TW202208418A - 具有vgll1特異性之t細胞受體及其用途 - Google Patents

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葛雷格里 利茲
嘉誠 余
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Abstract

本文提供腫瘤抗原VGLL1特異性T細胞受體。TCR可用於諸如自體細胞移植等各種療法中，以治療癌症。亦提供使靶向VGLL1之T細胞之群體擴增的方法。

Description

具有VGLL1特異性之T細胞受體及其用途
本發明一般而言係關於免疫及醫藥領域。更具體而言，其係關於腫瘤抗原特異性T細胞受體及其用於治療癌症之用途。
胰臟導管腺癌(PDAC)係胰臟癌之最具攻擊性之形式，因其預後差及高死亡率而臭名昭著，其總體5年存活率為8%，係所有癌症類型中最低的。早期檢測不常見，85%之患者呈現局部晚期或轉移性疾病。針對有效治療之進展緩慢，且PDAC相關死亡之發生率持續上升。儘管經由優化手術及化療治療方案之順序實現了一些令人鼓舞之近期存活改善，但開發新的有效治療選擇仍然為晚期PDAC患者所迫切需要(Strobel等人，2019)。
基於細胞毒性T淋巴球(CTL)之免疫療法已經成功地在多種癌症類型中誘導客觀臨床反應。經由T淋巴球之非特異性活化起作用之檢查點抑制劑(CPI)療法對患者之長期存活產生顯著積極影響。然而，CPI之益處主要限於高度突變之腫瘤類型，如黑色素瘤及肺腺癌，其可在表面HLA分子之背景下表現潛在新抗原肽之大陣列(Rizvi等人，2015)。腫瘤浸潤淋巴球(TIL)療法(其中向個別癌症患者重新輸注自其自身之腫瘤擴增之T細胞)亦已顯示誘導巨大腫瘤之消退之大的希望。TIL係多株的，且可識別患者特異性新抗原以及共有之腫瘤相關抗原(TAA)，例如黑色素細胞分化抗原(MDA)或睪丸癌抗原(CTA)。經由抗原特異性內源性T細胞(ETC療法)或遺傳工程化TCR-T細胞之輸注靶向個別驗證之HLA I類限制性TAA亦已證明成功地在患有黑色素瘤及其他實體腫瘤之患者中誘導臨床反應。
不幸的是，基於CPI及CTL之免疫療法在治療PDAC患者中未顯示相同有益影響(Young等人，2018)。此種缺乏成功已歸因於PDAC之高度免疫抑制性腫瘤微環境(TME)，以及促成新抗原靶標缺乏之相對低之突變負荷(Yarchoan等人，2017)。在PDAC中已鑑別到許多潛在之可靶向之HLA I類限制性肽抗原，其中最顯著的是源自癌胚抗原相關細胞黏著分子(CEACAM)、黏蛋白16 (MUC16)、間皮素(MSLN)及突變之KRAS等之彼等。靶向該等TAA之療法儘管有前景但仍面臨固有之限制，包括在非腫瘤組織中誘導毒性、靶抗原表現之低盛行率、或不能破壞通常阻礙高親和力CTL之產生之自身耐受機制。除了有限之例外，靶向該等抗原之臨床試驗產生令人失望之結果，強調了鑑別在PDAC患者中展現更高盛行率之安全免疫原性靶之需要。因此，對於針對該等惡性病之額外靶抗原之基於T細胞之新穎療法，存在未滿足之醫學需要。
在一些實施例中，本揭示內容提供VGLL1 T細胞受體(TCR)及其例如在包括過繼性T細胞療法之療法中的使用方法。在一個實施例中，提供工程化T細胞受體(TCR)，其中該TCR特異性結合退變樣蛋白1 (Vestigial 1, VGLL1)且包含：(a) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:10)、CDR2 (SEQ ID NO:11)及CDR3 (SEQ ID NO:12)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:21)、CDR2 (SEQ ID NO:22)及CDR3 (SEQ ID NO:23)；(b) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:33)、CDR2 (SEQ ID NO:34)及CDR3 (SEQ ID NO:35)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:44)、CDR2 (SEQ ID NO:45)及CDR3 (SEQ ID NO:46)；(c) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:56)、CDR2 (SEQ ID NO:57)及CDR3 (SEQ ID NO:58)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:67)、CDR2 (SEQ ID NO:68)及CDR3 (SEQ ID NO:69)；或(d) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:79)、CDR2 (SEQ ID NO:80)及CDR3 (SEQ ID NO:81)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:90)、CDR2 (SEQ ID NO:91)及CDR3 (SEQ ID NO:92)。
在一些態樣中，TCR包含α鏈CDR1 (SEQ ID NO:10)、CDR2 (SEQ ID NO:11)及CDR3 (SEQ ID NO:12)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:21)、CDR2 (SEQ ID NO:22)及CDR3 (SEQ ID NO:23)。在某些態樣中，TCR包含與SEQ ID NO:15之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:20之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之β鏈可變區。舉例而言，可變區包含CDR且序列之其餘部分具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)序列一致性。在特定態樣中，TCR包含SEQ ID NO:15之α鏈可變區及SEQ ID NO:20之胺基酸序列之β鏈可變區。在某些態樣中，TCR包含與SEQ ID NO:3之核苷酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:9之核苷酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之β鏈可變區。在具體態樣中，TCR包含含有SEQ ID NO:3之核苷酸序列之α鏈可變區及包含SEQ ID NO:9之核苷酸序列之β鏈。在一些態樣中，除CDR外之TCR與SEQ ID NO:13具有至少90%一致性。在特定態樣中，TCR包含SEQ ID NO:13。
在某些態樣中，TCR包含α鏈CDR1 (SEQ ID NO:33)、CDR2 (SEQ ID NO:34)及CDR3 (SEQ ID NO:35)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:44)、CDR2 (SEQ ID NO:45)及CDR3 (SEQ ID NO:46)。在某些態樣中，TCR包含與SEQ ID NO:38之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:43之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之β鏈可變區。在某些態樣中，TCR包含SEQ ID NO:38之α鏈可變區及SEQ ID NO:43之胺基酸序列之β鏈可變區。在一些態樣中，TCR包含與SEQ ID NO:26之核苷酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:32之核苷酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之β鏈可變區。在一些態樣中，TCR包含含有SEQ ID NO:26之核苷酸序列之α鏈可變區及包含SEQ ID NO:32之核苷酸序列之β鏈可變區。在一些態樣中，除CDR外之TCR與SEQ ID NO:36具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性。在某些態樣中，TCR包含SEQ ID NO:36。
在某些態樣中，TCR包含α鏈CDR1 (SEQ ID NO:56)、CDR2 (SEQ ID NO:57)及CDR3 (SEQ ID NO:58)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:67)、CDR2 (SEQ ID NO:68)及CDR3 (SEQ ID NO:69)。在一些態樣中，TCR包含與SEQ ID NO:61之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:66之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之β鏈可變區。在一些態樣中，TCR包含SEQ ID NO:61之α鏈可變區及SEQ ID NO:66之胺基酸序列之β鏈可變區。在某些態樣中，TCR包含與SEQ ID NO:49之核苷酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:55之核苷酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之β鏈可變區。在一些態樣中，TCR包含含有SEQ ID NO:49之核苷酸序列之α鏈可變區及包含SEQ ID NO:55之核苷酸序列之β鏈。在特定態樣中，除CDR外之TCR與SEQ ID NO:59具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性。在具體態樣中，TCR包含SEQ ID NO:59。
在一些態樣中，TCR包含α鏈CDR1 (SEQ ID NO:79)、CDR2 (SEQ ID NO:80)及CDR3 (SEQ ID NO:81)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:90)、CDR2 (SEQ ID NO:91)及CDR3 (SEQ ID NO:92)。在某些態樣中，TCR包含與SEQ ID NO:84之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:89之胺基酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之β鏈可變區。在一些態樣中，TCR包含SEQ ID NO:84之α鏈可變區及SEQ ID NO:89之胺基酸序列之β鏈可變區。在某些態樣中，TCR包含與SEQ ID NO:72之核苷酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:78之核苷酸序列具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性之除CDR外之β鏈可變區。在一些態樣中，TCR包含含有SEQ ID NO:72之核苷酸序列之α鏈可變區及包含SEQ ID NO:78之核苷酸序列之β鏈。在特定態樣中，除CDR外之TCR與SEQ ID NO:82具有至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%或99%)一致性。在具體態樣中，TCR包含SEQ ID NO:82。
在一些態樣中，工程化TCR結合HLA-A*0101。在某些態樣中，TCR進一步定義為可溶性TCR，其中可溶性TCR不包含跨膜結構域。在額外態樣中，TCR進一步包含可檢測標記。在一些態樣中，TCR共價結合至治療劑，例如免疫毒素或化學治療劑。
又一實施例提供多價TCR複合物，其包含本實施例或其態樣之複數個TCR (例如工程化T細胞受體(TCR)，其中TCR特異性結合退變樣蛋白1 (VGLL1)且包含：(a) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:10)、CDR2 (SEQ ID NO:11)及CDR3 (SEQ ID NO:12)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:21)、CDR2 (SEQ ID NO:22)及CDR3 (SEQ ID NO:23)；(b) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:33)、CDR2 (SEQ ID NO:34)及CDR3 (SEQ ID NO:35)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:44)、CDR2 (SEQ ID NO:45)及CDR3 (SEQ ID NO:46)；(c) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:56)、CDR2 (SEQ ID NO:57)及CDR3 (SEQ ID NO:58)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:67)、CDR2 (SEQ ID NO:68)及CDR3 (SEQ ID NO:69)；或(d) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:79)、CDR2 (SEQ ID NO:80)及CDR3 (SEQ ID NO:81)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:90)、CDR2 (SEQ ID NO:91)及CDR3 (SEQ ID NO:92))。在一些態樣中，多價TCR包含2、3、4或更多個彼此締合之TCR。在某些態樣中，多價TCR存在於脂質雙層、脂質體中，或附接至奈米粒子。在一些態樣中，TCR經由連接體分子彼此締合。
另一實施例提供多肽，該多肽編碼本實施例或其態樣之TCR (例如工程化T細胞受體(TCR)，其中TCR特異性結合退變樣蛋白1 (VGLL1)且包含：(a) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:10)、CDR2 (SEQ ID NO:11)及CDR3 (SEQ ID NO:12)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:21)、CDR2 (SEQ ID NO:22)及CDR3 (SEQ ID NO:23)；(b) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:33)、CDR2 (SEQ ID NO:34)及CDR3 (SEQ ID NO:35)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:44)、CDR2 (SEQ ID NO:45)及CDR3 (SEQ ID NO:46)；(c) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:56)、CDR2 (SEQ ID NO:57)及CDR3 (SEQ ID NO:58)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:67)、CDR2 (SEQ ID NO:68)及CDR3 (SEQ ID NO:69)；或(d) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:79)、CDR2 (SEQ ID NO:80)及CDR3 (SEQ ID NO:81)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:90)、CDR2 (SEQ ID NO:91)及CDR3 (SEQ ID NO:92))。又一實施例提供編碼多肽之多核苷酸，該多肽編碼本實施例或其態樣之TCR。
在另一實施例中，提供表現載體，該表現載體編碼本實施例或其態樣之TCR (例如工程化T細胞受體(TCR)，其中TCR特異性結合退變樣蛋白1 (VGLL1)且包含：(a) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:10)、CDR2 (SEQ ID NO:11)及CDR3 (SEQ ID NO:12)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:21)、CDR2 (SEQ ID NO:22)及CDR3 (SEQ ID NO:23)；(b) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:33)、CDR2 (SEQ ID NO:34)及CDR3 (SEQ ID NO:35)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:44)、CDR2 (SEQ ID NO:45)及CDR3 (SEQ ID NO:46)；(c) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:56)、CDR2 (SEQ ID NO:57)及CDR3 (SEQ ID NO:58)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:67)、CDR2 (SEQ ID NO:68)及CDR3 (SEQ ID NO:69)；或(d) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:79)、CDR2 (SEQ ID NO:80)及CDR3 (SEQ ID NO:81)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:90)、CDR2 (SEQ ID NO:91)及CDR3 (SEQ ID NO:92))。在一些態樣中，編碼TCR之序列在啟動子之控制下。在某些態樣中，表現載體係病毒載體。在一些態樣中，病毒載體係反轉錄病毒載體。在額外態樣中，載體進一步編碼連接體結構域。舉例而言，連接體結構域位於α鏈與β鏈之間。
