KR102231285B1

KR102231285B1 - Vla-4에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102231285B1
Application number: KR1020190105907A
Authority: KR
Inventors: 전태훈; 양준; 이창희; 강석진; 박인병
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2021-03-22
Also published as: KR20210025905A

Abstract

본 발명은 VLA-4에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체; 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드; 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 벡터로 형질전환된 세포; 상기 세포를 포함하는 세포치료제; 및 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 키메릭 항원 수용체는 VLA-4를 인지하는 VCAM-1의 세포외 도메인과 T 세포의 신호 전달에 중요한 작용을 하는 CD8의 막관통 도메인, CD28, 4-1BB, CD3-zeta 각각의 세포내 도메인을 결합한 재조합 단백질로서, 이를 과발현시킬 수 있는 벡터로 형질전환된 세포독성 T 세포의 경우 다발성골수종에 특이적으로 세포독성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 의한 키메릭 항원 수용체를 과발현하는 세포독성 T 세포는 다발성골수종 치료를 위한 세포치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

VLA-4에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도{Chimeric antigen receptor specifically binding to VLA-4 and use thereof}

본 발명은 VLA-4에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체; 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드; 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 벡터로 형질전환된 세포; 상기 세포를 포함하는 세포치료제; 및 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

다발성골수종은 골수 내에 있는 형질세포의 비이상적인 증식에 의해 발생하는 질병이다(Rajkumar et al., 2014). 이 질병은 골용해성 병변, 빈혈, 신부전 그리고 면역저하에 따른 세균감염의 특징을 가진다. 전세계적으로 비호즈킨성 림프종(non-Hodgkin lymphoma) 다음으로 발병율이 높은 혈액암이며(Rajkumar and Harousseau, 2016), 국내에서는 인구 10만명 당 3명 정도 발생하며, 발병 연령은 평균 67세로 70대 이상의 고령환자가 30%를 차지한다(국립암센터, 2015).

다발성골수종의 치료는 항암화학요법을 기본으로 하는데, 주로 이용되는 약제로는 프로테아좀 억제제(proteasome inhibitor)인 보르테조밉(bortezomib, 상품명=Velcade), 면역조절제인 lenalidomide(레날리도마이드) 등이 주로 사용되고 있다(Rajkumar and Harousseau, 2016). 이 밖에도 덱사메타손(dexamethasone)을 주사제로 주입하여 치료하는 방법이 있다(Palumbo et al., 2011). 만약 화학요법이 효과가 없는 경우 조혈모세포 이식을 통해 치료한다(Rajkumar and Harousseau, 2016). 지금까지 사용되는 화학요법의 경우 완치에 어려움이 있으며, 조혈모세포 이식은 다발성골수종의 대다수를 차지하는 고령의 환자에게는 불가능하다는 단점이 있다. 따라서 다발성골수종에 대한 새로운 치료제의 개발이 시급하다.

효과적인 암 치료를 위해서 직접적으로 암 세포를 표적하는 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocytes, CTL)가 중요하다는 사실이 보고되어 왔다. 지금까지 T 세포 치료를 이용한 항암 치료에 대한 연구는 환자의 T 세포에 특정 항원을 인식하는 TCR(T cell receptor)을 전달하거나 또는 항원을 인식하는 항체의 scFv 부분을 CD3 신호전달 도메인에 접목시킨 키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)를 전달하는 방법으로 시도되었다. 키메릭 항원 수용체를 T 세포에 접목시키면 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)에 의한 신호 전달과 관계없이 scFv의 특정 항원 인지만으로 T 세포를 항암 작용을 활성화시킬 수 있으며, 또한 HLA type에 제한적이지 않아 효율적인 치료 방법으로 이용할 수 있다. 이러한 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포는 여러 암에서 효능을 보이며, 특히 혈액암에서 치료 효과가 높은 것으로 알려져 있다(Holzinger et al., 2016; Pettitt et al., 2018).

한편, Very Late Antigen-4 (VLA-4)는 세포가 골수에 존재하기 위해 필요한 세포부착 단백질이다. 특히, 다발성골수종 세포에서 VLA-4의 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다(Vij et al., 2016; Touzeau et al., 2016). 이러한 VLA-4의 발현 증가는 다발성골수종세포가 안정적으로 골수 내에 존재할 수 있게 해준다. 또한, 다발성골수종 세포에서는 VLA-4의 구조적 변화를 유도하여 외부의 신호를 더욱 강하게 전달할 수 있도록 하는데, 이러한 구조적 변화로 인한 신호전달의 증가는 세포의 이동이나 분열이 잘 일어나도록 하며 항암제에 대한 내성이 올라간다(Vij et al., 2016; Touzeau et al., 2016). VLA-4는 골수 내에서 또 다른 세포부착 단백질인 VCAM-1과 강하게 결합한다(Chakraborty et al., 2015).

