JP2024514354A - キメラ抗原受容体(car)-t細胞 - Google Patents
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Abstract
本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞に関し、特に、排他的ではないが、免疫療法におけるそれらの使用、並びにT細胞リンパ腫等の癌、HIV及びTB等の様々な微生物感染症、並びに自己免疫疾患の治療、予防又は改善のための使用に関する。本発明は、CAR操作された粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞の使用、並びに高度に精製されたMAIT細胞を刺激し、単離し、及び拡大させるための新規方法に関し、その後、そのようなCAR-MAIT細胞に操作することができる。本発明はまた、インビトロでのMAIT細胞の増殖のための方法に関する。【選択図】図1
Description
本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞に関し、特に、排他的ではないが、免疫療法におけるそれらの使用、並びにT細胞リンパ腫等の癌、HIV及びTB等の様々な微生物感染症、並びに自己免疫疾患の治療、予防又は改善のための使用に関する。本発明は、CAR操作された粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞の使用、並びに高度に精製されたMAIT細胞を刺激し、単離し、及び拡大させるための新規方法に関し、その後、そのようなCAR-MAIT細胞に操作することができる。本発明はまた、インビトロでのMAIT細胞の増殖のための方法に関する。本発明は、遺伝子構築体それ自体、並びにCAR-MAIT細胞の作製におけるそれらの使用、及び形質導入されたCAR-MAIT細胞それ自体に及ぶ。本発明はまた、構築物及び形質導入CAR-MAIT細胞の様々な医学的使用、並びにこれらの構築物及びCAR-MAIT細胞を含む医薬組成物にも及ぶ。
T細胞リンパ腫は、ヒトTリンパ球向性ウイルスI型(HTLV-1)によって引き起こされる成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)等の末梢T細胞リンパ腫(PTCL)、及びセザリー症候群(SS)等の皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)を含む、臨床的に侵攻性の疾患の不均一な群である。T細胞悪性腫瘍は、B細胞悪性腫瘍よりも治療が困難である。ATL及びSSは、稀でしばしば侵襲性のT細胞リンパ腫型であり、治療基準を確立するために十分な患者がランダム化試験に登録されていない。結果として、使用される一般的な第1選択療法は、他のタイプのT細胞リンパ腫を治療するために使用されるものと同じである。例えば、T細胞悪性腫瘍を治療するための現在認可されている薬物には、化学療法剤、生物学的応答調節剤(例えば、インターフェロン、ベキサロテン及びHDAC阻害剤)、モノクローナル抗体(アレムツズマブ、モガムリズマブ、ブレンツキシマブ)、造血幹細胞移植(HSCT)及び体外光フェレーシス(ECP)が含まれる。しかしながら、単一の治療レジメンが、その全奏効率又は奏効期間において他よりも優れていることは知られていない。同種異系(HSCT)が唯一の潜在的な治癒的レジメンであったにもかかわらず、かなりの数の患者が、HSCTに関連する死亡率に加えて高齢及び併存症のためにHSCTに適合しない可能性がある。したがって、ATLに対する現在の治療による生存期間中央値はわずか8ヶ月(Katsuya et al.,2015)であるので、より効果的な治療が必要とされている。
最近FDAが承認したキメラ抗原受容体(CAR)ベースのT細胞療法(CAR-T)は、ほぼ100%の寛解を達成するCD19抗原を標的とすることによるB細胞悪性腫瘍の治療における最も重要な突破口の1つと見なされている(Park et al.,2018)。しかしながら、B細胞悪性腫瘍に対するCAR-T療法の有効性にもかかわらず、T細胞由来悪性腫瘍を標的とするための同様のアプローチは十分に確立されていない。免疫グロブリン遺伝子(すなわち、クローン)の同一の再構成を含み、CD19等のpan-B細胞マーカーを発現するほとんどのB細胞悪性腫瘍と同様に、ATL及びCTCLの大部分(>95%)は、定義されたT細胞受容体(TCR)遺伝子(すなわち、クローンTCR-Vβ鎖)及びpan-Tヘルパー細胞マーカーCD4を発現する優性T細胞クローンに由来する。したがって、Tリンパ腫の治療のためのモノクローナル抗体(mAb)によるCD4又はTCR-Vb鎖等のpan-T細胞マーカーの標的化が試験されているが、小規模臨床試験では部分的な退縮しかもたらされていない。
現在のCAR-T療法は、主に従来のαβT細胞に基づく。しかしながら、αβT細胞の抗原認識はMHCによって著しく制限され、それにより、自己治療には適しているが、同種異系養子移入には非常に困難になる。更に、αβ T細胞の不適切な腫瘍浸潤のために、従来のCAR-T療法は、CTCL等の固形腫瘍において低い有効性を示すが、液体腫瘍療法において有望な可能性を示す。しかしながら、従来のCAR-T細胞療法は、その更なる適用を制限するいくつかの大きな欠点を有する。例えば、現在のCAR-T療法は、(i)移植片対宿主病(GVHD)による自己輸血によって制限され、(ii)サイトカイン放出症候群を伴うオンターゲット/オフ腫瘍毒性によって制限され、(iii)患者のT細胞機能の変動性、製品の標準化及びコスト等の自己CAR-Tの欠点である。
したがって、PTCL及びCTCLを含むT細胞リンパ腫等のT細胞悪性腫瘍、並びに HIV及びTB等の微生物感染症を治療するための改善された免疫療法を提供する必要がある。
T細胞悪性腫瘍を治療するために、本発明者らは、自然のエフェクター様の性質を示す免疫系のT細胞のサブセットである粘膜関連インバリアントT細胞(MAIT細胞)に注目した。MAIT細胞は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)-Ib関連タンパク質MR1によって制限されるT細胞受容体鎖Vα7.2の不変の使用によって定義され、C型レクチンCD161及びIL18受容体の高い発現を示す。ヒトでは、MAIT細胞は、血液、肝臓、肺及び粘膜に見られ、微生物活性及び感染を防御する。MHCクラスI様タンパク質MR1は、細菌産生ビタミンB代謝産物、例えば5-OP-RUをMAIT細胞に提示する役割を果たす。MR1による外来抗原の提示後、MAIT細胞は炎症促進性サイトカインを分泌し、細菌感染細胞を溶解することができる。
現在のMAIT細胞増殖方法は、インビトロ培養でのMAIT細胞の増殖を支援するためにヒト同種異系フィーダー細胞の使用を必要とし、これはヒトにおける適応免疫療法のための大規模生産及び品質管理にとって困難である。加えて、これらの公知の方法を使用して作製されたMAIT細胞は、ある割合の他の細胞サブセット(例えば、従来のCD4+T細胞及びCD8+T細胞等)を含有し、したがって、得られたMAIT単離体は、それらの細胞サブセットが移植片対宿主病(GvHD)を引き起こすので、同種異系養子移入におけるその使用に完全に適さなくなる。
したがって、MAIT細胞産生をスケールアップするために、同種異系フィーダー細胞を必要とせずに純粋なMAIT細胞培養物を刺激及び単離するための改善された方法、したがって同種異系養子移入において使用される方法もまた必要とされている。
実施例に記載されるように、本発明者らは、ヒトPBMCからのMAIT細胞の高純度培養物を刺激及び単離するための新規な方法を開発した。本発明者らはまた、それぞれがキメラ抗原受容体(CAR)をコードし、次いで純粋なMAIT細胞に形質導入され、それによりT細胞上のCD4分子(「CART4」を使用)又はTCR-Vβ7.1鎖(「CARTVb7.1」を使用)のいずれかを特異的に標的とするCAR-MAIT細胞を産生するいくつかの新規な遺伝子構築物及びベクター(本明細書では「CART4」及び「CARTVb7.1」と呼ばれる)を開発した。これは、第3世代CARを形成するためのCD28/4-1BB/CD3ζ鎖シグナル伝達部分を有する、(i)抗CD4mAb(例えば、Hu5A8)又は(ii)抗TCR-Vb7.1mAb(例えば3G5)のいずれかのscFvを含む新規遺伝子構築物を作製することによって達成された。次いで、これらのCARを、末梢血単核細胞(PBMC)から精製されたMAIT細胞に形質導入して、T細胞上のCD4又はT細胞上のTCR-Vβ7.1鎖のいずれかを標的とする得られたCAR-MAIT細胞を作製した。本発明者らは、これらのCAR-MAIT細胞が、驚くべきことに、従来のCAR-T細胞と同等の、更には優れた抗Tリンパ腫活性を示したことを明らかにした。
Katsuya et al.,2015
Park et al.,2018
したがって、本発明の第1の態様では、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞が提供される。
本明細書で論じられるように、MAIT細胞は、哺乳動物の進化の間に高度に保存され、MR1タンパク質によって提示される微生物抗原を認識し、ヒト血液中に存在し、広範な抗菌応答性のために組織ホメオスタシスを維持する、インバリアントT細胞受容体(TCR)を発現する非従来型の自然様T細胞である。更に、有利には、MAIT細胞の抗原認識機構はMHC非依存性であり、これにより、MAIT細胞は、MHC依存性である現在のT細胞療法におけるような自己療法に限定されないように、同種異系T細胞殺傷療法の刺激的な候補となる。換言すれば、MAIT細胞は、低い同種異系反応性を有し、ヒトにおいて移植片対宿主病(GVHD)を誘導する傾向がより低く、したがって、同種異系CAR-T療法のための理想的なT細胞サブセットを表す。比較して、本発明のCART-MAIT細胞及び結果として生じる細胞療法は、容易に同種異系移入することができ、MAIT細胞の内因性特性により、固形腫瘍治療のために末梢組織に浸潤する有望な候補となる。したがって、CAR-MAIT細胞は固形腫瘍に効果的に浸潤することができ、これにより、MAIT細胞ベースの細胞療法が固形腫瘍並びに液体腫瘍の有望な治療法となる。
有利には、本発明のCAR-MAIT細胞は、T細胞悪性腫瘍、例えばヒトTリンパ球向性ウイルスI型(HTLV-1)によって引き起こされる成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)及び皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、例えばセザリー症候群を治療するために使用され得る。T細胞悪性腫瘍は、臨床的に攻撃的な疾患の不均一な群であり、B細胞悪性腫瘍よりも有意に治療が困難であることが理解されよう。有利には、CAR-MAIT療法は、固形腫瘍に対して増大した有効性を示し、同種異系であることが予想され、それにより、自己移植の必要性がなくなり、したがって、それを既製の療法として位置付ける。
好ましくは、一実施形態では、CAR-MAIT細胞は、T細胞上のCD4抗原を標的とするCARを発現する。したがって、好ましくは、CARはT細胞上のCD4抗原に特異的である。CD4抗原は、Tヘルパー細胞、単球、マクロファージ及び樹状細胞(T細胞表面糖タンパク質CD4[Homo sapiens]UniProt No.P01730.1;NCBI参照配列NP_000607.1)等の免疫細胞の表面に見られる糖タンパク質であることが理解されよう。CD4抗原のポリペプチド配列の一実施形態は、本明細書では以下のように配列番号1として表される。
MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGKKVVL GKKGDTVELT CTASQKKSIQ FHWKNSNQIK ILGNQGSFLT KGPSKLNDRA DSRRSLWDQG NFPLIIKNLK IEDSDTYICE VEDQKEEVQL LVFGLTANSD THLLQGQSLT LTLESPPGSS PSVQCRSPRG KNIQGGKTLS VSQLELQDSG TWTCTVLQNQ KKVEFKIDIV VLAFQKASSI VYKKEGEQVE FSFPLAFTVE KLTGSGELWW QAERASSSKS WITFDLKNKE VSVKRVTQDP KLQMGKKLPL HLTLPQALPQ YAGSGNLTLA LEAKTGKLHQ EVNLVVMRAT QLQKNLTCEV WGPTSPKLML SLKLENKEAK VSKREKAVWV LNPEAGMWQC LLSDSGQVLL ESNIKVLPTW STPVQPMALI VLGGVAGLLL FIGLGIFFCV RCRHRRRQAE RMSQIKRLLS EKKTCQCPHR FQKTCSPI
[SEQ ID No:1]
したがって、好ましくは、CARは、実質的に配列番号1に示されるアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含むCD4抗原に特異的である。
[SEQ ID No:1]
したがって、好ましくは、CARは、実質的に配列番号1に示されるアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含むCD4抗原に特異的である。
好ましくは、別の実施形態では、CAR-MAIT細胞は、T細胞上のT細胞受容体(TCR)β鎖可変領域(Vβ)を標的とするCARを発現する。T細胞受容体(TCR)は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子に結合したペプチドとして抗原の断片を認識する役割を果たす、T細胞又はTリンパ球の表面に見られるタンパク質複合体であることが理解されよう。TCRは、2つの異なるタンパク質鎖から構成される。ヒトでは、T細胞の95%において、TCRは、TRAによってコードされるアルファ(α)鎖と、TRBによってコードされるベータ(β)鎖とからなる。
以下の表1は、関連するコード遺伝子と共にT細胞上のVβ領域を列挙し、これらのうちのいずれか1つ又は複数が本発明のCAR-MAIT細胞上のCARによって標的化され得る。
CAR-MAIT細胞は、T細胞上の複数のT細胞受容体(TCR)β鎖可変領域(Vβ)を標的とするCARを発現し得る。好ましくは、複数のVβ領域は、表1に示すVβ領域の群から選択されてもよい。例えば、CAR-MAIT細胞は、好ましくは表1に列挙されるように、T細胞上の少なくとも2つ又は少なくとも3つ又は少なくとも4つのT細胞受容体(TCR)β鎖可変領域(Vβ)を標的とするCARを発現し得る。CAR-MAIT細胞は、好ましくは表1に列挙されるように、T細胞上の少なくとも5つ、又は少なくとも6つ、又は少なくとも7つのT細胞受容体(TCR)β鎖可変領域(Vβ)を標的とするCARを発現し得る。複数のTCR Vβ領域は、同じ又は異なるVβ領域であり得る。
以下のVbファミリーは、T細胞リンパ腫、すなわちVb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17及びVb 20に頻繁に関連すると考えられている。したがって、好ましい実施形態では、CAR-MAIT細胞は、以下のVβ領域:Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17及びVb 20からなる群から選択されるT細胞上の1つ又は複数のTCR Vβ領域を標的とするCARを発現する。好ましくは、CAR-MAIT細胞は、以下のVβ領域:Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17及びVb 20からなる群から選択されるT細胞上の少なくとも2つ又は3つのTCR Vβ領域を標的とするCARを発現する。
したがって、好ましくは、CARは、T細胞上の少なくとも1つ又は複数のTCR Vβ領域、最も好ましくはTCR-Vβ7.1鎖に特異的である。TCR Vβ7.1領域(H.sapiensが再配列したTCR Vβ7.1UniProtKB/Swiss-Prot:A0A577.1)のポリペプチド配列の一実施形態は、本明細書では以下のように配列番号2として表される。
MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQKAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSQ
[SEQ ID No:2]
したがって、好ましくは、CARは、実質的に配列番号2に示されるアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む少なくとも1つ又は複数のTCR Vβ領域(及びより好ましくはTCR-Vβ7.1鎖)に特異的である。
[SEQ ID No:2]
したがって、好ましくは、CARは、実質的に配列番号2に示されるアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む少なくとも1つ又は複数のTCR Vβ領域(及びより好ましくはTCR-Vβ7.1鎖)に特異的である。
好ましくは、CAR-MAIT細胞は、アポトーシスを誘導することによって標的T細胞を直接死滅させるように構成される。
好ましくは、CAR-MAIT細胞は、例えば患者の有害反応の場合に、CAR-MAIT細胞を制御可能に又は誘導可能に排除することを可能にする1つ又は複数のコード配列を含む。1つ又は複数のコード配列は、いわゆる「自殺遺伝子」として当業者に公知であり得る。
したがって、一実施形態では、1つ又は複数のコード配列は、上皮成長因子受容体(EGFR)又は切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)(refs)(UniProt No.P00533;NCBI参照配列NP_001333826.1)をコードし得る。tEGFRの発現は、患者におけるCAR-T細胞のモニタリング又は枯渇のための抗EGFRmAb(セツキシマブ)によって制御することができる。EGFRは、ヒトにおいてHER1として知られており、細胞外タンパク質リガンド(UniProt No.P01133;NCBI参照配列NP_001171601.1)の上皮成長因子(EGF)のメンバーの受容体である膜貫通タンパク質であることが理解されよう。
別の実施形態において、1つ又は複数のコード配列は、誘導性カスパーゼ-9(iC9)(Mol.Therapy,Diaconu et al.,580,25,3,March 2017)をコードし得る。iC9は、ヒトFK506結合タンパク質(UniProt No.P62942;NCBI参照配列NP_000792.1)に融合して、融合タンパク質を発現するCAR-T細胞のアポトーシスを誘発する、二量体化化学誘導物質(カスパーゼ誘導性薬物(CID)、Rimiducid)を用いた条件付き二量体化を可能にする改変ヒトカスパーゼ-9(UniProt No.P55211;NCBI参照配列NP_001220.2)である。
好ましくは、CAR-MAIT細胞は、切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)及び/又は誘導性カスパーゼ-9(iC9)をコードするコード配列を含む。より好ましくは、CAR-MAIT細胞は、切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)及び誘導性カスパーゼ-9(iC9)をコードするコード配列を含む。
CAR-MAIT細胞は、CARをコードする核酸又は遺伝子構築物をMAIT細胞に形質導入することによって産生されることが理解されるであろう。T細胞特異的かつ活性なCAR-MAIT細胞を産生するために、MAIT細胞の高度に精製された培養物がCAR形質導入工程において使用されることが重要である。したがって、本発明者らは、磁気活性化細胞選別(MACS)法及び蛍光活性化細胞選別(FACS)法を組み合わせることによって、ヒト末梢血単球細胞(PBMC)から精製MAIT細胞を単離するための効果的な方法を開発し、その結果、得られた方法は、高い増殖倍率で大量のMAIT細胞を生じる。
したがって、好ましくは、MAIT細胞は、ヒト末梢血単球細胞(PBMC)から単離される。好ましくは、MAIT細胞は、磁気活性化細胞選別(MACS)及び/又は蛍光活性化細胞選別(FACS)、より好ましくはMACS及びFACSの両方によってPBMCから単離される。本発明者らは、それらのMAIT単離方法がそれ自体新規であると考えている。
したがって、第2の態様では、MAIT細胞を単離する方法が提供され、
(i)末梢血単球細胞(PBMC)を提供することと、
(ii)PBMCを磁気活性化細胞選別(MACS)及び/又は蛍光活性化細胞選別(FACS)に供して、そこからMAIT細胞を単離することと、
を含む。
(i)末梢血単球細胞(PBMC)を提供することと、
(ii)PBMCを磁気活性化細胞選別(MACS)及び/又は蛍光活性化細胞選別(FACS)に供して、そこからMAIT細胞を単離することと、
を含む。
好ましくは、本発明の方法は、純粋なエクスビボMAIT細胞の単離をもたらす。一実施形態では、方法は、PBMCをMACS又はFACSのいずれかに供して、そこからMAIT細胞を単離することを含む。しかしながら、好ましくは、方法は、PBMCをMACS及びFACSの両方に供して、そこからMAIT細胞を単離することを含む。好ましくは、PBMCは、最初にMACSに供され、続いてFACSに供される。好ましくは、方法は、MACSによってPBMCからTCR Vα7.2+細胞を単離すること、次いで、MR1-5-OP-RU四量体染色によってそれらの細胞をFACSに供して、MAIT細胞を単離することを含む。
MACS手順(工程(ii))は、PBMCを回収し、次いで、細胞を結合緩衝液で洗浄することを含み得る。上清を捨て、得られた細胞ペレットをMACS緩衝液(例えば、1×107/100μlの濃度で)に再懸濁してもよい。溶液をフィコエリトリン(PE)抗ヒトTCR Vα7.2抗体(例えば、1:100の比で)と接触させることができる。溶液を混合し、次いでそれをインキュベートすることができる(例えば氷上で30分間)。細胞をMACS緩衝液(例えば、300×gで5分間遠心分離することによって)で洗浄することができる。細胞をMACS緩衝液(例えば107/80μlの濃度で)に再懸濁し得る。懸濁液を抗PEマイクロビーズと接触させ、次いで、それをインキュベートすることができる(例えば氷上で20分間)。細胞を洗浄することができる(例えば、10倍体積のMACS緩衝液)。溶液を遠心分離することができる(例えば、300×gで5分間)。細胞を再懸濁し得る(例えば1mlのMACS緩衝液中)。MSカラムをMACS緩衝液で予備洗浄し、磁石上に組み立てることができる。細胞をカラムに適用し、MACSを実施してもよい。次いで、カラムを1回又は複数回洗浄することができる(例えば、毎回MACS緩衝液)。カラムを磁石から除去し、結合した細胞をカラムから溶出させることができる(例えば、MACS緩衝液中)。
(工程(ii)における)FACS手順は、磁石分離された細胞を収集し、次いで遠心分離すること(例えば、300×gで5分間)を含み得る。細胞を再懸濁し得る(例えば、FACS緩衝液を用いて107/100μlの濃度で)。溶液を、BV421標識ヒト5-OP-RU MR1四量体(例えば、1:500の比で)及びAPC-H7コンジュゲート抗ヒトCD3(例えば、1:200の比で)と接触させ得る。次いで、溶液をインキュベートすることができる(例えば氷上で20分間)。細胞を洗浄することができる(例えば、10倍体積のFACS緩衝液)。溶液を遠心分離することができる(例えば、300×gで5分間)。細胞を再懸濁し得る(例えば2mlのFACS緩衝液中)。次いで、FACS選別機(例えば、BD Prodigy Sorter)に細胞試料を負荷し、FACSを行うことができる。
単離されたMAIT細胞にCARをコードする核酸を形質導入する前に、好ましくは、MAIT細胞は、第2の態様の方法における工程(ii)の後の後続の工程において活性化される。したがって、この方法は、単離されたMAIT細胞を抗CD3抗体で、好ましくはインビトロで活性化することを更に含む。この方法は、単離されたMAIT細胞を抗CD28抗体で、好ましくはインビトロで活性化することを含む。好ましくは、単離されたMAIT細胞は、抗CD3抗体及び抗CD28抗体の両方により、実質的に同時に又は順次に活性化される。逐次活性化は、MAIT細胞を最初に抗CD3と接触させ、続いて抗CD28抗体と接触させること、又は最初に抗CD28抗体と接触させ、次いで抗CD3抗体と接触させることを含み得る。抗体との接触は、少なくとも1日間、2日間又は3日間であり得る。
MAIT細胞活性化手順は、遠心分離(例えば、300×gで5分間)によって選別されたMAIT細胞を回収することを含み得る。上清を廃棄してもよく、ペレットを再懸濁してもよい(例えば、R10培地中106細胞/mlまで)。溶液をDynabeads Human T-Activator CD3/CD28と接触させ得る(例えば、30秒間ボルテックスすることによって)。所望の体積のDynabeadsをチューブに移してもよい。等体積の緩衝液をチューブに加えてもよく、これを混合してもよい(例えば、5秒間ボルテックスすることによって)。チューブを磁石(例えば1分間)上に置き、上清を廃棄してもよい。チューブを磁石から取り出し、洗浄したDynabeadsを再懸濁してもよい(例えば、R10培地中で)。所望の体積のDynabeadsを細胞懸濁液(例えば、37℃のインキュベーターにおいて24ウェルプレート中100IU/ml IL-2で約1:1のビーズ対細胞比を得るために)と接触させ得る。
次いで、この方法は、単離され、活性化されたMAIT細胞に、CARをコードする核酸を形質導入することを含み得る。
MAIT細胞は、MHCクラスI様分子MR1を認識するCD3+TCRVa7.2+CD161+細胞として定義される自然T細胞のサブセットである。以前の研究は、MAIT細胞がインビトロで拡大され得るが、同種異系フィーダー細胞の存在を必要とすることを示している。しかしながら、この方法の問題は、大規模な生産及び品質管理が困難であることである。実施例10に記載されるように、また、図15に示されるように、本発明者らはここで、様々なサイトカインの組合せの存在下でPBMCを抗原(5-OP-RU)ロードMR1テトラマービーズ又は5-OP-RU(単独)により最初に刺激することによってインビトロにおけるMAIT細胞の拡大培養のための驚くほど効果的な方法を最大6日間にわたってインビトロで開発した。次いで、MAIT細胞をMACS又はFACS選別によって単離し、その後、上記のように、CARに基づく治療のために抗CD3/CD28ビーズによって更に拡大させた。
したがって、好ましい実施形態では、方法は、MACS及び/又はFACS工程(すなわち、工程ii)に供される前にPBMCを刺激することを含み得る。好ましくは、この初期の刺激する工程は、PBMCを(a)MR1/5-OP-RU又は5-OP-RUのいずれかを含む抗原並びに/あるいは(b)サイトカインと接触させることを含む。好ましくは、刺激する工程は、PBMCを(a)MR1/5-OP-RU又は5-OP-RUのいずれかを含む抗原並びに(b)サイトカインと接触させることを含む。刺激工程は、PBMCを抗原及び/又はサイトカインと少なくとも1日、2日又は3日間接触させることを含み得る。刺激工程は、少なくとも4日間、5日間又は6日間継続し得る。好ましくは、刺激工程は、インビトロ培養においてPBMCを抗原及び/又はサイトカインと接触させることを含む。
MR1/5-OP-RU及び5-OP-RUは国際公開第2015/149130号に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。したがって、好ましくは、抗原は、国際公開第2015/149130号(PCT/AU2015/050148)に記載されているように、MR1/5-OP-RU又は5-OP-RUのいずれかを含む。
サイトカインは、どのようなインターロイキンであってもよい。しかしながら、好ましくは、サイトカインは、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18及びIL-23からなる群から選択される1つ又は複数のインターロイキン、又はそれらの任意の組合せであり得る。インターロイキンの濃度は、少なくとも5、10又は20ng/ml、好ましくは少なくとも30、40又は50ng/mlであり得る。
例えば、1つ又は複数のインターロイキンは、(i)IL-2のみ(図15の条件1)、(ii)IL-12及びIL-18(図15の条件11)、(iii)IL-2、IL-12及びIL-18(図15の条件3)、(iv)IL-12、IL-18及びIL-23(図15の条件12)、(v)IL-2、IL-12、IL-18及びIL-23(図15の条件13)、又は(vi)IL-7、IL-15、IL-12及びIL-18(図15の条件8)。
最も好ましくは、1つ又は複数のインターロイキンは、IL-12、IL-18及びIL-23の組合せを含み得る。したがって、好ましくは、刺激する工程は、PBMCを(a)MR1/5-OP-RU又は5-OP-RUのいずれかを含む抗原及び(b)IL-12、IL-18及びIL-23の組合せと接触させることを含む。
本発明者らは、PBMCの培養物中のMAIT細胞を刺激するための新規な方法を考案したと考えている。
したがって、別の態様では、PBMCの培養物中のMAIT細胞を刺激する方法であって、方法は、PMBCの培養物を、(a)MR1/5-OP-RU若しくは5-OP-RUを含む抗原、並びに/又は(b)IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18及びIL-23、若しくはそれらの任意の組合せからなる群から選択される1つ又は複数のインターロイキンと接触させることを含む。
好ましくは、1つ又は複数のインターロイキンは、IL-12、IL-18及び/又はIL-23である。より好ましくは、1つ又は複数のインターロイキンは、IL-12、IL-18及びIL-23である。
本発明者らは、CAR-MAIT細胞を作製する本発明者らの方法もまた、それ自体が新規であると考える。
したがって、第3の態様では、CAR-MAIT細胞を作製する方法が提供され、方法は、
(i)末梢血単球細胞(PBMC)を提供することと、
(ii)PBMCをMACS及び/又はFACSに供して、そこからMAIT細胞を単離することと、
(iii)単離されたMAIT細胞を、場合により抗CD3抗体及び/又は抗CD28抗体と接触させることによって、活性化することと、
(iv)活性化されたMAIT細胞を、CARをコードする核酸で形質導入し、それにより、CAR-MAIT細胞を作製することと、
を含む。
(i)末梢血単球細胞(PBMC)を提供することと、
(ii)PBMCをMACS及び/又はFACSに供して、そこからMAIT細胞を単離することと、
(iii)単離されたMAIT細胞を、場合により抗CD3抗体及び/又は抗CD28抗体と接触させることによって、活性化することと、
(iv)活性化されたMAIT細胞を、CARをコードする核酸で形質導入し、それにより、CAR-MAIT細胞を作製することと、
を含む。
第3の態様の方法の工程(i)、(ii)及び/又は(iii)は、第2の態様の方法に関して本明細書に記載された工程と同じであってもよく、したがって、これらの方法工程は交換可能である。
更に、好ましくは、この方法は、PBMCをMACS及び/又はFACS工程(すなわち、工程ii)に供する前に刺激することを含む。好ましくは、この初期の刺激する工程は、PBMCを(a)MR1/5-OP-RU又は5-OP-RUのいずれかを含む抗原並びに/あるいは(b)サイトカインと接触させることを含む。好ましくは、刺激する工程は、PBMCを(a)MR1/5-OP-RU又は5-OP-RUのいずれかを含む抗原並びに(b)サイトカインと接触させることを含む。サイトカインは、上記のように、第2の態様に関連して記載されるインターロイキン、好ましくはIL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18及びIL-23からなる群から選択される1つ又は複数のインターロイキン、又はそれらの任意の組合せであり得る。
