KR20200070236A - 면역치료제로서의 pd1-특이적 키메라 항원 수용체 - Google Patents

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KR20200070236A
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Abstract

PD1-특이적 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포의 입양 세포 전달을 통한, PDL1 및/또는 PDL2 양성 암을 치료하는데 유용한 방법 및 조성물이 본원에서 제공된다. Dap10 과 같은 공동-자극 도메인이 효능을 증강시키기 위해 포함될 수 있다.

Description

면역치료제로서의 PD1-특이적 키메라 항원 수용체
본 개시는 일반적으로 암 치료를 위해, PD1 리간드를 표적으로 삼는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 유전자 조작된 T 세포에 관한 것이다. 특히, 키메라 항원 수용체는 치료 효능을 증강시키기 위해 공동-자극 도메인, 예컨대 Dap10 을 포함할 수 있다.
키메라 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor; CAR) 로 T 세포를 조작하는 것은 T-세포 항-종양 효능을 증가시키는 하나의 접근법이다. CAR 은 T-세포 특이성을 재지시 (redirection) 하고 종양-관련 항원의 MHC-독립적 인지를 허용하여 종양 표적화를 증강시키는데 사용된다. 암 치료에 있어서 CAR-변형된 T 세포를 이용하는 장점에는 광범위한 종양 유형을 인지하고, 면역 검출을 피하기 위해 종양이 사용하는 메카니즘을 극복하고, T-세포 기능을 증강시키는 능력이 포함된다. 그러나, T 세포 상 저해 수용체 발현의 상향 조절 및 종양 미세환경에서의 저해 리간드의 발현은 CAR T-세포 반응 및 효능을 제한한다.
암 환자에서, 면역 반응의 음성 조절은 종종 T 세포의 지속적인 활성화 후에 발생한다. 항-종양 T-세포 반응을 저해하는데 중요한 역할을 하는 그러한 하나의 저해 수용체는 프로그램된 사멸 수용체 1 (PD1, CD279) 로, 이는 T-세포 활성화 직후에 상향 조절되고, 증식, 사이토카인 생성 및 세포독성을 포함하는 CD28 시그널링 (signaling) 및 T-세포 수용체의 다운스트림에 존재하는 다수의 T-세포 기능을 저해한다. PD1 수용체는 2 가지 상이한 리간드인, 프로그램된 사멸 리간드 1 (PDL1, B7-H1, CD274) 및 프로그램된 사멸 리간드 2 (PDL2, B7-DC, CD273) 에 결합하고, 이들 둘 모두는 여러 유형의 고형 종양 및 림프종을 포함하는 혈액암 상에서 과발현된다. PD1 리간드를 표적화하는 효과적인 치료법이 필요하다.
본 발명의 개요
본 개시는 입양 (adoptive) T 세포 치료에 적합하고 PD1 리간드를 표적으로 하는 CAR 을 제공한다.
본 개시의 한 측면은 프로그램된 사멸 리간드 1 (PDL1) 및 프로그램된 사멸 리간드 2 (PDL2) 중 적어도 하나에 대해 특이적인 세포외 결합 도메인; 트랜스멤브레인 (transmembrane) 도메인; 및 세포질 시그널링 도메인을 포함하는 CAR 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 프로그램된 사멸 수용체 1 (PD1) 세포외 도메인이다. 일부 구현예에서, 세포질 시그널링 도메인은 CD3ζ 세포질 도메인이다. 일부 구현예에서, CAR 폴리펩티드는 추가로 DNAX-활성화 단백질 10 (Dap10) 공동-자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3 와 90% 이상 상동인 서열을 포함한다.
본 개시의 또 다른 측면은 본 개시에 따른 CAR 를 발현하도록 유전자 조작된 T 림프구를 제공한다.
본 개시의 또 다른 측면은 본 개시의 T 림프구 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 입양 세포 전달을 위한 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 화학치료제 또는 방사선치료제를 추가로 포함한다.
본 개시의 또 다른 측면은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게, 치료적 유효량의 본 개시에 따른 입양 세포 전달을 위한 조성물을 투여하는 것을 포함하는 상기 대상체에서의 암 치료 방법으로서, 이때 상기 암의 세포는 PDL1 및 PDL2 중 하나 이상을 발현한다. 일부 구현예에서, 암은 림프종, 흑색종, 골수종, 췌장암, 유방암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 1A-F. 키메라 프로그램된 사멸 1 (chPD1) T 세포는 프로그램된 사멸 리간드 (PDL)-발현 RMA 세포를 PD1-의존적 방식으로 용해시킨다. (a) chPD1-Dap10, chPD1-CD28, 및 야생형 (wt) PD1 수용체의 대표적인 벡터 지도. (b) 효과기 (effector) 쥐과동물 형질도입되지 않은, wtPD1, 또는 chPD1 (검정색) T 세포를 항-PD1 또는 이소타입 대조군 항체로 염색하거나, 또는 (c) 쥐과동물 chPD1 T 세포를 항-PDL1 또는 항-PDL2 또는 이소타입 대조군 항체로 염색하고, 유세포 측정법을 이용하여 분석하였다. (d) RMA 세포를 항-PDL1 또는 항-PDL2 또는 이소타입 대조군 항체로 염색하고, 유세포 측정법을 이용하여 분석하였다. (e) 형질도입되지 않은 (사각형), wtPD1 (삼각형) 또는 chPD1 (원) T 세포를, 지시된 효과기 대 표적 (E : T) 비 (1 : 1, 5 : 1, 25 : 1) 로 RMA 세포와 함께 효과기 세포로서 이용하고, 세포 용해를 락테이트 데히드로게나아제 어세이를 이용하여 측정했다. chPD1 T 세포는 형질도입되지 않은 또는 wtPD1 T 세포와 비교할 때 모든 E : T 비에서 유의미하게 더 높은 특이적 용해를 가졌다 (*P　< 0.0001). (f) PD1 수용체 의존성을 나타내기 위해, wtPD1 또는 chPD1 T 세포를, 종양 세포와의 인큐베이션 이전에 항-PD1 항체 (개방형 기호), 또는 대조군 IgG 항체 (폐쇄형 기호) 와 함께 인큐베이션하였다. PD1 수용체를 차단하면 대조군과 비교할 때 모든 비율에서 종양 세포에 대한 chPD1 T 세포의 세포독성이 유의미하게 감소되었다 (*P　< 0.001). 데이터는 평균 + SD 로 제시하였으며, 적어도 3 가지 실험을 대표한다.
도 2A-B. 키메라 프로그램된 사멸 1 (chPD1) T 세포와 RMA 세포의 배양은 친염증성 (pro-inflammatory) 사이토카인의 분비를 야기한다. 형질도입되지 않은, 야생형 (wt) PD1-발현 (검정색), 또는 chPD1-발현 (개방형) T 세포를 RMA 세포 또는 배지와 함께 배양하였다. 24 시간 후, (a) 친염증성 사이토카인 인터페론-γ　(IFN-γ), 종양 괴사 인자-α　(TNF-α), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 및 인터류킨-2 (IL-2), 및 (b) 항-염증성 사이토카인 IL-10 의 분비를, ELISA 에 의해 무세포 상청액에서 측정하였다. chPD1 T 세포는 RMA 세포와의 배양시 wtPD1 T 세포와 비교할 때, 더 높은 수준의 친염증성 사이토카인 및 감소된 수준의 항-염증성 사이토카인을 생성하였다 (*P　< 0.001). 데이터는 평균 + SD 로 제시하였고, 적어도 3 가지 실험을 대표한다.
도 3A-D. 키메라 프로그램된 사멸 1 (chPD1) T 세포로의 치료는 종양 부담 (tumor burden) 의 감소 및 RMA-GFP-보유 마우스의 생존 증가로 이어진다. RMA-GFP 세포 (2 × 106) 를, B6 마우스에 제 0 일에 정맥 내 (i.v.) 주사하였다. 마우스를 (a) 2 일 후, (b) 5 일 후, PBS 또는 야생형 (wt) PD1 (검정색) 또는 chPD1 (개방형) T 세포 (5 × 106) 의 단일 치료로, 또는 (c) 5 및 8 일 후, wtPD1 또는 chPD1 T 세포의 2 회 투여량으로 i.v. 치료하였다. 마우스를 RMA-GFP 세포 주사 후 13 일 후에 사멸시키고, 종양 부담을 비장 및 림프절에서 RMA-GFP 세포의 개수를 계산함으로써 측정하였다 (n　= 6). (d) 마우스를 5 및 12 일 후, wtPD1- 또는 chPD1 T 세포의 2 회 투여량으로 i.v. 치료하고, 마우스의 생존을 확인하였다 (n　= 7). chPD1 T 세포는 wtPD1 T 세포 또는 PBS 와 비교할 때 유의미하게 RMA 종양 부담을 감소시켰고, 생존을 증가시켰다 (*P　< 0.01). 데이타는 평균 + SD 로 제시하였고, 2 가지의 독립적인 실험을 대표한다.
도 4A-C. 키메라 프로그램된 사멸 1 (chPD1) -Dap10 T 세포는 chPD1-CD28 T 세포와 비교할 때 증가된 수준의 친염증성 사이토카인 및 감소된 수준의 항-염증성 사이토카인을 분비한다. 야생형 (wt) PD1- (검정색), chPD1-Dap10 (개방형), 또는 chPD1-CD28 를 발현하는 T 세포를 RMA 세포 또는 배지와 배양하였다. 24 시간 후, (a) 사이토카인 및 (b) 케모카인의 분비를 ELISA 또는 LEGENDplex 분석으로써 무세포 상청액에서 측정하였다. chPD1-Dap10 T 세포는 RMA 세포와의 배양시 wtPD1- 또는 chPD1-CD28 T 세포와 비교했을 때 더 높은 수준의 친염증성 사이토카인 및 감소된 수준의 항-염증성 사이토카인을 생성하였다 (*P　< 0.01). (c) wtPD1 (삼각형), chPD1-Dap10 (원), 또는 chPD1-CD28 (다이아몬드) T 세포를, 지시된 효과기 대 표적 (E : T) 비 (1 : 1, 5 : 1, 25 : 1) 로 RMA 세포와 효과기 세포로서 이용하고, 세포 용해를 락테이트 데히드로게나아제 어세이를 이용하여 측정했다. 데이타는 평균 + SD 로 제시하고, 적어도 3 가지의 실험을 대표한다.
도 5A-B. Dap10 공동-자극 도메인의 포함은 키메라 프로그램된 사멸 1 (chPD1) T 세포에서 중심 기억 표현형을 유도한다. 야생형 (wt) PD1- (검정색), chPD1-Dap10 (개방형), 또는 chPD1-CD28 을 발현하는 T 세포를 RMA 세포 또는 배지와 배양하였다. 24 시간 후, (a) 효과기 및 중심 기억 분화를 제어하는 유전자의 발현을, RT-PCR 로써 측정하거나, 또는 (b) 세포 표면 마커 발현을 유세포 측정법으로써 측정하였다. RMA 세포로의 자극은, 배지에서의 배양과 비교할 때 유전자 또는 세포 표면 마커 발현을 변경시켰다 (*P　< 0.01). 데이터는 평균 + SD 로 제시하고, 적어도 2 가지의 실험을 대표한다.