이러한 배경하에, 본 발명자들은 다발성골수종 세포에서의 VLA-4 발현이 증가한다는 점과, 상기 VLA-4가 VCAM-1과 결합이 가능하다는 점을 이용하여 VCAM-1을 사용한 다발성골수종 특이적 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포를 제작하였다. VLA-4를 인지하여 결합하는 VCAM-1의 세포외 도메인과 해당 도메인이 다발성골수종 세포와 결합 시 다발성골수종과 세포독성 T 세포가 결합하였다는 것을 세포 내부로 신호를 전달해 줄 수 있고, 세포독성 T 세포를 활성화시켜 다발성골수종에 대한 세포독성을 가질 수 있게 하는 CD8의 막관통 도메인, CD28, 4-1BB, CD3-zeta 각각의 세포내 도메인과 결합한 재조합 단백질을 발현하는 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포를 제작하였다. 또한, 상기 T 세포가 다발성골수종 모델 세포주에 특이적으로 세포독성 능력이 있음을 체외 실험을 통해 확인하였다. 따라서, 본 발명에 의해서 고안된 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포는 다발성골수종과 같은 혈액암 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

한국공개특허 제10-2019-0057366호

따라서 본 발명의 목적은 VLA-4에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포를 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 VCAM-1의 세포외 도메인; 막관통 도메인; 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는, VLA-4에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB 및 CD3-zeta로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 폴리 뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 표시될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포는 세포독성 T 세포일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈액암은 다발성 골수종(multiple myeloma), B세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma, NHL), B세포 만성림프성 백혈병(B-cell chronic lymphocytic leukemia, B-CLL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL) 및 T세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 키메릭 항원 수용체는 VLA-4를 인지하는 VCAM-1의 세포외 도메인과 T 세포의 신호 전달에 중요한 작용을 하는 CD8의 막관통 도메인, CD28, 4-1BB, CD3-zeta 각각의 세포내 도메인을 결합한 재조합 단백질로서, 이를 과발현시킬 수 있는 벡터로 형질전환된 세포독성 T 세포의 경우 다발성골수종에 특이적으로 세포독성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 의한 키메릭 항원 수용체를 과발현하는 세포독성 T 세포는 다발성골수종과 같은 혈액암 치료를 위한 세포치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 벡터의 모식도이며, 도 1b는 본 발명의 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 2a는 역전사 중합효소연쇄반응을 이용하여 VLA-4를 형성하는 물질인 CD49d(α4)와 CD29(β1)의 발현을 확인한 결과이다.
도 2b는 유세포 분석을 통하여 VLA-4를 형성하는 물질인 CD49d(α4)의 발현을 확인한 결과이다.
도 3a는 본 발명의 키메릭 항원 수용체 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입 시킨 세포독성 T 세포(VCAM CAR-T/T cell)에서의 copGF의 발현 비율을 세포독성 T 세포(Negative control) 혹은 공벡터를 형질도입시킨 세포독성 T 세포(Mock/T cell)와 비교한 그림이다.
도 3b는 본 발명의 키메릭 항원 수용체 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입 시킨 세포독성 T 세포(VCAM-1 CAR-T/T cell)에서의 VCAM-1의 발현 비율을 세포독성 T 세포(Negative control) 혹은 공벡터를 형질도입시킨 세포독성 T 세포(Mock/T cell)와 비교한 그림이다.
도 4는 본 발명의 키메릭 항원 수용체를 발현하는 세포독성 T 세포(VCAM-1 CAR-T / T cell)와 공벡터를 형질도입 시킨 세포독성 T 세포(Mock / T cell)를 다발성골수종 세포와 다양한 세포 수의 비율로 공배양한 다음 세포독성을 측정한 결과이다.

본 발명은 VLA-4에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 제공한다.

본 발명에서 "키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)"는 자연적으로 T 세포가 활성화하는데 필요한 항원 제시 세포(APC)의 매개없이 원하는 항원에 결합하여 항원-항체 반응을 통해 T 세포의 활성화를 유도하고 해당 항원을 발현하는 세포를 공격할 수 있도록 하기 위해 T 세포에 발현시키기 위한 융합 단백질을 의미할 수 있다. 곧, T 세포에 발현시 항원에 결합하여 T 세포의 활성화를 유도하는 단백질이라고 볼 수 있다. 이를 통해 면역 반응을 일으키고자 하는 세포에 특이적인 항원을 인식하는 단백질일 수 있으며, 상기 면역 반응을 일으키고자 하는 세포는 특정 조직에 존재하거나 병변을 일으킨 조직을 이루는 세포를 의미할 수 있다.

본 발명에서 "VLA-4(Very Late Antigen-4)"는 인테그린 α4β1로 불리는 인테그린 다이머(integrin dimer)로서 CD49d (alpha 4) 및 CD29 (beta 1)로 구성되어 있다. VLA-4는 세포가 골수에 존재하기 위해 필요한 세포부착 단백질로서 특히 다발성골수종 세포에서 VLA-4의 발현이 증가한다고 알려져 있다. 또한, VLA-4는 골수 내에서 또 다른 세포부착 단백질인 VCAM-1과 강하게 결합하는 특징을 가진다.

본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체는 VCAM-1의 세포외 도메인; 막관통 도메인; 및 세포 내 신호전달 도메인 포함한다.