最も好ましくは、1つ又は複数のインターロイキンは、IL-12、IL-18及びIL-23の組合せを含み得る。したがって、好ましくは、刺激する工程は、PBMCを(a)MR1/5-OP-RU又は5-OP-RUのいずれかを含む抗原及び(b)IL-12、IL-18及びIL-23の組合せと接触させることを含む。
MAIT細胞は、単離されたMAIT細胞が工程(iv)においてCARをコードする核酸で形質導入される前に工程(iii)において活性化されることが好ましい。単離されたMAIT細胞は、抗CD3抗体で、好ましくはインビトロで活性化され得る。単離されたMAIT細胞は、抗CD28抗体で、好ましくはインビトロで活性化され得る。好ましくは、単離されたMAIT細胞は、第2の態様の方法に関連して記載されるように、抗CD3抗体及び抗CD28抗体の両方により、実質的に同時に又は順次に活性化される。
MAIT細胞形質導入手順(すなわち、工程(iv))は、CARをコードする核酸でMAIT細胞を形質導入することを含み得る。形質導入工程はウイルス形質導入を含み得る。好ましくは、MAIT細胞形質導入手順は、CARをコードする核酸でMAIT細胞をレトロウイルス形質導入することを含む。MAIT細胞は、本明細書に記載されるような、例えば第5の態様によるCAR又は第6の態様によるベクターをコードする任意の核酸で形質導入され得る。核酸は、T細胞上のCD4抗原又は少なくとも1つ又は複数のTCR Vβ領域を標的とするCARをコードし得る。好ましくは、核酸は、T細胞上の表1に示される1つ又は複数のTCR Vβ領域(及びより好ましくはTCR-Vβ7.1鎖)を標的とするCARをコードし得る。核酸は、以下のVβ領域:Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17及びVb 20からなる群から選択されるT細胞上の1つ又は複数のTCR Vβ領域を標的とするCARをコードし得る。
好ましくは、形質導入は、MAIT細胞活性化の少なくとも34時間後、36時間後又は48時間後に行われる。形質導入の前に(例えば、約1日前)、レトロネクチン被覆プレートを調製することができる。レトロネクチン(例えば約15μg)をPBS(例えば約1ml)と接触させて溶液を形成することができる。この方法は、非組織培養処理24ウェルプレートの一方のウェルに溶液を導入することを含み得る。プレートを包み(例えば、粘着フィルムによる)、約4℃で保存してもよい(例えば冷蔵庫で一晩)。遺伝子導入の日に、未結合のレトロネクチンをウェルから取り出す。ウェルを洗浄してもよい(例えば、2mlのPBSで1回又は2回)。好ましくは、ウェルを乾燥させない。レトロウイルス上清を解凍することができる(例えば、37℃の水浴中で)。ウイルス上清を、好ましくはレトロネクチン被覆プレートの各ウェルに移す(例えば約1ml)。プレートは、粘着フィルムによって包まれてもよい。プレートを遠心分離することができる(例えば、1000×g、32℃で2時間)。遠心分離中に、活性化MAIT細胞を収集することができる。回収した細胞を再懸濁してもよい(例えば、1×106/mlの濃度まで100IU/mlのIL-2を含有する新鮮なR10培地において)。遠心分離が完了したら、上清をプレートから廃棄することができる。細胞懸濁液(例えば1ml)を各ウェルに添加してもよい。プレートを遠心分離することができる(例えば、500×gで10分間)。次いで、プレートをインキュベートすることができる(例えば、37℃のインキュベーター内で)。必要に応じて、より高い形質導入効率を達成するために形質導入工程を繰り返してもよい。形質導入効率は、形質導入の約48時間後にフローサイトメトリによって検出され得る。
本発明の方法は、好ましくは、第3の態様の方法における工程(iv)の後の後続の工程においてCAR-MAIT細胞を拡大する工程を含む。CAR-MAIT細胞増殖工程は、形質導入の1又は2日後に、好ましくはレトロウイルス又はウイルスを用いて、形質導入されたCAR-MAIT細胞を回収することを含み得る。回収した細胞を計数することができる(例えば、血球計によって)。次いで、回収した細胞をプレートのウェルに(例えば、1×107個の細胞をGrex6Mウェルプレートのウェルに)移すことができる。次いで、回収した細胞をインターロイキンと接触させることができる。例えば、インターロイキンは、R10培地(例えば130ml)等の適切な培地に含まれるIL-2(例えば約100IU/ml)であり得る。プレートをインキュベーターに戻してもよい。次いで、IL-2をリフレッシュすることができる(例えば、3日ごとに100IU/mlの最終濃度まで)。CAR-MAIT細胞を8~12日間の培養後に回収することができる。拡大されたCAR-MAIT細胞が、表現型試験、機能的アッセイのために使用される場合があり、かつ/又は、その後の使用のために凍結される場合がある(例えば液体窒素中で)。
有利には、実施例に記載されるように、11日間の培養により、100倍の拡大レベルのCAR-MAIT細胞がもたらされ、形質導入効率が50%を超えた。本発明者らは、CAR-MAIT細胞が、驚くべきことに、従来のCAR発現CD8+T細胞と少なくとも同等の細胞傷害性効力を示したことを認めた。
第4の態様において、第3の態様の方法によって得られるか又は得ることができるCAR-MAIT細胞が提供される。
本明細書中に記載されるように、第2の態様又は第3の態様のいずれかの方法を使用して得られる単離されたMAIT細胞が活性化され得、最終的には、CARをコードする核酸構築物により形質導入されて、第1の態様又は第4の態様のCAR-MAIT細胞が作製される。本明細書で論じられるように、本発明者らは、T細胞上のCD4分子(この場合、構築物及びベクターは本明細書で「CART4」と呼ばれる)又は1つ若しくは複数のTCR-Vβ領域、例えばTCR-Vβ7.1鎖(この場合、構築物及びベクターは本明細書で「CARTVb7.1」と呼ばれる)のいずれかを特異的に標的とするCARをコードする新規な遺伝子構築物及び組換えベクターを開発した。これらの構築物及びベクターのいずれかが、第3の態様又は第4の態様の方法においてMAIT細胞を形質導入するために使用され得る。
遺伝子構築物は、第3世代CARを形成するためのCD28/4-1BB/CD3-ゼータ鎖シグナル伝達部分を有する、(i)抗CD4mAb(例えば、Hu5A8)又は(ii)抗TCR-VbmAb、例えば抗TCR-Vb7.1mAb(例えば3G5)のいずれかのscFvを含む。CARをコードする構築物は、切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)及び/又は誘導性カスパーゼ-9(iC9)等のいわゆる自殺遺伝子によってコードされる少なくとも1つの安全スイッチを更に含み、所望に応じて結果として生じるCAR-T細胞の除去を可能にし、そのため、CAR-T細胞を治療に使用する場合に洗練されたモニタリングシステム又は安全機構を提供する。tEGFRの発現は、CAR-T細胞を監視又は枯渇させるための抗EGFRmAb(例えば、セツキシマブ)によって認識することができ、iC9は、ヒトFK506結合タンパク質に融合された改変ヒトCaspase-9であり、融合タンパク質を発現するCAR-T細胞のアポトーシスを誘発する二量体化の化学的誘導物質(例えば、Rimiducid)を用いた条件付き二量体化を可能にする。本発明者らは、本発明者らが開発したCARコード核酸構築物がそれ自体新規であると考える。図1A(1及び2)を参照すると、本発明によるCARコード化構築物の2つの実施形態に含まれる機能的要素を示す概略図が示され、すなわち、「CART4」が図1A(1)に示されており、「CARTVb7.1」が図1A(2)に示されている。しかしながら、Vβ7.1ファミリーを標的とする抗TCR-Vb7.1を有する「CARTVb7.1」は純粋に例示的なものであり、任意のVβ領域、例えば表1に示されるVβのいずれか、特にVb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17及びVb 20のいずれかがCARによって標的とされ得ることが理解されよう。
したがって、第5の態様では、抗CD4キメラ抗原受容体(CAR)又は抗T細胞受容体(TCR)V-β CARのいずれかをコードする、第1のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸構築物が提供される。
プロモータは、構成的プロモータ、活性化可能なプロモータ、誘導可能なプロモータ、又は組織特異的プロモータを含む任意の適切なプロモータであり得る。
構成的プロモータは、異種遺伝子(導入遺伝子とも呼ばれる)が宿主細胞において構成的に発現されることを可能にする。本明細書で企図される例示的な構成的プロモータには、サイトメガロウイルス(CMV)プロモータ、ヒト伸長因子-1α(hEFla)、ユビキチンCプロモータ(UbiC)、ホスホグリセロキナーゼプロモータ(PGK)、シミアンウイルス40初期プロモータ(SV40)、及びCMV初期エンハンサーとカップリングされたニワトリβ-アクチンプロモータ(CAGG)が含まれるが、これらに限定されない。誘導性プロモータは、調節プロモータのカテゴリーに属する。誘導性プロモータは、1つ又は複数の条件、例えば、物理的条件、操作された免疫エフェクター細胞の微小環境、又は操作された免疫エフェクター細胞の生理学的状態、誘導物質(すなわち、誘導剤)、又はそれらの組合せによって誘導することができる。いくつかの態様において、誘導条件は、操作された哺乳動物細胞において、及び/又は薬学的組成物を受ける被験体において内因性遺伝子の発現を誘導しない。いくつかの実施形態では、誘導条件は、誘導物質、照射(電離放射線、光等)、温度(熱等)、酸化還元状態、腫瘍環境、及び操作された哺乳動物細胞の活性化状態からなる群から選択される。
一実施形態では、プロモータはPGKプロモータ(EMBL番号:A19297.1)であり得る。一実施形態では、PGKプロモータは、以下のように、本明細書では配列番号3と呼ばれる。
GGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATTCTCCGGGCCTTTCG
[SEQ ID No:3]
したがって、好ましくは、プロモータは、実質的に配列番号3に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
[SEQ ID No:3]
したがって、好ましくは、プロモータは、実質的に配列番号3に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
核酸構築物は、シグナル伝達ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。有利には、シグナル伝達ペプチドは、CAR(すなわち、融合タンパク質である)をT細胞外膜に導くように構成される。好ましくは、シグナル伝達ペプチドをコードする配列は、プロモータの3’側に配置される。好ましくは、シグナル伝達ペプチドはIgκシグナル伝達ペプチドである。一実施形態では、シグナル伝達ペプチドは、以下のように、本明細書で配列番号4と呼ばれるアミノ酸配列を有することができる。
METDTLLLWVLLLWVPGSTGD
[SEQ ID No:4]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するシグナル伝達ペプチド、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:4]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するシグナル伝達ペプチド、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、シグナル伝達ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本明細書では以下のように配列番号5と呼ばれる。
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACAGGTGAC
[SEQ ID No:5]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号5に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
[SEQ ID No:5]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号5に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、第1のコード配列は、シグナル伝達ペプチドをコードする配列の3’に配置される。核酸構築物の第1の実施形態では、第1のコード配列が抗CD4キメラ抗原受容体(CAR)をコードする。好ましくは、CARは、実質的に配列番号1に示されるアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含むCD4抗原に特異的である。
図1A(1)(「CART4」)に示されるように、第1のコード配列は、VL(可変軽鎖)配列及びVH(可変重鎖)配列を含み得るscFv領域をコードし得る。好ましくは、VL配列はVH配列の上流(すなわち、5’)にある。しかしながら、いくつかの実施形態では、VH配列はVL配列の上流にあり得る。
VL配列及びVH配列は、一実施形態では、T細胞上のCD4抗原に結合するためのHu5A8(すなわち、抗CD4モノクローナル抗体のハイブリドーマクローン名)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域であり得る。
したがって、一実施形態では、第1のコード配列(CD4に結合するためのVL配列をコードし得る)は、以下のように、本明細書では配列番号6と呼ばれるアミノ酸配列をコードする。
DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIK
[SEQ ID No:6]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号6に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:6]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号6に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、第1のコード配列(CD4に結合するためのVL配列をコードし得る)は、以下のように、本明細書では配列番号7と呼ばれるヌクレオチド配列を含む:
GACATTGTGATGACTCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTCTCACTGGGCGAAAGGGTGACCATGAATTGTAAATCTTCTCAGAGCCTGCTGTACAGTACAAACCAGAAAAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGAGCCCTAAGCTGCTGATCTATTGGGCAAGTACCCGAGAGTCAGGAGTGCCAGACAGATTCTCCGGGTCTGGAAGTGGCACAGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACGTGGCTGTCTACTATTGCCAGCAGTACTATAGCTACCGAACTTTCGGCGGGGGAACCAAACTGGAAATCAAG
[SEQ ID No:7]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号7に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
GACATTGTGATGACTCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTCTCACTGGGCGAAAGGGTGACCATGAATTGTAAATCTTCTCAGAGCCTGCTGTACAGTACAAACCAGAAAAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGAGCCCTAAGCTGCTGATCTATTGGGCAAGTACCCGAGAGTCAGGAGTGCCAGACAGATTCTCCGGGTCTGGAAGTGGCACAGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACGTGGCTGTCTACTATTGCCAGCAGTACTATAGCTACCGAACTTTCGGCGGGGGAACCAAACTGGAAATCAAG
[SEQ ID No:7]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号7に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
一実施形態では、第1のコード配列(CD4に結合するためのVH配列をコードし得る)は、以下のように、本明細書では配列番号8と呼ばれるアミノ酸配列をコードする。
QVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSS
[SEQ ID No:8]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号8に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:8]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号8に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、第1のコード配列(CD4に結合するためのVH配列をコードし得る)は、以下のように、本明細書では配列番号9と呼ばれるヌクレオチド配列を含む:
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCAGAGGTGGTCAAACCCGGCGCTAGCGTCAAAATGTCCTGTAAGGCATCTGGCTACACTTTCACCTCTTATGTGATTCACTGGGTCAGACAGAAGCCTGGGCAGGGACTGGACTGGATCGGGTACATTAACCCATATAATGATGGAACTGACTACGATGAAAAGTTTAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCCGACACCTCAACAAGCACTGCTTATATGGAGCTGTCTAGTCTGAGGTCTGAAGACACAGCAGTGTACTATTGCGCCCGCGAGAAGGATAACTACGCCACTGGCGCTTGGTTTGCATATTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACAGTCTCATCC
[SEQ ID No:9]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号9に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCAGAGGTGGTCAAACCCGGCGCTAGCGTCAAAATGTCCTGTAAGGCATCTGGCTACACTTTCACCTCTTATGTGATTCACTGGGTCAGACAGAAGCCTGGGCAGGGACTGGACTGGATCGGGTACATTAACCCATATAATGATGGAACTGACTACGATGAAAAGTTTAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCCGACACCTCAACAAGCACTGCTTATATGGAGCTGTCTAGTCTGAGGTCTGAAGACACAGCAGTGTACTATTGCGCCCGCGAGAAGGATAACTACGCCACTGGCGCTTGGTTTGCATATTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACAGTCTCATCC
[SEQ ID No:9]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号9に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、VH(例えば、配列番号9)及びVL(例えば、配列番号7)配列は、いずれかの配向にある場合、リンカー配列によって分離されている。一実施形態では、リンカー配列は、本明細書では以下のように配列番号10と呼ばれるG4Sリンカー配列であり得る。
GGGGSGGGGSGGGGS
[SEQ ID No:10]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号10に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:10]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号10に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、リンカー配列は、以下のように、本明細書では配列番号11と呼ばれるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
GAGGAGGAGGCAGTGGCGGAGGAGGGTCAGGAGGAGGAGGAAGC
[SEQ ID No:11]
したがって、好ましくは、リンカー配列は、実質的に配列番号11に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
[SEQ ID No:11]
したがって、好ましくは、リンカー配列は、実質的に配列番号11に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
しかしながら、核酸構築物の第2の実施形態(「CARTVb7.1」)では、第1のコード配列は抗T細胞受容体(TCR)V-β領域CARをコードする。任意のVβ領域がCARによって標的化され得ることが理解されるであろう。例えば、表1に列挙されるVβ領域のいずれかは、第1のコード配列によってコードされるCARによって標的化され得る。
第1のコード配列は、複数のT細胞受容体(TCR)β鎖可変領域(Vβ)CARをコードし得る。好ましくは、複数のVβ領域は、表1に示すVβ領域の群から選択されてもよい。同じ構築物上で2つ以上のVβ領域標的化CARを組み合わせることも可能である。例えば、構築物は、好ましくは表1に列挙されるような、少なくとも2つ、又は少なくとも3つ、又は少なくとも4つのT細胞受容体(TCR)β鎖可変領域(Vβ)標的CARをコードするコード配列を含み得る。構築物は、好ましくは表1に列挙されるように、少なくとも5つ、又は少なくとも6つ、又は少なくとも7つのT細胞受容体(TCR)β鎖可変領域(Vβ)標的CARをコードするコード配列を含み得る。複数のTCR Vβ領域は、同じ又は異なるVβ領域であり得る。
以下のVbファミリーは、T細胞リンパ腫、すなわちVb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17及びVb 20に頻繁に関連すると考えられている。したがって、好ましい実施形態では、構築物は、以下のVβ領域:Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17、及びVb 20からなる群から選択されるT細胞上の1つ又は複数のTCR Vβ領域を標的とする少なくとも1つのCARをコードするコード配列を含む。好ましくは、構築物は、以下のVβ領域:Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17、及びVb 20からなる群から選択されるT細胞上の少なくとも2つ又は3つのTCR Vβ領域を標的とする少なくとも1つのCARをコードするコード配列を含む。
したがって、好ましくは、複数の抗T細胞受容体(TCR)V-β CARをコードする第1のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸構築物が提供され、ここで、T細胞上の異なるV-β領域が標的化される。
好ましくは、CARは、実質的に配列番号2に示されるアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含むTCR Vβ領域(好ましくは、TCR-Vβ7.1鎖)に特異的である。
図1A(2)に示されるように、第1のコード配列は、VL(可変軽鎖)配列及びVH(可変重鎖)配列を含み得るscFv領域をコードし得る。好ましくは、VL配列はVH配列の上流(すなわち、5’)にある。しかしながら、いくつかの実施形態では、VH配列はVL配列の上流にあり得る。好ましくは、いずれかの向きのVH及びVLコード配列は、G4Sリンカー配列等のリンカー配列によって分離されている。
VL配列及びVH配列は、一実施形態では、TCR V-β7.1抗原に結合するための3G5(すなわち、抗TCR Vβ7.1モノクローナル抗体のハイブリドーマクローン名)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域であり得る。
一実施形態では、第1のコード配列(これは、TCR V-β、好ましくはTCR-Vβ7.1鎖に結合するためのVL配列をコードし得る)は、本明細書で以下の配列番号12と呼ばれるアミノ酸配列をコードする。
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTRYWITWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSGFTKYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREGGNYWYFDVWGTGTTVTVSS
[SEQ ID No:12]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号12に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:12]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号12に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、第1のコード配列(これは、TCR V-β、好ましくはTCR-Vβ7.1鎖に結合するためのVL配列をコードし得る)は、本明細書で以下の配列番号13と呼ばれるヌクレオチド配列を含む。
CAAGTTCAGCTGCAACAGCCTGGCGCCGAGCTTGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAGATACTGGATCACCTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTCGAGTGGATCGGCGATATCTATCCTGGCTCCGGCTTCACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACCGTGGACACCAGCAGCAGCACAGCCTACATGCAGCTGTCTAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGCTAGAGAAGGCGGCAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCACCGGCACCACAGTGACAGTTAGTTCT
[SEQ ID No:13]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号13に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
[SEQ ID No:13]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号13に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
一実施形態では、第1のコード配列(これは、TCR V-β、好ましくはTCR-Vβ7.1鎖に結合するためのVH配列をコードし得る)は、本明細書で以下の配列番号34と呼ばれるアミノ酸配列をコードする。
DIQMTQSPSSLSASLGGKVTLTCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDVATYYCLQYDNLRTFGGGTKLEIKRTD
[SEQ ID No:34]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号34に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:34]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号34に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、第1のコード配列(これは、TCR V-β、好ましくはTCR-Vβ7.1鎖に結合するためのVH配列をコードし得る)は、本明細書で以下の配列番号35と呼ばれるヌクレオチド配列を含む。
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTCTCGGCGGAAAAGTGACCCTGACATGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAAGTATATCGCCTGGTATCAGCACAAGCCCGGCAAGGGACCTAGACTGCTGATCCACTACACCAGCACACTGCAGCCTGGCATCCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCAGAGACTACAGCTTCAGCATCAGCAACCTGGAACCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCTGCAGTACGACAACCTGCGGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAGCGGACAGAT
[SEQ ID No:35]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号35に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
[SEQ ID No:35]
したがって、好ましくは、第1のコード配列は、実質的に配列番号35に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、VH(例えば、配列番号35)及びVL(例えば、配列番号13)配列は、いずれかの配向にある場合、リンカー配列によって分離されている。一実施形態では、リンカー配列は、配列番号10に実質的に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得るか又はそれからなり得るG4Sリンカー配列であり得る。したがって、好ましくは、リンカー配列は、実質的に配列番号11に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
核酸構築物は、CD8aヒンジ及び膜貫通(TM)構造ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。有利には、ヒンジ及びTMドメインは、CARの表示及びCAR-T細胞への固定のために構成される。好ましくは、ヒンジ及びTMドメインをコードする配列は、第1のコード配列の3’に配置される。
一実施形態では、CD8aヒンジ及び膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、本明細書では以下のように配列番号14と呼ばれる。
FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN
[SEQ ID No:14]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号14に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:14]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号14に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、CD8aヒンジ及び膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列は、以下のように、本明細書では配列番号15と呼ばれる。
TTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAAC
[SEQ ID No:15]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号15に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
[SEQ ID No:15]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号15に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
核酸構築物は、CD28のシグナル伝達ドメイン、4-1BBのシグナル伝達ドメイン及び/又はCD3ζ鎖、より好ましくはCD28のシグナル伝達ドメイン、4-1BBのシグナル伝達ドメイン及びCD3ζ鎖を含み得る細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。これらの成分は、第3世代CARの基礎を形成し、細胞内シグナル伝達経路を誘発するために必要であることが理解されよう。好ましくは、細胞内ドメインは、ヒンジ及び膜貫通ドメインをコードする配列の3’側に配置される。CD28のシグナル伝達ドメインは、4-1BBのシグナル伝達ドメインの5’であり得る。4-1BBのシグナル伝達ドメインは、CD3ζ鎖の5’であり得る。
CD28シグナル伝達ドメインの一実施形態は、以下のように、本明細書では配列番号16と呼ばれるアミノ酸配列を有することができる。
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
[SEQ ID No:16]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号16に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:16]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号16に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、CD28シグナル伝達ドメインは、以下のように、本明細書では配列番号17と呼ばれる核酸配列によってコードされ得る。
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
[SEQ ID No:17]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号17に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
[SEQ ID No:17]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号17に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
4-1BBシグナル伝達ドメインの一実施形態は、以下のように、本明細書では配列番号18と呼ばれるアミノ酸配列を有することができる。
RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
[SEQ ID No:18]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号18に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:18]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号18に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、4-1BBシグナル伝達ドメインは、以下のように、本明細書では配列番号19と呼ばれる核酸配列によってコードされ得る。
CGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
[SEQ ID No:19]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号19に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
[SEQ ID No:19]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号19に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
CD3ζ鎖の一実施形態は、以下のように、本明細書において配列番号20と呼ばれるアミノ酸配列を有することができる。
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[SEQ ID No:20]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号20に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:20]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号20に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、CD3ζ鎖は、以下のように、本明細書では配列番号21と呼ばれる核酸配列によってコードされ得る。
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
[SEQ ID No:21]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号21に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
[SEQ ID No:21]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号21に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、核酸構築物は、少なくとも1つの自殺タンパク質、より好ましくは少なくとも2つの自殺タンパク質をコードする第2のコード配列を含む。本発明の構築物は、少なくとも1つの自殺タンパク質をコードする第2のコード配列の存在が、その構築物により形質導入された得られたCAR-T細胞が、例えば、有害な患者反応の場合に、制御可能に又は誘導可能に検出され得るか又は排除され得ることを意味するという点で有利である。
したがって、好ましくは、一実施形態では、抗CD4キメラ抗原受容体(CAR)をコードする第1のコード配列、及び少なくとも1つの自殺タンパク質、より好ましくは少なくとも2つの自殺タンパク質をコードする第2のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸構築物が提供される。
好ましくは、別の実施形態では、抗T細胞受容体(TCR)V-β CARをコードする第1のコード配列、及び少なくとも1つの自殺タンパク質、より好ましくは少なくとも2つの自殺タンパク質をコードする第2のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸構築物が提供される。
更に別の実施形態では、好ましくは、T細胞上の異なるV-β領域が標的とされる複数の抗T細胞受容体(TCR)V-β CARをコードする第1のコード配列、及び少なくとも1つの自殺タンパク質、より好ましくは少なくとも2つの自殺タンパク質をコードする第2のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸構築物が提供される。
一実施形態では、第2のコード配列は、上皮成長因子受容体(EGFR)又は切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)(UniProt No.P00533;NCBI参照配列NP001333826.1)をコードし得る。tEGFRの発現は、患者におけるCAR-T細胞のモニタリング又は枯渇のための抗EGFRmAb(セツキシマブ)によって制御することができる。一実施形態では、tEGFRのアミノ酸配列は、本明細書では以下のように配列番号22と呼ばれ得る。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
[SEQ ID No:22]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号22に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:22]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号22に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、tEGFRは、以下のように、本明細書では配列番号23と呼ばれる核酸配列によってコードされ得る。
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAACCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATG
[SEQ ID No:23]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号23に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
[SEQ ID No:23]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号23に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
別の実施形態において、第2のコード配列は、誘導性カスパーゼ-9(iC9)をコードし得る。iC9は、ヒトFK506結合タンパク質(UniProt No.P62942;NCBI参照配列NP_000792.1)に融合して、融合タンパク質を発現するCAR-T細胞のアポトーシスを誘発する、二量体化化学誘導物質(カスパーゼ誘導性薬物(CID)、Rimiducid)を用いた条件付き二量体化を可能にする改変ヒトカスパーゼ-9(UniProt No.P55211;NCBI参照配列NP_001220.2)である。一実施形態では、iC9のアミノ酸配列は、本明細書では以下のように配列番号24と呼ばれ得る。
MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSVDYPYDVPDYALD*
[SEQ ID No:24]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号24に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:24]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号24に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、iC9は、以下のように、本明細書では配列番号25と呼ばれる核酸配列によってコードされ得る。
ATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAA
[SEQ ID No:25]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号25に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
[SEQ ID No:25]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号25に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、本発明の核酸構築物は、EGFR若しくは切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)及び/又は誘導性カスパーゼ-9(iC9)をコードするコード配列を含む。1つの自殺遺伝子を有することは、治療において使用される場合、CAR及びCAR-MAIT細胞の発現に対する(検出及び/又は排除のための)ロバストな制御を提供する。
しかしながら、より好ましくは、核酸構築物は、切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)及び誘導性カスパーゼ-9(iC9)の両方をコードするコード配列を含む。有利には、2つの自殺遺伝子を有することは、治療に使用される場合、CAR及びCAR-MAIT細胞の発現に対する(検出及び/又は排除のための)更に厳密な制御を提供する。
好ましくは、核酸構築物は、消化される(又は自己切断される)ように構成されたペプチドスペーサーをコードするヌクレオチド配列を含み、それにより、スペーサーの両側にコードされたポリペプチドを別個の分子、例えば、細胞内ドメイン及び自殺遺伝子コードタンパク質(tEGFR及び/又はiC9であり得る)として産生する。したがって、ペプチドスペーサーは、自己切断性ペプチドとして知られ得る。
好ましくは、スペーサー配列は、ウイルスペプチドスペーサー配列、より好ましくはウイルス2Aペプチドスペーサー配列(Furler S,Paterna J-C,Weibel M and Bueler H Recombinant AAV vectors containing the foot and mouth disease virus 2A sequence confer efficient bicistronic gene expression in cultured cells and rat substantia nigra neurons Gene Ther.2001,vol.8,PP:864-873)を含み、コードする。
好ましくは、2Aペプチド配列をコードするスペーサー配列は、細胞内ドメインをコードする配列を自殺タンパク質をコードする配列に接続する。構築物が2つの自殺タンパク質(例えば、EGFR/tEGFR及びiC9)をコードする実施形態では、核酸構築物は、細胞内ドメインをコードする配列と第1の自殺タンパク質をコードする配列との間に配置された第1のスペーサー配列、及び第1の自殺タンパク質をコードする配列と第2の自殺タンパク質をコードする配列との間に配置された第2のスペーサー配列を含む。第1の自殺タンパク質はEGFR/tEGFRであり得、第2の自殺タンパク質はiC9であり得る。別の実施形態では、第1の自殺タンパク質はiC9であり得、第2の自殺タンパク質はEGFR/tEGFRであり得る。
2Aスペーサー配列は、Wang Y et al.Scientific Reports 2015,5に開示されているように、E2A、F2A、P2A及びT2Aと呼ばれる配列を含む任意の既知のバリアントであり得る。好ましくは、自己切断性ペプチドはP2Aである。一実施形態では、P2Aスペーサーは、本明細書で以下の配列番号26と呼ばれるアミノ酸配列を有する。
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
[SEQ ID No:26]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号26に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:26]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号26に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、2Aスペーサーは、以下のように、本明細書では配列番号27と呼ばれる核酸配列によってコードされ得る。
GGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCT
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号27に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号27に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
更なる実施形態では、構築物は、導入遺伝子の発現を増強するウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)をコードするヌクレオチド配列を更に含み得る。好ましくは、WPREコード配列は、自殺タンパク質をコードする配列の3’に配置される。特に、WPRE配列は、好ましくはiC9コード配列の3’である。
WPREの一実施形態は、以下のように、ガンマ-アルファ-ベータ要素を含めて592bp長であり、本明細書では配列番号28と呼ばれる。
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG
[SEQ ID NO:28]
好ましくは、核酸は、実質的に配列番号28に示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
[SEQ ID NO:28]
好ましくは、核酸は、実質的に配列番号28に示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、構築物は、左(すなわち、5’)及び/又は右(すなわち、3’)の長末端反復配列(LTR)を含む。好ましくは、各LTRは、構築物の5’及び/又は3’末端に配置される。
好ましい実施形態では、核酸構築物は、この指定された順序で、5’プロモータ、CD4又はTCR V-β領域に特異的なscFvをコードする配列;及び細胞内ドメインをコードする3’配列を含む。5’及び3’の使用は、特徴が上流又は下流のいずれかであることを示し、特徴が必然的に終端特徴であることを示すことを意図しない。
好ましい実施形態では、核酸構築物は、この指定された順序で、5’プロモータ;CD4又はTCR V-β領域に特異的なscFvをコードする配列;細胞内ドメインをコードする配列;及び少なくとも1つの自殺タンパク質をコードする3’配列を含む。
より好ましい実施形態では、核酸構築物は、この指定された順序で、5’プロモータ(好ましくは、PGKプロモータ);CD4又は1つ若しくは複数のTCR V-β領域(好ましくは、VLドメイン及び/又はVHドメイン)に特異的なscFvをコードする配列;細胞内ドメイン(好ましくは、CD28、4-1BB及び/又はCD3ζ鎖)をコードする配列;少なくとも1つの自殺タンパク質(好ましくは、EGFR/EGFRt及び/又はiC9)をコードする3’配列を含む。
更により好ましい実施形態では、核酸構築物は、この指定された順序で、5’プロモータ(好ましくは、PGKプロモータ);シグナル伝達ペプチド(SP)をコードする配列;CD4又は1つ若しくは複数のTCR V-β領域(好ましくは、G4Sリンカーによって分離されたVLドメイン及びVHドメイン)に特異的なscFvをコードする配列;CD8aヒンジ及び膜貫通ドメインをコードする配列;細胞内ドメイン(好ましくは、CD28、4-1BB及びCD3ζ鎖)をコードする配列;細胞内ドメインをコードする配列と自殺タンパク質をコードする配列との間に自己切断ペプチドスペーサーを有していてもよい、少なくとも1つの自殺タンパク質(好ましくは、EGFR/EGFRt及びiC9)をコードする3’配列を含む。
第1の最も好ましい実施形態(「CART4」として知られる)では、核酸構築物は、この指定された順序で、5’PGKプロモータ;シグナル伝達ペプチド(SP)をコードする配列;CD4に特異的なscFvのVLドメイン及びVHドメインをコードする配列(好ましくは、G4Sリンカーによって分離される);CD8aヒンジ及び膜貫通ドメインをコードする配列;細胞内ドメインのCD28、4-1BB及びCD3ζ鎖をコードする配列;第1の自己切断ペプチドスペーサーをコードする配列;EGFR/EGFRtをコードする配列;第2の自己切断ペプチドスペーサーをコードする配列;iC9をコードする3’配列を含む。
第2の最も好ましい実施形態(「CARTVb7.1」として知られる)では、核酸構築物は、この指定された順序で、5’PGKプロモータ;シグナル伝達ペプチド(SP)をコードする配列;1つ又は複数のTCR V-β領域、好ましくはTCR-Vβ7.1鎖に特異的なscFvのVLドメイン及びVHドメインをコードする配列(好ましくは、G4Sリンカーによって分離される);CD8aヒンジ及び膜貫通ドメインをコードする配列;細胞内ドメインのCD28、4-1BB及びCD3ζ鎖をコードする配列;第1の自己切断ペプチドスペーサーをコードする配列;EGFR/EGFRtをコードする配列;第2の自己切断ペプチドスペーサーをコードする配列;iC9をコードする3’配列を含む。
したがって、核酸構築物(「CART4」として知られる)の好ましい一実施形態は、以下の通り、本明細書では配列番号29と呼ばれるアミノ酸配列を有する。
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDDIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSVDYPYDVPDYALD*
[SEQ ID No:29]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号29に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:29]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号29に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
好ましくは、核酸構築物(「CART4」として知られている)の実施形態は、以下の通り、本明細書では配列番号30と呼ばれるヌクレオチド配列を有する。
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACAGGTGACGACATTGTGATGACTCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTCTCACTGGGCGAAAGGGTGACCATGAATTGTAAATCTTCTCAGAGCCTGCTGTACAGTACAAACCAGAAAAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGAGCCCTAAGCTGCTGATCTATTGGGCAAGTACCCGAGAGTCAGGAGTGCCAGACAGATTCTCCGGGTCTGGAAGTGGCACAGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACGTGGCTGTCTACTATTGCCAGCAGTACTATAGCTACCGAACTTTCGGCGGGGGAACCAAACTGGAAATCAAGGGAGGAGGAGGCAGTGGCGGAGGAGGGTCAGGAGGAGGAGGAAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCAGAGGTGGTCAAACCCGGCGCTAGCGTCAAAATGTCCTGTAAGGCATCTGGCTACACTTTCACCTCTTATGTGATTCACTGGGTCAGACAGAAGCCTGGGCAGGGACTGGACTGGATCGGGTACATTAACCCATATAATGATGGAACTGACTACGATGAAAAGTTTAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCCGACACCTCAACAAGCACTGCTTATATGGAGCTGTCTAGTCTGAGGTCTGAAGACACAGCAGTGTACTATTGCGCCCGCGAGAAGGATAACTACGCCACTGGCGCTTGGTTTGCATATTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACAGTCTCATCCGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAACCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGGGATCTGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAA
[SEQ ID No:30]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号30に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
[SEQ ID No:30]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号30に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
したがって、核酸構築物の第2の好ましい実施形態(「CARTVb7.1」として知られている)は、以下の通り、本明細書では配列番号31と呼ばれるアミノ酸配列を有する。
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASLGGKVTLTCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDVATYYCLQYDNLRTFGGGTKLEIKRTDGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTRYWITWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSGFTKYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREGGNYWYFDVWGTGTTVTVSSAAAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSVDYPYDVPDYALD*
[SEQ ID No:31]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号31に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
[SEQ ID No:31]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号31に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
好ましくは、核酸構築物の実施形態(「CARTVb7.1」として知られている)は、以下の通り、本明細書では配列番号32と呼ばれるヌクレオチド配列を有する。
ATGGCTCTGCCTGTTACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTCTCGGCGGAAAAGTGACCCTGACATGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAAGTATATCGCCTGGTATCAGCACAAGCCCGGCAAGGGACCTAGACTGCTGATCCACTACACCAGCACACTGCAGCCTGGCATCCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCAGAGACTACAGCTTCAGCATCAGCAACCTGGAACCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCTGCAGTACGACAACCTGCGGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAGCGGACAGATGGCGGAGGCGGATCAGGCGGCGGAGGAAGCGGTGGCGGAGGATCTCAAGTTCAGCTGCAACAGCCTGGCGCCGAGCTTGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAGATACTGGATCACCTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTCGAGTGGATCGGCGATATCTATCCTGGCTCCGGCTTCACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACCGTGGACACCAGCAGCAGCACAGCCTACATGCAGCTGTCTAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGCTAGAGAAGGCGGCAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCACCGGCACCACAGTGACAGTTAGTTCTGCGGCCGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAACCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGGGATCTGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAA
[SEQ ID No:32]
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号32に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
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したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号32に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
したがって、第2又は第3の態様のいずれかの方法を使用して得られた単離されたMAIT細胞は活性化され得、最終的には、CARをコードする第5の態様による核酸構築物で形質導入されて、それにより、第1の態様又は第4の態様のCAR-MAIT細胞が作製されることが理解されるであろう。
第6の態様では、第5の態様の核酸構築物をコードする発現ベクターが提供される。
好ましくは、ベクターは組換え体である。好ましくは、ベクターはウイルスベクター、より好ましくはレトロウイルスベクターである。本発明のベクターの2つの好ましい実施形態の特徴を示すマップを図9及び図10に示す。
一実施形態(CART4:CAR4-tEGFR-iC9;図9を参照)では、ベクターは、以下の通り、本明細書では配列番号33と呼ばれる核酸配列を有する。
TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTATTCCCAATAAAGCCTCTTGCTGTTTGCATCCGAATCGTGGACTCGCTGATCCTTGGGAGGGTCTCCTCAGATTGATTGACTGCCCACCTCGGGGGTCTTTCATTTGGAGGTTCCACCGAGATTTGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCCCCCGCCGGGAGGTAAGCTGGCCAGCGGTCGTTTCGTGTCTGTCTCTGTCTTTGTGCGTGTTTGTGCCGGCATCTAATGTTTGCGCCTGCGTCTGTACTAGTTAGCTAACTAGCTCTGTATCTGGCGGACCCGTGGTGGAACTGACGAGTTCTGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTTGGGGGCCGTTTTTGTGGCCCGACCTGAGGAAGGGAGTCGATGTGGAATCCGACCCCGTCAGGATATGTGGTTCTGGTAGGAGACGAGAACCTAAAACAGTTCCCGCCTCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTGGAACCGAAGCCGCGCGTCTTGTCTGCTGCAGCGCTGCAGCATCGTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAAAATTAGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTTCTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTGGCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCAAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCCTCGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCGGAATTAGATCTCTCGAGGTTAACGAATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATTCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCCAAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACAGGTGACGACATTGTGATGACTCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTCTCACTGGGCGAAAGGGTGACCATGAATTGTAAATCTTCTCAGAGCCTGCTGTACAGTACAAACCAGAAAAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGAGCCCTAAGCTGCTGATCTATTGGGCAAGTACCCGAGAGTCAGGAGTGCCAGACAGATTCTCCGGGTCTGGAAGTGGCACAGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACGTGGCTGTCTACTATTGCCAGCAGTACTATAGCTACCGAACTTTCGGCGGGGGAACCAAACTGGAAATCAAGGGAGGAGGAGGCAGTGGCGGAGGAGGGTCAGGAGGAGGAGGAAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCAGAGGTGGTCAAACCCGGCGCTAGCGTCAAAATGTCCTGTAAGGCATCTGGCTACACTTTCACCTCTTATGTGATTCACTGGGTCAGACAGAAGCCTGGGCAGGGACTGGACTGGATCGGGTACATTAACCCATATAATGATGGAACTGACTACGATGAAAAGTTTAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCCGACACCTCAACAAGCACTGCTTATATGGAGCTGTCTAGTCTGAGGTCTGAAGACACAGCAGTGTACTATTGCGCCCGCGAGAAGGATAACTACGCCACTGGCGCTTGGTTTGCATATTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACAGTCTCATCCGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAACCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGGGATCTGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGG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CCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTATCGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATGGGTAACAGTTTCTTGAAGTTGGAGAACAACATTCTGAGGGTAGGAGTCGAATATTAAGTAATCCTGACTCAATTAGCCACTGTTTTGAATCCACATACTCCAATACTCCTGAAATAGTTCATTATGGACAGCGCAGAAGAGCTGGGGAGAATTAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGCGATTAGTCCAATTTGTTAAAGACAGGATATCAGT
GGTCCAGGCTCTAGTTTTGACTCAACAATATCACCAGCTGAAGCCTATAGAGTACGAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAA
[SEQ ID NO:33]
好ましくは、ベクターは、実質的に配列番号33に示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
CCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTATCGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATGGGTAACAGTTTCTTGAAGTTGGAGAACAACATTCTGAGGGTAGGAGTCGAATATTAAGTAATCCTGACTCAATTAGCCACTGTTTTGAATCCACATACTCCAATACTCCTGAAATAGTTCATTATGGACAGCGCAGAAGAGCTGGGGAGAATTAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGCGATTAGTCCAATTTGTTAAAGACAGGATATCAGT
GGTCCAGGCTCTAGTTTTGACTCAACAATATCACCAGCTGAAGCCTATAGAGTACGAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAA
[SEQ ID NO:33]
好ましくは、ベクターは、実質的に配列番号33に示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
一実施形態(CARTVb7.1:CARTVb7.1-tEGFR-iC9;図10を参照されたい)では、ベクターは、以下の通り、本明細書では配列番号36と呼ばれる核酸配列を有する。
TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTATTCCCAATAAAGCCTCTTGCTGTTTGCATCCGAATCGTGGACTCGCTGATCCTTGGGAGGGTCTCCTCAGATTGATTGACTGCCCACCTCGGGGGTCTTTCATTTGGAGGTTCCACCGAGATTTGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCCCCCGCCGGGAGGTAAGCTGGCCAGCGGTCGTTTCGTGTCTGTCTCTGTCTTTGTGCGTGTTTGTGCCGGCATCTAATGTTTGCGCCTGCGTCTGTACTAGTTAGCTAACTAGCTCTGTATCTGGCGGACCCGTGGTGGAACTGACGAGTTCTGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTTGGGGGCCGTTTTTGTGGCCCGACCTGAGGAAGGGAGTCGATGTGGAATCCGACCCCGTCAGGATATGTGGTTCTGGTAGGAGACGAGAACCTAAAACAGTTCCCGCCTCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTGGAACCGAAGCCGCGCGTCTTGTCTGCTGCAGCGCTGCAGCATCGTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAAAATTAGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTTCTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTGGCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCAAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCCTCGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCGGAATTAGATCTCTCGAGGTTAACGAATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATTCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCCAAGCCACCATGGCTCTGCCTGTTACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTCTCGGCGGAAAAGTGACCCTGACATGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAAGTATATCGCCTGGTATCAGCACAAGCCCGGCAAGGGACCTAGACTGCTGATCCACTACACCAGCACACTGCAGCCTGGCATCCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCAGAGACTACAGCTTCAGCATCAGCAACCTGGAACCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCTGCAGTACGACAACCTGCGGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAGCGGACAGATGGCGGAGGCGGATCAGGCGGCGGAGGAAGCGGTGGCGGAGGATCTCAAGTTCAGCTGCAACAGCCTGGCGCCGAGCTTGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAGATACTGGATCACCTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTCGAGTGGATCGGCGATATCTATCCTGGCTCCGGCTTCACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACCGTGGACACCAGCAGCAGCACAGCCTACATGCAGCTGTCTAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGCTAGAGAAGGCGGCAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCACCGGCACCACAGTGACAGTTAGTTCTGCGGCCGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAACCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGGGATCTGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCT
TCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTATCGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATGGGTAACAGTTTCTTGAAGTTGGAGAACAACATTCTGAGGGTAGGAGTCGAATATTAAGTAATCCTGACTCAATTAGCCACTGTTTTGAATCCACATACTCCAATACTCCTGAAATAGTTCATTATGGACAGCGCAGAAGAGCTGGGGAGAATTAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGCGATTAGTCCAATTTGTTAAAGACAGGATATCAGTGGTCCAGGCTCT
AGTTTTGACTCAACAATATCACCAGCTGAAGCCTATAGAGTACGAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAA
[SEQ ID NO:36]
好ましくは、ベクターは、実質的に配列番号36に示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
TCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTATCGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATGGGTAACAGTTTCTTGAAGTTGGAGAACAACATTCTGAGGGTAGGAGTCGAATATTAAGTAATCCTGACTCAATTAGCCACTGTTTTGAATCCACATACTCCAATACTCCTGAAATAGTTCATTATGGACAGCGCAGAAGAGCTGGGGAGAATTAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGA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[SEQ ID NO:36]
好ましくは、ベクターは、実質的に配列番号36に示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
したがって、第2又は第3の態様のいずれかの方法を使用して得られた単離されたMAIT細胞が活性化され得、最終的には、CARをコードする第6の態様の発現ベクターで形質導入され、それにより、第1の態様又は第4の態様のCAR-MAIT細胞が作製されることが理解されるであろう。
第11の態様では、場合により抗CD4キメラ抗原受容体(CAR)又は抗Vβ CARを発現する、第5の態様に記載の構築物又は第6の態様に記載のベクターを含むT細胞が提供される。
好ましくは、T細胞は粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞である。
第7の態様では、第11の態様によるT細胞、好ましくは第1の態様又は第4の態様によるMAIT細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。
好ましくは、医薬組成物は、本発明のT細胞又はMAIT細胞を複数含む。例えば、組成物は、少なくとも100、1000又は10,000個のT細胞又はMAIT細胞を含み得る。好ましくは、組成物は、少なくとも100,000個、又は少なくとも1,000,000個、又は少なくとも10,000,000個のT細胞又はMAIT細胞を含む。
第8の態様では、治療に使用するための、第11の態様のT細胞、又は第1の態様若しくは第4の態様のMAIT細胞、又は第7の態様の医薬組成物が提供される。
第9の態様において、(i)免疫療法における、(ii)癌を治療、予防若しくは改善するための、(ii)微生物感染症を治療、予防若しくは改善するための、又は(iv)自己免疫疾患を治療、予防若しくは改善するための、使用のための、第11の態様に記載のT細胞、又は第1の態様若しくは第4の態様に記載のMAIT細胞、又は第7の態様の医薬組成物が提供される。
第10の態様では、本発明は、(i)免疫療法で被験体の疾患を治療、予防若しくは改善するための、(ii)癌を治療、予防若しくは改善するための、(iii)被験体における微生物感染を治療、予防若しくは改善するための、又は(iv)被験体の自己免疫疾患を治療、予防若しくは改善するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に、治療有効量の第11の態様のT細胞若しくは第1の態様若しくは第4の態様のMAIT細胞、又は第7の態様の医薬組成物を投与すること、又は投与したことがあることを含む方法が提供される。
好ましくは、T細胞、MAIT細胞又は医薬組成物は、固形腫瘍又は液体腫瘍であり得るT細胞悪性腫瘍の治療、予防又は改善に使用するためのものである。
T細胞悪性腫瘍は、末梢T細胞リンパ腫(PTCL)又は皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)であり得る。
末梢T細胞リンパ腫(PTCL)は、患者のT細胞が癌性になる、稀で攻撃的な疾患の多様な群を含む。PTCLは、3つのカテゴリー、すなわち、結節性、節外性及び白血病性に分けられ、これらはそれぞれ本発明に包含される。
PTCLは、成人T細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病(ATL);腸疾患関連リンパ腫;肝脾リンパ腫;皮下脂漏様リンパ腫(SPTCL);前駆T細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病;及び血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)からなる群から選択されるPTCLサブタイプであり得る。
成人T細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病(ATL)は、米国よりも日本及びメキシコでより一般的に見られ、ヒトT細胞白血病ウイルス-1(HTLV-1)に関連する。腸症関連リンパ腫は、セリアック病(小麦、ライ麦及び大麦に見られるグルテンタンパク質に対する過敏症によって引き起こされる慢性腸障害)に関連する。症状には、通常、胃痛、体重減少、胃腸出血又は腸穿孔が含まれる。腸症関連T細胞リンパ腫の患者の治療には、アントラサイクリン系化学療法レジメン、栄養補助食品、及び適切な場合はグルテンフリー食が含まれる。肝脾リンパ腫は、肝臓又は脾臓で始まり、通常20歳代及び30歳代の若年成人が罹患する極めて稀で侵襲性の疾患である。肝脾T細胞リンパ腫の患者の治療には、アントラサイクリンをベースとした化学療法及び場合によっては幹細胞移植が含まれる。
皮下脂漏様リンパ腫(SPTCL)は、T細胞リンパ腫の中で最も少なく、最も明確に定義されていない。このリンパ腫は主に皮下脂肪組織に発生し、そこで結節を形成させる。症状としては、発熱、悪寒、体重減少及び口腔粘膜潰瘍が挙げられる。SPTCLは、急速な侵襲性であるか、又は緩徐進行性(ゆっくりと成長する)のいずれかであり得る。治療には、アントラサイクリンに基づく併用化学療法又は局所放射線が含まれる。前駆T細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病は、白血病又はリンパ腫又はその両方と診断され得る。この癌は小児及び成人の両方に見られ、最も一般的には青年及び成人男性で診断される。前駆T細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病を有する新たに診断された患者の治療は、積極的な化学療法及び放射線療法である。ネララビン(Arranon(登録商標))は、成人及び小児における再発性又は難治性前駆体T細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病の治療に承認されている。
血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)は、その臨床的、病理学的、細胞的及び生物学的特性によって証明されるように、強い炎症反応及び免疫反応を特徴とする新生物の一例である。腫瘍細胞は、表現型が濾胞性ヘルパーT(Tfh)細胞に似ているため、反応性濾胞性過形成に見られる非腫瘍性Tfh細胞とある程度類似して機能すると考えられる。しかしながら、濾胞は過形成性ではなく、むしろ大部分のAITL症例において枯渇又は破壊される。AITLは最近、PTCLの36.1%を占めると報告された。
皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)は、原発性皮膚リンパ腫の約70~75%を構成する。CTCLは、以下からなる群から選択されるCTCLサブタイプであり得る:菌状息肉症(MF);セザリー症候群(SS);及びCD4+小中多形性T細胞リンパ増殖性障害。
菌状息肉症(MF)は、最も一般的なサブタイプである。セザリー症候群(SS)は、より攻撃的なタイプのCTCLである。SS患者は、紅皮症(すなわち、>80%の体表面積に影響を及ぼす発疹[BSA])、リンパ節症、及び末梢血中の多数の循環新生物CD4+T細胞を有する。
他の実施形態では、T細胞、MAIT細胞又は医薬組成物は、ウイルス(例えば、HIV、HBV、HTLV、EBV、HPV)、細菌(例えばTB)又は真菌感染症を治療、予防又は改善するのに使用され得る。
他の実施形態では、T細胞、MAIT細胞又は医薬組成物は、自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は重症筋無力症を治療、予防又は改善するのに使用され得る。
好ましくは、方法は、自殺タンパク質をコードする配列を誘発することを含む。したがって、核酸構築物がEGFR又はtEGFRをコードする配列を含む実施形態では、方法は、好ましくは、被験体に抗EGFR抗体を投与することを含む。例えば、抗EGFR抗体は、モノクローナル抗体Cetuximabであり得る。抗体の投与は、被験体におけるCAR-T細胞のモニタリング又は枯渇を可能にする。
核酸構築物がiC9をコードする配列を含む実施形態では、方法は、被験体にカスパーゼ誘導性薬物(CID)を投与することを含み得る。例えば、CIDは、Rimiducidを含み得る。CIDの投与は、カスパーゼの条件付き二量体化を可能にし、これは、融合タンパク質を発現するCAR-T細胞のアポトーシス、及び結果としての被験体におけるCAR-T細胞の枯渇を引き起こす。
最も好ましい実施形態では、構築物は、iC9及びtEGFRの両方を含む2つの自殺タンパク質をコードするので、抗EGFR抗体及びCIDの使用は、治療を受けている被験体におけるCAR-T又はCAR-MAIT細胞の寿命の精巧な制御を可能にする。
本発明によるCAR-T細胞又はCAR-MAIT細胞(本明細書中で集合的に「作用物質」と称される)は、単剤療法(例えば、T細胞又はCAR-MAIT細胞単独の使用)において、治療のために、好ましくは免疫療法において、(i)癌又はT細胞悪性腫瘍を治療、改善又は予防する、又は(ii)微生物感染症を治療、予防若しくは改善する、又は(iii)自己免疫疾患を治療、予防若しくは改善するために使用され得ることが理解されるであろう。あるいは、本発明によるCAR-T細胞又はCAR-MAIT細胞は、公知の免疫療法の補助として、又は公知の免疫療法と組み合わせて、又は微生物感染症並びに癌若しくは自己免疫疾患を治療するために使用され得る。
本発明による薬剤は、特に組成物が使用される様式に応じて、多数の異なる形態を有する組成物中で組み合わせることができる。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、又は治療を必要とする人若しくは動物に投与され得る任意の他の適切な形態であり得る。本発明による医薬のビヒクルは、それが与えられる被験体によって十分に許容されるものでなければならないことが理解されるであろう。
本発明の薬剤を含む医薬品は、いくつかの方法で使用することができる。例えば、経口投与が必要とされ得、その場合、薬剤は、例えば、錠剤、カプセル又は液体の形態で経口摂取され得る組成物内に含有され得る。本発明の薬剤及び医薬品を含む組成物は、吸入(例えば鼻腔内)によって投与することができる。組成物はまた、局所使用のために製剤化され得る。例えば、クリーム又は軟膏を皮膚に塗布することができる。
本発明による薬剤及び医薬品はまた、徐放又は遅延放出デバイス内に組み込まれてもよい。そのようなデバイスは、例えば、皮膚の上又は下に挿入されてもよく、医薬品は、数週間又は数ヶ月にわたって放出されてもよい。デバイスは、少なくとも治療部位に隣接して配置されてもよい。このようなデバイスは、本発明に従って使用される薬剤による長期治療が必要であり、通常は頻繁な投与(例えば、少なくとも毎日の注射)を必要とする場合に特に有利であり得る。
好ましい実施形態では、本発明による薬剤及び医薬は、血流への注射又は治療を必要とする部位への直接注射によって被験体に投与され得る。注射は、静脈内(ボーラス又は注入)又は皮下(ボーラス又は注入)又は皮内(ボーラス又は注入)であり得る。
必要とされる遺伝子構築物又はベクター(すなわち、薬剤)の量は、その生物学的活性及び生物学的利用能によって決定され、これは、投与様式、薬剤の物理化学的特性、及び単剤療法として使用されているか、又は併用療法で使用されているかに依存することが理解されよう。投与の頻度はまた、治療される被験体内での薬剤の半減期によって影響されるであろう。投与される最適な投与量は、当業者によって決定され得、使用中の特定の薬剤、医薬組成物の強度、投与様式、及び治療される疾患、例えば癌、T細胞悪性腫瘍、微生物感染、又は自己免疫疾患の進行によって変化する。被験体の年齢、体重、性別、食事及び投与時間を含む、治療される特定の被験体に依存する更なる因子は、投薬量を調節する必要性をもたらすであろう。
一般に、0.001μg/kg体重~10mg/kg体重の本発明による作用物質の1日用量を、いずれかの作用物質に依存して、治療のために、特に癌、T細胞悪性腫瘍、微生物感染又は自己免疫疾患を治療、改善又は予防するために使用することができる。より好ましくは、薬剤の1日用量は、0.01μg/kg体重~1mg/kg体重、より好ましくは0.1μg/kg体重~100μg/kg体重、最も好ましくは約0.1μg/kg体重~10μg/kg体重である。
あるいは、被験体に投与される用量は、0.5×107~5×1012形質導入単位(TU)/体重Kgであり得る。より好ましくは、被験体に投与される用量は、0.5×108~5×1011TU/kg体重であり得る。最も好ましくは、被験体に投与される用量は、0.5×109~5×1010TU/kg体重であり得る。
薬剤は、癌、T細胞悪性腫瘍、微生物感染又は自己免疫疾患の発症前、発症中又は発症後に投与され得る。毎日の用量は、単回投与(例えば、1日1回の注射)として与えられ得る。あるいは、薬剤は、1日に2回以上の投与を必要とし得る。一例として、薬剤は、0.07μg~700mg(すなわち、体重を70kgと仮定する)の1日2回(又は治療される疾患、例えば癌の重症度に応じて更に)用量として投与され得る。治療を受けている患者は、起床時に第1の用量を服用し、次いで夕方に第2の用量を服用してもよく(2回の用量計画の場合)、又はその後3時間又は4時間間隔で服用してもよい。あるいは、薬剤は、週に1回、更には月に1回の投与を必要とし得る。あるいは、徐放装置を使用して、反復用量を投与する必要なく、本発明による薬剤の最適用量を患者に提供することができる。公知の手順、例えば、製薬業界によって従来から使用されている手順(例えば、インビボ実験、臨床試験等)を使用して、本発明による薬剤の特定の製剤及び正確な治療レジメン(例えば、薬剤の1日用量及び投与頻度)を形成することができる。
本発明の医薬組成物は、好ましくは免疫療法治療組成物、又は自己免疫疾患治療組成物、又は抗感染組成物、又は抗癌組成物、すなわち被験体における癌の治療的改善、予防又は治療に使用される医薬製剤である。
本発明はまた、第11の態様において、第7の態様による医薬組成物を製造するためのプロセスであって、第1又は第4の態様による治療有効量のMAIT細胞と薬学的に許容され得るビヒクルとを組み合わせることを含む、プロセスを提供する。
「被験体」は、脊椎動物、哺乳動物、又は家畜であり得る。したがって、本発明による医薬品は、任意の哺乳動物、例えば家畜(例えば、ウマ)、ペットを治療するために使用されてもよく、又は他の獣医学的用途で使用されてもよい。最も好ましくは、被験体はヒトである。
遺伝子構築物又はベクターの「治療有効量」は、被験体に投与された場合、治療される疾患、例えば癌を治療するために必要な、又は所望の効果をもたらす薬剤の量である任意の量である。
例えば、使用される遺伝子構築物又はベクターの治療有効量は、約0.001ng~約1mg、好ましくは約0.01ng~約100ngであり得る。遺伝子構築物又はベクターの量は、約0.1ng~約10ng、最も好ましくは約0.5ng~約5ngの量であることが好ましい。
本明細書で言及される「薬学的に許容され得るビヒクル」は、医薬組成物の製剤化に有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物又は既知の化合物の組合せである。
一実施形態では、薬学的に許容され得るビヒクルは固体であり得、組成物は粉末又は錠剤の形態であり得る。固体の薬学的に許容され得るビヒクルは、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味料、保存剤、染料、コーティング又は錠剤崩壊剤としても作用し得る1つ又は複数の物質を含み得る。ビヒクルはまた、封入材料であってもよい。粉末において、ビヒクルは、本発明による微粉化された活性剤と混合された微粉化された固体である。錠剤では、活性剤を、必要な圧縮特性を有するビヒクルと適切な割合で混合し、所望の形状及びサイズに圧縮することができる。散剤及び錠剤は、好ましくは最大99%の活性剤を含有する。適切な固体ビヒクルとしては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス及びイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態では、医薬ビヒクルはゲルであってもよく、組成物はクリーム等の形態であってもよい。
しかしながら、医薬ビヒクルは液体であってもよく、医薬組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル及び加圧組成物の調製に使用される。本発明による活性剤は、水、有機溶媒、両方又は薬学的に許容され得る油又は脂肪の混合物等の薬学的に許容され得る液体ビヒクルに溶解又は懸濁され得る。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味料、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤又は浸透圧調整剤等の他の適切な医薬添加剤を含むことができる。経口及び非経口投与のための液体ビヒクルの適切な例としては、水(上記のような添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する)、アルコール(一価アルコール及び多価アルコール、例えばグリコールを含む)及びそれらの誘導体、並びに油(例えば、分画されたヤシ油及び落花生油)が挙げられる。非経口投与の場合、ビヒクルは油性エステル、例えばオレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルであってもよい。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与のための滅菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素又は他の薬学的に許容され得る噴射剤であり得る。
