KR102335524B1 - 뉴캐슬병 바이러스 벡터 기반 pten 유전자 삽입 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 뇌종양 치료용 암용해바이러스 및 이를 이용한 뇌종양 치료용 조성물 - Google Patents

뉴캐슬병 바이러스 벡터 기반 pten 유전자 삽입 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 뇌종양 치료용 암용해바이러스 및 이를 이용한 뇌종양 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뉴캐슬병 바이러스 벡터 기반 PTEN(phosphatase and tensin homolog) 유전자 삽입 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 뇌종양 치료용 암용해바이러스 및 이를 이용한 뇌종양 치료용 조성물에 관한 것으로 PTEN 유전자 이상에 의한 뇌종양 치료를 목적으로 인간의 뇌까지 전파될 수 있는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV)에 PTEN 유전자를 포함하여, 이를 이용하는 경우 암세포에서 PTEN 단백질을 발현하여 뇌종양 세포 사멸을 통한 뇌종양 치료가 가능함을 확인하였다. 따라서 본 발명은 인간 PTEN 단백질 유전자를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스로서 뇌종양 세포에 감염되어 정상적인 PTEN 단백질을 발현하여 뇌종양 세포 사멸 또는 뇌종양 조직 축소를 통해 임상 증상 감소 도는 부분 관해 도는 완전 관해를 유도할 수 있는 치료용 바이러스 제제에 관한 것이다.

Description

뉴캐슬병 바이러스 벡터 기반 PTEN 유전자 삽입 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 뇌종양 치료용 암용해바이러스 및 이를 이용한 뇌종양 치료용 조성물{Oncolytic recombinant newcastle disease virus contain PTEN gene constructed by based on the Newcastle disease virus for glioblastoma treatment and its composition}
본 발명은 뇌종양 치료를 위한 암용해바이러스(oncolytic virus) 개발 및 이를 이용한 치료 및 치료제에 대한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) 벡터 기반 PTEN(Phosphatase and tensin homolog) 유전자가 삽입된 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 뇌종양 치료용 암용해바이러스 및 이를 이용한 뇌종양 치료 조성물에 관한 것이다.
교묘세포종 또는 뇌종양은 뇌의 신경 아교 세포(glia, neuroglia, glial cell) 세포에서 유래하여 발생하는 가장 흔하고 심각한 증상의 암이다. 또한, 중추신경계에서 발생하는 심각한 암이기도 하다. 이러한 교묘세포종 또는 뇌종양에 사용되는 일반적인 치료법은 수술요법과 화학치료 또는 방사선 치료와 같은 방법을 병용으로 사용하고 있다. 환자에서 발생하는 가장 흔한 임상적 증상은 지속적인 두통, 구토, 부등상시, 미각 상실, 갑작스러운 성격 변화, 현기증, 뇌출혈 등 암 조직이 영향을 미치는 뇌 조직 부위에 따른 다양한 증상이 발생할 수 있다. 뇌 신생물 중 악성에 해당하는 75% 이상이 뇌종양 또는 교모세포종인 것으로 알려져 있다. 악성 뇌종양의 단계와 뇌종양의 모양은 glial 세포에서 유래되어 어떻게 어떤 형태로 뇌조직에 형성 여부에 영향을 받으며 이러한 이유로 인해 환자에 따른 효과적인 치료제가 아직 개발되지 못하고 있는 실정이다.
암용해바이러스(oncolytic virus) 치료는 암치료의 새로운 바이오의약품으로서 새로운 접근을 하고 있으며 실험과 임상 수준에서 상당한 발전을 이루고 있다. 최근에 바이러스 치료에 이용되는 oncolytic virus는 바이러스 자체가 oncolyitc 성질을 가지고 있는 것을 이용하는 방법과 암세포 특이적으로 작용하여 암세포 사멸 효과를 가지는 유전자를 삽입한 바이러스 또는 두 가지 방법 모두를 이용하고 있다.
이에, 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV)를 이용한 다양한 암치료 효과에 대한 연구가 진행되고 있다. NDV는 바이러스 자체적으로 암세포에서만 증식이 활발하게 일어나 암세포 사멸을 유도하는 oncolytic 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이는 정상세포에서 유도되는 인터페론 알파(interferon-α)가 암세포에서는 매우 약하게 또는 반응하지 않는 특성에 의해 oncolytic 효과를 갖는 것으로 알려져 있으며 최근 연구에 따르면 특정 바이러스 단백질에 의한 암세포 면역반응 유도 및 세포사멸(apoptosis) 효과 증진에 따른 암세포 사멸 효과를 갖는 것으로 밝혀져 있다. NDV는 정상 세포에 감염되는 경우 감염된 세포에 의한 인터페론 알파에 의한 면역반응에 의해 쉽게 NDV 바이러스의 RNA 게놈이 파괴되어 증식하지 못하여 포유류 감염성이 없으며 바이러스에 의한 항체 형성도 되지 않는 것으로 밝혀져있다. 이러한 NDV의 특징은 바이러스를 이용한 암치료제로서의 장점이 될 수 있다. 1950년대 강독성(velogenic) NDV 바이러스 주를 이용한 암세포 사멸 효과를 시험하였으며 특정 경우에는 암환자를 대상으로 한 임상시험도 진행되었다. 여러 연구과 임상시험을 통해 NDV를 이용한 암 치료가 전망이 좋을 것이라는 여러 증거가 확보되었고, NDV는 정상적인 포유류 세포에는 감염되지 않을 뿐만 아니라 반복되는 NDV 접종에 의한 부작용 없이 암세포 사멸 효과나 암 조직 성장 저해 효과가 유지되며, 임상시험에서도 5년간 NDV 바이러스 접종으로 암환자가 5년이상 생존한 경우도 있었다. 그러나 강독성 NDV는 닭에 감염되는 치명적인 바이러스로서 양계 산업에 매우 위험한 바이러스로 강독성 바이러스로 암 치료제 개발에 한계가 발생하였다.
2000년대 많은 과학자들은 중간독(mesogenic) NDV 바이러스를 이용한 oncolytic 바이러스 개발을 시작하였다. 그러나 중간독 NDV 바이러스는 병원성이 줄어든 만큼 암세포 사멸 효과나 암 조직 성장 저해 효과등에서 강독주 NDV에 비해 효능이 떨어지는 것으로 확인되었다. 낮은 효능을 보이는 가장 큰 이유는 중간독 NDV 바이러스가 용원성(lysogenic) 바이러스와 같은 성격을 가지며 감염된 암세포에서 다른 암세포로 다시 재감염이 쉽게 일어나지 못하는 단점이 있기 때문이다. 그럼에도 불구하고 뇌종양 치료에 NDV를 지속적으로 이용하고자 하는 가장 큰 장점은 NDV가 신경계 감염을 통해 뇌혈관막(Blood-Brain Barrier, BBB)를 통과하여 뇌까지 전파 감염될 수 있어 뇌종양 세포에 감염되어 뇌종양 세포를 사멸시킬 수 있다는 큰 이유가 있기 때문이다. 이러한 중간독 NDV의 결점을 극복하기 위하여 다양한 암세포사멸과 암 조직 성장 억제 유전자를 포함하는 재조합 NDV가 개발되기 시작하였다. 암억제 유전자가 삽입된 재조합 NDV 바이러스는 기존의 중간독 NDV 바이러스에 비해 보다 좋은 효능을 보여주고 있으며 NDV에 관련된 다양한 연구를 통해 지속적인 발전을 이루고 있다.
한편, PTEN(Phophatase and tensin homolog)는 잘 알려진 암 억제 유전자로서 PIP3(Phospho-inositol triphosphate)의 3’ phosphate를 제거하여 PIP2(phospho-inositol biphosphate)로 전환시키는 효소이다. 이는 탈인산화(Dephosphorylation)을 통해 세포의 이동, 생존 세포 증식 등이 조절된다. 또한, PTEN 유전자의 결손이나 돌연변이에 의해 PTEN의 효소 활성이 없어져 암이 발생하는 동안 세포 사멸을 억제하고 세포 증식을 활발하게 촉진하는 것으로 알려져 있다. PTEN 유전자의 이상이 암 발생의 원인으로 알려진 것은 전립선암, 내배엽유래 암, 유방암, 폐암 등이 있으며 최근 뇌종양 환자의 50% 이상에서 PTEN 이상으로 인해 phosphatidylinositol 3-OH kinease 경로의 이상이 중요한 원인으로 밝혀지고 있다. PTEN의 약화된 탈인산화효소(phosphatase) 활성은 암 억제에 밀접한 관련이 있고 또한 세포 주기 조절, 증식 조절 등에 중요한 유전자이다. 따라서 본 발명은 재조합 NDV 바이러스에 뇌종양의 원인으로 알려져 있는 PTEN 유전자를 삽입하여 뇌종양에 대한 바이러스 치료제 개발을 위한 방법을 제공하기 위한 것으로, 더욱 구체적으로는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) 벡터 기반 PTEN(Phosphatase and tensin homolog) 유전자가 삽입된 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 뇌종양 치료용 암용해바이러스 및 이를 이용한 뇌종양 치료 조성물에 관한 것이다.