본 발명의 VCAM-1의 세포외 도메인은 항원 결합 도메인에 해당하며, 상기 도메인은 항원에 해당하는 VLA-4에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 "VCAM-1"은 vascular cell adhesion molecule-1의 약어이며, 이는 서열번호 3 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 막통과 도메인 (Transmembrane domain)은 VCAM-1의 세포외 도메인과 보조자극, 필수 신호전달 도메인을 세포막 사이로 연결하는 부위이며, 세포내 신호 전달 도메인은 항원 결합 도메인의 결합에 의해 면역 세포의 면역반응을 활성화 시키는 부위를 의미한다.

본 발명의 키메릭 항원 수용체의 일 구성요소인 막통과 도메인은 CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막통과 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 막통과 도메인은 CD8의 막통과 도메인일 수 있고, 이는 서열번호 4 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 키메릭 항원 수용체의 일 구성요소인 세포내 신호전달 도메인은 항원 결합 도메인에 결합에 의해 면역 세포의 면역반응을 활성화시키는 부위를 의미한다. 본 발명의 일 구현예로서, 상기 세포내 도메인은 CD28, 4-1BB, CD3 제타 (zeta) 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 키메릭 항원 수용체는 세포내 도메인으로 CD28, 4-1BB, CD3 제타 (zeta)를 이용함으로써 높은 활성으로 암 세포, 특히 VLA-4를 발현하는 다발성골수종 세포에 대한 사멸효과를 나타낼 수 있다.

이 경우, CD28은 서열번호 5 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; 4-1BB(CD137)은 서열번호 6 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; CD3 제타 (zeta)는 NK 세포 활성화 도메인으로 기능하며, 서열번호 7 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어 질 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체 단백질의 범위는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. ‘기능적 동등물’이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. ‘실질적으로 동질의 생리활성’이란 VLA-4에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 가진 것을 의미한다.

본 발명은 또한 키메릭 항원 수용체의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 ‘단편’, ‘유도체’ 및 ‘유사체’는 본 발명의 키메릭 항원 수용체 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ⅱ) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (ⅲ) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (ⅳ) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

또한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 기술한 ‘VLA-4에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체’를 코딩 (암호화)할 수 있는 폴리 뉴클레오티드이다. 본 발명의 항원 수용체를 암호화하는 폴리 뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여 또는 상기 항원 수용체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 항원 수용체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리 뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 일 구현예로서, 상기 폴리 뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열일 수 있다.

또한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포이다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 당 분야에 공지된 벡터를 다양하게 사용할 수 있고, 상기 항원 수용체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator), 인핸서 (enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

본 발명에서는 바람직한 일 예로서, 렌티-바이러스용 벡터를 사용할 수 있으며, 본 발명의 하기 실시예에서는 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터를 사용하였다(도 1b 참조).

또한 본 발명의 VLA-4에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 상기 벡터를 통해 세포에 도입하여 세포를 형질전환 시킬 수 있다. 상기 세포는 T 세포, 종양 침윤 림프구, B 세포, NK 세포, 또는 NK-T 세포일 수 있으며, 바람직하게는, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 골수, 말초혈액, 말초혈액단핵세포 또는 제대혈로부터 얻거나 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 기술한 벡터를 이용하여 VLA-4에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)에 형질전환 시킬 수 있다.

상기와 같이 본 발명의 키메릭 항원 수용체가 도입되어 형질전환된 세포는 VLA-4를 항원으로 인식하고 이와 강하게 결합하는 특징을 갖는다.

본 발명에서, "키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(chimeric antigen receptor T cell, 이하 간략하게 ‘CAR-T 세포’라 약칭함)"란 정상의 T 세포를 형질도입 등의 방법으로 본래의 T 세포 수용체가 아닌 암세포에 특이적으로 반응하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 의미한다. 이 수용체를 갖는 T 세포는 타겟 세포의 세포자살을 유도하여 세포독성을 나타낸다.

본 발명에 있어, 특히 CAR-T 세포는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)에 본 발명의 키메릭 항원 수용체가 도입된 세포일 수 있다. 상기 세포는 CAR-T 치료제의 기존 장점인 항암 특이적 표적 치료의 장점을 가지며, 특히, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 장착시킨 세포독성 T 세포는 VLA-4를 발현하는 다발성골수종 세포를 인지하여 효과적으로 파괴할 수 있다.

따라서 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 세포를 포함하는 세포치료제; 이를 유효성분으로 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 상기 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법이다.

본 발명에 있어 상기 세포는, 예를 들어, T 세포, 종양 침윤 림프구, 자연 살해 세포(Natural Killer cell), 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 또는 전구 세포(progenitor cell), 예를 들어, 조혈 줄기세포, 중간엽 간질 세포, 줄기세포, 전분화능 줄기세포, 및 배아 줄기세포일 수 있으며, 이들은 항암치료 등의 세포 요법에 사용될 수 있다. 세포는 공여자로부터 올 수 있거나, 환자로부터 얻어진 세포가 될 수 있다. 세포는 예를 들어, 병에 걸린 세포의 기능을 대체하는 재생에 사용될 수 있다. 세포는 또한 이종 유전자를 발현하도록 변형되어 생물학 제제가, 예를 들어, 병에 걸린 골수 또는 전이성 침착물과 같은 특정 미세 환경으로 전달될 수 있다.

