KR102231284B1

KR102231284B1 - Cd38에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102231284B1
Application number: KR1020190105875A
Authority: KR
Inventors: 전태훈; 양준; 이창희; 강석진; 박인병
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2021-03-22
Also published as: KR20210025895A

Abstract

본 발명은 CD38에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체; 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드; 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 벡터로 형질전환된 세포; 상기 세포를 포함하는 세포치료제; 및 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 키메릭 항원 수용체는 CD38을 인지하는 PECAM-1의 세포외 도메인 1, 2번과 T 세포의 신호 전달에 중요한 작용을 하는 CD8의 막관통 도메인, CD28, 4-1BB, CD3-zeta 각각의 세포내 도메인을 결합한 재조합 단백질로서, 이를 과발현시킬 수 있는 벡터로 형질전환된 세포독성 T 세포의 경우 CD38를 발현하는 다발성골수종에 특이적으로 세포독성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 의한 키메릭 항원 수용체를 과발현하는 세포독성 T 세포는 다발성골수종과 같은 혈액암 치료를 위한 세포치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CD38에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도{Chimeric antigen receptor specifically binding to CD38 and use thereof}

본 발명은 CD38에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체; 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드; 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 벡터로 형질전환된 세포; 상기 세포를 포함하는 세포치료제; 및 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

다발성골수종은 골수 내에 있는 형질세포의 비이상적인 증식에 의해 발생하는 질병이다(Rajkumar et al., 2014). 이 질병은 골용해성 병변, 빈혈, 신부전 그리고 면역저하에 따른 세균감염의 특징을 가진다. 전세계적으로 비호즈킨성 림프종(non-Hodgkin lymphoma) 다음으로 발병율이 높은 혈액암이며(Rajkumar and Harousseau, 2016), 국내에서는 인구 10만명 당 3명 정도 발생하며, 발병 연령은 평균 67세로 70대 이상의 고령환자가 30%를 차지한다(국립암센터, 2015).

다발성골수종의 치료는 항암화학요법을 기본으로 하는데, 주로 이용되는 약제로는 프로테아좀 억제제(proteasome inhibitor)인 보르테조밉(bortezomib, 상품명=Velcade), 면역조절제인 lenalidomide(레날리도마이드) 등이 주로 사용되고 있다(Rajkumar and Harousseau, 2016). 이 밖에도 덱사메타손(dexamethasone)을 주사제로 주입하여 치료하는 방법이 있다(Palumbo et al., 2011). 만약 화학요법이 효과가 없는 경우 조혈모세포 이식을 통해 치료한다(Rajkumar and Harousseau, 2016). 지금까지 사용되는 화학요법의 경우 완치에 어려움이 있으며, 조혈모세포 이식은 다발성골수종의 대다수를 차지하는 고령의 환자에게는 불가능하다는 단점이 있다. 따라서 다발성골수종에 대한 새로운 치료제의 개발이 시급하다.

효과적인 암 치료를 위해서 직접적으로 암 세포를 표적하는 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocytes, CTL)가 중요하다는 사실이 보고되어 왔다. 지금까지 T 세포 치료를 이용한 항암 치료에 대한 연구는 환자의 T 세포에 특정 항원을 인식하는 TCR(T cell receptor)을 전달하거나 또는 항원을 인식하는 항체의 scFv 부분을 CD3 신호전달 도메인에 접목시킨 키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)를 전달하는 방법으로 시도되었다. 키메릭 항원 수용체를 T 세포에 접목시키면 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)에 의한 신호 전달과 관계없이 scFv의 특정 항원 인지만으로 T 세포를 항암 작용을 활성화시킬 수 있으며, 또한 HLA type에 제한적이지 않아 효율적인 치료 방법으로 이용할 수 있다. 이러한 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포는 여러 암에서 효능을 보이며, 특히 혈액암에서 치료 효과가 높은 것으로 알려져 있다(Holzinger et al., 2016; Pettitt et al., 2018).

한편, CD38은 cyclic ADP ribose hydrolase라고 불리우는 세포 표면 당단백질이다(Chini et al., 2002). CD38은 면역세포에서 세포부착, 외부의 신호전달, 그리고 세포 내부 칼슘 이온의 양을 조절한다(Hartman et al., 2010). CD38은 정상의 림프구나 골수세포에서는 발현이 적지만, 전신홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus)와 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)을 비롯한 자가면역질환에서 활성화된 B 림프구에서 과발현되며(Cole et al., 2018), 또한 골수유래 면역억제 세포(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)에서도 진단 마커로 사용된다(Karakasheva et al., 2018). 특히 다양한 혈액암에서 CD38의 과발현이 관찰되는데, 다발성 골수종(multiple myeloma), B세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma, NHL), B세포 만성림프성 백혈병(B-cell chronic lymphocytic leukemia, B-CLL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL), T세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)의 진단 마커로 사용된다(Ibrahim et al., 2001; Jiang et al., 2016; Bride et al., 2018).