KR 10-2019-0019236
본 발명의 목적은 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) cDNA 및 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 포함하는 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터 및 암 억제 유전자 PTEN(phosphatase and tensin homolog) 유전자를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 바이러스를 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 이로부터 정제된 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
아울러, 본 발명의 다른 목적은 PTEN 유전자를 포함하며 이를 암세포 내에서 단백질로 발현 할 수 있는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
마지막으로, 본 발명의 다른 목적은 인간을 제외한 동물에서의 뇌종양 치료 효과를 평가하는 방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) cDNA 및 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 유효성분으로 포함하는 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터에서, 상기 트랜스진 카세트(transgene cassette)는 IGS 서열(GE(Gene end), IG(Intergenic sequence) 및 GS(Gene start)) 및 MCS(Multiple cloning site)로 이루어진 것인, 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 ‘벡터’는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 ‘트랜스진 카세트(transgene cassette)’는 뉴캐슬병 바이러스의 NP 유전자와 P 유전자 사이에 삽입되는 것을 특징으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 ‘LVP-K1 벡터’는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 kozak sequence를 더 포함하는 것을 특징으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 LVP-K1 벡터에서, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PTEN 유전자를 더 포함하는, LVP-K1-PTEN 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 ‘벡터’는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 ‘PTEN 유전자’는 NP와 P 유전자 사이에 도입된 것을 특징으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 LVP-K1-PTEN 벡터가 도입된 재조합 뉴캐슬병 바이러스(수탁번호 KCTC 14422BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 재조합 뉴캐슬병 바이러스로부터 정제된 항원을 더 포함하는 것을 특징으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제9항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양을 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제9항의 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 동물에서의 뇌종양 예방 또는 치료 효과 평가 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 ‘방법’은 인간을 제외한 동물의 암세포 또는 암 조직의 변화를 측정하여 평가하는 것으로할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
마지막으로, 본 발명은 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 숙주 세포주에 접종하는 단계; 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는, 재조합 뉴캐슬병 바이러스 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 뇌종양 발생 원인의 50% 이상으로 확인되고 있는 PTEN(phosphatase and tensin homolog) 유전자 이상에 의한 뇌종양 치료를 목적으로 인간의 뇌까지 전파될 수 있는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV)에 PTEN 유전자를 포함하여, 이를 이용하는 경우 암세포에서 PTEN 단백질을 발현하여 뇌종양 세포 사멸을 통한 뇌종양 치료가 가능함을 확인하였다. 따라서 상기 뇌종양 치료 효과를 위해 본 발명에서는 LVP-K1-PTEN oncolytic virus를 개발하여 안전하고, 효능이 뛰어난 뇌종양 치료제 개발을 완성하였고, 이는 뇌종양으로 인한 환자의 치료와 뇌종양 악화를 억제하여 뇌종양 치료에 기여할 수 있을 것이다.
도 1a는 본 발명의 NDV VG/GA strain을 cDNA로 합성하여 pBR322 벡터로의 삽입과정을 나타내며, 도 1b는 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN 벡터의 유전자 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN 바이러스 작출 후 바이러스의 확인, PTEN 유전자 확인, 벡시니아 바이러스의 제거 확인을 위한 RT-PCR 산물을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포에서의 PTEN mRNA의 상대적인 전사량을 나타낸 도이다(*은 P value 0.05 이하, **은 P value 0.01 이하를 나타냄).
도 4는 웨스턴 블랏(Western Blot)을 이용하여 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN, LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포에서의 상대적인 PTEN 단백질의 발현량을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포의 사멸도를 나타낸 도이다(*은 P value 0.05 이하, **은 P value 0.01 이하를 나타냄).
도 6은 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포의 세포 변성 효과(cytopathic effect)를 현미경을 통해 관찰한 도이다.
도 7은 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스를 Xenograft에 꼬리 정맥 또는 암에 직접 주사하여 암 크기 감소를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스를 Xenograft에 꼬리 정맥 또는 암에 직접 주사하여 암 크기 감소를 1일마다 그래프로 나타낸 도이다(*은 P value 0.05 이하, **은 P value 0.01 이하를 나타냄).
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 이로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는(w/w) %, 고체/액체는(w/v) %, 그리고 액체/액체는(v/v) %이다.
이하, 본 발명에 대하여보다 상세하게 설명하도록 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) cDNA 및 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 유효성분으로 포함하는 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터를 제공한다.
또한, 상기 트랜스진 카세트(transgene cassette)는 IGS 서열(Gene end(GE), Intergenic sequence(IG), Gene start(GS)) 및 Multiple cloning site(MCS)로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV)”는 약 15kb 정도 (-)sense RNA 게놈을 가지고 있는 paramyxovirus에 속하며 인체감염성 없는 포유류에 안전한 바이러스로 알려져 있다. NDV 게놈 RNA는 30 base 정도의 extragenic leader 서열을 가지고 있으며 50 base 정도의 tail 서열을 가지고 있다. 양쪽 말단의 두 서열은 바이러스의 유전자의 전사(transcription)와 복제 replication) 그리고 새롭게 합성된 RNA 게놈을 바이러스 파티클 안에 봉입(encapsidation) 과정을 조절하는 것으로 알려져 있다. NDV 유전자 구성은 양쪽 말단 리더와 꼬리 유전자 사이에 NP, P, M, F, HN 및 L을 포함하는 6개의 유전자로 구성되어 있으며 각각의 유전자는 nucleoprotein(NP), phosphoprotein(P), matrix protein(M), fusion protein(F), hemagglutinin-neuraminidase protein(HN), large protein(L)을 암호화하고 있다.
상기 뉴캐슬병 바이러스는 각각의 유전자 사이에 IGS(GE-IG-GS) 서열이 존재하고 있으며 숙주세포 감염 초기 각각의 유전자는 전사과정을 거쳐 숙주세포의 소포체(endoplasmic reticulum, ER)으로 이동 단백질을 합성하게 된다. 이후 M protein 합성량이 일정 수준 이상으로 올라가게 되면 (+)sense RNA 게놈을 합성하고 이를 주형으로 하여 (-)sense RNA 게놈을 합성하게 된다. 완성된 바이러스 파티클은 세포 밖으로 배출되게 된다.
상기 뉴캐슬병 바이러스의 외부 유전자 도입 능력은 최대 6 kb 정도인 것으로 알려져 있으며 외래 유전자 도입은 주로 P과 M 유전자 사이 그리고 HN과 L 유전자 사이에 이루어져 왔다. 다만 6개의 유전자 사이에 외래유전자 도입이 모두 가능한 것으로 알려져 있으나 각각의 위치에 따라 mRNA 발현, 단백질 발현 그리고 심한 경우 바이러스 증식에도 영향이 있는 것으로 알려져 있으나 각각의 위치에 따라 정량적인 비교 시험은 이루어지지 않은 상태이다. 각각의 유전자 사이에는 GE-IG-GS 유전자가 있으며 특히 IG 유전자의 경우 NP-P, P-M, M-F 사이에는 1개 또는 2개의 뉴클레오티드를 가지고 있으며 F-HN 사이는 35개, HN-L 사이는 47개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 바이러스 감염 후 (-)sense RNA 게놈은 NDV가 보유하고 있는 NP, P, 및 L 단백질에 의해 감염 초기 각 단백질의 mRNA를 합성하여 합성된 mRNA가 숙주 세포의 소포체로 이동하여 각 유전자의 단백질을 합성하게 된다. 이후 NP, P, L 단백과 M 단백의 상호작용에 의해 (+)sense RNA 게놈을 합성하고 이를 주형으로 많은 copy의 (-)sense RNA 게놈을 합성하고 숙주세포 밖으로 방출되게 된다. 최초 감염시 자가 단백질 생산을 위한 mRNA의 합성량은 N 말단, 즉 NP mRNA가 가장 많이 합성되고 이후 N 말단으로부터 멀어질수록 mRNA 합성은 줄어드는 것으로 알려져 있다.
뉴캐슬병 바이러스의 cDNA 구축에는 NDV (-)sense RNA 게놈을 reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)법을 통해 여러 조각의 double strand DNA로 만든 이후 각각의 조각을 다시 ligation 하여 전체 NDV의 cDNA clone을 만드는 방법이 사용되고 있다. 이 방법을 이용한 cDNA 작성은 reverse transcriptase의 특성상 point mutation이 일어날 가능성이 높아 cDNA를 다 작성한 이후에 sequencing을 통해 15 kb에 달하는 유전자 서열을 확인하고 하나 이상의 point mutation 이 발생하면 다시 NDV 게놈으로부터 cDNA를 만드는 과정을 반복해야 한다. cDNA 조각을 pBR322 벡터에 삽입하여 recombinant NDV를 구축한다.