又一實施例提供經工程化以表現本實施例或其態樣之TCR (例如，工程化T細胞受體(TCR)，其中TCR特異性結合退變樣蛋白1 (VGLL1)且包含：(a) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:10)、CDR2 (SEQ ID NO:11)及CDR3 (SEQ ID NO:12)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:21)、CDR2 (SEQ ID NO:22)及CDR3 (SEQ ID NO:23)；(b) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:33)、CDR2 (SEQ ID NO:34)及CDR3 (SEQ ID NO:35)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:44)、CDR2 (SEQ ID NO:45)及CDR3 (SEQ ID NO:46)；(c) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:56)、CDR2 (SEQ ID NO:57)及CDR3 (SEQ ID NO:58)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:67)、CDR2 (SEQ ID NO:68)及CDR3 (SEQ ID NO:69)；或(d) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:79)、CDR2 (SEQ ID NO:80)及CDR3 (SEQ ID NO:81)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:90)、CDR2 (SEQ ID NO:91)及CDR3 (SEQ ID NO:92))的宿主細胞。在一些態樣中，細胞係T細胞、NK細胞、不變NK細胞、NKT細胞、間質幹細胞(MSC)或誘導性多潛能幹(iPS)細胞。在某些態樣中，宿主細胞係免疫細胞。在特定態樣中，宿主細胞係分離自臍帶。在一些態樣中，T細胞係CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或γδ T細胞。在特定態樣中，T細胞係調控性T細胞(Treg)。在一些態樣中，細胞係自體的。在某些態樣中，細胞係同種異體的。
另一實施例提供工程化本實施例或其態樣之宿主細胞的方法，其包含使該免疫細胞與本實施例或其態樣之TCR (例如，工程化T細胞受體(TCR)，其中TCR特異性結合退變樣蛋白1 (VGLL1)且包含：(a) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:10)、CDR2 (SEQ ID NO:11)及CDR3 (SEQ ID NO:12)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:21)、CDR2 (SEQ ID NO:22)及CDR3 (SEQ ID NO:23)；(b) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:33)、CDR2 (SEQ ID NO:34)及CDR3 (SEQ ID NO:35)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:44)、CDR2 (SEQ ID NO:45)及CDR3 (SEQ ID NO:46)；(c) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:56)、CDR2 (SEQ ID NO:57)及CDR3 (SEQ ID NO:58)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:67)、CDR2 (SEQ ID NO:68)及CDR3 (SEQ ID NO:69)；或(d) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:79)、CDR2 (SEQ ID NO:80)及CDR3 (SEQ ID NO:81)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:90)、CDR2 (SEQ ID NO:91)及CDR3 (SEQ ID NO:92))或本實施例或其態樣中之任一者之表現載體接觸。在一些態樣中，免疫細胞係T細胞或外周血淋巴球。在某些態樣中，接觸進一步定義為轉染或轉導。在一些態樣中，轉染包含將編碼本實施例或其態樣之TCR之RNA電穿孔至免疫細胞中。在一些態樣中，該方法進一步包含在轉導免疫細胞之前自技術方案41之表現載體產生上清液。在一些態樣中，免疫細胞係刺激之淋巴球，例如人類淋巴球。在特定態樣中，刺激包含使免疫細胞與OKT3及/或IL-2中之免疫細胞接觸或培育該免疫細胞。在額外態樣中，該方法進一步包含分選免疫細胞以分離TCR工程化之T細胞。在一些態樣中，該方法進一步包含藉由連續稀釋實施T細胞選殖。在具體態樣中，該方法進一步包含藉由快速擴增方案擴增T細胞純系。
又一實施例提供治療個體之癌症之方法，其包含向個體投與有效量之本實施例或其態樣之TCR工程化之細胞。在一些態樣中，該個體經鑑別具有HLA-A*0101等位基因。在某些態樣中，TCR工程化之細胞係T細胞或外周血淋巴球。在特定態樣中，T細胞係CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或Treg。在一些態樣中，癌症係胰臟癌、卵巢癌、胃癌、乳癌、膀胱癌、子宮癌或子宮頸癌。在某些態樣中，個體係人類。在一些態樣中，TCR工程化之細胞係自體的。在某些態樣中，TCR工程化之細胞係同種異體的。在額外態樣中，該方法進一步包含在投與VGLL1特異性T細胞之前對個體進行淋巴清除。舉例而言，淋巴清除包含投與環磷醯胺(cyclophosphamide)及/或氟達拉濱(fludarabine)。在額外態樣中，該方法進一步包含第二抗癌療法。在一些態樣中，該療法係化學療法、免疫療法、手術、放射療法或生物療法。在某些態樣中，TCR工程化之細胞及/或至少第二治療劑係經靜脈內、腹膜內、氣管內、腫瘤內、肌內、內視鏡、病灶內、經皮、皮下、區域性地或藉由直接注射或灌注來投與。在一些態樣中，個體經確定具有過表現VGLL1之癌細胞。
自以下詳細說明可易知本發明之其他目標、特徵及優點。然而，應瞭解，當闡述本發明之較佳實施例時，詳細說明及具體實例僅以說明方式給出，此乃因熟習此項技術者由該詳細說明可明瞭本發明精神及範圍內之各種變化及修改。
本申請案主張於2020年5月21日提出申請之美國臨時專利申請案第63/028,262號之權益，該案件之整個內容以引用方式併入本文中。
基於細胞毒性T淋巴球(CTL)之癌症免疫療法已顯示藉由靶向腫瘤相關抗原(TAA)誘導臨床消退之巨大前景。為了擴展胰臟導管腺癌(PDAC)之TAA圖譜，對35名PDAC患者之腫瘤樣本實施HLA I類結合肽之串聯質譜分析。此導致鑑別到共有之HLA-A*0101限制性肽，其源自共轉錄活化劑退變樣蛋白1 (VGLL1)，一種新的推定的TAA，其展現在多種腫瘤類型中之過表現及在必需正常組織中之低轉錄本表現或缺乏轉錄本表現。自雄性PDAC患者之血液中分離及擴增VGLL1特異性CTL，顯示以抗原特異性方式識別及殺死大部分HLA-A*0101同種異體腫瘤細胞系之能力，該等細胞系不僅源自PDAC，且亦源自膀胱癌、卵巢癌、胃癌、肺癌及基底樣乳癌。基因表現譜揭示VGLL1係一組獨特的癌症-胎盤抗原(CPA)之成員，其可構成具有多種不同癌症類型之患者之免疫治療性TAA靶標。研究將VGLL1鑑別為來自胰臟溶析之腫瘤相關抗原，如國際專利公開第WO2018/067869號中所述；其全文併入本文中。
使用該等肽表位，自胰臟患者外周血單核細胞(PBMC)產生抗原特異性細胞毒性T淋巴球(CTL)，該等胰臟患者外周血單核細胞識別HLA匹配之同種異體腫瘤細胞系上內源性呈遞之抗原，導致腫瘤細胞殺死。選殖並測序來自該等抗原特異性CTL之T細胞受體(TCR)，且在各種具體實施中，TCR可代表靶向癌症患者中之癌症(例如胰臟、卵巢、胃及乳房腫瘤)之有力工具。因此，本文提供之該等VGLL1特異性TCR可用於靶向實體癌(例如胰臟癌、卵巢癌、胃癌及乳癌)。
因此，本揭示內容提供特異性結合VGLL1之TCR (例如SEQ ID NO:1-92)，例如VGLL1肽表位(LSELETPGKY: SEQ ID NO:93)。本揭示內容亦提供編碼該等TCR之核苷酸序列、包含可用於修飾幼稚T細胞並產生VGLL1特異性T細胞之核苷酸序列之表現載體。本揭示內容進一步提供VGLL1特異性T細胞用於療法、例如用於癌症患者(例如HLA-A*0101陽性癌症患者，其惡性細胞表現VGLL1抗原)之過繼性細胞療法的用途。本文提供之抗原特異性T細胞(例如CTL)可用於靶向實體癌。 I.   定義
如本文所用，就指定組分而言，「基本上不含」在本文中用於意指指定組分皆未有目的地調配至組合物中及/或僅作為污染物或以痕量存在。因此，由組合物之任何非預期污染產生之指定組分之總量遠低於0.05%、較佳低於0.01%。最佳者係其中用標準分析方法不能檢測到任何量之指定組分的組合物。
如本文說明書中所用，「一(a)」或「一(an)」可意指一或多個。如本文申請專利範圍中所用，在結合詞語「包含」使用時，詞語「一(a)」或「一(an)」可意指一個或多於一個。
除非明確指示僅指替代項或替代項相互排斥，否則申請專利範圍中所用術語「或」用於意指「及/或」，但本揭示內容支持僅指替代項及「及/或」之定義。如本文所用「另一」可意指至少第二者或更多。
術語「基本上」應理解為方法或組合物僅包括指定之步驟或材料，及實質上不影響彼等方法及組合物之基本及新穎特徵之彼等。
如本文所用，「實質上不含」指定物質或材料之組合物或介質含有≤ 30%、≤ 20%、≤ 15%、更佳≤ 10%、甚至更佳≤ 5%或最佳≤ 1%之物質或材料。
如本文所用術語「實質上」或「大約」可應用於修飾任何定量比較、值、量測或其他表示，其可容許在不導致其相關之基本功能之變化之情況下變化。
術語「約」通常意指如使用用於量測所述值之標準分析技術所確定之所述值之標準偏差內。該等術語亦可藉由引用所述值之加或減5%來使用。
「治療(Treatment及treating)」係指出於獲得疾病或健康相關病況之治療益處而向個體投與或施加治療劑或對個體實施程序或方式。舉例而言，治療可包括投與T細胞療法。
「個體」及「患者」係指人類或非人類，例如靈長類動物、哺乳動物及脊椎動物。在特定實施例中，個體係人類。
本申請案通篇使用之術語「治療益處」或「治療有效」係指關於該病況之醫學治療促進或增強個體之健康狀況之任何事物。此包括(但不限於)疾病之體徵或症狀之頻率或嚴重程度之降低。舉例而言，癌症之治療可包括例如腫瘤大小之減小、腫瘤侵襲力之降低、癌症生長速率之降低或轉移之預防。癌症之治療亦可指延長患有癌症之個體之存活。
「抗癌」劑例如藉由促進癌細胞之殺死、誘導癌細胞中之細胞凋亡、降低癌細胞之生長速率、降低轉移之發生率或數目、減小腫瘤大小、抑制腫瘤生長、減少對腫瘤或癌細胞之血液供應、促進針對癌細胞或腫瘤之免疫反應、預防或抑制癌症之進展、或增加患有癌症之個體之壽命能夠負面地影響個體之癌細胞/腫瘤。
片語「醫藥或藥理上可接受的」係指在適當時投與動物(例如人類)時不產生不良、過敏或其他不利反應之分子實體及組合物。根據本揭示內容，包含抗體或額外活性成分之醫藥組合物之製備為熟習此項技術者已知。此外，對於動物(例如人類)投與，應理解，製劑應符合如FDA生物標準辦公室(FDA Office of Biological Standards)所需之無菌性、致熱原性、一般安全性及純度標準。
如本文所用「醫藥上可接受之載劑」包括任何及所有水性溶劑(例如，水、醇/水溶液、鹽水溶液、非經腸媒劑，例如氯化鈉、林格氏(Ringer's)右旋糖等)、非水性溶劑(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油及可注射有機酯，例如油酸乙酯)、分散介質、塗料、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細菌或抗真菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、藥物、藥物穩定劑、凝膠、結合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、染料、體液及營養補充劑、該等類似材料及其組合，如熟習此項技術者已知。醫藥組合物中各種組分之pH及確切濃度係根據熟知參數來調節。
術語「單位劑量」或「劑量」係指適用於個體之物理離散單位，各單位含有結合其投與(即適當途徑及治療方案)經計算產生上述期望反應之預定量之治療性組合物。根據治療次數及單位劑量，欲投與之量取決於期望效應。投與給患者或個體之本揭示內容實施例之組合物之實際劑量量可藉由物理及生理因素確定，例如個體之體重、年齡、健康狀況及性別、所治療之疾病之類型、疾病滲透之程度、先前或並行之治療介入、患者之獨特性、投與途徑以及特定治療物質之功效、穩定性及毒性。舉例而言，劑量亦可包含每次投與約1 µg/kg/體重至約1000 mg/kg/體重(此所述範圍包括中間劑量)或更多，以及其中可推導之任何範圍。在來自本文所列示數值之可推導範圍之非限制性實例中，可投與約5 µg/kg/體重至約100 mg/kg/體重、約5 µg/kg/體重至約500 mg/kg/體重等之範圍。在任一情形下，負責投與之執業醫師將決定組合物中活性成分之濃度及用於個別個體之適當劑量。在一些實施例中，抗原特異性T細胞輸注之劑量可包含約100百萬至約30十億細胞，例如10、15或20十億細胞。
術語「腫瘤相關抗原」、「腫瘤抗原」及「癌細胞抗原」在本文中可互換使用。在每一情形下，該術語係指由癌細胞特異性或優先表現之蛋白質、醣蛋白或碳水化合物。
如本文所用術語「嵌合抗原受體(CAR)」可指例如人工T細胞受體、嵌合T細胞受體或嵌合免疫受體，且涵蓋將人工特異性移植至特定免疫效應細胞上之工程化之受體。CAR可用於將單株抗體之特異性賦予至T細胞上，從而允許產生大量特異性T細胞，例如用於過繼性細胞療法。在具體實施例中，例如，CAR將細胞之特異性引導至腫瘤相關抗原。在一些實施例中，CAR包含細胞內活化結構域、跨膜結構域及包含腫瘤相關抗原結合區之細胞外結構域。在特定態樣中，CAR包含源自單株抗體之單鏈可變片段(scFv)與CD3-ζ跨膜結構域及胞內結構域融合之融合體。其他CAR設計之特異性可源自受體(例如肽)之配體或源自模式識別受體，例如Dectins。在某些情形下，可修飾抗原識別結構域之間距以減少活化誘導之細胞死亡。在某些情形下，CAR包含用於額外共刺激信號傳導之結構域，例如CD3ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10及/或OX40。在一些情形下，分子可與CAR共表現，包括共刺激分子、用於成像(例如，用於正電子發射斷層攝影術)之報導基因、在添加前藥時有條件地消除T細胞之基因產物、歸巢受體、趨化介素、趨化介素受體、細胞介素及細胞介素受體。
聚核苷酸或聚核苷酸區(或多肽或多肽區)與另一序列具有一定百分比(例如80%、85%、90%或95%)之「序列一致性」或「同源性」意指，當比對時，比較兩個序列時鹼基(或胺基酸)之百分比相同。此比對及同源性或序列一致性百分比可使用業內已知之軟體程式來測定，例如在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel等人編輯，1987)增刊30，第7.7.18部分，表7.7.1中所述之彼等軟體程式。較佳地，內定參數用於比對。較佳比對程式係使用內定參數之BLAST。具體而言，較佳程式係BLASTN及BLASTP，使用以下內定參數：遺傳密碼=標準；濾波器=無；股=兩者；截止值=60；期望值=10；矩陣= BLOSUM62；說明=50個序列；分類依據=高分；數據庫=非冗餘，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。 II.    VGLL1 TCR方法及組合物
在一些實施例中，本揭示內容提供VGLL1特異性TCR。TCR可包含SEQ ID NO:16-19、39-41、62-64或86-87之α鏈CDR及/或SEQ ID NO:21-23、44-46、67-69或90-92之β鏈CDR。TCR可包含與SEQ ID NO:15、38、61或84具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性或相似性之α可變鏈及/或與SEQ ID NO:20、43、66或89具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性或相似性之β可變鏈。TCR可包含與SEQ ID NO:13、36、59或82具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性或相似性之胺基酸序列。
本文亦提供編碼本文提供之VGLL1 TCR之α鏈及/或β鏈的多核苷酸。編碼本揭示內容TCR之多核苷酸可包含SEQ ID NO:4-6、27-29、50-52或73-75之α鏈CDR及/或SEQ ID NO:10-12、33-35、56-58或79-81之β鏈CDR。TCR可由與SEQ ID NO:1、24、47或70具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性或相似性之α鏈及/或與SEQ ID NO:7、30、53或76具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性或相似性之β鏈編碼。TCR可由與SEQ ID NO:3、26、49或72具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性或相似性之α可變鏈及/或與SEQ ID NO:9、32、55或78具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性或相似性之β可變鏈編碼。