이러한 배경하에, 본 발명자들은 다발성골수종 세포에서의 CD38 발현이 증가한다는 점과, 상기 CD38와 PECAM-1이 결합이 가능하다는 점을 이용하여 PECAM-1의 세포외 도메인 1번과 2번을 사용한 다발성골수종 특이적 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포를 제작하였다. PECAM-1의 세포외 도메인이 CD38를 인지하여 다발성골수종 세포와 결합 시 다발성골수종과 세포독성 T 세포가 결합하였다는 것을 세포 내부로 신호를 전달해 줄 수 있고, 세포독성 T 세포를 활성화시켜 다발성골수종에 대한 세포독성을 가질 수 있게 하는 CD8의 막관통 도메인, CD28, 4-1BB, CD3-zeta 각각의 세포내 도메인과 결합한 재조합 단백질을 발현하는 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포를 제작하였다. 또한, 상기 T 세포가 CD38을 발현하는 세포(다발성골수종 모델 세포주)에 특이적으로 세포독성 능력이 있음을 체외 실험을 통해 확인하였다. 따라서, 본 발명에 의해서 고안된 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포는 다발성골수종과 같은 혈액암의 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

한국공개특허 제10-2019-0057366호

따라서 본 발명의 목적은 CD38에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포를 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 PECAM-1의 세포외 도메인 1, 2번; 막관통 도메인; 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB 및 CD3-zeta로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 폴리 뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 표시될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포는 세포독성 T 세포일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈액암은 다발성 골수종(multiple myeloma), B세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma, NHL), B세포 만성림프성 백혈병(B-cell chronic lymphocytic leukemia, B-CLL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL) 및 T세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 키메릭 항원 수용체는 CD38을 인지하는 PECAM-1의 세포외 도메인 1, 2번과 T 세포의 신호 전달에 중요한 작용을 하는 CD8의 막관통 도메인, CD28, 4-1BB, CD3-zeta 각각의 세포내 도메인을 결합한 재조합 단백질로서, 이를 과발현시킬 수 있는 벡터로 형질전환된 세포독성 T 세포의 경우 CD38를 발현하는 다발성골수종에 특이적으로 세포독성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 의한 키메릭 항원 수용체를 과발현하는 세포독성 T 세포는 다발성골수종과 같은 혈액암 치료를 위한 세포치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 벡터의 모식도이며, 도 1b는 본 발명의 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 2a는 야생형 SP2/0 세포(wildtype SP2/0)와 CD38 유전자를 레트로바이러스 형질도입을 이용해 발현하도록 만들어준 SP2/0 세포(CD38⁺ SP2/0)에서 CD38 발현량을 역전사 중합효소연쇄반응을 이용하여 확인한 결과이다.
도 2b는 CD38 단백질의 발현을 위한 유전자 구축 모식도이다.
도 2c는 야생형 SP2/0 세포(wildtype SP2/0)와 CD38 유전자를 레트로바이러스 형질도입을 이용해 발현하도록 만들어준 SP2/0 세포(CD38⁺ SP2/0)에서 CD38 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정한 결과이다.
도 3a는 본 발명의 키메릭 항원 수용체 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입 시킨 세포독성 T 세포(PECAM-1 domain 1,2 CAR-T / T cell)에서의 GFP의 발현 비율을 세포독성 T 세포(Negative control) 혹은 공벡터를 형질도입시킨 세포독성 T 세포(Mock/T cell)와 비교한 그림이다.
도 3b는 본 발명의 키메릭 항원 수용체 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입 시킨 세포독성 T 세포(PECAM-1 domain 1,2 CAR-T / T cell)에서의 PECAM-1 domain 1,2의 발현량을 세포독성 T 세포(Negative control) 혹은 공벡터를 형질도입시킨 세포독성 T 세포(Mock/T cell)와 비교한 그림이다.
도 4는 본 발명의 키메릭 항원 수용체를 발현하는 세포독성 T 세포(PECAM-1 domain 1,2 CAR-T / T cell)와 공벡터를 형질도입 시킨 세포독성 T 세포(Mock / T cell)를 CD38⁺ 세포주(CD38⁺ SP2/0 세포) 또는 공벡터를 형질도입 시킨 SP2/0 세포(CD38^- SP2/0)와 6시간 공배양 후 각 세포독성 T 세포의 세포독성을 측정한 결과이다.

본 발명은 CD38에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 제공한다.

본 발명에서 "키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)"는 자연적으로 T 세포가 활성화하는데 필요한 항원 제시 세포(APC)의 매개없이 원하는 항원에 결합하여 항원-항체 반응을 통해 T 세포의 활성화를 유도하고 해당 항원을 발현하는 세포를 공격할 수 있도록 하기 위해 T 세포에 발현시키기 위한 융합 단백질을 의미할 수 있다. 곧, T 세포에 발현시 항원에 결합하여 T 세포의 활성화를 유도하는 단백질이라고 볼 수 있다. 이를 통해 면역 반응을 일으키고자 하는 세포에 특이적인 항원을 인식하는 단백질일 수 있으며, 상기 면역 반응을 일으키고자 하는 세포는 특정 조직에 존재하거나 병변을 일으킨 조직을 이루는 세포를 의미할 수 있다.