또한, 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 통해 항원 단백질이 발현 또는 작동할 수 있도록 외래 유전자 삽입 가능한 위치에 쉽게 외래유전자를 도입할 수 있도록 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 만들어 삽입하였다. 트랜스진 카세트(transgene cassette)는 외래 유전자 삽입위치 N말단 앞쪽에 GE-IG-GS sequence 및 multi cloning site(MCS)로 구성되어 있으며, 다양한 제한효소(restriction enzyme) 서열과 함께 rule of six에 맞춰 NP 및 P 유전자 사이, P 및 M 유전자 사이, HN 및 L 유전자 사이에 삽입하여 제작할 수 있다. 바람직하게는 NP 및 P 유전자 사이, P 및 M 유전자 사이에 삽입하는 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 NP 및 P 유전자 사이에 삽입되는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터는 완벽하게 만들어진 recombinant NDV에 상기 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 각 유전자 사이에 넣고 4조각의 DNA로 나누어 각각의 NDV 조각 유전자를 pBR322 plasmid DNA에 라이게이션(ligation) 후 TOP10 E.coli 에 형질전환(transformation)하여 4종의 재조합 균주로 제작 보관한 후 새로운 유전자 도입 시 각 재조합 E. coli 균주로부터 유전자를 분리하고 본 유전자를 PCR을 이용하여 fragment를 획득한 후 overlap cloning 방법을 통해 재조합 NDV 바이러스를 제작하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기와 같은 방법으로 제작된 벡터는 매번 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 만드는 과정 중에 발생하는 point mutation을 막아주며 multiple cloning site(MCS)를 통해 쉽게 외래 유전자를 NDV cDNA에 삽입할 수 있다는 특징이 있다.
또한, 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것일 수 있으며, 이와 기능적으로 동등한 물질을 포함한다. 상기 “기능적 동등한 물질”이란 뉴클레오티드의 치환 결손의 결과로 상기 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열을 갖는 유전자와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 유전자 또는 유전자 조합을 말한다.
이어서, 본 발명은 상기 외래유전자 삽입용 LVP-K1 벡터 및 사람의 PTEN(Phosphatase and tensin homolog) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제공한다.
또한, PTEN 유전자는 뇌세포에서 암세포가 빠르게 성장하면서 포도당을 젖산으로 변환시키며 에너지 생산을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 일련의 대사과정에서 PTEN-PI3K-AKT-mTOR 신호 체계는 포도당 대사의 중심적인 역할을 하게 되는데 포도당 흡수 및 운반 지질생성 유도 단백질 합성에서 당화로 인한 ATP 소비 증가 등에 관련되어 있으며 PTEN 유전자 이상으로 인한 일련의 대사과정이 암세포 성장과 밀접한 관련이 있는 것으로 연구되고 있다. 이러한 PTEN 유전자 정보(Gene ID: NCBI Reference Sequence: NG_007466.2)를 바탕으로 확립된 유전자이다.
또한, 상기 PTEN 단백질은 사람의 다양한 기관의 세포에서 발현되는 단백질을 말하며, 바람직하게는 Glial cell에서 발현되는 PTEN 단백질 일 수 있고 정확한 아미노산 서열은 서열번호 4에 의해 나열된 서열일 수 있다.
PTEN 단백질을 코딩하는 유전자 확보를 위한 방법은 유전자 합성기기를 이용하여 인공적으로 합성하거나, 사람 세포에 존재하는 PTEN 유전자로부터 상보적 결합이 가능한 primer를 이용하여 polymerase chain reaction(PCR) 방법을 이용할 수 있다. 발현 시스템에 따라 코돈(codon)최적화로 인하여 사람의 PTEN 단백질을 코딩하는 유전자와 상이함이 있을 수 있어 재조합 PTEN을 코딩하는 유전자는 PTEN 단백질의 아미노산 잔기를 포함하는 다양한 염기서열 형태로 존재할 수 있다.
상기 PTEN 단백질의 유전자가 도입되는 숙주세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있으며, 도입되는 PTEN 단백질의 발현율이 높은 세포라면 제한되지 않고 사용될 수 있다. 예를 들어, 대장균, 포유류 세포주, 곤충 세포주, 진균, 효모, 재조합 바이러스와 같은 진핵 및 원핵 숙주 등이 있다.
또한, PTEN 단백질의 발현은 단순한 subunit 단백질로 발현될 수 있고 또는 특정한 바이러스 또는 바이러스의 표면에 결합하여 외부로 노출되는 형태로 존재할 수 있다. 바람직하게는 바이러스에 의해 유전자가 숙주세포에 전달되어 세포주에서 발현되는 경우이며 바람직하게는 바이러스로 인해 전달된 PTEN 단백질의 정상적인 세포내 발현과 기능적인 활성이 유진되는 발현이 될 것이다.
상기 PTEN 단백질의 발현을 위한 바이러스로서는 렌티바이러스(Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus), 벡시니아 바이러스(Vaccinia virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno associated virus), 거대세포바이러스(Cytomegalovirus), 센다이 바이러스(Sendai virus), 폭스바이러스(Poxvirus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 알파바이러스(Alphavirus)와 같이 외래 유전자 도입을 통해 단백질을 발현 할 수 있고, 높은 안정성, 높은 발현 능력 및 높은 바이러스 역가 생산이 가능한 바이러스이면 제한되지 않고 사용할 수 있다. 바람직하게는 피막 바이러스(enveloped virus)로서 폭스바이러스(Poxvirus), 플라비바이러스(Flavivirus), 알파바이러스(alphavirus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV)가 될 수 있다. 더욱 바람직하게는 인체 감염성이 없는 안전한 바이러스이며 높은 바이러스 역가 생산이 가능한 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV)일 수 있다.
상기 뉴캐슬병 바이러스는 닭에게 감염되어 신경증상 및 호흡기 증상 등을 일으키는 법정 전염병으로 닭에게는 매우 치명적인 바이러스로 이러한 병원성에 따라 강병원성(velogenic), 약병원성(mesogenic), 비병원성(lentogenic)으로 나뉘며, 모두 PTEN 유전자 전달 바이러스 벡터 백신 제조에 모두 사용이 가능하나 바람직하게는 약병원성, 비병원성 바이러스가 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는 비병원성 바이러스주를 이용한 재조합 바이러스가 될 것이다.
상기 PTEN 유전자를 발현하는 트랜스진 카세트(transgene cassette)와 MCS 그리고 NDV 바이러스주의 NP, P 유전자는 PTEN 단백질 유전자가 뇌종양 세포에 재조합 NDV를 통해 전달되어 정상적인 단백질로 발현 암세포 증식 억제, 사멸 효과 등을 발휘하는데 고안된 유전자 또는 유전자 조합이다. 따라서 NP 단백질로부터 트랜스진 카세트(transgene cassette), PTEN 유전자 그리고 P 유전자까지의 전체적인 조합은 기능적으로 PTEN 단백질 유전자의 전달 발현 기능적 활성에 최적의 염기서열을 제공한다. 이와 동일한 기능적 활성을 가지고 있는 다양한 염기서열이 가능할 것이며 바람직하게는 70% 이상의 동일한 염기서열일 것이다. 더욱 바람직하게는 80% 이상의 동일한 염기서열일 것이며 가장 바람직하게는 90% 이상의 기능적 활성을 가지는 염기서열일 것이다.
또한, 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스(수탁번호 KCTC14496BP)는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 LVP-K1-PTEN 벡터가 도입된 것일 수 있으며, 기능적으로 동등한 물질을 포함한다. 상기 “기능적 동등한 물질”이란 뉴클레오티드의 치환 결손의 결과로 상기 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열을 갖는 유전자와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 유전자 또는 유전자 조합을 말한다.
아울러, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 정제된 바이러스를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 상술한 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 재조합 뉴캐슬병 바이러스와 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
또한, 약학 조성물은 면역증강물질 또는 아쥬반트(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 면역증강물질 또는 아쥬반트(adjuvant)는 암세포 면역 면역반응의 유도에 의한 치료 효과에 도움을 줄 수 있는 물질이 될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스(수탁번호 KCTC14496BP)는 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 체내 흡수가 용이한 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피 (transdermal) 패치에 함유시킬 수도 있다. 액체 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양(예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.
