KR20200101065A - 면역세포 또는 항체 치료제를 유도하는 종양용해성 바이러스, 상기 바이러스에 의해 발현된 항원에 특이적인 면역세포 및 이를 이용한 병용치료 방법 - Google Patents

면역세포 또는 항체 치료제를 유도하는 종양용해성 바이러스, 상기 바이러스에 의해 발현된 항원에 특이적인 면역세포 및 이를 이용한 병용치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역세포 또는 항체 치료제를 유도하는 종양용해성 바이러스에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포 표면에 표지되고 면역세포 또는 항체 치료제에 의해 특이적으로 인식되는 항원의 발현카세트를 포함하는 종양용해성 바이러스 및 상기 바이러스를 포함하는 암의 병용치료조성물; 및 종양용해성 바이러스에 의해 도입된 항원에 특이적인 면역세포 및 상기 면역세포를 포함하는 암의 병용치료조성물을 개시한다. 본 발명에 따른 종양용해성 바이러스를 투여하는 단계 및 상기 투여 후에 상기 항원을 특이적으로 인식하는 면역세포 또는 항체 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 암의 병용치료방법은 상기 면역세포가 암세포로 유도되도록 함으로써 암의 치료, 특히 고형암의 치료에 있어 기존의 면역세포 및 종양용해성 바이러스 요법이 각각 가지는 한계를 뛰어넘을 수 있는 암의 병용 치료방법을 제공한다.

Description

면역세포 또는 항체 치료제를 유도하는 종양용해성 바이러스, 상기 바이러스에 의해 발현된 항원에 특이적인 면역세포 및 이를 이용한 병용치료 방법 {ONCOLYTIC VIRUS GUIDING IMMUNE CELL OR ANTIBODY THERAPEUTICS, THE IMMUNE CELLS SPECIFIC FOR THE ANTIGEN INDUCED BY THE VIRUS, AND COMBINATION THERAPY USING THEREOF}
본 발명은 면역세포 또는 항체 치료제를 유도하는 항원의 발현카세트를 포함하는 종양용해성 바이러스, 상기 항원에 특이적인 면역세포 및 이를 이용한 병용치료 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포 표면에 표지되고 면역세포 또는 항체 치료제에 의해 특이적으로 인식되는 항원의 발현카세트를 포함하는 종양용해성 바이러스 및 상기 바이러스를 포함하는 암의 병용치료조성물, 종양용해성 바이러스에 의해 도입된 항원에 특이적인 면역세포 및 상기 면역세포를 포함하는 암의 병용치료조성물, 및 세포 표면에 표지되는 항원의 발현카세트를 포함하는 종양용해성 바이러스를 투여하는 단계 및 상기 투여 후에 상기 항원을 특이적으로 인식하는 면역세포 또는 항체 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 암의 병용치료방법에 관한 것이다.
종양, 특히 악성 종양은 전 세계적으로 주요 사망요인이 되고 있으며, 개인적·사회적으로 막대한 부담을 지움에 따라 종양의 치료에 대한 중요성이 높아지고 있다. 분자생물학의 발전에 따라 이에 대한 다양한 접근이 시도되었으며, 그 중 성과를 나타낸 치료 방법으로 CAR-T로 대표되는 면역세포치료와 종양용해성 바이러스를 들 수 있으나, 두 치료법 모두 특히 고형암에서는 한계를 드러내었다.
고형암의 치료에 있어서, CAR-T세포는 각종 장벽에 부딪히는 것으로 밝혀졌다. CAR-T는 혈류로부터 암 내로 옮겨져 암 덩어리 내로 침투하고 면역억제적인 종양미세환경을 가지는 암 내에서 생존하는 동시에 이펙터로서의 기능을 유지하고 증식해야 한다. 또한, CAR-T는 암 세포 전체를 없애는 데 한계를 드러내었는데, 이는 암 세포가 발현하는 항원이 이형성(heterogeneity)을 가지며 변이를 통해 CAR-T의 특이적 인식 범주에서 빠져나가기 쉽기 때문이다. 또한, CAR-T는 살아있는 약으로서 상당한 독성을 일으킬 가능성이 있다. 현재 이러한 장벽을 넘어 고형암에 효과를 가지는 면역세포에 대한 연구가 다양하게 이루어지고 있으며, 예컨대 대한민국 공개공보 제10-2016-0138298호 등이 있으나 탁월한 효과를 나타내는 임상시험 결과는 아직 확인할 수 없었다.
종양용해성 바이러스(oncolytic virus)는 고유하게(intrinsically) 또는 엔지니어링되어 종양세포를 선택적으로 감염킬 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이러한 감염을 통해 종양세포를 죽일 수 있는 바이러스로서, 종양용해(oncolysis)를 통해 종양 세포를 죽이는 동시에 새로운 감염성 있는 비리온(virion) 및 종양 항원을 방출시키고 숙주의 항종양 면역반응을 촉진함으로써 종양세포의 제거에 효과를 나타낼 수 있는 것으로 알려졌다. 그러나 종양용해성 바이러스 단독으로는 부피가 크거나 전이된 암을 완전히 치료하기 힘든 것으로 나타났다. 현재 고형암 치료를 위한 몇 가지 시도가 존재하며, 예컨대 대한민국 공개공보 제10-2018-0118249 가 있으나 면역세포치료와의 병용치료를 제시하고 있지 않다.
따라서 효과적인 항암치료제에 대한 요구가 여전히 존재하며, 특히 고형암 및 그 변이암의 경우 종양미세환경 및 접근성 등 암의 특성에 따른 어려움이 있어 새로운 접근이 필요하다.
본 발명은 전술한 요구를 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명의 일 실시예는 세포 표면에 표지되는 항원으로서, 엔지니어링된 면역세포 또는 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원의 발현카세트를 포함하는 종양용해성 바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 종양용해성 바이러스를 포함하는 암의 병용 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 종양용해성 바이러스에 의해 도입되어 종양세포의 표면에 표지된 항원을 특이적으로 인식하도록 엔지니어링된 면역세포를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 엔지니어링된 면역세포를 포함하는 암의 병용 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 세포 표면에 표지되는 항원의 발현카세트를 포함하는 종양용해성 바이러스를 투여하는 단계; 및 상기 투여 후에 상기 항원을 특이적으로 인식하는 엔지니어링된 면역세포를 투여하는 단계를 포함하여, 상기 면역세포가 암세포로 유도되도록 함으로써 암의 치료, 특히 고형암의 치료에 있어 기존의 면역세포 및 종양용해성 바이러스 요법이 각각 가지는 한계를 뛰어넘을 수 있는 암의 병용 치료방법을 제공한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면에 따른 종양용해성 바이러스는 세포 표면에 표지되는 항원으로서, 엔지니어링된 면역세포 또는 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원의 발현카세트를 포함한다.
여기서, 상기 항원은 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 특이적으로 발현되는 항원 또는 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원일 수 있다. 상기 항원은 5T4, 알파 5β인테그린, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β카테닌/m, Bcr-abl, MN/CIX 항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CD4, CD7, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44 variant domain 6, CD123, CD135, CD138, CD269, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLEC12A, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT(또는 hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MART-2/Ski, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, natural killer group 2D, Lewis Y antigen, PAP, 프로테이나제-3, p190 마이너 bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1, SART-3, 서바이빈, TEL/AML1, TGFβTPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT1, NY-Eso-1 및 NY-Eso-B 중에서 선택되는 것이고 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 특이적으로 발현되는 항원일 수 있다. 상기 항원은 5T4, 알파 5β인테그린, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β카테닌/m, Bcr-abl, MN/CIX 항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CD4, CD7, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44 variant domain 6, CD123, CD135, CD138, CD269, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLEC12A, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT(또는 hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MART-2/Ski, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, natural killer group 2D, Lewis Y antigen, PAP, 프로테이나제-3, p190 마이너 bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1, SART-3, 서바이빈, TEL/AML1, TGFβTPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT1, NY-Eso-1 및 NY-Eso-B 중에서 선택되는 것이고 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원일 수 있다. 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원은 바이러스를 투여하고자 하는 대상과 다른 종 또는 바이러스로부터 유래된 펩타이드, 또는 펩타이드신규에피토프(peptide neo epitope, PNE)를 포함할 수 있다. 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원은 투여하는 바이러스 유래 당단백질 또는 막단백질을 포함하는 것일 수 있다.
상기 종양은 고형암이고, 상기 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD138 및 CD269 중에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 항원은 막단백질 또는 주조직적합성복합체(MHC)에 의해 제시된 펩타이드 형태로 세포막 상에 표지되는 것일 수 있다.
상기 종양용해성 바이러스는 레오바이러스, 세네카밸리바이러스, 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병바이러스, 헤르페스심플렉스바이러스, 홍역바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자바이러스, 신드비스바이러스, 폭스바이러스, 콕사키바이러스, 횡문근바이러스, 파보바이러스, 셈리키포레스트바이러스 및 아데노바이러스 중 어느 하나에 속할 수 있다.
