt tcttgtgtat ga 42
<110>罗赫诊断器材股份有限公司
霍夫曼-拉罗奇有限公司
<120>含稳定聚合酶的反应化合物的干组合物
<130>25614 FT
<150>EP08022082
<151>2008-12-19
<160>10
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>正向引物Eamst
<400>1
gtggcggcac catgtct 17
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>反向引物Eamst
<400>2
ctggttaaaa agattggttg cga 23
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Fam-Tamra探针Eamst
<400>3
cagctggacc tacgggagcg gg 22
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>正向引物Wsebi
<400>4
ggcttagtga atccttcgga g 21
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>反向引物Wsebi
<400>5
gtttacccaa ctttgcagtc ca 22
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Fam-Tamra探针Wsebi
<400>6
tgtgccgttg ccggctcaaa tag 23
<210>7
<211>3227
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Eamst质粒
<400>7
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatagatc ctgaggatcg gggtgataaa tcagtctgcg ccacatcggg ggaaacaaaa 240
tggcgcgaga tctaaaaaaa aaggctccaa aaggagcctt tcgcgctacc aggtaacgcg 300
ccactccgac gggattaacg agtgccgtaa acgacgatgg ttttaccgtg tgcggagatc 360
aggttctgat cctcgagcat cttaagaatt cgtcccacgg tttgtctaga gcagccgaca 420
atctgggtgg cggcaccatg tctggtcctc gagcgtatgg ggctttgtca cccgctcccg 480
taggtccagc tggcagctag cctcgcaacc aatcttttta accagccaat ttcctgacgg 540
gtaattttga tttgcatgcc gtccgggtga gtcatagcgt ctggttgttt tgccagattc 600
agcagagtct gtgcaatgcg gccgctgacg tcgaggaacg ccaggttgcc cactttctca 660
ctagtgacct gcagccggcg cgccatctgt gcagacaaac gcatcaggat atccggattt 720
acctgaatca attggcgaaa ttttttgtac gaaatttcag ccacttcaca ggcggttttc 780
gcacgtaccc atgcgctacg ttcctggccc tcttcaaaca ggcccagttc gccaataaaa 840
tcaccctgat tcagatagga gaggatcatt tctttaccct cttcgtcttt gatcagcact 900
gccacagagc ctttaacgat gtagtacagc gtttccgctt tttcaccctg gtgaataagc 960
gtgctcttgg atgggtactt atgaatgtgg caatgagaca agaaccattc gagagtagga 1020
tccgtttgag gtttaccaag taccataaga tccttaaatt tttattatct agctagatga 1080
taatattata tcaagaattg tacctgaaag caaataaatt ttttatctgg cttaactatg 1140
cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 1200
gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 1260
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 1320
ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 1380
ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 1440
atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 1500
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 1560
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 1620
ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 1680
ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 1740
acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 1800
gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 1860
ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 1920
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 1980
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 2040
ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 2100
agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 2160
ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 2220
gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 2280
catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 2340
cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 2400
cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 2460
gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 2520
tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 2580
gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 2640
tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 2700
gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 2760
gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 2820
taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 2880
tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 2940
ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 3000
taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 3060
tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 3120
aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgctaagaaa ccattattat 3180
catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 3227
<210>8
<211>3200
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Wasabi质粒
<400>8
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatagatc ctgaggatcg gggtgataaa tcagtctgcg ccacatcggg ggaaacaaaa 240
tggcgcgaga tctaaaaaaa aaggctccaa aaggagcctt tcgcgctacc aggtaacgcg 300
ccactccgac gggattaacg agtgccgtaa acgacgatgg ttttaccgtg tgcggagatc 360
aggttctgat cctcgagcat cttaagaatt cgtcccacgg tttgtctaga gcagccgaca 420
atctgggttt acccaacttt gcagtccaaa tgtgccgttg ccggctcaaa tagaccactc 480
cgaaggattc actaagcccc aatttcctga cgggtaattt tgatttgcat gccgtccggg 540
tgagtcatag cgtctggttg ttttgccaga ttcagcagag tctgtgcaat gcggccgctg 600
acgtcgagga acgccaggtt gcccactttc tcactagtga cctgcagccg gcgcgccatc 660
tgtgcagaca aacgcatcag gatatccgga tttacctgaa tcaattggcg aaattttttg 720
tacgaaattt cagccacttc acaggcggtt ttcgcacgta cccatgcgct acgttcctgg 780
ccctcttcaa acaggcccag ttcgccaata aaatcaccct gattcagata ggagaggatc 840
atttctttac cctcttcgtc tttgatcagc actgccacag agcctttaac gatgtagtac 900
agcgtttccg ctttttcacc ctggtgaata agcgtgctct tggatgggta cttatgaatg 960
tggcaatgag acaagaacca ttcgagagta ggatccgttt gaggtttacc aagtaccata 1020
agatccttaa atttttatta tctagctaga tgataatatt atatcaagaa ttgtacctga 1080
aagcaaataa attttttatc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag 1140
tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc 1200
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 1260
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 1320
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 1380
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 1440
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 1500
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 1560
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 1620
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 1680
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 1740
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 1800
ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 1860
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 1920
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 1980
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 2040
tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 2100
ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 2160
gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 2220
tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 2280
cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 2340
ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 2400
gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 2460
caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 2520
gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 2580
ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 2640
tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 2700
caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 2760
tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 2820
cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 2880
ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 2940
aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 3000
tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 3060
gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 3120
gaaaagtgcc acctgctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg 3180
tatcacgagg ccctttcgtc 3200
<210>9
<211>46