본 발명의 치료용 바이러스에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용 가능한" 이란 생리학적으로 허용되고 사람에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
바이러스 안정성 및 치료제로서의 안전성을 필요한 기술 분야는 당업자에게 공지되어 있으며 단백질, 당 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액, 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 보조제로서 정형 또는 비정형 유기 또는 무기 고분자 등이 사용될 수 있다. 추가될 수 있는 조성물로는 안정제, 항생제, 보존제, 등이 사용될 수 있다. 투여 경로에 따라 바이러스는 증류수, 완충용액 등과도 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 치료용 바이러스는 암 조직에 직접 주사하거나 경구, 근육, 피하, 정맥 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 정맥 투여 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 "개체"는 질병의 치료 및 증상의 완화에 대한 조절 또는 치료 방법을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 뇌종양 세포의 증식 억제 또는 사멸 그리고 뇌종양 조직의 감소 증가 지연 등의 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 뇌종양에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
나아가, 본 발명은 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 숙주 세포주에 접종하는 단계; 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 바이러스 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN은 통상의 바이러스 작출 방법을 통해 회수할 수 있다. PTEN 단백질 발현을 위한 감염성 클론 cDNA 서열번호 2를 제작 완료한 후 3종의 helper plasmid(NP, P, L), modified vaccina virus(MVA/T7)를 HEp-2 세포주에 주입하여 배양한 후 재조합 바이러스를 회수하는 절차는 통상적인 방법에 따라 실시하였다. 세포주에 주입방법은 lipofectamine 3,000을 이용한 transfection을 실시하였으며 세포주는 HEp-2 cell을 이용하였다. 3~4일 배양 후 재조합 바이러스를 회수하여 8에서 10일령 SPF 유정란 allantoic cavity에 접종하여 바이러스를 배양한 후 allantoic fluid를 회수하여 다시 같은 방법으로 유정란에 blind passage를 최소 2대 이상 배양하여 바이러스 역가를 높이는 작업을 수행하였다. 이후 allantoic fluid로부터 통상의 정제 방법을 통해 정제한 후 적절한 세포주로 선정된 Vero 76 세포에서 배양하여 실험에 사용하였다. 상기 재조합 바이러스주 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN 바이러스의 PTEN 단백질 발현 확인을 위한 방법은 Reverse transcription PCR 방법을 이용하여 PTEN 단백질의 유전자 안정성(도 2)과 mRNA 발현 및 Western blotting을 이용하여 PTEN 단백 발현을 확인하였으며 Western blot을 수행하기 이전에 바이러스 정제를 수행한다.
재조합 바이러스 배양액을 harvest 후 원심분리하여 clarification을 진행한다. Clarification은 원심분리나 micro filtration 방법을 사용할 수 있다. 원심분리 조건은 10,000 g, 10 분, 4 ℃ 조건에서 실행하여 supernatant를 다음 정제 과정에 사용할 수 있다. Micro filtration의 경우 filter의 pore size는 1.0 ㎛ 에서 0.2 ㎛ 사이의 filter를 사용할 수 있으며 바람직하게는 0.45 ㎛ pore size filter를 사용할 수 있다. Filtration 방법은 dead end filtration이나 cross flow filtration 방법을 사용할 수 있으며 두 방법 모두 적용 가능하다. 재조합 바이러스 정제는 크로마토그래피나 ultrafiltration 방법을 통해 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해 정제 가능하다. 크로마토그래피를 이용한 정제 방법은 친화성, 이온 교환, 크기별 배제 그리고 소수성 등의 결합력 차이를 통해 적절한 resin과 buffer의 조합을 통해 바이러스 정제가 가능하다. 통상적으로 바이러스 정제는 sucrose gradient media를 이용한 초고속 원심분리를 하여 바이러스를 침전 또는 분리하여 회수하고 회수된 바이러스는 TNE buffer에 재부유하여 다음 공정에 사용한다. 재조합 바이러스는 양이온 교환수지 크로마토그래피 방법을 이용하여 정제하였으며 샘플 loading 후 sodium chloride 농도 구배를 통해 특정 농도에서 추출되는 fraction을 회수하였다. 회수된 fraction은 sucrose gradient media를 이용한 초고속 원심분리를 하여 바이러스를 침전 또는 분리하여 회수하고 회수된 바이러스는 주사용 생리식염수에 재부유하여 다음 공정에 사용한다.
또한, 본 발명은 사람의 뇌종양에 대한 치료 효과를 유도하기 위해 상기 바이러스 조성물의 치료 유효량을 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 뇌종양 치료 유도법을 제공한다.
또한, 상기 치료 효과는 뇌종양으로 인한 통상적으로 나타내는 임상적 징후의 감소 또는 부재, 보다 신속한 회복 시간 또는 보다 낮아진 지속시간 또는 뇌종양 세포의 혈액 또는 체액 또는 기관의 샘플에서 낮은 뇌종양 세포수의 차이나 뇌종양 조직의 감소, 뇌종양 세포의 사멸에 의해 입증된다.
또한, 치료제의 유효량은 치료 효과를 유도하여 사람에서 뇌종양에 의한 임상적 증상 감소 암세포의 감소 암 조직의 감소 등의 효과를 유도할 수 있는 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 유효량은 재조합 바이러스 조성물을 포함하는 치료제의 경우 정제된 바이러스의 양은 105.0 TCID50/ml 에서1011.0 TCID50/ml 일수 있다. 더 바람직하게는 108.0 TCID50/ml 에서 109.0 TCID50/ml 이상일 수 있다.
상기 치료 효과 유도법은 이것에 한정되는 것은 아니지만, 경구, 경피, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 피하 내 경로로 상기 조성물을 접종하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 1차 및 2차 이상의 조성물을 정맥 또는 암 조직에 직접 주사하는 것일 수 있다. 더 바람직하게는 정맥주사일 수 있다. 치료 효과에 따라 접종 횟수를 제한하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양을 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 동물에서의 치료 효과 평가 방법을 제공한다.
또한, 상기 방법은 인간의 암세포주를 이용한 암세포 사멸 효과를 측정하는 것일 수 있다.
상기 암세포주는 뇌종양 유래 세포주일 수 있으며 바람직하게는 T98G 세포주일 수 있다. 이 외에도 환자 유래 암 세포주를 이용할 수 있으며 본 발명에서는 뇌종양 유래 세포주에만 제한하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 LVP-K1-PTEN 바이러스를 뇌종양 세포를 이식한 마우스 즉 Xenograft 모델의 암 조직에 주사하여는 방법을 제공하는 것이다. 암 조직 생성 후 정맥 주사 또는 암 조직에 직접 주사하는 방법을 이용할 수 있으며 바이러스 주사로 인해 암 조직 완전 관해, 부분 관해 또는 축소 등의 효과를 측정 할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> NDV VG/GA 주를 기본 backbone으로 한 재조합 NDV 바이러스 게놈 전사 벡터의 제조
NDV VG/GA는 약 15 kb 정도의 negative-sense 단일 가닥 RNA를 유전정보로 가지며 6개의 ORFs로 구성되어 있으며 바이러스의 구조를 이루는 단백질은 NP(nucleoprotein), P(phosphoprotein), M(matrix protein), F(fusion protein), HN(hemagglutinin-neuraminidase) 및 L(RNA-directed RNA polymerase) 유전자를 코딩한다. viral RNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 RNA를 분리(isolation) 후, 유전자에 특이적인 4쌍의 프라이머를 제작하여 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하였다. 상기 유전자에 특이적인 5쌍의 프라이머는 표 1(본 발명의 cDNA 합성 후 pBR322 벡터로의 제한효소를 이용한 삽입과정 중 사용된 프라이머를 나타냄)에 나타내었다. RT-PCR은 42 ℃ 1시간, 94 ℃에서 5분간 반응한 후, 94 ℃ 1분, 60 ℃ 1분, 72 ℃ 1분의 반응을 총 30 사이클 실시한 후, 72 ℃에서 7분간 반응하였으며, 네 조각의 cDNA 절편 세트를 연속적으로 연결시키는 클로닝 전략은 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.
Gene Direction Sequence (5`→3`) Restriction site
Fragment 1 (L2) Forward ACGCGTggtctcaggtttatatgcagggaa MluⅠ
Reverse TTAATTAAaccaaacaaagatttggtgaatg PacⅠ
Fragment 2 (L1) Forward ACTAGTtgagattctcaaggatgatggggt SpeⅠ
Reverse ACGCGTcgagtgcaagagactaatagtttt MluⅠ
Fragment 3 (F-HN) Forward GGCGCCattatcggtggtgtagctctcgg Kas I
Reverse ACTAGTaaagggacgattctgaattccccg SpeⅠ
Fragment 4 (P-M-F) Forward CCGCGGaaacagccaagagagaccgcagaa SacⅡ
Reverse GGCGCCaaccgggatccagaatcttctacccgt Kas I
Fragment 5 (NP-P) Forward GTTTAAACaccaaacagagaatccgtaagg PmeⅠ
Reverse CCGCGGctttgttgactcccctgttgttga SacⅡ
벡터의 재구성 효율을 높이기 위해 바람직하게는 low-copy-number plasmid인 modified pBR322 벡터로 인식부위와 절단부위가 상이한 PacⅠ과 PmeⅠ제한효소를 위치시켜 클로닝을 수행하였다. Modified pBR322 벡터는 바람직하게는 T7 RNA polymerase promoter의 통제 하에 있으며, NDV 게놈 말단에서 RNA를 분할하는데 사용되는 HDV(hepatitis delta virus) antigenome ribozyme과 T7 terminator 유전자에 의해 종결되도록 위치시켜 바이러스의 encapsidation 및 packaging을 가능하게 하였다. 또한, NDV VG/GA strain의 완전한 게놈 서열을 포함시켜 정확하게 전사되도록 하였다.
