WO2022220433A1 - Programmed death-ligand 1(pd-l1)에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

Programmed death-ligand 1(pd-l1)에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2022220433A1
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chimeric antigen
cancer
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전태훈
양준
이창희
이나영
박인병
강석진
박시원
이현정
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주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩
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Definitions

  • the present invention relates to a chimeric antigen receptor (CAR) that specifically binds to PD-L1; a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor protein; a vector comprising the polynucleotide; T cells or natural killer cells transformed with the vector (Natural killer cell, NK cell); And it relates to a cell therapeutic agent or a pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising the cell as an active ingredient.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • Programmed death-ligand 1 (PD-L1 or CD274 or B7-H1) is a 40 kDa integral membrane protein, and is used in various types of malignant cells and myeloid-derived suppressor cells, MDSCs) or immune cells (Iwai et al., 2002; Blank et al., 2004; Von Knethen and Brune, 2019).
  • cancer cells overexpress PD-L1 to evade attack by tumor antigen-specific T cells (Okazaki and Honjo, 2007; Markham, 2016; Cao et al., 2019).
  • cancer cells when cancer cells overexpress PD-L1, it binds to PD-1, a receptor for PD-L1 expressed in tumor antigen-specifically activated T cells, and is specific for tumor antigens through PD-L1/PD-1 signaling. It inhibits the activity of enemy T cells (Okazaki and Honjo, 2007; Markham, 2016; Cao et al., 2019). Accordingly, neutralizing antibodies (immune checkpoint inhibitors) that can inhibit PD-L1/PD-1 signaling have been developed, and these neutralizing antibodies are attracting attention as therapeutic agents that can more effectively remove cancer. (Sznol and Chen, 2013; Homet Moreno et al., 2015).
  • Carcinomas expressing PD-L1 so far have been melanoma, lung cancer, sarcoma, renal-cell carcinoma, lymphoma, colorectal cancer, and gastric cancer.
  • cancer esophageal cancer, advanced solid tumor, breast cancer, head and neck cancer, ovarian cancer, prostate cancer, etc. (Zhang) et al., 2020).
  • cytotoxic T lymphocytes CTL
  • NK cells natural killer cells
  • a single-chain variable fragment (scFv) portion of an antigen-recognizing antibody is grafted onto a domain grafted to CD3 zeta or the cytoplasmic signaling domain of another protein. It was attempted as a method of delivering chimeric antigen receptor (CAR).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the chimeric antigen receptor is grafted onto T cells or natural killer cells, the anticancer action of T cells or natural killer cells is enhanced by the specific antigen recognition of single-chain Fv fragments regardless of signal transduction by antigen presenting cells (APCs). It can be activated, and it is not limited to the HLA type, so it can be used as a more efficient treatment method that can be used universally by many people. Indeed, these chimeric antigen receptor-expressing T cells or natural killer cells have shown efficacy in several cancers (Holzinger et al., 2016; Pettitt et al., 2018; Wang et al., 2020).
  • programmed death 1 is a type 1 membrane protein composed of 288 amino acids, and is an immunoglobulin (Ig) superfamily that is expressed on the cell surface when T cells are activated. It is an integral membrane protein belonging to the family (Ishida et al., 1992). PD-1 expressed in activated T cells binds to its ligand, PD-L1, and is known to inhibit T cell activity (Syn et al., 2017).
  • a chimeric antigen receptor Korean Patent Publication No. 10-2017-0090506
  • a humanized anti-BCMA chimeric antigen receptor wherein a population of immune effector cells is an anti-PD-L1 antibody
  • a method of co-administration in combination with Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2017-0037626
  • the PD-1 extracellular domain having binding specificity for PD-L1-expressing cancer cells is antigen-binding.
  • the invention of using a chimeric antigen receptor having a domain configuration as an immunocancer therapeutic agent has not been described.
  • the present inventors identified or induced PD-L1 expression in various cancer cells and developed PD using the extracellular domain of PD-1 using the fact that the PD-L1 and PD-1 binding is possible.
  • -L1-expressing cancer-specific chimeric antigen receptor-expressing T cells and natural killer cells were prepared, and experiments were conducted to test that the T cells or natural killer cells have specific cytotoxicity to PD-L1-expressing cells. confirmed through.
  • the signal transduction strength was amplified by making a fusion protein linking each of the extracellular domains of PD-1 with the human immunoglobulin G 1 heavy chain constant region (IgG 1 heavy chain constant region).
  • the existing chimeric antigen receptor has one site for recognizing an antigen by a single-chain Fv fragment, whereas the chimeric antigen receptor designed by the present inventors converts each of the extracellular domains of PD-1 into human human immunoglobulin.
  • the G 1 heavy chain constant region IgG 1 heavy chain constant region
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor protein, a vector containing the polynucleotide, and T cells or natural killer cells transformed with the vector.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment of cancer that kills cancer cells expressing cell therapy or PD-L1, including the transformed T cells or natural killer cells.
  • the present invention provides an antigen-binding site, an extracellular domain; transmembrane domain; and an intracellular signaling domain, wherein the antigen binding domain comprises an extracellular domain of PD-1 that specifically binds to PD-L1. to provide.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor protein, a vector containing the polynucleotide, and T cells or natural killer cells transformed with the vector.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising the transformed T cells or natural killer cells, which kills a cell therapeutic agent or a cancer cell expressing PD-L1.
  • the chimeric antigen receptor according to the present invention comprises an extracellular domain of PD-1 that specifically binds to PD-L1. Therefore, in the case of cytotoxic T cells or natural killer cells transformed with a vector capable of overexpressing the chimeric antigen receptor, they have specific cytotoxicity to a carcinoma expressing PD-L1, so an immune cell therapeutic agent for cancer treatment can be usefully used as
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the cDNA region of each domain expressing a chimeric antigen receptor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2A is a schematic diagram of a lentiviral vector according to an embodiment of the present invention.
  • 2B is a schematic diagram of a retroviral vector according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a chimeric antigen receptor expressed on the surface of cytotoxic T cells or natural killer cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring the expression level of PD-L1 in cancer cells expressing PD-L1, a target of the chimeric antigen receptor provided in the present invention, using flow cytometry.
  • Figure 5a is a diagram showing the result of comparing the expression rate of GFP in cytotoxic T cells (PD-1 CAR-T cells) transduced with the expression vector according to an embodiment of the present invention using a lentiviral system. .
  • Figure 5b is a diagram showing the result of comparing the expression ratio of PD-1 in natural killer cells (PD-1 CAR-T cell) transduced with the expression vector according to an embodiment of the present invention using a retroviral system to be.
  • 6a is a flow cytometric analysis showing whether cytotoxic T cells (PD-1 CAR-T cells) transduced with an expression vector according to an embodiment of the present invention using a lentiviral system recognize PD-L1 it is do
  • Figure 6b is a diagram showing using flow cytometry whether natural killer cells (PD-1 CAR-NK cells) transduced with the expression vector according to an embodiment of the present invention using a retroviral system recognize PD-L1 to be.
  • Figure 7a is a cytotoxic T cell (PD-1 CAR-T cell) or a cytotoxic T cell (Mock T cell) transduced with an empty vector according to an embodiment of the present invention as an effector cell (effector cell) PD - It is a diagram showing the result of measuring the cytotoxicity to cancer cells (Raji cells) expressing L1.
  • FIG. 7b shows PD-L1 using natural killer cells (PD-1 CAR-NK cells) or mock NK cells transduced with an empty vector as effector cells according to an embodiment of the present invention. It is a diagram showing the result of measuring the cytotoxicity to the cancer cells (Raji cells) expressing.
  • the present invention provides an antigen-binding domain; transmembrane domain; and an intracellular signaling domain, wherein the antigen binding domain comprises an extracellular domain of PD-1 that specifically binds to PD-L1. .
  • chimeric antigen receptor binds to a desired antigen without the mediation of antigen presenting cells (APCs) or antibodies necessary for naturally activating T cells or natural killer cells, thereby producing an antigen-antibody reaction. It refers to a fusion protein for expression in T cells or natural killer cells in order to induce activation of T cells and attack cells expressing the corresponding antigen. That is, when expressed in T cells or natural killer cells, it can be considered as a protein that binds to an antigen and induces activation of these cells. Through this, it may be a protein recognizing an antigen specific to a cell to cause an immune response, and the cell to cause an immune response may refer to a cell existing in a specific tissue or constituting a tissue causing a lesion.