本揭示內容TCR之抗原結合區可包括於嵌合抗原受體(CAR)中作為包含抗原結合區之細胞外結構域。TCR可轉染至可用於過繼性細胞轉移療法中之細胞(例如自體或同種異體細胞)中。在一些實施例中，CAR經人類化以降低免疫原性(hCAR)。
下文提供VGLL1 TCR序列。VGLL1 TCR #1 TRAV19*01 J56*01/ TRBVC1 5-6*01 J1-1 α 鏈 TCTAGACCGCCATGGGTCGACGCCACC ATGAACATGCTGACTGCCAGCCTGTTGAGGGCAGTCATAGCCTCCATCTGTGTTGTATCCAGCATGGCTCAGAAGGTAACTCAAGCGCAGACTGAAATTTCTGTGGTGGAGAAGGAGGATGTGACCTTGGACTGTGTGTATGAAACCCGTGATACTACTTATTACTTATTCTGGTACAAGCAACCACCAAGTGGAGAATTGGTTTTCCTTATTCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCAAAATGAAATAAGTGGTCGGTATTCTTGGAACTTCCAGAAATCCACCAGTTCCTTCAACTTCACCATCACAGCCTCACAAGTCGTGGACTCAGCAGTATACTTCTGTGCTCTGAGTCCTGGAGCCAATAGTAAGCTGACATTTGGAAAAGGAATAACTCTGAGTGTTAGACCAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC (SEQ ID NO:1)VGLL1 TCR #1 α鏈信號肽 ATGAACATGCTGACTGCCAGCCTGTTGAGGGCAGTCATAGCCTCCATCTGTGTTGTATCCAGCATGGCT (SEQ ID NO:2)VGLL1 TCR #1 α鏈 V 區 CAGAAGGTAACTCAAGCGCAGACTGAAATTTCTGTGGTGGAGAAGGAGGATGTGACCTTGGACTGTGTGTATGAAACCCGTGATACTACTTATTACTTATTCTGGTACAAGCAACCACCAAGTGGAGAATTGGTTTTCCTTATTCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCAAAATGAAATAAGTGGTCGGTATTCTTGGAACTTCCAGAAATCCACCAGTTCCTTCAACTTCACCATCACAGCCTCACAAGTCGTGGACTCAGCAGTATACTTCTGTGCTCTGAGTCCTGGAGCCAATAGTAAGCTGACATTTGGAAAAGGAATAACTCTGAGTGTTAGACCAG (SEQ ID NO:3)VGLL1 TCR #1 α鏈 CDR1 ACCCGTGATACTACTTATTAC (SEQ ID NO:4)VGLL1 TCR #1 α鏈 CDR2 CGGAACTCTTTTGATGAGCAAAAT (SEQ ID NO:5)VGLL1 TCR #1 α鏈 CDR3 TGTGCTCTGAGTCCTGGAGCCAATAGTAAGCTGACATTT (SEQ ID NO:6)VGLL1 TCR #1 β 鏈 ATGGGCCCCGGGCTCCTCTGCTGGGCACTGCTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCTTAGTGGACGCTGGAGTCACCCAAAGTCCCACACACCTGATCAAAACGAGAGGACAGCAAGTGACTCTGAGATGCTCTCCTAAGTCTGGGCATGACACTGTGTCCTGGTACCAACAGGCCCTGGGTCAGGGGCCCCAGTTTATCTTTCAGTATTATGAGGAGGAAGAGAGACAGAGAGGCAACTTCCCTGATCGATTCTCAGGTCACCAGTTCCCTAACTATAGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCCTTGTTGCTGGGGGACTCGGCCCTCTATCTCTGTGCCAGCAGCGTCGGGACAGGTATCACTGAAGCTTTCTTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTCTGACTCGAGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCGATAAAATAA (SEQ ID NO:7)VGLL1 TCR #1 β 鏈信號肽 ATGGGCCCCGGGCTCCTCTGCTGGGCACTGCTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCTTAGTGGACGCT (SEQ ID NO:8)VGLL1 TCR #1 β 鏈 V 區 GGAGTCACCCAAAGTCCCACACACCTGATCAAAACGAGAGGACAGCAAGTGACTCTGAGATGCTCTCCTAAGTCTGGGCATGACACTGTGTCCTGGTACCAACAGGCCCTGGGTCAGGGGCCCCAGTTTATCTTTCAGTATTATGAGGAGGAAGAGAGACAGAGAGGCAACTTCCCTGATCGATTCTCAGGTCACCAGTTCCCTAACTATAGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCCTTGTTGCTGGGGGACTCGGCCCTCTATCTCTGTGCCAGCAGCGTCGGGACAGGTATCACTGAAGCTTTCTTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTAG (SEQ ID NO:9)VGLL1 TCR #1 β 鏈 CDR1 TCTGGGCATGACACT (SEQ ID NO:10)VGLL1 TCR #1 β 鏈 CDR2 TATTATGAGGAGGAAGAG (SEQ ID NO:11)VGLL1 TCR #1 β 鏈 CDR3 TGTGCCAGCAGCGTCGGGACAGGTATCACTGAAGCTTTCTTT (SEQ ID NO:12)VGLL1 TCR #1 胺基酸序列 MNMLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSPGANSKLTFGKGITLSVRPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSVGTGITEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF (SEQ ID NO:13)VGLL1 TCR #1 α鏈信號肽 MNMLTASLLRAVIASICVVSSM (SEQ ID NO:14)VGLL1 TCR #1 α鏈 V 區 AQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSPGANSKLTFGKGITLSVRPDIQ (SEQ ID NO:15)VGLL1 TCR #1 α鏈 CDR1 TRDTTYY (SEQ ID NO:16)VGLL1 TCR #1 α鏈 CDR2 RNSFDEQN (SEQ ID NO:17)VGLL1 TCR #1 α鏈 CDR3 CALSPGANSKLTF (SEQ ID NO:18)VGLL1 TCR #1 β 鏈信號肽 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ATGGGCCCCGGGCTCCTCTGCTGGGCACTGCTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCTTAGTGGACGCTGGAGTCACCCAAAGTCCCACACACCTGATCAAAACGAGAGGACAGCAAGTGACTCTGAGATGCTCTCCTAAGTCTGGGCATGACACTGTGTCCTGGTACCAACAGGCCCTGGGTCAGGGGCCCCAGTTTATCTTTCAGTATTATGAGGAGGAAGAGAGACAGAGAGGCAACTTCCCTGATCGATTCTCAGGTCACCAGTTCCCTAACTATAGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCCTTGTTGCTGGGGGACTCGGCCCTCTATCTCTGTGCCAGCAGCGTCGGGACAGGTATCACTGAAGCTTTCTTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTCTGA CTCGAG AAGCTTGCGGCCGC GGATCCGATAA (SEQ ID NO:30)VGLL1 TCR #2 β 鏈信號肽 ATGGGCCCCGGGCTCCTCTGCTGGGCACTGCTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCTTAGTGGACGCT (SEQ ID NO:31)VGLL1 TCR #2 β 鏈 V 區 GGAGTCACCCAAAGTCCCACACACCTGATCAAAACGAGAGGACAGCAAGTGACTCTGAGATGCTCTCCTAAGTCTGGGCATGACACTGTGTCCTGGTACCAACAGGCCCTGGGTCAGGGGCCCCAGTTTATCTTTCAGTATTATGAGGAGGAAGAGAGACAGAGAGGCAACTTCCCTGATCGATTCTCAGGTCACCAGTTCCCTAACTATAGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCCTTGTTGCTGGGGGACTCGGCCCTCTATCTCTGTGCCAGCAGCGTCGGGACAGGTATCACTGAAGCTTTCTTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTAG (SEQ ID NO:32)VGLL1 TCR #2 β 鏈 CDR1 TCTGGGCATGACACT (SEQ ID NO:33)VGLL1 TCR #2 β 鏈 CDR2 TATTATGAGGAGGAAGAG (SEQ ID NO:34)VGLL1 TCR #2 β 鏈 CDR3 TGTGCCAGCAGCGTCGGGACAGGTATCACTGAAGCTTTCTTT (SEQ ID NO:35)VGLL1 TCR #2 胺基酸序列 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MGPGLLCWALLCLLGAGLVDA (SEQ ID NO:42)VGLL1 TCR #2 β 鏈 V 區 GVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSVGTGITEAFFGQGTRLTVVE (SEQ ID NO:43)VGLL1 TCR #2 β 鏈 CDR1 SGHDT (SEQ ID NO:44)VGLL1 TCR #2 β 鏈 CDR2 YYEEEE (SEQ ID NO:45)VGLL1 TCR #2 β 鏈 CDR3 CASSVGTGITEAFF (SEQ ID NO:46)VGLL1 TCR#3 TRAV13-1*02 J1301/ TRBVC1 5-6*01 J1-1 α鏈 TCTAGACCGCCATGGGTCGACGCCACC 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ATGGGCCCCGGGCTCCTCTGCTGGGCACTGCTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCTTAGTGGACGCT (SEQ ID NO:54)VGLL1 TCR #3 β 鏈 V 區 GGAGTCACCCAAAGTCCCACACACCTGATCAAAACGAGAGGACAGCAAGTGACTCTGAGATGCTCTCCTAAGTCTGGGCATGACACTGTGTCCTGGTACCAACAGGCCCTGGGTCAGGGGCCCCAGTTTATCTTTCAGTATTATGAGGAGGAAGAGAGACAGAGAGGCAACTTCCCTGATCGATTCTCAGGTCACCAGTTCCCTAACTATAGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCCTTGTTGCTGGGGGACTCGGCCCTCTATCTCTGTGCCAGCAGCGTCGGGACAGGTATCACTGAAGCTTTCTTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTAG (SEQ ID NO:55)VGLL1 TCR #3 β 鏈 CDR1 TCTGGGCATGACACT (SEQ ID NO:56)VGLL1 TCR #3 β 鏈 CDR2 TATTATGAGGAGGAAGAG (SEQ ID NO:57)VGLL1 TCR #3 β 鏈 CDR3 TGTGCCAGCAGCGTCGGGACAGGTATCACTGAAGCTTTCTTT (SEQ ID NO:58)VGLL1 TCR #3 胺基酸序列 MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKRPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAAIPNSGGYQKVTFGIGTKLQVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSVGTGITEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF (SEQ ID NO:59)VGLL1 TCR #3 α鏈信號肽 MTSIRAVFIFLWLQLDLVNG (SEQ ID NO:60)VGLL1 TCR #3 α鏈 V 區 ENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKRPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAAIPNSGGYQKVTFGIGTKLQVIPNI (SEQ ID NO:61)VGLL1 TCR #3 α鏈 CDR1 DSASNY (SEQ ID NO:62)VGLL1 TCR #3 α鏈 CDR2 IRSNVGE (SEQ ID NO:63)VGLL1 TCR #3 α鏈 CDR3 CAAIPNSGGYQKVTF (SEQ ID NO:64)VGLL1 TCR #3 β 鏈信號肽 MGPGLLCWALLCLLGAGLVDA (SEQ ID NO:65)VGLL1 TCR #3 β 鏈 V 區 GVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSVGTGITEAFFGQGTRLTVV (SEQ ID NO:66)VGLL1 TCR #3 β 鏈 CDR1 SGHDT (SEQ ID NO:67)VGLL1 TCR #3 β 鏈 CDR2 YYEEE (SEQ ID NO:68)VGLL1 TCR #3 β 鏈 CDR3 CASSVGTGITEAFF (SEQ ID NO:69)VGLL1 TCR #4   TRAV23 J12/TRBV5-6*01 FJ1-1*01 F α鏈 TCTAGACCGCCATGGGTCGACGCCACC 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ATGGGCCCCGGGCTCCTCTGCTGGGCACTGCTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCTTAGTGGACGCTGGAGTCACCCAAAGTCCCACACACCTGATCAAAACGAGAGGACAGCAAGTGACTCTGAGATGCTCTCCTAAGTCTGGGCATGACACTGTGTCCTGGTACCAACAGGCCCTGGGTCAGGGGCCCCAGTTTATCTTTCAGTATTATGAGGAGGAAGAGAGACAGAGAGGCAACTTCCCTGATCGATTCTCAGGTCACCAGTTCCCTAACTATAGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCCTTGTTGCTGGGGGACTCGGCCCTCTATCTCTGTGCCAGCAGCGTCGGGACAGGTATCACTGAAGCTTTCTTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTCTGACTCGAGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCGATAAA (SEQ ID NO:76)VGLL1 TCR #4 β 鏈信號肽 ATGGGCCCCGGGCTCCTCTGCTGGGCACTGCTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCTTAGTGGACGCT (SEQ ID NO:77)VGLL1 TCR #4 β 鏈 V 區 GGAGTCACCCAAAGTCCCACACACCTGATCAAAACGAGAGGACAGCAAGTGACTCTGAGATGCTCTCCTAAGTCTGGGCATGACACTGTGTCCTGGTACCAACAGGCCCTGGGTCAGGGGCCCCAGTTTATCTTTCAGTATTATGAGGAGGAAGAGAGACAGAGAGGCAACTTCCCTGATCGATTCTCAGGTCACCAGTTCCCTAACTATAGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCCTTGTTGCTGGGGGACTCGGCCCTCTATCTCTGTGCCAGCAGCGTCGGGACAGGTATCACTGAAGCTTTCTTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTAG (SEQ ID NO:78)VGLL1 TCR #4 β 鏈 CDR1 TCTGGGCATGACACT (SEQ ID NO:79)VGLL1 TCR #4 β 鏈 CDR2 TATTATGAGGAGGAAGAG (SEQ ID NO:80)VGLL1 TCR #4 β 鏈 CDR3 TGTGCCAGCAGCGTCGGGACAGGTATCACTGAAGCTTTCTTT (SEQ ID NO:81)VGLL1 TCR #4 胺基酸序列 MDKILGASFLVLWLQLCWVSGQQKEKSDQQQVKQSPQSLIVQKGGISIINCAYENTAFDYFPWYQQFPGKGPALLIAIRPDVSEKKEGRFTISFNKSAKQFSLHIMDSQPGDSATYFCAAVRYNFNKFYFGSGTKLNVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSVGTGITEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF (SEQ ID NO:82)VGLL1 TCR #4 α鏈信號肽 MDKILGASFLVLWLQLCWVSG (SEQ ID NO:83)VGLL1 TCR #4 α鏈 V 區 QQKEKSDQQQVKQSPQSLIVQKGGISIINCAYENTAFDYFPWYQQFPGKGPALLIAIRPDVSEKKEGRFTISFNKSAKQFSLHIMDSQPGDSATYFCAAVRYNFNKFYFGSGTKLNVKPNIQ (SEQ ID NO:84)VGLL1 TCR #4 α鏈 CDR1 NTAFDY (SEQ ID NO:85)VGLL1 TCR #4 α鏈 CDR2 IRPDVSE (SEQ ID NO:86)VGLL1 TCR #4 α鏈 CDR3 CAAVRYNFNKFYF (SEQ ID NO:87)VGLL1 TCR #4 β 鏈信號肽 MGPGLLCWALLCLLGAGLVDA (SEQ ID NO:88)VGLL1 TCR #4 β 鏈 V 區 GVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSVGTGITEAFFGQGTRLTVV (SEQ ID NO:89)VGLL1 TCR #4 β 鏈 CDR1 SGHDT (SEQ ID NO:90)VGLL1 TCR #4 β 鏈 CDR2 YYEEEE (SEQ ID NO:91)VGLL1 TCR #4 β 鏈 CDR3 CASSVGTGITEAFF (SEQ ID NO:92)
在一些實施例中，本揭示內容之宿主細胞(例如T細胞(例如CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、γδ T細胞及Tregs)、NK細胞、不變NK細胞、NKT細胞、間質幹細胞(MSCs)或誘導性多潛能幹(iPS)細胞)可經遺傳工程化以表現抗原受體，例如工程化TCR及/或CAR。因此，本文進一步提供經工程化以表現本文提供之VGLL1特異性TCR之細胞，例如T細胞、NK細胞、不變NK細胞、NKT細胞、MSC或iPS細胞。舉例而言，自體或同種異體細胞(例如，自臍帶分離)經修飾以表現對癌症抗原具有抗原特異性之TCR。該等非T細胞效應免疫細胞可表現TCR以及CD3分子或與該TCR連接之其他信號傳導結構域，此將起始該等細胞中之信號轉導。適宜修飾方法為業內已知。參見(例如) Sambrook及Ausubel，上文文獻。舉例而言，可使用以下中所述之轉導技術轉導T細胞以表現對癌症抗原具有抗原特異性之TCR：Heemskerk等人Hum Gene Ther. 19:496-510 (2008)及Johnson等人Blood 114:535-46 (2009)。
在一些實施例中，抗原特異性細胞可藉由使用本文提供之VGLL1 TCR (例如SEQ ID NO:1-92)產生。在此方法中，將該TCR序列插入載體(例如，反轉錄病毒或慢病毒載體)中，該載體被引入宿主細胞(例如CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、γδ T細胞及Tregs)、NK細胞、不變NK細胞、NKT細胞、MSC或iPS細胞)中，以產生可用於癌症患者之過繼性細胞療法之抗原特異性細胞。
可使用熟習此項技術者已知之許多確立之基因轉移方法中之任一者來構築工程化之免疫細胞。在某些實施例中，使用基於病毒載體之基因轉移方法構築工程化之細胞，以引入編碼VGLL1特異性TCR之核酸。基於病毒載體之基因轉移方法可包括慢病毒載體、反轉錄病毒載體、腺病毒或腺相關病毒載體。在某些實施例中，使用基於非病毒載體之基因轉移方法構築工程化之細胞，以引入編碼VGLL1特異性TCR之核酸。TCR之載體可包含α鏈多肽及β鏈多肽，其可藉由連接體結構域或IRES序列連接。在某些實施例中，基於非病毒載體之基因轉移方法包括選自由以下組成之群之基因編輯方法：鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應物核酸酶(TALEN)及成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)/CRISPR相關蛋白9 (Cas9)核酸酶。在某些實施例中，基於非病毒載體之基因編輯方法包含選自由以下組成之群之轉染或轉變方法：脂轉染、核轉染、病毒體、脂質體、聚陽離子或脂質：核酸結合物、裸DNA、人工病毒粒子及試劑增強之DNA攝取。
編碼全長TCR α及β (或γ及δ)鏈之RNA之電穿孔可用作克服由反轉錄病毒轉導及內源性TCR鏈之配對引起之自體反應性之長期問題的替代方案。即使該等交替配對發生在瞬時轉染策略中，可能產生之自體反應性T細胞通常在一段時間後喪失此自體反應性，此乃因引入之TCR α及β鏈僅瞬時表現。當導入之TCR α及β鏈表現減少時，僅留下正常自體T細胞。當全長TCR鏈藉由穩定反轉錄病毒轉導引入時，情況並非如此，此乃因該轉導不會喪失引入之TCR鏈，從而在患者中引起持續存在之自體反應性。
實例性抗原受體(包括CAR及重組TCR)以及用於工程化細胞及將受體引入細胞中之方法包括以下中所述之彼等：國際專利申請公開案第WO200014257號、第WO2013126726號、第WO2012/129514號、第WO2014031687號、第WO2013/166321號、第WO2013/071154號、第WO2013/123061號；美國專利申請公開案第US2002131960號、第US2013287748號、第US20130149337號、美國專利第6,451,995號、第7,446,190號、第8,252,592號、第8,339,645號、第8,398,282號、第7,446,179號、第6,410,319號、第7,070,995號、第7,265,209號、第7,354,762號、第7,446,191號、第8,324,353號及第8,479,118號；及歐洲專利申請案第EP2537416號、及/或以下中所述之彼等：Sadelain等人，Cancer Discov .  2013年4月；3(4): 388-398；Davila等人 (2013)PLoS ONE 8(4): e61338；Turtle等人，Curr. Opin. Immunol ., 2012年10月；24(5): 633-39；Wu等人，Cancer , 2012年3月18(2): 160-75。在一些態樣中，遺傳工程化抗原受體包括如美國專利第7,446,190號中所述之CAR、及國際專利申請公開案第WO/2014055668 Al號中所述之彼等。 A．  T細胞受體
在一些實施例中，遺傳工程化抗原受體包括重組TCR及/或自天然存在之T細胞選殖之TCR。「T細胞受體」或「TCR」係指含有可變a及β鏈(亦分別稱為TCRα及TCRβ)或可變γ及δ鏈(亦分別稱為TCRγ及TCRδ)且其能夠特異性結合至與MHC受體結合之抗原肽的分子。在一些實施例中，TCR呈αβ形式。
通常，以αβ及γδ形式存在之TCR通常結構上相似，但表現其之T細胞可具有不同解剖學位置或功能。可在細胞表面上或以可溶形式發現TCR。通常，在T細胞(或T淋巴球)之表面上發現TCR，在該表面上TCR通常負責識別與主要組織相容性複合體(MHC)分子結合之抗原。在一些實施例中，TCR亦可含有恆定結構域、跨膜結構域及/或短胞質尾區(例如，參見Janeway等人，Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 第3版, Current Biology Publications, 第433頁, 1997)。舉例而言，在一些態樣中，TCR之每一鏈可具有一個N-末端免疫球蛋白可變結構域、一個免疫球蛋白恆定結構域、跨膜區及在C-末端之短胞質尾區。在一些實施例中，TCR與參與介導信號轉導之CD3複合物之不變蛋白相關。除非另外陳述，否則「TCR」應理解為涵蓋其功能性TCR片段。該術語亦涵蓋完整或全長TCR，包括呈αβ形式或γδ形式之TCR。
因此，出於本文之目的，TCR之提及包括任何TCR或功能片段，例如結合至結合於MHC分子之特定抗原肽之TCR之抗原結合部分，亦即MHC-肽複合物。TCR之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」可互換使用，係指含有TCR之結構性結構域之一部分、但結合完全TCR所結合之抗原(例如MHC-肽複合物)之分子。在一些情形下，抗原結合部分含有足以形成用於結合至特異性MHC-肽複合物之結合位點的TCR之可變結構域，例如TCR之可變a鏈及β鏈，例如通常其中每一鏈含有三個互補決定區。
在一些實施例中，TCR鏈之可變結構域締合以形成類似於免疫球蛋白之環或互補決定區(CDR)，其賦予抗原識別且藉由形成TCR分子之結合位點來決定肽特異性，且決定肽特異性。通常，與免疫球蛋白一樣，CDR由構架區(FR)分開(例如，參見Jores等人，PNAS U.S.A . 87:9138, 1990；Chothia等人，EMBO J . 7:3745, 1988；亦參見Lefranc等人，Dev. Comp. Immunol . 27:55, 2003)。在一些實施例中，CDR3係負責識別經處理之抗原之主要CDR，儘管α鏈之CDR1亦顯示與抗原肽之N-末端部分相互作用，而β鏈之CDR1與肽之C-末端部分相互作用。CDR2被認為識別MHC分子。在一些實施例中，β-鏈之可變區可含有又一超變(HV4)區。
在一些實施例中，TCR鏈含有恆定結構域。舉例而言，與免疫球蛋白一樣，TCR鏈(例如，α鏈、β鏈)之細胞外部分可含有兩個免疫球蛋白結構域、在N-末端之可變結構域(例如，Va 或Vp；通常基於Kabat編號之胺基酸1至116，Kabat等人，「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 第5版)及一個鄰近細胞膜之恆定結構域(例如，a鏈恆定結構域或Ca ，通常基於Kabat之胺基酸117至259；β鏈恆定結構域或Cp，通常基於Kabat之胺基酸117至295)。舉例而言，在一些情形下，由兩條鏈形成之TCR之細胞外部分含有兩個近膜恆定結構域、及兩個含有CDR之遠膜可變結構域。TCR結構域之恆定結構域含有短連接序列，其中半胱胺酸殘基形成二硫鍵，使得在兩條TCR鏈之間形成連接。在一些實施例中，TCR在α及β鏈中之每一者中可含有額外半胱胺酸殘基，使得TCR在恆定結構域中含有兩個二硫鍵。
在一些實施例中，TCR鏈可含有跨膜結構域。在一些實施例中，跨膜結構域帶正電荷。在一些情形下，TCR鏈含有胞質尾區。在一些情形下，該結構允許TCR與如CD3等其他分子締合。舉例而言，含有恆定結構域及跨膜區之TCR可將蛋白質錨定在細胞膜中，並與CD3信號傳導裝置或複合物之不變亞基締合。
通常，CD3係可具有哺乳動物中之三條不同鏈(γ、δ及ε)及ζ鏈之多蛋白複合物。舉例而言，在哺乳動物中，複合物可含有CD3γ鏈、CD3δ鏈、兩條CD3ε鏈、及CD3ζ鏈之同二聚體。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈係含有單一免疫球蛋白結構域之免疫球蛋白超家族之高度相關之細胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈之跨膜區帶負電荷，此係允許該等鏈與帶正電荷之T細胞受體鏈締合之特徵。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈之細胞內尾區各自含有單一保守基序，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM，而每一CD3ζ鏈具有三個基序。通常，ITAM參與TCR複合物之信號傳導能力。該等輔助分子具有帶負電荷之跨膜區，且在將信號自TCR傳播至細胞中起作用。CD3-及ζ-鏈與TCR一起形成所謂之T細胞受體複合物。
在一些實施例中，TCR可為兩條鏈α及β (或視情況γ及δ)之異二聚體，或其可為單鏈TCR構築體。在一些實施例中，TCR係含有兩條單獨鏈(α鏈及β鏈或γ鏈及δ鏈)之異二聚體，該兩條鏈藉由例如一或多個二硫鍵連接。在一些實施例中，鑑別靶抗原(例如，癌症抗原)之TCR並將其引入細胞中。在一些實施例中，編碼TCR之核酸可由各種來源獲得，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增可公開獲得之TCR DNA序列。在一些實施例中，TCR係自生物來源、例如自細胞、例如自T細胞(例如細胞毒性T細胞)、T細胞雜交瘤或其他可公開獲得之來源獲得。在一些實施例中，T細胞可自活體內分離之細胞中獲得。在一些實施例中，可自患者分離高親和力T細胞純系，並分離TCR。在一些實施例中，T細胞可為培養之T細胞雜交瘤或純系。在一些實施例中，在經人類免疫系統基因(例如，人類白血球抗原系統或HLA)工程化之轉基因小鼠中已產生靶抗原之TCR純系。例如，參見腫瘤抗原(例如，參見Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res . 15: 169-180及Cohen等人 (2005)J Immunol . 175:5799-5808)。在一些實施例中，噬菌體展示用於分離針對靶抗原之TCR (例如，參見Varela-Rohena等人 (2008)Nat Med . 14: 1390-1395及Li (2005)Nat Biotechnol . 23:349-354)。在一些實施例中，TCR或其抗原結合部分可根據TCR序列之知識合成產生。 B．   嵌合T細胞受體
在一些實施例中，工程化抗原受體包括CAR，包括活化或刺激性CAR、共刺激性CAR (參見WO2014/055668)及/或抑制性CAR (iCAR，參見Fedorov等人，Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013年12月)。在一些態樣中，CAR通常包括經由連接體及/或跨膜結構域與一或多個細胞內信號傳導組分連接之細胞外抗原(或配體)結合結構域。該等分子通常模擬或近似通過天然抗原受體之信號、通過該受體與共刺激性受體組合之信號及/或通過單獨共刺激性受體之信號。在一些實施例中，CAR包括抗體分子之一或多個抗原結合部分，例如源自單株抗體(mAb)之可變重(VH)及可變輕(VL)鏈之單鏈抗體片段(scFv)。
CAR之抗原結合結構域之佈置可為多聚體，例如雙價抗體或多聚體。多聚體可藉由將輕鏈及重鏈之可變部分交叉配對成可稱為雙價抗體者而形成。在一些實施例中，CAR之鉸鏈部分可縮短或排除(即，產生僅包括抗原結合結構域、跨膜區及細胞內信號傳導結構域之CAR)。本發明可使用多種鉸鏈，如表1中所示。在一些實施例中，鉸鏈區可維持第一半胱胺酸，或藉由脯胺酸或絲胺酸取代突變，或截短至第一半胱胺酸。Fc部分可自用作抗原結合區之scFv中缺失，以產生本發明之CAR。在一些實施例中，抗原結合區可編碼Fc結構域中之僅一者，例如來自人類免疫球蛋白之CH2或CH3結構域。一者亦可包括人類免疫球蛋白之鉸鏈、CH2及CH3區，人類免疫球蛋白經修飾以改善二聚化及寡聚化。在一些實施例中，鉸鏈部分可包含8-14個胺基酸之肽(例如12個AA之肽)、CD8α之一部分或IgG4 Fc，或由其組成。在一些實施例中，可使用促進寡聚化之結構域(例如CD8 α)將抗原結合結構域自細胞表面懸浮。在一些實施例中，可使用由單株抗體(mAb)純系2D3 (例如Singh等人，2008中闡述之mAb純系2D3)識別之結構域將抗原結合結構域自細胞表面懸浮。
CAR之胞內結構域或細胞內信號傳導結構域通常可引起或促進包含CAR之免疫細胞之至少一種正常效應功能之活化。舉例而言，胞內結構域可促進T細胞之效應功能，例如細胞溶解活性或包括細胞介素分泌之輔助活性。幼稚、記憶或記憶型T細胞中之效應功能可包括抗原依賴性增殖。術語「細胞內信號傳導結構域」或「胞內結構域」係指可轉導效應功能信號及/或引導細胞執行專門功能之CAR之部分。儘管通常整個細胞內信號傳導結構域可包括在CAR中，但在一些情形下，可包括胞內結構域之截短部分。通常，胞內結構域包括截短之胞內結構域，其中截短之胞內結構域保留轉導細胞中效應功能信號之能力。
在一些實施例中，胞內結構域包含T細胞受體之ζ鏈或任何其同系物(例如，η、δ、γ或ε)、MB1鏈、B29、Fc RIII、Fc RI及信號傳導分子之組合，例如CD3ζ及CD28、CD27、4-1BB、DAP-10、OX40及其組合，以及其他類似之分子及片段。可使用活化蛋白家族之其他成員之細胞內信號傳導部分，例如FcγRIII及FcεRI。該等替代跨膜及細胞內結構域之實例可參見例如Gross等人 (1992), Stancovski等人 (1993), Moritz等人 (1994), Hwu等人(1995), Weijtens等人 (1996)及Hekele等人(1996)，其全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，胞內結構域可包含人類CD3ζ細胞內結構域。
抗原特異性細胞外結構域及細胞內信號傳導結構域較佳藉由跨膜結構域連接。可包括在CAR中之跨膜結構域包括(例如)人類IgG4 Fc鉸鏈及Fc區、人類CD4跨膜結構域、人類CD28跨膜結構域、跨膜人類CD3ζ結構域、或半胱胺酸突變之人類CD3ζ結構域、或來自人類跨膜信號傳導蛋白(例如CD16及CD8以及促紅血球生成素受體)之跨膜結構域。