도 6A-C. 키메라 프로그램된 사멸 1 (chPD1) -Dap10 T 세포로의 치료는, chPD1-CD28 T 세포로의 치료와 비교할 때 종양 부담의 더 큰 감소 및 RMA-GFP-보유 마우스의 증가된 생존을 도모한다. RMA-GFP 세포 (2 × 106) 를, B6 마우스에 제 0 일에, 정맥 내 (i.v.) 주사하였다. 마우스를 5 및 8 일 후에 2 회 투여량의 야생형 (wt) PD1 (검정색), chPD1-Dap10 (개방형), 또는 chPD1-CD28 T 세포 (5 × 106) 로 i.v. 치료하였다. (a) 마우스를 RMA-GFP 세포 주사 후 13 일 후에 사멸시키고, 종양 부담을 비장 및 림프절에서 RMA-GFP 세포의 개수를 계산함으로써 측정하였다 (n　= 6). (b) 마우스의 생존을 측정하였다 (n　= 6). chPD1-CD28 T 세포는 wtPD1 T 세포와 비교할 때 유의미하게 RMA 종양 부담을 감소시키고 생존을 증가시켰다 (*P　< 0.01). chPD1-Dap10 T 세포는 chPD1-CD28 T 세포보다 유의미하게 RMA 종양 부담을 감소시키고, 생존을 증가시켰다 (# P　< 0.01). (c) RMA-보유 마우스를 종양 세포 주입 후 5 일 후에, 5 × 106　Ly5.1+　chPD1-Dap10 (개방형) 또는 chPD1-CD28 T 세포로 i.v. 치료하였다. 비장 및 림프절 세포를 T-세포 주입 후 다양한 시점에서 단리시키고, Ly5.1+CD3+　세포의 백분율을 산출하였다 (n　= 4). chPD1-Dap10 T 세포는, chPD1-CD28 T 세포와 비교할 때 생체 내 증가된 지속성을 지녔다 (*P　< 0.01). 데이터는 평균 + SD 로서 제시되고, 2 가지의 독립된 실험을 대표한다.
암과 싸우기 위해 숙주 면역계를 이용하는 면역요법은 암 치료에 중요한 옵션을 제공한다. T 세포는 병에 걸린 세포를 표적으로 삼아 제거함으로써 질병으로부터 개체를 보호한다. 종양-특이적 T 세포는 단리 후 신체 외부에서 활성화 및 팽창한 다음 환자에게 재주입되어 암 퇴행을 매개할 수 있는데, 이는 입양 T 세포 요법으로 지칭되는 과정이다.
PD1 리간드를 표적으로 하는, 즉 PDL1 또는 PDL2 중 하나 이상을 표적으로 하는 CAR 이 본원에서 제공된다. 키메라 PD1 수용체 (chPD1) 폴리펩티드는 PDL1 및 PDL2 중 하나 이상에 대해 특이적인 세포외 결합 도메인; 트랜스멤브레인 도메인; 및 세포질 시그널링 도메인을 포함할 수 있다.
본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환하여 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기를 갖는 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 2 개 이상의 아미노산을 함유해야 하고, 단백질의 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 최대 개수의 아미노산에 대한 제한은 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 둘 이상의 아미노산을 갖는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에서 이용되는 바와 같이, 상기 용어는 당업계에서 흔히 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로서 지칭되는 단쇄와 당업계에서 일반적으로 단백질로 지칭되는 장쇄 양자 모두를 지칭하며, 여기에는 다수의 유형이 존재한다.
"폴리펩티드"는 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩티드, 올리고펩티드, 호모다이머, 헤테로다이머, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드 또는 이들의 조합물을 포함한다.
PDL1 및 PDL2 중 적어도 하나에 특이적인 (즉, 표적으로 삼거나, 인지하거나 또는 결합하는) 세포외 결합 도메인은 PD1 (CD279) 수용체의 세포외 도메인일 수 있다. PD1 수용체는 개체 자신의 세포에 대한 면역계 반응을 조절하는 역할을 하는 T 림프구와 같은 세포의 표면에서 발견되는 단백질이다. 인간에 있어서, PD1 단백질은 PDCD1 유전자에 의해 인코딩된다. PD1 에 대한 대표적인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 도메인은 PD1 의 아미노산 1-155 를 포함하거나 이로 이루어진다.
트랜스멤브레인 도메인은 세포 막을 가로지르는 소수성 폴리펩티드를 포함한다. 특히, 트랜스멤브레인 도메인은 세포막의 한 측면 (세포외) 에서부터 세포막의 다른 측면 (세포 내 또는 세포질) 에 걸쳐 있다. 트랜스멤브레인 도메인은 알파 나선형 또는 베타 배럴형 또는 이들의 조합일 수 있다. 트랜스멤브레인 도메인은 다수의 트랜스멤브레인 조각을 갖고 이들 각각이 알파-나선형, 베타 시트, 또는 이들의 조합인 폴리토픽 (polytopic) 단백질을 포함할 수 있다. 한 측면에서, CAR 내 도메인 중 하나와 자연스레 연관된 트랜스멤브레인 도메인이 사용된다. 또 다른 구현예에서, 트랜스멤브레인 도메인은 이러한 도메인의 동일 또는 상이한 표면 막 단백질의 트랜스멤브레인 도메인과 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형되어 수용체 복합체의 다른 구성원과 상호작용을 최소화할 수 있다.
예를 들어, 트랜스멤브레인 도메인은 T-세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD3 제타 사슬, CD28, CD3s, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 이들의 작용성 유도체, 및 이들의 조합의 트랜스멤브레인 도메인을 포함한다.
인위적으로 고안된 트랜스멤브레인 도메인은 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 주로 포함하는 폴리펩티드이다. 한 구현예에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항이 합성 트랜스멤브레인 도메인의 각 말단에서 발견된다.
CAR 의 세포질 시그널링 도메인은 세포외 리간드 결합 도메인의 표적과의 결합 후 세포내 시그널링을 담당하여 면역 세포의 활성화 또는 저해 및 면역 반응을 일으킬 수 있다. 다시 말해서, 신호 전달 (signal transducing) 도메인은 CAR 이 발현되는 면역 세포의 정상 효과기 기능 중 하나 이상의 활성화 또는 비활성화를 담당할 수 있다. 따라서, 용어 "세포질 시그널링 도메인"은 효과기 신호 기능 신호를 전달시키고 세포가 특수화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 본 개시의 CAR 에서 사용하기 위한 신호전달 도메인의 예는 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하도록 협력하여 작용하는 T 세포 수용체 및 공동-수용체의 세포질 서열뿐 아니라 이들 서열의 임의 유도체 또는 변이체 및 동일한 작용 능력을 갖는 임의의 합성 서열일 수 있다. 세포질 시그널링 서열은 ITAM 의 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프로서 공지된 시그널링 모티프를 포함할 수 있다. ITAM 은 syk/zap70 부류 티로신 키나아제에 대한 결합 부위로서 작용하는 다양한 수용체의 세포질내 꼬리에서 발견되는 잘 정의된 시그널링 모티프이다. ITAM 의 예는 비제한적인 예로서 TCR제타, FcR감마, FcR베타, FcR엡실론, CD3감마, CD3델타, CD3엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d 로부터 유래된 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR 의 시그널링 신호전달 도메인은 CD3제타 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 시그널링 신호전달 도메인은 CD3제타의 아미노산 52-164 를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, PD1 의 저해 도메인은 세포질 시그널링 도메인의 활성화 도메인으로 대체되어, 음성 PD1 시그널을 T 세포에 대한 활성화 시그널이 되도록 전환시킨다. 이는 PD1 의 면역 억제 효과를 감소시키고, 그 대신 PD1 리간드와의 상호작용시 항-종양 면역을 유도할 것이다.
CAR T 세포에서 공동-자극 도메인의 포함은 사이토카인 분비, 분화, 세포독성, 증식 및 생존을 포함한 T-세포 기능을 증강시킬 수 있다. 본 개시의 CAR 과 상용성인 공동-자극 수용체에는 이에 제한되는 것은 아니나, Dap10, CD28, OX40, ICOS, 4-1BB (CD137), NKG2C, 및 NKG2D 으로부터의 작용성 도메인, 및 이들의 활성화 단편, 작용성 유도체 및 그 조합이 포함된다. 실시예 1 에서 나타낸 바와 같이, CD28 및 Dap10 은 포스파티딜이노시톨-3 키나아제, AKT/단백질 키나아제 B 및 미토겐-활성화 단백질 키나아제를 포함하는 많은 유사한 경로를 활성화시킨다. 그러나, CD28 및 Dap10 자극은 β-카테닌, 핵 인자-κB 및 라파마이신의 포유류 표적 (mTOR) 을 포함하는 신호전달 경로의 차등 활성화를 포함해 효과기 T 세포에 대한 독특한 효과를 갖는 것으로 보이며, 이는 상이한 사이토카인 분비 및 T-세포 분화를 야기한다. 구체적으로, CD28 과 비교할 때, Dap10 을 통한 공동-자극은 CD8 T-세포 기억 분화 및 친-염증성이지만 항-염증성이 아닌 사이토카인의 분비를 유도하며, 이들 둘 모두 성공적인 CAR T-세포 치료요법에 바람직한 특성인 것처럼 보인다. 따라서, 일부 구현예에서, CAR 내 Dap10 공동-자극 도메인의 포함은 CD28 보다 바람직할 수 있다.
본원에서 개시된 바와 같은 폴리펩티드의 작용성-보존적 유도체 또는 변이체는 폴리펩티드의 구조에서 (및 이를 인코딩하는 DNA 서열에서) 이루어질 수 있는 변형 및 변화로 인해 발생할 수 있으며, 여전히 바람직한 특성 (예, 종양파괴성 및/또는 면역자극성 효과) 을 갖는 작용성 분자를 수득할 수 있다. 작용성-보존적 유도체는 또한 이것의 작용성을 유지하는 폴리펩티드의 단편으로 이루어질 수도 있다.
따라서, 작용성-보존적 유도체 또는 변이체는, 단백질 내 제공된 아미노산 잔기가, 이에 제한되는 것은 아니나, 아미노산의 유사한 특성 (예, 예를 들어 극성, 수소 결합 전위, 산성, 염기성, 소수성, 방향족 등) 을 갖는 것으로의 대체를 포함해, 폴리펩티드의 전체 형태 (conformation) 및 기능을 변경시키지 않으면서 변화되어진 것이다. 보존된 것으로 지시된 것 이외의 아미노산은 단백질이 상이하여, 유사한 기능의 임의의 두 단백질 사이의 단백질 또는 아미노산 서열 유사성%은 변할 수 있고, 예를 들어 유사성이 MEGALIGN 알고리즘에 기초하는 클러스터 방법에 의한 것과 같은 정렬 방식에 따라 측정된 바와 같이 70% 내지 90% 일 수 있다. 작용성-보존적 유도체는 또한 BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상의 아미노산 상동성을 갖고, 이것이 비교되는 천연 또는 부모 단백질과 동일하거나 실질적으로 유사한 특성 또는 작용을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 특정 아미노산은 종양파괴 효과의 현저한 손실 없이 단백질 구조에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 생물학적 작용성 활성을 정의하는 것이 단백질의 상호작용 능력 및 성질이기 때문에, 특정 아미노산 치환이 단백질 서열에서는 물론 이것의 DNA 인코딩 서열에서 행해질 수 있지만, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 가진 단백질을 수득할 수 있다. 따라서, 본 개시의 폴리펩티드 서열 또는 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 상응하는 DNA 서열에서, 이들의 생물학적 활성의 현저한 손실 없이 다양한 변화가 행해질 수 있는 것이 고려된다. 상기 종양파괴 활성 및 면역자극 활성은 당업계에 익히 공지되어 있는 다양한 기술, 예컨대 실시예에서 언급된 어세이에 의해 평가될 수 있다.