상기 종양용해성 바이러스는 백시니아바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스 중에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 백시니아바이러스는 Lister, Wyeth, Copenhagen 및 Western reserve 주 중에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 종양용해성 바이러스는 하나 이상의 유전자가 녹아웃되거나 삽입되어 항종양성이 향상된 것일 수 있다. 상기 녹아웃된 유전자는 티미딘 키나제, 백시니아 성장인자, E3L, K3L, B18R, B8R, E1B55K, E1ACR2, E3gp19K, E1B19K, ICP6, ICP0, ICP34.5 및 ICP47 중에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 상기 삽입된 유전자는 사이토카인, 케모카인, 면역세포 공자극단백질, 면역관문저해제 및 세포외기질조절단백질을 코딩하는 유전자 중에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 상기 삽입된 유전자는 항체, 항원결합단편 및 저해성 핵산 중에서 선택되는 것이고, 상기 항체, 항원결합단편 및 저해성 핵산은 상기 종양 세포 상의 억제성 면역관문리간드를 억제하거나 상기 면역세포 상의 억제성 면역관문수용체를 저해하는 것일 수 있다.
상기 종양은 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골암, 난소암, 뇌종양, 대장암, 두경부암, 방광암, 상피암, 선암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 육종, 자궁경부암, 자궁암, 전립선암, 중피종, 직장암, 췌장암, 폐암, 피부암 및 흑색종을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일측면에 따른 암의 병용 치료용 조성물은 전술한 종양용해성 바이러스를 포함한다.
여기서, 상기 암의 병용 치료용 조성물은 암환자에게 엔지니어링된 면역세포를 투여하기 전에 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 암의 병용 치료용 조성물은 107 내지 1011 pfu의 상기 종양용해성 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 암의 병용 치료용 조성물은 비경구투여용으로 조성된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 따른 면역세포는 종양용해성 바이러스에 의해 도입되어 종양세포의 표면에 표지된 항원을 특이적으로 인식하도록 엔지니어링된 것이다.
여기서, 상기 엔지니어링된 면역세포는 상기 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor) 또는 단일클론 T세포 수용체(monoclonal T cell receptor)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 면역세포는 T세포 또는 NK세포 중에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 항원은 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 특이적으로 발현되는 항원 또는 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원일 수 있다. 상기 항원은 5T4, 알파 5β인테그린, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β카테닌/m, Bcr-abl, MN/CIX 항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CD4, CD7, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44 variant domain 6, CD123, CD135, CD138, CD269, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLEC12A, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT(또는 hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MART-2/Ski, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, natural killer group 2D, Lewis Y antigen, PAP, 프로테이나제-3, p190 마이너 bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1, SART-3, 서바이빈, TEL/AML1, TGFβTPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT1, NY-Eso-1 및 NY-Eso-B 중에서 선택되는 것이고 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 특이적으로 발현되는 항원일 수 있다. 상기 항원은 5T4, 알파 5β인테그린, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β카테닌/m, Bcr-abl, MN/CIX 항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CD4, CD7, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44 variant domain 6, CD123, CD135, CD138, CD269, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLEC12A, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT(또는 hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MART-2/Ski, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, natural killer group 2D, Lewis Y antigen, PAP, 프로테이나제-3, p190 마이너 bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1, SART-3, 서바이빈, TEL/AML1, TGFβTPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT1, NY-Eso-1 및 NY-Eso-B 중에서 선택되는 것이고 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원일 수 있다. 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원은 바이러스를 투여하고자 하는 대상과 다른 종 또는 바이러스로부터 유래된 펩타이드, 또는 펩타이드신규에피토프(peptide neo epitope, PNE)를 포함할 수 있다. 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원은 투여하는 바이러스 유래 당단백질 또는 막단백질을 포함하는 것일 수 있다.
상기 종양은 고형암이고, 상기 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD138 및 CD269 중에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 항원은 막단백질 또는 주조직적합성복합체(MHC)에 의해 제시된 펩타이드 형태로 세포막 상에 표지되는 것일 수 있다.
상기 종양용해성 바이러스는 레오바이러스, 세네카밸리바이러스, 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병바이러스, 헤르페스심플렉스바이러스, 홍역바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자바이러스, 신드비스바이러스, 폭스바이러스, 콕사키바이러스, 횡문근바이러스, 파보바이러스, 셈리키포레스트바이러스 및 아데노바이러스 중 어느 하나에 속할 수 있다.
상기 종양용해성 바이러스는 백시니아바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스 중에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 백시니아바이러스는 Lister, Wyeth, Copenhagen 및 Western reserve 주 중에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 종양용해성 바이러스는 하나 이상의 유전자가 녹아웃되거나 삽입되어 항종양성이 향상된 것일 수 있다. 상기 녹아웃된 유전자는 티미딘 키나제, 백시니아 성장인자, E3L, K3L, B18R, B8R, E1B55K, E1ACR2, E3gp19K, E1B19K, ICP6, ICP0, ICP34.5 및 ICP47 중에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 상기 삽입된 유전자는 사이토카인, 케모카인, 면역세포 공자극단백질, 면역관문저해제 및 세포외기질조절단백질을 코딩하는 유전자 중에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 상기 삽입된 유전자는 항체, 항원결합단편 및 저해성 핵산 중에서 선택되는 것이고, 상기 항체, 항원결합단편 및 저해성 핵산은 상기 종양 세포 상의 억제성 면역관문리간드를 억제하거나 상기 면역세포 상의 억제성 면역관문수용체를 저해하는 것일 수 있다.
상기 종양은 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골암, 난소암, 뇌종양, 대장암, 두경부암, 방광암, 상피암, 선암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 육종, 자궁경부암, 자궁암, 전립선암, 중피종, 직장암, 췌장암, 폐암, 피부암 및 흑색종을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 따른 암의 병용 치료용 조성물은 상기 엔지니어링된 면역세포를 포함한다.
여기서, 상기 암의 병용 치료용 조성물은 106 내지 1012 개의 엔지니어링된 면역세포를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 암의 병용 치료용 조성물은 비경구투여용으로 조성된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 따른 암의 병용 치료방법은 세포 표면에 표지되는 항원의 발현카세트를 포함하는 종양용해성 바이러스를 투여하는 단계; 및 상기 투여 후에 상기 항원을 특이적으로 인식하는 엔지니어링된 면역세포를 투여하는 단계를 포함한다.
여기서, 상기 엔지니어링된 면역세포를 투여하는 단계는 상기 항원이 종양 세포에 발현된 이후에 수행되는 것일 수 있다.
상기 엔지니어링된 면역세포를 투여하는 단계는 상기 종양용해성 바이러스를 투여 후 1시간 내지 100일 이후에 수행되는 것일 수 있다.
상기 종양용해성 바이러스는 정맥, 근육, 복강 또는 종양 내로 투여하는 것일 수 있다.
상기 엔지니어링된 면역세포는 정맥 내로 투여하는 것일 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 종양용해성 바이러스는 항원을 종양 세포에서 발현 및 표지시킴으로써 상기 항원에 특이적인 면역세포 또는 항체 치료제를 종양으로 유도하는 효과를 가질 수 있다. 특히, 상기와 같은 효과를 가지는 상기 바이러스 및 치료제의 병용은, 분자 마커 발굴, 상기 마커에 특이적인 면역세포 또는 항체 치료제의 개발 및 승인 과정을 개별 암 별로 거치며 천문학적인 시간과 비용을 들일 필요가 없이 상기 종양용해성 바이러스에 의해 감염가능한 신생물(neoplasm) 질환 전반에 적용될 수 있다. 또한, 암의 경우 지속적인 변이를 거치며 마커 항원에 변이가 일어나거나 상기 항원의 발현이 줄어들며 개인별 변화 양상도 다양하게 나타남으로써 초기 마커 항원에 효과적이었던 면역세포 또는 항체 치료제가 더 이상 항암효과를 나타내지 못하는 경우가 있는데, 본 발명의 실시예에 따른 치료방법은 이러한 마커의 변화에 따른 효과의 상실 역시 우회할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 종양용해성 바이러스는 면역세포 또는 항체 치료제의 종양 공격에 좀더 적합한 환경을 제공할 수 있다. 즉, 종양 세포의 용해(lysis)를 통해 종양덩어리가 부서지면서 암세포 표면이 외부로 더 많이 노출되며, 상기 바이러스에 의해 도입된 항원이 표지된 세포의 노출이 증가됨으로써 상기 항원이 상기 면역세포 또는 항체에 의해 인식될 가능성이 높아지고, 상기 바이러스의 감염 자체가 종양세포에 위험 신호로 작용하여 사이토카인 발현이 증가하며, 상기 바이러스에 의한 감염 후 혈관세포의 복구과정에서 T세포의 유입이 더욱 용이하도록 변화시키는 등 면역억제적인 종양미세환경이 면역세포의 종양 내 유입, 증폭 및 유지에 적합하도록 변화할 수 있다. 추가적으로, 상기 바이러스의 단독작용으로 용해되지 못한 세포들이 면역세포에 의해 공격을 받아 용해되어 더 많은 종류 및 양의 암 항원이 분출될 수 있다.
본 발명에 따른 종양용해성 바이러스 및 면역세포 또는 항체 치료제의 병용요법은 전술한 같은 효과에 의해, 특히 현재까지의 치료제들이 큰 성과를 보이지 못한 고형암의 치료에 효율적일 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 종양용해성 바이러스의 게놈의 대표적인 요소를 도식적으로 나타낸 것이다.