이후, 하기 표 2(본 발명의 LVP-K1 벡터 제작을 위해 이용한 프라이머를 나타냄)와 표 3(본 발명의 LVP-K2 벡터 제작을 위해 이용한 프라이머를 나타냄)에 나타낸 바와 같이 네 조각으로 나뉘어 cDNA 절편 세트를 연속적으로 연결시키는 클로닝 전략을 이용하여 NP 유전자와 P 유전자 사이에 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 도입 및 P 유전자와 M 유전자 사이에 트랜스진 카세트(transgene cassette)를 도입하였다.
Gene Direction Sequence (5`→3`) Size (bp)
Fragment 1
(pBR322-NP)		 Forward TTCTCGCTTCCGGCGGCATC 5,036
Reverse CCGCTTCTACCCGTATTTTTTCTAAGCAGAGGAATTGGGATGACCTC
Fragment 2
(P-M)		 Forward TACGGGTAGAAGCGGCCGCGGCCGGCCCCACACCCCACCCCTCAATCC 2,938
Reverse CCGGGATCCAGAATCTTCTACCC
Fragment 3
(F-HN)		 Forward GATTCTGGATCCCGGTTGGCG 5,578
Reverse CCGCCATCACTTGACAGTTCC
Fragment 4
(L)		 Forward GTCAAGTGATGGCGGAAGGG 5,256
Reverse CGCCGGAAGCGAGAAGAATC
Gene Direction Sequence (5`→3`) Size (bp)
Fragment 1
(pBR322-NP-P)		 Forward TTCTCGCTTCCGGCGGCATC 6,545
Reverse TTCTACCCGTATTTTTTCTTAAGTTTGCAGAGAGG
Fragment 2
(M-F)		 Forward AAAATACGGGTAGAAGCGGCCGCCCAAGGTCCAACACCCCGAG 3,728
Reverse GACGTCGCTAGCATCATCTAC
Fragment 3
(HN-L)		 Forward GATGCTAGCGACGTCACATC 3,245
Reverse CCGCCATCACTTGACAGTTCC
Fragment 4
(L)		 Forward GTCAAGTGATGGCGGAAGGG 5,626
Reverse CGCCGGAAGCGAGAAGAATC
RNA-dependent RNA polymerase는 유전자 사이의 stop-start 메커니즘 IGS(GE-IG-GS)에 의해 순차적인 방식으로 전사를 시작한다. GS에서 전사의 재개시가 완전하지 않으므로 3' 말단에 위치한 mRNA의 전사 수준이 높다. 따라서 3' 말단 일수록 높은 mRNA 전사 수준을 보이며 5' 말단으로 갈수록 그 수준이 낮아진다. 그러므로 NP 유전자와 P 유전자 사이의 새로운 외부 유전자 삽입은 P 유전자와 M 유전자 및 HN 유전자와 L 유전자 사이에 비해 더 높은 수준의 mRNA 전사와 외부 단백 번역이 일어나므로 NP-P 사이의 유전자 삽입이 더 바람직하다고 할 수 있다.
상기 네 조각의 cDNA 절편은 말단 15 bp의 염기서열이 동일하며, 트랜스진 카세트(transgene cassette)는 IGS(GE-IG-GS) 서열 및 Multiple cloning site(MCS)로 이루어졌다. overlap cloning법을 이용해 NP 유전자와 P 유전자 사이(LVP-K1) 및 P 유전자와 M 유전자 사이(LVP-K2)에 삽입하여 외래 유전자 삽입용 LVP-K1(서열번호 1) 및 LVP-K2 벡터를 구축하였다.
<실시예 2> PTEN 유전자를 함유하는 재조합 NDV 바이러스 cDNA 제작
뉴캐슬병 바이러스(NDV) 바이러스 cDNA에 PTEN 단백질 유전자를 함유하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 제작하였다.
LVP-K1(NP-MCS-P) 벡터는 Fse I 제한효소와 LVP-K2(P-MCS-M) 벡터는 Not I 제한효소로 필요한 PTEN 포함 DNA 절편을 얻어낸 후 준비된 NDV cDNA backborn의 NP와 P 유전자 사이(LVP-K1-PTEN 벡터) 그리고 P 유전자와 M 유전자 사이(LVP-K2-PTEN 벡터)에 삽입한다. 이후 완성된 plasmid는 전체 유전자 염기서열 분석을 통해 100% 일치함을 확인하였다.
<실시예 3> 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 작출
NDV 전사효소 복합체의 개별적인 클론(NP, P, L)을 pBR322 벡터로 클로닝 하여 helper plasmid로 이용하였다(pBR322-NP, pBR322-P 및 pBR322-L). 전날 6-well 플레이트에 5 × 105 cells/well로 HEp-2 세포를 준비 후 변형된 벡시니아 바이러스 (MVA-T7)를 1 MOI(Multiplicity of infection)로 감염시켰다. 상기 세포주에 T7 promoter에 의해 단백질이 발현되는 pBR322-NP, pBR322-P 및 pBR322-L Helper plasmid와 PTEN 단백질 유전자를 포함하는 플라스미드인 LVP-K1-PTEN 또는 LVP-K2-PTEN 벡터를 각각 2.5 μg, 1.5 μg, 0.5 μg, 및 5 μg을 lipofectamine 3000(Invitrogen)과 적정비율로 혼합하여 형질전환 하였다. 이후 3일에서 4일간 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양 후 HEp-2 세포 상층액을 수확하였다. 이후 9~11일령의 SPF 발육란의 allantoic cavity로 접종하였으며, 접종 4일 후 요막강액을 채취하였다.
이후, 백시니아 바이러스 제거를 위해 PBS를 이용하여 10-3으로 희석된 요막강액을 각각 9~11일령의 SPF 발육란의 allantoic cavity로 접종 뒤 4일 후 요막강액을 채취하여 바이러스 확인 실험을 실시하였다. 바이러스 확인 실험은 요막강액을 Viral RNA extraction kit(Qiagen)을 이용하여 분리(isolation) 후, 추출한 RNA 5 ul와 하기 표 4(본 발명의 재조합 NDV 바이러스(LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN) 구축 확인에 필요한 프라이머)의 프라이머를 Forward 및 Reverse 각각 1 μl를 이용하여 ONE-STEP RT-PCR로 42 ℃에서 1시간, 94 ℃에서 5분간 반응한 후, 94 ℃에서 1분, 60 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분의 반응을 총 35 사이클 실시한 후, 72 ℃에서 7분간 수행하였으며 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이, 백시니아 바이러스가 제거되고, 뉴캐슬병 바이러스 및 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-PTEN(서열번호 2) 및 LVP-K2-PTEN 바이러스만 남아 있는 것을 확인하였다.
하기 표 5(PTEN 유전자를 LVP-K1 벡터에 삽입하기 위한 프라이머) 및 표 6(PTEN 유전자를 LVP-K2 벡터에 삽입하기 위한 프라이머)은 PTEN 유전자를 벡터에 삽입하기 위한 프라이머를 나타낸 것이다.
Gene Direction Sequence (5`→3`) Size (bp)
NDV check Forward CCACAATTCCAAGATAACCGGAG 327
Reverse GCTGCCACAATCAGATGCCTTTG
NP-PTEN-P check Forward AACAGATCACAAGGGCAACCG 1,822
Reverse TGGTTTTCCCTGGGCCGTAATT
P-PTEN-M
check		 Forward GGCAAGCGGGCCTGATATAGG 1,734
Reverse CTTCCCGTCCCCTGTGTCTTG
Vaccinia virus check Forward ATGACGATGAAAATGATGGTACATA 1,059
Reverse CTCCAATACTACTGTAGTTGTAAGG
Gene Direction Sequence (5`→3`) Size (bp)
Kozak PTEN
(1st PCR)		 Forward GCCACCATGACAGCCATCATCAAAG 1,221
Reverse AGAAGCGGCCGCGGCCGGCCACCATGACAGCC
Fse I Kozak
PTEN
(2nd PCR)		 Forward GCCTCAGACTTTTGTAATTTGTGTATG 1,258
Reverse GTTGGACCTTGGTATGGCCGGCCTCAGACTTTTGTAATTTGTG
Gene Direction Sequence (5`→3`) Size (bp)
Kozak PTEN
(1st PCR)		 Forward GCCACCATGACAGCCATCATCAAAG 1,221
Reverse CGCTCAGACTTTTGTAATTTGTGTA
Not I Kozak
PTEN
(2nd PCR)		 Forward ATACGGGTAGAAGCGGCCGCCACCATGACAGCC 1,254
Reverse TGGACCTTGGGCGGCCGCTCAGACTTTTGTAATTTG
<실시예 4> 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-PTEN 배양 및 정제
Vero 76 세포를 3 × 105 cells/mL로 배양 후 다음날 재조합 바이러스 0.05 MOI(Multiplicity of infection)를 접종 2일 후 가장 높은 역가의 바이러스 상층액을 얻었다. 이후, 바이러스 상층액은 부유물을 제거하기 위해 5,000 g, 4 ℃에서 10분간 원심분리하고 상층액을 수거하였다. 수거된 상층액은 재조합 바이러스 농축을 위해 32,000 rpm 4 ℃에서 3 시간동안 초원심분리를 진행하였으며, 상층액을 제거 후 TNE buffer (10 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA)로 재부유하였다. 농축된 바이러스는 30 ~ 60 % sucrose gradient 법을 이용해 32,000 rpm 4 ℃에서 2시간 동안 초원심분리를 진행하였다. 40 ~ 50 %에서 재조합 바이러스를 수득하였다. 마지막으로 수득한 재조합 바이러스를 32,000 rpm 4 ℃에서 2시간 초원심분리를 한번 더 진행하여 수크로스 (sucrose)를 제거하여 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-PTEN(서열번호 2) 및 LVP-K2-PTEN을 정제하였다.