본 발명에서, "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명의 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 혈액암을 억제시키거나 발생을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 혈액암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

상세하게는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 혈액암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 개체란, 혈액암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한없이 포함된다.

본 발명에 있어 치료 대상이 되는 혈액암의 종류로는 다발성 골수종(multiple myeloma), B세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma, NHL), B세포 만성림프성 백혈병(B-cell chronic lymphocytic leukemia, B-CLL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL), T세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)으로 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

유전자 합성 방법에 의한 유전자의 클로닝

본 발명의 키메릭 항원 수용체를 제조하기 위해서 VCAM-1의 세포외 도메인과 CD8의 막관통 도메인, CD28, 4-1BB, CD3-zeta 각각의 세포내 도메인 부분의 단백질 암호화 서열을 유전자 데이터베이스(database)에서 확인하였다. 그리고 이 도메인들을 이루는 염기서열의 종결 코돈 부분을 제외한 나머지 서열들을 하나로 이어서 유전자 합성을 진행하였다. 유전자 합성의 정확도는 단백질 발현 플라스미드를 제작한 후 시퀀싱을 통하여 확인하였다.

<실시예 2>

단백질 발현 플라스미드 제조

VCAM-1의 세포외 도메인과 T 세포 신호 전달 단백질이 융합된 재조합 단백질(본 발명의 키메릭 항원 수용체 단백질, 이하 “VCAM-1 CAR-T”로 약칭함)을 발현 시키기 위해, 서열번호 2로 표시되는 해당 유전자를 렌티바이러스 유래 포유류 발현벡터인 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(System Biosciences, Catalog # CD511B-1)에 클로닝 하였다. 먼저 5′말단에 제한효소 NheI 의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들고, 3′말단에도 제한효소 NotI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들었다. 그 후 중합효소연쇄반응으로 인해 제한효소 절단 부위를 가진 유전자를 5′말단은 NheI을 처리하였으며, 3′말단은 NotI을 처리하였다. 그리고 발현 벡터의 다중클로닝 자리를 NheI과 NotI을 처리하여 유전자가 삽입될 수 있게 만들었다. 제한효소가 처리된 유전자와 발현 벡터를 섞어 준 다음 결합효소(ligase)를 처리하여 연결을 하였다. 그 결과 VCAM-1 세포외 도메인과 T 세포 신호 전달 단백질이 융합된 단백질을 발현하는 재조합 벡터 VCAM-1 CAR-T/pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP를 완성하였다(도 1a와 1b 참조).

<실시예 3>

VLA-4를 발현하는 세포주 확인

본 발명의 키메릭 항원 수용체를 발현하는 T 세포의 다발성골수종 특이적 세포독성을 확인하기 위하여, B 림프구 유래 세포주인 SP2/0 세포(mouse myeloma, ATCC CRL-1581, H-2^d haplotype)를 이용하였다. 먼저 VCAM-1과 결합이 가능한 물질인 VLA-4의 발현을 확인하기 위하여 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction)과 유세포 분석(fluorescence-activated cell sorting)을 이용하여 SP2/0 세포의 VLA-4 발현을 확인하였으며, 이때 사용한 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.

SP2/0 세포주의 VLA-4 발현을 확인하기 위해 사용한 프라이머 서열

Gene name	Primer	Sequence (5'-3')
GAPDH	Forward	AATCGTAGAGGATTCAGTCCT
GAPDH	Reverse	ACTGAATTCCAGAATCCTCGG
CD49d	Forward	GGAAGACATGCCTGGAGGAGA
CD49d	Reverse	ATGTCCTAGCTCCAACTGAGTAG

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, SP2/0 세포에서 VLA-4를 발현하는 것으로 확인되었는바, 상기 세포는 본 발명의 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포의 다발성골수종 특이적 세포독성 실험에 이용할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 4>

세포독성 T 세포 분리 및 활성화

본 발명의 키메릭 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 제작하기 위해 먼저 세포 독성 T 세포를 생쥐에서 분리하였다. 8주령 Balb/c 생쥐의 비장을 수술용 가위와 포셉을 이용하여 채취한 다음 마이크로슬라이드(frosted microslide) 및 70μm 세포여과기를 이용해 단일 세포로 분리하였다. 분리한 단일 세포들에서 세포독성 T 세포를 분리하기 위해서 자력이용 세포 분리법(magnetic-activated cell sorting)을 이용하였다. 앞서 분리한 비장유래 단일 세포들을 세포독성 T 세포를 제외한 다른 면역세포들과 결합 가능한 항체(CD8+ T cell biotin-conjugated antibody cocktail)와 결합시킨 다음 이 항체들을 다시 자성을 가진 마이크로비드(anti-biotin microbead)와 결합시켰다. 이 마이크로비드와 그에 붙은 항체, 세포들을 자기장 분리 칼럼(magnetic seperation column)에 통과시켜 그 중 항체로 표지되지 않은 세포독성 T 세포를 얻었다. 분리한 세포독성 T 세포의 순도를 확인하기 위하여 세포독성 T 세포의 세포표면 인자인 CD8과 TCRβ를 이용한 유세포 분석을 실시하였다.