도2는 본 발명의 실시예에 따른 종양용해성 바이러스의 재조합 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도3은 본 발명의 실시예에 따른 종양용해성 바이러스의 서열 분석 결과이다.
도4는 본 발명의 실험예에 따른 종양용해성 바이러스에 감염된 세포의 표면에 표지된 항원의 분석 결과이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 않으며 본 발명은 후술할 청구범위에 의해 정의될 뿐이다.
덧붙여, 본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명의 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에서 유전자라는 지칭 하에 사용한 각 유전자의 고유명칭은 공식적으로 알려진 유전자명, 관용적으로 사용되는 명칭 또는 그 유전자의 산물의 명칭, 예컨대 단백질을 코딩하는 유전자의 경우 그 단백질이다. 본 명세서 상에서 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 서로 교환가능한 개념으로 사용되었고, 펩티드 결합에 의해 공유결합을 이루는 아미노산 잔기를 포함하는 화합물을 의미한다.
본 발명의 일측면에 따른 종양용해성 바이러스는 세포 표면에 표지되고, 엔지니어링된 면역세포 또는 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원의 발현카세트를 포함한다.
여기서, '발현카세트'는 발현시키고자 하는 RNA 또는 단백질의 코딩 서열과 상기 서열의 발현을 조절할 수 있는 서열이 포함되고, 상기 조절 서열은 상기 코딩 서열에 작동이 가능하도록 연결되어 있는 단위를 의미한다. 상기 조절 서열에는 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 폴리아데닐레이션 신호 (polyadenylation signal), IRES(internal ribosome entry site), 인트론(intron), 기타 전사 후 조절인자(post-transcriptional regulatory elements) 등이 하나 이상 포함될 수 있다. 여기서 상기 프로모터는 다양한 바이러스 또는 생물 유래일 수 있고, 예컨대 바이러스 유래인 경우 백시니아바이러스, 아데노바이러스 또는 헤르페스심플렉스바이러스로부터 얻어진 것일 수 있다. 상기 프로모터는 특정 바이러스 또는 생물 유래이거나 그로부터 변형된 것일 수 있고, 예컨대 백시니아바이러스 유래이며, 후기(late)-초기(early) VACV p7.5프로모터, 백시니아 변형된 H5(mH5) 프로모터, 백시니아 짧은 합성 초기-후기 pS 프로모터, pC11R 프로모터, pF11L 프로모터, psFJ1-10 합성 초기 프로모터, pHyb 합성 초기 프로모터, 임의의 천연 백시니아 초기 프로모터, 후기-초기 최적화된 (LEO) 프로모터 및 후기 프로모터(pLate) 중에서 선택된 것일 수 있다. 상기 프로모터는 발현카세트에 의해 발현되는 상기 항원의 성질에 따라 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 항원이 정상세포에서 발현되어 부작용을 일으킬 가능성이 있는 경우, 상기 발현이 상기 바이러스 감염 후 늦은 시점에 이루어질 수 있는 후기 프로모터를 이용할 수 있다. 상기 발현카세트는 온전한 카세트 형태로 바이러스 게놈 내에 도입된 것이거나, 바이러스 내에 존재하는 일부 서열을 활용하여 카세트를 이룰 수 있도록 도입될 수 있으며, 어느 경우이든 결과적으로 항원이 적절히 발현이 되는 형태로 상기 바이러스 게놈에 포함됨을 의미한다.
상기 '면역세포' 및 '엔지니어링된 면역세포'에 대해서는 후술한다.
상기 '항체'는 일반적으로 이뮤노글로뷸린(immunoglobulin)을 지칭하나, 본 발명에서는 항원의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단편(binding fragment)을 포함한 개념을 의미하고, 상기 항체는 추가적으로 Fc(crystallizable fragment), 콘쥬게이션된 약물(conjugated drugs) 등을 포함할 수 있다.
항원이 면역세포 또는 항체에 의해 '특이적으로 인식'된다는 것은 자명하다시피, 상기 항원의 적어도 하나의 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 단편이 상기 면역세포 상의 수용체 또는 상기 항체의 일부로 존재함을 의미하고, 상기 결합에 의해 상기 면역세포 또는 항체에 의한 면역작용, 콘쥬게이션된 약물작용 등의 반응이 일어날 수 있다.
상기 항원은 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 특이적으로 발현되는 항원 또는 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원일 수 있다. 이때, 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 이미 특이적으로 발현되는 항원을 상기 바이러스에 의해 추가로 도입할 경우, 상기 항원의 발현량이 증가하여 상기 항원에 특이적인 면역세포 또는 항체에 노출될 가능성이 높아져 상기 면역세포 또는 항체를 포함하는 치료제의 항암효과를 높일 수 있다. 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원을 상기 바이러스에 의해 추가로 도입할 경우, 도입 전에는 상기 종양 세포에 반응하지 않았을 상기 항원에 특이적인 면역세포 또는 항체가 상기 종양 세포로 유도되도록 할 수 있다. 즉, 이미 개발된 면역세포 또는 항체가 특이적으로 인식하는 항원을 상기 종양용해성 바이러스로 세포에 도입시켜 발현 또는 표지할 수 있도록 한다면 개별 암 별로 차이가 나는 마커 항원을 발굴하고 상기 항원에 대한 면역세포 또는 항체 치료제를 개발하기 위해 막대한 시간과 비용을 지불하지 않고 기존의 면역세포 또는 항체를 사용하여 다양한 암을 치료할 수 있다.
상기 항원은 5T4, 알파 5β인테그린, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β카테닌/m, Bcr-abl, MN/CIX 항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CD4, CD7, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44 variant domain 6, CD123, CD135, CD138, CD269, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLEC12A, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT(또는 hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MART-2/Ski, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, natural killer group 2D, Lewis Y antigen, PAP, 프로테이나제-3, p190 마이너 bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1, SART-3, 서바이빈, TEL/AML1, TGFβTPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT1, NY-Eso-1 및 NY-Eso-B 중에서 선택되는 것이고 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 특이적으로 발현되는 항원일 수 있다. 상기 항원은 5T4, 알파 5β인테그린, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β카테닌/m, Bcr-abl, MN/CIX 항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CD4, CD7, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44 variant domain 6, CD123, CD135, CD138, CD269, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLEC12A, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT(또는 hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MART-2/Ski, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, natural killer group 2D, Lewis Y antigen, PAP, 프로테이나제-3, p190 마이너 bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1, SART-3, 서바이빈, TEL/AML1, TGFβTPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT1, NY-Eso-1 및 NY-Eso-B 중에서 선택되는 것이고 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원일 수 있다. 상기 5T4 이하 나열된 항원은 알려진 암 마커 항원의 예시일 뿐이며, 본 발명의 항원은 이에 제한되지 않는다.
상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원은 바이러스를 투여하고자 하는 대상과 다른 종 또는 바이러스로부터 유래된 펩타이드, 또는 펩타이드신규에피토프(peptide neo epitope, PNE)를 포함할 수 있다. 여기서 바이러스를 투여하고자하는 대상과 다른 종으로부터 유래된 펩타이드는 상기 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않을 뿐 아니라, 상기 대상의 종양 세포 상에서 발현되는 단백질과 유사하더라도 상기 대상에 존재하는 면역세포에 의해 같은 항원으로 인식되지 않을 정도로 상동성이 낮은 것이 선호되며, 이는 통상의 기술자에게 자명한 사항이므로 자세한 설명은 생략한다. 상기 PNE는 인공적으로 디자인된 펩타이드 항원을 의미한다. 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원은 투여하는 바이러스 유래 당단백질 또는 막단백질을 포함하는 것일 수 있다.
상기 종양은 고형암이고, 상기 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD138 및 CD269 중에서 선택되는 것일 수 있다. CD19 이하 나열된 상기 항원은 혈액세포에서 특이적으로 발현되는 항원으로, 상기 항원을 원래 발현하지 않을 고형암에 도입시킬 경우, 상기 항원에 특이적이며 이미 개발된 혈액암 면역세포 치료제를 추가로 투여하여 이들 세포를 타겟 종양으로 유도할 수 있다.
상기 항원은 온전한 길이의(full-length) 단백질 또는 그 일부인 펩타이드일 수 있다.
상기 항원은 막단백질 또는 주조직적합성복합체(MHC, major histocompatibility complex)에 의해 제시된 펩타이드 형태로 세포막 상에 표지되는 것일 수 있다. 여기서, 상기 막단백질은 막관통영역, 부분적 막관통영역(예컨대, 양친매성 알파-헬릭스(amphipathic α-helix); 친유성 루프(hydrophobic loop) 등), 지질그룹과의 공유결합(lipidation, 예컨대 myristoylation, palmitoylation, prenylation, glycosyl-phosphatidylinositol addition 등), 기타 막과 정전기성(electrostatic) 또는 이온성(ionic) 상호작용할 수 있는 영역 등에 의해 막에 직접 연결되어 있고 세포 외로 노출된 영역을 포함하는 것을 의미한다. 주조직적합성복합체(MHC)에 의해 제시되는 단백질은 프로테아좀(proteasomal) 또는 리소좀(lysosomal) 시스템에 의해 분해되어 MHC로 로딩(loading)되어 세포막 상에 표지되는 것을 뜻한다.