본 발명에서 "CD38"은 cyclic ADP ribose hydrolase라고 불리우는 세포 표면 당단백질이다. CD38은 면역세포에서 세포부착, 외부의 신호전달, 그리고 세포 내부 칼슘 이온의 양을 조절하며, 정상의 림프구나 골수세포에서는 발현이 적지만, 전신홍반성 루프스와 류마티스 관절염을 비롯한 자가면역질환 및 다양한 혈액암에서 과발현되는 것으로 알려져 있다. 또한, CD38은 CD31(PECAM-1)의 세포외 도메인 1번과 2번과 강하게 결합하는 특징을 가진다.

본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체는 PECAM-1의 세포외 도메인 1, 2번; 막관통 도메인; 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다.

본 발명의 키메릭 항원 수용체는 PECAM-1의 세포외 도메인 1, 2번이 CD38에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하며, 상기 "PECAM-1"은 Platelet endothelial cell adhesion molecule-1의 약어이며, 이는 서열번호 3 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 막통과 도메인 (Transmembrane domain)은 PECAM-1의 세포외 도메인과 보조자극, 필수 신호전달 도메인을 세포막 사이로 연결하는 부위이며, 세포내 신호 전달 도메인은 항원 결합 도메인의 결합에 의해 면역 세포의 면역반응을 활성화 시키는 부위를 의미한다.

본 발명의 키메릭 항원 수용체의 일 구성요소인 막통과 도메인은 CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막통과 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 막통과 도메인은 CD8의 막통과 도메인일 수 있고, 이는 서열번호 4 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 키메릭 항원 수용체의 일 구성요소인 세포내 신호전달 도메인은 항원 결합 도메인에 결합에 의해 면역 세포의 면역반응을 활성화시키는 부위를 의미한다. 본 발명의 일 구현예로서, 상기 세포내 도메인은 CD28, 4-1BB, CD3 제타 (zeta) 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 키메릭 항원 수용체는 세포내 신호전달 도메인으로 CD28, 4-1BB, CD3 제타 (zeta)를 이용함으로써 높은 활성으로 암 세포, 특히 CD28을 발현하는 다발성골수종 세포에 대한 사멸효과를 나타낼 수 있다.

이 경우, CD28은 서열번호 5 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; 4-1BB(CD137)은 서열번호 6 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; CD3 제타 (zeta)는 NK 세포 활성화 도메인으로 기능하며, 서열번호 7 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어 질 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체 단백질의 범위는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. ‘기능적 동등물’이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. ‘실질적으로 동질의 생리활성’이란 CD28에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 가진 것을 의미한다.

본 발명은 또한 키메릭 항원 수용체의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 ‘단편’, ‘유도체’ 및 ‘유사체’는 본 발명의 키메릭 항원 수용체 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ⅱ) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (ⅲ) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (ⅳ) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

또한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 기술한 ‘CD28에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체’를 코딩 (암호화)할 수 있는 폴리 뉴클레오티드이다. 본 발명의 항원 수용체를 암호화하는 폴리 뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여 또는 상기 항원 수용체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 항원 수용체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리 뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 일 구현예로서, 상기 폴리 뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열일 수 있다.

또한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포이다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 당 분야에 공지된 벡터를 다양하게 사용할 수 있고, 상기 항원 수용체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator), 인핸서 (enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

본 발명에서는 바람직한 일 예로서, 렌티-바이러스용 벡터를 사용할 수 있으며, 본 발명의 하기 실시예에서는 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터를 사용하였다(도 1b 참조).

또한 본 발명의 CD28에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 상기 벡터를 통해 세포에 도입하여 세포를 형질전환 시킬 수 있다. 상기 세포는 T 세포, 종양 침윤 림프구, B 세포, NK 세포, 또는 NK-T 세포일 수 있으며, 바람직하게는, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 골수, 말초혈액, 말초혈액단핵세포 또는 제대혈로부터 얻거나 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 기술한 벡터를 이용하여 CD28에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)에 형질전환 시킬 수 있다.

상기와 같이 본 발명의 키메릭 항원 수용체가 도입되어 형질전환된 세포는 CD28을 항원으로 인식하고 이와 강하게 결합하는 특징을 가진다.

본 발명에서, "키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(chimeric antigen receptor T cell, 이하 간략하게 ‘CAR-T 세포’라 약칭함)"란 정상의 T 세포를 형질도입 등의 방법으로 본래의 T 세포 수용체가 아닌 암세포에 특이적으로 반응하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 의미한다. 이 수용체를 갖는 T 세포는 타겟 세포의 세포자살을 유도하여 세포독성을 나타낸다.