분리한 세포독성 T 세포의 활성화를 위해 1μg/ml anti-CD3ε 항체, 0.5μg/ml anti-CD28 항체, 그리고 100U/μl recombinant human IL-2가 첨가된 10% 송아지 혈청 함유 RPMI에 1.5×10⁶/ml의 밀도로 세포를 재구성하여 6 웰(well) 세포 배양 접시에 접종 후 24시간 배양하였다. 참고로, 상기 anti-CD3ε 항체는 BD pharmigen로부터 구입하였으며, anti-CD28 항체는 Biolegend로부터 구입하였고, RPMI는 Welgene로부터 구입하였다.

<실시예 5>

키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포 제작

상기 실시예 2를 통해 제작한 재조합 벡터를 세포독성 T 세포에 도입하기 위하여 293FT 세포(Thermo Fisher Scientific社)를 사용한 렌티 바이러스 시스템을 이용하였다.

먼저, 293FT 세포를 100π 세포 배양 접시에 2.5×10⁶ 세포가 되도록 접종 한 후, 10% 송아지 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포가 접시의 60~70% 정도를 덮을 정도로 자라면, 20μg의 VCAM-1 CAR-T/pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터 DNA를 10μg의 psPAX2(Addgene)와 3μg의 pMD2.G(Addgene) 벡터와 함께 Calcium phosphate를 사용하여 293FT 세포에 도입하였다. 그 후, 상기 발현 벡터가 도입된 293FT 세포를 48시간 후 24시간 간격으로 바이러스(렌티바이러스)를 포함하는 배양 상층액을 모았다. 모은 상층액을 초고속 원심분리기를 21000rpm으로 2시간 원심분리하여 바이러스를 농축시켰다. 농축된 바이러스를 polybrene 0.8μg/ml과 혼합하여 활성화시킨 세포독성 T 세포의 배양액에 추가한 후 원심분리기를 이용해 4500rpm, 1시간 30분 원심분리하여 형질도입을 진행하였다. 원심 분리를 마친 세포독성 T 세포는 4시간 추가 배양 후 10% 송아지 혈청 함유 RPMI 배양액으로 교체하였으며 24시간 후에는 형질도입한 세포독성 T 세포의 일부를 형질도입 효율 측정에 사용하였다. 이 때, 세포독성 T 세포의 형질도입 효율을 세포내부의 copGFP 발현 비율 및 세포표면 VCAM-1 발현 비율로 유세포 분석기를 통하여 확인을 하였다. 형질도입된 세포독성 T 세포(VCAM-1 CAR-T/T cell)를 공벡터로 제작한 바이러스를 형질도입한 세포독성 T 세포(Mock/T cell)의 형질도입 비율과 비교한 결과는 도 3에 나타내었다.

<실시예 6>

다발성골수종 모델 세포주와의 공배양을 통한 VLA-4 발현 세포 특이적 세포독성 검증

제작한 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포가 다발성골수종 세포를 특이적으로 인지하여 독성을 나타내는지 확인하기 위해 다발성골수종 세포와 체외 공배양을 통해 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)를 이용한 비방사성 세포독성 분석법(non-radioactive cytotoxicity assay)을 진행하였다.

