KR20190096969A - 면역계를 조절하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

면역계를 조절하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20190096969A
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leu
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KR1020197014105A
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킴벌리 에이. 누난
에릭 알. 루츠
이반 보렐로
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윈드밀 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본원에 제공된 실시양태는 대상체의 면역계를 조절하고, 예컨대, 암을 치료하는 데 사용될 수 있는 키메라 단백질과 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

면역계를 조절하기 위한 조성물 및 방법
본 출원은 2016년 12월 22일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/438106호를 우선권으로 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 원용된다.
암을 치료하기 위하여 면역계를 조작하는 많은 조성물 및 방법이 있다. 그러나, 암을 치료하기 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 본원에 개시된 청구 대상은 이러한 요구 및 당업자에게 자명할 수 있는 다른 요구들을 충족시킨다.
요약
본원에 개시된 실시양태는 PD-1의 세포외 도메인; 4-1BB 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, CD27 막관통 도메인, 및 ICOS 막관통 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 막관통 도메인; 및 4-1BB 세포내 시그널링(signaling) 도메인, CD28 세포내 시그널링 도메인, CD27 세포내 시그널링 도메인, 및 ICOS 세포내 시그널링 도메인, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 단백질을 제공한다.
본원에 개시된 실시양태는 또한, 본원에서 제공된 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단백질 또는 핵산 분자를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 재조합 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 면역 반응을 증가시키거나 신생물을 치료하기 위한 실시양태를 제공한다.
본원에 사용된 용어, 예컨대, 단수형은 문맥 상 분명하게 달리 요구하지 않는 한 단수 및 복수 대상을 포함한다.
본원에 사용된 용어, "포함하다", "갖는다(복수형)", "갖는다(단수형)", 및 "포함하다", 및 본원에 사용된 이들의 동사 활용은 "포함하나 이에 제한되지 않는다"를 의미한다. 다양한 조성물 및 방법은 다양한 구성 요소 또는 단계를 ("포함하나 이에 제한되지 않는"을 의미하는 것으로 해석되는) "포함하는"의 용어로 기재하는 반면에, 조성물, 방법, 및 장치는 또한, 다양한 구성 요소 및 단계로 "본질적으로 구성될" 또는 "구성될" 수 있으며, 이러한 용어들은 본질적으로 폐쇄형 요소 그룹(closed-member groups)을 정의하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에서 사용된 용어, "치료하다", "치료된", 또는 "치료하는"은, 목표가 원치 않는 생리학적 병태, 질병 또는 질환을 감속(감소)시키는 것 또는 유익한 또는 원하는 임상 결과를 얻는 것인 치료적 처치를 의미한다. 본원에 기재된 실시양태의 목적을 위해, 유익한 또는 원하는 임상 결과는 징후의 완화; 병태, 질병 또는 질환의 정도의 감소; 병태, 질병 또는 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않은) 상태; 병태, 질병 또는 질환 진행의 개시의 지연 또는 둔화; 검출가능여부에 관계없이, 병태, 질병 또는 질환 상태의 호전 또는 (부분적 또는 전체적에 관계없이) 병의 차도; 환자에 의해 반드시 인식될 수 있는 것이 아닌, 하나 이상의 측정가능한 물리적 매개변수의 호전; 또는 병태, 질병 또는 질환의 향상 또는 개선을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, "암의 치료" 또는 "암을 치료하는"은 암 또는 본원에 기재된 임의의 다른 병태와 연관된 1차 현상 또는 2차 징후 중 어느 하나를 완화시키거나 호전시키는 활성을 의미한다. 일부 실시양태에서, 치료받고 있는 암은 본원에 언급된 암 중 하나이다.
본원에 사용된 용어, "자가 유래(autologous)"는 나중에 개체 내로 재도입되는 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭하는 데 사용될 수 있다.
"동종이계(allogeneic)"는 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
"이종(xenogeneic)"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "암"은 비정상 세포의 빠르고 조절되지 않는 성장으로 특징지어지는 질환으로서 정의된다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 퍼질 수 있다. 다양한 암의 예로는 유방암, 전립선암, 난소 암, 자궁 경부암, 피부암, 췌장암, 결장 직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 다발성 골수종, 폐암 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 암의 예로는 또한, 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이나 림프 악성종양을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 더 많은 예로는 신장암이나 콩팥암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장 직장암, 소세포 폐암과 비소세포 폐암과 폐의 선암과 폐의 편평상피암을 비롯한 폐암, 편평세포암(예컨대, 편평상피세포암), 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 간암, 방광암, 복막암, 간세포암, 위장관암을 비롯한 위암, 위장관 간질 종양(GIST), 췌장암, 두경부암, 교모세포종, 망막모세포종, 성상세포종, 난포막종, 남성모세포종, 간세포암, 비호지킨 림프종(non-Hodgkins lymphoma, NHL)과 다발성 골수종과 급성 혈액학적 악성종양을 비롯한 혈액학적 악성종양, 자궁 내막 또는 자궁 암종, 자궁 내막증, 섬유육종, 융모막암종, 침샘암종, 외음부암, 갑상선암, 식도암종, 간암종, 항문암종, 음경암종, 비인두암종, 후두암종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 흑색종, 피부암종, 신경초종, 핍지교종, 신경모세포종, 횡문근육종, 골원성 육종, 평활근육종, 요로암종, 갑상선암종, 빌름스종양(Wilm's tumor) 뿐만 아니라, B 세포 림프종(저 등급(low grade)/여포성 비호지킨 림프종(NHL); 소림프구성(SL) NHL; 중 등급(intermediate grade)/여포성 NHL; 중 등급 미만성 NHL; 고 등급(high grade) 면역모세포성 NHL; 고 등급 림프모구성 NHL; 고 등급 소 비분할세포 NHL; 벌키(bulky) 질환 NHL; 외투세포(mantle cell) 림프종; 에이즈(AIDS) 관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia)을 포함함); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프모구성 백혈병(ALL); 털세포(Hairy cell) 백혈병, 만성 골수모구성 백혈병; 및 장기이식 후 림프 증식성 질병(post-transplant lymphoproliferative disorder, PTLD) 뿐만 아니라, 달리 분류되지 않은 모반증(phakomatoses), (예컨대, 뇌종양과 연관된) 부종 및 메이그스 증후군(Meigs' syndrome)과 연관된 비정상적인 혈관 증식을 포함한다. 본원에 사용된 "종양"은 악성 또는 양성에 관계없이 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 특정 생물학적 결과를 달성하는 데 효과적인, 본원에 기재된 화합물, 제형, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 결과는 당업계에서 적합한 임의의 수단에 의해 측정된 바와 같이 바이러스 감염의 억제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
"발현 벡터"는 발현되는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함할 수 있고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관 내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 당업계에 공지된 모든 것, 예컨대, 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하는 코스미드, (예컨대, 노출된(naked) 또는 리포솜에 함유된) 플라스미드 및 바이러스(예컨대, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스)를 포함한다.
달리 명시하지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축중(縮重, degenerate) 형태인 것 및 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 것인 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 또한, 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 형태에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로, 인트론을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 인트론을 함유하지 않고 코딩 서열만을 함유한다.
본원에 사용된 "렌티바이러스"는 레트로바이러스과(Retroviridae family)의 속명(genus)을 지칭한다. 렌티바이러스는 비분열세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서도 특이하며; 이들은 상당량의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA내로 전달할 수 있어서, 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV, 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 생체 내에서 상당 수준의 유전자 이동을 달성할 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 이종 핵산 서열의 발현을 야기하는, 조절 서열과 이종 핵산 서열 간의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 놓이는 경우, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 주는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하며, 필요하다면 동일한 리딩 프레임(reading frame)에서 2개의 단백질 코딩 영역을 결합시킨다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 쇄로서 정의된다. 또한, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본원에 사용된 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호교환 가능하다. 당업자는, 핵산이 단량체 "뉴클레오티드"로 가수 분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드라는 일반적인 지식을 갖고 있다. 단량체 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본원에 사용된 폴리뉴클레오티드는 비-제한적으로 재조합 수단, 즉, 통상적인 클로닝 기술 및 PCRTM 등을 사용하여 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터의 핵산 서열의 클로닝을 포함하는 당업계에서 이용 가능한 임의의 수단에 의해, 및 합성 수단에 의해 수득된 모든 핵산 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환 가능하며, 펩티드 결합에 의해 공유 결합으로 연결된 아미노산 잔기로 구성되는 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 2개 이상의 아미노산을 함유하여야만 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 갯수에 대한 어떠한 제한도 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 이 용어는 또한, 당업계에서 흔히, 예를 들어, 펩티드, 올리고펩티드, 및 올리고머로서 지칭되는 단쇄, 및 당업계에서 일반적으로 많은 유형으로 존재하는 단백질로서 지칭되는 장쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는 예를 들어, 그 중에서도 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동의 폴리펩티드, 올리고펩티드, 호모다이머, 헤테로다이머, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적인 전사를 개시하는 데 필요한, 세포의 합성 기작 또는 도입된 합성 기작에 의해 인식되는 DNA 서열로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 산물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 경우에, 이 서열은 핵심 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우에, 이 서열은 또한, 유전자 산물의 발현에 필요한 인핸서(inhancer) 서열 및 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은, 예를 들어, 조직 특이적 방법으로 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.
"항시발현(constitutive)" 프로모터는, 유전자 산물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우, 세포의 대부분 또는 모든 생리적 조건 하에서 세포에서 유전자 산물이 생산되도록 유발하는, 뉴클레오티드 서열이다.
"유도성(inducible)" 프로모터는, 유전자 산물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우, 프로모터에 상응하는 유도인자(inducer)가 세포에 존재하는 경우에만, 세포에서 유전자 산물이 실질적으로 생산되도록 유발하는, 뉴클레오티드 서열이다.
"조직 특이적(tissue-specific)" 프로모터는, 유전자에 의해 코딩 또는 특정된 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우, 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만, 세포에서 유전자 산물이 실질적으로 생산되도록 유발하는, 뉴클레오티드 서열이다.
본원에서 사용된 "실질적으로 정제된" 세포는 본질적으로 다른 세포 유형이 없는 세포이다. 실질적으로 정제된 세포는 또한, 이의 자연 발생 상태에서 정상적으로 회합되어 있는 다른 세포 유형으로부터 분리되어 있는 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 세포의 균질 집단을 의미한다. 다른 경우에, 이 용어는 단순히 이들의 자연 상태에서 자연적으로 회합되어 있는 세포로부터 분리되어 있는 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관 내에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 세포는 시험관 내에서 배양되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "형질주입된(transfected)" 또는 "형질전환된(transformed)" 또는 "형질도입된(transduced)"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 이동 또는 도입되는 과정을 지칭한다. "형질주입된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질주입, 형질전환 또는 형질도입된 것이다. 세포는 1차 대상체 세포와 이의 자손을 포함한다.
본원에 사용된 어구 "전사 조절 하에서" 또는 "작동 가능하게 연결된"은, RNA 중합효소에 의한 전사의 개시 및 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하기 위해, 프로모터가 폴리뉴클레오티드에 대해 정확한 위치 및 배향에 있다는 것을 의미한다.
"벡터"는, 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물(composition of matter)이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하는 많은 벡터가 당업계에 공지되어 있지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 용어 "벡터"는 자가-복제형 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 세포로의 핵산의 이동을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예컨대, 폴리리신 화합물, 리포좀 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예로는, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
범위: 본 명세서 전체에 걸쳐, 다양한 실시양태가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 표현은 편의성 및 간략화를 위한 것일 뿐이며 본 발명의 범주에 대한 융통성 없는 제한으로서 해석되지 않아야 함을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 표현은 가능한 모든 부분 범위 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적인 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 표현은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적인 숫자, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6과 같은 부분 범위를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
종양 면역학의 주요 장애는 많은 세포 기반 접근법의 내재적 항암 효능을 제한하는 종양 특이적 내성의 유도이다. 최근 연구들은 전이성 흑색종에 대한 항-CTLA-4 및 항-PD-1의 승인을 이끌어내는 체크포인트 억제제를 대상으로 함으로써 유의한 임상적 효능을 보여왔다. 일부 양태에서, 실시양태는 면역계의 불활성화를 방지할 수 있는 단백질의 도메인을 발현하는 세포외 도메인, 및 활성화된 세포내 도메인을 포함하는, 키메라 수용체에 관한 것이다. 이는 내성-유발(tolerogenic) 메커니즘을 활성화 시그널(signal)로 하이잭킹(hijack)하는 이점을 갖는다. 이 접근법은, T 세포 아네르기가 질병의 발병기전의 주요 양태이고, 항원 특이성이 내인성 T 세포 레퍼토리에 의해 제공되는 모든 임상 상황에서 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 실시양태는 억제성 수용체의 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메라 막관통 단백질에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 도메인은 면역 반응을 활성화시킬 수 있다. 세포내 시그널링 도메인은 세포내 시그널링 단백질의 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 세포, 예컨대, T 세포의 활성화를 유지하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 시그널을 세포내 시그널링 도메인에 전달할 수 있다. 예를 들어, 세포외 도메인은 천연(native) 억제성 수용체의 작용제와 결합할 때 시그널을 세포내 시그널링 도메인에 전달할 수 있다.
시그널 전달(signal transduction)은 단백질의 올리고머화를 포함할 수 있다. 올리고머화는 호모-올리고머화 또는 헤테로-올리고머화를 포함할 수 있다. 올리고머화는 단백질의 이량체화, 즉, 제2 키메라 막관통 단백질을 사용한 호모-이량체화 또는 상이한 단백질을 사용한 헤테로-이량체화를 포함할 수 있다.
시그널 전달은 인산화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포내 시그널링 도메인은 키나아제 활성 및/또는 인산화 부위를 포함할 수 있다. 시그널 전달은 자가인산화, 예컨대, 세포내 시그널링 도메인의 자가인산화를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, "스위치 수용체"로서 지칭될 수 있는 수용체는 또한, 본원에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용체는 본원에 기재된 핵산 서열로 코딩된다.
일부 실시양태에서, 수용체는 CD8 리더 펩티드, PD-1 세포외 도메인, 4-1BB 막관통 도메인, 및 4-1BB 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리더 펩티드는 세포에서 단백질의 가공과정 동안에 절단되어, PD-1 세포외 도메인, 4-1BB 막관통 도메인, 및 4-1BB 세포내 도메인을 포함하는 수용체를 남긴다. 일부 실시양태에서, 도메인은 본원 및 하기에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 수용체는 CD8 리더 펩티드, PD-1 세포외 도메인, CD28 막관통 도메인, 및 CD28 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리더 펩티드는 세포에서 단백질의 가공과정 동안에 절단되어, PD-1 세포외 도메인, CD28 막관통 도메인, 및 CD28 세포내 도메인을 포함하는 수용체를 남긴다. 일부 실시양태에서, 도메인은 본원 및 하기에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 수용체는 CD8 리더 펩티드, PD-1 세포외 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 세포내 도메인, 및 4-1BB 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리더 펩티드는 세포에서 단백질의 가공과정 동안에 절단되어, PD-1 세포외 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 세포내 도메인, 및 4-1BB 세포내 도메인을 포함하는 수용체를 남긴다. 일부 실시양태에서, 도메인은 본원 및 하기에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 수용체는 CD8 리더 펩티드, PD-1 세포외 도메인, CD27 막관통 도메인, 및 CD27 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리더 펩티드는 세포에서 단백질의 가공과정 동안에 절단되어, PD-1 세포외 도메인, CD27 막관통 도메인, 및 CD27 세포내 도메인을 포함하는 수용체를 남긴다. 일부 실시양태에서, 도메인은 본원 및 하기에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 수용체는 CD8 리더 펩티드, PD-1 세포외 도메인, CD27 막관통 도메인, CD27 세포내 도메인, 및 4-1BB 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리더 펩티드는 세포에서 단백질의 가공과정 동안에 절단되어, PD-1 세포외 도메인, CD27 막관통 도메인, CD27 세포내 도메인, 및 4-1BB 세포내 도메인을 포함하는 수용체를 남긴다. 일부 실시양태에서, 도메인은 본원 및 하기에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 수용체는 CD8 리더 펩티드, PD-1 세포외 도메인, ICOS 막관통 도메인, 및 ICOS 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리더 펩티드는 세포에서 단백질의 가공과정 동안에 절단되어, PD-1 세포외 도메인, ICOS 막관통 도메인, 및 ICOS 세포내 도메인을 포함하는 수용체를 남긴다. 일부 실시양태에서, 도메인은 본원 및 하기에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 억제성 수용체의 세포외 도메인이다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 리간드 결합 도메인, 예컨대, 억제성 수용체의 작용제-결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 리간드 결합에 반응하여 막을 가로질러 시그널을 전달하기에 충분한 구조를 포함한다. 임의의 특정 이론에 구애됨 없이, 다가(multivalent) 리간드에 의해 매개되는 올리고머화에 의해 시그널을 전달하는 억제성 수용체의 경우, 리간드-결합 도메인의 존재만으로도 리간드 결합에 반응하여 막을 가로질러 시그널을 전달하기에 충분한 구조일 수 있다. 임의의 특정 이론에 구애됨 없이, 세포막에 대한 막관통 도메인의 배향을 변화시킴으로써 시그널을 전달하는 억제성 수용체의 경우, 세포외 도메인은 리간드 결합에 반응하여 막을 가로질러 시그널을 전달하기 위하여 리간드-결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 천연 구조가 필요할 수 있다. 예를 들어, 세포외 도메인은, 리간드-결합 도메인으로부터 막관통 도메인까지의 억제성 수용체의 천연 서열을 포함할 수 있다.
천연 억제성 수용체는 인간 억제성 수용체 또는 마우스 억제성 수용체일 수 있다. 따라서, 세포외 도메인은 인간 또는 마우스 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연 억제성 수용체의 유래는 예컨대, 키메라 막관통 단백질에 대한 면역 반응을 피하기 위하여, 치료되는 대상체의 종과 매칭하도록 선택된다. 그럼에도 불구하고, 천연 억제성 수용체는 예컨대, 편의상 상이한 종으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 키메라 단백질은, 단백질이 발현되는 세포 또는 단백질이 투여되는 대상체의 종에 대해 이종 유래될 수도 있고 아닐 수도 있다.
일부 실시양태에서, 천연 억제성 수용체는, 천연 작용제와 결합할 때 면역 활성을 감소시키는 단백질들로부터 선택된다. 예를 들어, 천연 억제성 수용체는 천연 작용제와 결합할 때 T 세포 증식, T 세포 생존, 사이토카인 분비, 또는 면역 세포용해 활성을 감소시킬 수 있다. 천연 억제성 수용체는 림프구 억제성 수용체일 수 있다(즉, 억제성 수용체가 림프구, 예컨대, T 세포에서 발현될 수 있다). 예를 들어, 천연 억제성 수용체가 T 세포에서 발현될 수 있고, 천연 억제성 수용체와 작용제의 결합은 T 세포 증식, T 세포 생존, 사이토카인 분비, 또는 면역 세포용해 활성을 불리하게 하는 세포 시그널링을 유발할 수 있다.
일부 실시양태에서, 천연 억제성 수용체는 CTLA-4(세포독성 T-림프구 연관 단백질 4; CD 152), PD-1(세포예정사 단백질 1(Programmed cell death protein 1); CD279), LAG-3(림프구-활성화 유전자 3; CD223), 또는 Tim-3(T 세포 면역글로불린 뮤신-3)일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 CTLA-4, PD-1, LAG-3, 또는 Tim-3으로부터의 세포외 도메인일 수 있다. 억제성 수용체는 PD-1일 수 있다. 일부 실시양태에서, 막관통 단백질은 PD-1의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인의 서열은 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 도메인은 세포내 시그널링 단백질의 시그널링 도메인이다. 일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 도메인은 키나아제 활성 또는 인산화 부위를 포함할 수 있다. 세포내 시그널링 도메인은, 일부 실시양태에서, 예컨대, 세포막을 가로질러 시그널 전달한 다음에, 시그널링 분자, 예컨대, 키나아제 또는 포스포릴라아제를 활성화시킬 수 있다. 세포내 시그널링 도메인은 다운스트림(downstream) 키나아제 또는 포스포릴라아제를 통해 시그널을 보낼 수 있다.
세포내 시그널링 단백질은 인간 단백질 또는 마우스 단백질일 수 있다. 따라서, 세포내 시그널링 도메인은 인간 또는 마우스 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 단백질은, 대상체와, 치료를 위해 사용되는 세포의 종들을 매칭하도록 선택하여, 예컨대, 시그널링 도메인이 세포의 사이토졸의 기작을 이용하여, 다운스트림 시그널링 분자를 활성화할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 세포내 시그널링 단백질은 예컨대, 편의상, 상기 기재한 바와 같은 상이한 종으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 단백질은 면역 활성을 증가시킨다. 따라서, 키메라 막관통 단백질을 통한 시그널 전달은 면역 활성을 증가시키는 시그널 캐스케이드(cascade)를 야기할 수 있되, 여기서 세포내 시그널링 도메인은 세포내 시그널링 캐스케이드를 매개한다. 일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 단백질은 T 세포 증식, T 세포 생존, 사이토카인 분비, 또는 면역 세포용해 활성을 향상시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 단백질은 막관통 단백질이거나, 세포내 시그널링 단백질은 천연 막관통 단백질을 결합할 수 있다. 세포내 시그널링 단백질은 림프구 단백질일 수 있다(즉, 세포내 시그널링 단백질은 림프구, 예컨대, T 세포에서 발현될 수 있다).
일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 단백질은 CD3ζ(T 세포 표면 당단백질 CD3 제타 쇄; CD247), 4-1BB(종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(superfamily) 부재 9; CD137), 또는 CD28(T 세포 특이적 표면 당단백질 CD28; Tp44)이다. 따라서, 세포내 시그널링 단백질은 CD3ζ, 4-1BB, 또는 CD28로부터의 시그널링 도메인을 포함할 수 있다. 세포내 시그널링 단백질은 4-1BB일 수 있다. 따라서, 세포내 시그널링 단백질은 4-1BB의 시그널링 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 본원에 기재된 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 막관통 단백질은 자살 도메인, 즉 상기 단백질을 포함하는 재조합 세포를 사멸시키기 위한 자살 도메인을 포함한다. 자살 도메인은 티미딘 키나아제 활성 또는 카스파제 활성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 자살 도메인은 티미딘 키나아제 또는 카스파제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 자살 도메인은 HSV 티미딘 키나아제("HSV-TK")의 티미딘 키나아제 도메인이거나, 자살 도메인은 카스파제 9의 일부를 포함한다.
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 스위치 수용체는 하기 표에서 제공된 서열을 포함한다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 실시양태에서, 상기 표에 제공된 수용체는 N-말단 CD8 리더 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리더 서열은 MALPVTALLLPLALLLHAARP(서열번호 1)이다. 수용체가 리더 서열을 포함하는 경우, 이는 표의 서열의 N-말단에 부가될 수 있고 인접 서열을 형성할 수 있다. 예를 들어, 리더 서열은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 코딩될 수 있다. 본원에 제공된 세포내 도메인은 또한, 세포내 시그널링 도메인으로서 지칭될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 수용체는 다음 표에 제공된 서열을 포함한다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
일부 양태에서, 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 키메라 막관통 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산 분자는 프로모터를 포함할 수 있되, 상기 프로모터는 예컨대, 재조합 세포에서의 키메라 막관통 단백질의 발현을 위해, 키메라 막관통 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 항시발현 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 세포 특이적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다.
핵산 분자는 상기 개시된 서열을 포함할 수 있다. 핵산 분자는 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 유전 암호(genetic code)가 축중되었기 때문에, 핵산 서열의 변이는 코딩된 아미노산 서열을 변화시키지 않을 수 있다. 따라서, 축중된 변화가 본 명세서에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는, 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열에서 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 또는 700개 이상의 연속 뉴클레오티드와 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열에서 100개 이상의 연속 뉴클레오티드와 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상동성은 NCBI 웹 사이트에서 기본 설정(default setting)을 사용하여 Blastn 또는 BlastP를 실행시켜, 두 서열을 비교하거나 정렬할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 본원에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 본원에 개시된 아미노산 서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상동성은 단백질 측면에서 동일하거나 유사할 수 있다. 상동성은 기본 설정을 사용하여 Expasy, BLASTp, Clustal 등과 같은 일상적인 도구(tool)를 사용함으로써 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 키메라 막관통 단백질은 본원 및 상기 개시된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 막관통 단백질은 본원에 개시된 아미노산 서열 중 하나와 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 아미노산 서열의 변이체는 다양한 실시양태에 포함될 수 있다. 용어 "변이체"는 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하여, 하나 이상의(예컨대, 1, 2, 3, 4개 등) 아미노산 치환, 결실 및/또는 도입이 존재하는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭하며, 상기 용어는 단백질 또는 폴리펩티드의 자연-발생 대립유전자의 변이체 및 선택적 스플라이싱 변이체(alternative splicing variant)를 포함한다. 용어 "변이체"는 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을, 유사하거나 상동의 아미노산(들) 또는 유사하지 않는 아미노산(들)로 대체하는 것을 포함한다. 일부 변이체는 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 위치에서 알라닌 치환을 포함한다. 다른 치환은 단백질의 전체 순 전하, 극성 또는 소수성에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 보존적 치환을 포함한다. 보존적 치환은 키메라 막관통 단백질의 기능에 유의하지 않는 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 기능은, 림프구, 예컨대, 골수 침윤성 림프구(MIL)에서 발현되는 경우, 단백질의 특이성일 수 있다. 당업자는, 본원에 제공된 서열과 비교함으로써, 치환이 키메라 막관통 단백질의 기능에 영향을 주는지 여부를 결정할 수 있다. 비-제한적인 예시적 보존적 치환이 하기 표에 개시되어 있다. 일부 실시양태에 따르면, 키메라 막관통 단백질은 본원에 기재된 아미노산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는다.
보존적 아미노산 치환
Figure pct00008
하기 표는 보존적 아미노산 치환의 또다른 분류표를 제시한다.
Figure pct00009
따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 아미노산 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기는 보존적 치환으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 단지 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 잔기만이 보존적 치환으로 치환된다.
일부 실시양태에서, 키메라 막관통 단백질은 본원에 기재된 서열(서열번호 1 내지 44) 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단백질이 CD8의 리더 서열(서열 번호 1)을 포함하는 경우, 이는 또다른 시그널 펩티드 또는 리더 서열로 대체되어, 키메라 막관통 단백질을 세포외 막에 트래피킹(trafficking)하는 것을 도울 수 있다.
일부 양태에서, 실시양태는 본원에 개시된 바와 같은 핵산을 포함하는 재조합 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 키메라 막관통 단백질을 포함하는 재조합 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 본원에 개시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 키메라 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 림프구이다. 세포는 T 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 종양 침윤성 림프구("TIL") 또는 골수 침윤성 림프구("MIL")일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키메라 막관통 단백질을 포함하는 세포는, 대상체에 투여되는 경우, 키메라 막관통 단백질이 없는 세포와 비교하여 대상체에서 더 오래 지속된다.
일부 양태에서, 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자로 세포를 형질주입시키는 것을 포함하는, 재조합 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자로 세포를 형질주입시키는 것을 포함하는, 재조합 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 핵산 분자는 플라스미드일 수 있다. 세포는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드에 의해 형질주입될 수 있다. 세포는 또한, 핵산 분자를 포함하는 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로 감염될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노 연관 바이러스("AAV")이다. 일부 실시양태에서, 세포는 TIL 또는 MIL이다. 일부 실시양태에서, MIL은 활성화된 MIL이다. MIL은, 예를 들어, 이들을 항-CD3/항-CD28 비드 및 적절한 사이토카인과 함께, 예컨대, 저산소 조건 하에서 항온처리함으로써 활성화될 수 있다. 저산소 조건 하에서 MIL을 성장시키는 것의 예는, 예를 들어, 그 전체가 참고로 본원에 원용되는 WO2016037054에서 찾을 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는, 세포를 본원에 기재된 바와 같은 저산소 환경에서 항온처리한 후에, 세포 내로 형질주입된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는, 세포를 저산소 환경에서 약 1, 2, 3, 4, 또는 5일 동안 항온처리한 후에, 세포 내로 형질주입된다. 일부 실시양태에서, 이 후, 세포를 정상 산소 조건 하에서 약 1, 2, 3, 4, 또는 5일 동안 항온처리한다.