본 발명에 있어, 특히 CAR-T 세포는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)에 본 발명의 키메릭 항원 수용체가 도입된 세포일 수 있다. 상기 세포는 CAR-T 치료제의 기존 장점인 항암 특이적 표적 치료의 장점을 가지며, 특히, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 장착시킨 세포독성 T 세포는 CD28를 발현하는 다발성골수종 세포를 인지하여 효과적으로 파괴할 수 있다.

따라서 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 세포를 포함하는 세포치료제; 이를 유효성분으로 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 상기 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법이다.

본 발명에 있어 상기 세포는, 예를 들어, T 세포, 종양 침윤 림프구, 자연 살해 세포(Natural Killer cell), 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 또는 전구 세포(progenitor cell), 예를 들어, 조혈 줄기세포, 중간엽 간질 세포, 줄기세포, 전분화능 줄기세포, 및 배아 줄기세포일 수 있으며, 이들은 항암치료 등의 세포 요법에 사용될 수 있다. 세포는 공여자로부터 올 수 있거나, 환자로부터 얻어진 세포가 될 수 있다. 세포는 예를 들어, 병에 걸린 세포의 기능을 대체하는 재생에 사용될 수 있다. 세포는 또한 이종 유전자를 발현하도록 변형되어 생물학 제제가, 예를 들어, 병에 걸린 골수 또는 전이성 침착물과 같은 특정 미세 환경으로 전달될 수 있다.

본 발명에서, "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명의 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 혈액암을 억제시키거나 발생을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 혈액암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

상세하게는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 혈액암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 개체란, 혈액암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한없이 포함된다.

본 발명에 있어 치료 대상이 되는 혈액암의 종류로는 다발성 골수종(multiple myeloma), B세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma, NHL), B세포 만성림프성 백혈병(B-cell chronic lymphocytic leukemia, B-CLL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL), T세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)으로 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

유전자 합성 방법에 의한 유전자의 클로닝

본 발명의 키메릭 항원 수용체를 제조하기 위해서 PECAM-1의 세포외 도메인 1번, 2번과 CD8α의 막관통 도메인, CD28, 4-1BB, CD3-zeta 각각의 세포내 도메인 부분의 단백질 암호화 서열을 유전자 데이터베이스(database)에서 확인하였다. 그리고 이 도메인들을 이루는 염기서열의 종결 코돈 부분을 제외한 나머지 서열들을 하나로 이어서 유전자 합성을 진행하였다. 유전자 합성의 정확도는 단백질 발현 플라스미드를 제작한 후 시퀀싱을 통하여 확인하였다.

<실시예 2>

단백질 발현 플라스미드 제조

PECAM-1의 세포외 도메인 1번, 2번과 T 세포 신호전달 단백질을 융합시킨 재조합 단백질(PECAM-1 domain 1,2 CAR-T)을 발현 시키기 위해, 해당 유전자를 렌티바이러스 유래 발현벡터인 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(System Biosciences, Catalog # CD511B-1)에 클로닝 하였다. 먼저 5′말단에 제한효소 NheI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들고, 3′말단에도 제한효소 NotI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들었다. 그 후 중합효소연쇄반응으로 인해 제한효소 절단 부위를 가진 유전자를 5′말단은 NheI을 처리하였으며, 3′말단은 NotI을 처리하였다. 그리고 발현 벡터의 다중클로닝 자리를 NheI과 NotI을 처리하여 유전자가 삽입될 수 있게 만들었다. 제한효소가 처리된 유전자와 발현 벡터를 섞어 준 다음, 결합 효소(ligase)를 처리하여 연결하였다. 그 결과 도1a의 구조로 된 PECAM-1의 세포외 도메인 1번, 2번과 T 세포 신호 전달 단백질이 융합된 단백질을 발현하는 재조합 벡터 PECAM-1 domain 1,2 CAR-T/pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP를 완성하였다(도 1a와 1b 참조).

<실시예 3>

CD38을 발현하는 세포주 제작

CD38을 세포 표면에 발현하는 다발골수종 모델 세포주를 제작하기 위하여 B 림프구 유래 세포주인 SP2/0 세포(mouse myeloma, ATCC CRL-1581, H-2^d haplotype)를 이용하였다. 먼저 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction)과 유세포 분석(fluorescence-activated cell sorting)을 이용하여 SP2/0의 CD38 발현 여부를 확인하였으며 이 때 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.

SP2/0 세포주의 CD38 발현을 확인하기 위해 사용한 프라이머 서열

Gene name	Primer	Sequence (5'-3')
GAPDH	Forward	AATCGTAGAGGATTCAGTCCT
GAPDH	Reverse	ACTGAATTCCAGAATCCTCGG
CD38	Forward	GGTCTCCTGGTCCTGATCGCCTT
CD38	Reverse	GTACTCAGTATCTCCTGGCAGTTC

그 결과 SP2/0 세포는 자체적으로 세포 표면에 CD38을 발현하지 않음을 확인하였다(도 2a 및 2c 참조).