먼저 96 well 세포 배양 접시의 well에 표적 세포를 1.0×10⁴개씩 넣고, 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포(VCAM-1/CD8+ T cell) 혹은 공벡터를 도입한 세포독성 T 세포(Mock/CD8+ T cell)와 세포수의 비율을 1:1에서 1:50 비율로 100μl의 액체 배지에 접종하였다. 접종 후 원심분리기를 이용해 2000rpm, 5분 원심분리하여 세포간 간격을 가깝게 만든다. 6시간 배양 후 각 well의 상층액을 50μl씩 흡광도 측정용 투명 96 well 접시에 옮긴 후 분석용액과 3M 염산 용액을 처리하여 효소 반응을 진행 및 정지 시킨다. 효소반응이 끝나고 나면 형광/발광/흡광 측정기(mult-detection plate reader)를 이용하여 490nm 파장대의 흡광도를 측정하여 각 well의 세포독성 T 세포의 세포독성 정도를 정량화하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포에서 다발 골수종 모델 세포주인 SP2/0가 용혈되는 것을 확인할 수 있다. 또한 공배양한 세포 수의 비를 비교할 때, 적은 양의 세포독성 T세포를 넣어 주었을 때에는 세포독성이 낮고 차이가 없었지만, 표적 세포와 세포독성 T 세포를 세포 수의 비가 50:1로 공배양 하였을 때 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포의 경우는 35% 정도의 SP2/0 세포를 용혈시킨 반면, 대조군인 공벡터를 도입한 세포독성 T 세포에서는 7% 정도의 SP2/0 세포를 용혈시켜 세포 특이적 세포독성의 차이를 보였다. 표적세포와 세포독성 T 세포의 공배양한 세포 수의 비를 50:1으로 하였을 때, 상기 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포가 공벡터를 도입한 세포독성 T 세포보다 다발성골수종 특이적 세포독성이 유의적으로 뛰어남을 확인하였다(p<0.05). 이를 통해 제작한 키메릭 항원 인지 수용체 발현 세포독성 T 세포가 다발성골수종에 특이적으로 작용한다는 것을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> Chimeric antigen receptor specifically binding to VLA-4 and use thereof <130> NPDC-81090 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 921 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of VCAM-1 CAR-T construct <400> 1 Met Pro Val Lys Met Val Ala Val Leu Gly Ala Ser Thr Val Leu Trp 1 5 10 15 Ile Leu Phe Ala Val Ser Gln Ala Phe Lys Ile Glu Ile Ser Pro Glu 20 25 30 Tyr Lys Thr Ile Ala Gln Ile Gly Asp Ser Met Ala Leu Thr Cys Ser 35 40 45 Thr Thr Gly Cys Glu Ser Pro Leu Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp 50 55 60 Ser Pro Leu Asn Ala Lys Val Arg Thr Glu Gly Ser Lys Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Glu Pro Val Ser Phe Glu Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr 85 90 95 Ala Thr Cys Gly Ser Gly Lys Leu Glu Arg Ser Ile His Val Asp Ile 100 105 110 Tyr Ser Phe Pro Lys Asp Pro Glu Ile Gln Phe Ser Gly Pro Leu Glu 115 120 125 Val Gly Lys Pro Val Thr Val Lys Cys Leu Ala Pro Asp Ile Tyr Pro 130 135 140 Val Tyr Arg Leu Glu Ile Asp Leu Phe Lys Gly Asp Gln Leu Met Asn 145 150 155 160 Arg Gln Glu Phe Ser Ser Glu Glu Met Thr Lys Ser Leu Glu Thr Lys 165 170 175 Ser Leu Glu Val Thr Phe Thr Pro Val Ile Glu Asp Ile Gly Lys Ala 180 185 190 Leu Val Cys Arg Ala Lys Leu His Ile Asp Gln Ile Asp Ser Thr Leu 195 200 205 Lys Glu Arg Glu Thr Val Lys Glu Leu Gln Val Tyr Ile Ser Pro Arg 210 215 220 Asn Thr Thr Ile Ser Val His Pro Ser Thr Arg Leu Gln Glu Gly Gly 225 230 235 240 Ala Val Thr Met Thr Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro Glu Ile 245 250 255 Phe Trp Gly Arg Lys Leu Asp Asn Glu Val Leu Gln Leu Leu Ser Gly 260 265 270 Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ala Met Arg Met Glu Asp Ser Gly Val 275 280 285 Tyr Val Cys Glu Gly Val Asn Leu Ile Gly Arg Asp Lys Ala Glu Val 290 295 300 Glu Leu Val Val Gln Glu Lys Pro Phe Ile Val Asp Ile Ser Pro Gly 305 310 315 320 Ser Gln Val Ala Ala Gln Val Gly Asp Ser Val Val Leu Thr Cys Ala 325 330 335 Ala Ile Gly Cys Asp Ser Pro Ser Phe Ser Trp Arg Thr Gln Thr Asp 340 345 350 Ser Pro Leu Asn Gly Val Val Arg Asn Glu Gly Ala Lys Ser Thr Leu 355 360 365 Val Leu Ser Ser Val Gly Phe Glu Asp Glu His Ser Tyr Leu Cys Ala 370 375 380 Val Thr Cys Leu Gln Arg Thr Leu Glu Lys Arg Thr Gln Val Glu Val 385 390 395 400 Tyr Ser Phe Pro Glu Asp Pro Val Ile Lys Met Ser Gly Pro Leu Val 405 410 415 His Gly Arg Pro Val Thr Val Asn Cys Thr Val Pro Asn Val Tyr Pro 420 425 430 Phe Asp His Leu Glu Ile Glu Leu Leu Lys Gly Glu Thr Thr Leu Met 435 440 445 Lys Lys Tyr Phe Leu Glu Glu Met Gly Ile Lys Ser Leu Glu Thr Lys 450 455 460 Ile Leu Glu Thr Thr Phe Ile Pro Thr Ile Glu Asp Thr Gly Lys Ser 465 470 475 480 Leu Val Cys Leu Ala Arg Leu His Ser Gly Glu Met Glu Ser Glu Pro 485 490 495 Lys Gln Arg Gln Ser Val Gln Pro Leu Tyr Val Asn Val Ala Pro Lys 500 505 510 Glu Thr Thr Ile Trp Val Ser Pro Ser Pro Ile Leu Glu Glu Gly Ser 515 520 525 Pro Val Asn Leu Thr Cys Ser Ser Asp Gly Ile Pro Ala Pro Lys Ile 530 535 540 Leu Trp Ser Arg Gln Leu Asn Asn Gly Glu Leu Gln Pro Leu Ser Glu 545 550 555 560 Asn Thr Thr Leu Thr Phe Met Ser Thr Lys Arg Asp Asp Ser Gly Ile 565 570 575 Tyr Val Cys Glu