전술한 바와 같이, 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초한다. 앞서의 특징들 중 몇 가지를 고려한 예시적인 치환은 당업자에게 익히 공지되어 있으며 하기를 포함한다: 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신.
본 개시의 폴리뉴클레오티드는 벡터로 클로닝될 수 있다. "벡터"는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하고 그 단리된 폴리뉴클레오티드를 세포의 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연관된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 및 바이러스를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 다양한 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 바이러스는 파지, 파지 유도체를 포함한다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 핵산을 세포 내로 전달하는 것을 용이하게 하는 비(非)플라스미드 및 비(非)바이러스성 화합물, 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예에는 이에 제한되는 것은 아니나 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 포함된다.
한 구현예에서, 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 혼입 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함한다. 한 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 한 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 한 구현예에서, 조작된 세포는 바이러스 형질도입되어 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시킨다.
벡터로서 유용한 바이러스는 이에 제한되는 것은 아니나 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 작용성인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택성 마커를 함유한다.
키메라 항원 수용체 폴리뉴클레오티드의 발현은 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니나 SFFV 또는 인간 신장 인자 11a (EF) 프로모터, CAG (CMV 인핸서를 갖는 치킨 베타-액틴 프로모터) 프로모터 인간 신장 인자 la (EF) 프로모터 중 적어도 하나를 포함하는 발현 벡터를 이용하여 달성될 수 있다. 활용된 덜 강한 / 저 발현 프로모터의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 거대세포바이러스 (CMV) 최조기 프로모터, 유비퀴틴 C (UBC) 프로모터, 및 포스포글리세레이트 키나아제 1 (PGK) 프로모터 또는 그 부분을 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체의 유도성 발현은 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니나 TRE3GV (Tet-반응 요소, 모든 세대, 및 바람직하게 제 3 세대 포함), 유도성 프로모터 (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) 또는 그의 부분 또는 조합을 포함한 테트라사이클린 반응성 프로모터를 이용하여 달성될 수 있다.
유전자를 세포 내로 도입 및 발현시키는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터의 문맥에서, 벡터는 용이하게 숙주 세포, 예를 들어 포유류, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포에 당업계의 임의의 방법에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 숙주 세포에 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 전달될 수 있다.
입양 T 세포 치료요법은 T 세포를 개체의 혈액에서 단리하고 이러한 T 세포를 유전자 조작하여 본 개시의 CAR 을 발현시키는 것을 포함한다. 조작된 T 세포는 이후 생체 외에서 성장하고 다시 개체로 주입된다. CAR T 세포는 이어서 암 세포 상 표적된 항원과 결합하여 이들을 사멸시킬 수 있다.
본 개시의 한 구현예는 조작된 세포, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 CAR 폴리펩티드 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 본원에 기재된 T 세포/림프구를 제공한다. "조작된 세포"는 유전자, DNA 또는 RNA 서열, 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 첨가 또는 변형에 의해 변형, 형질전환 또는 조작된 임의의 유기체의 임의의 세포를 의미한다. 본 개시의 단리된 세포, 숙주 세포 및 유전자 조작된 세포는 CAR 또는 CAR 복합체를 인코딩하는 DNA 또는 RNA 서열을 함유하고 세포 표면 상에 키메라 수용체를 발현하는 NK 세포 및 T 세포와 같은 단리된 면역 세포를 포함한다. 단리된 숙주 세포 및 조작된 세포가 예를 들어 NK 세포 활성 또는 T 림프구 활성 증강을 위해, 암 치료 및 감염병 치료를 위해 사용될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 이것의 막 내로 발현할 수 있고/있거나 혼입할 수 있는 임의의 세포가 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 조작된 세포는 면역조절 세포를 포함한다.
면역조절 세포는 T-세포 (또는 T 림프구), 예컨대 CD4 T-세포 (보조 T-세포), CD8-T 세포 (세포독성 T-세포, CTL), 및 기억 T 세포 또는 기억 줄기 세포 T 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, T-세포는 자연 살해 T-세포 (NK T-세포)를 포함한다.
본 개시의 구현예는 필요로 하는 대상체의 암 치료 방법으로서, 상기 암의 세포는 PDL1 및 PDL2 중 하나 이상을 발현하는 것이며, 이 방법은 대상체에게 본 개시에 따른 CAR 을 발현하도록 유전자 조작된 T 세포를 포함하는 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
세포의 성질에 따라, 세포는 숙주 유기체 내로, 예를 들어 포유류 내로 다양한 방식으로 도입될 수 있다. 대안적인 구현예에서 세포는 암을 개량하거나 암에 개량하도록 변형되지만 특정 구현예에서 세포는 종양 부위에 도입될 수 있다. 사용되는 세포의 개수는 다수의 환경, 도입 목적, 세포의 수명, 사용되는 프로토콜, 예를 들어 투여 횟수, 세포의 증식 능력, 재조합 구축물의 안정성 등에 따라 좌우될 것이다. 세포는 분산액으로서 적용될 수 있으며, 일반적으로 관심있는 부위에 또는 그 주위에 주입된다. 세포는 생리학적으로 허용가능한 배지에 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, 투여 경로는 예를 들어 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하일 수 있다. 다수 투여는 동일한 경로로써 또는 상이한 경로로써 행해질 수 있다. 일부 구현예에서, 다중 투여량, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 투여량이 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 일 또는 그 이상의 일에 걸친 일정한 기간에 걸쳐 제공된다.
CAR T 세포의 주입 후 부작용 중 하나는 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 으로서 공지된 면역 활성화의 개시이다. 일부 구현예에서, IFN-γ, GM-CSF, IL-10 및 IL-6 로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인의 상승을 유도하지 않는 공동-자극 도메인이 이용된다. 일부 구현예에서, 토실리주맙 (tocilizumab; IL-6 안타고니스트) 과 같은 CRS 치료요법은 본 개시의 CAR 과 함께 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 방사선치료 및/또는 화학요법이 본 개시의 CAR 과 함께 또는 순차적으로 적용된다.
본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "암", "과증식성" 및 "신생물성"은 자율적 성장 능력을 갖는, 즉 빠르게 증식하는 세포 성장을 특징으로 하는 비정상적 상태 또는 병태의 세포를 지칭한다. 과증식성 및 신생물성 질병 상태는 병리학적, 즉 질병 상태를 특성화하거나 구성하는 것으로서 분류될 수 있거나, 또는 비병리학적, 즉 정상에서 벗어나 있지만 질병 상태와 관련되지 않은 것으로 분류될 수 있다. 이 용어는 조직병리학적 유형 또는 침습성 단계와 관계 없이 모든 유형의 암적 성장 또는 발암성 과정, 전이 조직 또는 악성 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "암 전이"는 이것의 당업계에서의 일반적인 의미를 갖고 한 기관 또는 부분에서 또 다른 비인접한 기관 또는 부분으로 종양이 퍼지는 것을 지칭한다.
이에 제한되는 것은 아니나 림프종, 흑색종, 골수종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선 암, 뇌암, 간암, 신장암, 폐암, 비장암, 담낭암, 항문암, 고환암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 골암, 및 결장암을 포함하는 PDL1 및 PDL2 중 적어도 하나를 발현하는 임의의 암 또는 전이성 암은 본 발명의 치료요법을 이용하여 표적화될 수 있다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 암을 앓고 있거나 또는 암이 있을 것으로 의심스럽거나, 그 위험이 있거나 또는 암에 취약한 포유류와 같은 동물을 지칭한다. 이 용어는 인간을 지칭할 수 있다. 이 용어는 또한 말, 소, 양, 가금류, 어류, 돼지, 고양이, 개 및 동물원 동물, 염소, 유인원 (예, 고릴라 또는 침팬지) 및 설치류, 예컨대 래트 및 마우스를 포함한, 음식용, 스포츠용 또는 애완 동물용으로 사육된 가축을 포함한다. 전형적인 대상체는 암에 걸리기 쉽거나 암을 앓고 있거나 또는 암을 앓았던 사람을 포함한다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 본원에서 이용되는 바와 같이 그러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태, 또는 그러한 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 역전, 완화, 그 진행을 저해, 또는 개선시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 개시의 치료는 상기 암의 성장을 늦추거나, 상기 암에서 종양 세포의 수를 감소시키거나, 종양 부하를 감소시키거나, 또는 상기 암을 제거할 수 있다.
"치료학적 유효량"이란, 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 이익/위험률로 암을 치료하기에 (예를 들어, 종양 성장을 제한하거나 또는 종양 전이를 늦추거나 차단하기에) 충분한 양의 분자를 의미한다. 그러나, 본 개시의 분자 및 조성물의 일일 총 사용량은 건강한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것임은 이해될 것이다. 임의의 특정 대상체에 대한 특정 치료학적 유효량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용된 특정 폴리펩티드의 활성; 사용된 특정 조성물, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이요법; 투여 시간, 투여 경로, 및 사용된 특정 폴리펩티드의 배출 속도; 치료 기간; 사용된 특정 폴리펩티드와 조합되어 또는 동시에 사용된 약물; 의학 분야에서 익히 공지된 유사 인자를 포함하는 다양한 인자에 따라 가변적일 것이다. 예를 들어, 원하는 치료 효과를 달성하는데 요구되는 수준보다 더 낮은 수준으로 화합물의 투여량을 시작하고 원하는 효과가 달성될 때까지 점차적으로 투여량을 증가시키는 것이 당업자의 능력 범위 내에 익히 존재한다.