이에, SP2/0 세포의 CD38 발현을 위해 레트로바이러스 형질도입을 통한 과발현 기법을 이용하였다. 이를 위해 레트로바이러스 유래 발현벡터인 pLNCX2(Addgene) 벡터에 CD38 유전자의 클로닝을 진행하였다. 먼저 골수세포 RNA의 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 얻은 상보적 DNA(complementary DNA)를 주형으로한 중합효소 연쇄반응을 통해 CD38 유전자를 합성하였으며 이 때 사용한 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다. 앞서 합성한 CD38 상보적 DNA를 주형으로 CD38 유전자의 5′과 3′말단에 제한효소 XhoI과 ClaI의 절단 부위 서열을 각각 추가할 수 있는 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응을 통해 CD38 유전자의 각 말단에 제한효소 절단 부위를 추가하였다. 이후 연결효소를 이용하여 제한효소 XhoI과 ClaI을 처리한 pLNCX2의 다중클로닝 자리에 CD38 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 완성하였다(도 2b 참조).

CD38을 pLNCX2 벡터로 클로닝 하기위해 사용한 프라이머 서열

Gene name	Primer	Sequence (5'-3')
CD38(cDNA)	Forward	ATGGCTAACTATGAATTTAG
CD38(cDNA)	Reverse	TCACGTATTAAGTCTACACG
CD38(Enzyme site)	Forward	CCGCTCGAGATGGCTAACTATGAATTTAG
CD38(Enzyme site)	Reverse	CCCATCGATTCACGTATTAAGTCTACACG

제작한 재조합 벡터를 SP2/0 세포에 도입하기 위하여 293GPG 세포를 사용한 레트로 바이러스 형질도입 시스템을 이용하였다. 먼저 293GPG 세포 3×10⁶개를 10ml의 10% 송아지 혈청 함유 DMEM 배양액 10ml에 풀어 100π 세포 배양 접시에 접종 후 24시간 배양하였다. 앞서 제작한 재조합 벡터(CD38/pLNCX2 벡터) 20μg을 Calcium phosphate 및 Hepes-buffered solution을 이용하여 결정화시킨 후 앞서 배양한 293GPG 세포의 배양액에 첨가해주었다. 이 후 24시간 간격으로 72시간에 걸쳐 배양액을 교체하며 레트로바이러스를 함유한 293GPG 세포의 배양 상층액을 채취 및 보관하였다. 채취한 레트로바이러스 함유 상층액은 초고속 원심분리기를 이용하여 21000rpm, 2시간 원심분리 후 농축 이전 대비 100배로 농축될 수 있도록 10% 송아지 혈청 함유 DMEM에 재구성하였다. 농축한 레트로바이러스를 SP2/0 세포에 형질도입하기 위해 SP2/0 세포를 24 well 세포 배양 접시에 3×10⁶/ml의 밀도로 접종하였다. 그 다음 농축된 레트로바이러스에 polybrene을 0.8ug/ml만큼 첨가한 혼합액을 배양 중인 SP2/0세포의 배양액에 추가한 후 4시간 배양하였다. 4시간 후 새 배양액으로 교체하였으며 유전자가 도입된 세포의 선별을 위해 배양액 교체 후 24시간 후부터는 neomycin 항생제가 첨가된 10% 송아지 혈청 함유 DMEM 배양액을 이용하여 레트로바이러스를 처리해준 SP2/0세포를 배양하였다. 7일간의 neomycin 선별과정을 마친 SP2/0 세포는 다시 신선한 배양액에 옮겨 1주일간 증식시켰다. 그 다음 역전사 중합효소 연쇄반응과 유세포 분석을 이용해 SP2/0세포의 CD38 발현량을 측정하였으며 형질도입된 SP2/0 세포(CD38+ SP2/0)와 야생형 SP2/0 세포(wildtype SP2/0)의 CD38 발현량을 비교하였다.

그 결과 도 2a 및 2c에 나타낸 바와 같이, 형질도입된 SP2/0 세포(CD38+ SP2/0)에 CD38이 발현되는 것을 확인하였다.