상기 종양용해성 바이러스는 레오바이러스, 세네카밸리바이러스, 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병바이러스, 헤르페스심플렉스바이러스, 홍역바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자바이러스, 신드비스바이러스, 폭스바이러스, 콕사키바이러스, 횡문근바이러스, 파보바이러스, 셈리키포레스트바이러스 및 아데노바이러스 중 어느 하나에 속할 수 있다. 상기 종양용해성 바이러스는 바람직하게 백시니아바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스심플렉스바이러스, 레트로바이러스, 레오바이러스, 랍도바이러스, 뉴캐슬병바이러스, 폴리오마바이러스, 피코르나바이러스, 콕사키바이러스, 파보바이러스 중에서 선택되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게 백시니아바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스심플렉스바이러스 중에서 선택되는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게 백시니아바이러스일 수 있다. 상기 백시니아바이러스는 Lister, Western Reserve (WR), Copenhagen (Cop), Bern, Paris, Tashkent, Tian Tan, Wyeth (DRYVX), IHD-J, IHD-W, Brighton, Ankara, CVA382, Modified Vaccinia Ankara (MVA), Dairen I, LC16m8, LC16M0, LIVP, ACAM2000, WR 65-16, Connaught, New York City Board of Health (NYCBH), EM-63 and NYVAC 중에서 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게 Lister, Wyeth, Copenhagen 및 Western reserve 주 중에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 종양용해성 바이러스는 하나 이상의 유전자가 녹아웃되거나 삽입되어 항종양성이 향상된 것일 수 있다. 여기서 녹아웃은 유전자가 불능화되거나 활성이 심각하게 저해된 것을 의미하며, 이는 대상 유전자의 결실, 변이 및 발현조절부위의 변형 등을 포함하는 방법을 통해 이루어진다. 유전자의 삽입은 상기 유전자가 발현가능한 형태로 이루어지는데, 예컨대 발현조절부위와 이에 연결된 유전자 코딩부분을 포함하는 서열이 삽입된 것을 의미한다. 항종양성의 향상은 상기 바이러스의 종양선택성 증가, 바이러스의 면역회피 및 저해 기전 제거, 면역세포의 침투력 또는 침투가능성 향상, 종양 부위로의 면역세포 유인, 및 기타 면역반응의 활성화를 포함한다.
상기 녹아웃된 유전자는 티미딘 키나제, 백시니아 성장인자, E3L, K3L, B18R, B8R, E1B55K, E1ACR2, E3gp19K, E1B19K, ICP6, ICP0, ICP34.5 및 ICP47 중에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 상기 종양용해성 바이러스는 백시니아바이러스 (vaccinia virus, VV)이고, 상기 녹아웃된 유전자는 티미딘 키나아제, 리보뉴클레오티드 환원효소, 백시니아 성장인자, E3L, K3L, B18R 및 B8R 중에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 티미딘 키나아제(thymidine kinase, TK) 및 리보뉴클레오티드 환원효소(ribonucleotide reductase, RR)는 바이러스 DNA의 증폭에 필수적인 요소이자 암세포에서 활성이 높은 인자들이며, 백시니아 성장인자(vaccinia growth factor, VGF)는 많은 암세포에서 활성화 또는 과발현되는(upregulated) EGFR(epidermal growth factor receptor)에 아고니스트로 작용하여 세포의 성장과 증식을 촉진하므로, TK, RR 또는 VGF 중 하나 이상의 녹아웃을 통해 상기 VV의 종양선택성을 높일 수 있다. E3L, K3L, B18R 및 B8R은 인터페론 반응을 회피하므로, 상기 유전자 중 하나 이상의 녹아웃을 통해 상기 VV가 침투한 세포의 면역반응을 증가시킬 수 있다. 상기 종양용해성 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus, AdV)이고, 상기 녹아웃된 유전자는 E1B55K, E1ACR2, E3gp19K 및 E1B19K 중에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. E1B55K 및 E1ACR2는 세포를 분열주기 중 S기로 진입하도록 촉진하는 역할을 하는데, 암세포에서는 S기 진입에 대한 조절기작이 제대로 작동하지 않으므로 상기 두 유전자 중 하나 이상의 녹아웃을 통해 상기 AdV의 종양선택성을 높일 수 있다. E3gp19K는 MHC에 의한 항원제시를 저해하며 E1B19K는 Bcl2의 기능적 상동체로 아폽토시스(apoptosis)를 저해하는 역할을 하므로, 상기 두 유전자 중 하나 이상을 녹아웃시킬 경우 상기 AdV가 침투한 세포에 대한 면역 및 저해반응을 증가시킬 수 있다. 상기 종양용해성 바이러스는 헤르페스심플렉스바이러스(herpes simplex virus, HSV)이고, 상기 녹아웃된 유전자는 티미딘 키나아제, ICP6, ICP0, ICP34.5, ICP47 중에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 티미딘 키나아제, 리보뉴클레오티드 환원효소인 ICP6 및 바이러스 게놈 증폭을 촉진하는 ICP0는 하나 이상 녹아웃시 상기 HSV의 종양선택성을 높일 수 있다. 인터페론 반응을 저해하는 ICP0, 세포의 단백질합성조절 및 자가포식(autophagy)을 저해하는 ICP34.5, MHC에 의한 항원제시를 저해하는 ICP47은 하나 이상 녹아웃시킴으로써 상기 HSV가 침투한 세포에 대한 면역 및 저해반응을 증가시킬 수 있다.
상기 삽입된 유전자는 사이토카인, 케모카인, 면역세포 공자극단백질, 면역관문저해제 및 세포외기질조절단백질을 코딩하는 유전자 중에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 상기 사이토카인은 TNF-알파 수퍼 패밀리(예컨대, TNF-알파, TNF-C, OX40L, CD154, FasL, LIGHT, TL1A, CD70, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드, EDA-A, EDA-A2), TGF-베타 수퍼 패밀리, IL-1 패밀리 (예컨대, IL-1 and IL-8), IL-2 패밀리, IL-10 패밀리, IL-17 패밀리, 인터페론 패밀리에 속하는 분자 중에서 하나 이상 선택될 수 있고, 예컨대, TNF-알파, TNF-alpha, IL-1, IL-8, IL-10, IL-17, LIGHT, TLIA, Siva, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, NGF, BDNF, NT-3, and EDA-A2, TNF-C, OX40L, CD154, FasL, CD70, CD153, 4-1BB 리간드, EDA-A, IL-2, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, Flt3 리간드, GM-CSF, IL-15, IL-12, fms-related tyrosine kinase 3 리간드(FLT3L) 중에서 하나 이상 선택될 수 있다. 상기 케모카인은 MIP-1 alpha, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 and CCL21 중에서 하나 이상 선택될 수 있다. 상기 면역세포 공자극단백질은 CD3 항체, CD3 결합단편, B7-1, B7-2, CD80, 또는 B7-1, B7-2, 또는 CD80의 활성단편 중에서 하나 이상 선택될 수 있다. 후술할 면역관문저해제는 면역세포의 억제성 면역관문수용체 활성을 저해하거나 촉진성 면역관문수용체 활성을 높일 수 있는 제제로, 상기 억제성 면역관문수용체는 A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, TIM-3 및 VISTA 중에서 하나 이상 선택된 것일 수 있고, 촉진성 면역관문수용체는 CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR 및 ICOS중에서 하나 이상 선택된 것일 수 있다. 상기 삽입된 유전자가 코딩하는 단백질은 상기 종양 세포 밖으로 분비되는 수용성 단백질 또는 막결합된 단백질일 수 있다.
상기 삽입된 유전자는 항체, 항원결합단편 및 저해성 핵산 중에서 선택되는 것이고, 상기 항체, 항원결합단편 및 저해성 핵산은 상기 종양 세포 상의 억제성 면역관문리간드를 억제하거나 상기 면역세포 상의 억제성 면역관문수용체를 저해하는 것일 수 있다. 분자 활성을 저해할 수 있는 기술은 본 발명 분야 통상적 기술자에 널리 알려져 있는 바이므로, 자세한 설명은 생략한다.
상기 종양은 양성종양(benign tumor) 및 악성종양(malignant tumor), 즉 암(cancer)을 포함할 수 있고, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골암, 난소암, 뇌종양, 대장암, 두경부암, 방광암, 상피암, 선암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 육종, 자궁경부암, 자궁암, 전립선암, 중피종, 직장암, 췌장암, 폐암, 피부암 및 흑색종을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일측면에 따른 암의 병용 치료용 조성물은 전술한 종양용해성 바이러스를 포함한다.
여기서, 상기 암의 병용 치료용 조성물은 암환자에게 후술할 엔지니어링된 면역세포를 투여하기 전에 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, 상기 종양용해성 바이러스에 의해 종양 세포에 항원이 도입되어 표지되고, 이를 특이적으로 인식하는 면역세포가 상기 항원에 의해 종양 세포로 유도되는 효과가 나타날 수 있다. 또한, 상기 종양용해성 바이러스에 의해 종양 세포가 용해되면서 더 많은 상기 항원이 노출되어 상기 면역세포에 의한 항종양효과를 높일 수 있다. 또한, 상기 바이러스의 침입에 대한 방어기작으로서 상기 종양 세포에서 생성되는 물질 또는 상기 바이러스에 의해 도입된 물질이 상기 면역세포의 투여 전에 이루어져 상기 면역세포에 의한 항종양효과를 높일 수 있다. 즉, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 면역세포공자극단백질, 면역관문저해제 또는 세포외기질조절단백질 등이 상기 종양 세포로부터 분비되어 상기 면역세포의 활성을 높이거나 상기 종양 세포로 상기 면역세포를 유인하거나, 상기 면역세포의 접근을 쉽게 만들 수 있다.