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>适配体NTQ12-46A
<400>9
cgatcatctc agaacattct tagcgttttg ttcttgtgta tgatcg 46
<210>10
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>适配体21-42-P
<400>10
gatcatctca gaacattctt agcgttttgt tcttgtgtat ga 42
Claims (13)
1.制备反应化合物的可储存干组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供反应化合物的液体混合物，所述液体混合物包含引物、核苷酸、Taq DNA聚合酶和第一稳定分子，其中所述第一稳定分子选自酪蛋白和BSA，以及
b)通过降低所述液体混合物周围的压力干燥所述液体混合物，
其中所述反应化合物的干组合物可溶于水溶液中，
所述方法的特征在于步骤a)的所述反应化合物的液体混合物进一步包含作为第二稳定分子的适配体，其中所述适配体选自序列SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10。
2.权利要求1的方法，其中所述反应化合物的液体混合物是含有镁盐的缓冲水溶液。
3.权利要求1或2的方法，其中在步骤b)中所述液体混合物周围的压力下降至低于600mbar。
4.权利要求3的方法，其中在步骤b)中所述液体混合物周围的压力下降至低于400mbar。
5.权利要求4的方法，其中在步骤b)中所述液体混合物周围的压力下降至200mbar。
6.权利要求1或2的方法，其中在步骤b)中所述干燥在室温下完成。
7.权利要求1或2的方法，其中所述反应化合物的液体混合物进一步包含检测探针。
8.权利要求7的方法，其中所述检测探针是荧光标记探针。
9.权利要求1或2的方法，其中所述反应化合物的液体混合物进一步包含模板DNA。
10.反应化合物的干组合物，所述干组合物包含引物、核苷酸、Taq DNA聚合酶、第一稳定分子和作为第二稳定分子的适配体，其中所述第一稳定分子选自酪蛋白和BSA，所述适配体选自序列SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10以及所述干组合物室温下储存至少1周后重新溶解时提供PCR活性。
11.权利要求10的反应化合物的干组合物，其中所述反应化合物的干组合物进一步包含检测探针。
12.实施PCR扩增的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过加入水溶液重新溶解权利要求10-11任一项的反应化合物的干组合物，并且
b)用包含重新溶解的反应化合物的水溶液来实施热循环方案。
13.权利要求12的方法，其中所述水溶液包含待通过热循环方案扩增的靶核酸。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP08022082 | 2008-12-19 | ||
| EP08022082.5 | 2008-12-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101768616A CN101768616A (zh) | 2010-07-07 |
| CN101768616B true CN101768616B (zh) | 2014-07-09 |
Family
ID=40510578
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910263837.4A Active CN101768616B (zh) | 2008-12-19 | 2009-12-17 | 含稳定聚合酶的反应化合物的干组合物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US8652811B2 (zh) |
| EP (1) | EP2202302B1 (zh) |
| JP (2) | JP5731113B2 (zh) |
| CN (1) | CN101768616B (zh) |
| CA (1) | CA2688174C (zh) |
| ES (1) | ES2394754T3 (zh) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2566985A4 (en) * | 2010-05-06 | 2014-08-06 | Ibis Biosciences Inc | INTEGRATED SAMPLE PREPARATION SYSTEMS AND MIXTURES OF STABILIZED ENZYMES |
| EP2598661B1 (en) | 2010-07-26 | 2017-09-27 | Biomatrica, INC. | Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
| US9376709B2 (en) | 2010-07-26 | 2016-06-28 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing DNA and RNA in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
| CN103124797B (zh) | 2010-10-04 | 2015-04-22 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于在相同反应容器内的细胞裂解和pcr的方法 |
| JP5798631B2 (ja) | 2010-10-04 | 2015-10-21 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | Ｒｔ−ｐｃｒ反応緩衝液中での細胞溶解のための方法 |
| JP2013005796A (ja) * | 2011-05-26 | 2013-01-10 | Arkray Inc | 乾燥試薬、乾燥試薬キット、試薬器、乾燥試薬の製造方法 |
| EP2574931B1 (en) | 2011-09-29 | 2017-03-22 | Qiagen GmbH | Dry composition comprising a control dye |
| WO2013053855A1 (en) * | 2011-10-11 | 2013-04-18 | Qiagen Gmbh | Sample processing method and sample processing cartridge |
| EP2776577B1 (en) | 2011-11-07 | 2017-01-11 | Qiagen GmbH | Lysis method and lysis composition |
| EP2730653A1 (en) | 2012-11-07 | 2014-05-14 | QIAGEN GmbH | Method for lysing a fixed biological sample |
| CN103849548A (zh) | 2012-12-03 | 2014-06-11 | 三星电子株式会社 | 用于扩增核酸的试剂容器及其制备方法、存储试剂的方法和用于核酸分析的微流体系统 |
| US9725703B2 (en) | 2012-12-20 | 2017-08-08 | Biomatrica, Inc. | Formulations and methods for stabilizing PCR reagents |
| JP5904153B2 (ja) * | 2013-03-29 | 2016-04-13 | ソニー株式会社 | 核酸増幅反応用試料の調製方法、核酸増幅方法、固相状核酸増幅反応用試薬及びマイクロチップ |
| JP6474391B2 (ja) | 2013-06-11 | 2019-02-27 | ビオカルティ ナームローゼ フェノーツハップＢｉｏｃａｒｔｉｓ ＮＶ | 長期貯蔵のための生体分子乾燥方法 |
| US10036061B2 (en) * | 2013-12-20 | 2018-07-31 | Roche Molecular Systems, Inc. | Oligonucleotide inhibitor of DNA polymerases |
| JP6661554B2 (ja) | 2014-06-10 | 2020-03-11 | バイオマトリカ，インク． | 周囲温度における血小板の安定化 |