  • APCs antigen presenting cells
  • the chimeric antigen receptor protein according to an embodiment of the present invention may include a functional equivalent.
  • “Functional equivalent” means at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably the amino acid sequence of the chimeric antigen receptor protein as a result of the addition, substitution, or deletion of amino acids. refers to a protein having a sequence homology of 95% or more and exhibiting substantially homogeneous physiological activity. “Substantially homogenous physiological activity” means that it has an activity capable of specifically binding to PD-L1.
  • the present invention also includes fragments, derivatives and analogues of chimeric antigen receptors.
  • fragments, derivatives and analogues of chimeric antigen receptors As used herein, the terms 'fragment', 'derivative' and 'analog' refer to a polypeptide that retains substantially the same biological function or activity as the chimeric antigen receptor protein of the present invention. Fragments, derivatives and analogs of the present invention may comprise (1) polypeptides in which one or more conservative or non-conservative amino acid residues (preferably conservative amino acid residues) are substituted, wherein the substituted amino acid residues are encoded by the genetic code.
  • polypeptide having substituent(s) at one or more amino acid residues may or may not be) or (2) a polypeptide having substituent(s) at one or more amino acid residues, or (3) another compound (a compound capable of extending the half-life of the polypeptide, such as polyethylene glycol); a polypeptide derived from the associated mature polypeptide, or (4) an additional amino acid sequence (eg, a leader sequence, a secretion sequence, a sequence used to purify the polypeptide, a proteinogen sequence, or a fusion protein); It may be a polypeptide derived from said polypeptide to which it is bound.
  • the fragments, derivatives and analogs as defined herein are well known to those skilled in the art.
  • PD-1 protein is a type 1 membrane protein composed of 288 amino acids, and is an integral membrane protein belonging to the immunoglobulin superfamily that is expressed on the cell surface when T cells are activated. membrane protein).
  • the antigen binding domain may be in the form of a dimer in which a pair of extracellular domains of PD-1 are linked to a human immunoglobulin G 1 heavy chain constant region (IgG 1 heavy chain constant region) to amplify signal transduction, respectively. , but is not limited thereto.
  • the extracellular domain of PD-1 may consist of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence showing 95% or more homology thereto, but is not limited thereto.
  • the human immunoglobulin G 1 heavy chain constant region may consist of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence showing 95% or more homology thereto, but is not limited thereto.
  • PD-L1 is a 40 kDa integral membrane protein, and is observed in various malignant cells and myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) or immune cells.
  • Carcinomas expressing PD-L1 so far have been melanoma, lung cancer, sarcoma, renal-cell carcinoma, lymphoma, colorectal cancer, and gastric cancer.
  • Select from the group consisting of cancer, esophageal cancer, advanced solid tumor, breast cancer, head and neck cancer, ovarian cancer and prostate cancer may be, but is not limited thereto.
  • the "transmembrane domain” is a site that connects the extracellular domain of PD-1 and the costimulatory and essential signaling domains between the cell membrane, and the intracellular signaling domain is formed by binding of the antigen-binding domain. It refers to a site that activates the immune response of immune cells.
  • the transmembrane domain is selected from the group consisting of CD28, CD3epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 and CD154. It may include one or more types, and the CD8 may be CD8 ⁇ or CD8 ⁇ , preferably the transmembrane domain of CD8 ⁇ , which may consist of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence that is 95% or more homologous thereto. However, the present invention is not limited thereto.
  • intracellular signaling domain refers to a site that activates an immune response of an immune cell by binding to an antigen-binding domain.
  • the intracellular domain may be CD28, 4-1BB, CD3 zeta, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the chimeric antigen receptor according to the present invention uses CD28, 4-1BB, and CD3 zeta as intracellular signaling domains, thereby exhibiting a killing effect on cancer cells, particularly cancer cells expressing PD-L1, with high activity. have.
  • the CD28 is SEQ ID NO: 4 or 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more sequence homology thereto, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and may consist of an amino acid sequence exhibiting a substantially equivalent function
  • 4-1BB (CD137) is SEQ ID NO: 5 or 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% thereof Having the above sequence homology, it may consist of an amino acid sequence exhibiting a function substantially equivalent to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, CD3 zeta functions as an NK cell activation domain, and SEQ ID NO: 6 or 70 thereof % or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and an amino acid sequence that exhibits a substantially equivalent function to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the antigen-binding domain may include a CD8 ⁇ signal peptide, and the CD8 ⁇ signal peptide may consist of SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence exhibiting 95% or more homology thereto, but is not limited thereto.
  • a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor protein in another aspect according to the present invention, there is provided a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor protein.
  • the polynucleotide encoding the antigen receptor of the present invention changes the amino acid sequence of the antigen receptor expressed from the coding region due to codon degeneracy or in consideration of the codon preferred in the organism to express the antigen receptor.
  • Various modifications may be made to the coding region within the range that does not occur, and various modifications or modifications may be made within the range that does not affect the expression of the gene in parts other than the coding region, and such modified genes are also within the scope of the present invention. It will be well understood by those skilled in the art.
  • nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and these are also included in the scope of the present invention.
  • a vector comprising the polynucleotide, and a cell transformed with the vector.
  • the vector used in the present invention may use a variety of vectors known in the art, and may include a promoter, a terminator, an enhancer, etc., depending on the type of host cell to produce the antigen receptor. Expression control sequences, sequences for membrane targeting or secretion, etc. can be appropriately selected and variously combined according to the purpose.
  • the vector of the present invention includes, but is not limited to, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, and a viral vector. Suitable vectors include a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoter, operator, start codon, stop codon, polyadenylation signal and enhancer, and may be prepared in various ways depending on the purpose.
  • a vector for a lenti-virus or a vector for a retro-virus can be used.
  • pLNCX2 retro-virus vector
  • a cell can be transformed by introducing a chimeric antigen receptor that specifically binds to PD-L1 into the cell through the vector.
  • the cell may be a T cell, a tumor infiltrating lymphocyte, a B cell, a natural killer cell, or an NKT cell, preferably a cytotoxic T cell or a natural killer cell.
  • the cell may be obtained or prepared from bone marrow, peripheral blood, peripheral blood mononuclear cells or umbilical cord blood, and the cell may be a human cell, but is not limited thereto.
  • the cells transformed by introducing the chimeric antigen receptor of the present invention recognize PD-L1 as an antigen and have a characteristic of strongly binding thereto.
  • chimeric antigen receptor T cells (hereinafter abbreviated as 'CAR-T cells')" or “chimeric antigen receptor NK cells (hereinafter referred to as chimeric antigen receptor NK cells)" 'CAR-NK cells') is a chimeric antigen receptor that specifically responds to cancer cells other than the original T cell receptor or NK cell receptor by transducing normal T cells or natural killer cells, etc. refers to T cells or NK cells expressing T cells or NK cells having this receptor induce apoptosis of target cells and exhibit cytotoxicity.
  • CAR-T cells or CAR-NK cells may be cytotoxic T cells or cells in which the chimeric antigen receptor of the present invention is introduced into NK cells.
  • the cells have the advantage of anticancer-specific targeted therapy, which is the existing advantage of CAR-T therapeutics.
  • the CAR-T cells or CAR-NK cells of the present invention can recognize and effectively destroy cancer cells expressing PD-L1. have.
  • the present invention provides a cell therapeutic agent comprising the cell or a pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising the same as an active ingredient.
  • cell therapeutic refers to cells and tissues prepared through isolation, culture, and special manipulation from an individual, and as pharmaceuticals used for therapeutic purposes, living autologous, allogeneic, or xenogeneic cells or tissues are restored to function. It refers to a drug used for therapeutic purposes through a series of actions, such as in vitro proliferation and selection or changing the biological properties of cells in other ways.
  • treatment refers to any action in which symptoms of cancer are improved or beneficially changed by administration of the composition.
  • composition may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the "pharmaceutically acceptable carrier” may mean a carrier or diluent that does not inhibit the biological activity and properties of the injected compound without irritating the organism.