<실시예 4>

세포독성 T 세포 분리 및 활성화

본 발명의 키메릭 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 제작하기 위해 먼저 세포 독성 T 세포를 생쥐에서 분리하였다. 8주령 Balb/c 생쥐의 비장을 수술용 가위와 포셉을 이용하여 채취한 다음 마이크로슬라이드(frosted microslide) 및 70μm 세포여과기를 이용해 단일 세포로 분리하였다. 분리한 단일 세포들에서 세포독성 T 세포를 분리하기 위해서 자력이용 세포 분리법(magnetic-activated cell sorting)을 이용하였다. 앞서 분리한 비장유래 단일 세포들을 세포독성 T 세포를 제외한 다른 면역세포들과 결합 가능한 항체(CD8⁺ T cell biotin-conjugated antibody cocktail)와 결합시킨 다음 이 항체들을 다시 자성을 가진 마이크로비드(anti-biotin microbead)와 결합시켰다. 이 마이크로비드와 그에 붙은 항체, 세포들을 자기장 분리 칼럼(magnetic seperation column)에 통과시켜 그 중 항체로 표지되지 않은 세포독성 T 세포를 얻었다. 분리한 세포독성 T 세포의 순도를 확인하기 위하여 세포독성 T 세포의 세포표면 인자인 CD8과 TCRβ를 이용한 유세포 분석을 실시하였다.

분리한 세포독성 T 세포의 활성화를 위해 1μg/ml anti-CD3ε 항체, 0.5μg/ml anti-CD28 항체, 그리고 100U/μl recombinant human IL-2가 첨가된 10% 송아지 혈청 함유 RPMI에 1.5×10⁶/ml의 밀도로 세포를 재구성하여 6 웰(well) 세포 배양 접시에 접종 후 24시간 배양하였다. 참고로, 상기 anti-CD3ε 항체는 BD pharmigen로부터 구입하였으며, anti-CD28 항체는 Biolegend로부터 구입하였고, RPMI는 Welgene로부터 구입하였다.

<실시예 5>

키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포 제작

상기 실시예 2를 통해 제작한 재조합 벡터를 세포독성 T 세포에 도입하기 위하여 293FT 세포(Thermo Fisher Scientific社)를 사용한 렌티 바이러스 시스템을 이용하였다.

먼저, 293FT 세포를 100π 세포 배양 접시에 2.5×10⁶ 세포가 되도록 접종 한 후, 10% 송아지 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포가 접시의 60~70% 정도를 덮을 정도로 자라면, 20μg의 VPECAM-1 domain 1,2 CAR-T / pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터 DNA를 10μg의 psPAX2(Addgene)와 3μg의 pMD2.G(Addgene) 벡터와 함께 Calcium phosphate를 사용하여 293FT 세포에 도입하였다. 그 후, 상기 발현 벡터가 도입된 293FT 세포를 48시간 후 24시간 간격으로 바이러스(렌티바이러스)를 포함하는 배양 상층액을 모았다. 모은 상층액을 초고속 원심분리기를 21000rpm으로 2시간 원심분리하여 바이러스를 농축시켰다. 농축된 바이러스를 polybrene 0.8μg/ml과 혼합하여 활성화시킨 세포독성 T 세포의 배양액에 추가한 후 원심분리기를 이용해 4500rpm, 1시간 30분 원심분리하여 형질도입을 진행하였다. 원심 분리를 마친 세포독성 T 세포는 4시간 추가 배양 후 10% 송아지 혈청 함유 RPMI 배양액으로 교체하였으며 24시간 후에는 형질도입한 세포독성 T 세포의 일부를 형질도입 효율 측정에 사용하였다. 형질도입 효율은 세포 내부의 GFP 발현량과 세포 표면의 PECAM-1 domain1,2 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정했으며 형질도입된 세포독성 T 세포(PECAM-1 domain 1,2 CAR-T / T cell)를 공벡터로 제작한 바이러스를 형질도입한 세포독성 T 세포(Mock / T cell)의 형질도입 비율과 비교한 결과는 도 3에 나타내었다.

<실시예 6>

CD38을 발현하는 세포(CD38+ cell)와의 공배양을 통한 CD38+ cell 특이적 세포독성 검증

제작한 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포가 다발성골수종 세포를 특이적으로 인지하여 독성을 나타내는지 확인하기 위해 CD38을 발현하는 세포(CD38⁺ cell)를 선택적으로 독성을 나타내는지 확인하기 위해 다발골수종 모델 세포주인 CD38⁺ SP2/0 세포 혹은 공벡터를 도입한 SP2/0(CD38^- SP2/0)를 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포(PECAM-1 domain 1,2 / CD8⁺ T cell) 혹은 공벡터를 도입한 세포독성 T 세포(Mock / CD8⁺ T cell)와 공배양하였다. 공배양 후 상층액에 존재하는 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)의 양으로 세포독성 T 세포의 표적세포에 대한 세포독성 정도를 측정하는 비방사성 세포독성 분석법(non-radioactive cytotoxicity assay)을 이용하였다.