在一些實施例中，胞內結構域包含編碼共刺激受體(例如，經修飾之CD28細胞內信號傳導結構域、或CD28、CD27、OX-40 (CD134)、DAP10、或4-1BB (CD137)共刺激受體)之序列。在一些實施例中，CAR中可包括由CD3ζ起始之初級信號、由人類共刺激受體提供之額外信號二者，以更有效地活化轉變之T細胞，此可幫助改善過繼性免疫療法之活體內持久性及治療成功。如表1中所述，胞內結構域或細胞內受體信號傳導結構域可包含單獨CD3或與Fcγ RIII共刺激信號傳導結構域(例如CD28、CD27、DAP10、CD137、OX40、CD2、4-1BB)之組合之ζ鏈。在一些實施例中，胞內結構域包含TCR ζ鏈、CD28、CD27、OX40/CD134、4-1BB/CD137、Fc ε RI γ、ICOS/CD278、IL-2Rβ/CD122、IL-2Rα/CD132、DAP10、DAP12及CD40中之一或多者之部分或全部。在一些實施例中，胞內結構域中可包括1、2、3、4或更多個細胞質結構域。舉例而言，在一些CAR中，已觀察到融合在一起之至少兩個或三個信號傳導結構域可導致相加或協同效應。
在一些態樣中，可產生包括編碼CAR之DNA序列之分離之核酸區段及表現盒。可使用多種載體。在一些較佳實施例中，載體可允許將編碼CAR之DNA遞送至免疫細胞，例如T細胞。CAR表現可在受調控之真核啟動子(例如MNDU3啟動子、CMV啟動子、EF1α啟動子或泛素啟動子)之控制下。此外，若無其他原因，載體可含有可選標記物，以促進其活體外操作。在一些實施例中，CAR可在活體外從自DNA模板轉錄之mRNA表現。
嵌合抗原受體分子係重組的，且藉由其經由存在於其胞質尾區中之免疫受體活化基序(ITAM)結合抗原及轉導活化信號之能力加以區分。利用抗原結合部分(例如，由單鏈抗體(scFv)產生)之受體構築體提供「通用」之額外優點，此乃因其可以HLA獨立性方式結合靶細胞表面上之天然抗原。舉例而言，scFv構築體可與編碼CD3複合物之ζ鏈(ζ)、Fc受體γ鏈及sky酪胺酸激酶之細胞內部分之序列融合(Eshhar等人，1993；Fitzer-Attas等人，1998)。在若干鼠類及人類抗原-scFv:ζ系統中已記載包括CTL之腫瘤識別及溶解之重新定向T細胞效應機制(Eshhar等人，1997；Altenschmidt等人，1997；Brocker等人，1998)。
在一些實施例中，TCR作為抗原結合結構域(例如作為scFv區)包含在CAR中，且CAR進一步包含鉸鏈區、跨膜區及胞內結構域。 C.     可溶性TCR及BiTE
另外，本揭示內容提供可直接用於治療陽性癌症患者之可溶性TCR。可溶性雙特異性T細胞接合分子(BiTE)可藉由將VGLL1 TCR連接至CD3特異性Fab片段而產生。該等雙特異性分子可經由其VGLL1 TCR與肽/ HLA複合物之結合而結合腫瘤細胞表面，且CD3特異性Fab片段將使TCR交聯。此將導致細胞活化及靶細胞之消除。因此，該等可溶性雙特異性TCR構築體可直接用於治療癌症患者。
最後，可溶性TCR可作為探針用於腫瘤細胞中之肽/ MHC之診斷性評估，或用於將治療性分子引導至腫瘤位點。該可溶性TCR分子亦可經示蹤劑(例如螢光探針或放射性探針)標記，且然後用於腫瘤細胞中肽/ MHC之呈遞之診斷性評估。此外，該可溶性TCR分子可與治療性分子(例如毒素)連接，且然後將該等治療性分子引導至腫瘤位點用於治療癌症患者。
在一些實施例中，本揭示內容提供可溶性TCR，例如本文提供之VGLL1特異性TCR。可溶性TCR可用於研究特異性TCR-pMHC相互作用，或作為診斷工具以檢測感染，或檢測自體免疫疾病標記物。可溶性TCR可應用於染色，例如對細胞染色以確定MHC背景中呈遞之特定肽抗原之存在。類似地，可溶性TCR可用於將治療劑(例如細胞毒性化合物或免疫刺激化合物)遞送至呈遞特定抗原之細胞。可溶性TCR亦可用於抑制T細胞，例如，與自體免疫肽抗原反應之彼等。在一些態樣中，TCR連接至遞送細胞至腫瘤附近之另一分子。在其他態樣中，TCR遞送毒素、細胞介素、共刺激配體或抑制劑配體，且將分子、細胞或化合物引導至表現肽-MHC之靶細胞。
在一些態樣中，本揭示內容提供可溶性T細胞受體(sTCR)，其包含(i)除其跨膜結構域外之TCR α鏈(例如，SEQ ID NO:1、24、47或70)之全部或部分，及(ii)除其跨膜結構域外之TCR β鏈(例如，SEQ ID NO:7、30、53或76)之全部或部分，其中(i)及(ii)各自包含TCR鏈之功能性可變結構域及至少恆定結構域之一部分，且藉由天然TCR中不存在之恆定結構域殘基之間之二硫鍵連接。
在一些態樣中，可溶性TCR包含TCR α或γ鏈細胞外結構域，其藉助一對C-末端二聚化肽(例如白胺酸拉鍊)而分別二聚化至TCR β或δ鏈細胞外結構域。
本揭示內容之可溶性TCR可以實質上純之形式提供，或作為純化或分離之製劑。舉例而言，其可以實質上不含其他蛋白質之形式提供。
本揭示內容之複數個可溶性TCR可以多價複合物之形式提供。因此，在一態樣中，本揭示內容提供多價TCR複合物，其包含如本文所述之複數個可溶性TCR。複數個可溶性TCR中之每一者較佳係相同的。
根據本揭示內容之多價TCR複合物以其最簡單形式包含較佳經由連接體分子彼此結合(例如共價連接或以其他方式連接)之兩個或三個或四個或更多個T細胞受體分子之多聚體。適宜連接體分子包括(但不限於)多價連接分子，例如抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白及外抗生物素蛋白(extravidin)，其各自具有四個生物素結合位點。因此，生物素化TCR分子可形成具有複數個TCR結合位點之TCR之多聚體。多聚體中TCR分子之數目將取決於相對於用於製備多聚體之連接體分子之量之TCR之量，且亦取決於任何其他生物素化分子之存在或不存在。較佳多聚體係二聚體、三聚體或四聚體TCR複合物。
用於本揭示內容方法之適宜結構包括膜結構(例如脂質體)及固體結構，該固體結構較佳為顆粒，例如珠粒，例如乳膠珠粒。其他可外部經T細胞受體分子包被之結構亦係適宜的。較佳地，該等結構用T細胞受體多聚體而非用個別T細胞受體分子包被。
在脂質體之情形下，T細胞受體分子或其多聚體可與膜連接或以其他方式與膜結合。用於此目之技術為熟習此項技術者熟知。
標記或另一部分(例如毒性或治療性部分)可包括在本揭示內容之多價TCR複合物中。舉例而言，標記或其他部分可包括在混合分子多聚體中。該多聚體分子之實例係含有三個TCR分子及一個過氧化物酶分子之四聚體。此可藉由將TCR及酶以3:1之莫耳比混合以產生四聚體複合物並自不含正確比率之分子之任何複合物分離期望複合物來達成。該等混合分子可含有分子之任何組合，條件係立體阻礙不損害或不顯著損害分子之期望功能。鏈黴抗生物素蛋白分子上結合位點之定位適合於混合四聚體，此乃因不太可能發生立體阻礙。
本揭示內容之TCR (或其多價複合物)可替代地或另外地與治療劑締合(例如共價地或以其他方式連接)，該治療劑可為例如用於殺死細胞之毒性部分、或免疫刺激劑，例如介白素或細胞介素。與非多聚體T細胞受體異二聚體相比，本揭示內容之多價TCR複合物可具有增強之TCR配體結合能力。因此，根據本揭示內容之多價TCR複合物特別適用於在活體外或活體內追蹤或靶向呈遞特定抗原之細胞，且亦用作用於產生具有該等用途之其他多價TCR複合物之中間體。因此，TCR或多價TCR複合物可以醫藥上可接受之調配物提供以用於活體內。
本揭示內容亦提供用於將治療劑遞送至靶細胞之方法，該方法包含在允許TCR或多價TCR複合物與靶細胞連接之條件下使潛在靶細胞與根據本揭示內容之TCR或多價TCR複合物接觸，該TCR或多價TCR複合物對TCR配體具有特異性且具有與其結合之治療劑。
具體而言，可溶性TCR或多價TCR複合物可用於將治療劑遞送至呈遞特定抗原之細胞之位置。此在許多情況下、具體而言針對腫瘤將為有用的。可遞送治療劑，使得其將局部發揮其效應，而不僅僅係對其所結合之細胞發揮效應。因此，一種特定策略設想與對腫瘤抗原具有特異性之T細胞受體或之多價TCR複合物連接之抗腫瘤分子。
許多治療劑可用於該用途，例如放射性化合物、酶(例如穿孔蛋白)或化學治療劑(例如順鉑)。為了確保在期望位置發揮毒性效應，毒素可在與鏈黴抗生物素蛋白連接之脂質體內部，以便化合物緩慢釋放。此將防止在體內轉運期間之損害效應，並確保毒素在TCR與相關抗原呈遞細胞結合後具有最大效應。
本揭示內容之可溶性TCR可藉由與特異性TCR配體結合且藉此抑制T細胞活化，而用於調節T細胞活化。涉及T細胞介導之發炎及/或組織損害之自體免疫疾病將受該方法之影響，例如I型糖尿病。此用途需要由相關pMHC呈遞之特異性肽表位的知識。
亦設想本揭示內容之可溶性TCR及/或多價TCR複合物在製備用於治療癌症或自體免疫疾病之組合物中之用途。
亦提供治療癌症或自體免疫疾病之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本揭示內容之可溶性TCR及/或多價TCR複合物。
如在抗癌及自體免疫療法中所常見，本揭示內容之可溶性TCR可與其他藥劑組合用於治療癌症及自體免疫疾病、以及在類似患者組中發現之其他相關病況。 III.    過繼性細胞轉移療法
本文提供用於在個體中治療癌症或延遲癌症進展之方法，其包含向個體投與有效量之抗原特異性細胞(例如自體或同種異體T細胞(例如調節性T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或γ-δ T細胞)、NK細胞、不變NK細胞、NKT細胞、MSC或iPS細胞)療法、例如VGLL1特異性細胞療法。本文亦提供利用遺傳工程化TCR轉導之T細胞(例如，表現包含SEQ ID NO: 1-92中之一者之TCR)之過繼性T細胞療法。在一些實施例中，過繼細胞轉移療法與第二療法(例如化學療法、放射療法、手術或第二免疫療法)組合提供給個體(例如，人類患者)。
本揭示內容之實施例係關於獲得TCR工程化細胞並將其投與給個體作為靶向癌細胞之免疫療法。具體而言，TCR工程化細胞係抗原特異性細胞(例如VGLL1特異性細胞)。在過去二十年中已闡述用於功能性抗腫瘤效應細胞之衍生、活化及擴增之若干基本方法。該等細胞包括：自體細胞，例如腫瘤浸潤淋巴球(TIL)；使用自體DC、淋巴球、人工抗原呈遞細胞(APC)或用T細胞配體及活化抗體包被之珠粒離體活化之T細胞，或藉助捕獲靶細胞膜分離之細胞；天然表現抗宿主腫瘤T細胞受體(TCR)之同種異體細胞；及非腫瘤特異性自體或同種異體細胞，其經遺傳地重新編程或「重新定向」以表現腫瘤反應性TCR或展示稱為「T-體」之抗體樣腫瘤識別能力之嵌合TCR分子。該等方法已產生可用於本文所述方法之T細胞製備及免疫之許多方案。 A．  T細胞製備
在一些實施例中，T細胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官。在一些態樣中，細胞係人類細胞。細胞通常係原代細胞，例如直接自個體分離及/或自個體分離並冷凍之彼等。在一些實施例中，細胞包括T細胞或其他細胞類型之一或多個亞組，例如完整之T細胞群體、CD4+ 細胞、CD8+ 細胞及其亞群體，例如由功能、活化狀態、成熟度、分化潛能、擴增、再循環、定位及/或持久性能力、抗原特異性、抗原受體類型、特定器官或區室中之存在、標記或細胞介素分泌譜及/或分化程度所定義之彼等。關於欲治療之個體，細胞可為同種異體的及/或自體的。在一些態樣，例如對於現成技術，細胞係多潛能及/或多效的，例如幹細胞，例如誘導之多潛能幹細胞(iPSC)。在一些實施例中，該等方法包括自個體分離細胞；如本文所述對其進行製備、處理、培養及/或工程化；及在冷凍保存之前或之後將其重新引入同一患者。
T細胞之亞型及亞群體(例如，CD4+ 及/或CD8+ T細胞)包括幼稚T (TN )細胞、效應T細胞(TEFF )、記憶T細胞及其亞型，例如幹細胞記憶T (TSCM )、中樞記憶T (TCM )、效應記憶T (TEM )、或終末分化之效應記憶T細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、不成熟T細胞、成熟T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關之不變T (MAIT)細胞、天然存在及適應性調節性T (Treg)細胞、輔助T細胞，例如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助T細胞、α/β T細胞及δ/γ T細胞。
在一些實施例中，T細胞群體中之一或多者富集或耗盡對特定標記(例如表面標記)呈陽性或對特定標記呈陰性之細胞。在一些情形下，該等標記係在T細胞(例如，非記憶細胞)之某些群體上不存在或以相對低程度表現、但在某些T細胞(例如，記憶細胞)之其他群體上存在或以相對較高程度表現之彼等。
在一些實施例中，藉由負向選擇在非T細胞(例如B細胞、單核球或其他白細胞，例如CD14)上表現之標記自PBMC樣品分離T細胞。在一些態樣，使用CD4+ 或CD8+ 選擇步驟分離CD4+ 輔助及CD8+ 細胞毒性T細胞。藉由正向或負向選擇在一或多種幼稚、記憶及/或效應T細胞亞群體上表現或表現程度相對較高之標記，可將該等CD4+ 及CD8+ 群體進一步分選為亞群體。
在一些實施例中，CD8+ T細胞例如藉由基於與各別亞群體相關之表面抗原之正向或負向選擇進一步富集或耗盡幼稚、中樞記憶、效應記憶及/或中樞記憶幹細胞。在一些實施例中，實施中樞記憶T (TCM )細胞之富集以增加效能，例如改善投與後之長期存活、擴增及/或植入，其在一些態樣中在該等亞群體中尤其穩健。參見Terakura等人 (2012)Blood . 1:72- 82；Wang等人 (2012)J Immunother . 35(9):689-701。
在一些實施例中，T細胞係自體T細胞。在該方法中，自患者獲得腫瘤樣品並獲得單細胞懸浮液。單細胞懸液可以任何適宜方式、例如機械地(使用例如gentleMACS™解離器(Miltenyi Biotec, Auburn, Calif.)使腫瘤解聚)或酶促地(例如膠原酶或DNA酶)獲得。在介白素-2 (IL-2)中培養腫瘤酶消化物之單細胞懸浮液。培養細胞直至鋪滿(例如，約2×106 個淋巴球)，例如，約5至約21天、較佳約10至約14天。
可彙集培養之T細胞並快速擴增。快速擴增在約10至約14天之時段內提供至少約50倍(例如，50、60、70、80、90或100倍或更大倍)之抗原特異性T細胞數量之增加。更佳地，快速擴增在約10至約14天之時段內提供至少約200倍(例如，200、300、400、500、600、700、800、900倍或更大倍)之增加。
擴增可藉由業內已知之多種方法中之任一者來完成。舉例而言，可在飼養淋巴球及介白素-2 (IL-2)或介白素-15 (IL-15) (其中IL-2較佳)存在下使用非特異性T細胞受體刺激使T細胞快速擴增。非特異性T細胞受體刺激可包括約30 ng/ml OKT3，一種小鼠單株抗CD3抗體(可自Ortho-McNeil®, Raritan, N.J.獲得)。或者，在T細胞生長因子(例如IL-2)存在下藉由用癌症之一或多種抗原(包括其抗原部分，例如表位或細胞)活體外刺激外周血單核細胞(PBMC)可快速擴增T細胞，該等抗原可視情況自載體(例如人類白血球抗原A1 (HLA-A1)結合肽)表現。藉由用脈衝至表現HLA-A1之抗原呈遞細胞上之癌症之相同抗原重新刺激來快速擴增活體外誘導之T細胞。或者，可用例如經輻照之自體淋巴球或用經輻照之HLA-A1+同種異體淋巴球及IL-2重新刺激T細胞。
自體T細胞可經修飾以表現促進自體T細胞生長及活化之T細胞生長因子。適宜T細胞生長因子包括例如介白素(IL)-2、IL-7、IL-15及IL-12。適宜修飾方法為業內已知。參見(例如) Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology , Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994。在特定態樣中，經修飾之自體T細胞以高程度表現T細胞生長因子。T細胞生長因子編碼序列(例如IL-12之編碼序列)在業內係容易獲得的，啟動子亦係如此，其與T細胞生長因子編碼序列之可操作連接促進高程度表現。 B．   治療方法
本文進一步提供在個體中治療癌症或延遲癌症進展之方法，其包含向個體投與有效量之抗原特異性T細胞療法，例如VGLL1特異性T細胞療法。本文亦提供用遺傳工程化TCR轉導之T細胞(TCR與其他生物反應性蛋白(例如，抗CD3)之結合物)之過繼性T細胞療法。在其他實施例中，提供治療癌症之方法，其包含用純化腫瘤抗原或免疫顯性腫瘤抗原特異性肽對個體進行免疫。
考慮用於治療之癌症之實例包括肺癌、頭頸癌、乳癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、子宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、肺中之癌前病灶、結腸癌、黑色素瘤及膀胱癌。額外實例性癌症包括(但不限於)肺癌、頭頸癌、乳癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、子宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、肺中之癌前病灶、結腸癌、黑色素瘤及膀胱癌。其他實例性癌症包括黑色素瘤、惡性黑色素瘤、結腸癌、淋巴瘤、肉瘤、母細胞瘤、腎癌、胃腸腫瘤、神經膠質瘤、前列腺癌、膀胱癌、直腸腫瘤、胃癌、食管癌、胰臟癌、肝癌、乳癌、子宮癌、子宮頸癌、急性髓性白血病(AML)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、白血病、肝細胞瘤、各種病毒誘導之腫瘤，例如乳頭瘤病毒誘導之癌(例如子宮頸癌)、腺癌、疱疹病毒誘導之腫瘤(例如柏基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、EBV誘導之B細胞淋巴瘤)、B型肝炎誘導之腫瘤(肝細胞癌)、HTLV-1及HTLV-2誘導之淋巴瘤、聽神經瘤、肺癌、小細胞肺癌、咽癌、肛門癌、神經膠母細胞瘤、直腸癌、星形細胞瘤、腦瘤、視網膜母細胞瘤、基底細胞瘤、腦轉移、髓母細胞瘤、陰道癌、胰臟癌、睪丸癌、霍奇金氏症候群(Hodgkin's syndrome)、腦脊髓膜瘤、施耐博格病(Schneeberger disease)、垂體腫瘤、蕈樣肉芽腫、類癌、神經元瘤、脊髓瘤、柏基特淋巴瘤、喉癌、腎癌、胸腺瘤、本體癌、骨癌、非霍奇金氏淋巴瘤、尿道癌、CUP症候群、頭/頸瘤、少突膠質細胞瘤、外陰癌、腸癌、結腸癌、食道癌、疣累及、小腸腫瘤、顱咽管瘤、卵巢癌(ovarian carcinoma)、生殖器腫瘤、卵巢癌(ovarian cancer)、胰臟癌、子宮內膜癌、肝轉移、陰莖癌、舌癌、膽囊癌、白血病、漿細胞瘤、眼瞼腫瘤及前列腺癌。
在一些實施例中，T細胞係自體的。然而，細胞可為同種異體的。在一些實施例中，T細胞係自患者自身分離，使得細胞係自體的。若T細胞係同種異體的，則可自若干供體彙集T細胞。將細胞以足以控制、減輕或消除所治療疾病之症狀及體徵之量投與給感興趣之個體。
在一些實施例中，可在T細胞療法之前向個體投與非清髓性淋巴球耗竭性化學療法。非清髓性淋巴球減少性化療可為任何適宜此類療法，其可藉由任何適宜途徑投與。非清髓性淋巴球耗竭性化學療法可包括例如投與環磷醯胺(cyclophosphamide)及氟達拉濱(fludarabine)，特別是若癌症係可為轉移性的黑色素瘤。投與環磷醯胺及氟達拉濱之實例性途徑係經靜脈內。同樣，可投與任何適宜劑量之環磷醯胺及氟達拉濱。在特定態樣中，投與約60 mg/kg環磷醯胺兩天，之後投與約25 mg/m2 氟達拉濱五天。
在某些實施例中，將促進自體T細胞生長及活化之T細胞生長因子與自體T細胞同時或隨後投與給患者。T細胞生長因子可為促進自體T細胞生長及活化之任何適宜生長因子。適宜T細胞生長因子之實例包括介白素(IL)-2、IL-7、IL-15及IL-12，其可單獨使用或以各種組合使用，例如IL-2及IL-7、IL-2及IL-15、IL-7及IL-15、IL-2、IL-7及IL-15、IL-12及IL-7、IL-12及IL-15、或IL-12及IL2。IL-12係較佳T細胞生長因子。
T細胞可經靜脈內、肌內、皮下、局部、經口、經皮、腹膜內、眼眶內、藉由植入、藉由吸入、鞘內、心室內或鼻內投與。T細胞療法之適當劑量可基於欲治療之疾病之類型、疾病之嚴重程度及進程、個體之臨床狀況、個體之病史及對治療之反應以及主治醫師之判斷來確定。
腫瘤內注射或注射至腫瘤血管系統中特別考慮用於離散、實體、可及之腫瘤。局部、區域或全身投與亦可為適當的。對於＞4 cm之腫瘤，欲投與之體積將為約4-10 ml (具體而言10 ml)，而對於＜4 cm之腫瘤，將使用約1-3 ml之體積(具體而言3 ml)。以單劑量遞送之多次注射包含約0.1 ml至約0.5 ml體積。 C.     醫藥組合物
在選擇之實施例中，考慮表現如本文揭示之TCR之細胞、含有TCR之可變區之蛋白質、或編碼本揭示內容之TCR之可變區之DNA可包含於疫苗組合物中，且投與給個體以在個體中誘導針對癌症(例如表現VGLL1之癌症)之治療性免疫反應。在個體中用於醫藥用途之疫苗組合物可包含本文揭示之腫瘤抗原肽(例如VGLL1)組合物及醫藥上可接受之載劑。在個體中用於醫藥用途之治療性組合物可包含本文揭示之TCR組合物，例如可溶性TCR (視情況連接至成像劑)及醫藥上可接受之載劑。
如本文所用，「保護性免疫反應」係指哺乳動物宿主之免疫系統對癌症之反應。保護性免疫反應可提供治療癌症之治療效應，例如，減小腫瘤大小、增加存活率等。
醫學領域之普通技術人員將理解，投與給動物或人類患者之治療性組合物之實際劑量量可藉由物理及生理因素(例如體重、病況之嚴重程度、所治療疾病之類型、先前或同時之治療介入、患者之特發病及投與途徑)來確定。在任一情形下，負責投與之執業醫師將決定組合物中活性成分之濃度及用於個別個體之適當劑量。
本文揭示之治療性組合物可經靜脈內、真皮內、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、局部、腫瘤內、肌內、腹膜內、皮下、結膜下、囊內、黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、局部(topically, locally)、及藉由吸入、注射、輸注、連續輸注、灌洗及局部灌注來投與。治療性組合物亦可經由導管、以乳膏劑、以脂質組合物、藉由彈道微粒遞送、或藉由其他方法或前述之任何組合投與給個體，如熟習此項技術者已知(參見，例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21版Lippincott Williams and Wilkins, 2005，其以引用方式併入本文中)。
儘管熟習此項技術者已知之任何適宜載劑可用於本發明之醫藥組合物中，但載劑之類型將根據投與模式而變化。對於非經腸投與(例如皮下注射)，載劑較佳包含水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩衝液。對於經口投與，可採用任何上述載劑或固體載劑，例如甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖及碳酸鎂。生物可降解之微球(例如，聚乳酸半乳糖苷)亦可用作本發明之醫藥組合物之載劑。適宜生物可降解之微球揭示於例如美國專利4,897,268及5,075,109中。
在一些實施例中，疫苗組合物可藉由微結構化經皮或彈道顆粒遞送來投與。作為用於疫苗調配之載劑之微結構係疫苗應用之合意構形，且在業內廣泛已知(Gerstel及Place 1976 (美國專利3,964,482)；Ganderton及McAinsh 1974 (美國專利3,814,097)；美國專利5,797,898、5,770,219及5,783,208及美國專利申請案2005/0065463)。在該等實施例中，支撐基材可包括(但不限於)微膠囊、微粒、微球、奈米膠囊、奈米顆粒、奈米球或其組合。
用作本文揭示之TCR (例如可溶性TCR)之支撐基材之微結構或彈道顆粒可包含生物可降解材料及生物不可降解材料，且該等支撐基材可包含合成聚合物、二氧化矽、脂質、碳水化合物、蛋白質、凝集素、離子劑、交聯劑及業內可用之其他微結構組分。用於將本發明之肽固定至由該等材料構成之支撐基材上之方案及試劑係在商業上及業內廣泛可得。
在其他實施例中，疫苗組合物包含本文揭示之固定或囊封之TCR或可溶性TCR以及支撐基材。在該等實施例中，支撐基材可包括(但不限於)脂質微球、脂質奈米顆粒、醇質體、脂質體、類脂質體、磷脂、鞘脂體、表面活性劑、傳遞體、乳液或其組合。脂質體及其他脂質奈米載體及微載體調配物之形成及使用通常為熟習此項技術者已知，且脂質體、微粒、奈米膠囊及諸如此類之使用已廣泛用於遞送治療劑(例如，美國專利5,741,516，其全文以引用方式具體併入本文中)。已綜述許多脂質體及脂質體樣製劑作為潛在藥物載劑之方法，包括肽之囊封(美國專利5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868及5,795,587，其各自全文以引用方式具體併入)。
除了本文所述之遞送方法之外，亦考慮許多用於投與所揭示之疫苗組合物之替代技術。作為非限制性實例，疫苗組合物可藉由以下方式投與：超音波穿刺術(即超音波)，其已經使用並闡述於美國專利5,656,016中，用於提高藥物滲透進入及穿過循環系統之速率及效能；骨內注射(美國專利5,779,708)、或反饋控制遞送(美國專利5,697,899)，且本段中之每一專利階全文以引用方式具體併入本文中。
多種佐劑中之任一者可用於本揭示內容之疫苗中以非特異性地增強免疫反應。大部分佐劑含有經設計以保護抗原免於快速分解代謝之物質，例如氫氧化鋁或礦物油，以及免疫反應之非特異性刺激劑，例如脂質A、百日咳桿菌(Bortadella pertussis )或結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )。適宜佐劑可作為例如弗氏不完全佐劑(Freund's Incomplete Adjuvant)及弗氏完全佐劑(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)及默克佐劑(Merck Adjuvant) 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.)商購獲得。其他適宜佐劑包括明礬、生物可降解之微球、單磷醯脂質A及quil A。
可溶性TCR可以中性或鹽之形式調配至組合物中。醫藥上可接受之鹽包括酸加成鹽(與蛋白質之游離胺基形成)，其與無機酸(例如鹽酸或磷酸)或該等有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸及諸如此類)形成。與游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；以及有機鹼，例如異丙胺、三甲胺、組胺酸、普魯卡因(procaine)及諸如此類。
在任何情形下，組合物可包含各種抗氧化劑以延遲一或多種組分之氧化。另外，可藉由防腐劑(例如各種抗細菌及抗真菌劑，包括但不限於對羥苯甲酸酯(例如，對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞或其組合)來防止微生物之作用。
藉由將所需量之活性肽與上述列舉之各種其他成分一起納入適當溶劑中、根據需要之後過濾滅菌，製備無菌可注射溶液。通常，藉由將各種經滅菌活性成分納入含有基本分散介質及/或其他成分之無菌媒劑中製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之無菌粉末之情形下，較佳製備方法係真空乾燥或冷凍乾燥技術，其自其先前無菌過濾之液體介質產生活性成分加任何額外期望成分之粉末。液體介質視需要應經適當緩衝，且在注射前首先用足夠鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。亦考慮用於直接注射之高度濃縮之組合物的製備，其中設想使用DMSO作為溶劑導致極快之滲透，從而將高濃度之活性劑遞送至小區域。
組合物在製造及儲存條件下必須穩定，且必須防止受到諸如細菌及真菌等微生物之污染作用。應瞭解，內毒素污染應在最小程度上保持在安全量，例如小於0.5 ng/mg蛋白質。
在特定實施例中，可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來延長可注射組合物之吸收。 D.     組合療法
在某些實施例中，本實施例之組合物及方法涉及抗原肽或抗原特異性T細胞群體與至少一種額外療法之組合。額外療法可為放射療法、手術(例如乳房腫瘤切除術及乳房切除術)、化學療法、基因療法、DNA療法、病毒療法、RNA療法、免疫療法、骨髓移植、奈米療法、單株抗體療法或前述之組合。額外療法可呈輔助或新輔助療法形式。
在一些實施例中，額外療法係投與小分子酶抑制劑或抗轉移劑。在一些實施例中，額外療法係投與副作用限制劑(例如，意欲減少治療副作用之發生及/或減輕其嚴重程度之藥劑，如抗噁心劑等)。在一些實施例中，額外療法係放射療法。在一些實施例中，額外療法係手術。在一些實施例中，額外療法係放射療法及手術之組合。在一些實施例中，額外療法係γ輻照。在一些實施例中，額外療法係靶向PBK/AKT/mTOR路徑之療法、HSP90抑制劑、微管蛋白抑制劑、細胞凋亡抑制劑及/或化學預防劑。額外療法可為業內已知之一或多種化學治療劑。
T細胞療法可相對於額外癌症療法(例如免疫檢查點療法)在之前、期間、之後或以各種組合投與。投與之間隔可在同時至數分鐘至數天至數週之範圍內。在將T細胞療法與額外治療劑分開提供給患者之實施例中，通常將確保在每次遞送之時間之間無顯著時間段，使得兩種化合物將仍然能夠對患者發揮有利組合效應。在該等情況下，考慮可在彼此約12至24或72小時內、且更特別地在彼此約6-12 h內，給患者提供抗體療法及抗癌症療法。在一些情況下，可能期望顯著延長治療之時間段，其中在各別投與之間經過若干天(2、3、4、5、6或7天)至若干週(1、2、3、4、5、6、7或8週)。
可採用各種組合。對於下文之實例，抗原特異性T細胞療法係「A」，且抗癌症療法係「B」： A/B/A   B/A/B   B/B/A   A/A/B   A/B/B   B/A/A   A/B/B/B   B/A/B/B B/B/B/A   B/B/A/B   A/A/B/B   A/B/A/B   A/B/B/A   B/B/A/A B/A/B/A   B/A/A/B   A/A/A/B   B/A/A/A   A/B/A/A   A/A/B/A
考慮到試劑之毒性(若有的話)，向患者投與本實施例之任何化合物或療法將遵循投與該等化合物之一般方案。因此，在一些實施例中，存在監測可歸因於組合療法之毒性之步驟。 1.   化學療法
根據本實施例，可使用多種化學治療劑。術語「化學療法」係指使用藥物治療癌症。「化學治療劑」用於表示在癌症治療中投與之化合物或組合物。該等藥劑或藥物根據其在細胞內之活性模式進行分類，例如，其係否影響細胞週期以及在什麼階段影響細胞週期。或者，試劑可基於其直接交聯DNA、插入DNA中或藉由影響核酸合成誘導染色體及有絲分裂畸變之能力來表徵。
化學治療劑之實例包括烷基化劑，例如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(meturedopa)及烏得哌(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫化磷醯胺及三羥甲基蜜胺；番荔枝內酯(acetogenin) (尤其係布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(camptothecin) (包括合成類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚抑制素(bryostatin)；卡利斯他汀(callystatin)；CC-1065 (包括其合成類似物阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin))；念珠藻素(cryptophycin) (尤其係念珠藻素1及念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌黴素(duocarmycin) (包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，例如氮芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲基二氯乙基胺(mechlorethamine)、甲基二氯乙基胺氧化物鹽酸鹽、美法倉(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)及尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸鹽類，例如氯膦酸(clodronate)；埃斯波黴素(esperamicin)；以及新製癌菌素髮色團(neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C (cactinomycin)、卡拉黴素(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D (dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin) (包括嗎啉基-多柔比星、氰嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及去氧多柔比星)、泛艾黴素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin) (例如絲裂黴素C)、黴酚酸、諾拉黴素(nogalarnycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(烏苯美司)、淨司他丁(淨司他汀)、佐柔比星(佐柔比星)；抗代謝物，例如胺甲蝶呤(胺甲喋呤)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(二甲葉酸)、胺甲喋呤、蝶羅呤(蝶羅呤)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)及硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-阿紮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)及氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)及睪內酯(testolactone)；抗腎上腺素，例如米托坦(mitotane)及曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，例如亞葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺醣苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(eflornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美登素(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；硝胺丙吖啶(nitraerine)；噴司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣複合物；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西左非蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2’’-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecene)(尤其T-2毒素、疣疱菌素A (verracurin A)、桿孢菌素(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；胺基甲酸酯(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加賽特辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside) (「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；類紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多西紫杉醇(doxetaxel)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑配位複合物，例如順鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide) (VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺喋呤(aminopterin)；截瘤達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan) (例如CPT-11)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，例如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；卡鉑、丙卡巴肼、普卡黴素(plicomycin)、吉西他濱、諾維本(navelbine)、法尼基(farnesyl)蛋白轉移酶抑制劑、反鉑及上述中之任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。 2.   放射療法