| EP3015553A1 (de) * | 2014-10-30 | 2016-05-04 | Biotecon Diagnostics GmbH | Stabilisierte Reaktionsmischung |
| SG11201804776SA (en) | 2015-12-08 | 2018-07-30 | Biomatrica Inc | Reduction of erythrocyte sedimentation rate |
| GB201716963D0 (en) * | 2017-10-16 | 2017-11-29 | Biofortuna Ltd | Compositions and methods for use in stabilising nucleic acid amplification assays |
| CN109486824B (zh) * | 2018-11-20 | 2021-11-16 | 安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司 | 一种特异性结合Taq酶的核酸适配体及其筛选方法、应用 |
| CN111961709A (zh) * | 2020-01-21 | 2020-11-20 | 上海酷乐生物科技有限公司 | 一种用于口腔拭子直接荧光pcr扩增的试剂和试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006131391A1 (en) * | 2005-06-10 | 2006-12-14 | Epigenomics Ag | Prognostic assay for prediction of treatment response and/or survival of breast cell proliferative disorder patients |
Family Cites Families (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3300474A (en) | 1964-02-12 | 1967-01-24 | Pharmacia Ab | Sucrose ether copolymerizates |
| US5118801A (en) | 1988-09-30 | 1992-06-02 | The Public Health Research Institute | Nucleic acid process containing improved molecular switch |
| GB8826429D0 (en) | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Univ Leeds Ind Service Ltd | Enzyme stabilisation systems |
| GB8903593D0 (en) | 1989-02-16 | 1989-04-05 | Pafra Ltd | Storage of materials |
| ES2259800T3 (es) | 1990-06-11 | 2006-10-16 | Gilead Sciences, Inc. | Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico. |
| US5270163A (en) | 1990-06-11 | 1993-12-14 | University Research Corporation | Methods for identifying nucleic acid ligands |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5200399A (en) | 1990-09-14 | 1993-04-06 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Method of protecting biological materials from destructive reactions in the dry state |
| US5538848A (en) * | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| US5565318A (en) | 1994-09-02 | 1996-10-15 | Pharmacia Biotech, Inc. | Room temperature stable reagent semi-spheres |
| US5593824A (en) | 1994-09-02 | 1997-01-14 | Pharmacia Biotech, Inc. | Biological reagent spheres |
| PT912766E (pt) | 1996-06-04 | 2009-07-16 | Univ Utah Res Found | Monitorização da hibridização durante a pcr |
| JP4281877B2 (ja) | 1996-06-04 | 2009-06-17 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | 生物学的プロセスを実行し且つモニタリングするためのシステムと方法 |
| EP1002875A1 (en) * | 1998-11-17 | 2000-05-24 | Mira Diagnostica GmbH | An oligonucleotide inhibitor of thermostable polymerase |
| PL202358B1 (pl) | 1999-11-17 | 2009-06-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, magnetyczne cząstki szklane, kompozycja magnetycznych cząstek szklanych, zawiesina z magnetycznymi cząstkami szklanymi, probówka z kompozycją lub zawiesiną magnetycznych cząstek szklanych, zestaw części z tą probówką, zastosowanie kompozycji, zawiesiny i zestawu zawierających magnetyczne cząstki szklane, sposób izolowania materiału biologicznego |
| WO2003057910A2 (en) | 2002-01-08 | 2003-07-17 | Roche Diagnostics Gmbh | Use of silica material in an amplification reaction |
| US7407747B2 (en) * | 2002-10-15 | 2008-08-05 | Applera Corporation | Method for drying dye-terminator sequencing reagents |
| CA2521127C (en) * | 2003-04-01 | 2014-05-27 | Eragen Biosciences, Inc. | Polymerase inhibitor and method of using same |
| EP1502958A1 (en) * | 2003-08-01 | 2005-02-02 | Roche Diagnostics GmbH | New detection format for hot start real time polymerase chain reaction |
| JPWO2005030958A1 (ja) * | 2003-09-30 | 2007-11-15 | 独立行政法人理化学研究所 | 酵素が固定されている支持体、印刷物、試薬キット、該支持体の製造法、酵素の保存法及び酵素の再生法 |
| US20060099567A1 (en) * | 2004-04-08 | 2006-05-11 | Biomatrica, Inc. | Integration of sample storage and sample management for life science |