먼저 96 well 세포 배양 접시의 well에 세포독성 T 세포와 표적 세포를 각각 1×10⁴씩, well당 부피는 100μl가 되도록 접종 후 원심분리기를 이용해 2000rpm, 5분 원심분리하여 세포간 간격을 가깝게 만든다. 6시간 배양 진행 후 각 well의 상층액을 50μl씩 걷어내어 흡광도 측정용 투명 96 well 접시에 옮긴 후 분석용액 및 3M 염산용액을 처리하여 효소 반응을 진행 및 정지시킨다. 효소 반응을 정지시키고 난 후에는 형광/발광/흡광 측정기(multi-detection plate reader)를 이용하여 490nm 파장대의 흡광도를 측정 및 수치 변환하여 각 well의 세포독성 T 세포의 세포독성 정도를 정량화하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포(PECAM-1 domain 1,2 CAR-T / T cell)를 공벡터를 형질도입 시킨 SP2/0 세포(CD38^- SP2/0) 또는 다발 골수종 모델 세포주(CD38⁺ SP2/0)와 공배양했을때 CD38을 발현하지 않는 표적 세포에 대해서는 0.5% 정도의 세포독성을 보인 반면 CD38을 발현하는 다발 골수종 모델 세포주에 대해서는 53% 이상의 세포독성을 보임을 확인하였다. 반면 대조군인 공벡터를 도입한 세포독성 T 세포의 경우 공벡터를 형질도입 시킨 SP2/0 세포에 대해서는 세포독성을 보이지 않았으며 다발 골수종 모델 세포주와 공배양한 경우에도 21% 정도의 세포독성을 갖는 것으로 측정되었으며 실험군과 비교해보았을 때 유의적인 차이를 보였다 (p<0.005). 이를 통해 제작한 키메릭 항원 인지 수용체 발현 세포독성 T 세포가 다발골수종에 특이적인 세포독성을 보임을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> Chimeric antigen receptor specifically binding to CD38 and use thereof <130> NPDC-81089 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of PECAM-1 extracellular domain 1,2 CAR-T construct <400> 1 Met Leu Leu Ala Leu Gly Leu Thr Leu Val Leu Tyr Ala Ser Leu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Glu Asn Ser Phe Thr Ile Asn Ser Ile His Met Glu Ser Leu 20 25 30 Pro Ser Trp Glu Val Met Asn Gly Gln Gln Leu Thr Leu Glu Cys Leu 35 40 45 Val Asp Ile Ser Thr Thr Ser Lys Ser Arg Ser Gln His Arg Val Leu 50 55 60 Phe Tyr Lys Asp Asp Ala Met Val Tyr Asn Val Thr Ser Arg Glu His 65 70 75 80 Thr Glu Ser Tyr Val Ile Pro Gln Ala Arg Val Phe His Ser Gly Lys 85 90 95 Tyr Lys Cys Thr Val Met Leu Asn Asn Lys Glu Lys Thr Thr Ile Glu 100 105 110 Tyr Glu Val Lys Val His Gly Val Ser Lys Pro Lys Val Thr Leu Asp 115 120 125 Lys Lys Glu Val Thr Glu Gly Gly Val Val Thr Val Asn Cys Ser Leu 130 135 140 Gln Glu Glu Lys Pro Pro Ile Phe Phe Lys Ile Glu Lys Leu Glu Val 145 150 155 160 Gly Thr Lys Phe Val Lys Arg Arg Ile Asp Lys Thr Ser Asn Glu Asn 165 170 175 Phe Val Leu Met Glu Phe Pro Ile Glu Ala Gln Asp His Val Leu Val 180 185 190 Phe Arg Cys Gln Ala Gly Ile Leu Ser Gly Phe Lys Leu Gln Glu Ser 195 200 205 Glu Pro Ile Arg Ser Glu Tyr Val Thr Val Gln Glu Ser Phe Ser Thr 210 215 220 Pro Lys Phe Glu Ile Lys Pro Pro Gly Met Ile Ile Glu Ile Trp Ala 225 230 235 240 Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr 245 250 255 Leu Ile Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn 260 265 270 Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr 275 280 285 Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro Ser Val Leu Lys Trp 290 295 300 Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr 305 310 315 320 Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln 325 330 335 Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu Arg Ala Lys Phe Ser 340 345 350 Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr 355 360 365 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys 370 375 380 Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg 385 390 395 400 Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 405 410 415 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 420 425 430 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 435 440 445 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg 450 455 460 <210> 2 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence of PECAM-1 extracellular domain 1,2 CAR-T construct <400> 2 atgctcctgg ctctgggact cacgctggtg ctctatgcaa gcctccaggc tgaggaaaac 60 tccttcacca tcaacagcat ccatatggaa agcctgccat catgggaggt gatgaatggg 120 cagcaactga ccctggagtg ccttgtggac atcagcacca cctcgaaaag caggtctcag 180 caccgggtgc tgttctataa ggacgatgcg atggtgtata acgtcacctc cagggagcac 240 accgagagct acgtcattcc tcaggctcgg gtcttccact ccgggaagta caaatgcaca 300 gtgatgctga acaacaagga aaaaaccacg attgagtacg aggtgaaggt gcatggcgta 360 tccaagccca aggtgacact ggacaaaaag gaggtgacag aaggcggggt cgtgacggtc 420 aattgttcct tgcaagaaga aaagccaccg atctttttta aaattgaaaa attagaagtg 480 gggacaaagt ttgtcaagcg aaggatagat aagacctcca acgagaactt tgtgctcatg 540 gaattcccca ttgaggcgca ggaccacgtg ttagtgtttc gctgccaagc