일부 실시양태에서, 키메라 막관통 단백질을 포함하는 MIL은, 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 WO2016037054에 기재된 방법에 따라 제조된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체로부터의 골수, 림프구 및/또는 골수 침윤성 림프구("MIL")에서 세포를 제거하는 것; 세포를 저산소 환경에서 항온처리하여, 활성화된 MIL을 생산하는 것; 및 활성화된 MIL을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 세포는 또한, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD3/항-CD28 항체 및 사이토카인의 존재 하에서 활성화될 수 있다. 키메라 막관통 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 예컨대, 본원에 기재된 것 중 하나는, MIL을 저산소 환경에서 항온처리하기 전 또는 후에 세포 내로 형질주입되거나 감염될 수 있다.
저산소 환경은 약 21% 미만의 산소, 예컨대, 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% 미만, 또는 약 3% 미만의 산소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 저산소 환경은 약 0%의 산소 내지 약 20%의 산소, 예컨대, 약 0%의 산소 내지 약 19%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 18%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 17%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 16%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 15%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 14%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 13%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 12%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 11%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 10%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 9%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 8%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 7%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 6%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 5%의 산소, 약 0%의 산소 내지 약 4%의 산소, 또는 약 0%의 산소 내지 약 3%의 산소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저산소 환경은 약 1% 내지 약 7%의 산소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저산소 환경은 약 1% 내지 약 2%의 산소이다. 일부 실시양태에서, 저산소 환경은 약 0.5% 내지 약 1.5%의 산소이다. 일부 실시양태에서, 저산소 환경은 약 0.5% 내지 약 2%의 산소이다. 저산소 환경은 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 약 0%의 산소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저산소 환경은 약 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%의 산소를 포함한다.
MIL을 저산소 환경에서 항온처리하는 것은, 예컨대, 조직 배양 배지에서 MIL을, 약 1시간 이상 동안, 예컨대, 약 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 60시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 이상, 또는 심지어 약 14일 이상 동안 항온처리하는 것을 포함할 수 있다. 항온처리하는 것은 MIL을 약 1시간 내지 약 30일 동안, 예컨대, 약 1일 내지 약 20일, 약 1일 내지 약 14일, 또는 약 1일 내지 약 12일 동안 항온처리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, MIL을 저산소 환경에서 항온처리하는 것은 MIL을 저산소 환경에서 약 2일 내지 약 5일 동안 항온처리하는 것을 포함한다. 상기 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 동안 항온처리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 3일 동안 항온처리하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 2일 내지 약 4일 동안 항온처리하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 3일 내지 약 4일 동안 항온처리하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 예컨대, MIL을 저산소 환경에서 항온처리한 후에, MIL을 정상 산소 환경에서 항온처리하는 것을 추가로 포함한다.
정상 산소 환경은 약 21% 이상의 산소를 포함할 수 있다. 정상 산소 환경은 약 5%의 산소 내지 약 30%의 산소, 예컨대, 약 10%의 산소 내지 약 30%의 산소, 약 15%의 산소 내지 약 25%의 산소, 약 18%의 산소 내지 약 24%의 산소, 약 19%의 산소 내지 약 23%의 산소, 또는 약 20%의 산소 내지 약 22%의 산소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 정상 산소 환경은 약 21%의 산소를 포함한다.
정상 산소 환경에서 MIL을 항온처리하는 것은, 예컨대, 조직 배양 배지에서 약 1시간 이상 동안, 예컨대, 약 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 60시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 이상, 또는 심지어 약 14일 이상 동안 항온처리하는 것을 포함할 수 있다. 항온처리하는 것은 MIL을 약 1시간 내지 약 30일 동안, 예컨대, 약 1일 내지 약 20일, 약 1일 내지 약 14일, 약 1일 내지 약 12일, 또는 약 2일 내지 약 12일 동안 항온처리하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 정상 산소 환경에 놓인 후에, 또는 정상 산소 환경에 놓이기 전에, 본원에 기재된 키메라 막관통 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 형질주입 또는 감염된다.
일부 실시양태에서, MIL은, 대상체로부터 골수 샘플을 추출하고 본원에 기재된 바와 같이 세포를 배양/항온처리함으로써 수득된다. 일부 실시양태에서, 골수 샘플을 원심 분리하여 적혈구를 제거한다. 일부 실시양태에서, 골수 샘플은 혈액성분채집(apheresis)에 적용되지 않는다. 일부 실시양태에서, 골수 샘플은 말초 혈액 림프구("PBL")를 포함하지 않거나, 골수 샘플에는 실질적으로 PBL이 없다. 이러한 방법은 TIL로 알려진 것과 동일하지 않은 세포를 선택한다. 따라서 MIL은 TIL이 아니다. TIL은 당업자에게 공지된 방법에 의해 선택될 수 있고, 본원에 기재된 핵산 분자로 형질주입 또는 감염될 수 있어, TIL이 본원에 기재된 키메라 막관통 단백질을 발현할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 또한, CD3 및 CD28에 대한 항체와 함께 배양함으로써 활성화된다. 이는, 예컨대, 상업적으로 입수가능하거나 당업자에 의해 제조될 수 있는 항-CD3/항-CD28 비드와 함께, 세포를 항온처리함으로써 수행될 수 있다. 이 후, 세포를 플레이트, 플라스크, 또는 백(bag)에 플레이팅할 수 있다. 저산소 조건은 저산소 챔버 또는 세포 배양 백을, 95% 질소 및 5% CO2 가스 혼합물로 3분 동안 플러싱(flushing)함으로써 달성할 수 있다. 이는, 예를 들어, 용기 내에 1 내지 2% 이하의 O2 가스를 야기시킬 수 있다. 이후에, 세포를 본원에 기재된 바와 같이 또는 본원에 참고로 원용되는 WO2016037054의 실시예에서와 같이 배양할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 막관통 단백질을 포함하는 저산소 MIL이 제공된다. 일부 실시양태에서, 저산소 MIL은 약 0.5% 내지 약 5%의 산소 가스의 환경에 있다. 일부 실시양태에서, 저산소 MIL은 약 1% 내지 약 2%의 산소 가스의 환경에 있다. 일부 실시양태에서, 저산소 MIL은 약 1% 내지 약 3%의 산소 가스의 환경에 있다. 일부 실시양태에서, 저산소 MIL은 약 1% 내지 약 4%의 산소 가스의 환경에 있다. 저산소 MIL은 본원에 기재된 것과 같이, 저산소 환경에서, 본원에 기재된 것과 같은 일정 기간 동안 항온처리된 MIL이다. 임의의 특정 이론에 구애됨 없이, 저산소 MIL은 MIL의 항암 능력에 영향을 미치는 단백질 및/또는 유전자 발현에 변화를 겪게될 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 저산소 MIL은 또한, 항-CD3/항-CD28 비드 또는 다른 유사한 활성화 시약의 존재로 활성화될 수 있다. 따라서, 저산소 MIL은 또한 활성화된 저산소 MIL일 수 있다.