  • the type of carrier usable in the present invention is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art and pharmaceutically acceptable may be used.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier may be in various oral or parenteral formulations.
  • formulation it is prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants that are usually used.
  • solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient to the compound, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose. , gelatin, etc. may be mixed and prepared.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose. , gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • Witepsol, Macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin fat, glycerogelatin, etc. may be used as the base of the suppository.
  • composition may be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is dependent on the subject's type and severity, age, sex, infected virus type, and drug. Activity, sensitivity to drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including concomitant drugs and other factors well known in the medical field.
  • Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, may be administered intranasally, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may be administered daily or intermittently, and the number of administrations per day may be administered once or divided into two to three times. When the two active ingredients are single drugs, the number of administrations may be the same or different.
  • the composition of the present invention may be used alone or in combination with other drug treatments for the treatment of PD-L1-expressing cancer. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the subject means a human, monkey, cow, horse, sheep, pig, chicken, turkey, quail, cat, dog, mouse, rat, rabbit or guinea pig that has or can develop cancer expressing PD-L1. all animals, including If the disease can be effectively treated by administering the pharmaceutical composition of the present invention to the subject, the type of subject is included without limitation.
  • the types of cancer to be treated include melanoma, lung cancer, sarcoma, renal-cell carcinoma, lymphoma, colorectal cancer, Gastric cancer, esophageal cancer, advanced solid tumor, breast cancer, head and neck cancer, ovarian cancer and prostate cancer consisting of It may be selected from the group, but is not limited thereto.
  • Example 1 By gene synthesis method chimeric antigen receptor genetic cloning
  • a pair of extracellular domains of PD-1 are respectively linked to the human immunoglobulin G 1 heavy chain constant region (IgG 1 heavy chain constant region) and the antigen recognition site and CD8 ⁇ transmembrane
  • the protein coding sequence of the intracellular domain portion of each domain, CD28, 4-1BB, and CD3 zeta was identified in a gene database.
  • FIG. 1 A schematic diagram showing the cDNA region of each domain expressing the chimeric antigen receptor is shown in FIG. 1 .
  • the gene is expressed in pCDH, a lentivirus-derived expression vector.
  • pCDH a lentivirus-derived expression vector.
  • -CMV-MCS-EF1-copGFP System Biosciences
  • pLNCX2 retrovirus-derived expression vector
  • a primer that creates a cleavage site sequence of restriction enzyme XbaI at the 5' end was synthesized, and a restriction enzyme cleavage site was created by polymerase chain reaction, and also restricted at the 3' end. Restriction enzyme cleavage site was created by polymerase chain reaction by synthesizing a primer making the cleavage site sequence of the enzyme NotI.
  • the 5' end of the gene having a restriction enzyme cleavage site was treated with XbaI, and the 3' end was treated with NotI due to the polymerase chain reaction.
  • the multicloning site of the expression vector was treated with XbaI and NotI to allow the gene to be inserted. After mixing the restriction enzyme-treated gene with the expression vector, it was ligated by treatment with a ligase.
  • a primer that creates a cleavage site sequence of restriction enzyme Bgl II at the 5' end was synthesized to create a restriction enzyme cleavage site by polymerase chain reaction, and the cleavage site sequence of restriction enzyme NotI was also synthesized at the 3' end.
  • a restriction enzyme cleavage site was created by synthesizing the primers to be made and by polymerase chain reaction.
  • the 5' end of the gene having a restriction enzyme cleavage site was treated with BglII, and the 3' end was treated with NotI due to the polymerase chain reaction.
  • the multicloning site of the expression vector was treated with BglII and NotI to allow the gene to be inserted. After mixing the restriction enzyme-treated gene with the expression vector, it was ligated by treatment with a ligase.
  • a recombinant vector PD-L1.CAR-T.pCDH-CMV- that recognizes PD-L1 and expresses a protein in which a human immunoglobulin G 1 heavy chain constant region and a signaling protein domain are fused (see FIG. 3 ).
  • MCS-EF1-copGFP and PD-L1.CAR-NK.pLNCX2 were completed (see FIGS. 2A and 2B ).
  • the expression of PD-L1 was confirmed in the Raji (ATCC) cell line, which is a B cell lymphoma-derived cell line.
  • Raji ATC
  • the cell line was treated with an antibody (biolegend) capable of binding to PD-L1 to which the fluorescent protein was attached, and then flow cytometry (fluorescence-activated cell sorting) was used.
  • flow cytometry fluorescence-activated cell sorting
  • a Raji cell line expressing PD-L1 was used as a target cell.
  • cytotoxic T cells were first isolated from human peripheral blood mononuclear cells. After purchasing human peripheral blood mononuclear cells (Medilab Korea), magnetic-activated cell sorting was used to isolate cytotoxic T cells. Peripheral blood mononuclear cells were combined with an antibody (CD8 + T cell biotin-conjugated antibody cocktail, Miltenyi Biotec) capable of binding to other immune cells except for cytotoxic T cells, and then the antibodies were re-conjugated with magnetic microbeads (anti- biotin microbead) (Miltenyi Biotec).
  • an antibody CD8 + T cell biotin-conjugated antibody cocktail, Miltenyi Biotec
  • magnetic microbeads anti- biotin microbead
  • the microbeads, antibodies and cells attached thereto were passed through a magnetic seperation column (Miltenyi Biotec) to obtain cytotoxic T cells not labeled with the antibody.
  • a magnetic seperation column Miltenyi Biotec
  • flow cytometry using CD8 and CD3 ⁇ , which are cell surface factors of cytotoxic T cells was performed, and as a result, the purity was greater than 95%.
  • cytotoxic T cells For activation of isolated cytotoxic T cells, 1 ⁇ 10 6 pieces/ml of magnetic beads coated with human CD3 and CD28 antibodies (Thermo Fisher Scientific), and 10% calf serum supplemented with 100 U/ ⁇ l recombinant human IL-2 Cells were reconstituted in RPMI (Welgene) at a density of 1.5 ⁇ 10 6 pieces/ml and cultured for 24 hours after inoculation in a 24-well cell culture dish.
  • Example 2 In order to introduce the recombinant vector prepared in Example 2 into cytotoxic T cells, a lentiviral system using 293FT cells (Thermo Fisher Scientific) was used.
  • 293FT cells were inoculated to become 2.5 ⁇ 10 6 cells in a 100 ⁇ cell culture dish, and then cultured in DMEM medium containing 10% calf serum. After 24 hours of incubation, when the cells have grown to cover 60-70% of the dish, 20 ⁇ g of PD-1.CAR-T.pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP vector DNA is mixed with 10 ⁇ g of psPAX2 (Addgene) and 3 ⁇ g pMD2.G (Addgene) vector was crystallized using calcium phosphate and Hepes-buffered solution, and then introduced into 293FT cells.
  • psPAX2 Additional phosphate
  • the culture supernatant containing the lentivirus was collected at intervals of 24 hours after 48 hours of the 293FT cells introduced with the expression vector.
  • the collected supernatant was centrifuged at 21,000 rpm in an ultra-high speed centrifuge for 2 hours to concentrate the virus.
  • the concentrated virus was mixed with 4 ⁇ g/ml of polybrene and added to the culture of activated cytotoxic T cells, the transduction was performed by centrifugation at 1,800 g for 75 minutes using a centrifuge. After centrifugation, the cytotoxic T cells were further cultured for 4 hours, and then replaced with an RPMI culture medium containing 10% calf serum.
  • Transduction efficiency was measured by using flow cytometry to measure the expression level of GFP inside the cells, and cytotoxic T cells (Mock) transduced with a virus prepared by using the transduced cytotoxic T cells (PD-1 CAR-T cells) as an empty vector. CAR-T cells) were compared in transduction rates (see FIG. 5a ).
  • Example 6 chimeric antigen receptor expression natural killer cells produce
  • 293GPG cells were dissolved in 10 ml of 10 ml of 10% calf serum-containing DMEM culture medium and inoculated in a 100 ⁇ cell culture dish and then cultured for 24 hours.
  • 20 ⁇ g of the previously prepared recombinant vector (PD-1.CAR-NK.pLNCX2 vector) was crystallized using calcium phosphate and Hepes-buffered solution, and then added to the culture medium of the previously cultured 293GPG cells. Thereafter, the culture medium was changed over 72 hours at 24 hour intervals, and the culture supernatant of 293GPG cells containing retrovirus was collected and stored.