본원에서 기술된 T 세포 치료요법은 표준 치료 (예, 방사선요법, 호르몬 요법) 와 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 림프구는 하나 이상의 화학치료제 또는 방사선치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 화학치료제 또는 방사선치료제는 항암제로서 사용되는 치료 활성제이다. 예를 들어 상기 항암제는 이에 제한되는 것은 아니나 하기를 포함한다: 플루다라빈 (fludarabine), 겜시타빈 (gemcitabine), 카페시타빈 (capecitabine), 메토트렉세이트 (methotrexate), 메르캅토퓨린 (mercaptopurine), 티오구아닌 (thioguanine), 히드록시우레아 (hydroxyurea), 사이타라빈 (cytarabine), 시클로포스파미드, 이포스파미드 (ifosfamide), 니트로소우레아 (nitrosourea), 백금 착물, 예컨대 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin) 및 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 미토마이신 (mitomycin), 다카르바진 (dacarbazine), 프로카르바진 (procarbazine), 에피포도필로톡신 (epipodophyllotoxin), 예컨대 에토포시드 (etoposide) 및 테니포시드 (teniposide), 캄토테신 (camptothecin), 예컨대 이리노테칸 (irinotecan) 및 토포테칸 (topotecan), 블레오마이신 (bleomycin), 독소루비신 (doxorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 플리카마이신 (plicamycin), 미톡산트론 (mitoxantrone), L-아스파라기나아제, 독소루비신 (doxorubicin), 에피루비신 (epirubicin), 5-플루오로우라실 및 류코보린 (leucovorin) 과 조합된 5-플루오로우라실, 탁산 (taxane), 예컨대 도세탁셀 (docetaxel) 및 파클리탁셀 (paclitaxel), 레바미솔 (levamisole), 에스트라무스틴 (estramustine), 질소 머스타드, 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴 (carmustine) 및 로무스틴 (lomustine), 빈카 알칼로이드 (vinca alkaloid), 예컨대 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신 (vindesine) 및 비노렐빈 (vinorelbine), 이마티닙 메실레이트 (imatinib mesylate), 헥사메틸멜라민 (hexamethylmelamine), 키나아제 저해제, 포스파타아제 저해제, ATPase 저해제, 티르포스틴 (tyrphostin), 프로테아제 저해제, 저해제 헤르비마이신 (herbimycin) A, 게니스테인 (genistein), 에르브스타틴 (erbstatin), 및 라벤두스틴 (lavendustin) A. 한 구현예에서, 추가적인 항암제는 하기 부류의 작용제 중 하나 또는 그 조합으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다: 알킬화제, 식물 알칼로이드, DNA 토포이소머라아제 저해제, 안티폴레이트, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, DNA 항대사제, 탁산, 포도필로톡신 (podophyllotoxin), 호르몬 요법, 레티노이드, 감광제 또는 광역학 요법, 혈관신생 저해제, 항유사분열제, 이소프레닐화 저해제, 세포 주기 저해제, 액티노마이신 (actinomycin), 블레오마이신 (bleomycin), 안트라시클린 (anthracycline), MDR 저해제 및 Ca2+ ATPase 저해제.
추가적인 항암제는 이에 제한되는 것은 아니나 하기로부터 선택될 수 있다: 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 성장 저해 인자, 호르몬, 가용성 수용체, 디코이 (decoy) 수용체, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성 항체, 모노바디, 폴리바디.
추가의 치료 활성제는 항구토제일 수 있다. 적합한 항구토제는 이에 제한되는 것은 아니나 하기를 포함한다: 메토클로프라미드 (metoclopramide), 돔페리돈 (domperidone), 프로클로르페라진 (prochlorperazine), 프로메타진 (promethazine), 클로르프로마진 (chlorpromazine), 트리메토벤자미드 (trimethobenzamide), 온단세트론 (ondansetron), 그라니세트론 (granisetron), 히드록시진 (hydroxyzine), 아세틸류신 (acetylleucine), 알리자프리드 (alizapride), 아자세트론 (azasetron), 벤즈퀴나미드 (benzquinamide), 비에타나우틴 (bietanautine), 브로모프리드 (bromopride), 부클리진 (buclizine), 클레보프리드 (clebopride), 시클리진 (cyclizine), 디멘히드리네이트 (dimenhydrinate), 디페니돌 (diphenidol), 도라세트론 (dolasetron), 메클리진 (meclizine), 메탈라탈 (methallatal), 메토피마진 (metopimazine), 나빌론 (nabilone), 피파마진 (pipamazine), 스코폴라민 (scopolamine), 술피리드 (sulpiride), 테트라히드로카나비놀 (tetrahydrocannabinol), 티에틸페라진 (thiethylperazine), 티오프로페라진 (thioproperazine) 및 트로피세트론 (tropisetron). 바람직한 구현에에서, 항구토제는 그라니세트론 또는 온단세트론이다.
또 다른 구현예에서, 또 다른 치료 활성제는 아편유사 (opioid) 또는 비아편유사 (non-opioid) 진통제일 수 있다. 적합한 아편유사 진통제에는 이에 제한되는 것은 아니나 하기가 포함된다: 모르핀, 헤로인, 히드로모르폰, 히드로코돈, 옥시모르폰, 옥시코돈, 메토폰, 아포모르핀, 부프레노르핀, 메페리딘, 로페라미드, 에토헵타진 (ethoheptazine), 베타프로딘, 디페녹실레이트, 펜타닐 (fentanyl), 수펜타닐 (sufentanil), 알펜타닐 (alfentanil), 레미펜타닐 (remifentanil), 레보파놀 (levorphanol), 덱스트로메토판 (dextromethorphan), 페나존 (phenazone), 페마조신 (pemazocine), 시클라조신 (cyclazocine), 메타돈 (methadone), 이소메타돈 (isomethadone) 및 프로폭시펜 (propoxyphene). 적합한 비아편유사 진통제에는 이에 제한되는 것은 아니나 하기가 포함된다: 아스피린, 셀레콕시브 (celecoxib), 로페콕시브 (rofecoxib), 디클로페나크 (diclofenac), 디플루니살 (diflunisal), 에토돌락 (etodolac), 페노프로펜 (fenoprofen), 플루르비프로펜 (flurbiprofen), 이부프로펜 (ibuprofen), 케토프로펜 (ketoprofen), 인도메타신 (indomethacin), 케토로락 (ketorolac), 메클로페나케이트 (meclofenamate), 메페나믹산 (mefenamic acid), 나부메톤 (nabumetone), 나프록센 (naproxen), 피록시캄 (piroxicam) 및 술린다크 (sulindac).
또 다른 구현예에서, 추가 치료 활성제는 항불안제일 수 있다. 적합한 항불안제에는 이에 제한되는 것은 아니나 부스피론 (buspirone), 및 벤조디아제핀 (benzodiazepine), 예컨대 디아제팜 (diazepam), 로라제팜 (lorazepam), 옥사자팜 (oxazapam), 클로라제페이트 (clorazepate), 클로나제팜 (clonazepam), 클로르디아제폭시드 (chlordiazepoxide) 및 알프라졸람 (alprazolam) 이 포함된다.
본원에서 이용되는 바와 같은 용어 "방사선치료제"는 제한 없이 암을 치료 또는 개선하는데 효과적인 것으로 당업자에게 공지되어 있는 임의의 방사선치료제를 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 방사선치료제는 근접치료 또는 방사선핵종 요법에서 투여되는 것과 같은 약제일 수 있다. 이러한 방법은 임의로는 하나 이상의 추가적인 암 요법, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나 화학요법 및/또는 기타 방사선요법의 투여를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시의 또 다른 측면은 본 개시에 따른 T 림프구 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. "약학적" 또는 "약학적으로 허용가능한"이란, 적절하게 인간과 같은 대상체에게 투여될 때 부작용, 알러지 또는 기타 유해 반응을 일으키지 않는 분자 독립체 (entity) 및 조성물을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 재료 또는 모든 유형의 제형 보조제를 지칭한다.
본 개시의 T 림프구는 안정성을 유지하기 위해 생리 식염수, 인산염 완충 식염수 (PBS), 배양 배지 등에 함유될 수 있다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 주사될 수 있는 제형물에 약학적으로 허용가능한 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성, 멸균성, 식염수 용액 (모노소듐 또는 디소듐 포스페이트, 소듐, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등, 또는 이러한 염의 혼합물) 일 수 있거나, 또는 멸균수 또는 생리 식염수의 첨가 시, 경우에 따라 주사용 용액의 구성을 허용하느 건조, 특히 동결 건조된 조성물일 수 있다.
주사용으로 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형물; 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에서, 상기 형태는 멸균되어야 하며, 용이하게 주사 가능할 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다.
유리 염기 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로서 본 개시의 화합물을 포함하는 용액은 계면활성제, 예컨대 히드록시프로필셀룰로오스와 적절히 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다.
약학적으로 허용가능한 염은 산 부가 염 (단백질의 유리 아미노기로 형성됨) 을 포함하는데, 이는 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산과 같은 유기산 등으로 형성된다. 자유 카르복실기로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대 예를 들어 소듐, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철 및 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다.
담체는 또한 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산액 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 (thimerosal) 등에 의해 도모될 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들어 당 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 겔라틴과 같이 흡수 지연제의 조성물에서의 사용으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기 열거된 몇 가지 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양으로 T 림프구를 혼입한 후 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을, 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분 및 염기성 분산 매질을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 이의 앞서 멸균-여과된 용액으로부터의 임의 추가 바람직한 성분의 분말을 생성하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
용매로서 DMSO 를 이용하여 매우 빠르게 침투시켜 작은 종양 영역에 고농도의 활성제를 전달하는 것이 상상되는, 직접 주사를 위한 더욱 또는 고도의 농축된 용액의 제조가 또한 고려된다.
제형화시, 용액은 투여 제형물과 양립가능한 방식으로 및 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형물은 다양한 투여 형태로, 예컨대 상기 기재된 주사 가능한 용액의 형태로 용이하게 투여되나, 약물 방출 캡슐 등도 또한 사용될 수 있다.
수용액으로의 비경구 투여를 위해, 예를 들어 용액은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제가 먼저 충분한 식염수 또는 글루코오스와 등장성이어야 한다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강 내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시에 견주어 볼 때 당업자에게 공지될 것이다. 치료되는 대상체의 상태에 따라 일부 투여량의 변화가 반드시 발생할 것이다. 투여 책임자는 어떠한 경우에서든 개별 대상체에 대해 적절한 투여량을 결정할 것이다.
정맥내 또는 근육내 주사와 같이 비경구 투여를 위해 제형화된 본 개시의 조성물에 부가하여, 기타 약학적으로 허용가능한 형태는 예를 들어 경구 투여를 위한 정제 또는 다른 고체; 리포솜 제형물; 시간 방출 캡슐; 및 임의의 현재 사용중인 기타 형태를 포함한다.
본원에서 기술된 임의의 조성물은 키트에 포함될 수 있다. 비제한적인 예에서, 본 개시에 따른 재조합 발현된 CAR 을 보유하는 세포 요법에 사용되는 하나 이상의 세포 및/또는 세포 요법에 사용되는 하나 이상의 세포를 생성하기 위한 시약이 키트에 포함될 수 있다. 키트 구성 요소는 적합한 용기 수단으로 제공된다. 특정 구현예에서, 키트는 벡터, 프라이머, 효소 (제한 효소, 리가아제, 폴리머라아제, 등), 완충제, 뉴클레오티드 등과 같은 재조합 조작 시약을 포함한다.
키트의 일부 구성 요소는 수성 매질 또는 동결 건조된 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 일반적으로 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 보틀, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 것이며, 여기에 구성 요소가 배치될 수 있고, 바람직하게는 적절히 분취될 수 있다. 키트에 하나 이상의 구성 요소가 존재하는 경우, 키트는 또한 일반적으로 제 2, 제 3, 또는 다른 추가 용기를 함유할 것이며, 여기에 추가적인 구성 요소가 별도로 배치될 수 있다. 그러나, 구성 요소의 다양한 조합이 바이알에 포함될 수 있다. 본 개시의 키트는 또한 전형적으로 상업적인 판매를 위해 구성 요소를 밀접하게 유폐시켜 함유하는 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기는 원하는 바이알이 유지되는 인젝션 또는 블로우-몰딩 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
본 발명은 물론 변경될 수 있는 것으로서 설명된 특정 구현예로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 본 발명의 범위가 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 이것으로 제한하려는 의도가 없음을 이해해야 한다.