<실시예 5> T98G 세포 배양 및 Vero cell 배양
암세포 사멸효과를 확인하기 위해 T98G(CRL-1690™, ATCC) 뇌종양 세포를 이용하였다. T98G 세포의 배양은 다음과 같다. T98G 세포는 세포배양용 penicillin-streptomycin(Gibco, USA)과 10% FBS를 포함하는 Minimum Essential Medium(MEM, Gibco, USA) 배지를 이용하여, 37 ℃ 배양기(5% CO2)에서 175T flask를 이용하여 배양하였다. 세포가 플라스크에 70 ~ 80 % monolayer를 형성하여 자라게 되면 1:4에서 1:6으로 subculture를 통해 세포를 유지한다. Seeding density는 2 ~ 4 × 104 cells/ml 정도로 한다. Vero cell(Vero 76 KCLB No. 21587)은 세포배양용 penicillin-streptomycin(Gibco, USA)과 10 % FBS를 포함하는 Minimum essential medium(MEM, Gibco, USA) 배지를 이용하여 배양하였으며 175T Flask 플라스크를 이용하여 배양하였다. 세포가 70 ~ 80% 이상 monolayer를 형성하여 자라게 되면 subculture를 진행하여 유지한다. Vero cell의 split ratio는 1:8까지 가능하며 seeding density는 1×104 cells/ml 이다.
<실시예 6> Vero cell을 이용한 재조합 바이러스의 증식 확인
실시예 5에서 준비한 Vero cell을 이용하여 LVP-K1(서열번호 1) 바이러스 및 LVP-K1-PTEN(서열번호 2) 바이러스의 증식에 대한 비교 실험을 실시하였다. 일반적으로 외래 유전자를 삽입한 바이러스의 경우 증식이 잘 되지 않는 현상이 자주 발생하여 PTEN 유전자를 삽입한 바이러스의 증식을 비교 확인하였다. 70 ~ 80% 이상 monolayer를 형성한 Vero 76 cell(175 T flask) 배양액을 제거한 후 혈청이 포함되지 않은 MEM 배지를 10 ml을 플라스크에 넣고 조심해서 흔들어 세포를 세척한다. 이런 과정을 2~3회 반복하고 난 후 미리 LVP-K1(서열번호 1) 바이러스 및 LVP-K1-PTEN(서열번호 2) 바이러스를 5 ml(1 MOI)을 플라스크에 넣고 37 ℃ incubator에서 10분 간격으로 흔들어 주며 1시간 동안 바이러스를 감작 시킨다. 이후 바이러스액을 제거하고 혈청이 없는 MEM 배지 10 ml을 플라스크에 넣어 남아있는 바이러스액을 제거한 후 다시 5% FBS가 첨가된 MEM 배지를 50 ml 씩 넣어주고 4시간 간격으로 각각의 플라스크에서 1 ml의 배양액을 채취하여 바이러스 역가를 TCID50 측정 방법으로 측정하였다.
<실시예 7> Vero cell에서 배양된 바이러스의 PTEN 유전자 확인
Vero cell에서 배양된 재조합 뉴캐슬병 바이러스 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K2-PTEN이 Vero cell에서 배양되는 동안 PTEN 유전자 손실 없이 유지되는지 확인하기 위하여 7대 계대 배양된 바이러스를 PTEN 유전자 증폭을 위한 상기 표 4의 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 유전자 확인을 하였다. 전기영동을 통해 획득한 유전자는 Sequencing 방법을 통해 PTEN 유전자임을 확인하였다.
<실시예 8> Real time qPCR 방법을 이용한 LVP-K1-PTEN 유전자의 mRNA 발현량 평가
미리 준비된 T98G 세포에 1 MOI로 LVP-K1(서열번호 1) 바이러스 및 LVP-K1-PTEN(서열번호 2) 바이러스를 접종하고 하나의 플라스크는 어떤 바이러스도 접종하지 않고 6시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 모든 플라스크를 AccuPrep®Universal RNA extraction kit(바이오니아, 대전, 한국)를 이용하여 RNA를 확보한 후 하기 표 7(본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스가 감염된 T98G 세포에서의 PTEN mRNA의 상대적인 전사량을 나타내기 위한 프라이머와 프로브)의 primer와 probe를 첨가하여 real time PCR을 수행하였다. 각각의 샘플에 대한 CT 값을 측정하여 mRNA의 발현량을 확인하였다. real time qPCR 조건은 다음과 같다. 42 ℃에서 10분, 95 ℃에서 2분간 반응한 후, 95 ℃에서 10초, 59.8 ℃에서 1분, 형광 수준 측정의 반응을 총 40 사이클 실시하였다. CFX Connect™ Real-Time System(cat. No. 1855201 Bio-Rad, USA)를 이용하였다.
Gene Direction Sequence (5`→3`) Size (bp)
PTEN
Real-time		 Forward TCCCAGTCAGAGGCGCTATGT 152
Reverse GGCAGACCACAAACTGAGGA
Probe TGCAAGTTCCGCCACTGAACA -
도 3에 나타낸 결과를 보면 PTEN 유전자를 가지고 있는 LVP-K1-PTEN 바이러스 접종 샘플에서 mRNA 발현이 LVP-K1 바이러스 접종 그리고 바이러스가 접종되지 않은 T98G 세포주(대조군)에서 보다 높게 발현되는 것을 알 수 있다.
<실시예 9> PTEN 단백질 western blotting을 통한 PTEN 단백질 발현량 비교
미리 준비된 T98G 세포에 세 가지 종류의 바이러스를 접종하고, 접종하지 않은 T98G 세포에서의 PTEN 단백질 발현을 비교하였다. 세 종류의 바이러스는 다음과 같다. LVP-K1-PTEN(PTEN 유전자를 NP와 P 유전자 사이에 삽입, 서열번호 2), LVP-K2-PTEN(PTEN 유전자를 P와 M 유전자 사이에 삽입), 그리고 PTEN 유전자를 삽입하지 않은 LVP-K1(서열번호 1) 바이러스이다. Western blotting이 정량적인 단백질량을 정확히 평가할 수 없는 실험이나 상대적인 평가를 통해 단백질 발현량을 비교할 수 있다고 판단하여 실험을 실시하였다. 80% 이상 monolayer를 형성한 T98G 세포주에 실시예 6 또는 실시예 8에서와 같은 방법으로 titer 가 측정된 세 종류의 바이러스를 준비하여 MOI 1되게 접종한 후 9시간 후에 배양액 전체를 동결 해동을 3회 이상 반복한 후에 샘플을 채취하여 통상적인 SDS-PAGE(Gel 농도 12%) 방법을 통해 단백질을 분리하고 단백질은 transblottor(Thermo fisher)를 이용하여 PVDF membrane(25A, 15분)에 이송하였다. PVDF memebrane은 1% BSA 용액으로 blocking을 한 후 통상적인 western blotting 방법에 따라 실시하였다. PTEN에 특이적으로 결합하는 1차 항체는 PTEN 단클론 항체를 사용하였다(Cat No. ab32119, Abcam). 단백질 특이적인 발생 반응을 확인하기 위한 2차 항체는 anti-rabbit IgG goat horese peroxidase conjugate antibody(Invoitrogen)를 사용하였으며 항체 농도는 제조사의 권장량을 사용하였다. 2차 항체 반응 후 발색제로 ECL(Enhanced chemiluminescence, Bio-Rad) 용액을 적당량 넣고 발색이 되면 ChemiDoc™ MP Imaging System(Bio-Rad) 이용하여 단백을 확인하였다.