일부 양태에서, 실시양태는 본원에 기재된 바와 같이 재조합 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 면역 반응을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 신생물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 신생물은 양성 신생물, 악성 신생물, 또는 이차 신생물이 될 수 있다. 신생물은 암일 수 있다. 신생물은 림프종 또는 백혈병, 예컨대, 만성 림프구성 백혈병("CLL") 또는 급성 림프구성 백혈병("ALL")일 수 있다. 신생물은 다발성 골수종 뿐만 아니라 임의의 고형 종양(예컨대, 유방암, 전립선암, 폐암, 식도암, 뇌암, 신장암, 방광암, 췌장암, 골육종 등)일 수 있다. 암은 또한 본원에 기재된 암일 수 있다.
이 방법은 본원에 기재된 바와 같은 다수의 재조합 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 본원에 기재된 바와 같은 재조합 세포의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 재조합 세포를 수용하는 대상체에 대해 자가유래 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 재조합 세포를 수용하는 대상체에 대해 동종 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 재조합 세포를 수용하는 대상체에 대해 이종 세포이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 수득되고 본원에 제공된 수용체로 변형시킨 세포로서, 그 후 상기 대상체에 다시 투여된다. 세포는 본원에 기재된 바와 같을 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 상이한 대상체로부터 수득되고 본원에 제공된 수용체로 변형시킨 세포로서, 그 후 세포의 공급원과 동일하지 않은 대상체에 투여된다. 세포는 본원에 기재된 바와 같을 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 상이한 종(예컨대, 돼지)로부터 수득되고 본원에 제공된 수용체로 변형시킨 세포로서, 그 후 세포의 공급원과 동일하지 않는 대상체에 다시 투여된다. 상기 세포는 본원에 기재된 바와 같을 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 수득된다. 형질주입 또는 감염되는 세포는 대상체로부터 수득될 수 있다. 세포는 본원에 기재된 바와 같이 수득될 수 있다. 예를 들어, 투여되는 세포는 대상체에 대해 자가유래일 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여되는 세포는 대상체에 대해 동종이다. 세포는 대상체로부터 수득되고 본원에 기재된 바와 같은 키메라 막관통 단백질을 코딩하는 핵산으로 형질주입 또는 감염될 수 있다. 세포는 딸세포일 수 있되, 여기서 딸세포의 모세포는 대상체로부터 수득된다. 재조합 세포는 핵산으로 형질주입 또는 감염되었을 수 있거나, 재조합 세포의 모세포가 핵산으로 형질주입 또는 감염되었을 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질주입 또는 감염된 후에, 세포는 본원에 기재된 하나 이상의 아미노 서열을 포함하는 단백질을 발현한다.
본 방법은 재조합 세포를 제조하는 것을 추가로 포함할 수 있되, 여기서 재조합 세포를 제조하는 것은 본원에 기재된 것과 같은 키메라 막관통 단백질을 코딩하는 핵산으로 세포를 형질주입 또는 감염시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 막관통 단백질은 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 중 임의의 하나로 개시된 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함한다. 유사하게, 상기 방법은 복수의 재조합 세포를 제조하는 것을 추가로 포함할 수 있되, 여기서 상기 다수의 재조합 세포를 제조하는 것은 본원에 기재된 것과 같은, 키메라 막관통 단백질을 코딩하는 핵산으로 다수의 세포를 형질주입 또는 감염시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 모세포를 증식시키는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 예컨대, 재조합 세포는 모세포의 딸세포일 수 있다. 상기 방법은 세포 집단을 증식시키는 것을 포함할 수 있으며, 예컨대, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 다수의 재조합 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있고, 다수의 재조합 세포의 각 세포는 모세포의 딸세포일 수 있다.
상기 방법은 대상체로부터 세포 또는 모세포를 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 예컨대, 형광 활성 세포 분류("FACS") 또는 자기 활성 세포 분류("MACS")에 의해 세포를 분류하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
세포는 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 조성물에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물에는 발열원이 없다. 예를 들어, 세포의 투여는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 투여는 비경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 근육내, 두개내(intracranial), 안와내(intraorbital), 안과(ophthalmic), 심실내, 피막내, 척수 내, 수조내, 복강내, 뇌실내(intracerebroventricular), 또는 척추강내(intrathecal)일 수 있다. 비경구 투여의 경우, 세포는 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 담체와 함께 조성물로, 정맥내, 피하 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 세포는 주사, 예를 들어, 볼루스 주사(bolus injection) 또는 연속 주입(continuous infusion)에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액, 또는 유화제와 같은 형태를 취할 수 있고, 제형화제, 예를 들어, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다.
주사에 의한 투여의 경우, 용액을 등장성으로 만들기 위해 완충액 또는 보존제 뿐만 아니라 충분한 양의 약학적으로 허용가능한 염 또는 글루코스와 같은 다른 용질을 또한 함유할 수 있는 멸균 수성 비히클 중 용액에서 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화되어, 주사제 투여용 멸균 용액 또는 현탁액을 제공할 수 있다. 특히, 주사제는 액체 용액, 또는 현탁액, 또는 유화제와 같은 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 레시틴, 알부민, 소듐 글루타메이트, 시스테인 하이드로클로라이드 등이다. 또한, 원한다면, 주사 가능한 약학 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대, 습윤제, pH 완충제 등을 함유할 수 있다. 적합한 약학 담체는 E. W. Martin의 "Remington's pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다.
대상체는 면역 세포를 포함하는 임의의 유기체일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 설치류, 개(canine), 고양이과, 돼지, 양, 소, 말, 및 영장류로부터 선택될 수 있다. 대상체는 마우스 또는 인간일 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 신생물을 가질 수 있다. 신생물은 양성 신생물, 악성 신생물, 또는 이차 신생물이 될 수 있다. 신생물은 암일 수 있다. 신생물은 림프종 또는 백혈병, 예컨대, 만성 림프구성 백혈병("CLL") 또는 급성 림프구성 백혈병("ALL")일 수 있다. 대상체는 교모세포종, 수모세포종, 유방암, 두경부암, 신장암, 난소암, 카포시 육종, 급성 골수성 백혈병, 및 B 계통의 악성 종양이 있을 수 있다. 대상체는 다발성 골수종을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 "이를 필요로 하는" 대상체이다. 본원에 사용된 어구 "이를 필요로 하는"은 대상체가 특정 방법 또는 치료에 대한 필요성이 있는 것으로 확인 또는 의심된다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 확인은 임의의 진단 수단에 의한 것일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법 및 치료에서, 대상체는 이를 필요로 할 수 있다.
본원에 제공된 수용체는 또한, "CAR"로 일컬을 수 있는, 다른 키메라 활성 수용체와 함께 세포 내에 위치할 수 있다.
실시예
다음 실시예는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 설명하는 것이지 제한하는 것이 아니다. 당업자에게 자명하고 치료법에서 통상적으로 접하는 다양한 조건 및 매개변수의 다른 적절한 변형 및 개조는 실시양태의 진의 및 범주 내에 있다.
실시예 1: 렌티바이러스 형질도입된 저캣(Jurkat) 백혈병 세포주에서의 PD-1 스위치 수용체 발현.
하기 기재된 수용체를 렌티바이러스 발현 시스템을 사용하여, 본원에 기재된 바와 같이 저캣 세포에 형질도입하였다. 간략히 말해서, 저캣 세포를, 녹색 형광 단백질(GFP)만(빈 벡터(empty vector))을 운반하는 빈 벡터 대조군을 운반하는 렌티바이러스로, 또는 T2a 절단가능한 펩티드에 의해 GFP에 연결된 6가지 PD-1 스위치 수용체 각각을 운반하는 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 형질도입 이후 4일째에, 상기 세포들을 항-PD-PECy7 또는 이소타입-매칭되는 대조군 항체로 표지하고, 벡크만 쿨터 갈리오스(Beckman Coulter Galios) 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. PD-1, PD-1 스위치 수용체들 또는 GFP를 발현하지 않는 형질도입되지 않은 저캣 세포(형질도입되지 않음)를 동일한 방식으로 표지하고, 음성 대조군으로서 사용하였다. 수용체는 세포에서 발현되는 것으로 밝혀졌다.
발현은 또한, 4량체 인간 PDL1을 세포에 결합시키고 FACS에 의해 분석함으로써 측정되며, 이는 PD-1 스위치 수용체가 PD-1 리간드인 PDL1에 결합할 수 있음을 입증하였다. 이는 다음 절차를 사용함으로써 측정되었다. 간략히 말해서, 저캣 세포를, 녹색 형광 단백질(GFP)만(빈 벡터)을 운반하는 빈 벡터 대조군을 운반하는 렌티바이러스로, 또는 T2a 절단가능한 펩티드에 의해 GFP에 연결된 6가지 PD-1 스위치 수용체 각각을 운반하는 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 상기 세포들을 형광 분자인 피코에리트린(PE)이 태깅(tagging)된 4량체 인간 PDL1-Ig로 표지하고, 벡크만 쿨터 갈리오스 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. PD-1, PD-1 스위치 수용체, 또는 GFP를 발현하지 않는 형질도입되지 않은 저캣 세포(형질도입되지 않음)를 동일한 방식으로 표지하고, 음성 대조군으로서 사용하였다.
수용체는 또한, MIL 내로 형질도입된 후에, 발현되는 것으로 밝혀졌다. 간략히 말해서, 3명의 다발성 골수종 환자( A) 환자 476-2312, B) 환자 1431, C) 환자 1943)로부터의 골수(BM)를 사용하여, 저산소 조건 하에서 활성화된 MIL을 생성하였다. 3일째에, MIL을 GFP만(빈 벡터)을 운반하는 빈 벡터 대조군을 운반하는 렌티바이러스로, 또는 T2a 절단가능한 펩티드에 의해 GFP에 연결된 6가지 PD-1 스위치 수용체 각각을 운반하는 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 형질도입 이후 3일째에, 세포를 항-CD3-APC, 항-CD8-APCH7, 라이브-데드 옐로우(Live-dead Yellow), 및 항-PD1-PECy7이나 이소타입-매칭되는 대조군 항체로 표지하고, 벡크만 쿨터 갈리오스 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. PD-1 스위치 수용체 또는 GFP를 발현하지 않는 형질도입되지 않은 MIL(형질도입되지 않음)을 동일한 방식으로 표지하고, 음성 대조군으로서 사용하였다. 발현은 유세포 분석기로 측정하였다. 빈 벡터 대조군-형질도입된 MIL과 비교하여 GFP + PD-1 스위치 수용체-형질도입된 MIL에서 관찰된 PD1-발현의 증가는 PD1 스위치 수용체의 발현에 상응한다. MIL은 저산소 조건 하에서 활성화되었다. 이러한 결과는 수용체가 상이한 세포 유형에서 발현될 수 있음을 입증한다. 수용체를 발현하는 세포는 본원에 기재된 암과 같은 신생물을 치료하는 데 사용될 수 있다.
실시예 2: 저산소 활성화된 MIL의 암 치료
대상체로부터 수득된 MIL은 본원에 기재된 바와 같이 활성화되고 증식된다. 간략하게, 대상체로부터 골수 샘플을 수득한 후에, 세포를, 본원에 참고로 원용되는 WO2016037054에 기재된 바와 같이, 항-CD3/항-CD28 비드 및 사이토카인의 존재 하에 저산소 조건 하에서 항온처리한다. 이 후, MIL을 서열번호 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31을 포함하는 키메라 막관통 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스로 감염시킨다. 핵산 분자는 또한, 형질주입 또는 형질도입에 의해 도입될 수 있다. 키메라 수용체는 또한 본원에 제공된 바와 같은 리더 서열을 포함할 수 있다. 이 후, 세포는 정상 산소 조건 하에서 성장되고 증식하는 것이 허용된다. 대조군 및 감염된 MIL을 상이한 세포 유형과 접촉시킨다. MILS의 증식도 항원을 인식하는 MIL의 능력도 키메라 막관통 단백질의 존재에 의해 부정적인 영향을 받지 않는다. 키메라 막관통 단백질을 MIL에 부가하면 그의 기능과 성장에 해가 되지 않는다. MIL은 암, 예컨대, 다발성 골수종을 앓는 대상체에 투여되며, 암은 치료되고 대상체는 병의 차도가 있다. 세포는 또한, 계속 지속되는 것으로 발견되었고 대상체에서 병의 차도가 계속 유지되도록 하였다.
요약하면, 본원에 제공된 실시양태 및 실시예는 본원에 제공된 키메라 막관통 단백질을 발현하는 세포가 암을 치료하고/하거나 면역 반응을 조절하는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 입증한다.
본 명세서에 언급되거나 및/또는 응용 데이터 시트에 나열된, CAS 번호를 포함하는 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공개공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원, 및 비-특허 공개물은 그 전체가 참고로 본원에 원용된다.
SEQUENCE LISTING <110> WINDMIL THERAPEUTICS, INC. Noonan, Kimberly A. Lutz, Eric R. <120> Compositions And Methods For Modulating The Immune System <130> 144502.00502 <150> 62/438,106 <151> 2016-12-22 <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD Leader Peptide <400> 1 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 2 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD Leader Peptide <400> 2 atggccctgc ccgtgaccgc cctgctcctg cctctggctc tgctgctgca tgccgccaga 60 cct 63 <210> 3 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Extracellular Domain <400> 3 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr 35 40 45 Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 55 60 Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn 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cagaagcaac 600 aagggcgaga gccccgtgga acctgccgag ccttgtagat acagctgtcc cagagaggaa 660 gagggcagca caatccccat ccaagaggac tacagaaagc ccgagcctgc ctgctctccc 720 aagagaggca gaaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 780 accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 840 gagctt 846 <210> 43 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Extracellular Domain; ICOS Transmembrane Domain; ICOS Intracellular Domain <400> 43 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro 20 25 30 Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly 35 40 45 Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe 50 55 60 Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu 65 70 75 80 Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe 85 90 95 Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val 100 105 110 Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser 115 120 125 Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg 130 135 140 Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser 145 150 155 160 Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Phe Trp Leu Pro Ile 165 170 175 Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu Ile 180 185 190 Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn 195 200 205 Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg 210 215 220 Leu Thr Asp Val Thr Leu 225 230 <210> 44 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 Extracellular Domain; ICOS Transmembrane Domain; ICOS Intracellular Domain <400> 44 atggccctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctcttgctc tgcttctgca tgccgctaga 60 cctccaggct ggttcctgga ctctcccgac agaccttgga accctccaac attcagcccc 120 gctctgctgg tggttaccga gggcgataat gccaccttca cctgtagctt cagcaacacc 180 agcgagagct tcgtgctgaa ctggtacaga atgagcccca gcaaccagac cgacaagctg 240 gccgcctttc ctgaggatag atctcagccc ggccaggact gccggttcag agttacacag 300 ctgcccaacg gccgggactt ccacatgtct gtcgtccggg ccagaagaaa cgacagcggc 360 acatatctgt gcggcgccat ttctctggcc cctaaggctc agatcaaaga gagcctgaga 420 gccgagctga gagtgacaga aagacgggcc gaagtgccca cagctcaccc ttcaccttct 480 ccaagacctg ccggccagtt tcagaccctg gtgttctggc tgcctatcgg ctgtgccgct 540 tttgtggtcg tgtgcatcct gggctgcatc ctgatctgct ggctgaccaa gaaaaagtac 600 agcagcagcg tgcacgaccc caacggcgag tacatgttca tgagagccgt gaacaccgcc 660 aagaagtcca gactgaccga cgtgaccctt 690

Claims (49)

  1. PD-1의 세포외 도메인;
    4-1BB 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, CD27 막관통 도메인, 및 ICOS 막관통 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 막관통 도메인; 및
    4-1BB 세포내 시그널링 도메인, CD28 세포내 시그널링 도메인, CD27 세포내 시그널링 도메인, 및 ICOS 세포내 시그널링 도메인, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포내 시그널링 도메인
    을 포함하는 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 막관통 도메인이 4-1BB 막관통 도메인인 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인이 4-1BB 세포내 시그널링 도메인, CD28 세포내 시그널링 도메인, CD27 세포내 시그널링 도메인, 및 ICOS 세포내 시그널링 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질.
  4. 제2항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인이 4-1BB의 세포내 도메인과; CD28 세포내 시그널링 도메인, CD27 세포내 시그널링 도메인, 및 ICOS 세포내 시그널링 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포내 도메인인 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 막관통 도메인이 CD28 막관통 도메인인 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인이 4-1BB 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, CD27 막관통 도메인, 및 ICOS 막관통 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질.
  7. 제5항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인이 4-1BB의 세포내 도메인과; CD28 세포내 시그널링 도메인, CD27 세포내 시그널링 도메인, 및 ICOS 세포내 시그널링 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포내 도메인인 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 막관통 도메인이 CD27 막관통 도메인인 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인이 4-1BB 세포내 시그널링 도메인, CD28 세포내 시그널링 도메인, CD27 세포내 시그널링 도메인, 및 ICOS 세포내 시그널링 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질.
  10. 제8항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인이 4-1BB의 세포내 도메인과; CD28 세포내 시그널링 도메인, CD27 세포내 시그널링 도메인, 및 ICOS 세포내 시그널링 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포내 도메인인 단백질.
  11. 제1항에 있어서, 막관통 도메인이 ICOS 막관통 도메인인 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인이 4-1BB 세포내 시그널링 도메인, CD28 세포내 시그널링 도메인, CD27 세포내 시그널링 도메인, 및 ICOS 세포내 시그널링 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질.
  13. 제11항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인이 4-1BB의 세포내 도메인과; CD28 세포내 시그널링 도메인, CD27 세포내 시그널링 도메인, 및 ICOS 세포내 시그널링 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포내 도메인인 단백질.
  14. 제1항에 있어서, 단백질이 서열번호 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31의 서열을 포함하는 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 리더 서열을 포함하는 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 단백질이 CD8 리더 서열을 포함하는 단백질.
  17. 제16항에 있어서, CD8 리더 서열이 서열번호 1을 포함하는 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
  19. 서열번호 22, 24, 26, 28, 30, 또는 32의 서열을 포함하는 핵산 분자.
  20. 제19항에 있어서, 서열번호 2로 코딩되는 리더 서열을 추가로 포함하는 핵산 분자.
  21. 제19항 또는 제20항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 세포.
  22. 제18항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 세포.
  23. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 단백질을 포함하는 재조합 세포.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 세포가 림프구 또는 T 세포인 세포.
  25. 제21항 또는 제22항에 있어서, 세포가 종양 침윤 림프구(TIL)인 세포.
  26. 제21항 또는 제22항에 있어서, 세포가 골수 침윤 림프구(MIL)인 세포.
  27. 제26항에 있어서, MIL이 저산소 MIL인 세포.
  28. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 세포를 형질주입 또는 감염시키는 것을 포함하는, 재조합 세포를 제조하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 세포가 MIL인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 세포를 형질주입 또는 감염시키기 전에, 저산소 조건 하에서 MIL을 항온처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 저산소 조건이 약 0.5% 내지 약 5%의 산소 가스를 포함하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 저산소 조건이 약 1% 내지 약 2%의 산소 가스를 포함하는 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 저산소 항온처리 후에, 정상 산소 조건 하에서 세포를 항온처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 항-CD3/항-CD28 비드와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  35. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항의 재조합 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 면역 반응을 증가시키는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 재조합 세포를 제조하는 것을 추가로 포함하되, 여기서 재조합 세포를 제조하는 것이 단백질을 코딩하는 핵산으로 세포를 형질주입시키는 것을 포함하는 방법.
  37. 제35항에 있어서, 대상체로부터 세포를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  38. 제35항에 있어서, 대상체가 신생물을 갖는 방법.
  39. 제35항에 있어서, 신생물이 백혈병, 림프종, 또는 다발성 골수종인 방법.
  40. 제35항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  41. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항의 재조합 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 신생물을 치료하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 재조합 세포를 제조하는 것을 추가로 포함하되, 여기서 재조합 세포를 제조하는 것이 키메라 막관통 단백질을 코딩하는 핵산으로 세포를 형질주입시키는 것을 포함하는 방법.
  43. 제41항에 있어서, 대상체로부터 세포를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  44. 제41항에 있어서, 대상체가 신생물을 갖는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 신생물이 다발성 골수종, 백혈병, 또는 림프종인 방법.
  46. 제41항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  47. 제41항에 있어서, 세포를 대상체에 투여하기 전에,
    세포를 항-CD3/항-CD28 비드와 접촉시키는 것;
    세포를 저산소 조건 하에서 항온처리하는 것; 및
    세포를 정상 산소 조건 하에서 항온처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 세포를 저산소 조건 하에서 약 0.5 내지 약 4일 동안 항온처리하는 방법.
  49. 제47항에 있어서, 세포를 정상 산소 조건하에서 약 0.5 내지 약 4일 동안 항온처리하는 방법.
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