tgggatcctg 600 tccggattca aattgcagga gtcagaaccc atcaggagtg aatacgtcac cgtgcaggag 660 tccttctcca ctcccaagtt tgaaatcaag ccccctggga tgatcataga aatctgggca 720 cccttggccg gaatctgcgt ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catcaatagt 780 agaaggaaca gactccttca aagtgactac atgaacatga ctccccggag gcctgggctc 840 actcgaaagc cttaccagcc ctacgcccct gccagagact ttgcagcgta ccgcccctct 900 gtgctcaaat ggatcaggaa aaaattcccc cacatattca agcaaccatt taagaagacc 960 actggagcag ctcaagagga agatgcttgt agctgccgat gtccacagga agaagaagga 1020 ggaggaggag gctatgagct gagagcaaaa ttcagcagga gtgcagagac tgctgccaac 1080 ctgcaggacc ccaaccagct ctacaatgag ctcaatctag ggcgaagaga ggaatatgac 1140 gtcttggaga agaagcgggc tcgggatcca gagatgggag gcaaacagca gaggaggagg 1200 aacccccagg aaggcgtata caatgcactg cagaaagaca agatggcaga agcctacagt 1260 gagatcggca caaaaggcga gaggcggaga ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1320 ctcagcactg ccaccaagga cacctatgat gccctgcata tgcagaccct ggcccctcgc 1380 taa 1383 <210> 3 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of PECAM-1 Extracellular domain <400> 3 Met Leu Leu Ala Leu Gly Leu Thr Leu Val Leu Tyr Ala Ser Leu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Glu Asn Ser Phe Thr Ile Asn Ser Ile His Met Glu Ser Leu 20 25 30 Pro Ser Trp Glu Val Met Asn Gly Gln Gln Leu Thr Leu Glu Cys Leu 35 40 45 Val Asp Ile Ser Thr Thr Ser Lys Ser Arg Ser Gln His Arg Val Leu 50 55 60 Phe Tyr Lys Asp Asp Ala Met Val Tyr Asn Val Thr Ser Arg Glu His 65 70 75 80 Thr Glu Ser Tyr Val Ile Pro Gln Ala Arg Val Phe His Ser Gly Lys 85 90 95 Tyr Lys Cys Thr Val Met Leu Asn Asn Lys Glu Lys Thr Thr Ile Glu 100 105 110 Tyr Glu Val Lys Val His Gly Val Ser Lys Pro Lys Val Thr Leu Asp 115 120 125 Lys Lys Glu Val Thr Glu Gly Gly Val Val Thr Val Asn Cys Ser Leu 130 135 140 Gln Glu Glu Lys Pro Pro Ile Phe Phe Lys Ile Glu Lys Leu Glu Val 145 150 155 160 Gly Thr Lys Phe Val Lys Arg Arg Ile Asp Lys Thr Ser Asn Glu Asn 165 170 175 Phe Val Leu Met Glu Phe Pro Ile Glu Ala Gln Asp His Val Leu Val 180 185 190 Phe Arg Cys Gln Ala Gly Ile Leu Ser Gly Phe Lys Leu Gln Glu Ser 195 200 205 Glu Pro Ile Arg Ser Glu Tyr Val Thr Val Gln Glu Ser Phe Ser Thr 210 215 220 Pro Lys Phe Glu Ile Lys Pro Pro Gly Met Ile Ile Glu 225 230 235 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of CD8 alpha transmembrane domain <400> 4 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ile Ile Thr Leu Ile 20 <210> 5 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of CD28 Cytoplasmic domain <400> 5 Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro 35 40 <210> 6 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of CD137(4-1BB) Cytoplasmic domain <400> 6 Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln 1 5 10 15 Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser 20 25 30 Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu 35 40 45 <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of CD3 zeta Cytoplasmic domain <400> 7 Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp 1 5 10 15 Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro 100 105 110 Arg

Claims

PECAM-1의 세포외 도메인 1, 2번;
막관통 도메인; 및
세포 내 신호전달 도메인을 포함하는, CD38에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 막관통 도메인은 CD8인 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB 및 CD3-zeta로 이루어진 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 키메릭 항원 수용체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
제1항의 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드.
제5항에 있어서,
상기 폴리 뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리 뉴클레오티드.
제6항의 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제7항의 벡터로 형질전환된 세포.
제8항에 있어서,
상기 세포는 세포독성 T 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
삭제
제9항의 세포를 유효성분으로 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제11항에 있어서,
상기 혈액암은 다발성 골수종(multiple myeloma), B세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma, NHL), B세포 만성림프성 백혈병(B-cell chronic lymphocytic leukemia, B-CLL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL) 및 T세포 급성 림프구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.