상기 암의 병용 치료용 조성물은 107 내지 1011 pfu, 바람직하게 109 내지 1011 pfu의 상기 종양용해성 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 조성물 내의 상기 종양용해성 바이러스 양이 지나치게 적을 경우 효과를 충분히 낼 수 없을 수 있으며, 지나치게 높을 경우 전신독성 등 부작용을 나타낼 수 있고 비용면에서도 합리적이지 못할 수 있다.
상기 암의 병용 치료용 조성물은 비경구투여용으로 조성된 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서 비경구투여는 종양 내(intratumoral), 정맥 내(intravenous), 뇌 내(intracerebral), 복강 내(intraperitoneal), 근육 내(intramuscular), 흉골 내(instrasternal), 피하(subcutaneous), 비강 내(intranasal)로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 비경구투여는 종양 내, 정맥 내, 복강 내로 이루어질 수 있고, 가장 바람직하게 종양 내로 이루어질 수 있다. 뇌암의 경우, 상기 비경구투여는 바람직하게 종양 내, 비강 내 또는 뇌 내로 이루어질 수 있다.
상기 비경구투여를 위해 상기 조성물은 현탁액 또는 에멀전 형태일 수 있다. 상기 조성물은 전술한 바와 같은 유효투여량의 종양용해성 바이러스 외에도 약학적으로 포함될 수 있는 희석제, 방부제, 용해제, 유화제, 어쥬반트(adjuvant) 및 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에는 그 외 추가로 아스코르브산(ascorbic acid), 염화메타바이설파이트(sodium metabisulfite) 등의 항산화제, 락토오즈, 만니톨 등의 부형제가 포함될 수 있다. 상기 희석제는 멸균수, 다양한 버퍼조성(예컨대, Tris-HCl, acetate, phosphate), pH 및 이온강도의 완충식염수일 수 있고, 유성 용해제 또는 비히클은 프로필렌 글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol), 식물성 오일 등을 포함한다.
상기 투여경로의 선택 및 각 투여경로에 따른 추가성분 및 그 조성은 본 발명의 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 바이므로, 이에 대한 자세한 설명은 생략한다.
본 발명의 또 다른 일측면에 따른 면역세포는 종양용해성 바이러스에 의해 도입되어 종양세포의 표면에 표지된 항원을 특이적으로 인식하도록 엔지니어링된 것이다.
여기서, 상기 종양용해성 바이러스에 대한 기술적 내용은 전술한 바와 같다.
'엔지니어링된' 세포는 세포에 조작이 가해진 것을 의미하며, 핵산 또는 외부 물질의 도입에 의해, 고유하게(intrinsically) 발현하지 않던 유전자를 발현하게 되거나, 소량 발현하던 유전자의 발현량이 늘게 되거나, 발현하던 유전자의 발현량이 감소하거나 발현하지 않게 된 세포를 의미한다.
상기 면역세포는 T세포 또는 NK(natural killer) 세포 중에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 T세포는 CD4 양성 T세포 및 CD8 양성 T세포를 포함한다.
상기 엔지니어링된 면역세포는 상기 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 또는 단일클론 T세포 수용체(monoclonal T cell receptor, mTCR)를 포함하는 것일 수 있다.
TCR은 한 개의 α 및 β사슬로 구성되어 있으며, CD3 및 제타(ζ)사슬과 비공유결합을 통해 복합체를 이룬다. α 및 β사슬의 항원인식부위를 통해 항원이 인식되면, CD3 및 제타사슬이 이러한 TCR 복합체가 발현된 면역세포의 세포질 내로 신호를 전달하여 기능적인 활성화를 유도하게 된다. 일부 TCR은 α 및 β사슬 대신 γ 및 δ사슬로 구성될 수 있다. 본 발명의 mTCR은 표적 항원을 인식하는 α, β, γ 및 δ사슬로부터 선택된 사슬, CD3 및 제타사슬을 포함할 수 있으며, 추가적으로 공자극성 분자를 포함할 수 있는데, 상기 공자극성 분자는 ICOS, OX40, CD137(4-1BB), CD27 또는 CD28로부터 선택될 수 있다.
CAR는 일반적으로 면역세포 상에 존재 시에 이러한 면역세포가 표적 세포(일반적으로 암 세포)에 대한 특이성을 가지게 됨과 동시에, 세포내 신호전달이 이루어지도록 하는, 폴리펩타이드로 구성된 세트이다. CAR는 최소한 표적 항원을 인식하는 세포 외 항원인식영역, 막관통영역 및 세포 내 신호전달영역을 포함하며, 상기 세포 내 신호전달영역은 후술할 촉진성 분자 또는 공자극성 분자로부터 유래한 것이다. 상기 폴리펩타이드로 구성된 세트는 붙어 있을 수도 있고, 자극에 의해 이합체화되는 스위치를 가져 서로 붙게 되는 형태일 수 있다. 상기 촉진성 분자는 전술한 TCR의 제타사슬일 수 있다. 상기 세포 내 신호전달영역은 전술한 공자극성 분자로부터 유래한 하나 이상의 기능성 신호전달영역을 추가로 포함할 수 있다. 또한 CAR는 상기 세포 외 항원인식영역, 상기 막관통영역 및 상기 세포 내 신호전달영역을 포함하는 융합단백질일 수 있다. 상기 CAR 융합단백질은 추가로 N말단에 리더시퀀스(leader sequence)를 포함할 수 있고, 상기 리더시퀀스는 CAR가 발현되어 세포막에 안착하는 과정에서 잘려나갈 수 있다.
상기 엔지니어링된 면역세포는 해당 세포의 활성 또는 적합성을 향상시키는 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 작용제는 면역세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어 억제하는 분자를 저해하는 작용제일 수 있다. 상기 면역세포의 기능을 억제하는 분자는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR-베타를 포함한다. 상기 작용제는 억제성 핵산(예컨대 dsRNA, siRNA, shRNA) 또는 억제성 단백질 또는 시스템(예컨대 CRISPR, TALEN, ZFN)일 수 있다. 상기 작용제와 관련된 사항은 본 발명 분야 통상의 기술자에게 알려진 바이므로 자세한 설명은 생략한다.
상기 엔지니어링된 면역세포에 포함된 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 또는 단일클론 T세포 수용체(monoclonal T cell receptor, mTCR) 및 추가 작용제(들)는 상기 면역세포에 벡터의 삽입을 통해 도입된 것일 수 있다. 여기서 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터 중에서 선택되는 것일 수 있다. 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터 중에서 선택할 경우, 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터에 들어가 있는 유전자들은 면역세포의 엔지니어링 시에 그 세포의 게놈DNA에 삽입되어 상기 유전자들을 안정적으로 발현할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 따른 암의 병용 치료용 조성물은 상기 엔지니어링된 면역세포를 포함한다.
여기서, 상기 암의 병용 치료용 조성물은 106 내지 1012 개, 바람직하게 108 내지 1010 개의 엔지니어링된 면역세포를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 조성물 내의 상기 엔지니어링된 면역세포의 양이 지나치게 적을 경우 효과를 충분히 낼 수 없을 수 있으며, 지나치게 높을 경우 전신독성 등 부작용을 나타낼 수 있고 비용면에서도 합리적이지 못할 수 있다.
상기 암의 병용 치료용 조성물은 비경구투여용으로 조성된 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서 비경구투여는 종양 내, 정맥 내, 뇌 내, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 피하, 또는 비강 내로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 비경구투여는 종양 내, 정맥 내, 또는 복강 내로 이루어질 수 있고, 가장 바람직하게 종양 내로 이루어질 수 있다. 뇌암의 경우, 상기 비경구투여는 바람직하게 종양 내, 비강 내 또는 뇌 내로 이루어질 수 있다. 상기 비경구투여를 위해 상기 조성물은 수용액 상태로 조제된 것일 수 있다. 상기 조성물은 전술한 바와 같은 유효투여량의 엔지니어링된 면역세포 외에도 약학적으로 포함될 수 있는 희석제, 방부제, 용해제, 유화제, 어쥬반트(adjuvant), 완충제 및 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 성분으로는 중성완충식염수, 인산완충식염수 등의 완충액, 글루코스, 만노스, 수크로즈, 덱스트란, 만니톨 등의 탄수화물, 폴리펩티드, 글리신 등의 아미노산, 항산화제, EDTA, 글루타티온 등의 킬레이트 시약, 알루미늄 하이드록시드 등의 어쥬반트 및 보존제 등이 있다.
상기 투여경로의 선택 및 각 투여경로에 따른 추가성분 및 그 조성은 본 발명의 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 바이므로, 이에 대한 자세한 설명은 생략한다.