Gly Ile Asn Glu Ala Gly Ile Ser Arg Lys Ser Val 580 585 590 Glu Leu Ile Ile Gln Val Ser Pro Lys Asp Ile Gln Leu Thr Val Phe 595 600 605 Pro Ser Lys Ser Val Lys Glu Gly Asp Thr Val Ile Ile Ser Cys Thr 610 615 620 Cys Gly Asn Val Pro Glu Thr Trp Ile Ile Leu Lys Lys Lys Ala Lys 625 630 635 640 Thr Gly Asp Met Val Leu Lys Ser Val Asp Gly Ser Tyr Thr Ile Arg 645 650 655 Gln Ala Gln Leu Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Glu Cys Glu Ser Lys Thr 660 665 670 Glu Val Gly Ser Gln Leu Arg Ser Leu Thr Leu Asp Val Lys Gly Lys 675 680 685 Glu His Asn Lys Asn Tyr Phe Ser Pro Glu Ile Trp Ala Pro Leu Ala 690 695 700 Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu Ile Asn 705 710 715 720 Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 725 730 735 Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala 740 745 750 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys 755 760 765 Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala 770 775 780 Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu 785 790 795 800 Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala 805 810 815 Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 820 825 830 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala 835 840 845 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln 850 855 860 Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 865 870 875 880 Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 885 890 895 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 900 905 910 Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg 915 920 <210> 2 <211> 2766 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence of VCAM-1 CAR-T construct <400> 2 atgcctgtga agatggtcgc ggtcttggga gcctcaacgg tactttggat actgtttgca 60 gtctctcaag cttttaaaat cgagatctcc cctgaataca aaacgattgc tcaaatcggt 120 gactccatgg 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ctttccatct aagagtgtca aagagggaga caccgtcatt 1860 atctcctgca cttgtggaaa tgtgcccgaa acatggataa tcctgaagaa gaaagcaaag 1920 acaggagaca tggtattaaa gtctgtggat ggctcgtaca ccatccgcca ggcacagctg 1980 caggatgccg gcatatacga gtgtgaatct aagactgaag ttggctcaca attaagaagt 2040 ttaacacttg atgtaaaagg aaaagaacat aacaagaact atttttcgcc cgaaatctgg 2100 gcacccttgg ccggaatctg cgtggccctt ctgctgtcct tgatcatcac tctcatcaat 2160 agtagaagga acagactcct tcaaagtgac tacatgaaca tgactccccg gaggcctggg 2220 ctcactcgaa agccttacca gccctacgcc cctgccagag actttgcagc gtaccgcccc 2280 tctgtgctca aatggatcag gaaaaaattc ccccacatat tcaagcaacc atttaagaag 2340 accactggag cagctcaaga ggaagatgct tgtagctgcc gatgtccaca ggaagaagaa 2400 ggaggaggag gaggctatga gctgagagca aaattcagca ggagtgcaga gactgctgcc 2460 aacctgcagg accccaacca gctctacaat gagctcaatc tagggcgaag agaggaatat 2520 gacgtcttgg agaagaagcg ggctcgggat ccagagatgg gaggcaaaca gcagaggagg 2580 aggaaccccc aggaaggcgt atacaatgca ctgcagaaag acaagatggc agaagcctac 2640 agtgagatcg gcacaaaagg cgagaggcgg agaggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 2700 ggtctcagca ctgccaccaa ggacacctat gatgccctgc atatgcagac cctggcccct 2760 cgctaa 2766 <210> 3 <211> 698 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of VCAM-1 Extracellular domain <400> 3 Met Pro Val Lys Met Val Ala Val Leu Gly Ala Ser Thr Val Leu Trp 1 5 10 15 Ile Leu Phe Ala Val Ser Gln Ala Phe Lys Ile Glu Ile Ser Pro Glu 20 25 30 Tyr Lys Thr Ile Ala Gln Ile Gly Asp Ser Met Ala Leu Thr Cys Ser 35 40 45 Thr Thr Gly Cys Glu Ser Pro Leu Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp 50 55 60 Ser Pro Leu Asn Ala Lys Val Arg Thr Glu Gly Ser Lys Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Glu Pro Val Ser Phe Glu Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr 85 90 95 Ala Thr Cys Gly Ser Gly Lys Leu Glu Arg Ser Ile His Val Asp Ile 100 105 110 Tyr Ser Phe Pro Lys Asp Pro Glu Ile Gln Phe Ser Gly Pro Leu Glu 115 120 125 Val Gly Lys Pro Val Thr Val Lys Cys Leu Ala Pro Asp Ile Tyr Pro 130 135 140 Val Tyr Arg Leu Glu Ile Asp Leu Phe Lys Gly Asp Gln Leu Met Asn 145 150 155 160 Arg Gln Glu Phe Ser Ser Glu Glu Met Thr Lys Ser Leu Glu Thr Lys 165 170 175 Ser Leu Glu Val Thr Phe Thr Pro Val Ile Glu Asp Ile Gly Lys Ala 180 185 190 Leu Val Cys Arg Ala Lys Leu His Ile Asp Gln Ile Asp Ser Thr Leu 195 200 205 Lys Glu Arg Glu Thr Val Lys