  • the collected retrovirus-containing supernatant was centrifuged at 21,000 rpm for 2 hours using an ultra-high speed centrifuge, and then reconstituted in Myelocult H5100 culture medium (STEMCELL) containing 10% calf serum to be concentrated 100 times compared to before concentration.
  • NK92MI cells American type culture collection, ATCC
  • NK92MI cells were inoculated into a 24 well cell culture dish at a density of 5 ⁇ 10 5 /ml.
  • a mixed solution of 8 ug/ml of polybrene added to the concentrated retrovirus was added to the culture medium of NK92MI cells in culture and cultured for 24 hours. After culturing, the culture medium was replaced with a new culture medium.
  • the Myelocult H5100 culture medium supplemented with neomycin antibiotic 600 ⁇ g/ml was used to culture the retrovirus-treated NK92MI cells. After 14 days of neomycin selection, NK92MI cells were transferred to fresh culture medium and proliferated for 1 week.
  • NK92MI cells After proliferation, the PD-1 expression level of NK92MI cells was measured using flow cytometry. NK92MI cells introduced with PD-1.CAR-NK.pLNCX2 (PD-1 CAR-NK cells) and NK92MI cells introduced with the empty vector pLNCX2. The PD-1 expression level of (Mock CAR-NK cells) was compared using a flow cytometer using an anti-human PD-1 antibody (biolegend) (see Fig. 5b).
  • Example 7 chimeric Affinity determination of antigen receptors and human cell lines expressing PD-L1
  • the PD-1 CAR-T cells and PD-1 CAR-NK cells prepared in Examples 5 and 6
  • water-soluble recombinant human PD-L1 IgG R&D system
  • PD-1 CAR-T cells and PD-1 CAR-NK cells were treated with PD-1 CAR-T cells and PD-1 CAR-NK cells and confirmed by flow cytometry.
  • the water-soluble recombinant human PD-L1 IgG did not bind to Mock CAR-T cells, but bound to PD-1 CAR-T cells (see FIG.
  • PD-1 CAR-T cells and PD-1 CAR-NK cells expressing the chimeric antigen receptor prepared based on the above results were used as effector cells, and the Raji cell line expressing PD-L1 was used as target cells, PD-L1-specific cytotoxicity of PD-1 CAR-T cells and PD-1 CAR-NK cells was verified.
  • Raji cells (PD-L1 positive cells) selected in Example 3 ) were co-cultured with chimeric antigen receptor-expressing cytotoxic T cells (PD-1 CAR-T cells) or cytotoxic T cells (Mock T cells) introduced with the empty vector for 6 hours.
  • PD-1 CAR-T cells chimeric antigen receptor-expressing cytotoxic T cells
  • cytotoxic T cells cytotoxic T cells introduced with the empty vector for 6 hours.
  • a non-radioactive cytotoxicity assay that measures the degree of cytotoxicity of cytotoxic T cells to target cells by the amount of lactate dehydrogenase present in the supernatant after co-culture was performed. was used.
  • cytotoxic T cells (1x10 5 cells) and target cells (1x10 4 cells) into the wells of a 96-well cell culture dish, set the effector: target ratio to 10:1, and inoculate so that the volume per well becomes 100 ⁇ l Centrifuge for 4 minutes at 250 g using a centrifuge to close the intercellular space. After culturing for 6 hours, remove 50 ⁇ l of the supernatant from each well, transfer to a transparent 96-well dish for absorbance measurement, and process the assay solution and 1M hydrochloric acid solution to proceed and stop the enzymatic reaction.
  • the absorbance in the 490 nm wavelength band was measured and numerically converted using a fluorescence/luminescence/absorption meter (multi-detection plate reader) to quantify the degree of cytotoxicity of cytotoxic T cells in each well.
  • the prepared chimeric antigen receptor-expressing cytotoxic T cells (PD-1 CAR-T cells) showed a high toxicity of 16% or more to the Raji cell line, whereas the control cells introduced with the empty vector Toxic T cells (Mock CAR-T cells) showed 6% toxicity to the Raji cell line.
  • the chimeric antigen recognition receptor-expressing cytotoxic T cells containing the PD-1 extracellular domain showed cytotoxicity specific to the PD-L1 protein, and thus the CAR-T cells were used to treat related cancer cells. was able to confirm that it is possible.
  • Raji cells PD-L1 positive cells
  • the target cells selected in Example 3 were It was co-cultured with chimeric antigen receptor-expressing NK cells (PD-1 CAR-NK cells) or NK cells introduced with an empty vector (mock NK cells).
  • a non-radioactive cytotoxicity assay was used to measure the degree of cytotoxicity of NK cells to target cells by the amount of lactate dehydrogenase present in the supernatant after co-culture.
  • the absorbance of the 490 nm wavelength band was measured and numerically converted using a fluorescence/luminescence/absorption meter (multi-detection plate reader) to quantify the degree of cytotoxicity of NK cells in each well.
  • the prepared chimeric antigen receptor-expressing natural killer cells showed a high toxicity of 45% or more to the Raji cell line, while cytotoxicity introduced with the empty vector as a control.
  • T cells Mouse CAR-NK cells
  • the Raji cell line showed 8% toxicity.
  • the chimeric antigen-recognizing receptor-expressing NK cells containing the PD-1 extracellular domain showed cytotoxicity specific to the PD-L1 protein, so it is possible to treat related cancer cells using the CAR-NK cells. was able to confirm

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Abstract

본 발명은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체; 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드; 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 벡터로 형질전환된 세포; 및 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제 또는 암의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 PD-1의 세포외 도메인을 포함한다. 따라서, 상기 키메릭 항원 수용체를 과발현시킬 수 있는 벡터로 형질전환된 세포독성 T 세포 또는 자연살생세포의 경우 PD-L1을 발현하는 암종에 특이적으로 세포독성을 갖게되므로 암 치료를 위한 면역세포 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

PROGRAMMED DEATH-LIGAND 1(PD-L1)에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도
본 발명은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR); 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드; 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 벡터로 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포(Natural killer cell, NK cell); 및 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제 또는 암의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
Programmed death-ligand 1(PD-L1 또는 CD274 또는 B7-H1)은 40 kDa의 내재성 막 단백질(integral membrane protein)이며, 다양한 암종(malignant cells)과 골수유래 면역억제 세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs) 또는 면역세포에서 관찰된다(Iwai et al., 2002; Blank et al., 2004; Von Knethen and Brune, 2019). 특히 암세포는 PD-L1을 과발현하여 종양 항원 특이적 T 세포(tumor antigen-specific T cells)의 공격을 회피하게 된다(Okazaki and Honjo, 2007; Markham, 2016; Cao et al., 2019). 즉, 암세포가 PD-L1을 과발현하면, 종양 항원 특이적으로 활성화된 T 세포에서 발현되는 PD-L1의 수용체인 PD-1과 결합하고, PD-L1 / PD-1 신호전달을 통하여 종양 항원 특이적 T 세포의 활성을 억제하게 된다(Okazaki and Honjo, 2007; Markham, 2016; Cao et al., 2019). 이에 따라, PD-L1 / PD-1 신호전달을 억제할 수 있는 중화항체(면역관문 억제제, immune checkpoint inhibitor)가 개발되었고, 이러한 중화항체가 암을 좀 더 효과적으로 제거 할 수 있는 치료제로 각광받고 있다(Sznol and Chen, 2013; Homet Moreno et al., 2015). 지금까지 PD-L1을 발현하는 암종은 흑색종(melanoma), 폐암(lung cancer), 육종(Sarcoma), 신장암(renal-cell carcinoma), 림프종(lymphoma), 직장암(colorectal cancer), 위암(gastric cancer), 식도암(esophageal cancer), 진행된 고형암(advanced solid tumor), 유방암(breast cancer), 두경부암(head and neck cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer) 등이 있다(Zhang et al., 2020).