滅菌溶液又は懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内及び特に皮下注射によって利用することができる。薬剤は、滅菌水、生理食塩水、又は他の適切な滅菌注射用媒体を使用して、投与時に溶解又は懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。
本発明の薬剤及び組成物は、他の溶質又は懸濁化剤(例えば、溶液を等張性にするのに十分な生理食塩水又はグルコース)、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート80(エチレンオキシドと共重合されたソルビトール及びその無水物のオレイン酸エステル)等を含有する滅菌溶液又は懸濁液の形態で経口投与され得る。本発明に従って使用される薬剤は、液体又は固体の組成物形態のいずれかで経口投与することもできる。経口投与に適した組成物には、固体形態、例えば丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤及び散剤、並びに液体形態、例えば液剤、シロップ剤、エリキシル剤及び懸濁剤が含まれる。非経口投与に有用な形態には、滅菌溶液、エマルジョン、及び懸濁液が含まれる。
本発明は、本明細書で言及される任意の配列(そのバリアント又は断片を含む)のアミノ酸又は核酸配列を実質的に含む任意の核酸又はペプチド又はそのバリアント、誘導体又は類似体に及ぶことが理解されよう。「実質的にアミノ酸/ヌクレオチド/ペプチド配列」、「バリアント」及び「断片」という用語は、本明細書で言及される配列のいずれか1つのアミノ酸/ヌクレオチド/ペプチド配列と少なくとも40%の配列同一性、例えば配列番号1~36として識別される配列と40%の配列同一性を有する配列等であり得る。
言及される配列のいずれかと65%超、より好ましくは70%超、更により好ましくは75%超、更により好ましくは80%超の配列同一性を有するアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列も想定される。好ましくは、アミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列は、本明細書で言及される配列のいずれかと少なくとも85%の同一性、より好ましくは少なくとも90%の同一性、更により好ましくは少なくとも92%の同一性、更により好ましくは少なくとも95%の同一性、更により好ましくは少なくとも97%の同一性、更により好ましくは少なくとも98%の同一性、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
当業者は、2つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージを計算する方法を理解するであろう。2つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列間の同一性パーセントを計算するために、2つの配列のアライメントを最初に調製し、続いて配列同一性値を計算しなければならない。2つの配列の同一性率は、以下に応じて異なる値をとることができる:-(i)配列を整列させるために使用される方法、例えばClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman(異なるプログラムで実施される)、又は3D比較からの構造的整列;(ii)位置合わせ方法によって使用されるパラメータ、例えば、局所対全体位置合わせ、使用されるペアスコアマトリックス(例えば、BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)、及びギャップペナルティ、例えば、関数形及び定数。
アライメントを行った後、2つの配列間の同一性パーセントを計算する多くの異なる方法がある。例えば、識別情報の数を以下で割ることができる。(i)最短配列の長さ;(ii)アライメントの長さ;(iii)配列の平均長さ;(iv)非ギャップ位置の数;又は(v)オーバーハングを除く等価な位置の数。更に、同一性パーセントもまた、長さに強く依存することが理解されよう。したがって、配列のペアが短いほど、偶然に生じると予想される配列同一性が高くなる。
したがって、タンパク質又はDNA配列の正確なアライメントは複雑なプロセスであることが理解されよう。一般的な多重アライメントプログラムClustalW(Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Research,22,4673-4680;Thompson et al.,1997,Nucleic Acids Research,24,4876-4882)は、本発明に従ってタンパク質又はDNAの多重アライメントを生成するための好ましい方法である。ClustalWの適切なパラメータは以下の通りであり得る:DNAアライメントの場合:ギャップオープンペナルティ=15.0、ギャップ伸長ペナルティ=6.66、及び行列=Identity。タンパク質アライメントの場合:ギャップオープンペナルティ=10.0、ギャップ伸長ペナルティ=0.2、及び行列=Gonnet。DNA及びタンパク質のアライメントの場合:ENDGAP=-1、及びGAPDIST=4。当業者は、最適な配列アライメントのためにこれら及び他のパラメータを変化させることが必要であり得ることを認識するであろう。
好ましくは、次いで、2つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージの計算は、(N/T)*100のようなアライメントから計算することができ、式中、Nは配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Tはギャップを含み、オーバーハングを含むか又は除外して比較される位置の総数である。好ましくは、オーバーハングが計算に含まれる。したがって、2つの配列間の同一性パーセンテージを計算するための最も好ましい方法は、(i)適切なパラメータセットを使用してClustalWプログラムを使用して、例えば上記のように配列アライメントを調製することと、(ii)N及びTの値を以下の式:-配列同一性=(N/T)*100に挿入することと、を含む。
類似の配列を同定するための代替方法は、当業者に公知である。例えば、実質的に類似のヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下でDNA配列又はそれらの相補体にハイブリダイズする配列によってコードされる。ストリンジェントな条件とは、本発明者らは、3×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中、約45℃でフィルターに結合したDNA又はRNAへのヌクレオチドハイブリッド形成、続いて0.2×SSC/0.1%SDS中、約20~65℃で少なくとも1回の洗浄を意味する。あるいは、実質的に類似のポリペプチドは、例えば、アミノ酸配列である配列番号1~配列番号36に示される配列と少なくとも1個、5、10、20、50又は100個未満のアミノ酸が異なっていてもよい。
遺伝暗号の縮重のために、本明細書に記載の任意の核酸配列は、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく変化又は変更されて、その機能的バリアントを提供することができることは明らかである。適切なヌクレオチドバリアントは、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変更された配列を有し、したがってサイレント(同義)変化を生じるものである。他の適切なバリアントは、相同なヌクレオチド配列を有するが、保存的変化をもたらすために、アミノ酸をコードする異なるコドンを、それが置換するアミノ酸と類似の生物物理学的特性の側鎖で置換することによって変化する配列の全部又は一部を含むバリアントである。例えば、小さな非極性の疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン及びメチオニンが挙げられる。大きな非極性疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。正に荷電した(塩基性)アミノ酸には、リジン、アルギニン及びヒスチジンが含まれる。負に帯電した(酸性)アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。したがって、どのアミノ酸を、類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸と置き換えることができるかが理解され、当業者は、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知るであろう。
本明細書に記載の全ての特徴(添付の特許請求の範囲、要約、及び図面を含む)、及び/又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスの全ての工程は、そのような特徴及び/又は工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組合せを除いて、任意の組合せで上記の態様のいずれかと組み合わせることができる。
本発明をよりよく理解するために、及び本発明の実施形態をどのように実施することができるかを示すために、ここで、例として、添付の図面を参照する。
生物発光イメージングを、腫瘍注射後45日目まで週に2回行った。B.カプラン・マイヤー生存分析による、示されたCAR形質導入細胞で治療したマウスの全生存。C.腫瘍注射後40日目のマウスの生物発光イメージング(BLI)。D.40日目の個々のマウスの放射輝度。n=5又は6マウス/群。*スチューデントのt検定によりP<0.05。Ph、光子;sr、ステラジアン
PBMCにおけるMAIT細胞の濃縮を示す。PBMCを、表に示すように異なるサイトカインの存在下で、1:1のビーズ対細胞比でMR1/5-OP-RU複合体ビーズ又は10nMで5-OP-RU抗原のいずれかによって6日間刺激した。MAIT細胞増加の倍数を、6日目の生存MAIT(CD3+Va7.2+CD161+)細胞の頻度を0日目のMAIT細胞の元の頻度で割ることによって計算した。上位5つの群をオレンジ色で強調した(すなわち、条件1、3、11、12及び13)。IL-12、IL-18及びIL-23の組合せは、PBMC中のMAIT細胞の増加の最大倍数を与える。
キメラ抗原受容体(CAR)に基づくT細胞療法は、pan-B細胞特異的抗原を標的とすることによってB細胞悪性腫瘍の治療において大きな成功を収めている。しかし、T細胞リンパ腫についての同様の戦略はこれまで実現されておらず、主に、B細胞悪性腫瘍と比較して、Tリンパ腫における全体的なT細胞枯渇及び正常T細胞の機能不全/低頻度による潜在的な重篤な毒性のためである。これらの制限を克服するために、本発明者らは、2つの新規なCAR構築物を操作し、第1のCAR構築物は、pan-T細胞マーカー(CD4)に特異的である「CART4」と呼ばれ、第2のCAR構築物は、TCR-Vbアイソタイプ鎖に特異的である「CARTVb7.1」と呼ばれる。両方のCAR構築物は、切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)及び誘導性カスパーゼ-9(iC9)から選択される1つ又は2つの安全スイッチを組み込んでいる。しかしながら、図1に示すように、両方の安全スイッチが示されている。本発明者らは、同種異系反応性が低い粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞が、CAR構築物で形質導入された後、従来のT細胞と同様の抗腫瘍殺傷活性を示すかどうかを調査した。
更に、MAIT細胞は、MHCクラスI様分子MR1を認識するCD3+TCRVa7.2+CD161+細胞として定義される自然T細胞のサブセットであることが知られている。以前の研究は、MAIT細胞をインビトロで拡大させることができるが、同種異系フィーダー細胞の存在を必要とすることを示しているが、この方法は大規模生産及び品質管理にとって困難である。本研究では、本発明者らは、両方とも様々なサイトカイン(IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18及びIL-23)の組合せの存在下で、インビトロ培養で最大6日間、抗原(5-OP-RU)ロードMR1四量体ビーズ又は5-OP-RU単独でPBMCを最初に刺激することによって、インビトロでMAIT細胞を増殖させるための効果的な方法を開発した。次いで、得られたMAIT細胞を、先の実施例に記載されるように、MACS又はFACS選別によって単離し、CARに基づく治療のために抗CD3/CD28ビーズによって更に拡大させた。
材料及び方法
CARプラスミドの構築
Hu5A8及びLeu16のscFv及びヒトIgκリーディング配列をコードするDNA断片をGenewizによって合成した。NcoI及びNotIを使用して、これらの断片並びにMSCV CAR発現レトロウイルスベクターを切断した。MSCV CAR発現ベクターを、IRES-GFP領域をヒトCD8膜貫通ドメイン及び第3世代CAR細胞内シグナル伝達ドメイン(CD28及び4-1BBの共刺激ドメイン、CD3ζシグナル伝達ドメイン)で置き換えることによって、MSCV-IRES-GFPベクター(Addgene)から改変した。tEGFRの配列は、ヒトEGFRタンパク質の細胞外部分及び細胞内ドメインのドメインI及びIIを欠失させた米国特許第8802347号から得た。tEGFRを、自己切断性T2A配列及びヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)受容体のリーダーペプチドと共にGenewizによって合成した。iC9のDNA配列は、Prof.Lishan Su(University of North Carolina,Chapel Hill)の厚意により提供された。iC9のDNA断片は、短いGly-Gly-Gly-Ser(GGGS)フレキシブルリンカーを介して、一つの12kDaヒトFK506結合タンパク質(FKBP12)に連結されたカスパーゼ分子の大サブユニット及び小サブユニットを含む、切断型カスパーゼ9からなる。
CARプラスミドの構築
Hu5A8及びLeu16のscFv及びヒトIgκリーディング配列をコードするDNA断片をGenewizによって合成した。NcoI及びNotIを使用して、これらの断片並びにMSCV CAR発現レトロウイルスベクターを切断した。MSCV CAR発現ベクターを、IRES-GFP領域をヒトCD8膜貫通ドメイン及び第3世代CAR細胞内シグナル伝達ドメイン(CD28及び4-1BBの共刺激ドメイン、CD3ζシグナル伝達ドメイン)で置き換えることによって、MSCV-IRES-GFPベクター(Addgene)から改変した。tEGFRの配列は、ヒトEGFRタンパク質の細胞外部分及び細胞内ドメインのドメインI及びIIを欠失させた米国特許第8802347号から得た。tEGFRを、自己切断性T2A配列及びヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)受容体のリーダーペプチドと共にGenewizによって合成した。iC9のDNA配列は、Prof.Lishan Su(University of North Carolina,Chapel Hill)の厚意により提供された。iC9のDNA断片は、短いGly-Gly-Gly-Ser(GGGS)フレキシブルリンカーを介して、一つの12kDaヒトFK506結合タンパク質(FKBP12)に連結されたカスパーゼ分子の大サブユニット及び小サブユニットを含む、切断型カスパーゼ9からなる。
レトロウイルスベクターの作製
Plat-GP細胞(Cellbiolabs)を、7ulのX-tremeGENE HPトランスフェクション試薬(Roche)を介してMSCV-レトロウイルスプラスミド及びpCMV-VSVGベクター(Addgene)でトランスフェクトして、VSVエンベロープを有するウイルスを作製した。高力価のCARコードレトロウイルス上清を産生するために、その後のPG-13(ATCC)を含む安定なウイルス産生細胞株を行った。PG-13細胞を、8ug/mlポリブレン(Sigma)を含有するPlat-GPからのウイルス上清によって形質導入した。プレートを粘着フィルムで包み、1000g、32℃で2時間遠心分離した。高力価ウイルス粒子を産生するために、コンフルエントな細胞をトリプシン処理によって2つに1つ通過させる。24時間後に上清を回収する。培地を等分し、300gで5分間遠心分離した後、-80℃で保存する。
Plat-GP細胞(Cellbiolabs)を、7ulのX-tremeGENE HPトランスフェクション試薬(Roche)を介してMSCV-レトロウイルスプラスミド及びpCMV-VSVGベクター(Addgene)でトランスフェクトして、VSVエンベロープを有するウイルスを作製した。高力価のCARコードレトロウイルス上清を産生するために、その後のPG-13(ATCC)を含む安定なウイルス産生細胞株を行った。PG-13細胞を、8ug/mlポリブレン(Sigma)を含有するPlat-GPからのウイルス上清によって形質導入した。プレートを粘着フィルムで包み、1000g、32℃で2時間遠心分離した。高力価ウイルス粒子を産生するために、コンフルエントな細胞をトリプシン処理によって2つに1つ通過させる。24時間後に上清を回収する。培地を等分し、300gで5分間遠心分離した後、-80℃で保存する。
初代T細胞及び腫瘍細胞
健康なドナー由来の末梢血単核細胞(PBMC)を、CAR-T細胞を操作するためのFicoll-Paque PLUS密度勾配遠心分離(GE Healthcare)によって単離した。ATL又はCTCL患者から作製したTリンパ腫細胞株をD10培地(10%ウシ胎児血清、100IU/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、及び2mM L-グルタミンを含むDMEM)中で培養し、T白血病細胞株(Jurket又はCEM)をR10培地(10%ウシ胎児血清、100IU/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン及び2mM L-グルタミンを含有するRPMI1640)中で維持した。
健康なドナー由来の末梢血単核細胞(PBMC)を、CAR-T細胞を操作するためのFicoll-Paque PLUS密度勾配遠心分離(GE Healthcare)によって単離した。ATL又はCTCL患者から作製したTリンパ腫細胞株をD10培地(10%ウシ胎児血清、100IU/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、及び2mM L-グルタミンを含むDMEM)中で培養し、T白血病細胞株(Jurket又はCEM)をR10培地(10%ウシ胎児血清、100IU/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン及び2mM L-グルタミンを含有するRPMI1640)中で維持した。
MAIT細胞の単離及び増殖
MAIT細胞を、抗ヒトTCR Vα7.2抗体(Biolegend、カタログ番号351724)MicroBeads(Miltenyi、カタログ番号130-090-485)、続いてProf Jim McCluskey(University of Melbourne,Australia)の厚意により提供されたBV421 MR1-5-OP-RU四量体を使用する2段階法によって健康なPBMCから単離した。簡潔には、製造手順(Miltenyi)に従ってビオチン化抗ヒトTCR Vα7.2抗体及び抗ビオチンMicroBeadsキットを使用して、TCR Vα7.2+T細胞をPBMCから単離した。次いで、BV421 MR1-5-OP-RU四量体を染色し、FACSMelody Cell Sorter(BD)を使用してFACS選別することによって、MAIT細胞をTCR Vα7.2+T細胞から単離した。
MAIT細胞を、抗ヒトTCR Vα7.2抗体(Biolegend、カタログ番号351724)MicroBeads(Miltenyi、カタログ番号130-090-485)、続いてProf Jim McCluskey(University of Melbourne,Australia)の厚意により提供されたBV421 MR1-5-OP-RU四量体を使用する2段階法によって健康なPBMCから単離した。簡潔には、製造手順(Miltenyi)に従ってビオチン化抗ヒトTCR Vα7.2抗体及び抗ビオチンMicroBeadsキットを使用して、TCR Vα7.2+T細胞をPBMCから単離した。次いで、BV421 MR1-5-OP-RU四量体を染色し、FACSMelody Cell Sorter(BD)を使用してFACS選別することによって、MAIT細胞をTCR Vα7.2+T細胞から単離した。
MAIT細胞をPBMCから2段階法によって分離した。PBMC細胞を計数し、15mLチューブ中のPBS/EDTA緩衝液中で1×108細胞/mLに希釈する。108細胞当たり5μLのビオチン抗ヒトTCR Vα7.2抗体(Biolegend、カタログ番号351724)を添加し、4℃で20分間インキュベートする。10倍容量のPBS/EDTA緩衝液を添加することによって細胞を洗浄し、300×gで10分間遠心分離する。上清を完全に吸引する。総細胞108個当たり、PBS/EDTA緩衝液800μL及びAnti-Biotin MicroBeads(Miltenyi、カタログ番号130-090-485)200μLを添加する。よく混合し、4℃で15分間インキュベートする。10倍容量のPBS/EDTA緩衝液を添加することによって細胞を洗浄し、300×gで10分間遠心分離する。上清を完全に吸引する。最大108個の細胞を1mLのPBS/EDTA緩衝液に再懸濁する。MSカラム(Miltenyi)を適切なMACSセパレータの磁場中に置く。PBS/EDTA緩衝液500μLですすぐことによってカラムを調製する。細胞懸濁液をカラムに適用する。カラムを3×500μLのPBS/EDTA緩衝液で洗浄する。保持した細胞を、1mLのPBS/EDTA緩衝液を添加することによって磁場の外側に溶出させる。TCR Vα7.2+細胞を回収し、APC抗ヒトCD3(Biolegend)及びBV421 MR1-5-OP-RU四量体(1:500)で4℃で30分間染色する。10倍容量のPBS/EDTA緩衝液を添加することによって細胞を洗浄し、300×gで10分間遠心分離する。上清を完全に吸引する。総細胞108個当たり1mLのPBS/EDTA緩衝液を添加する。FACSMelody Cell Sorter(BD)により、CD3+MR1-5-OP-RU+細胞集団をフロー選別する。
MAIT細胞の活性化及び拡大
選別したMAIT細胞を計数し、R10培地(90%RPMI+10%FBS+1%ペニシリン/ストレプトマイシン+2mM L-グルタミン)に106/mLまで再懸濁する。Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Life Technologies)で細胞を活性化して、37℃のインキュベーターにおいて24ウェルプレート中100IU/mL IL-2で1:1のビーズ対細胞比を得る。形質導入の2日後、細胞を回収し、細胞を6ウェルプレートに移す。R10を0.5~1×106/mLにリフレッシュする。2~3日ごとに細胞をR10培地でリフレッシュする。
選別したMAIT細胞を計数し、R10培地(90%RPMI+10%FBS+1%ペニシリン/ストレプトマイシン+2mM L-グルタミン)に106/mLまで再懸濁する。Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Life Technologies)で細胞を活性化して、37℃のインキュベーターにおいて24ウェルプレート中100IU/mL IL-2で1:1のビーズ対細胞比を得る。形質導入の2日後、細胞を回収し、細胞を6ウェルプレートに移す。R10を0.5~1×106/mLにリフレッシュする。2~3日ごとに細胞をR10培地でリフレッシュする。
CAR-T細胞又はCAR-MAIT細胞の作製
精製PBMC又はMAIT細胞を、100IU/mLのIL-2を含有するR10培地中のDynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Life Technologies)で48時間刺激した。次いで、活性化細胞を、CAR構築物をコードするレトロウイルスでトランスフェクトし、R10中で更に48時間培養した。CAR-T細胞又はCAR-MAIT細胞を、回収前に更に7日間、組換えIL7及びIL15(Miltenyi)の存在下でG-Rex6ウェルプレート(Wilsonwolf)において維持した。
精製PBMC又はMAIT細胞を、100IU/mLのIL-2を含有するR10培地中のDynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Life Technologies)で48時間刺激した。次いで、活性化細胞を、CAR構築物をコードするレトロウイルスでトランスフェクトし、R10中で更に48時間培養した。CAR-T細胞又はCAR-MAIT細胞を、回収前に更に7日間、組換えIL7及びIL15(Miltenyi)の存在下でG-Rex6ウェルプレート(Wilsonwolf)において維持した。
CAR-T細胞又はCAR-MAIT細胞の作製
レトロウイルス形質導入を、T細胞活性化の48時間後に行った。必要に応じて、24時間後により高い形質導入効率を達成するために形質導入工程を繰り返す。10×106個の細胞を移入し、110mLのR10培地を含むG-Rex6ウェルプレート(Wilsonwolf)中で更に培養した。サイトカインIL7/15を2日又は3日ごとに補充した。細胞をG-Rex中で1週間培養した後、回収した。
レトロウイルス形質導入を、T細胞活性化の48時間後に行った。必要に応じて、24時間後により高い形質導入効率を達成するために形質導入工程を繰り返す。10×106個の細胞を移入し、110mLのR10培地を含むG-Rex6ウェルプレート(Wilsonwolf)中で更に培養した。サイトカインIL7/15を2日又は3日ごとに補充した。細胞をG-Rex中で1週間培養した後、回収した。
共培養細胞傷害性アッセイ
この非放射性殺傷アッセイを以前に報告されたように行った(Rowan et al.,2014)。簡潔には、標的細胞を37℃で15分間、1uMのCFSE(Biolegend)で染色した。PBSで3回洗浄した後、100,000個の標的細胞を、CAR-T細胞又はCAR-MAIT細胞と1:1、1:3、1:5の比率で混合した。200ul共培養物を37℃のインキュベーター中で4時間インキュベートした。1ulのDAPI及び5ulのCountbrightビーズ(BD Biosciences)を試料に添加した。試料を一定速度でフローサイトメトリによって取得した。生存している標的細胞の数を、チューブ中の細胞=(収集された細胞/収集されたビーズ)×チューブに加えられた総ビーズとして計算した。
この非放射性殺傷アッセイを以前に報告されたように行った(Rowan et al.,2014)。簡潔には、標的細胞を37℃で15分間、1uMのCFSE(Biolegend)で染色した。PBSで3回洗浄した後、100,000個の標的細胞を、CAR-T細胞又はCAR-MAIT細胞と1:1、1:3、1:5の比率で混合した。200ul共培養物を37℃のインキュベーター中で4時間インキュベートした。1ulのDAPI及び5ulのCountbrightビーズ(BD Biosciences)を試料に添加した。試料を一定速度でフローサイトメトリによって取得した。生存している標的細胞の数を、チューブ中の細胞=(収集された細胞/収集されたビーズ)×チューブに加えられた総ビーズとして計算した。
細胞内サイトカイン染色
CART4又はCART20T細胞を、96ウェル底プレートにおいて特定の標的細胞と共培養した。全ての細胞を、200uL/ウェルのR10培地に2×105細胞/ウェルで播種した。陰性対照として単独で培養したT細胞、及び10ug/ml PMAと10ug/mlイオノマイシン(Biolegend)の複合刺激で培養したT細胞を陽性対照として含めた。10ug/mLのブレフェルジンA(Biolegend)を、1時間のインキュベーション後に全てのウェルに加えた。共培養系を更に5時間インキュベートした後、回収した。細胞を、暗所で30分間、抗体を使用して表面マーカーについて染色した。PBSで洗浄後、4%パラホルムアルデヒド溶液(Biolegend)を用いて室温で15分間細胞を固定した。固定緩衝液で更に洗浄した後、細胞内染色抗体を含む混合物によって細胞を再懸濁した。細胞を4℃で30分間インキュベートした後、固定緩衝液で洗浄する。それらを、蛍光マイナス1(FMO)対照を用いたフローサイトメトリによって分析して、IFN-γ及びTNF-αの発現レベルを決定した。
CART4又はCART20T細胞を、96ウェル底プレートにおいて特定の標的細胞と共培養した。全ての細胞を、200uL/ウェルのR10培地に2×105細胞/ウェルで播種した。陰性対照として単独で培養したT細胞、及び10ug/ml PMAと10ug/mlイオノマイシン(Biolegend)の複合刺激で培養したT細胞を陽性対照として含めた。10ug/mLのブレフェルジンA(Biolegend)を、1時間のインキュベーション後に全てのウェルに加えた。共培養系を更に5時間インキュベートした後、回収した。細胞を、暗所で30分間、抗体を使用して表面マーカーについて染色した。PBSで洗浄後、4%パラホルムアルデヒド溶液(Biolegend)を用いて室温で15分間細胞を固定した。固定緩衝液で更に洗浄した後、細胞内染色抗体を含む混合物によって細胞を再懸濁した。細胞を4℃で30分間インキュベートした後、固定緩衝液で洗浄する。それらを、蛍光マイナス1(FMO)対照を用いたフローサイトメトリによって分析して、IFN-γ及びTNF-αの発現レベルを決定した。
インビトロ自殺アッセイ
iC9細胞を有する、又は有さないCART4を、CART4又はiC9構築物を有さないCART4によるレトロウイルス形質導入を用いて作製した。CAR-T細胞を形質導入後5~7日間拡大させ続けた。カスパーゼ誘導性薬物(CID)、B/Bホモ二量体化剤AP20187(Clontech Laboratories)を様々な濃度でT細胞培養物に添加した。CIDによって誘導されたアポトーシスの誘導を、アネキシン-v/7-AAD(BD Biosciences)染色及びフローサイトメトリ分析を用いて24時間後に評価した。生存細胞を、ビーズ(BD Biosciences)をカウントすることによって定量した。生存指数を以下のように計算した:未処理対照試料中の生tEGFR+細胞の数/生tEGFR+細胞の数。
iC9細胞を有する、又は有さないCART4を、CART4又はiC9構築物を有さないCART4によるレトロウイルス形質導入を用いて作製した。CAR-T細胞を形質導入後5~7日間拡大させ続けた。カスパーゼ誘導性薬物(CID)、B/Bホモ二量体化剤AP20187(Clontech Laboratories)を様々な濃度でT細胞培養物に添加した。CIDによって誘導されたアポトーシスの誘導を、アネキシン-v/7-AAD(BD Biosciences)染色及びフローサイトメトリ分析を用いて24時間後に評価した。生存細胞を、ビーズ(BD Biosciences)をカウントすることによって定量した。生存指数を以下のように計算した:未処理対照試料中の生tEGFR+細胞の数/生tEGFR+細胞の数。
インビボマウス異種移植実験