Glu Leu Gln Val Tyr Ile Ser Pro Arg 210 215 220 Asn Thr Thr Ile Ser Val His Pro Ser Thr Arg Leu Gln Glu Gly Gly 225 230 235 240 Ala Val Thr Met Thr Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro Glu Ile 245 250 255 Phe Trp Gly Arg Lys Leu Asp Asn Glu Val Leu Gln Leu Leu Ser Gly 260 265 270 Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ala Met Arg Met Glu Asp Ser Gly Val 275 280 285 Tyr Val Cys Glu Gly Val Asn Leu Ile Gly Arg Asp Lys Ala Glu Val 290 295 300 Glu Leu Val Val Gln Glu Lys Pro Phe Ile Val Asp Ile Ser Pro Gly 305 310 315 320 Ser Gln Val Ala Ala Gln Val Gly Asp Ser Val Val Leu Thr Cys Ala 325 330 335 Ala Ile Gly Cys Asp Ser Pro Ser Phe Ser Trp Arg Thr Gln Thr Asp 340 345 350 Ser Pro Leu Asn Gly Val Val Arg Asn Glu Gly Ala Lys Ser Thr Leu 355 360 365 Val Leu Ser Ser Val Gly Phe Glu Asp Glu His Ser Tyr Leu Cys Ala 370 375 380 Val Thr Cys Leu Gln Arg Thr Leu Glu Lys Arg Thr Gln Val Glu Val 385 390 395 400 Tyr Ser Phe Pro Glu Asp Pro Val Ile Lys Met Ser Gly Pro Leu Val 405 410 415 His Gly Arg Pro Val Thr Val Asn Cys Thr Val Pro Asn Val Tyr Pro 420 425 430 Phe Asp His Leu Glu Ile Glu Leu Leu Lys Gly Glu Thr Thr Leu Met 435 440 445 Lys Lys Tyr Phe Leu Glu Glu Met Gly Ile Lys Ser Leu Glu Thr Lys 450 455 460 Ile Leu Glu Thr Thr Phe Ile Pro Thr Ile Glu Asp Thr Gly Lys Ser 465 470 475 480 Leu Val Cys Leu Ala Arg Leu His Ser Gly Glu Met Glu Ser Glu Pro 485 490 495 Lys Gln Arg Gln Ser Val Gln Pro Leu Tyr Val Asn Val Ala Pro Lys 500 505 510 Glu Thr Thr Ile Trp Val Ser Pro Ser Pro Ile Leu Glu Glu Gly Ser 515 520 525 Pro Val Asn Leu Thr Cys Ser Ser Asp Gly Ile Pro Ala Pro Lys Ile 530 535 540 Leu Trp Ser Arg Gln Leu Asn Asn Gly Glu Leu Gln Pro Leu Ser Glu 545 550 555 560 Asn Thr Thr Leu Thr Phe Met Ser Thr Lys Arg Asp Asp Ser Gly Ile 565 570 575 Tyr Val Cys Glu Gly Ile Asn Glu Ala Gly Ile Ser Arg Lys Ser Val 580 585 590 Glu Leu Ile Ile Gln Val Ser Pro Lys Asp Ile Gln Leu Thr Val Phe 595 600 605 Pro Ser Lys Ser Val Lys Glu Gly Asp Thr Val Ile Ile Ser Cys Thr 610 615 620 Cys Gly Asn Val Pro Glu Thr Trp Ile Ile Leu Lys Lys Lys Ala Lys 625 630 635 640 Thr Gly Asp Met Val Leu Lys Ser Val Asp Gly Ser Tyr Thr Ile Arg 645 650 655 Gln Ala Gln Leu Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Glu Cys Glu Ser Lys Thr 660 665 670 Glu Val Gly Ser Gln Leu Arg Ser Leu Thr Leu Asp Val Lys Gly Lys 675 680 685 Glu His Asn Lys Asn Tyr Phe Ser Pro Glu 690 695 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of CD8 alpha transmembrane domain <400> 4 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ile Ile Thr Leu Ile 20 <210> 5 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of CD28 Cytoplasmic domain <400> 5 Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro 35 40 <210> 6 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of CD137(4-1BB) Cytoplasmic domain <400> 6 Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln 1 5 10 15 Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser 20 25 30 Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu 35 40 45 <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of CD3-zeta Cytoplasmic domain <400> 7 Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp 1 5 10 15 Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro 100 105 110 Arg

Claims

VCAM-1의 세포외 도메인;
막관통 도메인; 및
세포 내 신호전달 도메인을 포함하는, VLA-4에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 막관통 도메인은 CD8인 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB 및 CD3-zeta로 이루어진 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 키메릭 항원 수용체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
제1항의 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드.
제5항에 있어서,
상기 폴리 뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리 뉴클레오티드.
제6항의 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제7항의 벡터로 형질전환된 세포.
제8항에 있어서,
상기 세포는 세포독성 T 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
삭제
제9항의 세포를 유효성분으로 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제11항에 있어서,
상기 혈액암은 다발성 골수종(multiple myeloma), B세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma, NHL), B세포 만성림프성 백혈병(B-cell chronic lymphocytic leukemia, B-CLL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL) 및 T세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.