도 4의 결과에서 보듯이 바이러스 감염 후 PTEN 단백질 발현량은 PTEN 유전자가 NP와 P 유전자 사이에 삽입된 LVP-K1-PTEN 바이러스가 가장 선명하게 발색되어 다른 시험군 보다 많은 양의 단백질이 T98G 세포에서 발현되는 것을 알 수 있었다.
<실시예 10> PTEN 유전자가 도입된 LVP-K1-PTEN 바이러스 감염으로 인한 뇌종양 세포 사멸 효과 확인
LVP-K1-PTEN 바이러스 감염으로 인한 뇌종양 세포 T98G 세포의 사멸 효과를 확인하기 위해 MTT assay 실험을 실시하였다. MTT assay 방법은 통상적인 MTT assay 방법에 따라 실시하였으며 자세한 실험과정을 기술한다. 96-well plate에 1개의 well당 1 × 104 개의 T98G 세포를 24시간동안 세포배양용 penicillin-streptomycin(Gibco, USA)과 10% FBS를 포함하는 Minimum Essential Medium(MEM, Gibco, USA) 배지를 이용하여, 37 ℃ 배양기(5% CO2)에서 배양하고 LVP-K1-PTEN 바이러스와 LVP-K1 바이러스를 MOI가 0.1, 1, 2.5, 5가 되도록 감염시킨다. 결과의 신뢰성을 위해서, 같은 조건의 well을 4개씩 준비하여 진행하였다. 감염 후, 37 ℃ 배양기(5% CO2)에서 배양하고 감염 후 96시간 이후에 각각의 well에 20μl의 MTT 용액(CellTiter 96® AQueous One solution Cell Proliferation Assay, Bio-Rad, USA)를 첨가하고 1시간동안 배양기(5% CO2)에서 배양한다. iMark Microplate Reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 490nm의 파장을 가지는 빛의 흡광도를 측정하여 세포 사멸도를 측정한다.
그 결과 도 5에서 보는 것과 같이 MTT assay 결과 PTEN 유전자를 삽입한 바이러스가 PTEN 바이러스를 삽입하지 않은 바이러스보다 암세포 사멸 효과가 더 높게 나타났다. 특히 이러한 암세포 사멸 효과의 차이는 세포에 접종된 바이러스 농도가 낮을수록 차이를 보이는데 이는 재조합 NDV 바이러스인 LVP-K1 바이러스 역시 본래 oncolytic effect를 가지고 있어 높은 농도에서는 차이를 보이지 않으나 MOI 1 이하에서 PTEN 유전자를 삽입한 바이러스의 사멸 효과가 높은 것은 바이러스로 전달된 PTEN 유전자에 의해 암세포 내에서 정상적인 PTEN 단백질이 발현되고, 이러한 PTEN 단백질이 암세포의 자살(apoptosis) 효과를 높여 세포 사멸에 영향을 준 것으로 판단된다.
T98G 세포 배양액에 바이러스를 접종 후 현미경 관찰을 실험을 실시하여 세포변성 효과(cytopathic effect)에 관찰을 하였다. T98G 세포를 6 well plate에서 배양하여 90 % 이상 monolayer가 형성된 후 각각의 바이러스를 1 MOI로 접종하여 T98G 세포변성 효과를 현미경으로 관찰하였다. PTEN 유전자를 가지고 있는 LVP-K1-PTEN 바이러스 접종 세포에서 PTEN 유전자가 없는 LVP-K1 바이러스 접종 세포보다 3시간 먼저 세포병변효과(CPE, Cytopathic effect)가 관찰되었으며 이후 18시간까지 관찰한 결과 더 빠른 세포병변효과가 LVP-K1-PTEN 바이러스 접종 세포에서 관찰 되었다(도 6 참조).
<실시예 11> T98G 세포 이식 xenograft 모델 마우스를 이용한 LVP-K1-PTEN 바이러스의 암세포 증식 억제 효과 확인
Xenograft model을 이용하여 LVP-K1-PTEN 바이러스의 암 조직 성장 억제 효과를 측정하였다. 배양된 T98G 세포 6 × 106 cells 을 100 ul MEM 배지에 풀어 100 ul Matrigel(Corning)과 혼합하여 마우스 좌측 어깨 부위에 접종하였다. 사용된 마우스는 SPF female BALB/c 누드 마우스 14 ~ 19 g 정도의 20마리를 SLC(Japan)로부터 구입하여 무작위로 그룹당 4마리씩 구분하여 실험하였다. 각 실험 그룹은 PTEN 유전자가 도입된 LVP-K1-PTEN 바이러스를 꼬리 정맥과 암 조직에 직접 주사한 두 그룹 그리고 PTEN 유전자가 도입되지 않은 LVP-K1 바이러스를 꼬리정맥과 암 조직에 직접 주사한 두 그룹 그리고 PBS 접종 그룹(대조군)으로 하였다. 접종한 바이러스의 농도는 모두 108.0 TCID50/ml 이며 100 ul 씩 접종 하였다. 바이러스 접종은 암 조직 사이즈가 T98G 세포 접종 후 7일째 평균 120 ~ 150 mm3 도달했을 때부터 2일 간격으로 2회 접종하여 7일간 매일 암 조직 변화를 관찰하였다. 암 조직의 크기는 4π/3 × (가장 작은 직경/2)2 × (가장 큰 직경/2)2 공식을 통해 계산하였다.
표 8(본 발명의 LVP-K1-PTEN 및 LVP-K1 바이러스를 xenograft에 꼬리 정맥 또는 암에 직접 주사하여 암 크기 감소), 도 7, 도 8a, 및 도 8b을 통해 PTEN 유전자가 도입된 LVP-K1-PTEN 바이러스 접종군에서 가장 빠르고 효과적으로 암 조직이 축소되는 것을 관찰할 수 있었다. 이때 특이한 것은 일반적으로 암 조직에 직접 주사하는 경우가 정맥주사보다 더 좋은 효과를 보여주는 것으로 알려져 있으나, 본 실험 결과에서는 정맥주사를 통해서도 암 조직에 직접 주사하는 경우와 큰 차이 없이 암세포 증식을 저해할 수 있는 것으로 확인되었다.
Figure 112021035247592-pat00001
결론적으로 포유류에서 면역반응을 일으키지 않고, 항체도 생성되지 않는 NDV 바이러스를 이용한 새로운 암치료용 바이러스 벡터 및 이를 이용한 바이러스의 제작을 통해 암세포 증식 억제 효과를 얻을 수 있음을 확인하였고, NDV 바이러스의 큰 단점이자 장점인 정상세포에서는 감염 즉시 선천 면역(innate immunity)에 의해 암세포에 도달하지 못하고 사라지는 NDV 바이러스가 많고, 또 정맥주사로 인한 희석 효과로 인해 기존에 사용해 오던 단순 재조합 바이러스가 아닌 암세포 증식 억제 효과, 세포자살 유도, 면역반응 유도등 다양한 유전자를 삽입하여 암세포에서 단백질로 발현되어 효능을 증가시키는 재조합 NDV 바이러스의 개발은 매우 중요한 과제이며 앞으로 추가적인 연구를 통해 더 많은 발전이 있어야 할 것이다.
본 발명은 뇌종양의 PTEN 유전자 돌연변이에 의한 정상적인 PTEN 단백질의 기능이 상실된 암세포에 oncolytic 기능을 어느 정도 가지고 있으며, 이에 PTEN 유전자를 추가 도입하고, 또 신경계를 따라 brain blood barrier를 통과할 수 있는 NDV 재조합 바이러스를 제작하고 이에 대한 효과가 개선되었음을 증명한 것이다.
기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC) KCTC14496BP 20210312
<110> LIBENTECH Co.,LTD. <120> Oncolytic recombinant newcastle disease virus contain PTEN gene constructed by based on the Newcastle disease virus for glioblastoma treatment and its composition <130> PN2103-123 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19091 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LVP-K1 <400> 1 accaaacaga gaatccgtaa ggtacgatag aaggcgaagg agcaatcgaa gtcgtacggg 60 tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagctcaaac tcgagagagc cttctgccaa 120 aatgtcttct gtattcgatg agtacgagca gctcctcgcg gctcagactc gccccaatgg 180 agctcatggc ggaggagaga aggggagcac cttaaaggta gaagtcccgg tattcactct 240 caacagtgat gacccagaag atagatggaa ctttgcagtg ttttgtcttc ggattgctgt 300 tagcgaggat gccaacaaac cacttaggca aggtgctctc atatctctct tatgttccca 360 ctctcaagtg atgaggaacc atgttgccct tgcggggaaa cagaatgagg ccacactggc 420 tgttcttgag atcgatggtt ttaccaacgg cgtgccccag ttcaacaaca ggagtggagt 480 gtctgaagag agagcacaga gatttatgat gatagcaggg tctctccctc gggcatgcag 540 caacggtacc ccgttcgtca cagctggggt tgaagatgat 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atgactcccc ggaaatggtg ttaacacaat tgcatcaagc cagtgataat 2340 ttcttcaagg aattgattca tgttaatcat ttgattggcc ataatttgaa ggatcgtgaa 2400 acaatcagat cagacacatt cttcatatac agcaaacgaa tattcaaaga tggagcaata 2460 ctcagtcaag tcctcaaaaa ttcatctaaa ttagtgctaa tatcaggcga ccttagtgaa 2520 aacaccgtaa tgtcctgtgc caacattgca tctactatag cacggctgtg cgagaacggg 2580 cttccaaagg atttctgtta ttacttaaac tacctgatga gttgcgtgca gacatacttt 2640 gattctgagt tttccatcac taacagctcg caccccgatt ctaaccagtc gtggattgaa 2700 gacatctctt ttgtgcactc atatgtcctg acccctgccc agctaggggg actgagcaac 2760 ctccaatact caaggctcta cacgaggaac atcggtgacc cgggaactac tgcttttgca 2820 gagatcaagc gattagaagc agtggggtta ctaagtccta gtattatgac taacatctta 2880 actaggccgc ctggaaatgg agattgggcc agtctgtgta acgaccctta ctctttcaat 2940 tttgagactg tcgcgagtcc aaatattgtc cttaagaaac atacacaaag agtcctattt 3000 gaaacttgtt caaatccctt attatctggc gtgcatacag aggataatga ggcagaagag 3060 aaggcgttgg ctgaattttt actcaatcaa gaagtaattc atccacgtgt cgcacatgct 3120 atcatggaag caagctctat aggtaggagg aagcagattc aagggcttgt tgacacaaca 3180 aacaccgtaa tcaagattgc attgactagg aggccacttg gcatcaagag gctgatgcgg 3240 atagttaact actcgagcat gcatgcaatg ctgtttagag acgatgtttt ctcatctaac 3300 aggtctaacc accccttagt ttcctctaat atgtgttctc tgacgctagc agactatgca 3360 cggaatagaa gctggtcacc attgacgggg ggtagaaaga tactgggtgt atctaatcct 3420 gatactatag aacttgtaga gggtgagatc cttagcgtca gcggaggatg cacaagatgt 3480 gacagcggag atgaacaatt cacttggttc catcttccga gcaatataga actgaccgat 3540 gacaccagca agaatcctcc gatgagagtg ccgtacctcg ggtcaaagac tcaagagagg 3600 agggccgcct cgcttgcgaa aatagctcat atgtcaccac atgtgaaagc tgctctaagg 3660 gcatcatccg tgttgatctg ggcttatgga gacaacgaag taaattggac tgctgctctt 3720 aaaattgcaa gatctcggtg caatataaac tcagagtatc ttcgactatt gtccccctta 3780 cccacagctg ggaatctcca acatagactg gatgacggca taactcagat gacattcacc 3840 cctgcatctc tctacagggt gtcaccttat attcacatat ccaatgattc tcaaaggtta 3900 ttcacggaag aaggagtcaa agagggaaat gtagtttatc agcaaatcat gctcttgggt 3960 ttatctctaa tcgaatcact cttcccgatg acgacaacca ggacatacga tgagatcaca 4020 ttgcacctcc acagtaaatt tagctgctgt atcagggaag caccggttgc agttcctttc 4080 gagttactcg ggatggcacc agaactaagg acagtgacct caaataagtt tatgtatgat 4140 cctagtcctg tatcggaggg tgactttgcg agacttgact tagctatctt taagagttat 4200 gagcttaatc tagaatcata tcccacaata gagctaatga acattctttc aatatccagc 4260 gggaagttaa tcggccagtc tgtggtttct tatgatgaag atacctccat aaagaatgac 4320 gccataatag tgtatgacaa cacccggaat tggatcagcg aagctcagaa ttcagatgtg 4380 gtccgcctat tcgagtatgc agcacttgaa gtgcttctcg actgttctta tcagctctac 4440 tatctgagag taagaggcct agacaatatc gtgttgtata tgagtgactt atataagaat 4500 atgccaggaa ttctactttc caacattgca gctacaatat ctcatcccat cattcattca 4560 agattgcatg cagtaggcct ggtcaatcac gacgggtcac accaacttgc agacacagat 4620 ttcatcgaaa tgtctgcaaa actattagtc tcttgcactc gacgcgtggt ctcaggttta 4680 tatgcaggga ataagtatga tctgctgttc ccgtctgtct tagatgataa cctgagtgag 4740 aagatgcttc agctgatatc tcggttatgc tgcctgtata cggtgctctt tgctacaaca 4800 agagagatcc cgaaaataag aggcttatct gcagaagaga agtgttcagt acttactgag 4860 tacctactgt cagatgctgt gaaaccatta cttagttctg agcaagtgag ctctatcatg 4920 tctcctaaca tagttacgtt cccagctaat ctatattaca tgtctcggaa gagccttaat 4980 ttgattaggg aaagagagga cagggacact atcttggcat tgttgttccc ccaagagcca 5040 ctacttgagt tccccttagt acaagatatt ggcgctcgag tgaaagatcc attcacccga 5100 caacctgcgg cgtttttaca agaattagat ttgagcgctc cagcaaggta tgacgcattt 5160 acacttagtc aggttcattc tgaacacaca tcaccaaatc cggaggacga ctacttagta 5220 cgatacctgt tcagaggaat agggaccgcg tcctcctctt ggtataaggc atctcacctt 5280 ctttctgtac ctgaggtcag atgtgcaagg cacgggaatt ccttatactt ggcagaagga 5340 agcggagcca ttatgagtct tctcgaactg catgtgccgc atgagactat ctattacaat 5400 acgctcttct caaacgagat gaacccccca cagcggcatt tcggaccgac cccaacacag 5460 tttctgaatt cagttgttta taggaatcta caggcggagg taccatgtaa ggatggattt 5520 gtccaggagt tccgtccatt atggagagag aatacagaag aaagcgatct gacctcagat 5580 aaagcagtgg gttacatcac atctgcagtg ccctaccggt ctgtatcatt gctgcactgt 5640 gacattgaga ttcctccagg atccaatcaa agcttactgg atcaactggc taccaatctg 5700 tctctgattg ccatgcattc tgtaagggag ggcggggtcg tgatcatcaa agtgttgtat 5760 gcaatgggat attacttcca tctactcatg aacttgttca ctccgtgttc tacgaaagga 5820 tatattctct ctaatggcta tgcatgtaga ggggatatgg agtgttacct ggtatttgtc 5880 atgggctatc gaggtgggcc tacatttgta catgaggtag tgaggatggc aaaaactcta 5940 gtgcagcggc acggtacact tttgtccaaa tcagatgaga tcacactgac taggttattt 6000 acctcacagc ggcagcgtgt aacagacatc ctatccagtc ctttaccgag actaataaag 6060 ttcttgagaa agaatatcga tactgcgcta attgaagccg ggggacaacc cgtccgtcca 6120 ttctgtgcag agagcttggt gaggacacta gcggacacaa ctcagatgac ccagatcatc 6180 gctagtcaca ttgacacagt cattcgatct gtgatctaca tggaggctga gggtgatctc 6240 gccgacacag tgttcttatt taccccctac aatctctcta cagacggtaa aaagagaaca 6300 tcacttaaac agtgcacaag gcagatctta gaggtcacaa tattgggtct tagagttgaa 6360 aatctcaata aagtaggtga tgtagtcagt ctagtactta aaggtatgat ttctctggag 6420 gacctgatcc ctctaagaac atacttgaag cgtagtacct gccctaagta tttgaagtct 6480 gttctaggta ttactaaact caaagaaatg tttacagaca cctctttatt atacttgact 6540 cgtgctcaac aaaaattcta catgaaaact ataggcaacg cagtcaaggg atactacagt 6600 aactgtgact cttaa 6615

Claims (14)

  1. 서열번호 2로 표시되는 LVP-K1-PTEN 벡터.
  2. 제1항의 LVP-K1-PTEN 벡터를 도입한 재조합 뉴캐슬병 바이러스(수탁번호 KCTC 14496BP).
  3. 제2항의 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 암세포 사멸효과를 갖는 것을 특징으로 하는 뇌종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 암세포 증식억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 뇌종양 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제3항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양을 예방 또는 치료하는 방법.
  7. 제3항의 조성물을 개체에 투여하는 단계; 및 개체의 암세포 또는 암 조직의
    변화를 측정하여 평가하는 단계를 포함하는 뇌종양을 예방 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 방법은 인간을 제외한 동물의 암세포 또는 암 조직의 변화를 측정하여 평가하는 것인, 동물에서의 뇌종양 예방 또는 치료 효과 평가 방법.
  9. 제2항의 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 숙주 세포주에 접종하는 단계;
    상기 숙주 세포주를 배양하는 단계; 및
    상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는, 재조합 뉴캐슬병 바이러스 제조 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
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