효과적인 암 치료를 위해서 직접적으로 암 세포를 표적하는 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocytes, CTL)와 자연살생세포(natural killer cell, NK cell)가 중요하다는 사실이 보고되어 왔다. 지금까지 세포독성 T 세포 또는 자연살생세포를 이용한 항암 치료에 대한 연구는 환자 유래 특정 암 항원을 환자의 세포독성 T 세포에 전달하여 활성을 유발하거나, 항체 의존성 세포 독성(antibody dependent cellular cytotoxicity)을 유발하고자 하였다(Galluzzi et al., 2018; Lu et al., 2020). 하지만, 최근에는 세포독성 T 세포와 자연살생세포를 이용한 새로운 항암 치료 방법이 도입되었다. 즉, 항원을 인식하는 항체의 단일사슬 Fv 단편(single-chain variable fragment, scFv) 부분을 CD3 제타(zeta) 또는 다른 단백질의 세포질내 신호전달 도메인(cytoplasmic signaling domain)에 접목시킨 도메인에 접목시킨 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 전달하는 방법으로 시도되었다. 키메릭 항원 수용체를 T 세포 또는 자연살생세포에 접목시키면 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)에 의한 신호 전달과 관계없이 단일사슬 Fv 단편의 특정 항원 인지만으로 T 세포 또는 자연살생세포의 항암 작용을 활성화시킬 수 있으며, 또한 HLA type에 제한적이지 않아 많은 사람들이 보편적으로 사용할 수 있는 보다 효율적인 치료 방법으로 이용할 수 있다. 실제로, 이러한 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포나 자연살생세포는 여러 암에서 효능을 보이고 있다(Holzinger et al., 2016; Pettitt et al., 2018; Wang et al., 2020).
한편, Programmed death 1(PD-1 또는 CD279)은 288개의 아미노산으로 구성된 1형 막 단백질(membrane protein)이며, T 세포가 활성화될 때 세포 표면에 발현하는 면역 글로불린(Ig) 수퍼 패밀리(immunoglobulin superfamily)에 속하는 내재성 막 단백질(integral membrane protein)이다(Ishida et al., 1992). 활성화된 T 세포에서 발현되는 PD-1은 그 리간드인 PD-L1과 결합하여, T 세포의 활성을 억제시키는 것으로 알려져 있다(Syn et al., 2017).
현재, 키메릭 항원 수용체(한국공개특허 제10-2017-0090506호)나 인간화 항-BCMA 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료에 관한 것으로, 면역 작동세포(effector cell)의 집단이 항 PD-L1 항체와 조합하여 병용투여 되는 방법(한국공개특허 제10-2017-0037626호)이 공개되어 있으나, PD-L1이 발현되는 암세포에 대한 결합 특이성을 갖는 PD-1 세포외 도메인(extracellular domain)을 항원 결합 도메인의 구성으로 한 키메릭 항원 수용체를 면역 항암 치료제로서 이용하는 발명에 대해서는 기재된 바 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 다양한 암세포에서의 PD-L1 발현이 확인 또는 유도된다는 점과, 상기 PD-L1과 PD-1의 결합이 가능하다는 점을 이용하여 PD-1의 세포외 도메인을 사용한 PD-L1을 발현하는 암 특이적 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포와 자연살생세포를 제작하고, 상기 T 세포 또는 자연살생세포가 PD-L1을 발현하는 세포에 특이적으로 세포독성 능력이 있음을 실험을 통해 확인하였다. 이 때, PD-1의 세포외 도메인 각각을 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)과 연결하는 융합 단백질을 만들어 신호 전달 강도를 증폭하였다. 즉, 기존의 키메릭 항원 수용체는 단일사슬 Fv 단편에 의해 항원을 인식하는 부위가 하나인 반면에, 본 발명자들이 고안한 키메릭 항원 수용체는 PD-1의 세포외 도메인 각각을 인간 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)과 연결시켜, 키메릭 항원 수용체 하나당 2개의 PD-1의 세포외 도메인이 항원을 인식하게 하여, 신호 전달 강도를 증폭하고자 하였다.
따라서 본 발명의 목적은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드, 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포를 포함하는, 세포 치료제 또는 PD-L1을 발현하는 암세포를 사멸시키는 암의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 항원 결합 부위인 세포외 도메인; 막관통 도메인; 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)로서, 상기 항원 결합 도메인은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 PD-1의 세포외 도메인을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드, 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포를 포함하는, 세포 치료제 또는 PD-L1을 발현하는 암세포를 사멸시키는 암의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 PD-1의 세포외 도메인을 포함한다. 따라서, 상기 키메릭 항원 수용체를 과발현시킬 수 있는 벡터로 형질전환된 세포독성 T 세포 또는 자연살생세포의 경우 PD-L1을 발현하는 암종에 특이적으로 세포독성을 갖게 되므로 암 치료를 위한 면역세포 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 각 도메인의 cDNA 구역을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 렌티바이럴 벡터의 모식도이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 레트로바이럴 벡터의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포독성 T 세포 또는 자연살생세포 표면에 발현하는 키메릭 항원 수용체의 모식도이다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 표적인 PD-L1을 발현하는 암세포에서 PD-L1의 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 세포독성 T 세포(PD-1 CAR-T cell)에서의 GFP의 발현 비율을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 레트로바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 자연살생세포(PD-1 CAR-T cell)에서의 PD-1의 발현 비율을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 세포독성 T 세포(PD-1 CAR-T cell)가 PD-L1을 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 레트로바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 자연살생세포(PD-1 CAR-NK cell)가 PD-L1을 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포독성 T 세포(PD-1 CAR-T cell) 또는 공벡터를 형질도입시킨 세포독성 T 세포(Mock T cell)를 작동 세포(effector cell)로 하여 PD-L1을 발현하는 암세포(Raji cell)에 대한 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 자연살생세포(PD-1 CAR-NK cell) 또는 공벡터를 형질도입시킨 자연살생세포(Mock NK cell)를 작동 세포(effector cell)로 하여 PD-L1을 발현하는 암세포(Raji cell)에 대한 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 하나의 양태로서, 항원 결합 도메인; 막관통 도메인; 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)로서, 상기 항원 결합 도메인은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 PD-1의 세포외 도메인을 포함하는, 키메릭 항원 수용체를 제공한다.
본 발명에서 "키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)"는 자연적으로 T 세포 또는 자연살생세포가 활성화하는데 필요한 항원 제시 세포(APC)나 항체의 매개 없이 원하는 항원에 결합하여 항원-항체 반응을 통해 T 세포의 활성화를 유도하고 해당 항원을 발현하는 세포를 공격할 수 있도록 하기 위해 T 세포 또는 자연살생세포에 발현시키기 위한 융합 단백질을 의미한다. 즉, T 세포 또는 자연살생세포에 발현시 항원에 결합하여 이들 세포들의 활성화를 유도하는 단백질이라고 볼 수 있다. 이를 통해 면역 반응을 일으키고자 하는 세포에 특이적인 항원을 인식하는 단백질일 수 있으며, 상기 면역 반응을 일으키고자 하는 세포는 특정 조직에 존재하거나 병변을 일으킨 조직을 이루는 세포를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체 단백질은 기능적 동등물을 포함할 수 있다. '기능적 동등물’이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 키메릭 항원 수용체 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. ‘실질적으로 동질의 생리활성’이란 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 가진 것을 의미한다.
본 발명은 또한 키메릭 항원 수용체의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 '단편', '유도체' 및 '유사체'는 본 발명의 키메릭 항원 수용체 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (1) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (2) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (3) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (4) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.
PD-1 단백질은 288개의 아미노산으로 구성된 1형 막 단백질(membrane protein)이며, T 세포가 활성화될 때 세포 표면에 발현하는 면역 글로불린(Ig) 수퍼 패밀리(immunoglobulin superfamily)에 속하는 내재성 막 단백질(integral membrane protein)이다.