본 명세서에서 인용된 모든 공보 및 특허는 각각의 개별 공보 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참조로써 통합되는 것으로 지시되는 것처럼 본원에서 참조로 통합되고, 공보가 인용하는 방법 및/또는 재료를 개시하고 기술하도록 본원에서 참조로 통합된다. 임의의 공보의 인용은 출원 이전에 그것의 개시에 대한 것이며, 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 공보를 대체할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 제공된 공보 날짜는 실제 공보 날짜와는 상이할 수 있으며, 이는 독립적으로 확인해야 할 필요가 있을 수 있다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 그 범위의 상한 및 하한과 그 언급된 범위 내의 임의의 기타 명시된 또는 개재된 값 사이에서 하한 단위의 10 분의 1 까지 각 개재 값은 본 발명 내에 포함된다는 것이 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 특별히 배제된 한도에 따라 본 발명 내에 포함되기도 한다. 언급된 범위는 한도 중 하나 또는 양쪽 모두를 포함하는 경우, 이들 포함된 한도 중 하나 또는 양쪽 모두를 제외한 범위도 또한 본 발명에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 바와 같이 단수 형태는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하는 점에 유의한다. 청구 범위는 임의의 선택적인 요소를 배제하도록 작성될 수 있음을 추가로 유의한다. 이와 같이, 이 진술은 청구 범위 요소의 언급 또는 "부정적인" 한도의 사용과 관련하여 "단독으로", "오직" 등과 같은 배타적인 용어의 사용에 대한 선행 기초로서 제공되도록 의도된다.
본 개시를 판독하자마자 곧 당업자에게 명백하게 되는 바와 같이, 본원에서 설명되고 도시된 각각의 개별 구현예는 본 발명의 영역 또는 사상으로부터 벗어나지 않은 채 기타 몇몇의 구현예 중 임의의 것의 특징으로부터 용이하게 분리될 수 있거나 이와 조합될 수 있는 명백한 성분 및 특징을 가진다. 임의의 인용된 방법은 인용된 이벤트 순서 또는 가능한 논리적인 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 발명은 본 발명을 추가로 설명하고 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되거나 해석되어서는 안되는 하기의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예 1. 림프종에 대한 면역치료제로서 키메라-PD1-Dap10 수용체를 발현하는 쥐과동물 T 세포의 입양 전달
개요
T 세포의 입양 전달은 유망한 암 치료요법이고, 키메라 항원 수용체의 발현은 종양 인지 및 T-세포 효과기 기능을 강화시킬 수 있다. CD3ζ의 세포질 도메인에 융합된 PD1 세포외 도메인을 포함하는 쥐과동물 키메라 PD1 수용체 (chPD1) 가 본원에 제공된다. 추가적으로, 키메라 항원 수용체 치료요법은 효능을 강화시키기 위해 다양한 공동-자극 도메인을 이용한다. 따라서, chPD1 수용체에서 Dap10 또는 CD28 공동-자극 도메인의 포함을 비교하여 어느 도메인이 림프종의 마우스 모델에서 최적의 항-종양 면역을 유도했는지 알아냈다. chPD1 T 세포는 친염증성 사이토카인을 분비하고, RMA 림프종 세포를 용해하였다. chPD1 T 세포의 입양 전달은 확립된 종양을 유의미하게 감소시켰고 림프종-보유 마우스에서 종양-미함유 생존을 이끌었다. Dap10 또는 CD28 도메인을 함유하는 chPD1 수용체를 비교할 때, 양쪽 모두의 수용체는 친염증성 사이토카인의 분비를 유도하였다; 그러나, chPD1-CD28 T 세포는 또한 항염증성 사이토카인을 분비한 반면, chPD1-Dap10 T 세포는 그렇지 않았다. 게다가, chPD1-Dap10 는 효과기 기억 표현형을 유도하는 chPD1-CD28 과 비교되는 중심 기억 T-세포 표현형을 유도하였다. chPD1-Dap10 T 세포는 또한 chPD1-CD28 T 세포와 비교시 항-종양 효능 및 생체 내 지속성을 강화시켰다. 따라서, chPD1 T 세포의 입양 전달은 림프종에 대한 신규한 치료요법을 나타내며, 키메라 항원 수용체 내 Dap10 공동-자극 도메인의 포함은 항-종양 치료요법에 대한 바람직한 사이토카인 프로파일 및 T-세포 분화 표현형을 유도할 수 있다.
재료 및 방법
wtPD1 및 chPD1 구축물의 제조
CD3ζ, PD1, CD28 및 Dap10 의 쥐과동물 cDNA 클론을, OriGene (Rockville, MD) 로부터 구입하였다. chPD1-Dap10 및 chPD1-CD28 수용체를, Phusion® 고정확성 DNA 폴리머라아제 (New England BioLabs, Ipswich, MA) 를 이용하여 PCR 중복으로써 제조하였다. chPD1-Dap10 수용체를 제조하기 위해, 쥐과동물 PD1 수용체의 세포외 도메인 [아미노산 (aa) 1-155] 을 CD28 의 트랜스멤브레인 영역 (aa 141-177) 및 Dap10 (aa 57-79) 및 CD3ζ (aa 52-164) 의 세포질 도메인과 프레임으로 융합하였다. chPD1-CD28 수용체를 제조하기 위해, 쥐과동물 PD1 수용체의 세포외 도메인 (aa 1-155) 을 CD28 의 트랜스멤브레인 (aa 141-177) 및 세포질 (aa 178-218) 도메인 및 CD3ζ (aa 52-164) 과 프레임으로 융합하였다. 야생형 PD1 (wtPD1) 수용체를 제조하기 위해, PD1 수용체의 세포외 및 트랜스멤브레인 도메인 (aa 1-190) 을 이용하였다. 모든 구축물을 플라스미드 및 구축물의 NotI 및　EcoRI 소화 (digestion) 를 이용하는 pQCXIN 레트로바이러스 발현 벡터에 클로닝하였고, 후속해서 벡터에 리게이션하였다. 제조자 지침 (Clontech, Mountain View, CA) 에 따라 EcoPack 2-293 세포주를 이용하여 동종숙주역 (Ecotropic) 레트로바이러스 상청액을 발현하였다. Xfect 중합체를 이용해 RetroX-Q 벡터 세트 (Clontech) 로부터의 pQCXIN 레트로바이러스 발현 벡터 및 pEco 외피 벡터로 EcoPack 2-293 세포를 공동 트랜스펙션하였다. RetroX 농축기를 이용하여 1차 쥐과동물 T 세포의 형질도입 전에 동종숙주역 레트로바이러스 상청액을 농축시켰다.
T 세포에서 wtPD1 및 chPD1 수용체의 발현
수컷 C57BL/6 (B6) 및 B6.SJL-Ptprc a 　(Ly5.1 유사유전자형) 마우스를 Taconic Biosciences (Hudson, NY) 로부터 구입하였다. 마우스는 각 실험 시작 때 8 내지 12 주령이었다. 모든 동물 작업은 Longwood University's Institutional Animal Use and Care Committee 로부터 승인받고 이에 따라 수행했다. B6 또는 Ly5.1 유사유전자형 마우스로부터의 비장세포를 18 시간 동안 콘카나발린 A (concanavalin A) (1 ㎍/㎖) 로 활성화하였다. T 세포 (0.5 × 106　세포/㎖) 를, 8 ㎍/㎖ 폴리브렌 및 25 U/㎖ 재조합 인간 인터류킨-2 (IL2) 의 존재 하에서 1 시간 동안 1000　 g 　로 원심분리함으로써 형질도입하고, 후속해서 레트로바이러스 상청액을 제거하고 10% 열-불활성화 소태아 혈청, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 1 mM 피루베이트, 10 mM　HEPES, 0.1 mM　불필수 아미노산 및 50 μM　2-메르캅토에탄올로 보충된 신선한 완전 RPMI-1640 배지로 대체하기 전에 6 시간 동안 배양했다. 감염 후 2 일째에, T 세포를 추가 3 일 동안 G418 (0.5 mg/㎖) + 25 U/㎖ 재조합 인간 IL-2 를 함유하는 완전 RPMI-1640 배지에서 선택하였다. 생존 세포를 Histopaque-1083 (Sigma, St Louis, MO) 를 이용하여 단리시키고, 기능 분석 전 G418 없이 추가 2 일 동안 확장시켰다.
RT-PCR
전체 RNA 를 제조자 지침 (Promega, Madison, WI) 에 따라 SV Total RNA 단리 키트를 이용하여 RMA 세포 또는 T 세포로부터 단리하였다. cDNA 를 랜덤 헥사머 프라이머 (Fermentas, Waltham, MA) 를 이용한 RevertAid First Strand cDNA 합성 키트를 이용해 제조했다. RT-PCT 에 대한 주형으로서, 100 ng 의 cDNA 를 이용해 PDL1, PDL2 및 β-액틴의 유전자 발현을 측정했다. Maxima SYBRGreen qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, MA) 및 유전자 특이적 프라이머를 이용했다:　β-액틴 F 5'-GTGTGATGGTGGGAATGGGTCAGA-3' (SEQ ID NO: 4) ,　β-액틴 R 5'-TACGACCAGAGGCATACAGGGACA-3' (SEQ ID NO: 5), PDL1 F 5'-GCTCCAAAGGACTTGTACGTG-3' (SEQ ID NO: 6), PDL1 R 5'-TGATCTGAAGGGCAGCATTTC-3' (SEQ ID NO: 7), PDL2 F 5'-CTGCCGATACTGAACCTGAGC-3' (SEQ ID NO: 8), PDL2 R 5'-GCGGTCAAAATCGCACTC-3' (SEQ ID NO: 9). T-세포 분화 유전자 T-bet, BLIMP1, Eomes 및 BCL6 에 대한 유전자-특이적 프라이머는 앞서 기술하였다. 프라이머는 Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) 에서 구입하였다.
유세포 측정법
RMA 및 T 세포 상 PDL1 및 PDL2 의 발현 및 T 세포 상 PD1 의 발현을 유세포 측정법을 이용하여 테스트하였다. 세포를 알로피코시아닌-표지된 항-PDL1 (클론 10F.9G2), 피코에리트린-표지된 항-PDL2 (클론 TY25), 또는 피코에리트린-표지된 항-PD1 (클론 RMP1-30) 항체 또는 이소타입 대조군으로 염색하였다. T-세포 분화 연구를 위해, wtPD1 또는 chPD1 T 세포 (2 × 105　세포/웰) 를 RMA 세포 (2 × 105　세포/웰) 로 24 시간 동안 자극하고, 유세포 측정법에 의해 세포 표면 마커 발현에 대해 분석했다. 세포를 피코에리트린-컨쥬게이션된 항-CD127 (클론 A7R34) 또는 항-KLRG1 (클론 2F1/KLRG1) 및 알로피코시아닌-컨쥬게이션된 항-CD62L (클론 MEL-14) 또는 이소타입 대조군으로 염색했다. T-세포 표면 발현을 분석하기 위해, RMA 세포를 인큐베이션 이전에 CFSE 로 표지하고, CFSE+　세포를 밖으로 게이팅하였다 (gating out). 모든 항체는 BioLegend (San Diego, CA) 로부터 구입했다. 세포 형광을 Accuri C6 유세포 측정기를 이용하여 측정했다.
chPD1 T 세포에 의한 사이토카인 생성 및 세포독성
chPD1, wtPD1 및 비형질도입된 T 세포 (105) 를, 둥근-바닥 96-웰 플레이트에서 배지 또는 RMA 세포 (105) 와 배양했다. 24 시간 후, 무세포 상청액을 인터페론-γ　(IFN-γ), 종양 괴사 인자-α　(TNF-α), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), IL-2 및 IL-10 의 존재에 대해, 제조자 지침 (BioLegend) 에 따라 ELISA 로써 테스트하였다. 사이토카인 및 케모카인 분비를 또한 제조자 지침에 따라 마우스 T 헬퍼 사이토카인 및 마우스 친염증성 케모카인 LEGENDPlex 어세이 (BioLegend) 를 이용하여 무세포 상청액에서 측정하였다.