| WO2007106579A2 (en) * | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Micronics, Inc. | Integrated nucleic acid assays |
| ATE555216T1 (de) * | 2006-05-23 | 2012-05-15 | Molecular Detection Inc | Umgebungstemperaturstabile kits für die molekulare diagnostik |
| CA2663440C (en) | 2006-09-18 | 2014-07-08 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | Preparation of glassified biological reagents |
| DE102006056790B3 (de) * | 2006-12-01 | 2008-01-17 | IfP Privates Institut für Produktqualität GmbH | Laboreinmalartikel für Analyse und Diagnosik |
| JP2010529850A (ja) * | 2007-06-16 | 2010-09-02 | エニグマ ディアグノスティックス リミテッド | 組成物 |
-
2009
- 2009-12-11 CA CA2688174A patent/CA2688174C/en active Active
- 2009-12-17 ES ES09015595T patent/ES2394754T3/es active Active
- 2009-12-17 JP JP2009286615A patent/JP5731113B2/ja active Active
- 2009-12-17 CN CN200910263837.4A patent/CN101768616B/zh active Active
- 2009-12-17 EP EP09015595A patent/EP2202302B1/en active Active
- 2009-12-18 US US12/641,747 patent/US8652811B2/en active Active
-
2014
- 2014-01-31 US US14/169,993 patent/US9163286B2/en active Active
-
2015
- 2015-01-09 JP JP2015003548A patent/JP2015091261A/ja active Pending
- 2015-09-16 US US14/855,915 patent/US9631233B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006131391A1 (en) * | 2005-06-10 | 2006-12-14 | Epigenomics Ag | Prognostic assay for prediction of treatment response and/or survival of breast cell proliferative disorder patients |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2688174A1 (en) | 2010-06-19 |
| US9163286B2 (en) | 2015-10-20 |
| US9631233B2 (en) | 2017-04-25 |
| CN101768616A (zh) | 2010-07-07 |
| EP2202302B1 (en) | 2012-09-12 |
| US20160237473A1 (en) | 2016-08-18 |
| CA2688174C (en) | 2018-08-07 |
| US20100159529A1 (en) | 2010-06-24 |
| JP2015091261A (ja) | 2015-05-14 |
| US20140162267A1 (en) | 2014-06-12 |
| ES2394754T3 (es) | 2013-02-05 |
| JP5731113B2 (ja) | 2015-06-10 |
| JP2010142229A (ja) | 2010-07-01 |
| US8652811B2 (en) | 2014-02-18 |
| EP2202302A1 (en) | 2010-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101768616B (zh) | 含稳定聚合酶的反应化合物的干组合物 | |
| CN113227368B (zh) | 工程化酶 | |
| CN104152572B (zh) | 同时检测三种链球菌的三重实时荧光pcr方法及试剂盒 | |
| CN113584033B (zh) | 一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其构建方法和在赤霉菌中的应用 | |
| AU2016201212B2 (en) | Plants with altered levels of vegetative starch | |
| CN101775410B (zh) | 一种鸡痘病毒载体穿梭质粒及其应用 | |
| CN107384958B (zh) | 基于反向遗传学构建的rsv反基因组质粒及其应用 | |
| CN110734480B (zh) | 大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用 | |
| KR101578445B1 (ko) | 구제역 a형 중동 유래 아시아 지역형의 방어항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법 | |
| CN1425075A (zh) | 差异表达筛选方法 | |
| US6537767B1 (en) | Method for screening antimycotically active substances | |
| KR102160215B1 (ko) | 자일로스 이용능이 개선된 야로위아 리폴리티카 균주 및 이의 제조방법 | |
| CN107151676B (zh) | 高灵敏监测POPs的转荧光蛋白基因鱼的制作与应用 | |
| KR101578444B1 (ko) | 구제역 a형 한국분리주를 이용한 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법 | |
| CN111378684B (zh) | 一种热诱导的基因编辑系统CRISPR-Cas12b在陆地棉中的应用 | |
| CN113186140B (zh) | 用于预防和/或治疗宿醉和肝病的基因工程细菌 | |
| CN106399373B (zh) | 一种Cas9表达载体 | |
| CN114959919A (zh) | 一种构建酿酒酵母人工小启动子文库的方法及应用 | |
| KR102335524B1 (ko) | 뉴캐슬병 바이러스 벡터 기반 pten 유전자 삽입 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 뇌종양 치료용 암용해바이러스 및 이를 이용한 뇌종양 치료용 조성물 | |
| CN111139210A (zh) | 一种重组甲基营养菌和口服疫苗 | |
| CN110305873A (zh) | 共编辑标记ben-1sgRNA靶位点及其CRISPR/Cas9共编辑系统和应用 | |
| CN113684240B (zh) | 利用原位倍增blm基因簇及双报告基因制备博莱霉素高产菌株的方法及其应用 | |
| CN110747216A (zh) | 一种多基因共表达成套载体及其应用 | |
| CN104450768B (zh) | 一种靶向酵母线粒体的穿梭载体及其应用 | |
| CN108728484A (zh) | 用于获得无标记转基因植物的载体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |