CN115087661A - Vcx/y肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了肿瘤抗原VCX/Y特异性肽和工程改造的VCX/Y特异性T细胞受体。本文还提供了用于产生VCX/Y特异性免疫细胞的方法及其用于治疗癌症的用途。此外，VCX/Y特异性肽可用作疫苗。

Description

VCX/Y肽及其用途
本申请要求2019年10月3日提交的美国临时专利申请序列号62/910,128的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。
发明背景
1.技术领域
本公开一般涉及免疫学和医学领域。更具体地，它涉及肿瘤抗原肽及其用于治疗癌症的用途。
2.相关技术描述
基于T细胞的疗法已显示出作为治疗许多癌症的方法的显著前景；不幸的是，这种方法也受到缺乏针对常见癌症的免疫原性抗原靶标和对非癌组织的潜在毒性的阻碍。这些基于T细胞的疗法可以包括ACT(过继细胞转移)和疫苗接种方法。ACT通常涉及将大量自体激活的肿瘤特异性T细胞注入患者体内，例如用于治疗癌症。ACT在黑色素瘤患者中产生了治疗性临床应答(Yee 2002；Dudley 2002；Yee 2014)。一般来说，要产生有效的抗肿瘤T细胞应答，通常需要以下三个步骤：启动和激活抗原特异性T细胞，将激活的T细胞迁移到肿瘤部位，以及通过抗原特异性T细胞识别和杀死肿瘤。靶抗原的选择对于诱导有效的抗原特异性T细胞很重要。
虽然已经针对黑色素瘤和少数其他实体瘤恶性肿瘤鉴定了几种肿瘤相关抗原，但对于胰腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌和头颈癌，几乎没有免疫原性靶标。有必要对这些常见且难以治疗的恶性肿瘤的新表位和靶抗原进行鉴定和验证。
发明概述
在至少一些实施方案中，本公开提供了涉及来自可变电荷X-连接/Y-连接(VCX/Y)家族(例如，VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B和VCY)的肽的方法和组合物，包括可用于过继性T细胞疗法的肽。在一些实施方案中，肽可用于体外扩增VCX/Y特异性T细胞，将其施用于哺乳动物受试者，例如人类患者，以治疗疾病(例如，癌症)。在进一步的实施方案中，T细胞经基因工程改造以表达对VCX/Y具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。在其他实施方案中，可将肽施用于哺乳动物受试者以诱导免疫应答或针对肽对受试者进行疫苗接种，并且此类免疫应答可用于治疗或减少患疾病或从疾病复发的机会，所述疾病例如癌症。
在一个实施方案中，本公开提供了一种长度为35个氨基酸或更短的分离的VCX/Y(例如，VCX3A)肽，其包含与SEQ ID NO:1(SEVEEPLSQ)具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，肽包含与SEQ ID NO：1具有至少91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，肽能够诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
在某些方面，肽的长度为30个氨基酸或更短，例如长度为29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个氨基酸。
在另一个实施方案中，提供了包含实施方案的分离的VCX/Y肽和药用载体的药物组合物。在一些方面，药物组合物被配制用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射，仅作为示例。在某些方面，肽包含在脂质体、纳米颗粒(例如，含脂质的纳米颗粒)中或基于脂质的载体中。在一些方面，药物制剂被配制成用于注射或作为鼻喷雾剂用于吸入。
另一个实施方案提供了编码实施方案的VCX/Y肽的分离的核酸。本文还提供了包含连续序列的载体，所述连续序列由编码VCX/Y肽的核酸组成或包含编码VCX/Y肽的核酸。
在又一个实施方案中，提供了在受试者中促进免疫应答的方法，包括向受试者施用有效量的实施方案的VCX/Y肽，其中肽在受试者中诱导抗原特异性T细胞。在一些方面，例如，受试者被诊断患有癌症或处于癌症风险中，包括处于高于一般人群的风险中。在某些方面，癌症是胰腺癌、卵巢癌、胃癌或乳腺癌。在特定方面，受试者是人。
在另外的方面，方法还包括施用至少第二抗癌疗法。在一些方面，第二抗癌疗法选自由化学疗法、放射疗法、免疫疗法或手术组成的组。在特定方面，免疫疗法是免疫检查点抑制剂。在一个具体方面，免疫检查点抑制剂是抗PD1单克隆抗体。
另一个实施方案提供了一种产生VCX/Y特异性T细胞的方法，包括获得T细胞的起始群体，并使T细胞的起始群体与实施方案的VCX/Y肽接触，从而产生VCX/Y-特异性T细胞。在一些方面，接触进一步定义为将T细胞的起始群体与抗原呈递细胞(APC)共培养，其中APC在其表面上呈递实施方案的VCX/Y肽。在特定方面，APC是树突细胞。在一些方面，T细胞的起始群体是CD8+T细胞。在某些方面，T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在一些方面，获得包括从外周血单核细胞(PBMC)中分离T细胞的起始群体。本文还提供了包含通过本文方法产生的VCX/Y特异性T细胞的药物组合物。
更进一步的实施方案提供了对VCX/Y具有抗原特异性的抗原受体，例如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。另一个实施方案提供了经工程改造以表达VCX/Y特异性TCR和/或VCX/Y特异性CAR的T细胞。
另一个实施方案提供了一种治疗受试者癌症的方法，包括向受试者施用有效量的实施方案的VCX/Y特异性T细胞。在一些方面，癌症是胸腺瘤、膀胱癌、子宫癌、黑色素瘤、肉瘤、宫颈癌或头颈癌。在特定方面，受试者是人。在一些方面，细胞对于受体个体是自体的或同种异体的。在一些方面，确定受试者有表达VCX/Y的癌细胞，尽管在其他情况下不知道受试者是否有表达VCX/Y的癌细胞。
在一些方面，宿主细胞是T细胞、外周血淋巴细胞、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、间充质干细胞(MSC)、诱导多能干细胞(iPS)或其混合物。在某些方面，宿主细胞是从脐带分离的。在一些方面，宿主细胞对于受体个体是自体的或同种异体的。在某些方面，T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞或其混合物。
在某些方面，方法进一步包括在施用抗原特异性T细胞之前对受试者的淋巴清除。在一些方面，淋巴清除包括施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。
在一些方面，方法进一步包括施用至少第二治疗剂。在某些方面，至少第二治疗剂包括化学疗法、免疫疗法、手术、放射疗法和/或生物疗法。在特定方面，免疫疗法是一种或多种免疫检查点抑制剂。在一些具体方面，免疫检查点抑制剂是抗PD1单克隆抗体。
在某些方面，静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌内、经内窥镜、病灶内、经皮、皮下、区域地或通过直接注射或灌注施用VCX/Y特异性T细胞和/或至少第二治疗剂。
在一些方面，确定受试者有表达VCX/Y家族蛋白的癌细胞。在特定方面，蛋白质是VCX3A。
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得显而易见。然而，应该理解的是，虽然显示了本发明的优选实施方案，但详细描述和具体实施例仅作为说明给出，因为从这个详细的描述中，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域的技术人员来说将变得显而易见。
附图的简要说明
以下附图形成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步展示本公开的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合本文呈现的说明性实施方案的描述，可以更好地理解本公开内容的主题。
图1：VCX54 TCR-T的识别靶肽的重叠肽库筛选，作为一个示例。整个序列是SEQ IDNO：7。
图2：VCX118肽交叉反应检测。
图3：肽滴定杀伤测定法。
图4：VCX118肽HLA-A2结合测定法。在三个分开的条形分组中，从左到右的条形代表100ug、30ug和10ug。
图5：VCX54 TCR-T识别不同长度的包含VCX118的较长肽。
说明性实施方案的描述
对于患有许多不同癌症类型的个体，基于T细胞的免疫疗法代表了一种具有已证实功效的有前途的方法。然而，针对大多数癌症类型的抗原特异性T细胞疗法是不可行的，因为缺乏目前已知的肿瘤相关抗原，这阻碍了它们的临床开发。本公开内容中的研究鉴定了在所有VCX/Y家族成员，包括VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B和VCY中发现的新的VCX/Y家族衍生肽表位。使用肽表位，从患者外周血单核细胞(PBMC)产生抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL),其识别同种异体肿瘤细胞系上的内源性呈递的抗原，导致肿瘤细胞杀伤。因此，这些抗原特异性CTL可用于靶向实体癌(例如胰腺癌、卵巢癌、胃癌和乳腺癌)。
因此，本公开内容提供了肿瘤抗原特异性肽，例如肿瘤抗原VCX/Y，用作免疫疗法，或与疗法相关，用于治疗癌症。本文公开了示例性VCX/Y肽，VCX118(例如包含SEQ ID NO:1)，其序列与所有VCX/Y家族成员，包括VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B和VCY共享。例如，肿瘤抗原特异性肽可与T细胞群体接触或用于刺激T细胞群体以诱导识别或结合肿瘤抗原特异性肽的T细胞的增殖。在其他实施方案中，本公开内容的VCX/Y特异性肽可以施用于受试者，例如人类患者，以增强受试者针对癌症的免疫应答。
VCX/Y特异性肽可以包括在主动免疫疗法(例如，癌症疫苗)或被动免疫疗法(例如，过继免疫疗法)中。主动免疫疗法包括用一种或多种纯化的肿瘤抗原或者一种或多种免疫显性VCX/Y特异性肽(天然的或修饰的)来免疫受试者；备选地，可以将用VCX/Y特异性肽脉冲(或用编码肿瘤抗原的基因转染)的抗原呈递细胞施用于受试者。VCX/Y-特异性肽可以被修饰或包含一种或多种突变，例如取代突变，包括例如保守突变。被动免疫疗法包括过继免疫疗法。过继免疫疗法通常涉及将细胞施用于受试者，其中细胞(例如，细胞毒性T细胞)已在体外对VCX/Y特异性肽进行致敏(参见，例如，US 7910109)。
特别地，患者自身的VCX/Y特异性T细胞可以在短时间内(例如6至8周)离体产生用于有效的基于免疫的治疗。T细胞可以从自外周血中分离的自体或同种异体T细胞(例如CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞和/或Tregs)分离和扩增，例如使用四聚体引导分选和快速扩增方案(REP)。接下来，可以将肽或相应的编码多核苷酸加载到树突细胞、LCL、PBMC和/或人工抗原呈递细胞(aAPC)，然后与T细胞共培养通过几轮刺激以产生抗原特异性CTL细胞系或克隆。此外，通过控制免疫调节参数，可以增强这些扩增的抗原特异性T细胞在体内的效应功能和长期持久性。这些自体CTL细胞可用于VCX/Y阳性癌症患者的过继免疫疗法。此外，可从本公开内容产生的其他VCX/Y特异性细胞包括自体或同种异体NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、间充质干细胞(MSC)和/或诱导多能干(iPS)细胞。这些细胞可以从血液、骨髓、淋巴、脐带和/或淋巴器官中分离出来。
I.定义
按照长期存在的专利法惯例，在本说明书中使用的词语“一个”和“一种”与词语包括一起使用(包括权利要求)时，表示“一个/种或多个/种”。如在说明书和权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种核酸”包括多种核酸，包括其混合物。本公开内容的一些实施方案可以由或基本上由本公开内容的一个或多个元件、方法步骤和/或方法组成。预期本文描述的任何方法或组合物可以相对于本文描述的任何其他方法或组合物来实施，并且可以组合不同的实施方案。
在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”、“包括”和“包括在内”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或元件或者步骤或元件的组，而不是排除任何其他步骤或元件或者步骤或元件的组。“由……组成”是指包括并限于“由……组成”这一短语之后的任何内容。因此，短语“由...组成”表示列出的元件是必需的或强制性的，并且没有其他元件可存在。“基本上由……组成”是指包括在该短语之后列出的任何元件，并且限于不干扰或有助于在公开内容中为列出的元件指定的活性或作用的其他元件。因此，短语“基本上由……组成”表示所列元件是必需的或强制性的，但没有其他元件是可选的，可能存在也可能不存在，这取决于它们是否影响所列元件的活性或作用。
如本文所用，术语“或”和“和/或”用于描述多个组件的组合或相互排斥。例如，“x、y和/或z”可以是指单独“x”、单独“y”、单独“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”，“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别考虑到，x、y或z可以被特别地排除在实施方案之外。
在整个本申请中，术语“约”用于指示值包括用于确定该值的设备、方法的固有误差变化或研究对象之间存在的变化。
本说明书通篇提及“一个实施方案”、“实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“附加实施方案”或“进一步实施方案”或其组合表示结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书的各个地方出现的前述短语不一定都指同一实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。
“治疗”和“治疗”是指为了获得疾病或健康相关病况的治疗益处的目的，向受试者施用或应用治疗剂或对受试者执行程序或方式。例如，治疗可以包括施用T细胞疗法和/或肽。
“受试者”和“患者”和“个体”是指人类或非人类，例如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特定实施方案中，受试者是任何性别或年龄或种族的人。
如贯穿本申请所使用的术语“治疗益处”或“治疗有效”是指直接或间接促进或增强受试者在该病况的医学治疗方面的健康的任何事物。这包括但不限于降低疾病的一种或多种体征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可以包括例如减小一种或多种肿瘤的大小、减小一种或多种肿瘤的侵袭性、降低癌症的生长速率、降低肿瘤负荷或者预防转移或转移扩大。癌症的治疗还可以指延长患有癌症的受试者的生存期。
“抗癌”剂能够对受试者中的癌细胞/肿瘤产生负面影响，例如，通过促进癌细胞的杀伤、诱导癌细胞的凋亡、降低癌细胞的生长速率、降低转移的发生率或数量，减小肿瘤大小，抑制肿瘤生长，减少对肿瘤或癌细胞的血液供应，促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答，预防或抑制癌症的进展，或者增加患有癌症的受试者的寿命。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性。
如本文所用，就特定组分而言，“基本上不含”在本文中用于表示没有任何特定组分被有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量因此远低于0.05％，优选地低于0.01％。最优选的是一种组合物，其中用标准分析方法不能检测到特定组分的量。
短语“药学或药理学上可接受的或药学上可接受的”是指当适当地施用于动物例如人时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，本领域技术人员将知道包含抗体或附加活性成分的药物组合物的制备。此外，对于动物(例如人)施用，应理解制备物应符合FDA生物标准办公室要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有水性溶剂(例如，水、醇/水溶液、盐溶液、肠胃外媒介物，例如氯化钠、林格氏葡萄糖等)、非水性溶剂(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯)、分散介质、涂料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、流体和营养补充剂，例如材料及其组合是本领域普通技术人员已知的。根据众所周知的参数调整药物组合物中各种组分的pH和准确浓度。
术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于受试者的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的治疗组合物，经计算以产生上文讨论的与其施用相关的所需应答，即，合适的途径和治疗方案。根据治疗次数和单位剂量，待施用的量取决于所需的效果。施用给患者或受试者的本发明实施方案的组合物的实际剂量可以通过身体和生理因素，例如受试者的体重、年龄、健康和性别，所治疗的疾病类型，疾病渗透的程度，先前或同时的治疗干预，患者的特发性疾病，施用的途径以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性来确定。例如，每次施用的剂量还可以包括从约1μg/kg/体重至约1000mg/kg/体重(该范围包括介入剂量(intervening dose))或更多，以及可由此得出的任何范围。在可从本文所列数字导出的范围的非限制性实例中，可以施用约5μg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重的范围等。无论如何，负责施用的从业者将确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量(对于个体受试者)。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞输注的剂量可包含约1亿至约300亿个细胞，例如100、150或200亿个细胞。
术语“免疫检查点”是指免疫系统中的分子，例如蛋白质，其向其组分提供信号以平衡免疫反应。已知的免疫检查点蛋白包括CTLA-4、PD1及其配体PD-L1和PD-L2，以及另外的LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR。涉及LAG3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3和KIR的途径在本领域中被认为构成类似于CTLA-4和PD-1依赖途径的免疫检查点途径(参见例如Pardoll，2012；Mellman等人，2011。
“免疫检查点抑制剂”是指抑制免疫检查点蛋白功能的任何化合物。抑制包括功能降低和完全阻断。特别地，免疫检查点蛋白是人免疫检查点蛋白。因此，免疫检查点蛋白抑制剂特别地是人免疫检查点蛋白的抑制剂。
如本文所用，“保护性免疫应答”是指哺乳动物宿主的免疫系统对癌症的应答。保护性免疫应答可为癌症的治疗提供治疗效果，例如减小肿瘤大小或增加存活率。
如本文所用，术语“抗原”是能够被抗体或T细胞受体结合的分子。抗原通常可用于诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，其导致B和/或T淋巴细胞产生。
术语“肿瘤相关抗原”、“肿瘤抗原”和“癌细胞抗原”在本文中可互换使用。在每种情况下，这些术语指的是由癌细胞特异性或优先表达的蛋白质、糖蛋白或碳水化合物。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体(CAR)”可以指例如人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，并且包括将人工特异性移植到特定的免疫效应细胞上的经工程改造的受体。CAR可用于将单克隆抗体的特异性赋予T细胞，从而允许产生大量特异性T细胞，例如用于过继细胞疗法。例如，在特定实施方案中，CAR将细胞的特异性引导至肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，CAR包含细胞内激活结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，其包含肿瘤相关抗原结合区。在特定方面，CAR包含源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合物，融合到CD3-zeta、跨膜结构域和一个或多个内结构域。其他CAR设计的特异性可能来自受体的配体(例如肽)或来自模式识别受体，例如Dectin。在某些情况下，可以修改抗原识别结构域的间距以减少激活诱导的细胞死亡。在某些情况下，CAR包含另外的共刺激信号传导的结构域，例如CD3ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或OX40。在某些情况下，分子可以与CAR共表达，包括共刺激分子、用于成像(例如，用于正电子发射断层扫描)的报告基因、在添加前药后有条件地消融T细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列具有一定百分比(例如，80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”或“同源性”是指，当比对时，碱基(或氨基酸)的百分比在比较两个序列时是相同的。这种比对和同源性百分比或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定，例如在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987)Supplement 30,section 7.7.18,Table 7.7.1中描述的那些。优选地，默认参数用于比对。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数。特别是，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。
II.VCX/Y肽
本公开的实施方案涉及肿瘤抗原特异性肽，例如来自VCX/Y肿瘤抗原的肽。在特定实施方案中，肿瘤抗原特异性肽具有VCX/Y肽的氨基酸序列(SEVEEPLSQ：SEQ ID NO：1)。肿瘤抗原特异性肽可以具有与SEQ ID NO：1的肽序列具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列同一性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“肽”涵盖包含7-35个氨基酸的氨基酸链，包括8-35个氨基酸残基，例如8-25个氨基酸，或7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸的长度，或任何可从其中导出的范围。例如，在一些实施方案中，本公开内容的VCX/Y肽可以包含SEQ ID NO：1的VCX118肽或由其组成或基本上由其组成。在特定实施方案中，肽是抗原性肽，并且如本文所用，“抗原性肽”是当引入脊椎动物时可刺激脊椎动物中抗体产生的肽，即，具有抗原性，并且其中抗体可以选择性地识别和/或结合抗原性肽。抗原性肽可以包含免疫反应性VCX/Y肽，并且可以包含另外的序列。另外的序列可能来自或不来自天然抗原并且可能是异源的，并且这些序列可能但不必是免疫原性的。在某些实施方案中，VCX/Y肽是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸的长度，或其中可导出的任何范围。在具体实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)是8至35个氨基酸的长度。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)是7-10、8-10、9-10、7-9、7-8或8-9个氨基酸的长度。
如本领域技术人员将理解的，MHC分子可以结合不同大小的肽，但通常不结合全长蛋白质。虽然MHC I类分子传统上被描述为与8-11个氨基酸长的肽结合，但已表明15个氨基酸长度的肽可以通过在结合位点中间凸出或延伸出MHC I类分子结合槽而结合MHC I类分子(Guo等人，1992；Burrows等人，2006；Samino等人，2006；Stryhn等人，2000；Collins等人，1994；Blanchard和Shastri，2008)。此外，最近的研究还表明，较长的肽可能更有效地被抗原呈递细胞内吞、加工和呈递(Zwaveling等人，2002；Bijker等人，2007；Melief和van derBurg，2008；Quintarelli等人,2011)。正如Zwaveling等人(2002)所证明的那样，长达35个氨基酸的肽可用于选择性结合II类MHC并且是有效的。正如技术人员立即理解的那样，天然存在的全长肿瘤抗原，例如VCX/Y，对于选择性结合II类MHC以使其被内吞并产生T细胞增殖将无用。通常，天然存在的全长肿瘤抗原蛋白不显示这些特性，并且因此对这些免疫疗法目的没有用处。
在某些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)是免疫原性的或抗原性的。如以下实施例所示，本公开内容的多种肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)可以促进T细胞的增殖。预计此类肽可用于诱导某种程度的保护性免疫。
肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)可以是重组肽、合成肽、纯化的肽、固定的肽、可检测标记的肽、包封的肽或载体表达的肽(例如，由载体中的核酸编码的肽，该载体包含可操作地连接至核酸的异源启动子)。在一些实施方案中，可以将合成的肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)施用于受试者，例如人类患者，以在受试者中诱导免疫应答。与重组表达的肽相比，合成肽可能显示出某些优势，例如降低的细菌污染的风险。肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)也可以包含在药物组合物中，例如疫苗组合物，其被配制用于施用于哺乳动物或人类受试者。
A.细胞穿透肽
在一些实施方案中，免疫疗法可以利用与细胞穿透剂例如脂质体或细胞穿透肽(CPP)缔合的本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)。用肽脉冲的抗原呈递细胞(如树突细胞)可用于增强抗肿瘤免疫(Celluzzi等人，1996；Young等人，1996)。脂质体和CPP在下文中更详细地描述。在一些实施方案中，免疫疗法可以利用编码本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)的核酸，其中核酸例如在病毒载体或非病毒载体中递送。
肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)也可以与细胞穿透肽(CPP)缔合或共价结合。可与肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)共价结合的细胞穿透肽包括例如HIV Tat、疱疹病毒VP22、果蝇触角足同源框基因产物、信号序列、融合序列或protegrin I。将肽与CPP共价结合可以延长树突细胞对肽的呈递，从而增强抗肿瘤免疫力(Wang和Wang，2002)。在一些实施方案中，本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)(例如，包含在肽或多表位串内)可以与CPP共价结合(例如，通过肽键)以生成融合蛋白。在其他实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)或编码肿瘤抗原特异性肽的核酸可以封装在脂质体中或与脂质体缔合，例如多层、囊泡或多囊脂质体，胞外囊泡或外泌体。
如本文所用，“缔合”意指物理缔合、化学缔合或两者。例如，缔合可以涉及共价键、疏水相互作用、封装、表面吸附等。
如本文所用，“细胞穿透剂”是指增强肽/多表位串向抗原呈递细胞的细胞内递送的组合物或化合物。例如，细胞穿透剂可以是一种脂质，当与肽缔合时，增强了其穿过质膜的能力。可替代地，细胞穿透剂可以是肽。细胞穿透肽(CPP)在本领域中是已知的，并且包括例如HIV的Tat蛋白(Frankel和Pabo,1988)、HSV的VP22蛋白(Elliott和O'Hare,1997)和成纤维细胞生长因子(Lin等人，1995)。
已经从果蝇触角足同源框基因(Antp)、HIV Tat和疱疹病毒VP22的第三螺旋中鉴定出细胞穿透肽(或“蛋白质转导结构域”)，所有这些都含有富含精氨酸和赖氨酸残基的带正电荷的结构域(Schwarze等人，2000；Schwarze等人，1999)。此外，源自信号序列的疏水肽已被鉴定为细胞穿透肽。(Rojas等人，1996；Rojas等人，1998；Du等人，1998)。将这些肽与标志物蛋白(如β-半乳糖苷酶)偶联已被证明可以使标志物蛋白有效内化到细胞中，并且含有这些肽的嵌合框内融合蛋白已被用于将蛋白质体外和体内递送至多种细胞类型(Drin等，2002)。这些细胞穿透肽与肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)(根据本公开)的融合可以增强多肽的细胞摄取。
在一些实施方案中，细胞摄取通过脂质例如硬脂酸酯或肉豆蔻酸酯与多肽的附着来促进。已显示脂化可增强肽进入细胞的通道。脂质部分的附着是本公开内容增加细胞摄取多肽的另一种方式。下面进一步讨论细胞摄取。
本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)可以包含在脂质体疫苗组合物中。例如，脂质体组合物可以是或包含蛋白脂质体组合物。用于生产可用于本公开内容的蛋白脂质体组合物的方法在例如Neelapu等人(2007年)和Popescu等人(2007年)中有所描述。在一些实施方案中，蛋白脂质体组合物可用于治疗黑色素瘤。
通过增强肿瘤抗原特异性多肽的摄取，可能减少治疗所需的蛋白质或肽的量。这进而可以显著降低治疗成本并增加治疗剂的供应。较低剂量还可以最小化肽的潜在免疫原性并限制毒副作用。
在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)可以与纳米颗粒缔合以形成纳米颗粒-多肽复合物。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质体或其他基于脂质的纳米颗粒，例如基于脂质的囊泡(例如，DOTAP：胆固醇囊泡)。在其他实施方案中，纳米颗粒是基于氧化铁的超顺磁性纳米颗粒。直径范围为约10至100nm的超顺磁性纳米颗粒小到足以避免被脾脏隔离，但又大到足以避免被肝脏清除。这种大小的颗粒可以穿透非常小的毛细血管，并且可以有效地分布在身体组织中。超顺磁性纳米颗粒-多肽复合物可用作MRI造影剂，以识别和跟踪那些吸收肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)的细胞。在一些实施方案中，纳米颗粒是半导体纳米晶体或半导体量子点，两者均可用于光学成像。在进一步的实施方案中，纳米颗粒可以是纳米壳，其包括在二氧化硅核上的金层。纳米壳的一个优点是可以使用标准化学方法将多肽缀合到金层上。在其他实施方案中，纳米颗粒可以是富勒烯或纳米管(Gupta等人，2005)。
肽通过肾脏从循环中快速去除并且对血清中的蛋白酶的降解敏感。通过将肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)与纳米颗粒缔合，本公开内容的纳米颗粒-多肽复合物可以防止降解和/或减少肾脏的清除。这可以增加多肽的血清半衰期，从而减少有效疗法所需的多肽剂量。此外，这可以降低治疗成本，并最小化免疫问题和疗法的毒性反应。
B.多表位串
在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)被包括或包含在多表位串中。多表位串是肽或多肽，其含有来自一个或多个抗原的多个抗原性表位连接在一起。多表位串可用于在受试者(例如人类对象)中诱导免疫应答。多表位串先前已用于靶向疟疾和其他病原体(Baraldo等人，2005；Moorthy等人，2004；Baird等人，2004)。
多表位串可以指核酸(例如，编码包括VCX/Y肽在内的多种抗原的核酸)或者肽或多肽(例如，包含包括VCX/Y肽在内的多种抗原)。
多表位串可以包括在癌症疫苗组合物中。
C.生物功能等效物
本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)可以被修饰以包含不改变它们各自的相互作用的氨基酸取代、插入和/或缺失。这种肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)的生物学功能等效物可以是具有类似或其他所需特征的分子。作为非限制性实例，某些氨基酸可以取代本文公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)中的其他氨基酸，而不会明显损失相互作用能力。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽在锚定残基处具有取代突变，例如在以下位置的一个、两个或所有位置处具有取代突变：1(P1)、2(P2)和/或9(P9)。因此考虑在序列和/或结构上被修饰，但在生物学效用或活性上未改变的本文公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)(或编码这种肽的核酸)仍然在本文公开的组合物和方法的范围内。
本领域技术人员还很好地理解，生物学功能等价肽的定义中固有的概念是在分子的定义部分内可以进行的、同时仍保持可接受水平的等效生物活性改变的数量是有限的。因此，生物功能等价肽在本文中定义为其中某些而非大部分或全部氨基酸可以被取代的那些肽。当然，可以根据本公开内容容易地制备和使用具有不同取代的多种不同肽。
本领域技术人员还知道，在某些残基被证明对肽的生物学或结构特性特别重要的情况下，例如特定表位中的残基，这些残基通常可以不被交换。这可能是本公开内容的情况，因为本文公开的肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)中的突变可能导致物种特异性的丧失，进而降低所得肽用于本公开的方法中的效用。因此，具有抗原性且包含保守氨基酸取代的肽被理解为包括在本公开内容中。保守取代最不可能明显地改变蛋白质的活性。“保守氨基酸取代”是指用化学上相似的氨基酸取代氨基酸，即用其他非极性氨基酸取代非极性氨基酸；用其他极性氨基酸取代极性氨基酸，用其他酸性氨基酸取代酸性残基等。
氨基酸取代，例如可用于修饰本文公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)的那些通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析表明，精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的大小相似；并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有大致相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；在此定义为生物学功能等价物。在一些实施方案中，突变可以增强TCR-pMHC相互作用和/或肽-MHC结合。
本公开内容还考虑了本文公开的肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)的同种型。同种型包含与本公开内容的肽相同数量和种类的氨基酸，但同种型具有不同的分子结构。本公开内容考虑的同种型是具有与如本文所述的本公开内容的肽相同性质的那些。
可以通过现有氨基酸的化学修饰或通过从头合成肽(本文公开的)将非标准氨基酸掺入蛋白质中。非标准氨基酸是指化学结构与遗传密码编码的二十种标准氨基酸不同的氨基酸。
在选择的实施方案中，本公开内容考虑了本文公开的肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)的化学衍生物。“化学衍生物”是指具有通过侧官能团反应化学衍生的一个或多个残基并保留生物活性和效用的肽。此类衍生肽包括，例如，其中游离氨基已衍生形成特定盐或通过烷基化和/或酰化、对甲苯磺酰基、苯甲氧基、叔丁基环羰基、氯乙酰基、甲酰基或乙酰基等衍生的那些。游离羧基可衍生形成有机或无机盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼，以及优选地酰胺(伯或仲)。化学衍生物可以包括那些包含二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟脯氨酸可以取代丝氨酸；和鸟氨酸可以取代赖氨酸。
应注意，所有氨基酸残基序列在本文中由其左右方向为氨基末端至羧基末端的常规方向的分子式表示。此外，应注意，氨基酸残基序列开头或结尾处的破折号表示与一个或多个氨基酸残基的另一序列的肽键。本文所述的氨基酸优选为“L”异构体形式。然而，“D”异构形式的残基可以被任何L-氨基酸残基取代，只要蛋白质保留本文所述的所需功能特性。
D.编码肿瘤抗原特异性肽的核酸
在一个方面，本公开内容提供了编码分离的抗原特异性肽的核酸，其包含具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性SEQ IDNO：1，或肽与SEQ ID NO：1相比可具有1、2、3或4个点突变(例如，取代突变)。如上所述，这样的肿瘤抗原特异性肽的长度可以是例如8至35个氨基酸，或其中可衍生的任何范围。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽对应于肿瘤抗原蛋白，例如VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B或VCY(例如，VCX3A；GenBank登录号：AAI26903.1)的一部分。术语“核酸”旨在包括DNA和RNA并且可以是双链的或单链的。
本公开内容的一些实施方案提供重组产生的肿瘤抗原特异性肽(例如，VCX/Y肽)。因此，编码肿瘤抗原特异性肽的核酸可以可操作地连接至表达载体，并且使用分子生物学领域中众所周知的方法在适当的表达系统中产生肽。可将编码本文公开的肿瘤抗原特异性肽的核酸掺入确保肽良好表达的任何表达载体中。可能的表达载体包括但不限于粘粒、质粒或修饰的病毒(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，只要载体适用于宿主细胞的转化。
“适用于转化宿主细胞”的重组表达载体是指表达载体包含本公开内容的核酸分子和基于要用于表达的宿主细胞而选择的调控序列，其与核酸分子有效地连接。术语“有效地连接”或“可操作地连接”可互换使用，并意指核酸以允许核酸表达的方式与调节序列连接。
因此，本公开内容提供了一种重组表达载体，其包含编码肿瘤抗原特异性肽的核酸，以及用于插入的蛋白质序列的转录和翻译的必需调节序列。合适的调控序列可以衍生自多种来源，包括细菌、真菌或病毒基因(例如，参见Goeddel(1990)中描述的调控序列。
适当调节序列的选择通常取决于所选择的宿主细胞，并且可以由本领域普通技术人员容易地完成。这种调节序列的示例包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、核糖体结合序列，包括翻译起始信号。此外，根据选择的宿主细胞和使用的载体，其他序列，例如复制起点、另外的DNA限制性位点、增强子和赋予转录诱导能力的序列可以掺入表达载体中。还应当理解，必需的调节序列可以由天然蛋白质和/或其侧翼区提供。
重组表达载体还可以含有可选择标志物基因，其有助于选择用本文公开的重组肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)转化或转染的宿主细胞。可选择标志物基因的示例是编码蛋白质的基因，例如G418和潮霉素，它们赋予对某些药物、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫荧光素酶的抗性。可选择标志物基因的转录通过可选择标志物蛋白如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫荧光素酶的浓度变化来监测。如果可选择标志物基因编码赋予抗生素抗性如新霉素抗性的蛋白质，则可以用G418选择转化细胞。已经掺入可选择标志物基因的细胞将存活，而其他细胞则死亡。这使得可视化和测定重组表达载体的表达，并且特别是确定突变对表达和表型的影响成为可能。应当理解，可选择标志物可以被引入到与目标核酸分开的载体上。
可以将重组表达载体引入宿主细胞以产生转化宿主细胞。术语“转化宿主细胞”旨在包括已经用本公开内容的重组表达载体转化或转染的原核和真核细胞。术语“转化的”、“转染的”、“转化”和“转染”旨在涵盖通过本领域已知的许多可能技术之一将核酸(例如载体)引入细胞。合适的宿主细胞包括多种原核和真核宿主细胞。例如，本公开内容的蛋白质可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。
本公开内容的核酸分子也可以使用标准技术化学合成。化学合成聚脱氧核苷酸的多种方法是已知的，包括固相合成，其与肽合成一样，已在市售的DNA合成仪中完全自动化(参见例如美国专利号4,598,049；4,458,066；4,401,796和4,373,071)。
III.抗原特异性细胞疗法
本公开内容的实施方案涉及(任选地获得和)施用抗原特异性细胞(例如，自体或同种异体T细胞(例如，调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)，NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、间充质干细胞(MSC)和/或诱导多能干(iPS)细胞)至受试者作为靶向癌细胞的免疫疗法。特别是，细胞是抗原特异性T细胞(例如VCX/Y特异性T细胞)。在过去的二十年中，已经描述了几种用于衍生、激活和扩增功能性抗肿瘤效应细胞的基本方法。这些包括以下：自体细胞，如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；离体激活的T细胞，使用自体DC、淋巴细胞、人工抗原呈递细胞(APC)或涂覆有T细胞配体和激活性抗体的珠子，或通过捕获靶细胞膜分离的细胞；天然表达抗宿主肿瘤T细胞受体(TCR)的同种异体细胞；和非肿瘤特异性自体或同种异体细胞，其经基因重编程或“重定向”以表达肿瘤反应性TCR或嵌合TCR分子(显示抗体样肿瘤识别能力)，称为“T体”。这些方法产生了许多可用于本文所述方法的T细胞制备和免疫的方案。
在一些实施方案中，T细胞来源于血液、骨髓、淋巴、脐带和/或淋巴器官。在一些方面，细胞是人类细胞。细胞通常是原代细胞，例如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些细胞。它们可能或可能不与需要本公开内容的疗法的个体分离。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一种或多种亚群，例如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，例如由功能、激活状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持续能力、抗原特异性、抗原受体的类型、在特定器官或隔室中的存在、标志物或细胞因子分泌谱和/或分化程度限定的那些。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。在一些方面，例如对于现成技术，细胞是多能的(pluripotent)和/或多能的(multipotent)，例如干细胞，例如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，方法包括从受试者分离细胞，制备、加工、培养和/或工程改造它们，如本文所述，以及在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一个体。
T细胞(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)的亚型和亚群中有幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，例如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、黏膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节性T(Treg)细胞、辅助T细胞，例如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞和/或[NRF1]δ/γT细胞。
在一些实施方案中，T细胞群的一种或多种富集或耗尽对特定标志物如表面标志物呈阳性或对特定标志物呈阴性的细胞。在一些情况下，此类标志物是在T细胞的某些群体(例如，非记忆细胞)上不存在或以相对较低水平表达但在T细胞的某些其他群体(例如，记忆细胞)上存在或以相对更高水平表达的那些。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞例如B细胞、单核细胞或其他白细胞上表达的标志物例如CD14，从PBMC样品中分离T细胞。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过阳性选择或阴性选择在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或表达程度相对较高的标志物，可以将这样的CD4+和CD8+群体进一步分选成亚群。
在一些实施方案中，CD8+T细胞被进一步富集或耗尽幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞，例如通过基于与相应亚群相关的一种或多种表面抗原的阳性或阴性选择。在一些实施方案中，进行中枢记忆T(TCM)细胞的富集以提高功效，例如改善施用后的长期存活、扩增和/或植入，在一些方面，这在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人，2012；Wang等人，2012。
在一些实施方案中，T细胞是自体T细胞。在这种方法中，肿瘤样品获自个体，包括患者，并获得单细胞悬液。单细胞悬液可以以任何合适的方式获得，例如，机械方式(例如，使用gentleMACSTM Dissociator，Miltenyi Biotec，Auburn，Calif.分解肿瘤)或酶促方式(例如，胶原酶或DNA酶)。肿瘤酶消化物的单细胞悬液在白细胞介素2(IL-2)中培养。培养细胞直至汇合(例如，约2×106个淋巴细胞)，例如约5至约21天，优选地约10至约14天。
可以合并培养的T细胞并快速扩增。快速扩增使抗原特异性T细胞的数量在约10至约14天的时间段增加了至少约50倍(例如，50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多)。更优选地，快速扩增使得在约10至约14天的时间段增加了至少约200倍(例如，200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍或更多)。
扩增可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种来完成。例如，在存在饲养淋巴细胞和白细胞介素2(IL-2)和/或白细胞介素15(IL-15)的情况下，可以使用非特异性T细胞受体刺激来快速扩增T细胞。在一些情况下，非特异性T细胞受体刺激物可以包括抗CD3抗体，例如约30ng/ml的OKT3，一种小鼠单克隆抗CD3抗体(可获自
Figure BDA0003651573810000221
Raritan,N.J.)。可替换地，可以通过在体外用一种或多种癌症抗原(包括其抗原部分，例如表位，或细胞)刺激PBMC来快速扩增T细胞，其可以任选地从载体表达，例如肿瘤肽，在T细胞生长因子存在下，例如300IU/ml IL-2和/或IL-15。通过用脉冲到抗原呈递细胞上的相同癌症抗原的再刺激来迅速扩增体外诱导的T细胞。可替代地，例如，可以用辐照过的自体淋巴细胞或用辐照过的同种异体淋巴细胞和IL-2来再刺激T细胞。
可以修饰自体T细胞以表达促进自体T细胞生长和激活的T细胞生长因子。合适的T细胞生长因子包括例如IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-12。合适的修饰方法是本领域已知的。例如，参见Sambrook等人，2001；和Ausubel等人，1994。在特定方面，修饰的自体T细胞以高水平表达T细胞生长因子。T细胞生长因子编码序列，例如IL-12的序列，在本领域中很容易获得，启动子也是如此，其与T细胞生长因子编码序列的可操作连接促进高水平表达。
IV.治疗方法
本文提供了用于治疗个体癌症或延缓其进展的方法，包括向个体施用有效量的抗原特异性细胞疗法，例如VCX/Y特异性T细胞疗法。在进一步的实施方案中，提供了用于治疗癌症的方法，包括用纯化的肿瘤抗原或免疫显性肿瘤抗原特异性肽来免疫受试者。
本文提供的VCX/Y肽可用于开发癌症疫苗或免疫原(例如，肽或修饰的肽混合物与佐剂、编码多核苷酸和相应表达产物如失活病毒或其他微生物疫苗)。这些肽特异性疫苗或免疫原可用于直接免疫癌症患者以诱导体内抗肿瘤免疫应答，或用于在体外用肽或编码多核苷酸负载的APC刺激来扩增抗原特异性T细胞。这些大量的T细胞可以过继转移给患者以诱导肿瘤消退。
考虑用于治疗的癌症的例子包括肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、宫颈癌、胃肠道癌、淋巴瘤、肿瘤前病变肺癌、结肠癌、黑色素瘤和膀胱癌。
在一些实施方案中，T细胞是自体的。然而，细胞可以是同种异体的。在一些实施方案中，T细胞是从需要治疗的个体中分离的，因此细胞是自体的。如果T细胞是同种异体的，则可以从几个供体中汇集T细胞。以足以控制、减少或消除所治疗疾病的症状和体征的量将细胞施用于目标受试者。
在一些实施方案中，可以在T细胞疗法之前向受试者施用非清髓性淋巴清除化学疗法。非清髓性淋巴清除化学疗法可以是任何合适的此类疗法，其可以通过任何合适的途径施用。非清髓性淋巴清除化学疗法可以包括例如施用环磷酰胺和氟达拉滨，特别是如果癌症是黑色素瘤，其可以是转移性的。施用环磷酰胺和氟达拉滨的示例性途径是静脉内。同样，可以施用任何合适剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在特定方面，施用约60mg/kg的环磷酰胺两天，然后施用约25mg/m2氟达拉滨五天。
在某些实施方案中，将促进自体T细胞生长和激活的T细胞生长因子与自体T细胞同时或在自体T细胞之后施用于受试者。T细胞生长因子可以是促进自体T细胞生长和激活的任何合适的生长因子。合适的T细胞生长因子的示例包括IL-2、IL-7、IL-15和IL-12，它们可以单独使用或以各种组合使用，例如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15，或IL-12和IL2。在特定实施方案中，可以使用IL-12。
T细胞可以静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。T细胞疗法的合适剂量可根据待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、个体的临床情况、个体的临床病史和对治疗的应答以及主治医师的判断来确定。
对于离散的、实体的、可接近的肿瘤，特别考虑瘤内注射或注射到肿瘤脉管系统中。局部、区域或全身施用也可能是合适的。对于>4cm的肿瘤，待施用的体积约为4-10ml(特别是10ml)，而对于<4cm的肿瘤，将使用约1-3ml的体积(特别是3ml)。以单剂量递送的多次注射包括约0.1至约0.5ml的体积。
A.药物组合物
本文还提供了包含抗原特异性免疫细胞(例如，T细胞)和药学上可接受的载体的药物组合物和制剂。用于受试者的药物用途的疫苗组合物可以包含本文公开的肿瘤抗原肽(例如，VCX/Y)组合物和药学上可接受的载体。个体可以接收有效量的一种或两种。
可以通过将具有所需纯度的活性成分(例如抗体或多肽)与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences第22版，2012)混合来制备如本文所述的药物组合物和制剂，以冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，例如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003651573810000241
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
B.组合疗法
在某些实施方案中，本实施方案的组合物和方法涉及抗原特异性免疫细胞群和/或肿瘤抗原肽与至少一种附加疗法组合。附加疗法可以是放射疗法、手术(例如，乳房肿块切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法、激素疗法或以上的组合。附加疗法可以是辅助或新辅助疗法的形式。
在一些实施方案中，附加疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，附加疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减轻治疗副作用的发生和/或严重程度的试剂，例如抗恶心剂等)。在一些实施方案中，附加疗法是放射疗法。在一些实施方案中，附加疗法是手术。在一些实施方案中，附加疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，附加疗法是伽马辐射。在一些实施方案中，附加疗法是靶向PBK/AKT/mTOR途径、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、细胞凋亡抑制剂和/或化学预防剂的疗法。附加疗法可以是本领域已知的一种或多种化疗剂。
免疫细胞疗法可以在相对附加癌症疗法(例如免疫检查点疗法)之前、期间、之后或以各种组合方式施用。施用的间隔可以从同时到数分钟到数天到数周。在将免疫细胞疗法与另外的治疗剂分开提供给患者的实施方案中，通常会确保在每次递送时间之间并没有到期的相当长的时间段，使得两种化合物仍然能够发挥对患者有利的综合效果。在这种情况下，考虑可以在彼此相距约12至24或72小时内，更具体地，在彼此相距约6-12小时内向患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在某些情况下，可能需要显著延长治疗时间，其中各施用之间经过几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7、或8)。
可以采用各种组合。例如下面的抗原特异性免疫细胞疗法，或肽是“A”且抗癌疗法是“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/BB/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
将本实施方案的任何化合物或疗法给予患者将遵循用于给予此类化合物的一般方案，其中考虑到试剂的毒性(如果有的话)。因此，在一些实施方案中，有监测可归因于组合治疗的毒性的步骤。
1.化学疗法
根据本实施方案可以使用多种化疗剂。术语“化学疗法”是指使用药剂治疗癌症。“化疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些试剂或药剂根据它们在细胞内的活性模式进行分类，例如，它们是否以及在什么阶段影响细胞周期。可替代地，可以基于其直接交联DNA、嵌入DNA中或诱导染色体和有丝分裂畸变(通过影响核酸合成)的能力来表征试剂。
化疗剂的实例包括烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、异丙硫丹和哌泊硫丹；氮丙啶类，例如苯多巴、卡波醌、美多巴和乌多巴；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括三聚氰胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；acetogenins(尤其是bulatacin和bulatacinone)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡利他汀；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁；多卡霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；五加素；潘拉司他汀；肉毒杆菌素；海绵抑素；氮芥，例如苯丁酸氮芥、氯萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氯乙胺、盐酸甲氯乙胺、美法仑、诺维比辛、芬乃斯特、泼尼莫司汀、曲磷酰胺和尿嘧啶芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲佐菌素、氟替莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼司汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素gammalI和加利车霉素omegaI1)；达尼霉素，包括达尼霉素A；双膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯帕霉素；以及新制癌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authrarnycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素、卡拉比星(carabicin)、胭脂红霉素、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素、放线菌素、柔红霉素、去托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、埃索比星、伊达比星、马赛霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素、奎拉霉素、罗托霉素、链霉素、链脲霉素、结核菌素、乌苯美司、锌诺他丁和唑柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫胺嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿苷、依西他滨和氟尿苷；雄激素，例如卡卢斯酮、丙酸屈莫司他龙、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺素，如米托坦和三氯司坦；叶酸补充剂，如叶酸；aceglatone；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；defofamine；地美可辛；二嗪酮；elformithine；依利醋铵；埃坡霉素；乙环氧定；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；洛尼达宁；美登醇，例如美登素和安丝霉素；米托胍；米托蒽醌；莫匹丹莫；硝基苯胺；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根瘤菌素；西佐非兰；螺锗；细交链孢菌酮酸；三嗪酮；2,2',2″-三氯三乙胺；单端孢菌素(尤其是T-2毒素、维拉库林A、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；urethan；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；米托溴醇(mitobronitol)；米托内酯(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺万龙；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟胺酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普利霉素、吉西他滨、萘维滨、法尼基蛋白转移酶抑制剂、反铂和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
2.放射疗法
导致DNA损伤并已广泛使用的其他因素包括通常称为γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑了其他形式的DNA损伤因子，例如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV辐照。很可能所有这些因素都会对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维护产生广泛的损伤。X射线的剂量范围从每天剂量50至200伦琴用于长期(3到4周)到单剂量2000至6000伦琴。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、所发射辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。
3.免疫疗法
本领域技术人员将理解，另外的免疫疗法可以与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗
Figure BDA0003651573810000281
就是这样一个例子。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可以作为疗法的效应子，或也可以招募其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并用作靶向剂。可替代地，效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，该表面分子直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
抗体-药物偶联物已成为开发癌症疗法的突破性方法。癌症是世界上主要的死亡原因之一。抗体-药物偶联物(ADC)包含与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。这种方法将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效的细胞毒性药物相组合，从而产生“武装的”MAb，将有效载荷(药物)递送至具有富集抗原水平的肿瘤细胞。药物的靶向递送还可以最小化其在正常组织中的暴露，从而降低毒性并提高治疗指数。FDA批准的两种ADC药物，于2011年的
Figure BDA0003651573810000291
(维布妥昔单抗(brentuximab vedotin))和于2013年的
Figure BDA0003651573810000292
(曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)或T-DM1)验证了该方法。目前有30多种ADC候选药物处于癌症治疗临床试验的各个阶段(Leal等，2014)。随着抗体工程化和接头-有效负载优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合这种方法的新靶标的识别和验证以及靶向MAb的产生。ADC靶标的两个标准是肿瘤细胞中上调/高水平的表达和稳健的内化。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须带有一些易于靶向的标志物，即不存在于大多数其他细胞上。存在许多肿瘤标志物并且这些中的任何一个都可能适合于在本实施方案的上下文中靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个可替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相组合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子，如MIP-1、MCP-1、IL-8和生长因子，如FLT3配体。
目前正在研究或使用的免疫疗法的示例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌、恶性疟原虫、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander，2012；Hanibuchi等人，1998；美国专利5,824,311)。考虑一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗体疗法一起使用。
在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点要么调高信号(例如，共刺激分子)，要么调低信号。免疫检查点阻断可靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、程序性死亡1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞激活的V结构域Ig抑制因子(VISTA)。特别是，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体，或者特别是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开WO2015016718；Pardoll，Nat Rev Cancer，12(4):252-64,2012；两者均以引用方式并入本文)。可以使用已知的免疫检查点蛋白抑制剂或其类似物，特别是可以使用嵌合、人源化或人形式的抗体。如本领域技术人员所知，替代和/或等效名称可用于本公开内容中提及的某些抗体。这样的替代和/或等效名称在本公开的上下文中是可互换的。例如，已知Lambrolizumab也以替代和等效名称MK-3475和派姆单抗为人所知。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体在美国专利号US8735553、US8354509和US8008449中进行了描述，均以引用的方式并入本文。用于本文提供的方法中的其他PD-1轴拮抗剂是本领域已知的，例如美国专利申请号US20140294898、US2014022021和US20110008369中所述，均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自由纳武单抗、派姆单抗和CT-011组成的组。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含融合到恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0003651573810000311
是描述于WO2006/121168中的PD-1抗体。派姆单抗，也称为MK-3475、Merck 3475、lambrolizumab、
Figure BDA0003651573810000312
和SCH-900475，是WO2009/114335中描述的抗PD-1抗体。CT-011，也称为hBAT或hBAT-1，是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。
可以在本文提供的方法中靶向的另一个免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞表面上，并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，在辅助T细胞表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28相似，并且两种分子都与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)结合。CTLA4向T细胞传递抑制性信号，而CD28传递刺激性信号。细胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中，可能对其功能很重要。通过T细胞受体和CD28激活T细胞导致CTLA-4的表达增加，CTLA-4是B7分子的抑制性受体。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
适用于本方法的抗人-CTLA-4抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法产生。可替代地，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，抗CTLA-4抗体公开于：US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也称为替西木单抗(tremelimumab)；以前称为ticilimumab)，美国专利号6,207,156；Hurwitz等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17):10067-10071；Camcho等人(2004)J ClinOncology 22(145):Abstract No.2505(抗体CP-675206)；和Mokyr等人(1998)CancerRes58:5301-5304可用于本文公开的方法中。上述出版物中的每一个的教导通过引用并入本文。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合CTLA-4的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述在国际专利申请号WO2001014424、WO2000037504和美国专利号8,017,114中；全部通过引用并入本文。
示例性的抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和
Figure BDA0003651573810000321
)或其抗原结合片段和变体(参见，例如，WO01/14424)。在其他实施方案中，抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抗体包含伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体竞争结合和/或结合CTLA-4上的相同表位。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的其他分子包括CTLA-4配体和受体，例如描述在美国专利号US5844905、US5885796和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752中；全部以引用方式并入本文，以及免疫粘附素，例如描述在美国专利号US8329867中，通过引用并入本文。
4.手术
大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期、治疗性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，其中全部或部分癌组织被物理去除、切除和/或破坏，并且可以与其他疗法结合使用，例如本实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。肿瘤切除是指对至少部分肿瘤进行物理切除。除肿瘤切除外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微镜控制手术(莫氏手术)。
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空腔。治疗可以通过输注、直接注射或局部应用该区域(用另外的抗癌疗法)来完成。此类治疗可重复，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以有不同的剂量。
5.其他试剂
考虑其他试剂可以与本实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的疗效。这些其他试剂包括影响细胞表面受体上调和GAP连接的试剂、细胞生长抑制剂和分化试剂、细胞粘附的抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂或其他生物试剂。通过提高GAP连接的数量来增加细胞间信号传导将增加对邻近过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可与本实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的抗过度增殖功效。考虑使用细胞粘附的抑制剂来改善本实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的示例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他试剂，例如抗体c225，可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗功效。
V.制品或试剂盒
提供了包含抗原特异性免疫细胞、TCR和/或抗原肽(例如，VCX/Y肽)的制品或试剂盒。制品或试剂盒可进一步包含包装插页，该插页包含使用抗原特异性免疫细胞治疗个体癌症或延缓癌症进展或增强患有癌症的个体的免疫功能的说明。本文所述的任何抗原特异性免疫细胞可包括在制品或试剂盒中。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。容器可以由多种材料制成，例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(例如不锈钢或哈氏合金)。在一些实施方案中，容器容纳制剂并且容器上或与容器相关联的标签可以指示使用说明。制品或试剂盒还可以包括从商业和用户的角度看需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插页。在一些实施方案中，制品还包括一种或多种另一种试剂(例如，化疗剂和抗肿瘤剂)。一种或多种试剂的合适容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。
VI.实施例
包括以下实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表了发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成其实践的优选模式。然而，本领域的技术人员根据本公开内容应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。
实施例1–肿瘤抗原特异性肽的鉴定和表征
对VCX54 TCR-T细胞的识别靶肽进行重叠肽文库筛选(图1)。针对VCX54 TCR-T细胞识别的靶标筛选了覆盖VCX3A蛋白全长的具有8个氨基酸的9-mer肽重叠肽库。将肽逐一脉冲至T2细胞，并与VCX54 TCR-T共培养。过夜培养后，使用细胞内细胞因子染色(ICS)检测T细胞的激活标志物，如CD137、CD69、IFN-r和TNFα。发现靶标肽VCX54能够诱导VCX54 TCR-T的应答。然而，发现另一种肽VCX118也能够诱导VCX54 TCR-T细胞的应答。
对于VCX118肽交叉反应检测，使用不同浓度的VCX118肽以脉冲T2细胞，然后与VCX54 TCR-T细胞共培养。ICS检测显示在高浓度下，VCX118肽会被VCX54 TCR-T交叉识别，并且应答高于VCX54原始肽。M26肽用作阴性对照(图2)。
将不同浓度的VCX118肽脉冲T2细胞，用Calcein-AM标记，并与VCX54 TCR-T细胞共培养。使用calcein-AM猝灭测定法来检测对抗原应答的VCX54 TCR-T的杀伤能力。杀伤测定法表明在高浓度下，VCX54 TCR-T细胞可以交叉识别VCX118肽，并且应答高于VCX54肽(图3)。
将不同浓度的VCX118肽脉冲T2细胞，并进行HLA-A2稳定性分析以检测VCX118肽结合能力。VCX54、M26和M27肽用作对照。根据分析，VCX118显示出对HLA-A2的弱结合能力(图4)。
表1：包含VCX118肽的不同长度的肽。
Figure BDA0003651573810000351
将具有VCX118的不同长度的肽脉冲T2细胞并与VCX54 TCR-T细胞共培养。VCX118肽用作对照。ICS数据显示VCX54 TCR-T细胞只识别VCX118肽，不识别其他更长的肽，说明VCX54 TCR-T细胞可能只交叉识别VCX3A基因中的VCX118肽。
实施例2–材料和方法
VCX118特异性CD8 T细胞的产生和扩增：肿瘤抗原特异性CTL以先前描述的方式产生(Li 2005)。用肿瘤抗原肽脉冲的自体DC刺激白细胞分离术PBMC。为了诱导树突细胞，将贴壁的PBMC与GM-CSF和IL-4在AIM-V培养基(Invitrogen Life Technologies)中培养6天，然后加入IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2以使其成熟。1天后，在3μg/mlβ-微球蛋白存在下，用40μg/ml肽以2×106个细胞/ml的1％人血清白蛋白(HSA)/PBS在室温下脉冲成熟DC 4小时。用1％HSA/PBS洗涤后，在48孔板中以1.5×106个细胞/ml/孔将DC与PBMC混合。最初和培养后3-4天添加IL-21(30ng/ml)。在二次刺激后1天，添加IL-2和IL-7以扩增激活的抗原特异性T细胞。
二次刺激后6天，细胞用VCX/Y肽/MHC-PE-缀合的四聚体和CD8-APC抗体染色，然后通过ARIA II分选CD8和四聚体阳性细胞。分选的VCX/Y特异性CD8 T细胞通过快速扩增方案(REP)在IL-21下使用PBL和LCL的饲养细胞进行扩增。
肽-MHC四聚体染色：VCX118特异性CD8 T细胞通过用VCX118肽/MHC复合物的四聚体进行染色来确认。CD8 T细胞与PE缀合的四聚体孵育20分钟，洗涤，然后在室温下用APC缀合的CD8抗体染色15分钟。洗涤后，通过流式细胞仪(LSRFortessa X-20Analyzer)分析细胞。
产生T细胞克隆：将全长VCX3A RNA转染到成熟的树突细胞(DC)。在IL-21存在下，将RNA转染的DC与自体幼稚T细胞以DC:T＝1:10的比例共培养。一周后，用RNA转染的DC再次刺激T细胞。经过两轮刺激后，CD8+和四聚体+双阳性T细胞群体通过快速扩增方案进行分选和扩增。T细胞克隆是用有限稀释法产生的。通过肿瘤细胞杀伤测定法筛选高活性CTL克隆。
51Cr释放测定法：使用标准51Cr释放测定法测量T细胞或CTL克隆裂解肿瘤靶标的杀伤能力。肿瘤细胞或正常细胞在37℃下用200μCi的51Cr标记2h。洗涤标记的靶细胞，并然后在0.2ml完全培养基中与效应细胞以不同比例在37℃下孵育4h。使用自动伽马计数器对收获的上清液进行计数。通过在台盼裂解缓冲剂或培养基中在37℃下孵育标记的靶细胞4h来确定最大和自发的51Cr释放。每个数据点被确定为一式四份孔的平均值。特异性裂解百分比计算如下：杀死％＝((特异性释放-自发释放)/(总释放-自发释放))×100。
IFN-γ释放测定法：用ELISA方法检测从T细胞的IFN-γ释放。T细胞与靶细胞以10:1的比例在96孔板中与0.2ml培养基在37℃下孵育。共培养过夜后，收获上清液并根据试剂盒(Invitrogen Life Technologies)的手册使用ELISA检测IFN-γ浓度。
细胞内细胞因子染色(ICS)测定法：在37℃下，在存在布雷菲德菌素A(BFA)的情况下，将T细胞与靶细胞以10:1的比例孵育过夜。共培养后，收获并洗涤T细胞。首先用流式抗体抗表面标志物对细胞进行染色。之后，清洗细胞和用固定缓冲剂固定，然后使用透化溶液(eBioscience)进行透化。然后用细胞内细胞因子流动抗体对透化的细胞进行染色。最后，使用FACS分析细胞中产生的细胞因子水平。
统计分析：使用GraphPad prism 6.0e版进行数据分析。使用参数检验(Anova或非配对t检验)分析正态分布的数据。如果p值<0.05，则认为统计检验差异显著。
***
根据本公开内容，可以在没有过度实验的情况下制作和执行本文公开和要求保护的所有方法。尽管本发明的组合物和方法已根据优选实施方案进行了描述，但对于本领域技术人员来说，显然可以对本文描述的方法和方法的步骤或步骤顺序应用变化形式，而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体而言，明显的是某些化学和生理相关的试剂可以替代本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。对本领域技术人员而言显而易见的所有这些类似的替代和修改都被认为在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念之内。
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Claims (44)

1.一种长度为35个氨基酸或更短的分离的VCX/Y肽，包含与SEVEEPLSQ(SEQ ID NO:1)具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的肽，其中VCX/Y肽进一步定义为VCX3A肽。
3.权利要求1或2的肽，其中肽包含与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
4.权利要求1-3中任一项的肽，其中肽的长度为30个氨基酸或更短。
5.权利要求4的肽，其中肽的长度为25个氨基酸或更短。
6.权利要求5的肽，其中肽的长度为20个氨基酸或更短。
7.权利要求6的肽，其中肽的长度为15个氨基酸或更短。
8.权利要求1的肽，其中肽由SEQ ID NO：1组成或基本上由SEQ ID NO：1组成。
9.一种药物组合物，包含权利要求1-8中任一项的分离的肽和药物载体。
10.权利要求9的组合物，其中药物组合物被配制用于肠胃外施用、静脉内注射、肌肉内注射、吸入或皮下注射。
11.权利要求9或10的组合物，其中肽包含在脂质体、含脂质纳米颗粒或基于脂质的载体中。
12.权利要求9、10或11的组合物，其中药物制备物被配制成用于注射或作为鼻喷雾剂用于吸入。
13.一种编码权利要求1-8中任一项的VCX/Y肽的分离的核酸。
14.一种包含连续序列的载体，所述连续序列包含权利要求13的核酸或由权利要求13的核酸组成。
15.一种在受试者中促进免疫应答的方法，包括向受试者施用有效量的权利要求1-8中任一项的肽。
16.权利要求15的方法，其中受试者被诊断患有癌症。
17.权利要求16的方法，其中癌症是胸腺瘤、膀胱癌、子宫癌、黑色素瘤、肉瘤、宫颈癌或头颈癌。
18.权利要求15-17中任一项的方法，其中受试者是人。
19.权利要求15-18中任一项的方法，还包括施用至少第二抗癌疗法。
20.权利要求19的方法，其中第二抗癌疗法选自由化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法或手术组成的组。
21.权利要求20的方法，其中免疫疗法包括一种或多种免疫检查点抑制剂。
22.权利要求21的方法，其中免疫检查点抑制剂是抗PD1单克隆抗体。
23.一种产生VCX/Y特异性免疫细胞的方法，包括：
(a)任选地，获得免疫细胞的起始群体；和
(b)使免疫细胞的起始群体与权利要求1-8中任一项的VCX/Y肽接触，从而产生VCX/Y特异性免疫细胞。
24.权利要求23的方法，其中接触进一步定义为将免疫细胞的起始群体与抗原呈递细胞(APC)共培养，其中APC在其表面上呈递权利要求1-8中任一项的VCX/Y肽。
25.权利要求24的方法，其中APC是树突细胞。
26.权利要求23的方法，其中免疫细胞的起始群体是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
27.权利要求23的方法，其中免疫细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
28.权利要求23的方法，其中获得包括从外周血单核细胞(PBMC)中分离免疫细胞的起始群体。
29.根据权利要求23-28中任一项的方法产生的VCX/Y特异性免疫细胞。
30.一种药物组合物，包含根据权利要求23-28中任一项的方法产生的VCX/Y特异性免疫细胞。
31.一种治疗受试者中癌症的方法，包括施用有效量的权利要求29的VCX/Y特异性免疫细胞。
32.权利要求31的方法，其中免疫细胞是T细胞、外周血淋巴细胞、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、间充质干细胞(MSC)、诱导多能干细胞(iPS)或其混合物。
33.权利要求31或32的方法，其中免疫细胞是从脐带分离的。
34.权利要求31-33中任一项的方法，其中免疫细胞相对于受试者是自体的或同种异体的。
35.权利要求31的方法，其中免疫细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞或γδT细胞。
36.权利要求31-35中任一项的方法，其中癌症是胸腺瘤、膀胱癌、子宫癌、黑色素瘤、肉瘤、宫颈癌或头颈癌。
37.权利要求31-36中任一项的方法，其中受试者是人。
38.权利要求31-37中任一项的方法，还包括在施用VCX/Y特异性免疫细胞之前对受试者进行淋巴清除。
39.权利要求38的方法，其中淋巴清除包括施用有效量的环磷酰胺和/或氟达拉滨。
40.权利要求31-39中任一项的方法，还包括向受试者施用至少第二治疗剂。
41.权利要求40的方法，其中至少第二治疗剂包括化学疗法、免疫疗法、手术、放射疗法、激素疗法和/或生物疗法。
42.权利要求41的方法，其中通过静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌内、经内窥镜、病灶内、经皮、皮下、局部或通过直接注射或灌注施用VCX/Y特异性免疫细胞和/或至少第二治疗剂。
43.权利要求31-42中任一项的方法，其中确定受试者具有表达VCX/Y家族蛋白质的癌细胞。
44.权利要求43的方法，其中蛋白质是VCX3A。
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