상기 항원 결합 도메인은 신호전달을 증폭하기 위해 PD-1의 세포외 도메인 한 쌍을 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)에 각각 연결시킨 이합체(dimer) 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 PD-1의 세포외 도메인은 서열번호 1 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)은 서열번호 2 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "PD-L1"은 40 kDa의 내재성 막 단백질(integral membrane protein)이며, 다양한 암종(malignant cells)과 골수유래 면역억제 세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs) 또는 면역세포에서 관찰된다. 지금까지 PD-L1을 발현하는 암종은 흑색종(melanoma), 폐암(lung cancer), 육종(Sarcoma), 신장암(renal-cell carcinoma), 림프종(lymphoma), 직장암(colorectal cancer), 위암(gastric cancer), 식도암(esophageal cancer), 진행된 고형암(advanced solid tumor), 유방암(breast cancer), 두경부암(head and neck cancer), 난소암(ovarian cancer) 및 전립선암(prostate cancer)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "막관통 도메인(Transmembrane domain)"은 PD-1의 세포외 도메인과 보조자극, 필수 신호전달 도메인을 세포막 사이로 연결하는 부위이며, 세포내 신호 전달 도메인은 항원 결합 도메인의 결합에 의해 면역 세포의 면역반응을 활성화시키는 부위를 의미한다.
일 실시예에서, 상기 막관통 도메인은 CD28, CD3엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으며, 상기 CD8은 CD8α 또는 CD8β일 수 있으며, 바람직하게는 CD8α의 막관통 도메인일 수 있고, 이는 서열번호 3 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "세포내 신호전달 도메인"은 항원 결합 도메인에 결합에 의해 면역 세포의 면역반응을 활성화시키는 부위를 의미한다. 일 실시예에서, 상기 세포내 도메인은 CD28, 4-1BB, CD3 제타(zeta) 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체는 세포내 신호전달 도메인으로 CD28, 4-1BB, CD3 제타(zeta)를 이용함으로써 높은 활성으로 암 세포, 특히 PD-L1을 발현하는 암세포에 대한 사멸 효과를 나타낼 수 있다.
상기 CD28은 서열번호 4 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 4-1BB(CD137)은 서열번호 5 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, CD3 제타(zeta)는 NK 세포 활성화 도메인으로 기능하며, 서열번호 6 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
상기 항원 결합 도메인은 CD8α 신호 펩타이드를 포함할 수 있으며, 상기 CD8α 신호 펩타이드는 서열번호 7 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 다른 하나의 양태로서, 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 항원 수용체를 암호화하는 폴리 뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여 또는 상기 항원 수용체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 항원 수용체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리 뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명에 따른 또 다른 하나의 양태로서 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 당 분야에 공지된 벡터를 다양하게 사용할 수 있고, 상기 항원 수용체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
본 발명에서는 바람직한 일 실시예로서, 렌티-바이러스용 벡터 또는 레트로-바이러스용 벡터를 사용할 수 있으며, 본 발명의 하기 실시예에서는 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터(렌티-바이러스용 벡터)와 pLNCX2(레트로-바이러스용 벡터)를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 일시예에서, PD-L1에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 상기 벡터를 통해 세포에 도입하여 세포를 형질전환시킬 수 있다. 상기 세포는 T 세포, 종양 침윤 림프구, B 세포, 자연살생세포, 또는 NKT 세포일 수 있으며, 바람직하게는, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)또는 자연살생세포일 수 있다. 상기 세포는 골수, 말초혈액, 말초혈액단핵세포 또는 제대혈로부터 얻거나 제조될 수 있으며, 세포는 인간 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같이 본 발명의 키메릭 항원 수용체가 도입되어 형질전환된 세포는 PD-L1을 항원으로 인식하고 이와 강하게 결합하는 특징을 가진다.
본 발명에서, "키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(chimeric antigen receptor T cell, 이하 간략하게 'CAR-T 세포'라 약칭함)" 또는 "키메릭 항원 수용체 발현 NK 세포(chimeric antigen receptor NK cell, 이하 간략하게 'CAR-NK 세포'라 약칭함)"란 정상의 T 세포 또는 자연살생세포를 형질도입 등의 방법으로 본래의 T 세포 수용체 또는 NK cell 수용체가 아닌 암세포에 특이적으로 반응하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포 또는 NK cell을 의미한다. 이 수용체를 갖는 T 세포 또는 NK 세포는 표적세포(target cell)의 세포자살을 유도하여 세포독성을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 특히 CAR-T 세포나 CAR-NK 세포는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell) 또는 NK cell에 본 발명의 키메릭 항원 수용체가 도입된 세포일 수 있다. 상기 세포는 CAR-T 치료제의 기존 장점인 항암 특이적 표적 치료의 장점을 가지며, 특히, 본 발명의 CAR-T 세포나 CAR-NK 세포는 PD-L1을 발현하는 암세포를 인지하여 효과적으로 파괴할 수 있다.
따라서 본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 상기 세포를 포함하는 세포 치료제 또는 이를 유효성분으로 포함하는 암의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명의 용어, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
상세하게는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 PD-L1을 발현하는 암의 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 개체란, PD-L1을 발현하는 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한 없이 포함된다.
본 발명에 있어 치료 대상이 되는 암의 종류로는 흑색종(melanoma), 폐암(lung cancer), 육종(Sarcoma), 신장암(renal-cell carcinoma), 림프종(lymphoma), 직장암(colorectal cancer), 위암(gastric cancer), 식도암(esophageal cancer), 진행된 고형암(advanced solid tumor), 유방암(breast cancer), 두경부암(head and neck cancer), 난소암(ovarian cancer) 및 전립선암(prostate cancer)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 유전자 합성 방법에 의한 키메릭 항원 수용체 유전자의 클로닝
본 발명의 키메릭 항원 수용체를 제조하기 위해서 PD-1의 세포외 도메인 한 쌍을 각각 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)에 연결시킨 항원 인식 부위와 CD8α의 막관통 도메인, CD28, 4-1BB, CD3 제타(zeta) 각각의 세포내 도메인 부분의 단백질 암호화 서열을 유전자 데이터베이스(database)에서 확인하였다.
그 후 상기 도메인들을 이루는 염기서열의 종결 코돈 부분을 제외한 나머지 서열들을 하나로 이어 유전자 합성을 진행하였다. 유전자 합성의 정확도는 단백질 발현 플라스미드를 제작한 후 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 상기 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 각 도메인의 cDNA 구역을 나타낸 모식도를 도 1에 나타내었다.
실시예 2. 키메릭 항원 수용체 단백질 발현 플라스미드 제조
PD-L1을 인식하고, 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역과 신호전달 단백질 도메인을 융합시킨 재조합 단백질을 세포독성 T 세포와 자연살생세포에 발현시키기 위해, 해당 유전자를 렌티바이러스 유래 발현벡터인 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(System Biosciences) 또는 레트로바이러스 유래 발현벡터인 pLNCX2(Addgene)에 클로닝하였다.
먼저, pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터에 클로닝하기 위해서 5′말단에 제한효소 XbaI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들고, 3′말단에도 제한효소 NotI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들었다. 그 후 중합효소연쇄반응으로 인해 제한효소 절단 부위를 가진 유전자를 5′말단은 XbaI을 처리하였으며, 3′말단은 NotI을 처리하였다. 그리고 발현 벡터의 다중클로닝 자리를 XbaI과 NotI을 처리하여 유전자가 삽입될 수 있게 만들었다. 제한효소가 처리된 유전자와 발현 벡터를 섞어 준 다음, 결합 효소(ligase)를 처리하여 연결하였다.
다음, pLNCX2 벡터에 클로닝하기 위해서 5′말단에 제한효소 Bgl II의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들고, 3′말단에도 제한효소 NotI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들었다. 그 후 중합효소연쇄반응으로 인해 제한효소 절단 부위를 가진 유전자를 5′말단은 BglII를 처리하였으며, 3′말단은 NotI을 처리하였다. 그리고 발현 벡터의 다중클로닝 자리를 BglII과 NotI을 처리하여 유전자가 삽입될 수 있게 만들었다. 제한효소가 처리된 유전자와 발현 벡터를 섞어 준 다음, 결합 효소(ligase)를 처리하여 연결하였다.
그 결과, PD-L1을 인식하고, 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역과 신호전달 단백질 도메인을 융합시킨 단백질(도 3 참조)을 발현하는 재조합 벡터 PD-L1.CAR-T.pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 및 PD-L1.CAR-NK.pLNCX2를 완성하였다(도 2a 및 도 2b 참조).
실시예 3. PD-L1을 발현하는 사람 세포주 screening
PD-L1을 세포 표면에 발현하는 사람 세포주를 screening하기 위해서, B 세포 림프종(B cell lymphoma)유래 세포주인 Raji (ATCC) 세포주에서 PD-L1의 발현을 확인하였다. 발현 확인을 위해 형광단백질이 부착된 PD-L1과 결합이 가능한 항체(biolegend)를 세포주에 처리한 후, 유세포 분석(fluorescence-activated cell sorting)을 이용하였다. 분석결과, Raji 세포주에서 PD-L1을 발현하는 것을 확인하였다(도 4 참조).
상기 결과를 근거로 PD-L1을 발현하는 Raji 세포주를 표적세포(target cell)로 사용하였다.
실시예 4. 세포독성 T 세포 분리 및 활성화
본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 제작하기 위해 먼저 세포 독성 T 세포를 사람의 말초 혈액 단핵세포에서 분리하였다. 사람의 말초 혈액 단핵세포(메디랩 코리아)를 구입한 후, 세포독성 T 세포를 분리하기 위해서 자력이용 세포 분리법(magnetic-activated cell sorting)을 이용하였다. 말초 혈액 단핵세포들을 세포독성 T 세포를 제외한 다른 면역세포들과 결합 가능한 항체(CD8+ T cell biotin-conjugated antibody cocktail, Miltenyi Biotec)와 결합시킨 다음, 상기 항체들을 다시 자성을 가진 마이크로비드(anti-biotin microbead)(Miltenyi Biotec)와 결합시켰다. 상기 마이크로비드와 그에 붙은 항체, 세포들을 자기장 분리 칼럼(magnetic seperation column) (Miltenyi Biotec)에 통과시켜 그 중 항체로 표지되지 않은 세포독성 T 세포를 얻었다. 분리한 세포독성 T 세포의 순도를 확인하기 위하여 세포독성 T 세포의 세포표면 인자인 CD8과 CD3ε을 이용한 유세포 분석을 실시하였고 그 결과 95% 이상의 순도를 보였다.
분리한 세포독성 T 세포의 활성화를 위해 1Х106개/ml의 사람 CD3와 CD28 항체가 코팅된 자석비드(Thermo Fisher Scientific), 그리고 100 U/μl recombinant human IL-2가 첨가된 10% 송아지 혈청 함유 RPMI (Welgene)에 1.5Х106개/ml의 밀도로 세포를 재구성하여 24 웰(well) 세포 배양 접시에 접종 후 24시간 동안 배양하였다.
실시예 5. 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포 제작
상기 실시예 2를 통해 제작한 재조합 벡터를 세포독성 T 세포에 도입하기 위하여 293FT 세포(Thermo Fisher Scientific)를 사용한 렌티바이러스 시스템을 이용하였다.
먼저, 293FT 세포를 100π 세포 배양 접시에 2.5Х106 세포가 되도록 접종한 후, 10% 송아지 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포가 접시의 60~70% 정도를 덮을 정도로 자라면, 20μg의 PD-1.CAR-T.pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터 DNA를 10μg의 psPAX2(Addgene)와 3μg의 pMD2.G(Addgene) 벡터를 Calcium phosphate 및 Hepes-buffered solution을 이용하여 결정화시킨 후 293FT 세포에 도입하였다. 그 후, 상기 발현 벡터가 도입된 293FT 세포를 48시간 후 24시간 간격으로 렌티바이러스를 포함하는 배양 상층액을 모았다. 모은 상층액을 초고속 원심분리기를 21,000rpm으로 2시간 동안 원심분리하여 바이러스를 농축시켰다. 농축된 바이러스를 polybrene 4μg/ml과 혼합하여 활성화시킨 세포독성 T 세포의 배양액에 추가한 후 원심분리기를 이용해 1,800g로 75분 동안 원심분리하여 형질도입을 진행하였다. 원심 분리를 마친 세포독성 T 세포는 4시간 동안 추가 배양 후 10% 송아지 혈청 함유 RPMI 배양액으로 교체하였으며 48시간 후에는 형질도입한 세포독성 T 세포의 일부를 형질도입 효율 측정에 사용하였다. 형질도입 효율은 세포 내부의 GFP 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정했으며 형질도입된 세포독성 T 세포(PD-1 CAR-T cell)를 공벡터로 제작한 바이러스를 형질도입한 세포독성 T 세포(Mock CAR-T cell)의 형질도입 비율을 비교하였다(도 5a 참조).
실시예 6. 키메릭 항원 수용체 발현 자연살해세포 제작
상기 실시예 2를 통해 제작한 재조합 벡터를 NK 세포에 도입하기 위하여 293GPG 세포를 사용한 레트로바이러스 시스템을 이용하였다.
먼저, 293GPG 세포 3Х106개를 10ml의 10% 송아지 혈청 함유 DMEM 배양액 10ml에 풀어 100π 세포 배양 접시에 접종 후 24시간 동안 배양하였다. 앞서 제작한 재조합 벡터(PD-1.CAR-NK.pLNCX2 벡터) 20μg을 Calcium phosphate 및 Hepes-buffered solution을 이용하여 결정화시킨 후 앞서 배양한 293GPG 세포의 배양액에 첨가해주었다. 이후 24시간 간격으로 72시간에 걸쳐 배양액을 교체하며 레트로바이러스를 함유한 293GPG 세포의 배양 상층액을 채취 및 보관하였다.
상기 채취한 레트로바이러스 함유 상층액은 초고속 원심분리기를 이용하여 21,000 rpm으로 2시간 동안 원심분리 후 농축 이전 대비 100배로 농축될 수 있도록 10% 송아지 혈청 함유 Myelocult H5100 배양액(STEMCELL)에 재구성하였다. 농축한 레트로바이러스를 NK92MI 세포(American type culture collection, ATCC)에 형질도입하기 위해 NK92MI 세포를 24 well 세포 배양 접시에 5Х105/ml의 밀도로 접종하였다. 그 다음 농축된 레트로바이러스에 polybrene을 8ug/ml만큼 첨가한 혼합액을 배양 중인 NK92MI세포의 배양액에 추가한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새 배양액으로 교체하였으며 유전자가 도입된 세포의 선별을 위해 배양액 교체 후 24시간 후부터는 neomycin 항생제(600μg/ml)가 첨가된 Myelocult H5100 배양액을 이용하여 레트로바이러스를 처리해준 NK92MI세포를 배양하였다. 14일 간의 neomycin 선별과정을 마친 NK92MI 세포는 다시 신선한 배양액에 옮겨 1주일간 증식시켰다.
증식 후 유세포 분석을 이용해 NK92MI 세포의 PD-1 발현량을 측정하였으며 PD-1.CAR-NK.pLNCX2를 도입한 NK92MI 세포(PD-1 CAR-NK cell)와 공벡터인 pLNCX2를 도입한 NK92MI 세포(Mock CAR-NK cell)의 PD-1 발현량을 항 인간 PD-1 항체(biolegend)를 이용한 유세포분석기를 이용하여 비교하였다(도 5b 참조).
실시예 7. 키메릭 항원 수용체와 PD-L1을 발현하는 사람 세포주의 친화도 측정
상기 제작한 키메릭 항원 수용체가 PD-L1을 발현하는 사람 세포주와 친화도가 있는지 확인하기 위하여, 실시예 5 및 실시예 6에서 제작한 PD-1 CAR-T cell과 PD-1 CAR-NK cell이 PD-L1과 결합하는가를 측정하기 위해, 수용성 재조합 human PD-L1 IgG (R&D system)를 PD-1 CAR-T cell과 PD-1 CAR-NK cell에 처리하여 유세포 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과, 수용성 재조합 human PD-L1 IgG는 Mock CAR-T cell과 결합하지 않지만, PD-1 CAR-T cell과 결합하며(도 6a 참조), 또한 수용성 재조합 human PD-L1 IgG는 Mock CAR-NK cell과 결합하지 않지만, PD-1 CAR-NK cell과는 결합한다(도 6b 참조).
상기 결과를 근거로 제작한 키메릭 항원 수용체를 발현하는 PD-1 CAR-T cell과 PD-1 CAR-NK cell을 작동 세포(effector cell)로 PD-L1을 발현하는 Raji 세포주를 표적세포로, PD-1 CAR-T cell과 PD-1 CAR-NK cell의 PD-L1 특이적 세포독성을 검증하였다.