본 발명의 또 다른 일측면에 따른 암의 병용 치료방법은 세포 표면에 표지되는 항원의 발현카세트를 포함하는 종양용해성 바이러스를 투여하는 단계; 및 상기 투여 후에 상기 항원을 특이적으로 인식하는 엔지니어링된 면역세포 또는 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
전술한 바와 같이, 상기 종양용해성 바이러스에 의해 종양 세포에 항원이 도입되어 표지되면, 이를 특이적으로 인식하는 면역세포가 상기 항원에 의해 종양 세포로 유도되는 효과가 나타날 수 있다. 또한, 상기 종양용해성 바이러스에 의해 종양 세포가 용해되면서 더 많은 상기 항원이 노출되어 상기 면역세포에 의한 항종양효과를 높일 수 있다. 또한, 상기 바이러스의 침입에 대한 방어기작으로서 상기 종양 세포에서 생성되는 화학물질 또는 상기 바이러스에 의해 도입된 화학물질이 상기 면역세포의 투여 전에 이루어져 상기 면역세포에 의한 항종양효과를 높일 수 있다. 즉, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 면역세포공자극단백질, 면역관문저해제 또는 세포외기질조절단백질 등이 상기 종양 세포로부터 분비되어 상기 면역세포의 활성을 높이거나, 상기 종양 세포로 상기 면역세포를 유인하거나, 상기 면역세포의 접근을 쉽게 만들 수 있다.
여기서, 상기 엔지니어링된 면역세포를 투여하는 단계는 상기 항원이 종양 세포에 발현된 이후에 수행되는 것일 수 있다. 이 경우, 종양용해성 바이러스 침투 자체가 가져오는 면역세포의 활성 및 유입 증가 외에도, 전술한 바와 같이 상기 종양용해성 바이러스에 의해 도입되고 상기 엔지니어링된 면역세포가 특이적으로 인식하는 항원이 종양 세포에 표지됨에 따른 효과를 볼 수 있다.
상기 엔지니어링된 면역세포를 투여하는 단계는 상기 종양용해성 바이러스를 투여 후 1시간 내지 100일 이후에 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게 투여 후 1일 내지 30일 이후에 수행되는 것일 수 있다. 상기 면역세포를 투여하는 시점은 상기 종양용해성 바이러스의 투여를 통해 도입되는 항원이 상기 면역세포를 유도하는 효과를 가질 수 있는 수준으로 종양 세포 표면에 발현되는 시점으로, 이는 상기 바이러스의 종류, 상기 종양의 성질, 상기 바이러스에 의해 도입되는 항원의 종류, 상기 바이러스의 투입량 등의 변수에 따라 달라질 수 있다. 상기 종양용해성 바이러스 투여 후 지나치게 이른 시점에 상기 면역세포를 투여할 경우 상기 바이러스로 종양에 도입하고자 하는 항원이 충분히 발현되지 않을 수 있으며, 지나치게 늦은 시점에 투여할 경우 상기 바이러스 감염에 따른 종양 치료에 유리한 효과가 유지되지 않을 수 있고, 상기 바이러스와 상기 면역세포 투여에 의한 시너지 효과가 나타나지 못할 수 있다.
상기 종양용해성 바이러스는 종양 내, 정맥 내, 뇌 내, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 피하, 또는 비강 내로 투여할 수 있고, 바람직하게 정맥, 근육, 복강 또는 종양 내로 투여하는 것일 수 있다.
상기 엔지니어링된 면역세포는 종양 내, 정맥 내, 뇌 내, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 피하, 또는 비강 내로 투여할 수 있고, 바람직하게 정맥 내로 투여하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예1. CD19 삽입된 재조합 백시니아 바이러스의 제조
WR ΔTK pLEO160 CD19 재조합 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스 웨스턴 리저브 균주를 백본 바이러스로 사용하여 백본 바이러스의 티미딘 키나아제(Thymidine Kinase, TK, J2R) 영역을 완전히 제거하고 CD19 유전자를 삽입하였다. WR ΔTKΔVGF pLate CD19 재조합 백시니아 바이러스는 mCherry 형광유전자가 티미딘 키나아제를 대체, 삽입되고 백시니아 성장인자(Vaccinia Growth Factor, VGF)가 제거된 백시니아 바이러스 웨스턴 리저브 균주를 백본 바이러스로 사용하였다. 백본 바이러스의 mCherry 형광 단백질 영역을 완전히 제거하고 CD19 유전자를 삽입하였다. 상동 재조합을 위하여 pMA-WR ΔTK pLEO160 CD19 재조합 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스 웨스턴 리저브 균주를 백본 바이러스로 사용하여 백본 바이러스의 티미딘 키나아제(Thymidine Kinase, TK, J2R) 영역을 완전히 제거하고 CD19 유전자를 삽입하였다. WR ΔTKΔVGF pLate CD19 재조합 백시니아 바이러스는 mCherry 형광유전자가 티미딘 키나아제를 대체, 삽입되고 백시니아 성장인자(Vaccinia Growth Factor, VGF)가 제거된 백시니아 바이러스 웨스턴 리저브 균주를 백본 바이러스로 사용하였다. 백본 바이러스의 mCherry 형광 단백질 영역을 완전히 제거하고 CD19 유전자를 삽입하였다. 상동 재조합을 위하여 pMA-MC2 전달 벡터 내의 백시니아 바이러스 J1R과 J3R 영역사이에 백시니아 합성 전기/후기 프로모터인 pLEO160와 삽입 유전자 CD19, 백시니아 합성 후기 프로모터인 pLate와 삽입 유전자 CD19을 각각 클로닝 하였다. 따라서 삽입 유전자 CD19은 백시니아 합성 전기/후기 프로모터인 pLEO160와 백시니아 합성 후기 프로모터인 pLate에 의하여 각각 발현되도록 설계되었다. 전달 벡터 pMA-MC2는 Ottawa Hospital Research Institute (OHRI, Centre for Cancer Therapeutics, 3rd Floor, North Lab, 501 Smyth Road, Ottawa, Ontario, K1H 8L6, Canada)로부터, 사람 CD19 유전자는 카이스트 김찬혁 교수 연구실(대전광역시 유정구 대학로 291 E6-3 3206호)로부터 제공받았으며 pLEO160 프로모터와 pLate 프로모터는 de novo 합성(㈜마크로젠, 대전광역시 유성구)으로 제작하여 준비하였다. 최종 전달 벡터는 사람 CD19 유전자, pLEO160 염기서열, pMA-MC2 벡터와 사람 CD19 유전자 pLate염기서열, pMA-MC2 벡터는 각각 In-fusion HJD cloning kit (제조사 Clontech, 카탈로그 번호 639648) infusion 클로닝 방식으로 제작하였다. 재조합된 백시니아 바이러스를 선별하기 위하여 pLEO160와 삽입 유전자 CD19는 TK 유전자를 발현하지 않는 사람 골육종 (143B)세포주와 선별 시약 5-bromo-2'-deoxy uridine (BrdU)를 이용하였다. TK가 발현되는 경우, 인산화된 BrdU가 바이러스 DNA에 치명적인 돌연변이를 유발하여 TK가 불활성화된 재조합 백시니아 바이러스만이 생존하게 된다. 143B 세포주와 BrdU 시약을 사용한 선별 시험을 반복하여 재조합 백시니아 바이러스를 수득하였다. pLate와 삽입 유전자 CD19는 골육종 세포인 U-2OS 세포주에서 상동 재조합을 통해 mCherry 형광 유전자 영역으로 삽입됨으로써, mCherry 형광 단백질의 불활성 여부를 이용하여 재조합 바이러스를 선별하였다.
좀더 상세하게, 바이러스 재조합을 위하여 6-well 세포배양판에 숙주세포 143B와 U-2OS를 각각 배양하고, 약 16~20시간 후, 143B 세포주에는 EMEM 2.5 % FBS 배지로 희석한 야생형 백시니아 바이러스를, U-2OS 세포주에는 DMEM 2.5% FBS 배지로 희석한 mCherry 형광 유전자가 삽입된 백시니아 바이러스를 0.05 MOI (감염다중도, Multiplicity of Infection)로 2시간 동안 감염시켰다. 백시니아 바이러스의 TK 영역과 mCherry 형광 단백질 유전자 영역에 상동 재조합이 일어나도록 제작한 pMA-MC2-pLeo160-CD19 유전자와 pMA-MC2-pLate-CD19는 형질주입 중합체 Xfect (제조사 Clontech, 카탈로그 번호 631317)를 사용하였다. 제조사의 권장 실험 방법에 따라 나노복합체를 형성하게 한 후, 백시니아 바이러스가 감염된 숙주세포주에 첨가하였다. 4시간 이후 배양 배지를 새 것으로 교환하고 37 도씨 5 % CO2 세포배양기에서 72시간 배양하였다. 72시간 후 세포를 수거하고, 세포내 존재하는 백시니아 바이러스를 유리시키기 위하여 숙주세포 현탁액을 3회 반복 동결-해동 후 재조합 바이러스 선별 시험 전까지 -60 도씨 초저온 냉동고에 보관하였다.
다음으로, 유전자 재조합으로 인하여 TK 유전자가 불활성화된 재조합 백시니아 바이러스와 mCherry 형광 유전자가 불활성화된 재조합 백시니아 바이러스를 선별하기 위하여, 6-well 세포배양판에 숙주세포 143B와 U-2OS를 각각 배양하였다. 143B 세포주에는 150 μg/mL의 BrdU를 포함하는 EMEM 2.5 % FBS 배지에 희석한 재조합 숙주세포 현탁액을, U-2OS 세포주에는 DMEM 2.5% FBS 배지로 희석한 재조합 숙주세포 현탁액을 2시간 동안 배양시켰다. 이후, 바이러스 접종 배지를 제거하고 143B 세포주에는 150 μg/mL의 BrdU를 첨가한 DMEM + 2 % FBS + 1 % 한천을, U2OS 세포주에는 DMEM + 2 % FBS + 1 % 한천을 첨가하여 단일 플라크를 선별하도록 처리하였다. 세포배양판은 백시니아 플라크가 생성될 수 있도록 37 도씨 5 % CO2 세포배양기에서 약 3-4 일간 배양하였다. 플라크가 분명하게 확인되는 시점에 마이크로파이펫을 이용하여 단일 플라크를 수집하고 무혈청 EMEM 배지 또는 무혈청 DMEM 배지에 희석한 후, 세포를 용해하기 위하여 3회 반복 동결-해동하였다. 백시니아 바이러스 백본이 혼재하지 않고 재조합이 일어난 단일 바이러스 클론을 확보하기 위하여 동일한 플라크 선별 실험을 3-4회 반복하였다. 각 단계의 샘플은 -60도씨 초저온냉동고에 보관하였다.
재조합 백시니아 바이러스에서 외래 유전자의 삽입여부를 각 플라크 선별 실험의 단계별로 확인하기 위하여, TK 유전자와 삽입하고자 하는 유전자의 염기서열에 따른 프라이머를 설계하여 중합효소연쇄반응(PCR, polymeric chain reaction)을 통해 삽입유전자가 TK 유전자 또는 mCherry 형광 유전자와 대체되었는지 여부를 검사하였다. PCR 반응의 주형은 사람 자궁경부암 세포주인 HeLaS3 세포주에 플라크 샘플을 감염시킨 후 약 3일째의 배양 배지 상등액을 이용하였다. 재조합 영역에 결합하는 프라이머는 ㈜바이오니아(대전광역시 대덕구)와 ㈜마크로젠(대전광역시 유성구)에 합성 의뢰하여 제작하였다. 유전자증폭기(SureCycler 8800, G8800A, Agilent Technologies)로 증폭한 PCR 산물은 1.0 % 아가로즈겔(agarose gel)에 전기 영동하여 재조합 여부를 확인하였다. 백시니아 바이러스 백본의 혼입 여부를 확인하기 위하여 TK 영역에 결합하는 프라이머(Maruri-21)로 증폭한 PCR 산물의 존재를 전기영동으로 평가하였으며 최종 재조합 백시니아 바이러스 샘플에는 육안으로 관찰되는 야생형 백시니아 바이러스 혼입이 없는 것으로 확인되었다.
일련번호 프라이머 명칭 염기서열
pr024 TK_C1f ttgcgatcaataaatggatcacaaccag
pr025 TK_D1r ccgagtcagtctcatgttctcacc
pr135 CD19-0754F acagctcaagacgctggaaag
pr136 CD19-0911R aggcagaagatcagataagccaaag
N/A Maruri-21 aacggtttacgttgaaatgtccca
재조합 확인된 샘플의 PCR 산물에 염기서열분석(㈜마크로젠, 대전광역시 유성구)을 진행하였다 (Forward 프라이머: ctctagctaccaccgcaatagatcc, Reverse 프라이머: gcgacctcatttgcactttctgg). 최종 염기서열 분석에는 SnapGene 소프트웨어를 사용하였으며, TK 유전자 또는 mCherry 형광 유전자가 소실되고 해당 위치에 예상하는 CD19 유전자가 삽입된 것을 확인하였다.
염기서열분석을 통하여 재조합이 확인된 바이러스를 증폭하기 위하여 선별한 플라크 샘플을 숙주세포 HeLaS3를 사용하여 단계적으로 증식시켰다. 감염시킨 숙주세포는 3-4일간 충분한 세포변성효과(cytopathic effect)를 보일 때까지 37 도씨 5 % CO2 세포배양기에서 배양하고, 수집한 감염 세포는 3회 반복 동결-해동 처리한 후 다음 단계의 숙주세포에 순차적으로 감염시켰다.
실험예1. CD19 삽입된 재조합 백시니아 바이러스 감염에 따른 항원(CD19) 발현 확인
대조군 HeLa S3 세포는 T175 플라스크에서 1X106 cells/ml에서 하룻동안 배양한 후, 다음 날 수집하였다. 실험군은 T25 플라스크에서 배양된 HeLa S3에 재조합 바이러스 18EN06-44-5-1-1를 2시간 동안 감염시킨 후, 바이러스가 포함된 배지는 제거하고 2.5% FBS가 포함된 DMEM 배지를 추가한 다음, 37℃에서 72시간 증식시킨 후, 수집하였다.
수집된 대조군과 실험군은 1000rpm에서 5분동안 원심분리하여 상층액은 제거하고 1ml의 PBS를 추가하여 세포를 현탁하였다. 이와 같은 방법을 1회 반복하고, 상층액을 제거한 수집된 세포는 100ul의 유세포 분석기 전용 완충액(Stain Buffer, BD Pharmingen™cat.554656)으로 현탁시킨 후, 항-CD19항체(abcam, cat.ab134114)와 500:1의 비율로 30분동안 얼음에서 반응시켰다.
400xg에서 5분동안 원심분리한 후, 상층액은 제거하고 1ml의 유세포 분석기 전용 완충액으로 반응된 세포를 현탁하였다. 이와 같은 방법을 1회 반복하고, 상층액을 제거한 반응된 세포는 100ul의 유세포 분석기 전용 완충액으로 현탁시킨 후, 500:1의 비율로 FITC 형광물질(Fluorescein_FITC AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG, Jackson Immuno Research, cat. 111-097-003)을 얼음에서 30분동안 부착시켰다.
400xg에서 5분동안 원심분리한 후, 상층액은 제거하고 1ml의 유세포 분석기 전용 완충액으로 반응된 세포를 현탁하였다. 이와 같은 방법을 1회 반복하고, 최종산물은 유세포 분석기(BD LSRF)로 분석하였다. 그 결과는 도4와 같았는데, CD19을 발현하는 세포가 없는 대조군에 비해 재조합 바이러스를 2시간 동안 접촉시켰던 실험군은 33.5%의 세포가 CD19을 발현하고 있는 것으로 나타나, 실시예에 따라 제조된 재조합 바이러스가 발현카세트에 포함된 항원인 CD19의 발현을 종양 세포주에서 효과적으로 유도하였음을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (46)

  1. 세포 표면에 표지되는 항원으로서, 엔지니어링된 면역세포 또는 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원의 발현카세트를 포함하는 종양용해성 바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항원은
    상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 특이적으로 발현되는 항원 또는
    상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원
    인 것인 종양용해성 바이러스.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 항원은 5T4, 알파 5β인테그린, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β카테닌/m, Bcr-abl, MN/CIX 항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CD4, CD7, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44 variant domain 6, CD123, CD135, CD138, CD269, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLEC12A, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT(또는 hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MART-2/Ski, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, natural killer group 2D, Lewis Y antigen, PAP, 프로테이나제-3, p190 마이너 bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1, SART-3, 서바이빈, TEL/AML1, TGFβTPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT1, NY-Eso-1 및 NY-Eso-B 중에서 선택되는 것이고 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 특이적으로 발현되는 항원인 종양용해성 바이러스.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 항원은 5T4, 알파 5β인테그린, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β카테닌/m, Bcr-abl, MN/CIX 항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CD4, CD7, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44 variant domain 6, CD123, CD135, CD138, CD269, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLEC12A, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT(또는 hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MART-2/Ski, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, natural killer group 2D, Lewis Y antigen, PAP, 프로테이나제-3, p190 마이너 bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1, SART-3, 서바이빈, TEL/AML1, TGFβTPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT1, NY-Eso-1 및 NY-Eso-B 중에서 선택되는 것이고 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원인 종양용해성 바이러스.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원은 바이러스를 투여하고자 하는 대상과 다른 종 또는 바이러스로부터 유래된 펩타이드, 또는 펩타이드신규에피토프(peptide neo epitope, PNE)를 포함하는 것인 종양용해성 바이러스.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원은 투여하는 바이러스 유래 당단백질 또는 막단백질을 포함하는 것인 종양용해성 바이러스.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 종양은 고형암이고, 상기 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD138 및 CD269 중에서 선택되는 것인 종양용해성 바이러스.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항원은
    막단백질 또는
    주조직적합성복합체(MHC)에 의해 제시된 펩타이드
    형태로 세포막 상에 표지되는 것인 종양용해성 바이러스.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 종양용해성 바이러스는 레오바이러스, 세네카밸리바이러스, 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병바이러스, 헤르페스심플렉스바이러스, 홍역바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자바이러스, 신드비스바이러스, 폭스바이러스, 콕사키바이러스, 횡문근바이러스, 파보바이러스, 셈리키포레스트바이러스 및 아데노바이러스 중 어느 하나에 속하는 종양용해성 바이러스.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 종양용해성 바이러스는 백시니아바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스 중에서 선택되는 것인 종양용해성 바이러스.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 백시니아바이러스는 Lister, Wyeth, Copenhagen 및 Western reserve 주 중에서 선택되는 것인 종양용해성 바이러스.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 종양용해성 바이러스는 하나 이상의 유전자가 녹아웃되거나 삽입되어 항종양성이 향상된 것인 종양용해성 바이러스.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 녹아웃된 유전자는 티미딘 키나제, 백시니아 성장인자, E3L, K3L, B18R, B8R, E1B55K, E1ACR2, E3gp19K, E1B19K, ICP6, ICP0, ICP34.5 및 ICP47 중에서 하나 이상 선택되는 것인 종양용해성 바이러스.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 삽입된 유전자는 사이토카인, 케모카인, 면역세포 공자극단백질, 면역관문저해제 및 세포외기질조절단백질을 코딩하는 유전자 중에서 하나 이상 선택되는 것인 종양용해성 바이러스.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 삽입된 유전자는
    항체, 항원결합단편 및 저해성 핵산 중에서 선택되는 것이고,
    상기 항체, 항원결합단편 및 저해성 핵산은 상기 종양 세포 상의 억제성 면역관문리간드를 억제하거나 상기 면역세포 상의 억제성 면역관문수용체를 저해하는 것인 종양용해성 바이러스.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 종양은 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골암, 난소암, 뇌종양, 대장암, 두경부암, 방광암, 상피암, 선암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 육종, 자궁경부암, 자궁암, 전립선암, 중피종, 직장암, 췌장암, 폐암, 피부암 및 흑색종을 포함하는 것인 종양용해성 바이러스.
  17. 제1항에 따른 종양용해성 바이러스를 포함하는 암의 병용 치료용 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 암의 병용 치료용 조성물은
    암환자에게 엔지니어링된 면역세포를 투여하기 전에 투여하는 것을 특징으로 하는 암의 병용 치료용 조성물.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 암의 병용 치료용 조성물은
    107 내지 1011 pfu의 상기 종양용해성 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 병용 치료용 조성물.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 암의 병용 치료용 조성물은
    비경구투여용으로 조성된 것을 특징으로 하는 암의 병용 치료용 조성물.
  21. 종양용해성 바이러스에 의해 도입되어 종양 세포의 표면에 표지된 항원을 특이적으로 인식하도록 엔지니어링된 면역세포.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 엔지니어링된 면역세포는 상기 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor) 또는 단일클론 T세포 수용체(monoclonal T cell receptor)를 포함하는 것인 엔지니어링된 면역세포.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 면역세포는 T세포 또는 NK세포 중에서 선택되는 것인 엔지니어링된 면역세포.
  24. 제21항에 있어서,
    상기 항원은
    상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 특이적으로 발현되는 항원 또는
    상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원
    인 것인 엔지니어링된 면역세포.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 항원은 5T4, 알파 5β인테그린, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β카테닌/m, Bcr-abl, MN/CIX 항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CD4, CD7, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44 variant domain 6, CD123, CD135, CD138, CD269, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLEC12A, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT(또는 hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MART-2/Ski, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, natural killer group 2D, Lewis Y antigen, PAP, 프로테이나제-3, p190 마이너 bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1, SART-3, 서바이빈, TEL/AML1, TGFβTPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT1, NY-Eso-1 및 NY-Eso-B 중에서 선택되는 것이고 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 특이적으로 발현되는 항원인 엔지니어링된 면역세포.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 항원은 5T4, 알파 5β인테그린, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β카테닌/m, Bcr-abl, MN/CIX 항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CD4, CD7, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44 variant domain 6, CD123, CD135, CD138, CD269, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLEC12A, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT(또는 hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MART-2/Ski, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, natural killer group 2D, Lewis Y antigen, PAP, 프로테이나제-3, p190 마이너 bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1, SART-3, 서바이빈, TEL/AML1, TGFβTPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT1, NY-Eso-1 및 NY-Eso-B 중에서 선택되는 것이고 상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원인 엔지니어링된 면역세포.
  27. 제24항에 있어서,
    상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원은 바이러스를 투여하고자 하는 대상과 다른 종 또는 바이러스로부터 유래된 펩타이드, 또는 펩타이드신규에피토프(peptide neo epitope, PNE)를 포함하는 것인 엔지니어링된 면역세포.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 바이러스를 투여하고자 하는 대상의 종양 세포 상에서 발현되지 않는 항원은 투여하는 바이러스 유래 당단백질 또는 막단백질을 포함하는 것인 엔지니어링된 면역세포.
  29. 제24항에 있어서,
    상기 종양은 고형암이고, 상기 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD138 및 CD269 중에서 선택되는 것인 엔지니어링된 면역세포.
  30. 제21항에 있어서,
    상기 항원은
    막단백질 또는
    주조직적합성복합체(MHC)에 의해 제시되는 단백질
    인 것인 엔지니어링된 면역세포.
  31. 제21항에 있어서,
    상기 종양용해성 바이러스는 레오바이러스, 세네카밸리바이러스, 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병바이러스, 헤르페스심플렉스바이러스, 홍역바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자바이러스, 신드비스바이러스, 폭스바이러스, 콕사키바이러스, 횡문근바이러스, 파보바이러스, 셈리키포레스트바이러스 및 아데노바이러스 중 어느 하나에 속하는 엔지니어링된 면역세포.
  32. 제21항에 있어서,
    상기 종양용해성 바이러스는 백시니아바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스 중에서 선택되는 것인 엔지니어링된 면역세포.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 백시니아바이러스는 Lister, Wyeth, Copenhagen 및 Western reserve 주 중에서 선택되는 것인 엔지니어링된 면역세포.
  34. 제21항에 있어서,
    상기 종양용해성 바이러스는 하나 이상의 유전자가 녹아웃되거나 삽입되어 항종양성이 향상된 것인 엔지니어링된 면역세포.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 녹아웃된 유전자는 티미딘 키나제, 백시니아 성장인자, E3L, K3L, B18R, B8R, E1B55K, E1ACR2, E3gp19K, E1B19K, ICP6, ICP0, ICP34.5 및 ICP47 중에서 하나 이상 선택되는 것인 엔지니어링된 면역세포.
  36. 제34항에 있어서,
    상기 삽입된 유전자는 사이토카인, 케모카인, 면역세포 공자극단백질, 면역관문저해제 및 세포외기질조절단백질을 코딩하는 유전자 중에서 하나 이상 선택되는 것인 엔지니어링된 면역세포
  37. 제34항에 있어서,
    상기 삽입된 유전자는
    항체, 항원결합단편 및 저해성 핵산 중에서 선택되는 것이고,
    상기 항체, 항원결합단편 및 저해성 핵산은 상기 종양 세포 상의 억제성 면역관문리간드를 억제하거나 상기 면역세포 상의 억제성 면역관문수용체를 저해하는 것인 엔지니어링된 면역세포.
  38. 제21항에 있어서,
    상기 종양은 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골암, 난소암, 뇌종양, 대장암, 두경부암, 방광암, 상피암, 선암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 육종, 자궁경부암, 자궁암, 전립선암, 중피종, 직장암, 췌장암, 폐암, 피부암 및 흑색종을 포함하는 것인 엔지니어링된 면역세포.
  39. 제21항에 따른
    엔지니어링된 면역세포를 포함하는 암의 병용 치료용 조성물.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 암의 병용 치료용 조성물은
    106 내지 1012 개의 엔지니어링된 면역세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 병용 치료용 조성물.
  41. 제39항에 있어서,
    상기 암의 병용 치료용 조성물은
    비경구투여용으로 조성된 것을 특징으로 하는 암의 병용 치료용 조성물.
  42. 세포 표면에 표지되는 항원의 발현카세트를 포함하는 종양용해성 바이러스를 투여하는 단계; 및
    상기 투여 후에 상기 항원을 특이적으로 인식하는 엔지니어링된 면역세포를 투여하는 단계
    를 포함하는 암의 병용 치료방법.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 엔지니어링된 면역세포를 투여하는 단계는 상기 항원이 종양 세포에 발현된 이후에 수행되는 것인 암의 병용 치료방법.
  44. 제42항에 있어서,
    상기 엔지니어링된 면역세포를 투여하는 단계는 상기 종양용해성 바이러스를 투여 후 1시간 내지 100일 이후에 수행되는 것인 암의 병용 치료방법.
  45. 제42항에 있어서,
    상기 종양용해성 바이러스는
    정맥, 근육, 복강 또는 종양 내로 투여하는 것인 암의 병용 치료방법.
  46. 제42항에 있어서,
    상기 엔지니어링된 면역세포는
    정맥 내로 투여하는 것인 암의 병용 치료방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US11530422B2 (en) 2021-03-25 2022-12-20 Libentech Co., Ltd. Oncolytic virus for treating brain tumors using recombinant Newcastle disease virus into which Newcastle disease virus vector-based PTEN gene is inserted and composition for treating brain tumors using same
CN117660368A (zh) * 2023-08-28 2024-03-08 昆明理工大学 表达趋化因子ccl19的重组溶瘤流感病毒及应用

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