引起DNA損害並已廣泛使用之其他因子包括通常稱為γ-射線、X-射線之因子及/或放射性同位素定向遞送至腫瘤細胞之因子。亦考慮其他形式之DNA損害因子，例如微波、質子束輻照(美國專利5,760,395及4,870,287)及UV輻照。最可能的是，所有該等因子皆對DNA、DNA之前體、DNA之複製及修復以及染色體之裝配及維持實現寬範圍之損害。X射線之劑量範圍為自50至200倫琴(roentgen)之日劑量持續延長時間段(3至4週)至2000至6000倫琴之單劑量。放射性同位素之劑量範圍廣泛變化，且取決於同位素之半衰期、發射之輻射之強度及類型以及由贅瘤細胞之攝取。 3.   免疫療法
熟習此項技術者應理解，額外免疫療法可與實施例之方法組合或結合使用。在癌症治療之背景下，免疫治療劑通常依賴於使用免疫效應細胞及分子來靶向及破壞癌細胞。利妥昔單抗(Rituximab) (RITUXAN®)係該實例。免疫效應物可為例如對腫瘤細胞表面上之一些標記具有特異性之抗體。抗體單獨可用作療法之效應物，或者其可招募其他細胞以實際影響細胞殺死。抗體亦可與藥物或毒素(化學治療劑、放射性核種、蓖麻毒蛋白A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)結合，並用作靶向劑。或者，效應物可為攜帶直接或間接與腫瘤細胞靶相互作用之表面分子之淋巴球。各種效應細胞包括細胞毒性T細胞及NK細胞。
抗體-藥物結合物已經作為開發癌症治療劑之突破性方法出現。癌症係世界上死亡之主要原因之一。抗體-藥物結合物(ADC)包含與殺死細胞之藥物共價連接之單株抗體(MAb)。該方法將針對其抗原靶之MAb之高特異性與高效細胞毒性藥物組合，產生「武裝」 MAb，其將酬載(藥物)遞送至具有富集含量之抗原之腫瘤細胞。藥物之靶向遞送亦使其在正常組織中之暴露最小化，導致毒性降低及治療指數改善。FDA批准之兩種ADC藥物，即2011年之ADCETRIS® (貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin))及2013年之KADCYLA® (曲妥珠單抗艾坦辛(trastuzumab emtansine)或T-DM1)驗證了該方法。目前在癌症治療之臨床試驗之各個階段中存在超過30種ADC藥物候選者(Leal等人，2014)。隨著抗體工程化及連接體-酬載最佳化變得愈來愈成熟，新ADC之發現及開發愈來愈依賴於適於該方法之新靶標之鑑別及驗證以及靶向MAb之產生。ADC靶之兩個準則係腫瘤細胞中上調/高程度表現及穩健內化。
在免疫療法之一個態樣中，腫瘤細胞必須攜帶一些易於靶向、即不存在於大多數其他細胞上之標記。存在許多腫瘤標記，且該等中之任一者可適於在本實施例之背景下靶向。常見腫瘤標記包括CD20、癌胚抗原、酪胺酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液醯基路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、層黏蛋白受體、erb B及p155。免疫療法之一個替代態樣係將抗癌效應與免疫刺激效應組合。亦存在免疫刺激分子，包括：細胞介素(例如IL-2、IL-4、IL-12)、GM-CSF、γ-IFN、趨化介素(例如MIP-1、MCP-1)、IL-8及生長因子(例如FLT3配體)。
目前正在研究或使用之免疫療法之實例係免疫佐劑，例如牛分枝桿菌、惡性瘧原蟲、二硝基氯苯及芳香族化合物(美國專利5,801,005及5,739,169；Hui及Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)；細胞介素療法，例如干擾素干擾素α、β及γ、IL-1、GM-CSF及TNF (Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)；基因治療，例如TNF、IL-1、IL-2及p53 (Qin等人，1998；Austin-Ward及Villaseca, 1998；美國專利5,830,880及5,846,945)；及單株抗體，例如抗CD20、抗神經節苷酯GM2及抗p185 (Hollander, 2012；Hanibuchi等人，1998；美國專利5,824,311)。考慮一或多種抗癌療法可與本文所述之抗體療法一起使用。
在一些實施例中，免疫療法可為免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點調高信號(例如，共刺激分子)或調低信號。可由免疫檢查點阻滯靶向之抑制性免疫檢查點包括腺苷A2A受體(A2AR)、B7-H3 (亦稱為CD276)、B及T淋巴球減弱劑(BTLA)、細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA-4，亦稱為CD152)、吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)、細胞殺手免疫球蛋白(KIR)、淋巴球活化基因-3 (LAG3)、程式化死亡1 (PD-1)、T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3 (TIM-3)及T細胞活化之V-結構域Ig抑制劑(VISTA)。具體而言，免疫檢查點抑制劑靶向PD-1軸及/或CTLA-4。
免疫檢查點抑制劑可為藥物，例如小分子、配體或受體之重組形式，或具體而言係抗體，例如人類抗體(例如，國際專利公開案WO2015016718；Pardoll，2012；兩者皆以引用方式併入本文中)。可使用免疫檢查點蛋白或其類似物之已知抑制劑，具體而言可使用嵌合、人類化或人類形式之抗體。如熟練人員所知曉，替代及/或等價名稱可用於本揭示內容中提及之某些抗體。在本揭示內容之上下文中，該等替代及/或等效名稱係可互換的。舉例而言，已知蘭布魯珠單抗(lambrolizumab)亦以替代及等價名稱MK-3475及派姆單抗(pembrolizumab)已知。
在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係抑制PD-1與其配體結合配偶體結合之分子。在具體態樣中，PD-1配體結合配偶體係PDL1及/或PDL2。在另一實施例中，PDL1結合拮抗劑係抑制PDL1與其結合配偶體結合之分子。在具體態樣中，PDL1結合配偶體係PD-1及/或B7-1。在另一實施例中，PDL2結合拮抗劑係抑制PDL2與其結合配偶體結合之分子。在具體態樣中，PDL2結合配偶體係PD-1。拮抗劑可為抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。實例性抗體闡述於美國專利第US 8735553號、第US 8354509號及第US 8008449號中，所有專利皆以引用方式併入本文中。用於本文提供之方法之其他PD-1軸拮抗劑為業內已知，例如美國專利申請案第US20140294898號、第US2014022021號及第US20110008369號中所述，所有專利皆以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係抗PD-1抗體(例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)。在一些實施例中，抗PD-1抗體選自由以下組成之群：尼沃魯單抗(nivolumab)、派姆單抗及CT-011。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係免疫黏附素(例如包含與恆定區(例如免疫球蛋白序列之Fc區)融合之PDL1或PDL2之細胞外或PD-1結合部分的免疫黏附素)。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係AMP- 224。尼沃魯單抗，亦稱為MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558及OPDIVO® ，係WO2006/121168中所述之抗PD-1抗體。派姆單抗，亦稱為MK-3475、Merck 3475、蘭布魯珠單抗、KEYTRUDA® 及SCH-900475，係WO2009/114335中所述之抗PD-1抗體。CT-011，亦稱為hBAT或hBAT-1，係WO2009/101611中所述之抗PD-1抗體。AMP-224，亦稱為B7-DCIg，係WO2010/027827及WO2011/066342中所述之PDL2-Fc融合可溶性受體。
在本文提供之方法中可靶向之另一免疫檢查點係細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA-4)，亦稱為CD152。人類CTLA-4之完整cDNA序列具有基因庫登錄號L15006。在T細胞表面上發現CTLA-4，且當與抗原呈遞細胞表面之CD80或CD86結合時，其用作「關」開關。CTLA4係免疫球蛋白超家族之成員，其在輔助T細胞表面表現並將抑制信號傳遞至T細胞。CTLA4類似於T細胞共刺激蛋白CD28，且兩種分子皆結合至抗原呈遞細胞上之CD80及CD86，亦分別稱為B7-1及B7-2。CTLA4將抑制信號傳遞至T細胞，而CD28傳遞刺激信號。亦在調節性T細胞中發現細胞內CTLA4，且其可能對其功能係重要的。經由T細胞受體及CD28之T細胞活化導致CTLA-4表現增加，CTLA-4係B7分子之抑制性受體。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗CTLA-4抗體(例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。
適用於本發明方法之抗人類CTLA-4抗體(或由其衍生之VH及/或VL結構域)可使用業內熟知之方法產生。或者，可使用業內公認之抗CTLA-4抗體。舉例而言，本文揭示之方法中可使用以下中揭示之抗CTLA-4抗體：US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504 (CP675,206，亦稱為曲美目單抗(tremelimumab)；先前稱為替西木單抗(ticilimumab))、美國專利第6,207,156號；Hurwitz等人，1998；Camacho等人，2004；及Mokyr等人，1998。上文所提及之出版物中之每一者之教示以引用方式併入本文中。亦可使用與任何該等業內公認之抗體競爭結合至CTLA-4之抗體。舉例而言，人類化CTLA-4抗體闡述於國際專利申請案第WO2001014424號、第WO2000037504號及美國專利第US8017114號中；所有專利皆以引用方式併入本文中。
實例性抗CTLA-4抗體係伊匹單抗(ipilimumab) (亦稱為10D1、MDX- 010、MDX- 101及Yervoy®)或其抗原結合片段及變體(例如，參見WOO 1/14424)。在其他實施例中，抗體包含伊匹單抗之重鏈及輕鏈CDR或VR。因此，在一個實施例中，抗體包含伊匹單抗之VH區之CDR1、CDR2及CDR3結構域、及伊匹單抗之VL區之CDR1、CDR2及CDR3結構域。在另一實施例中，抗體與上文提及之抗體競爭結合及/或與上文提及之抗體結合至CTLA-4上之相同表位。在另一實施例中，抗體具有上文提及之抗體具有至少約90%可變區胺基酸序列一致性(例如與伊匹單抗具有至少約90%、95%或99%可變區一致性)。
用於調節CTLA-4之其他分子包括例如美國專利第US5844905號、第US5885796號及國際專利申請案第WO1995001994號及第WO1998042752號中所述之CTLA-4配體及受體(所有專利皆以引用方式併入本文中)、及例如以引用方式併入本文中之美國專利第US8329867號中所述之免疫黏附素。 4.   手術
大約60%之癌症患者將經歷一些類型之手術，包括預防性、診斷性或分期性、治癒性及姑息性手術。治癒性手術包括切除術，其中癌組織之全部或部分被物理地去除、切除及/或破壞，且可與其他療法(例如本實施例之治療、化學療法、放射療法、激素療法、基因療法、免疫療法及/或替代療法)結合使用。腫瘤切除術係指物理去除腫瘤之至少一部分。除了腫瘤切除術之外，藉由手術之治療包括雷射手術、冷凍手術、電外科手術及顯微控制手術(莫氏手術(Mohs’ surgery))。
在切除部分或全部癌細胞、組織或腫瘤後，可在體內形成空腔。治療可藉由灌注、直接注射或用額外抗癌症療法局部應用該區域來完成。舉例而言，可每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、或每1週、2週、3週、4週及5週或每1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或12個月重複該治療。該等治療亦可具有不同劑量。 5.   其他試劑
考慮其他試劑可與本實施例之某些態樣組合使用以改善治療之治療效能。該等額外試劑包括影響細胞表面受體及隙型連結之上調之試劑、細胞生長抑制劑及分化劑、細胞黏附抑制劑、增加過度增殖細胞對細胞凋亡誘導物之敏感性之試劑或其他生物試劑。藉由提高隙型連結之數目而增加細胞間信號傳導將增加對鄰近之過度增殖細胞群體之抗過度增殖效應。在其他實施例中，細胞抑制劑或分化劑可與本實施例之某些態樣組合使用以改善治療之抗過度增殖效能。考慮細胞黏附之抑制劑以改善本實施例之效能。細胞黏附抑制劑之實例係黏著斑激酶(FAKs)抑制劑及洛伐他汀(Lovastatin)。進一步考慮增加過度增殖細胞對細胞凋亡之敏感性之其他試劑，例如抗體c225，可與本實施例之某些態樣組合使用以改善治療效能。 IV.   製品或套組
本文亦提供包含抗原特異性T細胞或TCR之製品或套組。該製品或套組可進一步包含包裝插頁，其包含關於使用抗原特異性T細胞在個體中治療癌症或延遲癌症進展或增強患有癌症之個體之免疫功能之說明書。本文所述之任何抗原特異性T細胞可包括在製品或套組中。適宜容器包括例如瓶、小瓶、袋及注射器。容器可由各種材料(例如玻璃、塑膠(例如聚氯乙烯或聚烯烴)或金屬合金(例如不銹鋼或哈氏合金(hastelloy)))形成。在一些實施例中，容器容納調配物，且容器上或與容器相關聯之標籤可指示使用指導。製品或套組可進一步包括自商業及使用者觀點來看合意之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、注射器及具有使用說明書之包裝插頁。在一些實施例中，製品進一步包括一或多種其他試劑(例如，化學治療劑及抗瘤劑)。用於一或多種試劑之適宜容器包括例如瓶、小瓶、袋及注射器。 V.     實例
本發明包括下列實例以展現本發明之較佳實施例。彼等熟習此項技術者應瞭解，下列實例中揭示之技術代表本發明者發現在實踐本發明中運行良好之技術，且因此可認為構成其實踐之較佳方式。然而，彼等熟習此項技術者鑒於本揭示內容應瞭解，可對所揭示具體實施例作出多種改變且仍獲得相同或類似結果，此並不背離本發明之精神及範圍。實例 1- 退變樣蛋白 1 係由胰臟癌及基底樣乳癌表現之共享之可靶向之癌 - 胎盤抗原
PDAC 患者腫瘤之免疫肽體分析鑑別腫瘤相關肽： 為了鑑別PDAC之基於CTL之免疫療法之肽靶標，分析原子35名在M.D. Anderson Cancer Center治療之PDAC患者之39個腫瘤樣本。除了3個患者源異種移植物(PDX)及2個源自轉移之類器官細胞系之外，此亦包括34個新鮮切除之手術樣本(20個轉移瘤及14個原發性腫瘤)。使腫瘤細胞溶解，並進行全HLA I類免疫沈澱及酸溶析，之後進行串聯質譜法(MS)以分析HLA結合肽。對照Swiss-Prot數據庫(9/2018更新)搜索溶析之肽片段化譜，以鑑別在人類蛋白質體內編碼之匹配。使用若干正交參數評價個別肽匹配，該等正交參數包括Mascot Ion評分、MS1質量差異(δ質量)及藉由高解析度基因測序確定之預測之與患者HLA同種異型之結合。藉由評估用於以下之所有肽編碼基因確定了作為治療性TAA靶標之進一步驗證及潛在適用性：(1)藉由RNAseq確定之患者腫瘤組織轉錄本表現，(2)正常組織轉錄本表現(GTex Portal數據庫)，及(3)腫瘤組織中之總體表現(TCGA數據庫) (圖1A)。
免疫沈澱之HLA I類之量與所分析之新鮮腫瘤樣本之大小相關(R2 = 0.79)，除了藉由西方墨點分析評價之顯示相對低之HLA I類表現之8個腫瘤(21.6%) (圖7，表1)。如所預計，HLA I類蛋白含量與和溶析肽Swis-Prot數據庫匹配之數目相關(R2 = 0.62，圖8)。總之，所分析之39個腫瘤樣本產生總共23,245個獨特、高置信度之肽一致性，其中7,966個肽(34.3%)係預測結合至一或多個患者I類HLA同種異型之8聚體至13聚體肽。新鮮腫瘤樣本產生高度可變數目之肽，範圍為238至1657 (平均值= 542)。對於3名患者，PDX衍生導致較大之腫瘤樣本，在所有3個病例中產生增加數量之溶析肽。兩種患者源類器官細胞系之一(MP015)產生總體最多數目之溶析肽(n = 1903)，強調了在MS分析之前活體外擴增腫瘤樣本所提供之定量優點(表2，圖8)。
表2.自兩個HLA-A*0101+PDAC患者腫瘤類器官溶析之VGLL1源肽.