종양 세포의 용해를 알아내기 위해, chPD1, wtPD1 및 비형질도입된 T 세포 (105) 를, 다양한 효과기 대 표적 비 (E : T 25 : 1, 5 : 1, 및 1 : 1) 로 하여 RMA 와 배양하였다. 특정 용해를 제조자 지침에 따라 락테이트 데히드로게나아제 세포독성 어세이 키트 (Pierce, Waltham, MA) 를 이용하여 5 시간 후에 측정했다. PD1 수용체를 차단하기 위해, T 세포를 37°에서 2 시간 동안 항-PD1 모노클로날 항체 (클론 RMP1-14, 20 ㎍/㎖, 저 내독소, 정제된 아지드-비함유 LEAF, BioLegend) 또는 이소타입 대조군 모노클로날 항체와 표적 세포 첨가 이전에 사전 인큐베이션하였다.
유전적으로 변형된 T 세포로의 마우스 치료
RMA 및 RMA-GFP 세포를, 완전 RPMI-1640 에서 성장시켰다. RMA-GFP 세포 (2 × 106) 를 B6 마우스에 정맥 내 주사하였다. 종양 부담 실험을 위해, 마우스에 종양 주입 후 2 일 또는 5 일 후에 1 회 투여량의 wtPD1 또는 chPD1-변형된 T 세포 (5 × 106) 를 정맥 내 투여하거나, 종양 주입 후 5 및 8 일 후에 2 회 투여량의 T 세포를 투여하였다. 종양 부담의 확인을 위해, 비장 및 림프절 (겨드랑이, 상완 및 서혜부) 을 종양 주입 후 13 일 후에 수집했다. 림프양 조직을 기계적으로 티징하고 (teased) 적혈구를 ACK 용해 완충제 (0.15 mol/l NH4Cl, 1 mmol/l KHCO3, 0.1 mmol/l) 로 용해시켰다. 세포를 카운팅하고, GFP+　세포 백분율을 유세포 측정법을 통해 확인했다. 종양 세포의 총 개수를, GFP+　세포의 백분율에 세포 총 개수를 곱하여 결정하였다. 생존 연구를 위해, 마우스를 종양 세포 주입 후 제 5 일 및 제 8 일에, wtPD1 또는 chPD1 T 세포 (5 × 106) 로 치료하였다. 마우스의 건강을 면밀하게 모니터링하고, 스트레스 징후 (힘든 호흡, 다리 끌기, 등 굽힘, 또는 주름진 털) 이 관찰되면 마우스를 죽였다. T-세포 생존 분석을 위해, RMA-보유 마우스를 종양 세포 주입 후 5 일 후에 정맥 내 유사유전자형 Ly5.1+　chPD1-Dap10 또는 chPD1-CD28 T 세포 (5 × 106) 로 치료하고, 마우스를 T-세포 주입 후 1, 3, 7, 10, 14 또는 18 일에 죽였다. 비장 및 림프절 세포를 FcR 블록 및 마우스 γ-글로불린 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) 과 인큐베이션하여 비특이적 결합을 방지하고, 피코에리트린-컨쥬게이션된 항-CD3 및 알로피코시아닌-컨쥬게이션된 항-CD45.1 (클론 A20) 으로 염색하여 유세포 측정법으로 분석했다.
통계적 분석
다중 그룹을 비교할 때 짝을 이루지 않은, 양측 스튜던트 t-테스트 또는 사후 Tukey 테스트로의 분산 분석을 이용하여 통계적 분석을 수행했다. 데이타는 Shapiro-Wilk 테스트를 이용하여 정규 분포로 결정하였다. 프로그램 R 은 데이타의 통계적 분석에 사용되었다. 모든 실험은 적어도 2 개의 T 세포의 독립적인 세트로 삼회 중복 수행하였고, P 값 < 0.05 을 유의한 것으로 간주하였다. 생존 연구를 위해, Kaplan-Meier 생존 곡선을 Log 랭크 테스트 및 프리즘 소프트웨어 (graphpad　Software, San Diego, CA) 를 이용하여 플롯팅 및 분석했다.
결과
chPD1 T 세포는 친염증성 사이토카인을 분비하고 PD1-의존적 방식으로 PDL-발현 RMA 세포를 용해한다
종양 세포 상 발현된 PD1 리간드를 표적으로 삼기 위해, PD1 수용체의 세포외 영역과 Dap10 공동-자극 수용체의 세포내 영역 및 및 CD3ζ 을 융합함으로써 chPD1 수용체를 제조했다 (도 1a). PD1 수용체의 세포외 및 트랜스멤브레인 도메인으로 이루어진 wtPD1 수용체를 또한 대조군으로서 제조했다. chPD1 및 wtPD1 수용체는 형질도입되지 않은 활성화된 T 세포와 비교할 때 PD1 수용체의 증가된 세포 표면 발현으로 나타내어지는 바와 같이 활성화된 쥐과동물 T 세포에서 성공적으로 발현되었다 (도 1b). wtPD1 및 chPD1 T 세포 양자 모두는 활성화된 CD4+ (~10%) 및 CD8+　(~90%) T 세포의 혼합물로 이루어졌다.
때때로 활성화된 T 세포는 PDL1 을 발현시키는데, 이는 잠재적으로 chPD1 T 세포들이 서로를 죽일 수 있다.9 따라서, PDL1 및 PDL2 의 발현은 chPD1 T 세포 상에서 평가했다. 수득된 chPD1 T 세포의 개수는 테스트된 모든 T-세포 배치 (batch) 에 있어서 wtPD1 T 세포의 개수와 유사하였다. 게다가, chPD1 및 wtPD1 T 세포 상 유의미한 PDL1 또는 PDL2 발현은 관찰되지 않았다 (도 1c). 마지막으로, wtPD1 또는 chPD1 T 세포가 배지에서만 배양되었을 때 유의미한 수준의 세포 사멸이 관찰되지 않았다. 이들 데이타는 chPD1 T 세포가 유의미한 수준의 PDL 을 발현하지 않음을 시사한다.
쥐과동물 림프종 세포주 RMA 가 chPD1 T 세포의 잠재적인 표적인지 확인하기 위해, PDL1 및 PDL2 의 발현을 측정했다. RMA 세포는 유세포 분석법으로써 확인되는 바와 같이, 세포 표면 PDL1 및 PDL2 를 발현시켰다 (도 1d). PD1 리간드에 대한 RT-PCR 을 또한 수행하였고, RMA 세포는 PDL1 및 PDL2 에 대한 mRNA 를 발현하였다. chPD1 T 세포는 wtPD1 수용체를 발현하는 T 세포, 또는 비형질도입된 효과기 T 세포보다 RMA 세포를 현저하게 용해시켰다 (도 1e). 이 용해는 PD1 수용체에 의존적이었는데, 그 이유는 어세이가 chPD1 T 세포에 의한 종양 세포의 사멸을 무효화하기 전에 항-PD1 항체를 차단하면서 T 세포를 인큐베이션하기 때문이다 (도 1f).
종양 세포 용해에 덧붙여, T 세포는 친염증성 사이토카인을 분비하여 항종양 면역성을 증강시킨다.15 ,　 30 비형질도입된 또는 wtPD1 T 세포와 비교하면, chPD1 T 세포는 상당량의 친염증성 사이토카인 IFN-γ, TNF-α, GM-CSF 및 IL-2 을 분비했지만, RMA 세포와 배양시 항-염증성 사이토카인 IL-10 은 분비하지 않았다 (도 2). 함께, 이들 데이타는, RMA 세포가 PD1 리간드를 발현하고, chPD1 수용체의 발현이 친염증성 사이토카인 분비 및 RMA 쥐과동물 림프종 세포주의 용해를 유도한다는 점을 보여준다.
chPD1 T 세포로의 치료는 종양 부담의 감소 및 RMA-GFP-보유 마우스의 생존 증가를 도모한다
마우스에 정맥 내 주사시, RMA 종양 세포는 비장 및 림프절로 이동하고; 따라서 이 모델은 동계 (syngeneic), 면역적격 마우스에서 인간 림프종의 특징을 다시 정리한다.31 따라서, 림프종에 대한 치료요법으로서 생체 내 chPD1 T 세포 이용의 잠재성을 조사하였다. PD1 에 대한 리간드가 또한 건강한 조직에서 발현될 수도 있기 때문에, chPD1 T 세포의 안전성을 먼저 테스트하였다. chPD1 T 세포는 순수 (naive) 마우스에서 단리된 비장세포, 간 세포 또는 폐 세포와 함께 배양시 IFN-γ 를 용해시키거나 분비하지 않았다. 더욱이, chPD1 T 세포의 주사 후, 순수 마우스는 어떠한 불리한 증상 또는 증가된 수준의 혈청 IFN-γ을 나타내지 않았는데, 이는 chPD1 T 세포가 건강한 조직을 표적으로 삼지 않았음을 시사한다. 그 다음으로, chPD1 T 세포의 항-종양 효능을 테스트하기 위해, 림프종-보유 마우스를 종양 세포 주사 후 2 일 후에 chPD1 T 세포 단일 투여량으로 치료하고, 종양 부담을 비장 및 림프절에서 측정하였다 (도 3a). PBS 또는 wtPD1 T 세포로 치료된 마우스와 비교시, RMA 종양 부담은 chPD1 T 세포로 치료된 마우스에서 상당히 감소되었다. PBS 또는 wtPD1 T 세포로 치료된 마우스의 종양 부담은 유의미하게 다르지 않았으며, 이는 wtPD1 T 세포가 종양 부담을 감소시키지 않았음을 지시한다.
보다 확립된 종양 부담에 대항하는 chPD1 T 세포의 생체 내 치료적 효능을 테스트하기 위해, 마우스를 종양 세포 주입 후 5 일 후에 wtPD1 또는 chPD1 T 세포로 치료하였다. chPD1 T-세포-치료된 마우스의 비장 및 림프절에서 낮지만 검출가능한 수준의 종양 세포가 존재하고 있었지만, chPD1 T 세포로의 치료는 이들 확립된 종양을 현저히 감소시켰다 (도　3b). 앞선 연구로부터 CAR T 세포로의 다중 치료가 항-종양 효능을 증강시킨다는 점이 밝혀짐에 따라, 종양-보유 마우스는 종양 세포 주사 후 5 및 8 일 후에 2회 치료로의 wtPD1 또는 chPD1 T 세포를 주사하였다.3 ,　 30 - 32 2 회 투여량의 chPD1 T 세포로 치료된 마우스는 검출가능하지 않은 종양 수준의 종양 세포를 가졌다 (도　3c). 게다가, 종양 세포 주입 후 제 20 일 까지 종양으로 쓰러진 wtPD1 T 세포로 치료한 마우스와 비교하면, 2 회 투여량의 chPD1 T 세포로 치료된 마우스는 유의미한 생존 증가를 보였고, 림프종-보유 마우스의 70% 에서 장기간의 종양이 없는 생존이 존재했다 (도 3d). 이들 데이타는 확립된 림프종의 chPD1 T-세포 치료가 생존을 증가시키고, 다수 투여량의 chPD1 T 세포는 종양-보유 마우스에서 장기간의 생존을 도모한다는 것을 나타낸다.
chPD1-CD28 T 세포와 비교할 때, chPD1-Dap10 T 세포는 증가된 수준의 친염증성 사이토카인 및 감소된 수준의 항-염증성 사이토카인을 분비한다
CAR 에 공동-자극 도메인의 포함은 T-세포 항-종양 효과기 기능을 향상시키고, 각각의 공동-자극 수용체는 T 세포에 독특한 영향을 미친다.15 ,　 16 따라서, Dap10 도메인의 포함을 또 다른 공동-자극 수용체의 포함과 비교하기 위해, Dap10 세포질 도메인 대신 CD28 의 세포질 도메인을 함유하는 chPD1 수용체를 만들었다 (도 1a). 공동-자극 수용체 사이에서 종종 상이한 하나의 효과기 기능은 이들의 사이토카인 분비 유도 능력이다.26 - 28 따라서, chPD1-Dap10 및 chPD1-CD28 T 세포에 의한 친- 및 항-염증성 사이토카인의 분비를 비교했다. IFN-γ 의 분비는 유사하였지만, chPD1-Dap10 T 세포는 더 많은 양의 친염증성 사이토카인 TNF-α, GM-CSF, IL-17 및 IL-21 을 분비하였다. 대조적으로, chPD1-CD28 T 세포는 더 많은 IL-2 및 T 헬퍼 유형 2/항-염증성 사이토카인 IL-5 및 IL-10 을 분비했다 (도 4a). chPD1-Dap10 및 chPD1-CD28 T 세포는 또한 유사량의 염증성 케모카인 RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) 대식세포 염증성 단백질 1α 및 1β 을 분비했다. 두 CAR 의 사이토카인 분비 프로파일이 상이하지만, chPD1-Dap10 및 chPD1-CD28 T 세포에 의한 T-세포 증식, 생존 또는 종양 세포 용해에서 유의미한 차이는 없었다 (도 4c). 따라서, 이들 수용체에 의해 유도된 효과기 기능에 있어서, 특히 차등 사이토카인 분비의 유도와 관련하여 약간의 유의미한 차이가 존재했다.
Dap10 공동-자극 도메인의 포함은 chPD1 T 세포에 있어서 중심 기억 표현형을 유도한다
CAR T-세포 효능에 있어서 중요한 또 다른 특징은 T 세포의 분화 표현형이다. CD28-함유 CAR 은 종종 효과기 기억 또는 효과기 세포 표현형을 유도하고, 생체 내에서 그렇게 오래 살지 않는 반면 중심 기억 표현형을 유도하는 CAR 은 통상 생체 내에서 더 오래 지속하고 종종 더 강한 항-종양 효능을 갖는다.3 자연 살해 그룹 2D (NKG2D)/Dap10 의 자극은 최근 쥐과동물 효과기 CD8 세포에서 중심 기억 표현형을 유도하는 것으로 나타났으며, 따라서 chPD1-Dap10 및 chPD1-CD28 T 세포의 분화 표현형은 비교되었다.29 RMA 세포와 배양시, chPD1-CD28 T 세포는 효과기 세포 분화에 관여하는 전사 인자, T-bet 및 BLIMP-1 의 유전자 발현을 증가시키는 반면, chPD1-Dap10 T 세포는 중심 기억 분화를 지지하는 전사 인자, Eomes 및 BCL-6 의 발현을 증가시켰다 (도 5a). 추가적으로, chPD1-Dap10 T 세포는 중심 기억 표현형과 연관된 세포 표면 마커 (CD127hi, CD62Lhi, KLRG1lo) 를 발현시켰고, chPD1-CD28 T 세포는 효과기 기억 표현형 마커 (CD127lo, CD62Llo, KLRG1hi) 를 발현시켰다 (도 5b). 이들 데이터는 chPD1-Dap10 및 chPD1-CD28 수용체가 변경된 생체 내 항-종양 효능에 기여할 수 있는 상이한 T-세포 표현형을 유도한다는 점을 나타낸다.
chPD1-Dap10 T 세포로의 치료는 chPD1-CD28 T 세포로의 치료와 비교시 종양 부담의 더 큰 감소 및 RMA-GFP-보유 마우스의 증가된 생존율을 도모한다
chPD1-Dap10 및 chPD1-CD28 T 세포의 생체 내 치료적 효능을 비교하기 위해, 림프종-보유 마우스를 2 회 투여량의 wtPD1, chPD1-Dap10 또는 chPD1-CD28 T 세포로 치료하였다. chPD1-Dap10 또는 chPD1-CD28 T 세포로의 치료는 종양 부담을 현저하게 감소시켰으나, chPD1-Dap10 T 세포가 chPD1-CD28 T 세포보다 현저하게 종양 부담을 감소시켰다 (도 6a). 또한, 2 회 투여량의 chPD1-Dap10 T 세포로의 치료는 chPD1-CD28 T 세포로 치료된 마우스와 비교할 때 (마우스의 14%) 더 높은 백분율의 마우스 (마우스의 66%) 에서 장기간의 종양이 없는 생존을 도모했다 (도 6b). chPD1-Dap10 T 세포의 항-종양 효능을 강화시키는데 기여한 한 가지 잠재적인 인자는 림프종-보유 마우스의 비장 및 림프절에서 이것들의 증가된 생체 내 지속성이었다 (도 6c). Ly5.1+　chPD1-Dap10 T 세포는 T-세포 주입 후 14 일 후에 비장 및 림프절에서 유세포 측정법에 의해 여전히 검출가능하지만, chPD1-CD28 T 세포는 10 일 후 검출되지 않았다. 종합하여 볼 때, 이들 데이타는 chPD1 T 세포가 종양 부담을 줄일 수 있으며 림프종의 이 마우스 모델에서 생존을 증가시킬 수 있다는 점 및 Dap10 공동-자극 도메인의 포함이 CD28-함유 chPD1 수용체와 비교할 때 생체 내 치료 효능을 향상시킨다는 점을 나타낸다.
논의
CAR 의 도입은 암에 대한 T-세포 치료요법의 잠재적인 효능을 극적으로 증가시켰다. 1 ,　 3 ,　 33 　 그러나, PD1 수용체의 발현을 포함한 T-세포에서의 저해 수용체 발현의 상향 조절 및 종양 미세환경에서 저해 리간드의 발현이 CAR T-세포 반응 및 효능을 제한한다. 9 ,　 34 - 36 　 이 연구는 신규한 chPD1 수용체의 발현이 림프종 마우스 모델에서 T-세포 항-종양 효능을 증강시킨다는 것을 입증하였다. 우리의 결과는 chPD1 수용체-형질도입된 T 세포가 종양 상 PDL 발현을 표적으로 삼는다는 점 및 PDL 과의 상호작용이 T 세포의 저해 대신 활성화를 유도한다는 점을 시사한다. chPD1-발현 T 세포는 친염증성 사이토카인을 분비하고 PDL-발현 종양 세포를 용해하고 또한 종양 부담을 감소시키며 림프종-보유 마우스에서 종양이 없는 생존을 증가시켰다. 나아가, Dap10 공동-자극 도메인을 함유하는 chPD1 수용체는 CD28 공동-자극 도메인을 함유하는 chPD1 수용체와 비교할 때 작용적으로 더 우수하였다.
T 세포를 PD1 저해로부터 보호하는 다수의 새로운 메카니즘이 개발되고 있다. PD1 차단에 덧붙여, PD1 의 세포질 도메인을 CD28 의 세포질 도메인으로 대체하는 PD1-CD28 스위치 수용체의 발현은 T-세포 저해를 방지하는 것으로 나타났다. 37 - 40 종양-특이적 T 세포 수용체 또는 CAR 과 공동-발현시, PD1-CD28 스위치 수용체는 세포외 시그널 조절된 키나아제 인산화, 사이토카인 분비, 증식, 그랜자임 B 발현 및 강화된 항-종양 기능에 의해 나타내어지는 바와 같이 T-세포 활성화를 유도한다. 37 - 40 우리의 연구의 주요 목표는 PD1-세포외 도메인을 직접적으로 Dap10 또는 CD28 및 CD3ζ 의 세포 내 도메인에 연결하는 CAR 을 발현하는 T 세포의 효능을 테스트하여, 활성화 및 공동-자극성 시그널 양자 모두를 동일 수용체 내에서 제공하고, T 세포에서 2 개의 수용체를 공동-발현하기 위한 필요성을 제거하는 것이었다. 더욱이, 많은 이전의 PD1 스위치 수용체 연구는 면역결핍 마우스 모델에서 인간 T 세포의 항-종양 효능을 테스트하였다. 37 ,　 38 그러나, CAR T 세포는 종종 완전한 항-종양 효능에 대한 숙주 면역 반응의 유도를 요구한다. 15 ,　 30 - 32 게다가, 면역결핍 마우스에서 인간 CAR T-세포 효능을 테스트하는 것은 항-종양 면역 반응에서 골수-유래 억제인자 세포 및 조절성 T 세포를 포함한 기타 면역 세포의 역할을 조사하지는 않는다. 따라서, 쥐과동물 chPD1 수용체의 제조는 면역적격 숙주에서 chPD1 T-세포 효능의 연구를 가능하게 하고, 환자가 맞닥뜨릴 가능성이 있는 T 세포의 종양 미세환경을 나타낸다.
CAR 에서 공동-자극 도메인의 포함은 항종양 효능을 증가시키고, CAR T 세포 임상 시험의 대부분은 CD3ζ 및 CD28 또는 4-1BB 공동-자극 도메인으로 이루어진 2 세대 CAR 를 이용하고 있다. 1 ,　 3 ,　 4 ,　 15 ,　 16 ,　 33 ,　 41 　 CD28 또는 4-1BB 시그널링 도메인을 갖는 CAR T 세포 사이에서 관찰된 한 가지 차이점은 4-1BB 의 포함이 중심 기억 표현형을 유도하고, 이들 T 세포가 생체 내에서 더 오래 지속하고, 더 강한 항-종양 효능을 갖지만 CD28-CAR 을 갖는 T 세포는 효과기 기억 또는 효과기 세포 표현형을 유도하고 생체 내에서 그렇게 오래 살지 못한다는 것이다. 3 ,　 42 　 4-1BB-함유 CAR 을 발현하는 T 세포에서 중심 기억 표현형의 유도는 강화된 호흡 능력, 증가된 지방산 산화 및 증강된 미토콘드리아 생물방생을 포함하는 뚜렷한 대사 특징에 의해 부분적으로 야기된 반면, CD28 도메인을 갖는 CAR T 세포는 효과기 기억 세포를 유도하고 강화된 당분해 특징을 가졌다. 42 　 본 연구에서, Dap10 공동-자극 도메인의 포함은 생체 내에서 우수한 항-종양 면역성을 유도했다. 이론에 얽매이지 않고, 이는 chPD1-Dap10 T 세포의 증강된 생체 내 생존 및 중심 기억 표현형의 유도에 의해 잠재적으로 야기될 수 있다. NKG2D/Dap10 의 자극은 부분적으로 mTOR 의 차등적 활성화로 인해 최근 쥐과동물 효과기 CD8 세포에서 중심 기억 표현형을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 29 　 흥미롭게도, mTOR 은 호기성 당분해와 같이 T 세포에서 특정 대사 경로를 활성화하고 CD28 공동-자극과 비교할 때, NKG2D/Dap10 을 통한 활성화는 mTOR 의 더 약한 활성화를 나타낸다.29 ,　 43　 따라서, mTOR 활성화의 유도, 대사작용 및 세포 분화는 CAR T-세포 성공의 핵심적인 특성이다.