실시예 8. CAR-T 세포의 PD-L1+ cell 특이적 세포독성 검증
상기 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포가 PD-L1을 발현하는 세포를 특이적으로 인지하여 독성을 나타내는지 확인하기 위해, 실시예 3에서 선정한 표적세포인 Raji 세포(PD-L1 positive cell)를 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포(PD-1 CAR-T cell) 혹은 공벡터를 도입한 세포독성 T 세포(Mock T cell)와 6시간 동안 공배양하였다. 공배양 후 상층액에 존재하는 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)의 양으로 세포독성 T 세포의 표적세포(target cell)에 대한 세포독성 정도를 측정하는 비방사성 세포독성 분석법(non-radioactive cytotoxicity assay)을 이용하였다.
먼저, 96 well 세포 배양 접시의 well에 세포독성 T 세포(1x105 cell)와 표적세포(1x104 cell)를 각각 넣어 effector: target ratio를 10:1로 맞추고, well당 부피는 100μl가 되도록 접종 후 원심분리기를 이용해 250g 조건에서 4분 동안 원심분리하여 세포 간 간격을 가깝게 만든다. 6시간 배양 후 각 well의 상층액을 50μl씩 걷어내어 흡광도 측정용 투명 96 well 접시에 옮긴 후 분석용액 및 1M 염산용액을 처리하여 효소 반응을 진행 및 정지시킨다. 효소 반응을 정지시키고 난 후에는 형광/발광/흡광 측정기(multi-detection plate reader)를 이용하여 490nm 파장대의 흡광도를 측정 및 수치 변환하여 각 well의 세포독성 T 세포의 세포독성 정도를 정량화하였다.
그 결과 도 7a에서 나타낸 바와 같이, 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포(PD-1 CAR-T cell)는 Raji 세포주에 16% 이상의 높은 독성을 보인 반면, 대조군인 공벡터를 도입한 세포독성 T 세포(Mock CAR-T cell)의 경우 Raji 세포주에 6%의 독성을 나타내었다.
상기 결과를 통해 PD-1 세포외 도메인을 포함하고 있는 키메릭 항원 인지 수용체 발현 세포독성 T 세포가 PD-L1 단백질에 특이적인 세포독성을 보임으로써, 상기 CAR-T 세포를 이용하여 관련된 암 세포 치료가 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 9. CAR- NK 세포의 PD-L1+ cell 특이적 세포독성 검증
상기 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 NK 세포가 PD-L1을 발현하는 세포를 특이적으로 인지하여 독성을 나타내는지 확인하기 위해, 실시예 3에서 선정한 표적세포인 Raji 세포(PD-L1 positive cell)를 키메릭 항원 수용체 발현 NK 세포(PD-1 CAR-NK cell) 혹은 공벡터를 도입한 NK 세포(Mock NK cell)와 공배양하였다.
공배양 후 상층액에 존재하는 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)의 양으로 NK 세포의 표적세포에 대한 세포독성 정도를 측정하는 비방사성 세포독성 분석법(non-radioactive cytotoxicity assay)을 이용하였다.
먼저, 96 well 세포 배양 접시의 well에 자연살해세포(1x105 cell)와 표적세포(1x104 cell)를 각각 넣어 effector: target ratio를 10:1로 맞추고, well당 부피는 100μl가 되도록 접종 후 원심분리기를 이용해 250g의 조건에서 4분 동안 원심분리하여 세포간 간격을 가깝게 만든다. 6시간 배양 진행 후 각 well의 상층액을 50μl씩 걷어내어 흡광도 측정용 투명 96 well 접시에 옮긴 후 분석용액 및 1M 염산용액을 처리하여 효소 반응을 진행 및 정지시킨다. 효소 반응을 정지시키고 난 후에는 형광/발광/흡광 측정기(multi-detection plate reader)를 이용하여 490nm 파장대의 흡광도를 측정 및 수치 변환하여 각 well의 NK 세포의 세포독성 정도를 정량화하였다.
그 결과 도 7b에서 나타낸 바와 같이, 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 자연살생세포(PD-1 CAR-NK cell)는 Raji 세포주에 45% 이상의 높은 독성을 보인 반면, 대조군인 공벡터를 도입한 세포독성 T 세포(Mock CAR-NK cell)의 경우 Raji 세포주에 8%의 독성을 나타내었다.
상기 결과를 통해 PD-1 세포외 도메인을 포함하고 있는 키메릭 항원 인지 수용체 발현 NK 세포가 PD-L1 단백질에 특이적인 세포독성을 보임으로써, 상기 CAR-NK 세포를 이용하여 관련된 암 세포 치료가 가능함을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (15)

  1. 항원 결합 도메인;
    막관통 도메인; 및
    세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)로서, 상기 항원 결합 도메인은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 PD-1의 세포외 도메인을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인은 PD-1의 세포외 도메인 한 쌍이 이합체(dimer)의 형태로 각각 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)에 연결된 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 PD-1의 세포외 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  4. 제2항에 있어서,
    인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 CD8α이며, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB 및 CD3-zeta로 이루어진 것 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 CD28은 서열번호 4; 4-1BB은 서열번호 5; 및 CD3-zeta은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인은 CD8α 신호 펩타이드를 포함하며, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드.
  10. 제9항의 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  11. 제10항의 벡터로 형질전환된 세포.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 세포는 세포독성 T 세포 또는 NK 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  13. 제12항의 세포를 유효성분으로 포함하는 PD-L1을 발현하는 암의 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 PD-L1을 발현하는 암은 흑색종(melanoma), 폐암(lung cancer), 육종(Sarcoma), 신장암(renal-cell carcinoma), 림프종(lymphoma), 직장암(colorectal cancer), 위암(gastric cancer), 식도암(esophageal cancer), 진행된 고형암(advanced solid tumor), 유방암(breast cancer), 두경부암(head and neck cancer), 난소암(ovarian cancer) 및 전립선암(prostate cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제11항의 세포를 포함하는 세포 치료제.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9790282B2 (en) * 2013-03-25 2017-10-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-CD276 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors
KR20190096969A (ko) * 2016-12-22 2019-08-20 윈드밀 테라퓨틱스, 인크. 면역계를 조절하기 위한 조성물 및 방법
WO2020010284A1 (en) * 2018-07-04 2020-01-09 Cytoimmune Therapeutics, LLC Compositions and methods for immunotherapy targeting flt3, pd-1, and/or pd-l1
KR20200070236A (ko) * 2017-09-26 2020-06-17 롱우드 유니버시티 면역치료제로서의 pd1-특이적 키메라 항원 수용체

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3172237A2 (en) 2014-07-21 2017-05-31 Novartis AG Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
CN108064252A (zh) 2014-12-19 2018-05-22 达纳－法伯癌症研究所公司 嵌合抗原受体及其使用方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9790282B2 (en) * 2013-03-25 2017-10-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-CD276 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors
KR20190096969A (ko) * 2016-12-22 2019-08-20 윈드밀 테라퓨틱스, 인크. 면역계를 조절하기 위한 조성물 및 방법
KR20200070236A (ko) * 2017-09-26 2020-06-17 롱우드 유니버시티 면역치료제로서의 pd1-특이적 키메라 항원 수용체
WO2020010284A1 (en) * 2018-07-04 2020-01-09 Cytoimmune Therapeutics, LLC Compositions and methods for immunotherapy targeting flt3, pd-1, and/or pd-l1

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LE QIN;RUOCONG ZHAO;DONGMEI CHEN;XINRU WEI;QITING WU;YOUGUO LONG;ZHIWU JIANG;YANGQIU LI;HAIPENG WU;XUCHAO ZHANG;YILONG WU;SHUZHONG: "Chimeric antigen receptor T cells targeting PD-L1 suppress tumor growth", BIOMARKER RESEARCH, BIOMED CENTRAL LTD, LONDON, UK, vol. 8, no. 1, 3 June 2020 (2020-06-03), London, UK , pages 1 - 12, XP021277740, DOI: 10.1186/s40364-020-00198-0 *
LINDNER S. E, JOHNSON S. M., BROWN C. E., WANG L. D.: "Chimeric antigen receptor signaling: Functional consequences and design implications", SCIENCE ADVANCES, vol. 6, no. 21, 22 May 2020 (2020-05-22), pages 1 - 8, XP055975073, DOI: 10.1126/sciadv.aaz3223 *

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