6~8週齢のNRGマウス(Jackson Laboratory)を、T白血病細胞株を用いたインビボ実験に使用した。Gaussiaルシフェラーゼ及びEGFPを共発現する0.5×106個のCEM-ss細胞を、後軌道を介してマウスに注射した。その後、T細胞注射の前にマウスをランダム化した。健康なドナー由来のPBMCを活性化し、形質導入して、CART4 T細胞又は非形質導入T細胞を作製した。輸血日に、製造業者の指示に従って、未接触マイクロビーズヒトCD8 T細胞キット(Miltenyi)を使用することによって、CART4 CD8+T細胞及び非形質導入CD8+T細胞をCART4 T細胞又は非形質導入T細胞から負に単離した。4×106個の単離された細胞をPBSによって2回洗浄し、100μlに再懸濁し、眼窩後注射によって異種移植されたマウスに注入した。30~50μlの末梢血を、週に1回、尾静脈を介して採血した。500gで5分間遠心分離した後、血漿を分離して、製造業者の機器(Thermo Fisher Scientific)に従ってルシフェラーゼ活性を検出した。赤血球溶解後、細胞を、ヒトCD45、マウスCD45、ヒトCD3、ヒトCD8、ヒトEGFR及び生/死色素を含む表面マーカー染色用の100ul抗体マスターミックスで再懸濁した。細胞サブセットの組成を、フローサイトメトリ(BD AriaIII)を用いて分析した。記載された全ての研究を通してマウスを密接に監視した。マウスは、初期体重の20%超の減少、顕著な嗜眠、しゃがみ姿勢、重度の下痢又は重度の皮膚炎の症状の1つを示したときに安楽死させた。
6~8週齢のNRGマウス(Jackson Laboratory)を、T白血病細胞株を用いたインビボ実験に使用した。Gaussiaルシフェラーゼ及びEGFPを共発現する0.5×106個のCEM-ss細胞を、後軌道を介してマウスに注射した。その後、T細胞注射の前にマウスをランダム化した。健康なドナー由来のPBMCを活性化し、形質導入して、CART4 T細胞又は非形質導入T細胞を作製した。輸血日に、製造業者の指示に従って、未接触マイクロビーズヒトCD8 T細胞キット(Miltenyi)を使用することによって、CART4 CD8+T細胞及び非形質導入CD8+T細胞をCART4 T細胞又は非形質導入T細胞から負に単離した。4×106個の単離された細胞をPBSによって2回洗浄し、100μlに再懸濁し、眼窩後注射によって異種移植されたマウスに注入した。30~50μlの末梢血を、週に1回、尾静脈を介して採血した。500gで5分間遠心分離した後、血漿を分離して、製造業者の機器(Thermo Fisher Scientific)に従ってルシフェラーゼ活性を検出した。赤血球溶解後、細胞を、ヒトCD45、マウスCD45、ヒトCD3、ヒトCD8、ヒトEGFR及び生/死色素を含む表面マーカー染色用の100ul抗体マスターミックスで再懸濁した。細胞サブセットの組成を、フローサイトメトリ(BD AriaIII)を用いて分析した。記載された全ての研究を通してマウスを密接に監視した。マウスは、初期体重の20%超の減少、顕著な嗜眠、しゃがみ姿勢、重度の下痢又は重度の皮膚炎の症状の1つを示したときに安楽死させた。
統計解析
統計分析を、GraphPad Prismソフトウェアバージョン6.0(GraphPadソフトウェア)を使用することによって行った。両側対応のないスチューデントt試験を用いて、2群間のデータを比較した。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。エラーバーを有する全てのデータは、平均値±平均の標準誤差(SEM)として提示されている。0.05未満のP値を有意と見なした。GraphPad Prismソフトウェア(バージョン8)を使用してデータを分析した。
統計分析を、GraphPad Prismソフトウェアバージョン6.0(GraphPadソフトウェア)を使用することによって行った。両側対応のないスチューデントt試験を用いて、2群間のデータを比較した。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。エラーバーを有する全てのデータは、平均値±平均の標準誤差(SEM)として提示されている。0.05未満のP値を有意と見なした。GraphPad Prismソフトウェア(バージョン8)を使用してデータを分析した。
1.詳細な方法
1.1.MAIT細胞の検出
1.1.1.ヒト末梢血単核細胞(PBMC)の調製
1.1.1.1.ボランティアドナーからの5mLの末梢血をヘパリン処理チューブに移す。
1.1.MAIT細胞の検出
1.1.1.ヒト末梢血単核細胞(PBMC)の調製
1.1.1.1.ボランティアドナーからの5mLの末梢血をヘパリン処理チューブに移す。
1.1.1.2.全血を等体積のPBSで希釈する。
1.1.1.3.5mLのHistopaque-1077を15ml遠心管に入れる。Histopaque-1077上にチューブの壁に沿って希釈血液溶液10mlを慎重に穏やかに添加する;液体界面を破壊しない。
1.1.1.4.室温で30分間、400×gで遠心分離する。
注:ブレーキ及び加速度が遠心分離機の最低設定にあることを確認し、激しいブレーキ及び加速度が層分離に影響を及ぼす可能性がある。
1.1.1.5.遠心分離後、単核細胞を含む不透明界面から0.5cm以内までパスツールピペットで上層を慎重に吸引する。上層を破棄する。
1.1.1.6.回収したPBMCを10mlのPBSで250×gで10分間の遠心分離によって2回洗浄する。
1.1.1.7.RPMI1640培地を用いてPBMCペレットを再懸濁する。
1.1.2.BV421標識5-OP-RU/MR1テトラマーの調製
1.1.2.1.0.5mg/mlのストレプトアビジン-BV421 6.8μlをPBS10.2μlに希釈し、よく混合する。
1.1.2.1.0.5mg/mlのストレプトアビジン-BV421 6.8μlをPBS10.2μlに希釈し、よく混合する。
1.1.2.2.1/10のストレプトアビジン-BV421溶液(1.7μl)を18μlのMR1-5-OP-RU溶液(5μg)に10分ごとに添加し、ピペットで混合し、工程間に暗所で室温でインキュベートする。
1.1.2.3.BV421標識5-OP-RU/MR1溶液を4℃に保つ。
四量体は、使用のために滴定されるべきである;典型的には、1:500希釈で十分である。
1.1.3.フローサイトメトリによるヒトMAIT細胞の検出
ヒトMAIT細胞は、5-OP-RUを負荷したMR1四量体によって、又はCD161及びTCR Vα7.2鎖に対する抗体との共染色によって、フローサイトメトリで検出することができる。一般に、MAIT細胞は、CD3+T細胞のうちの末梢血において0.1~10%である。
ヒトMAIT細胞は、5-OP-RUを負荷したMR1四量体によって、又はCD161及びTCR Vα7.2鎖に対する抗体との共染色によって、フローサイトメトリで検出することができる。一般に、MAIT細胞は、CD3+T細胞のうちの末梢血において0.1~10%である。
1.1.3.1.100μlのFACS染色緩衝液当たり1×106細胞の濃度でPBMCを再懸濁する。
1.1.3.2.FACS抗体及び/又は5-OP-RU/MR1四量体を試料に添加する。
ヒトMAIT細胞の検出のために、2つの方法を使用することができる。
a)四量体染色:BV421標識ヒト5-OP-RU MR1四量体(1:500)及びAPC-H7コンジュゲート抗ヒトCD3(1:200)を使用する。
b)置換マーキング:PEコンジュゲート抗ヒトTCR Va7.2(1:200)、APC-H7コンジュゲート抗ヒトCD3(1:200)、及びFITCコンジュゲート抗ヒトCD161(1:200)。
1.1.3.3.暗所で4℃で30分間インキュベートする。
1.1.3.4.4℃で5分間、300×gで遠心分離することによって細胞をFACS染色緩衝液で洗浄し、300μlのFACS染色緩衝液で再懸濁する。
1.1.3.5.フローサイトメトリによってMAIT細胞を分析する(図11を参照のこと)。
1.2.MAIT細胞の単離
1.2.1.Vα7.2+細胞の磁気ビーズ分離。
1.2.1.Vα7.2+細胞の磁気ビーズ分離。
1.2.1.1.PBMCを回収し、細胞をBinding緩衝液で洗浄する。上清を捨て、細胞ペレットを1×107/100μlの濃度のMACS緩衝液で再懸濁する。PE抗ヒトTCR Vα7.2抗体(1:100)を添加する。均一に混合し、氷上で30分間インキュベートする。
1.2.1.2.300×gで5分間遠心分離することによって、細胞をMACS緩衝液で1回洗浄する。
1.2.1.3.細胞をMACS緩衝液で107/80μlの濃度で再懸濁する。107細胞当たり20μlの抗PEマイクロビーズを添加し、氷上で20分間インキュベートする。
1.2.1.4.細胞を10倍容量のMACS緩衝液で一回洗浄する。300×gで5分間遠心分離する。1mlのMACS緩衝液に再懸濁する。
1.2.1.5.MSカラムを1mlのMACS緩衝液で前洗浄し、磁石上で組み立てる。細胞をカラムに適用し、カラムを3回、毎回1mlのMACS緩衝液で洗浄する。
1.2.1.6.カラムを磁石から取り出し、結合した細胞を1mlのMACS緩衝液中で溶出させる。
1.2.2.MAIT細胞のフロー選別
1.2.2.1.磁石で分離した細胞を回収し、300×gで5分間遠心分離する。
1.2.2.1.磁石で分離した細胞を回収し、300×gで5分間遠心分離する。
1.2.2.2.細胞をMACS緩衝液で107/100μlの濃度で再懸濁する。BV421標識ヒト5-OP-RUMR1四量体(1:500)及びAPC-H7コンジュゲート抗ヒトCD3(1:200)を添加する。氷上で20分間インキュベートする。
1.2.2.3.細胞を10倍容量のMACS緩衝液で一回洗浄する。300×gで5分間遠心分離する。2mlのMACS緩衝液に再懸濁する。
1.2.2.4.BD Prodigy選別機をオンにし、細胞試料をロードする。CD3+四量体+細胞集団を選別する(図12を参照のこと)。
1.3.MAIT細胞の単離
1.3.1.選別したMAIT細胞を回収し、300×gで5分間遠心分離する。
1.3.1.選別したMAIT細胞を回収し、300×gで5分間遠心分離する。
1.3.2.上清を捨て、R10培地に106細胞/mlに再懸濁する。
1.3.3.Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28をボルテックスによって30秒間再懸濁する。
1.3.4.所望の体積のDynabeadsをチューブに移す。
1.3.5.等体積の緩衝液を加え、ボルテックスによって5秒間混合する。チューブを磁石上に1分間置き、上清を廃棄する。
1.3.6.チューブを磁石から取り出し、洗浄したDynabeadsをR10培地に再懸濁する。
1.3.7.所望の体積のDynabeadsを細胞懸濁液に添加して、37℃インキュベーター中24ウェルプレート中100IU/mlのIL-2で1:1のビーズ対細胞比を得る。
1.4.MAIT細胞のレトロウイルス形質導入
1.4.1.レトロウイルス形質導入を、MAIT細胞活性化の48時間後に行った。
1.4.1.レトロウイルス形質導入を、MAIT細胞活性化の48時間後に行った。
1.4.2.形質導入の1日前に、レトロネクチン被覆プレートを調製する。15μgのレトロネクチンを1mlのPBSに加える。よく混合し、非組織培養処理24ウェルプレートの一方のウェルに添加する。
1.4.3.プレートをフィルムで包み、4℃の冷蔵庫で一晩保存する。
1.4.4.遺伝子導入の日に、ウェルから未結合のレトロネクチンを除去する。PBS2mlで2回洗浄する。ウェル乾燥を避ける。
1.4.5.37℃の水浴中でレトロウイルス上清を解凍する。1mlのウイルス上清をレトロネクチン被覆プレートの各ウェルに移す。
1.4.6.プレートをフィルムで包み、プレートを1000×g、32℃で2時間遠心分離する。
1.4.7.遠心分離中、活性化されたMAIT細胞を回収する。100IU/ml IL-2を含有する新鮮なR10培地によって細胞を1×106/mlの濃度に再懸濁する。
1.4.8.スピンが終了したら、プレートから上清を廃棄する。1mlの細胞懸濁液を各ウェルに添加する。
1.4.9.プレートを500×gで10分間遠心分離する。
1.4.10.プレートを37℃のインキュベーターに戻す。
1.4.11.必要に応じて、形質導入工程を繰り返して、より高い形質導入効率を達成する。
注:形質導入効率は、形質導入の48時間後にフローサイトメトリによって検出することができる。
1.5.CAR-MAIT細胞の増殖
1.5.1.レトロウイルス形質導入の2日後、細胞を回収し、血球計によって細胞を計数する。
1.5.1.レトロウイルス形質導入の2日後、細胞を回収し、血球計によって細胞を計数する。
1.5.2.1×107細胞をGrex6Mウェルプレートの1つのウェルに移す。100IU/mlのIL-2を含有する130mlの新鮮なR10培地を添加し、プレートをインキュベーターに戻す。
1.5.3.IL-2を3日ごとに100IU/mlの最終濃度にリフレッシュする。
1.5.4.CAR-MAIT細胞を8~12日間の培養後に回収することができる(図13を参照のこと)。
注:拡大CAR-MAIT細胞は、表現型試験、機能アッセイのために使用され得るか、又は液体窒素中で凍結され得る。
結果
実施例1-CD4標的化T細胞及びTCR Vβ7.1標的化T細胞の作製
図1A(1)及び(2)を参照すると、本発明によるCAR構築物の2つの異なる実施形態に含まれる機能的要素を示す概略図が示されている。
実施例1-CD4標的化T細胞及びTCR Vβ7.1標的化T細胞の作製
図1A(1)及び(2)を参照すると、本発明によるCAR構築物の2つの異なる実施形態に含まれる機能的要素を示す概略図が示されている。
各実施形態において、構築物は、上流及び下流の長い末端反復配列(LTR)に隣接している。5’プロモータは、5’LTRの下流に配置され、PGKプロモータであり得る。プロモータの3’側には、融合タンパク質をT細胞外膜に導くためのIgκシグナリングペプチドであるSPが配置されている。SPの3’側には、上流VL(可変軽鎖)配列、中央G4S配列及び下流VH(可変重鎖)配列を含むscFv領域が提供される。VL配列及びVH配列は、一実施形態では(図1A(1)に示すように)、CD4抗原に結合するためのHu5A8軽鎖可変領域及び重鎖可変領域であり得る。他の実施形態において(図1A(2)に示されるように)、VL配列及びVH配列は、TCR-Vb7.1に結合するための3G5軽鎖可変領域及び重鎖可変領域であり得る。
scFv領域の3’側には、CARの表示及び固定のためのCD8aヒンジ及び膜貫通(TM)ドメイン構造ドメインが存在する。ヒンジ及びTMの3’側には、細胞内シグナル伝達経路を誘発するための、CD28、4-1BB及びCD3ζ鎖のシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインが提供される。P2A自己切断ペプチドは、ζ鎖の3’側及び切断型EGFR(EGFRt)の5’側に配置され、これを追跡し、第1の安全スイッチとして作用する。第2のP2A自己切断ペプチドが、EGFRtの3’側及び第2の安全スイッチとして作用する誘導性カスパーゼ-9(iC9)の5’側に配置される。この構築物は、発現を増強するウッドチャック肝炎制御エレメント(WPRE)(図9及び図10のプラスミドを参照のこと)を含み、最後に、末端の3’LTRを含む。
ヒトCD4に対する免疫特異性を有するヒト化5A8(Hu5A8)マウスIgG抗体のDNA配列は、CN103282385から見出された。TNX-355又はイバリズマブとしても知られているHu5A8は、CD4分子のHIV結合部位を遮断することによってHIV侵入を阻害するための第I相及び第II相臨床試験で広く評価された。対照として、抗CD20モノクローナル抗体(Leu16)のVH鎖及びVL鎖も合成し、前臨床及び臨床CAR-T研究におけるその有効性について評価した。scFv断片を、CD8膜貫通ドメイン、CD28エンドドメイン、4-1BBエンドドメイン及びCD3ζ鎖とインフレームで第3世代CARプラスミドの骨格にクローニングした。第3世代CARを、第1世代及び第2世代CARに対するその優位性を実証する研究のために使用した。tEGFRの有用性を、操作されたCAR-T細胞の除去のための選択、インビボ追跡マーカーとして、また第1の安全スイッチとして調べた。したがって、この残留tEGFR配列を、T2A-リボソームスキップ配列によってCAR配列と連結した。
CAR-T細胞は、抗CD19及び抗HIV CAR試験の場合のように、時には数十年もの間、患者に残存し得る。B細胞形成不全とは異なり、長期のCD4+T細胞形成不全は生命を脅かす。したがって、腫瘍若しくはウイルス枯渇後、又はCAR-T療法中の重篤な副作用に起因する緊急症例において、患者から本発明のCART4細胞を除去するための安全方法を確立することが必要である。二量体化薬物誘発カスパーゼ-9(iC9)自殺スイッチは、カスパーゼ誘導性薬物(CID)と呼ばれる、低化学分子薬物AP20187の存在下での条件付き二量体化を可能にする、変異ヒトFK506結合タンパク質(FKBP)へのヒトカスパーゼ-9の融合に基づく。iC9の使用は、ハプロタイプ一致HSC移植の臨床試験において安全かつ有効であることが既に証明されている。したがって、CD4 CAR、tEGFR及びiC9を含有する遺伝子断片を次に合成し(図1A.1)、レトロウイルスMSCV(マウス幹細胞ウイルス)ベクターに挿入した(図9に示す;10,348bp)。また、その後、TCR Vβ7.1 CAR、tEGFR及びiC9を含有する遺伝子断片を合成し(図1A.2)、レトロウイルスMSCV(マウス幹細胞ウイルス)ベクターに挿入した(図10に示す;10,347bp)。
CAR及びtEGFRの共発現を実証するために、ヒトPBMCをDynabeadsヒトT-アクチベーターで活性化し、図9及び図10に示すプラスミドのレトロウイルス形質導入によって遺伝子操作して、CAR/tEGFR/iC9遺伝子構築物を発現させた。実際、EGFR特異的抗体と組み合わせたマウスscFv特異的抗マウスIgG F(ab’)2抗体での表面染色時の二重陽性細胞集団の検出によって示されるように、CAR及びtEGFRの発現レベルは密接に相関することが見出された(図1B)。T細胞増殖と共に、tEGFR+細胞集団は、全細胞の約50%を占めるその割合を維持した。(図1C)。
インビトロでのiC9安全スイッチの効率を評価するために、iC9遺伝子を含まないCART4変異(iC9を含まないCART4)を対照としてクローニングした。CART4又はiC9構築物を含まないCART4で形質導入されたT細胞を、増加する濃度のCID AP20187(0.1nM~100nM)に24時間曝露した。7AAD及びアネキシンVを用いたフローサイトメトリ分析によって細胞死を評価した。生存した集団におけるtEGFR陽性パーセンテージは、CIDの濃度の増加と共に低下した。69.1%のtEGFR高細胞が、100nMの単回用量のCID後に排除された(図1D)。他の研究からの観察結果と一致して、死滅から逃れる細胞は、CID後にtEGFRの平均蛍光強度(MFI)が50%減少した低レベルの導入遺伝子を発現する細胞であった(図1E)。したがって、非応答性T細胞は、CIDの機能的活性化のためには不十分なiC9を発現した。臨床適用のために、CAR-T細胞は、投与前に十分な導入遺伝子発現のために選別されなければならない場合がある。
実施例2-インビトロでのCART4 T細胞の機能検証
CAR形質導入後4日以内に、CD4+T細胞は、形質導入されていない(NTD)及び細胞の約45%がCD4陽性のままであるCART20対照と比較して、ほぼ完全に枯渇した(図2A)。これらのデータは、T細胞増殖中のCART4細胞のCD4に対する強力な活性を示した。
CAR形質導入後4日以内に、CD4+T細胞は、形質導入されていない(NTD)及び細胞の約45%がCD4陽性のままであるCART20対照と比較して、ほぼ完全に枯渇した(図2A)。これらのデータは、T細胞増殖中のCART4細胞のCD4に対する強力な活性を示した。
自己初代健康ドナーPBMCに対して共培養を確立した。CFSE標識自己PBMCをCD8+CART4細胞又はCART20細胞のいずれかと共培養した。両方の設定において、CART4/20細胞は、それぞれの標的細胞に対する高レベルの細胞傷害性を媒介した。PBMC中のCD4+細胞の94%を、4時間の共培養中にE:T比3:1の条件でCART4細胞によって溶解した。しかしながら、NTD T細胞と比較して、CD20+細胞に応答したCART4の特異的T細胞細胞傷害性はなかった(図2C)。
CART4細胞の機能を更に評価するために、本発明者らは、Jurkat細胞株及びCEM-ss細胞株を使用して、CART4細胞の抗腫瘍効果を試験した。Jurkat及びCEM-ss細胞株は、T細胞白血病又はヒトT4リンパ芽球性白血病の患者の末梢血から最初に樹立されたT細胞株であった。両方の細胞株はCD4を発現し、一方、CEM-ss細胞株はより高レベルのCD4を発現する(図2D)。実際、CART4細胞は、CD4発現レベルに基づいてT腫瘍細胞株を標的とした。短時間のインキュベーションの後、CART4細胞は、5:1のE:T(エフェクター:標的)比でCEM-ss細胞を首尾よく排除した。対照として、CART4細胞を、CD4を発現しないヒトB細胞株(BCL)であるCD4-リンパ腫細胞に対するそれらの活性についても試験した(図2D)。フローサイトメトリ分析は、CART4細胞がBCLを標的化することができないことを実証した(図2E)。更に、CD4+腫瘍細胞と共に培養したCART4細胞は、細胞内サイトカイン染色によって有意なIFN-γ及びTNF-α応答を示した(図2F)。したがって、これらのデータは、CD4発現に対するCART4の強い用量依存的応答を証明した。CART4細胞をCD4陰性細胞とインキュベートした場合、殺滅効果は観察されなかった。したがって、これらの結果は、CART4細胞除去がCD4に特異的であることを示している。
実施例3-CART4細胞はCD4+T腫瘍細胞を特異的に死滅させる
患者試料に対するCART4の機能を調べるために、ATLL患者由来のPBMCを解凍し、表現型解析した。全ての試料は、67.4%~97.7%の範囲のCD4発現を有していた。CD4+細胞のほとんどは、T細胞受容体(TCR Vβ)の1つのユニークなβ鎖を発現し、T細胞白血病202~204のクローン発生を示している(図3A)。フローサイトメトリ分析によって定量化されるように、4時間にわたるCART4細胞とのATLL患者試料の共培養は、CD4+悪性腫瘍の迅速かつ完全な消失をもたらした。以前に示された芽球T細胞株の消失と一致して(図3B)、全てのATLL共培養物について約80%の消失が観察された。6人のCTCL患者由来の試料を用いて試験も行った。同様に、融解したばかりの初代CTCL細胞に対するCART4細胞の強い細胞傷害性が観察され、4時間の共培養後に悪性T細胞の約60%~80%の減少をもたらした(図3C)。したがって、CART4細胞は、患者試料から直接単離された攻撃的なCD4+T悪性腫瘍を効率的に排除した。これらの結果は、CD4がCD4+T悪性腫瘍の有望な治療標的であることを示している。
患者試料に対するCART4の機能を調べるために、ATLL患者由来のPBMCを解凍し、表現型解析した。全ての試料は、67.4%~97.7%の範囲のCD4発現を有していた。CD4+細胞のほとんどは、T細胞受容体(TCR Vβ)の1つのユニークなβ鎖を発現し、T細胞白血病202~204のクローン発生を示している(図3A)。フローサイトメトリ分析によって定量化されるように、4時間にわたるCART4細胞とのATLL患者試料の共培養は、CD4+悪性腫瘍の迅速かつ完全な消失をもたらした。以前に示された芽球T細胞株の消失と一致して(図3B)、全てのATLL共培養物について約80%の消失が観察された。6人のCTCL患者由来の試料を用いて試験も行った。同様に、融解したばかりの初代CTCL細胞に対するCART4細胞の強い細胞傷害性が観察され、4時間の共培養後に悪性T細胞の約60%~80%の減少をもたらした(図3C)。したがって、CART4細胞は、患者試料から直接単離された攻撃的なCD4+T悪性腫瘍を効率的に排除した。これらの結果は、CD4がCD4+T悪性腫瘍の有望な治療標的であることを示している。
実施例4-CART4細胞はインビボで抗白血病効果を効率的に媒介する
インビボ抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、Gaussiaルシフェラーゼ発現CEM-ss細胞株を使用して異種マウスモデルを開発した。彼らはまず、CART4細胞の単回用量(4×106個)でNRGマウスにおける白血病の出現を遅延させるCART4細胞の能力を試験した。フローサイトメトリ分析によって実証されるように、注射前に、細胞の約50%が抗CD4 CARを発現した。マウスは、CEM-ss細胞の後眼窩注射を受けた。腫瘍生着の4日後、CART4細胞又はNTDCD8+T細胞の後眼窩注射の単回用量を白血病を有するマウスに投与した(図4A)。腫瘍負荷を、末梢血中のルシフェラーゼ活性を毎週測定することによってモニターした。注入されたCART4細胞は、白血病進行に対する堅固な保護を提供し(図4B)、マウスの生存期間中央値を有意に延長した(対照群では38日間対CART4群では60日間、マンテル・コックス・ログランク検定によりP=0.026)(図4C)。実際、エンドポイントにより、eGFP+腫瘍の進行は、フローサイトメトリ分析により脾臓及び骨髄で劇的に遅延した(図4D)。
インビボ抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、Gaussiaルシフェラーゼ発現CEM-ss細胞株を使用して異種マウスモデルを開発した。彼らはまず、CART4細胞の単回用量(4×106個)でNRGマウスにおける白血病の出現を遅延させるCART4細胞の能力を試験した。フローサイトメトリ分析によって実証されるように、注射前に、細胞の約50%が抗CD4 CARを発現した。マウスは、CEM-ss細胞の後眼窩注射を受けた。腫瘍生着の4日後、CART4細胞又はNTDCD8+T細胞の後眼窩注射の単回用量を白血病を有するマウスに投与した(図4A)。腫瘍負荷を、末梢血中のルシフェラーゼ活性を毎週測定することによってモニターした。注入されたCART4細胞は、白血病進行に対する堅固な保護を提供し(図4B)、マウスの生存期間中央値を有意に延長した(対照群では38日間対CART4群では60日間、マンテル・コックス・ログランク検定によりP=0.026)(図4C)。実際、エンドポイントにより、eGFP+腫瘍の進行は、フローサイトメトリ分析により脾臓及び骨髄で劇的に遅延した(図4D)。
再発腫瘍細胞はCD4の発現を保持したが、発現レベルは対照群と比較して約40%のMFIまで低下した(図4E)。しかし、この下方制御は、再発腫瘍を排除するCART4細胞の能力を損なうには不十分であった(図4F)。この結果は、抗原回避ではなくCAR-T細胞持続性の欠如が腫瘍再発の主な理由であることを示していた。
実施例5-GMPに準拠したCAR-T細胞の製造方法の開発
スケーラビリティを評価し、CAR-T細胞製造を単純化するために、CAR-T製造のためのガス透過性静的細胞培養システム(G-Rex)を使用して、最適化された標準的な操作手順を確立した(図5A)。G-Rexシステムは、プレートの底部にシリコーン膜を含む。膜を横切るO2及びCO2を含むガス交換は、培養培地の深さを増加させ、より多くの栄養素を提供し、廃棄物を希釈することを可能にする。PBMCを活性化し、形質導入し、10×106細胞を移入し、更にG-Rex6ウェルプレート中で培養した。細胞にサイトカインIL-7及びIL-15を2~3日ごとに補充した。細胞は、初期数の2×106細胞から3×108を超えて拡大し、15日間で150倍増加した(図5B)。次に、G-Rex系におけるT細胞増殖後の最終生成物の形質導入効率を確認した。CART4の最終形質導入効率は、図5Cに示すように、従来のフラスコから産生された細胞(53.7%±5.3%)と同様に、57.6%±7.1%であった。予想通り、内因性CD4+集団は最終生成物中で完全に枯渇し、CAR-T細胞の抗CD4活性を示した。
スケーラビリティを評価し、CAR-T細胞製造を単純化するために、CAR-T製造のためのガス透過性静的細胞培養システム(G-Rex)を使用して、最適化された標準的な操作手順を確立した(図5A)。G-Rexシステムは、プレートの底部にシリコーン膜を含む。膜を横切るO2及びCO2を含むガス交換は、培養培地の深さを増加させ、より多くの栄養素を提供し、廃棄物を希釈することを可能にする。PBMCを活性化し、形質導入し、10×106細胞を移入し、更にG-Rex6ウェルプレート中で培養した。細胞にサイトカインIL-7及びIL-15を2~3日ごとに補充した。細胞は、初期数の2×106細胞から3×108を超えて拡大し、15日間で150倍増加した(図5B)。次に、G-Rex系におけるT細胞増殖後の最終生成物の形質導入効率を確認した。CART4の最終形質導入効率は、図5Cに示すように、従来のフラスコから産生された細胞(53.7%±5.3%)と同様に、57.6%±7.1%であった。予想通り、内因性CD4+集団は最終生成物中で完全に枯渇し、CAR-T細胞の抗CD4活性を示した。
興味深いことに、G-Rexにおいて産生されたCAR-T細胞は、セントラルメモリー表現型に対する分化優先性を示した。メモリーマーカーCD45RO及びCD62Lの評価は、従来の培養フラスコで培養した細胞と比較して、より高いCD45RO CD62L二重陽性集団割合(77%±7.1%対41%±5.5%)を示した(図5D)。CD45RO CD62L二重陽性細胞は、セントラルメモリーT細胞であり、インビボでの長期持続に必要であると考えられている。したがって、このバイオプロセス最適化方法は、CAR-T製造の技術者介入の数及びコストを減少させながら、細胞出力及びセントラルメモリー表現型を有する割合を増加させた。
実施例6-TCR Vβ7.1特異的CAR-T細胞の作製
T細胞悪性腫瘍は、通常、ユニークなTCRを発現する1つのモノクローナルな癌性細胞から発生する。TCR β(Vβ)鎖の可変(V)領域に対する広範囲の抗体が、25のVβファミリーのうち22の評価を可能にする直接コンジュゲート多色フォーマットで利用可能になり、正常な循環T細胞レパートリーの75%をカバーする。したがって、本発明者らは、TCR VβがT細胞悪性腫瘍に対するCAR-T療法の潜在的な標的であると考える。CAR-T(CARTVb7.1)細胞を標的とするTCR Vβを開発するために、本発明者らは、図1A(2)に示されるように、ヒトTCR Vβ7.1(オックスフォードのAndrewの研究室のDr Margret Callam)に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞3G5のscFv領域をCAR構築物にクローン化した。CAR形質導入の5日後、内因性TCR Vβ7.1+集団は、細胞の約1.2%がTCR Vβ7.1陽性のままであるCART20対照と比較して、ほぼ完全に枯渇した(図6B)。これらのデータは、T細胞拡大中のCAR-T細胞のTCR Vβ7.1に対する強力な活性を示した。
T細胞悪性腫瘍は、通常、ユニークなTCRを発現する1つのモノクローナルな癌性細胞から発生する。TCR β(Vβ)鎖の可変(V)領域に対する広範囲の抗体が、25のVβファミリーのうち22の評価を可能にする直接コンジュゲート多色フォーマットで利用可能になり、正常な循環T細胞レパートリーの75%をカバーする。したがって、本発明者らは、TCR VβがT細胞悪性腫瘍に対するCAR-T療法の潜在的な標的であると考える。CAR-T(CARTVb7.1)細胞を標的とするTCR Vβを開発するために、本発明者らは、図1A(2)に示されるように、ヒトTCR Vβ7.1(オックスフォードのAndrewの研究室のDr Margret Callam)に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞3G5のscFv領域をCAR構築物にクローン化した。CAR形質導入の5日後、内因性TCR Vβ7.1+集団は、細胞の約1.2%がTCR Vβ7.1陽性のままであるCART20対照と比較して、ほぼ完全に枯渇した(図6B)。これらのデータは、T細胞拡大中のCAR-T細胞のTCR Vβ7.1に対する強力な活性を示した。
CARTVb7.1細胞の機能を更に評価するために、本発明者らは、TCR Vβ7.1陽性腫瘍と診断されたATL患者から単離された腫瘍細胞を使用して抗腫瘍効果を試験した。実際、フローサイトメトリ分析によって定量化されるように、6時間にわたるCARTVb7.1細胞とのATL患者試料の共培養は、CD4+悪性腫瘍の迅速かつ完全な消失をもたらした。約60%の消失が、全てのATL共培養物について観察された(図6C、図6D)。これらの結果は、TCR VβがT悪性腫瘍の有望な治療標的であることを示している。
実施例7-CAR-MAIT細胞の開発
現在、CAR-T療法のほとんどは、自己の従来のCD3+T細胞を利用する。しかしながら、癌患者由来の免疫細胞は、機能性が低いか、又は少数で存在し得る。特に、腫瘍細胞をCARで操作することが可能であるため、T悪性腫瘍患者のPBMCを拡大させ、遺伝子改変することは危険であろう。したがって、第3者の同種異系細胞を製造することができる免疫療法を開発することが望ましい。ここで、本発明者らは、磁気分離とフローサイトメトリ選別の組合せによってPBMCから粘膜関連インバリアントT細胞(MAIT細胞)を単離する2段階法を開発した。TCR Vα7.2発現に基づく第1段階の分離の後、MAIT細胞パーセンテージは0.74%から33.3%に増加した(図7A、図7B)。次の工程のフロー選別は、MAIT純度を95%まで更に増加させ得る。選別した細胞をDynabeads Human T-Activator CD3/CD28で活性化し、サイトカインのカクテル(IL-2、IL-7及びIL-15)の存在下で拡大させた。増殖方法は、12~14日以内に約100倍の増殖をもたらした(図7C)。回収時に、拡大した細胞の90.9%がMR1-5-OP-RU四量体に対する特異性を維持した(図7D)。また、拡大したMAIT細胞を、レトロウイルス形質導入によってCAR遺伝子によって首尾よく操作することができた(図7E)。CAR形質導入MAIT(CAR-MAIT)細胞は、従来のCAR-T細胞と同等の細胞傷害能力を有する(図8)。
現在、CAR-T療法のほとんどは、自己の従来のCD3+T細胞を利用する。しかしながら、癌患者由来の免疫細胞は、機能性が低いか、又は少数で存在し得る。特に、腫瘍細胞をCARで操作することが可能であるため、T悪性腫瘍患者のPBMCを拡大させ、遺伝子改変することは危険であろう。したがって、第3者の同種異系細胞を製造することができる免疫療法を開発することが望ましい。ここで、本発明者らは、磁気分離とフローサイトメトリ選別の組合せによってPBMCから粘膜関連インバリアントT細胞(MAIT細胞)を単離する2段階法を開発した。TCR Vα7.2発現に基づく第1段階の分離の後、MAIT細胞パーセンテージは0.74%から33.3%に増加した(図7A、図7B)。次の工程のフロー選別は、MAIT純度を95%まで更に増加させ得る。選別した細胞をDynabeads Human T-Activator CD3/CD28で活性化し、サイトカインのカクテル(IL-2、IL-7及びIL-15)の存在下で拡大させた。増殖方法は、12~14日以内に約100倍の増殖をもたらした(図7C)。回収時に、拡大した細胞の90.9%がMR1-5-OP-RU四量体に対する特異性を維持した(図7D)。また、拡大したMAIT細胞を、レトロウイルス形質導入によってCAR遺伝子によって首尾よく操作することができた(図7E)。CAR形質導入MAIT(CAR-MAIT)細胞は、従来のCAR-T細胞と同等の細胞傷害能力を有する(図8)。
実施例8-CAR-MAIT細胞はインビボで抗白血病効果を効率的に媒介する
CAR-MAIT細胞の抗腫瘍機能をインビボで評価するために、本発明者らは、CAR細胞の単回用量(4×106個)でNSGマウスにおいて白血病の進行を遅延させる抗CD4 CAR-MAIT(CAR-MAIT4)細胞の能力を試験した。マウスは、CEM-ss細胞の後眼窩注射を受けた。腫瘍生着の4日後、CAR-MAIT4細胞又はCART4細胞の静脈内注射の単回用量を白血病を有するマウスに投与した(図14A)。抗CD20 CAR-MAIT(CAR-MAIT-Ctrl)細胞又は抗CD20 CART(CART-Ctrl)細胞を対照群として投与した。腫瘍負荷を、ルシフェラーゼ活性を毎週測定することによってモニターした。注入されたCAR-MAIT4細胞及びCART4細胞は、白血病進行に対する同等の保護を提供し(図14C及び図14D)、腫瘍担持マウスの生存を有意に延長した(図14B)。
CAR-MAIT細胞の抗腫瘍機能をインビボで評価するために、本発明者らは、CAR細胞の単回用量(4×106個)でNSGマウスにおいて白血病の進行を遅延させる抗CD4 CAR-MAIT(CAR-MAIT4)細胞の能力を試験した。マウスは、CEM-ss細胞の後眼窩注射を受けた。腫瘍生着の4日後、CAR-MAIT4細胞又はCART4細胞の静脈内注射の単回用量を白血病を有するマウスに投与した(図14A)。抗CD20 CAR-MAIT(CAR-MAIT-Ctrl)細胞又は抗CD20 CART(CART-Ctrl)細胞を対照群として投与した。腫瘍負荷を、ルシフェラーゼ活性を毎週測定することによってモニターした。注入されたCAR-MAIT4細胞及びCART4細胞は、白血病進行に対する同等の保護を提供し(図14C及び図14D)、腫瘍担持マウスの生存を有意に延長した(図14B)。
実施例9-ヒトMAIT細胞の検出、単離、拡大及び操作
本明細書中に記載される方法を使用して、ヒトMAIT細胞を検出し、単離し、拡大し、操作した。
本明細書中に記載される方法を使用して、ヒトMAIT細胞を検出し、単離し、拡大し、操作した。
図11に示されるように、ヒトMAIT細胞をフローサイトメトリによって分析した。
図12に示されるように、MAIT細胞をフロー選別した。
次いで、MAIT細胞を活性化し、CAR発現ベクターで形質導入してCAR-MAIT細胞を作製し、次いで、これを図13に示されるように拡大培養した。
実施例10-PMBCを刺激することによるMAIT細胞の増殖
MAIT細胞は、MHCクラスI様分子MR1を認識するCD3+TCRVa7.2+CD161+細胞として定義される自然T細胞のサブセットである。以前の研究は、MAIT細胞をインビトロで拡大させることができるが、同種異系フィーダー細胞の存在を必要とすることを示しているが、この方法は大規模生産及び品質管理にとって困難である。本研究では、本発明者らは、両方とも様々なサイトカイン(IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18及びIL-23)の組合せの存在下で、インビトロ培養で最大6日間、抗原(5-OP-RU)ロードMR1四量体ビーズ又は5-OP-RU単独でPBMCを最初に刺激することによって、インビトロでMAIT細胞を増殖させるための非常に新規かつ効果的な方法を開発した。次いで、得られたMAIT細胞を、先の実施例に記載されるように、MACS又はFACS選別によって単離し、CARに基づく治療のために抗CD3/CD28ビーズによって更に拡大させた。
MAIT細胞は、MHCクラスI様分子MR1を認識するCD3+TCRVa7.2+CD161+細胞として定義される自然T細胞のサブセットである。以前の研究は、MAIT細胞をインビトロで拡大させることができるが、同種異系フィーダー細胞の存在を必要とすることを示しているが、この方法は大規模生産及び品質管理にとって困難である。本研究では、本発明者らは、両方とも様々なサイトカイン(IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18及びIL-23)の組合せの存在下で、インビトロ培養で最大6日間、抗原(5-OP-RU)ロードMR1四量体ビーズ又は5-OP-RU単独でPBMCを最初に刺激することによって、インビトロでMAIT細胞を増殖させるための非常に新規かつ効果的な方法を開発した。次いで、得られたMAIT細胞を、先の実施例に記載されるように、MACS又はFACS選別によって単離し、CARに基づく治療のために抗CD3/CD28ビーズによって更に拡大させた。
材料及び方法
1.PBMCの単離
Ficoll-Hypaque密度勾配での遠心分離を介して、健常血液ドナーのバフィーコートからPBMCを単離した。単離したPBMCのアリコートを凍結し、使用するまで液体窒素中で保存した。実験を開始する前に、凍結PBMCストックを解凍し、10%FBSを補充したRPMI培地中で37℃でインキュベートした。
1.PBMCの単離
Ficoll-Hypaque密度勾配での遠心分離を介して、健常血液ドナーのバフィーコートからPBMCを単離した。単離したPBMCのアリコートを凍結し、使用するまで液体窒素中で保存した。実験を開始する前に、凍結PBMCストックを解凍し、10%FBSを補充したRPMI培地中で37℃でインキュベートした。
2.MR1/5-OP-RU複合ビーズの調製
ThermoFisher製のストレプトアビジン及びビオチン化MR1モノマーを含むM-280 dynabeadsを使用することによって、MR1/5-OP-RUテトラマーコーティングビーズを生成した。5-OP-RUロードMR1モノマーは、Dr Jim McCluskey(University of Melbourne,Australia)の厚意により提供された。ビーズを混合し、ロッカー上で4℃で12時間、5-OP-RUロードMR1モノマー(5ug/3×107ビーズ)でコーティングした。過剰な未結合タンパク質を、PBSにおける2回の10分間の洗浄によって除去した。調製したMR1テトラマーコーティングビーズをPBSに再懸濁し、使用するまで4℃で保存した。
ThermoFisher製のストレプトアビジン及びビオチン化MR1モノマーを含むM-280 dynabeadsを使用することによって、MR1/5-OP-RUテトラマーコーティングビーズを生成した。5-OP-RUロードMR1モノマーは、Dr Jim McCluskey(University of Melbourne,Australia)の厚意により提供された。ビーズを混合し、ロッカー上で4℃で12時間、5-OP-RUロードMR1モノマー(5ug/3×107ビーズ)でコーティングした。過剰な未結合タンパク質を、PBSにおける2回の10分間の洗浄によって除去した。調製したMR1テトラマーコーティングビーズをPBSに再懸濁し、使用するまで4℃で保存した。
3.PBMC中のMAIT細胞の濃縮
PBMC(ウェル当たり2×105細胞)を、R10培地(90%RPMI+10%FBS+1%ペニシリン/ストレプトマイシン+2mM L-グルタミン)を含む96ウェルプレート中で37℃インキュベーター中で培養し、インビトロで6日間、異なるサイトカインと組み合わせて、1:1のビーズ対細胞比でMR1/5-OP-RU複合体被覆ビーズ又は精製5-OP-RU抗原(10nM)(Dr Jeffrey Mak,University of Queensland,Australiaによって提供された)のいずれかによって刺激した。サイトカインIL-2(100IU/ml)(Roche)、IL-7(50ng/ml)(Miltenyi)、IL-15(50ng/ml)(Miltenyi)、IL-12(50ng/ml)(Miltenyi)、IL-18(50ng/ml)(ThermoFisher)及びIL-23(50ng/ml)(Miltenyi)を、図15の表に示されるように、1から15まで番号が付された15の異なる組合せで添加した。6日目に、拡大させた細胞を回収し、分析して、以下に記載されるようにフローサイトメトリによってMAIT細胞の割合を決定した。
PBMC(ウェル当たり2×105細胞)を、R10培地(90%RPMI+10%FBS+1%ペニシリン/ストレプトマイシン+2mM L-グルタミン)を含む96ウェルプレート中で37℃インキュベーター中で培養し、インビトロで6日間、異なるサイトカインと組み合わせて、1:1のビーズ対細胞比でMR1/5-OP-RU複合体被覆ビーズ又は精製5-OP-RU抗原(10nM)(Dr Jeffrey Mak,University of Queensland,Australiaによって提供された)のいずれかによって刺激した。サイトカインIL-2(100IU/ml)(Roche)、IL-7(50ng/ml)(Miltenyi)、IL-15(50ng/ml)(Miltenyi)、IL-12(50ng/ml)(Miltenyi)、IL-18(50ng/ml)(ThermoFisher)及びIL-23(50ng/ml)(Miltenyi)を、図15の表に示されるように、1から15まで番号が付された15の異なる組合せで添加した。6日目に、拡大させた細胞を回収し、分析して、以下に記載されるようにフローサイトメトリによってMAIT細胞の割合を決定した。
4.PBMC中のMAIT細胞頻度のFACS分析
拡大させたPBMCを、暗所で30分間、抗体を使用して表面マーカーについて染色した。FITCコンジュゲートCD3(クローンBW264/56、Miltenyi)、PEコンジュゲートVa7.2(クローン3C10、Biolegend)、APCコンジュゲートCD161(クローンDX12、BD)を1:100で使用して細胞を標識した。MAIT細胞は、CD3+Va7.2+CD161+細胞として定義される。死細胞は、LIVE/DEAD(商標)Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit(ThermoFisher)を使用して除外した。染色した細胞を5~10体積のPBSで洗浄し、500×gで5分間遠心分離し、200μlのPBSで再懸濁した後、フローサイトメトリ分析を行った。フローサイトメトリの結果をFlowJoによって分析した。
拡大させたPBMCを、暗所で30分間、抗体を使用して表面マーカーについて染色した。FITCコンジュゲートCD3(クローンBW264/56、Miltenyi)、PEコンジュゲートVa7.2(クローン3C10、Biolegend)、APCコンジュゲートCD161(クローンDX12、BD)を1:100で使用して細胞を標識した。MAIT細胞は、CD3+Va7.2+CD161+細胞として定義される。死細胞は、LIVE/DEAD(商標)Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit(ThermoFisher)を使用して除外した。染色した細胞を5~10体積のPBSで洗浄し、500×gで5分間遠心分離し、200μlのPBSで再懸濁した後、フローサイトメトリ分析を行った。フローサイトメトリの結果をFlowJoによって分析した。
結果
図15を参照すると、PBMC中のMAIT細胞を濃縮した結果が示されている。PBMCを、(i)1:1のビーズ対細胞比でのMR1/5-OP-RU複合体ビーズ又は(ii)10nMでの5-OP-RU抗原のいずれかによって、表に示すようにそれぞれ異なるサイトカイン(IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18及びIL-23)の存在下で6日間刺激した。例えば、条件1はIL-2のみに対応し、条件2はIL-7及びIL-15に対応し、条件3はIL-2、IL-12及びIL-18に対応する等である。
図15を参照すると、PBMC中のMAIT細胞を濃縮した結果が示されている。PBMCを、(i)1:1のビーズ対細胞比でのMR1/5-OP-RU複合体ビーズ又は(ii)10nMでの5-OP-RU抗原のいずれかによって、表に示すようにそれぞれ異なるサイトカイン(IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18及びIL-23)の存在下で6日間刺激した。例えば、条件1はIL-2のみに対応し、条件2はIL-7及びIL-15に対応し、条件3はIL-2、IL-12及びIL-18に対応する等である。
MAIT細胞増加の倍数を、6日目の生存MAIT(CD3+Va7.2+CD161+)細胞の頻度を0日目のMAIT細胞の元の頻度で割ることによって計算した。上位5つの群をオレンジ色で強調した(すなわち、条件1、3、11、12及び13)。
見られ得るように、(ドナー1については)MR1/5-OP-RU複合体ビーズについて、1、13、12、3及び11のサイトカインの組合せは、PBMC中のMAIT細胞の増加の最大倍を与えた。MR1/5-OP-RU複合体ビーズ(ドナー2について)では、12、13、1、11及び3のサイトカインの組合せは、PBMC中のMAIT細胞の増加の最大倍を与えた。
見られ得るように、5-OP-RU(ドナー1について)について、3、1、12、13及び11のサイトカインの組合せは、PBMC中のMAIT細胞の増加の最大倍数を与えた。5-OP-RU(ドナー2について)の場合、8、13、12、11及び3のサイトカインの組合せは、PBMC中のMAIT細胞の増加の最大倍数を与えた。
これらのデータに基づいて、異なるサイトカイン及びサイトカインの組合せ(IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18及びIL-23)が異なるレベルの刺激をもたらし、PBMC中のMAIT細胞の濃縮の改善をもたらしたことが明らかである。全体として、IL-12、IL-18及びIL-23の組合せは、PBMC中のMAIT細胞の増加の最大倍数を与える。
考察
MAIT細胞は、MHCクラスI様分子MR1を認識するCD3+TCRVa7.2+CD161+細胞として定義される自然T細胞のサブセットである。以前の研究は、MAIT細胞をインビトロで拡大させることができるが、同種異系フィーダー細胞の存在を必要とすることを示しており、この方法は大規模生産及び品質管理にとって困難である。上記のように、本発明者らは、3種のサイトカイン(IL-12、IL-18及びIL23)の組合せの存在下でPBMCを抗原(5-OP-RU)ロードMR1テトラマービーズ又は5-OP-RU単独で最初に刺激して最大6日間のインビトロ培養を行うことによって、インビトロでMAIT細胞を増殖させるための驚くほど効果的な方法を開発した。次いで、MAIT細胞を、MACS又はFACS選別によって単離し、CARに基づく治療のために抗CD3/CD28ビーズによって更に拡大させた。
MAIT細胞は、MHCクラスI様分子MR1を認識するCD3+TCRVa7.2+CD161+細胞として定義される自然T細胞のサブセットである。以前の研究は、MAIT細胞をインビトロで拡大させることができるが、同種異系フィーダー細胞の存在を必要とすることを示しており、この方法は大規模生産及び品質管理にとって困難である。上記のように、本発明者らは、3種のサイトカイン(IL-12、IL-18及びIL23)の組合せの存在下でPBMCを抗原(5-OP-RU)ロードMR1テトラマービーズ又は5-OP-RU単独で最初に刺激して最大6日間のインビトロ培養を行うことによって、インビトロでMAIT細胞を増殖させるための驚くほど効果的な方法を開発した。次いで、MAIT細胞を、MACS又はFACS選別によって単離し、CARに基づく治療のために抗CD3/CD28ビーズによって更に拡大させた。
現在、T細胞リンパ腫についての十分に確立された治療法は、B細胞悪性腫瘍と比較して利用可能ではなく、唯一の可能性のある治癒的レジメンは、同種造血幹細胞移植(HSCT)であり、それ自体は有意な治療関連死亡率を有する。T細胞リンパ腫の大部分(>95%)は、定義されたT細胞受容体(TCR)遺伝子を発現する優性T細胞クローン(すなわち、クローンTCR-Vb鎖)に由来し、pan-Tは細胞マーカーCD4を助けるので、これらのマーカーを標的とするモノクローナル抗体は、T細胞リンパ腫の治療について検討されており、いくつかは小規模臨床試験で部分的な退縮をもたらした(d’Amore et al.,2010;Hagberg et al.,2005;Kim et al.,2007)。
CAR-Tは、pan-B細胞マーカーCD19を標的化することによるB細胞悪性腫瘍の非常に有効な治療法であるにもかかわらず、このアプローチは、T細胞リンパ腫の治療に適用する場合に重大な障害に直面している。第1に、B細胞枯渇とは異なり、持続性T細胞形成不全、特にCD4+T細胞枯渇は、慢性HIV感染中に観察される日和見感染症等の重度の毒性をもたらすであろう。第2に、T細胞リンパ腫に関連するT細胞機能障害及び優性T細胞腫瘍成長によって引き起こされる正常T細胞数の低下は、自己CAR-T細胞を作製するために使用することができず、したがって、同種CAR-T細胞は、T細胞リンパ腫の治療のために必要である。最後に、ほとんどのT細胞リンパ腫は、リンパ節及び皮膚組織に関連する固形腫瘍であり、これらは、それらのより低い組織浸潤能力並びに厳しい腫瘍微小環境のために従来のCAR-Tによって治療することが困難である。
これらの問題に対処するために、本発明者らは、腫瘍細胞を根絶した後にCART4形質導入T細胞を選択的に排除するための安全スイッチとしてtEGFR及びiC9を含有するCAR標的化CD4抗原(CART4)を設計し、自己造血幹細胞又は同種HSCTからの正常なCD4+T細胞の回収を可能にした。CD4+T細胞の輸送枯渇は、抗CD4抗体による自己免疫疾患の治療において安全かつ忍容可能であることが示されている(Hagberg et al.,2005;Kim et al.,2007)。CART4形質導入ヒトT細胞は、ATLL又はCTCL患者から単離されたCD4+T細胞リンパ腫細胞株をインビトロで死滅させ、マウス異種移植モデルにおいてインビボで腫瘍成長を阻害することができた。より重要なことには、これらのCART4+T細胞は、抗EGFR抗体によって検出されるtEGFR及びインビトロ及びインビボでのCART4+T細胞のCID薬物誘発性アポトーシスによって決定されるiC9の両方と共にCARを共発現する。tEGFRの発現は、CART4+T細胞増殖をモニタリングするため、又はインビボで抗EGFR抗体を用いてCART4+T細胞を排除するためのいずれかに使用することができる。
一般に、正常T細胞は、病原体感染に対する細胞性免疫を維持するための非常に多様なTCRレパートリーからなる。TCRは、N末端可変領域及びC末端定常領域を含むa鎖及びb鎖のヘテロ二量体からなる。TCR-Vb領域(鎖)は、TCR-Vaよりも多型であり、免疫応答又はT細胞悪性腫瘍のクローン性を分析するためにしばしば使用される。現在、75%のTCRレパートリーをカバーするTCR-Vb鎖ファミリーに特異的な22mAbが存在する。T細胞リンパ腫のほとんどは、同じTCR Vb鎖を発現する単一のT細胞クローンに由来するので、したがって、残りの正常なT細胞レパートリーを維持しながら腫瘍クローンに定義されたTCR-Vb鎖を標的とするCARTは、日和見感染症を最小限に抑えるための理想的なアプローチであり、輸血後にCART細胞を除去する必要はない。
抗TCR-Vbベースの免疫療法の概念実証として、本発明者らは、TCR-Vb7.1鎖(CARTVb7.1)を特異的に標的とするCARを操作し、CARTVb7.1形質導入T細胞が、ATL患者から単離されたTCR-Vb7.1陽性腫瘍細胞を効果的に排除することができることを示し、抗TCR-Vb CARがT細胞リンパ腫の代替免疫療法を提供し得ることを示唆した。
最後に、本発明者らは、MAIT細胞が従来のT細胞を超えるいくつかの利点を有するので、MAIT細胞がCARに基づく治療のためのエフェクター細胞として使用され得るかどうかを調べた:
(1)哺乳動物進化の間に高度に保存された不変のTCRを発現することによる低い同種反応性(すなわち、移植片対宿主病、GVHDを誘発する);
(2)マウスモデルにおけるGVHDの阻害を含む調節機能;
(3)活性化誘導性のGrB、パーフォリン及びGrAによる殺滅活性;及び
(4)腸粘膜、皮膚及び肺における分布等の組織ホーミング。
(1)哺乳動物進化の間に高度に保存された不変のTCRを発現することによる低い同種反応性(すなわち、移植片対宿主病、GVHDを誘発する);
(2)マウスモデルにおけるGVHDの阻害を含む調節機能;
(3)活性化誘導性のGrB、パーフォリン及びGrAによる殺滅活性;及び
(4)腸粘膜、皮膚及び肺における分布等の組織ホーミング。
本明細書中に記載されるように、CARを形質導入されたMAIT細胞(CAR-MAIT)は、従来のCAR-T細胞が示したのと少なくとも同等な抗腫瘍活性をインビトロ及びインビボにおいて示した。
結論として、本発明者らは、オン標的/オフ腫瘍毒性及びサイトカイン放出症候群又は特異的TCR-Vb鎖(全体的な免疫抑制を回避するために悪性T細胞に固有である)を減少させるために切り替え可能なCAR-Tによりpan-T細胞マーカーCD4のいずれかを標的化することによって、T細胞悪性腫瘍の効果的な治療のための新規なCAR-MAITに基づく免疫療法を開発した。より重要なことには、CAR-MAIT細胞は、T細胞リンパ腫の治療に必要とされる同種異系CARに基づく療法を開発する可能性を有し得る。一貫して製造される場合、すなわち、大量のエクスビボ増殖である場合、それらは既製の開発に使用することができる。本発明者らは、CAR-MAITが、T細胞悪性腫瘍のためだけでなく、他の非免疫細胞型腫瘍のための効果的な治療のための新しいアプローチを提供し得ると考える。
結論
キメラ抗原受容体(CAR)に基づくT細胞療法は、pan-B細胞特異的抗原を標的とすることによってB細胞悪性腫瘍の治療において大きな成功を収めている。しかし、T細胞リンパ腫についての同様の戦略はこれまで実現されておらず、主に、B細胞悪性腫瘍と比較して、Tリンパ腫における全体的なT細胞枯渇及び正常T細胞の機能不全/低頻度による潜在的な重篤な毒性のためである。これらの制限を克服するために、本発明者らは、2つの安全スイッチ:切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)及び誘導性カスパーゼ-9(iC9)を組み込んだ、pan-T細胞マーカー(CD4)又はTCR-Vbアイソタイプ鎖に特異的な新規CAR構築物を操作した。本発明者らは、同種異系反応性が低い粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞が、CAR構築物で形質導入された後、従来のT細胞と同様の抗腫瘍殺傷活性を示すかどうかを調査した。
キメラ抗原受容体(CAR)に基づくT細胞療法は、pan-B細胞特異的抗原を標的とすることによってB細胞悪性腫瘍の治療において大きな成功を収めている。しかし、T細胞リンパ腫についての同様の戦略はこれまで実現されておらず、主に、B細胞悪性腫瘍と比較して、Tリンパ腫における全体的なT細胞枯渇及び正常T細胞の機能不全/低頻度による潜在的な重篤な毒性のためである。これらの制限を克服するために、本発明者らは、2つの安全スイッチ:切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)及び誘導性カスパーゼ-9(iC9)を組み込んだ、pan-T細胞マーカー(CD4)又はTCR-Vbアイソタイプ鎖に特異的な新規CAR構築物を操作した。本発明者らは、同種異系反応性が低い粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞が、CAR構築物で形質導入された後、従来のT細胞と同様の抗腫瘍殺傷活性を示すかどうかを調査した。
驚くべきことに、CARを形質導入されたT細胞は、患者から単離されたCD4+Tリンパ腫細胞又はTCR-Vb特異的T白血病クローンの特異的殺滅を示しただけでなく、インビトロ及びインビボでの誘導剤による処理時に排除された。更に、本発明者らは、CAR-MAIT細胞がインビトロ及びインビボで従来のT細胞と同程度に効率的に腫瘍成長を阻害することができることを初めて示した。この研究は、T細胞リンパ腫の治療のための新規な戦略を提供する。
したがって、広範囲の感染性疾患及び非感染性疾患への関与、並びに主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスI様タンパク質MR1によって提示される微生物リボフラビン誘導体抗原に対する異常な特異性で知られている免疫細胞の一種である本発明の粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞は、Tリンパ腫を特異的に認識し、攻撃することを可能にするキメラ抗原受容体(CAR)を有する遺伝子改変MAIT細胞によって癌患者を治療するための新規な形態の免疫療法に開発される。
References
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条項
1.キメラ抗原受容体(CAR)を発現する粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞。
d’Amore,F.,Radford,J.,Relander,T.,Jerkeman,M.,Tilly,H.,Osterborg,A.,Morschhauser,F.,Gramatzki,M.,Dreyling,M.,Bang,B.,&Hagberg,H.(2010).Phase II trial of zanolimumab(HuMax-CD4)in relapsed or refractory non-cutaneous peripheral T cell lymphoma.British Journal of Haematology,150(5),565-573.https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1365-2141.2010.08298.x
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条項
1.キメラ抗原受容体(CAR)を発現する粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞。
2.CAR-MAIT細胞が、T細胞上のCD4抗原を標的とするCARを発現する、条項1に記載のMAIT細胞。
3.CARが、実質的に配列番号1に示されるアミノ酸、又はそのバリアント若しくは断片を含むCD4抗原に特異的である、条項2に記載のMAIT細胞。
4.T細胞上のT細胞受容体(TCR)β鎖可変領域(Vβ)、好ましくは表1に示されるVβ領域のいずれか1つを標的とするCARを発現する、条項1~3のいずれか一項に記載のMAIT細胞。
5.CARがT細胞上の複数のT細胞受容体(TCR)β鎖可変領域(Vβ)を標的とし、好ましくは、複数のVβ領域が表1に示されるVβ領域の群から選択され、場合により、複数のTCR Vβ領域が同じ又は異なるVβ領域である、条項4に記載のMAIT細胞。
6.CARが、以下のVβ領域:Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17及びVb 20からなる群から選択されるT細胞上の1つ又は複数のTCR Vβ領域を標的とする、条項4又は条項5に記載のMAIT細胞。
7.CARが、実質的に配列番号2に示されるアミノ酸、又はそのバリアント若しくは断片を含むTCR Vβ領域に特異的である、条項4~6のいずれか一項に記載のMAIT細胞。
8.CAR-MAIT細胞が、CAR-MAIT細胞が制御可能に又は誘導可能に排除されることを可能にする1つ又は複数のコード配列を含む、条項1~7のいずれか一項に記載のMAIT細胞。
9.1つ又は複数のコード配列が上皮成長因子受容体(EGFR)又は切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)をコードする、条項8に記載のMAIT細胞。
10.1つ又は複数のコード配列が誘導性カスパーゼ-9(iC9)をコードする、条項8又は9に記載のMAIT細胞。
11.磁気活性化細胞選別(MACS)及び/又は蛍光活性化細胞選別(FACS)、より好ましくはMACS及びFACSの両方によってヒト末梢血単球細胞(PBMC)から単離される、条項1~10のいずれか一項に記載のMAIT細胞。
12.抗CD4キメラ抗原受容体(CAR)又は抗T細胞受容体(TCR)V-β CARのいずれかをコードする、第1のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸構築物。
13.プロモータがPGKプロモータであり、場合により、プロモータが、実質的に配列番号3に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、条項12に記載の構築物。
14.第1のコード配列が抗CD4キメラ抗原受容体(CAR)をコードし、場合によりCARが、実質的に配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むCD4抗原、又はそのバリアント若しくは断片に特異的である、条項12又は13に記載の構築物。
15.
(i)第1のコード配列は、実質的に配列番号6に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、
(ii)第1のコード配列が、実質的に配列番号7に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み、
(iii)第1のコード配列は、実質的に配列番号8に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び/又は
(iv)第1のコード配列は、実質的に配列番号9に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、
条項14に記載の構築物。
(i)第1のコード配列は、実質的に配列番号6に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、
(ii)第1のコード配列が、実質的に配列番号7に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み、
(iii)第1のコード配列は、実質的に配列番号8に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び/又は
(iv)第1のコード配列は、実質的に配列番号9に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、
条項14に記載の構築物。
16.第1のコード配列が、抗T細胞受容体(TCR)V-β領域CAR、場合により表1に列挙されるVβ領域のいずれかをコードする、条項12又は13に記載の構築物。
17.第1のコード配列が複数のT細胞受容体(TCR)β鎖可変領域(Vβ)CARをコードし、好ましくは複数のVβ領域が表1に示されるVβ領域の群から選択される、条項16に記載の構築物。
18.以下のVβ領域:Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17、及びVb 20からなる群から選択されるT細胞上の1つ又は複数のTCR Vβ領域を標的とする少なくとも1つのCARをコードするコード配列を含み、場合により以下のVβ領域:Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17、及びVb 20からなる群から選択されるT細胞上の少なくとも2つ又は3つのTCR Vβ領域を標的とする少なくとも1つのCARをコードするコード配列を含む、条項16又は17に記載の構築物。
19.CARが、実質的に配列番号2に示されるアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含むTCR Vβ領域(好ましくは、TCR-Vβ7.1鎖)に特異的である、条項16~18のいずれか一項に記載の構築物。
20.
(i)第1のコード配列は、実質的に配列番号12に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、
(ii)第1のコード配列が、実質的に配列番号13に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み、
(iii)第1のコード配列は、実質的に配列番号34に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び/又は
(iv)第1のコード配列は、実質的に配列番号35に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、
条項16~19のいずれか一項に記載の構築物。
(i)第1のコード配列は、実質的に配列番号12に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、
(ii)第1のコード配列が、実質的に配列番号13に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み、
(iii)第1のコード配列は、実質的に配列番号34に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び/又は
(iv)第1のコード配列は、実質的に配列番号35に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、
条項16~19のいずれか一項に記載の構築物。
21.CD8aヒンジ及び膜貫通(TM)構造ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、配列番号14に実質的に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び/又は配列番号15に実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、条項12~20のいずれか一項に記載の構築物。
22.CD28のシグナル伝達ドメイン、4-1BBのシグナル伝達ドメイン及び/又はCD3ζ鎖、より好ましくはCD28のシグナル伝達ドメイン、4-1BBのシグナル伝達ドメイン及びCD3ζ鎖を含む、細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、条項12~21のいずれか一項に記載の構築物。
23.
(i)構築物が、実質的に配列番号16に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、
(ii)構築物が、実質的に配列番号17に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み、
(iii)構築物が、実質的に配列番号18に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
(i)構築物が、実質的に配列番号16に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、
(ii)構築物が、実質的に配列番号17に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み、
(iii)構築物が、実質的に配列番号18に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
(iv)構築物が、実質的に配列番号19に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み、
(v)構築物が、実質的に配列番号20に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、並びに/あるいは
(vi)構築物が、実質的に配列番号21に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、
条項22に記載の構築物。
(v)構築物が、実質的に配列番号20に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、並びに/あるいは
(vi)構築物が、実質的に配列番号21に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、
条項22に記載の構築物。
24.核酸構築物が、少なくとも1つの自殺タンパク質、より好ましくは少なくとも2つの自殺タンパク質をコードする第2のコード配列を含む、条項12~23のいずれか一項に記載の構築物。
25.第2のコード配列が、(i)上皮成長因子受容体(EGFR)若しくは切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)、及び/又は(ii)誘導性カスパーゼ-9(iC9)をコードする、条項24に記載の構築物。
26.(i)構築物は、実質的に配列番号22に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、実質的に配列番号23に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み、並びに/あるいは(ii)構築物は、配列番号24に実質的に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、構築物は、配列番号25に実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、条項25に記載の構築物。
27.実質的に配列番号29に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、実質的に配列番号30に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、条項12から26のいずれか一項に記載の構築物。
28.実質的に配列番号31に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、実質的に配列番号32に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、条項12から26のいずれか一項に記載の構築物。
29.場合により、実質的に配列番号33若しくは36に示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、条項12~28のいずれか一項に記載の核酸構築物をコードする発現ベクター。
30.MAIT細胞を単離する方法であって、
(i)末梢血単球細胞(PBMC)を提供することと、
(ii)PBMCを磁気活性化細胞選別(MACS)及び/又は蛍光活性化細胞選別(FACS)に供して、そこからMAIT細胞を単離することと、
を含む、MAIT細胞を単離する方法。
(i)末梢血単球細胞(PBMC)を提供することと、
(ii)PBMCを磁気活性化細胞選別(MACS)及び/又は蛍光活性化細胞選別(FACS)に供して、そこからMAIT細胞を単離することと、
を含む、MAIT細胞を単離する方法。
31.CAR-MAIT細胞を作製する方法であって、
(i)末梢血単球細胞(PBMC)を提供することと、
(ii)PBMCをMACS及び/又はFACSに供して、そこからMAIT細胞を単離することと、
(iii)単離されたMAIT細胞を、場合により抗CD3抗体及び/又は抗CD28抗体と接触させることによって、活性化することと、
(iv)活性化されたMAIT細胞を、CARをコードする核酸で形質導入し、それにより、CAR-MAIT細胞を作製することと、
を含む、CAR-MAIT細胞を作製する方法。
(i)末梢血単球細胞(PBMC)を提供することと、
(ii)PBMCをMACS及び/又はFACSに供して、そこからMAIT細胞を単離することと、
(iii)単離されたMAIT細胞を、場合により抗CD3抗体及び/又は抗CD28抗体と接触させることによって、活性化することと、
(iv)活性化されたMAIT細胞を、CARをコードする核酸で形質導入し、それにより、CAR-MAIT細胞を作製することと、
を含む、CAR-MAIT細胞を作製する方法。
32.方法が、PBMCをMACS及びFACSの両方に供してそこからMAIT細胞を単離することを含み、場合によりPBMCをMACSに供し、引き続いてFACSに供する、条項30又は31に記載の方法。
33.単離されたMAIT細胞が抗CD3抗体及び抗CD28抗体で活性化される、条項30~32のいずれか一項に記載の方法。
34.工程(iv)が、CARをコードする核酸でMAIT細胞をウイルス的又はレトロウイルス的に形質導入することを含み、好ましくは、核酸が、(i)CD4抗原、又は(ii)T細胞上の少なくとも1つ若しくは複数のTCR Vβ領域、好ましくは表1に示される1つ若しくは複数のTCR Vβ領域、又は以下のVβ領域:Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17、及びVb 20からなる群から選択されるT細胞上の1つ若しくは複数のTCR Vβ領域を標的とするCARをコードする、条項31~33のいずれか一項に記載の方法。
35.MAIT細胞が、請求項12~28のいずれか一項に記載の核酸構築物又は請求項29に記載の発現ベクターで形質導入される、条項30~43のいずれか一項に記載の方法。
36.方法が、工程(iv)の後の後続の工程においてCAR-MAIT細胞を拡大させることを含む、条項30~35のいずれか一項に記載の方法。
37.条項30~36のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、又は得ることができるCAR-MAIT細胞。
38.条項1~11又は37のいずれか一項に記載のMAIT細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬組成物。
39.治療に使用するための、条項1~11若しくは37のいずれか一項に記載のMAIT細胞、又は条項38に記載の医薬組成物。
40.(i)免疫療法における、(ii)癌を治療、予防若しくは改善するための、(ii)微生物感染症を治療、予防若しくは改善するための、又は(iv)自己免疫疾患を治療、予防若しくは改善するための、使用のための、条項1~11又は37のいずれか一項に記載のMAIT細胞又は条項38に記載の医薬組成物。
41.T細胞悪性腫瘍、場合により固形腫瘍又は液体腫瘍を治療、予防又は改善するのに使用するための、条項39又は条項40のいずれか一項に記載の使用のための、条項1~11若しくは条項37のいずれか一項に記載のMAIT細胞、又は38項に記載の医薬組成物。
42.T細胞悪性腫瘍が末梢T細胞リンパ腫(PTCL)又は皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)である、条項41に従って使用するための、条項1~11又は37のいずれか一項に記載のMAIT細胞、又は条項38に記載の医薬組成物。
43.(i)PTCLが、成人T細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病(ATL);腸疾患関連リンパ腫;肝脾リンパ腫;皮下脂漏様リンパ腫(SPTCL);前駆T細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病;及び血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)からなる群から選択されるPTCLサブタイプであり、
(ii)CTCLが、菌状息肉症(MF);セザリー症候群(SS);及びCD4+小中多形性T細胞リンパ増殖性障害からなる群から選択されるCTCLサブタイプである、
条項41に記載の使用のための、条項1~11、又は37のいずれか一項に記載のMAIT細胞又は条項38に記載の医薬組成物。
(ii)CTCLが、菌状息肉症(MF);セザリー症候群(SS);及びCD4+小中多形性T細胞リンパ増殖性障害からなる群から選択されるCTCLサブタイプである、
条項41に記載の使用のための、条項1~11、又は37のいずれか一項に記載のMAIT細胞又は条項38に記載の医薬組成物。
44.ウイルス(例えば、HIV、HBV、HTLV、EBV、HPV)、細菌(例えばTB)若しくは真菌感染症を治療、予防若しくは改善するため、又は自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチ若しくは重症筋無力症を治療、予防若しくは改善するための、条項40~43のいずれか一項に記載の使用のための、条項1~11若しくは37のいずれか一項に記載のMAIT細胞、又は条項38に記載の医薬組成物。
45.使用が、自殺タンパク質をコードする配列を引き起こすことを含み、場合により方法が、抗EGFR抗体及び/又はカスパーゼ誘導性薬物(CID)を被験体に投与することを含む、条項40~44のいずれか一項に記載の使用のための、条項1~11若しくは37のいずれか一項に記載のMAIT細胞、又は条項38に記載の医薬組成物。
46.条項38に記載の医薬組成物を製造するためのプロセスであって、治療有効量の条項1-1又は条項37のいずれか一項に記載のMAIT細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを組み合わせることを含む、プロセス。
Claims (39)
- MAIT細胞を単離する方法であって、
(i)末梢血単球細胞(PBMC)を提供することと、
(ii)前記PBMCを磁気活性化細胞選別(MACS)及び/又は蛍光活性化細胞選別(FACS)に供して、そこからMAIT細胞を単離することと、
を含む、MAIT細胞を単離する方法。 - CAR-MAIT細胞を作製する方法であって、
(i)末梢血単球細胞(PBMC)を提供することと、
(ii)前記PBMCをMACS及び/又はFACSに供して、そこからMAIT細胞を単離することと、
(iii)前記単離されたMAIT細胞を、場合により抗CD3抗体及び/又は抗CD28抗体と接触させることによって、活性化することと、
(iv)前記活性化されたMAIT細胞を、CARをコードする核酸で形質導入し、それにより、CAR-MAIT細胞を作製することと、
を含む、CAR-MAIT細胞を作製する方法。 - MACS及び/又はFACSに供される前に前記PBMCを刺激することを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記刺激する工程が、前記PBMCを、(a)MR1/5-OP-RU又は5-OP-RUのいずれかを含む抗原、及び/又は(b)サイトカインと接触させることを含み、好ましくは、前記刺激する工程が、前記PBMCを(a)MR1/5-OP-RU又は5-OP-RUのいずれかを含む抗原、及び(b)サイトカインと接触させることを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記サイトカインがインターロイキンである、請求項4に記載の方法。
- 前記サイトカインが、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18及びIL-23、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される1つ又は複数のインターロイキンである、請求項4又は5に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のインターロイキンが、(i)IL-2;(ii)IL-12及びIL-18;(iii)IL-2、IL-12及びIL-18;(iv)IL-12、IL-18及びIL-23;(v)IL-2、IL-12、IL-18及びIL-23、又は(vi)IL-7、IL-15、IL-12及びIL-18を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のインターロイキンが、IL-12、IL-18及びIL-23の組合せを含む、請求項6又は7に記載の方法。
- 前記方法が、前記PBMCをMACS及びFACSの両方に供して、そこから前記MAIT細胞を単離することを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PBMCが、MACS、続いてFACSに供される、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離されたMAIT細胞が抗CD3抗体により活性化される、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離されたMAIT細胞が抗CD28抗体により活性化される、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(iv)が、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸で前記MAIT細胞を形質導入することを含み、場合により、前記形質導入が、ウイルス又はレトロウイルスを用いて行われる、請求項2~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸が、T細胞上のCD4抗原を標的とするCARをコードする、請求項13に記載の方法。
- 前記核酸が、T細胞上の少なくとも1つ又は複数のTCR Vβ領域を標的とするCARをコードする、請求項13に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のTCR Vβ領域が、(i)表1に示され、及び/又は(ii)以下のVβ領域:Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17、及びVb 20からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 工程(iv)の後の後続の工程において前記CAR-MAIT細胞を拡大させることを含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CAR-MAIT細胞を拡大させる工程が、形質導入の1日後又は2日後に、前記形質導入されたCAR-MAIT細胞を回収することを含み、場合により、回収された細胞が、インターロイキン、好ましくはIL-2と接触させられ、場合により、前記インターロイキンがR10培地中に存在する、請求項17に記載の方法。
- 請求項1~18のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、又は得ることができるCAR-MAIT細胞。
- キメラ抗原受容体(CAR)を発現する粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞。
- 前記CAR-MAIT細胞が、T細胞上のCD4抗原を標的とするCARを発現し、場合により、前記CARが、実質的に配列番号1に示されるアミノ酸を含むCD4抗原、又はそのバリアント若しくは断片に特異的である、請求項19又は請求項20に記載のMAIT細胞。
- 前記CAR-MAIT細胞が、T細胞上のT細胞受容体(TCR)β鎖可変領域(Vβ)、場合により(i)表1に示されるVβ領域のいずれか1つ、又は(ii)T細胞上の複数のT細胞受容体(TCR)β鎖可変領域(Vβ)を標的とするCARを発現し、場合により、前記複数のVβ領域が、表1に示されるVβ領域の群から選択され、場合により、前記複数のTCR Vβ領域が、同じ又は異なるVβ領域である、請求項19又は請求項20に記載のMAIT細胞。
- 前記CARが、以下のVβ領域:Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17及びVb 20からなる群から選択されるT細胞上の1つ又は複数のTCR Vβ領域を標的とし、場合により、前記CARは、配列番号2に実質的に示されるアミノ酸を含むTCR Vβ領域、又はそのバリアント若しくは断片に特異的である、請求項22に記載のMAIT細胞。
- 前記CAR-MAIT細胞が、前記CAR-MAIT細胞が制御可能に又は誘導可能に排除されることを可能にする1つ又は複数のコード配列を含む、請求項1~23のいずれか一項に記載のMAIT細胞。
- 前記1つ又は複数のコード配列が上皮成長因子受容体(EGFR)又は切断型上皮成長因子受容体(tEGFR)をコードし、場合により、前記1つ又は複数のコード配列が、実質的に配列番号22に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び/又は実質的に配列番号23に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項24に記載のMAIT細胞。
- 前記1つ又は複数のコード配列が誘導性カスパーゼ-9(iC9)をコードし、場合により、前記1つ又は複数のコード配列が、実質的に配列番号24に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び/又は実質的に配列番号25に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項24又は25に記載のMAIT細胞。
- 請求項19~26のいずれか一項に記載のMAIT細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 治療に使用するための、請求項19~26のいずれか一項に記載のMAIT細胞、又は請求項27に記載の医薬組成物。
- (i)免疫療法における、(ii)癌を治療、予防若しくは改善するための、(ii)微生物感染症を治療、予防若しくは改善するための、又は(iv)自己免疫疾患を治療、予防若しくは改善するための、使用のための、請求項19~26のいずれか一項に記載のMAIT細胞又は請求項27に記載の医薬組成物。
- T細胞悪性腫瘍、場合により固形腫瘍又は液体腫瘍を治療、予防又は改善するのに使用するための、請求項28又は請求項29に記載の使用のための、請求項19~26のいずれか一項に記載のMAIT細胞、又は請求項27に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞悪性腫瘍が、末梢T細胞リンパ腫(PTCL)又は皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)である、請求項30に記載の使用のための、請求項19~26のいずれか一項に記載のMAIT細胞、又は請求項27に記載の医薬組成物。
- (i)前記PTCLが、成人T細胞急性リンパ芽球性リンパ腫若しくは白血病(ATL);腸疾患関連リンパ腫;肝脾リンパ腫;皮下脂漏様リンパ腫(SPTCL);前駆T細胞急性リンパ芽球性リンパ腫若しくは白血病;及び血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)からなる群から選択されるPTCLサブタイプであり、並びに/又は
(ii)前記CTCLが、菌状息肉症(MF);セザリー症候群(SS);及びCD4+小中多形性T細胞リンパ増殖性障害からなる群から選択されるCTCLサブタイプである、
請求項31に記載の使用のための、請求項19~26のいずれか一項に記載のMAIT細胞又は請求項27に記載の医薬組成物。 - (i)ウイルス感染症、場合によりHIV、HBV、HTLV、EBV若しくはHPV、(ii)細菌感染症、場合によりTB、又は(iii)真菌感染症を治療、予防又は改善するための、あるいは自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は重症筋無力症を治療、予防又は改善するための、請求項29に記載の使用のための、請求項19~26のいずれか一項に記載のMAIT細胞、又は請求項27に記載の医薬組成物。
- 前記使用が、自殺タンパク質をコードする配列を引き起こすことを含み、場合により、前記方法が、抗EGFR抗体及び/又はカスパーゼ誘導性薬物(CID)を前記被験体に投与することを含む、請求項28~33のいずれか一項に記載の使用のための、請求項19~26のいずれか一項に記載のMAIT細胞又は請求項27に記載の医薬組成物。
- 請求項27に記載の医薬組成物を製造するためのプロセスであって、治療有効量の請求項19~26のいずれか一項に記載のMAIT細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを組み合わせることを含む、プロセス。
- PBMCの培養物中のMAIT細胞を刺激する方法であって、前記方法が、PMBCの培養物を、(a)MR1/5-OP-RU若しくは5-OP-RUを含む抗原、並びに/又は(b)IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18及びIL-23、若しくはそれらの任意の組合せからなる群から選択される1つ又は複数のインターロイキンと接触させることを含む、方法。
- 前記PMBCの培養物を、(a)MR1/5-OP-RU又は5-OP-RUを含む抗原、並びに(b)IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18及びIL-23又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される1つ又は複数のインターロイキンと接触させることを含む、請求項36に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のインターロイキンが、IL-12、IL-18及び/又はIL-23である、請求項36又は37に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のインターロイキンがIL-12、IL-18及びIL-23である、請求項38に記載の方法。
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