클리닉에서, CAR T 세포 주입 후 부작용 중 하나는 사이토카인 방출 증후군으로서 공지된 면역 활성화의 개시이다.44 ,　 45　 이는 CAR T-세포 주입 후 IFN-γ, GM-CSF, IL-10 및 IL-6 을 포함하는 사이토카인의 상승을 포함할 수 있고, 사이토카인의 극적인 증가는 일반적으로 입양 전달 세포의 확장 및 활성화와 관련이 있다.45 이 연구에서, chPD1-Dap10 과 chPD1-CD28 T 세포 사이에서 관찰된 한 가지 차이점은 사이토카인의 차등적인 발현이며, chPD1-Dap10 T 세포는 더 많은 양의 친염증성 사이토카인, TNF-α, GM-CSF, IL-17 및 IL-21 을 분비하고, chPD1-CD28 T 세포는 더 많은 IL-2 및 T 헬퍼 유형 2/항-염증성 사이토카인 IL-5 및 IL-10 을 분비한다 (도 4). 친염증성 사이토카인의 분비가 항-종양 면역성에 유익하고 항-염증성 사이토카인의 동시 분비가 면역 반응을 저해할 수 있음에도 불구하고, T 세포의 항종양 효능을 방해하지 않으면서 조절되지 않은 염증을 완화하거나 예방하기 위한 적절한 CAR 고안을 선택하는데 있어서 어려움이 존재할 수 있다. chPD1 T 세포를 수여받은 종양-보유 마우스는 치료 후 어떠한 부작용도 나타나지 않았으며, 장기간 생존했지만; 사이토카인 방출 증후군의 중증도 정도는 아마도 주입시 질병 부담에 의해 좌우된다.44 - 47 chPD1-Dap10 T 세포로부터 염증성 사이토카인의 고분비가 아마도 이들의 더 강한 항-종양 효능에 기여할지라도, 친염증성 사이토카인의 분비가 손상을 주는 양의 염증을 유도할 수 있을지 여부를 확인하기 위해 보다 높은 종양 부담을 갖는 마우스에서 사이토카인 방출 증후군 증상을 모니터링할 수 있다. 또한, chPD1-Dap10 T 세포는 IL-6R 차단과 같은 사이토카인 방출 증후군을 예방하는 작용제와 조합될 수 있다.
이 연구에서, chPD1 수용체 내 Dap10 공동-자극 도메인의 포함이 IL-10 의 분비를 유도하지 않지만, CD28 도메인의 포함은 유도했다. CD28-유도된 IL-10의 분비는, 항원-제시 세포 상 MHC 분자, CD28 리간드 및 세포간 접착 분자-1 의 하향 조절을 통해 T-세포 항-종양 반응을 변경시키는 것으로 드러났다.48　 결과적으로, 숙주 T-세포 반응은 저해되고, 친염증성 사이토카인의 분비가 억제된다. 나아가, 항-염증성 사이토카인의 분비는 CAR T-세포 효능을 저해하는 것뿐만이 아니라 또한 일부 연구에서 만성 독성을 유도하는 것으로 나타났다.49　 따라서, 이론에 구애받지 않고, chPD1-Dap10 T 세포로부터 IL-10 분비의 감소는 이들의 증강된 생체 내 항-종양 효능에 기여할 수 있다.
요약하면, 림프종의 면역적격 마우스 모델에서 강한 항종양 T-세포 반응 및 장기간의 종양이 없는 생존 유도를 유도하는 새로운 chPD1 수용체가 개발되었다. Dap10 공동-자극 수용체의 포함에 의해 유도된 친염증성 사이토카인의 강한 유도가 항-종양 치료요법에 있어서 유리할 수 있다.
실시예 2. 면역치료제로서 키메라-PD1-Dap10 을 발현하는 인간 T 세포
종양-반응성 T 세포의 입양 전달은 많은 암에 있어서 유망한 항-종양 치료요법이다. T 세포에 의한 종양 인지를 증강시키기 위해, 종양 항원을 인지하는 수용체에 융합된 시그널링 도메인으로 이루어진 키메라 항원 수용체 (CAR) 를 T 세포에서 생성 및 발현시킬 수 있다. 실시예 1 에서 나타낸 바와 같이, PD1 수용체에 대한 리간드가 많은 암 유형에서 발현되기 때문에 새로운 키메라 항원 수용체에 대한 표적인 한 수용체는 PD1 이다. 본 연구에서, PD1 수용체 세포외 도메인 및 CD3 제타의 활성화 도메인으로 이루어진 인간 키메라 PD1 수용체 (chPD1) 가 개발되었다. Dap10 공동자극 도메인도 또한 실시예 1 에서 논의된 바와 같이 chPD1 수용체 내 포함되었다. CAR 의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2 에 제시되어 있고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3 에 제시된다. 이 신규 CAR 이 광범위한 종양을 표적으로 삼을 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 인간 림프종, 흑색종, 골수종, 췌장, 유방 및 난소 암 세포주에 대항하는 chPD1 T 세포의 항-종양 효능을 측정하였다. 테스트된 8 개의 세포주 중에서, 모두 이들의 세포 표면 상에 PD1 리간드를 발현하였고, 이는 이들을 chPD1 T 세포에 대한 잠재적인 표적으로 만들었다. chPD1 수용체는 성공적으로 인간 T 세포의 표면 상에서 발현되었고, chPD1 T 세포의 발현은 모든 종양 세포주의 상당한 종양 세포 용해를 유도했고 친염증성 (IFNγ, TNFα, IL-2, GM-CSF, IL-17, 및 IL-21) 사이토카인을 분비했다. 따라서, chPD1-Dap10 T 세포의 입양 전달은 다수 유형의 암을 치료하는 신규한 치료 요법적 전략을 나타낸다.
참고 문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
바람직한 구현예에서 본 발명을 설명해왔지만, 당업자는 본 발명을 첨부된 청구 범위의 취지 및 영역 내에서 변형을 가해 실시할 수 있음을 알 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> LONGWOOD UNIVERSITY <120> PD1-SPECIFIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR AS AN IMMUNOTHERAPY <130> 14860001TA <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 165 170 175 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190 Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 <210> 2 <211> 1079 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic chimeric antigen receptor <400> 2 agtttccctt ccgctcacct ccgcctgagc agtggagaag gcggcactct ggtggggctg 60 ctccaggcat gcagatccca caggcgccct ggccagtcgt ctgggcggtg ctacaactgg 120 gctggcggcc aggatggttc ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct 180 ccccagccct gctcgtggtg accgaagggg acaacgccac cttcacctgc agcttctcca 240 acacatcgga gagcttcgtg ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac cagacggaca 300 agctggccgc cttccccgag gaccgcagcc agcccggcca ggactgccgc ttccgtgtca 360 cacaactgcc caacgggcgt gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg cgcaatgaca 420 gcggcaccta cctctgtggg gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc aaagagagcc 480 tgcgggcaga gctcagggtg acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc caccccagcc 540 cctcacccag gccagccggc cagttccaaa ccctggtgat ctacatctgg gcgcccttgg 600 ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctgtgcgca cgcccacgcc 660 gcagccccgc ccaagaagat ggcaaagtct acatcaacat gccaggcagg ggcggtgtca 720 ttctcactgc cttgttcctg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc 780 agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg 840 ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc 900 ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga 960 ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca 1020 gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 1079 <210> 3 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic chimeric antigen receptor <400> 3 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Ile Tyr Ile Trp Ala Pro 165 170 175 Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu 180 185 190 Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr 195 200 205 Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu 210 215 220 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 225 230 235 240 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 245 250 255 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 260 265 270 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 275 280 285 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 290 295 300 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 305 310 315 320 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 325 330 335 Arg <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 4 gtgtgatggt gggaatgggt caga 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 5 tacgaccaga ggcatacagg gaca 24 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 6 gctccaaagg acttgtacgt g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 7 tgatctgaag ggcagcattt c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 8 ctgccgatac tgaacctgag c 21 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 9 gcggtcaaaa tcgcactc 18

Claims (16)

  1. 하기를 포함하는, 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드:
    프로그램된 사멸 리간드 1 (PDL1) 및 프로그램된 사멸 리간드 2 (PDL2) 중 하나 이상에 대해 특이적인 세포외 결합 도메인;
    트랜스멤브레인 도메인; 및
    세포질 시그널링 도메인.
  2. 제 1 항에 있어서, 세포외 도메인이 프로그램된 사멸 수용체 1 (PD1) 세포외 도메인인, CAR 폴리펩티드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 세포질 시그널링 도메인이 CD3ζ 세포질 도메인인, CAR 폴리펩티드.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, DNAX-활성화 단백질 10 (Dap10) 공동-자극 도메인을 추가로 포함하는, CAR 폴리펩티드.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 3 와 90% 이상 상동인 서열을 포함하는, CAR 폴리펩티드.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 CAR 폴리펩티드를 포함하는 벡터.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 CAR 을 발현하도록 유전자 조작된 T 림프구.
  8. 제 7 항에 따른 T 림프구 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 입양 세포 전달을 위한 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 하나 이상의 화학치료제 또는 방사선치료제를 추가로 포함하는, 조성물.
  10. 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    프로그램된 사멸 리간드 1 (PDL1) 및 프로그램된 사멸 리간드 2 (PDL2) 중 하나 이상에 대해 특이적인 세포외 결합 도메인;
    트랜스멤브레인 도메인; 및
    세포질 시그널링 도메인
    을 포함하는 CAR 을 발현하도록 유전자 조작된 T 림프구를 포함하는 입양 세포 전달을 위한 조성물을 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 암의 세포는 PDL1 및 PDL2 중 하나 이상을 발현하는, 암을 치료하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 세포외 도메인이 프로그램된 사멸 수용체 1 (PD1) 세포외 도메인인, 암을 치료하는 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 세포질 시그널링 도메인이 CD3ζ 세포질 도메인인, 암을 치료하는 방법.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 이 Dap10 공동-자극 도메인을 추가로 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 이 SEQ ID NO: 2 와 90% 이상 상동인 서열을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  15. 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 림프종, 흑색종, 골수종, 췌장암, 유방암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암을 치료하는 방법.
  16. 제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학치료제 또는 방사선치료제 중 하나 이상을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 암을 치료하는 방법.
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