患者標識符 溶析肽 源基因 匹配等級 腫瘤RNA    表現(RNAseq, TPM) 預測之HLA結合親和力(nM)
C(1203 LSELETPGKY VGLL1 1 77.53 A*0101 A*2601 B*3502 B*3801 C*0401 C*1203
51 12558 33903 29369 30164 6181
MP081 LSELETPGKY VGLL1 1 56.39 A*0101 A*0101 B*3502 B*5701 C*0401 C*0602
51 51 33903 11936 30164 35852
編碼肽之基因之表現譜將VGLL1 鑑別為新穎胰臟癌TAA ： 為了評估任何溶析之肽是否構成潛在治療性CTL靶，參照含有源自＞50種不同人類組織之RNAseq數據之GTex Portal數據庫，個別地評價編碼肽之基因之正常組織轉錄本表現。將正常組織(不包括睪丸)分類成4組，其反映自藉由抗原特異性CTL之脫靶殺死活性所預計之潛在毒性(表2)。然後使用四種嚴格性增加相應表現濾器篩選編碼肽之基因，以消除CTL療法背景中最可能引發自體免疫毒性之候選TAA (圖1B)。因此，儘管在非必需組織(例如前列腺、乳房及脂肪組織)中允許TAA轉錄本表現高達30 TPM之最大值，但對於CTL識別可致死之高度必需組織(例如心臟及腦)，施加1 TPM之最大表現臨限值。使用該等嚴格準則，認為12種TAA肽係對靶最安全的，編碼該等肽之基因係MUC16 (編碼5種獨特肽)、MUC19 、 ZNF717 、 EIF5AL1 、 RGPD1 、 SLC30A8 、 MIA2 及 VGLL1 (各自編碼1種獨特肽)。亦檢測到由TAA MSLN及IDO1編碼之肽，但由於正常肺組織中升高之RNA轉錄本表現(分別為88 TPM及16 TPM，圖1B)而排除在篩選之外。在認為對靶最安全之TAA中，發現僅2種肽(源自MIA2 及VGLL1 )由多於一個PDAC患者之腫瘤呈遞(表2)。
自PDAC患者源類器官細胞系MP015-Org及MP081-Org溶析獨特地由VGLL1 編碼之10聚體肽LSELETPGKY (SEQ ID NO:93)。預測該肽以高親和力與HLA-A *0101結合(51 nM)，且RNAseq分析確認在兩種類器官系中之高VGLL1 轉錄本表現(表2)。藉由靶向之LC-MS確認肽一致性，其中分析作為與類器官腫瘤相關肽之混合物之一部分之合成肽。如圖1C所示，合成同位素標記之肽LSELETPGK Y (SEQ ID NO: 93)產生與自PDAC類器官系MP015-Org及MP081-Org檢測之天然VGLL1肽高度類似之片段化譜，且亦在幾乎相同之LC-MS滯留時間檢測到。對2個額外表現HLA-A*0101之細胞系(PANC10.05及BXPC3)之靶向MS分析展現，在PANC10.05上亦可檢測到相同肽，表明LSELETPGKY (SEQ ID NO: 93)可能構成廣泛共享之TAA (圖9)。
VGLL1 由多種癌症類型表現且與較差之總體存活相關： VGLL1(亦稱為TONDU)首先鑑別為果蠅(Drosophila )中Vestigial (Vg)蛋白之人類同系物，其係一種翅膀發育之關鍵調節劑。由於VGLL1係結合至參與癌症發展之轉錄因子(TEF)之TEA結構域家族的轉錄共活化物，故在TCGA中列出之31種癌症類型中進一步檢查VGLL1 轉錄本表現。如圖2A所示，與大部分正常組織相比，VGLL1 在許多不同癌症(包括PDAC、膀胱、卵巢、乳房、肺及胃癌)中過表現。有趣的是，VGLL1 似乎優先在基底樣乳癌中表現，而在其他乳癌亞型中展現相對低之盛行率(圖10)。藉由癌細胞系百科全書(CCLE，圖11)中列出之腫瘤細胞系之基因表現分析確認類似特性。根據GTex RNAseq數據庫，在3個非必需組織中發現最高中值VGLL1 轉錄本表現：膀胱(15.3 TPM)、唾液腺(3.9 TPM)及乳房(1.3 TPM)。必需組織中VGLL1 轉錄本之最高表現程度係在正常肺(1.0 TPM)、食管(0.73 TPM)及腎(0.34 TPM)中，而心臟及腦組織中之VGLL1 中之表現實際上係不可檢測的(圖2A)。總之，該數據表明VGLL1可構成用於多種癌症類型之安全、可靶向之TAA。
接下來評價腫瘤VGLL1 轉錄本表現是否與癌症患者存活相關。如圖2B所示，發現TCGA PDAC患者存活(n = 179)與VGLL1 表現負相關：與具有低表現或無表現之患者相比，具有高表現之患者具有顯著更短之總體中值存活(16個月對37個月，p=0.001)。此在37名M.D. Anderson PDAC患者之獨立同類群組中得以確認，對於該等患者可得到PDX組織：與存活超過36個月之患者相比，顯示總體存活少於18個月之患者展現顯著更高之平均PDXVGLL1 表現(57.3 TPM對9.6. TPM，p =0.003，圖2C)。值得注意的是，發現VGLL1 轉錄本表現與在手術切除之PDAC腫瘤中相比在PDAC腫瘤細胞系及PDX組織中更高，此可能係由於許多PDAC腫瘤之原位基質含量高(圖2A、2C、表2)。高度升高之VGLL1 表現亦與乳癌(p = 0.037)及胃癌(p = 0.047)中較短之總體存活時間相關，但顯示與卵巢癌中之存活無關(圖13)。有趣的是，低或不存在VGLL1 表現與膀胱癌中之較短存活時間相關(p = 0.036)。一種可能解釋係正常膀胱組織抗原(如VGLL1)之喪失可指示腫瘤去分化，此與膀胱癌及許多其他腫瘤類型中之較差預後相關。
VGLL1 係具有治療潛能之一組獨特癌症- 胎盤抗原(CPA) 之一部分： VGLL1先前已被鑑別為在人類胎盤發育之早期事件中具有調節作用，且係增殖性細胞滋養層之特異性標記。根據此，來自7個人類胎盤樣品之RNAseq基因表現數據顯示VGLL1 在該組織中展現最高表現，其表現範圍很大(平均值= 302.7 TPM)，比其正常膀胱表現高近20倍(圖3A)。此導致探索以下觀點：癌症-胎盤抗原(CPA)可構成一類不同之可靶向TAA，其類似於已成功地用基於CTL之療法靶向之癌症-睪丸抗原(CTA)。為了鑑別具有與VGLL1類似表現譜之其他CPA，在GTex、TCGA及其他RNAseq數據庫中搜索展現以下屬性之基因：(1)胎盤中最高正常組織表現；(2)在其他正常組織中低表現至無表現；及(3)在胰臟癌、乳癌、膀胱癌及/或卵巢癌中表現之升高。該搜索產生9個額外基因，包括胎盤特異性1 (PLAC1 )，其先前鑑別為癌症患者中體液性抗腫瘤免疫之靶。
有趣的是，亦將絨毛膜促性腺激素(CG) β亞單位3及5 (CGB3/CGB5 ) (即妊娠期間胎盤滋養層產生之CG激素複合物之組分)鑑別為潛在CPA，此乃因其在胰臟癌、睪丸癌、子宮癌及膀胱癌之亞群中過表現(圖3B)。其他6種推定CPA展現不同表現模式，範圍為自僅在一組有限之癌症類型中發現之彼等(IGF2BP3 、ADAM12 )至在大部分癌症類型中過表現之彼等，而且亦展現在正常雌性生殖組織中升高之表現(CAPN6 、MMP11 ) (圖3、14至23)。
儘管在該組PDAC樣本中檢測到源自該等基因之肽，但在多種腫瘤類型中已鑑別來自該等推定CPAs中之若干種之表位，並將其列於免疫表位數據庫(IEDB)中。
自PDAC 患者MP015 之外周血擴增VGLL1 特異性細胞毒性T 細胞： 當在2011年12月首次診斷患有原發性PDAC時，患者MP015為50歲男性。在手術去除原發性胰臟腫瘤後兩年，在2013年11月實施左肺病灶之胸腔鏡楔形切除術，並用於衍生類器官細胞系MP015-Org。經由一系列化學治療方案，保持檢查患者之疾病將近2年以上，但在進展後，其在M.D. Anderson入選IRB批准之細胞治療方案，以接受自體、擴增之腫瘤抗原特異性CTL。對擴增之類器官細胞系實施免疫肽體分析。
MP015-Org在2015年5月鑑別6個HLA I類結合之肽(4個源自MUC16且1個各自來自ZNF717及VGLL1)，其滿足作為安全、可靶向之TAA之準則(圖1B及表2)。定製之臨床級四聚體可用於6種潛在靶標中之3種：兩種HLA-B*3502限制性MUC16肽及單一HLA-A*0101限制性VGLL1肽。
在白血球分離術後，在IL-21存在下，用個別肽脈衝之DC刺激患者MP015 PBMC兩次，之後基於四聚體分選抗原特異性CD8+ T細胞(圖4A)。儘管MUC16特異性CTL不能自患者PBMC擴增，但VGLL1 CTL成功擴增，其中VGLL1四聚體陽性T細胞在DC-肽刺激2週後包含3.4%之CD8+ (圖4B)。重複兩次細胞分選及之後使用快速擴增方案(REP)，從而產生近200億個擴增之CTL，其中＞90%係VGLL1四聚體陽性的，且展現限制性Vβ使用(圖4B及C)。VGLL1特異性CTL亦成功地自2名健康HLA-A*0101陽性血液供體中之2名擴增，展現LSELETPGKY (SEQ ID NO: 93)肽之一般免疫原性(圖14)。
使用標準51 Cr釋放分析對來自患者MP015之擴增CTL進行功能性測試。用滴定量之VGLL1肽脈衝之Mel888黑色素瘤細胞(VGLL1陰性，HLA-A*0101陽性)在低至10 nM之肽濃度下引發CTL識別及殺死，指示對同源肽之相對高親和力(圖4D)。重要的是，擴增之患者源CTL亦顯示對自體類器官細胞系MP015-Org之穩健識別，其中VGLL1肽最初藉由MS自該自體類器官細胞系MP015-Org中檢測到(圖5A)。在2015年10月癌得星(Cytoxan)之預處理方案之後，患者MP015輸注196億自體、擴增之VGLL1特異性CTL，隨後接受介白素-2及派姆單抗。儘管患者經歷短暫發熱(T細胞輸注誘導之細胞介素釋放之常見副作用)，但其未經歷指示潛在CTL介導之毒性之不良事件。
不幸的是，2015年11月晚期之掃描顯示快速疾病進展，表現為肺病灶及基於胸膜之轉移性疾病之間隔增加。令人驚訝的是，此時對基於胸膜之結節進行之生檢揭示分化不良之神經內分泌腫瘤。對在前18個月內收集之連續液體生檢之DNA測序分析提供患者MP015之癌症由於大量進行性遺傳擴增、缺失、重排及後生改變而極快演變之證據。肺轉移之RNAseq分析亦展現，VGLL1轉錄本表現之顯著降低(35.1 TPM至1.6 TPM)在2013年11月與2015年12月之間發生，提供對ETC療法無臨床反應之潛在解釋(圖14)。患者MP015在2016年1月由於其肺轉移進展引起之廣泛併發症而死亡。
VGLL1 特異性CTL 展現針對多種同種異體PDAC 腫瘤細胞系之細胞毒性： 儘管患者MP015未經歷來自其自身VGLL1特異性CTL之過繼性轉移的臨床益處，但由該等T細胞在活體外展現之穩健抗腫瘤活性導致探索其是否可能對其他PDAC患者具有治療潛能。HLA-A*0101由PDAC患者同類群組之約30%表現，且TCGA及MDACC PDAC手術樣本及PDX之RNAseq分析顯示43.2%至62.5%之患者以＞5 TPM之位準表現VGLL1轉錄本。自該等數據估計12%至15%之PDAC患者在HLA-A*0101之背景下呈遞LSELETPGKY (SEQ ID NO: 93)肽靶標，且因此可潛在地自VGLL1-CTL療法受益。
為了確定源自患者MP015之VGLL1-CTL是否能夠識別同種異體PDAC腫瘤，使用51 Cr釋放分析測試一組表現HLA-A*0101之PDAC腫瘤細胞系作為殺死之靶。使用西方墨點分析以確認VGLL1蛋白表現，而流式細胞術確認細胞系中HLA-A*0101之表面表現(圖15)。雖然未識別到對照細胞系WM793 (VGLL1陰性，HLA-A *0101陽性)，但VGLL1特異性CTL識別自體MP015- Org細胞及所測試之4個異源PDAC系中之4個，包括誘導PANC-1005、CAPAN-1及BXPC3之穩健殺死(圖5A及5B)。源自患者MP081之PDAC類器官細胞亦由VGLL1-CTL溶解，但效率降低，此可能係由於培養物內VGLL1陰性細胞之生長。藉由與泛MHC I類抗體W6/32共培育展現VGLL1-CTL特異性，該泛MHC I類抗體W6/32導致PANC10.05識別及溶解之阻斷(圖27)。總之，該等結果提供LSELETPGKY肽構成可經VGLL1特異性CTL有效靶向之共享之PDAC腫瘤抗原之證據。
VGLL1-CTL 顯示針對多種腫瘤類型之活性及降低之原代細胞識別： TCGA RNAseq數據分析指示VGLL1由若干癌症類型(31種中之16種)表現，最顯著地在75-80%之患有膀胱癌、卵巢癌及基底型乳癌之患者中表現，及在15-20%之患有肺癌及胃癌之患者中表現(圖3B)。因此，開始確定原子該等癌症類型之細胞系是否可為VGLL1特異性CTL之靶(圖6A)。一組卵巢癌、基底型乳癌、膀胱癌、胃癌及肺癌細胞系之西方墨點分析顯示在所分析之14個系中之12個中有高VGLL1表現(圖6B)。在天然表現HLA-A*0101之8個細胞系中，VGLL1-CTL殺死3個卵巢系中之2個、3個乳房系中之2個及2個膀胱及肺癌系中之2個(圖6A)。轉導五個額外HLA-A*0101陰性細胞系(2個胃系、2個膀胱系及1個肺系)以表現HLA-A*0101，之後將其測試為VGLL1-CTL之靶。如圖6A所示，使得所有五種HLA-A*0101轉導之細胞系皆易受由VGLL1-CTL之殺死影響，指示來自經處理之內源表現之VGLL1蛋白之LSELETPGKY (SEQ ID NO: 93)肽之呈遞。綜上所述，該等結果表明VGLL1-CTL對於除PDAC以外之至少五種額外癌症類型具有潛在治療價值。
為了評價VGLL1-CTL用於潛在治療用途之安全性，根據GTex正常組織表現譜，其針對一組最可能引發VGLL1特異性反應性之正常原代細胞進行測試(圖2A)。由於膀胱展現最高正常組織VGLL1 轉錄本表現，測試兩種不同HLA-A*0101陽性原代膀胱細胞系作為VGLL1-CTL殺死之靶。如圖6C所示，特異性溶解較低，在一個膀胱系中可檢測到，但僅在最高E:T比率下可檢測到。由於GTex數據庫指示VGLL1 轉錄本在正常乳房及肺中亦以低程度表現，故測試針對表現HLA-A*0101之原代乳房及肺氣道細胞以及作為陰性對照之原代黑色素細胞的VGLL1-CTL殺死活性。在該組中，乳房細胞藉由VGLL1特異性CTL引發中等高程度之殺死，結果與藉由西方墨點法評價之VGLL1蛋白含量一致(圖6D)。相比之下，儘管展現足夠之HLA-A*0101表面表現，但肺氣道上皮細胞未由VGLL1-CTL殺死(圖15)。該等結果提供VGLL1特異性T細胞不可能識別必需正常組織之證據；然而，由於對於針對一些非必需組織之反應性之潛能，可能需要保證安全性問題。
採用源自35名PDAC患者之腫瘤樣本之無偏免疫肽體分析，將VGLL1鑑別為新穎推定之共享TAA，與基本正常組織相比，在腫瘤表現方面僅次於MUC16。然而，與MUC16表位相比，HLA-A *0101限制性VGLL1肽之免疫原性相當大，能夠自多個PBMC供體(包括一個PDAC患者)引發抗原特異性CTL。該免疫原性在開發用於癌症患者之內源性T細胞(ETC)療法之背景下提供了顯著優點。HLA-A*0101在西方歐洲及北美國家以相對高之盛行率(25-30%)表現，表明該等患者群體將最可能受益於靶向該表位52 。擴增之VGLL1特異性CTL不僅識別及殺死一組同種異體PDAC腫瘤細胞系，而且亦展現針對源自五種其他癌症類型之表現A*0101之腫瘤細胞之反應性。估計靶向該單一VGLL1表位可潛在地有益於大量西方癌症患者，包括超過20%之患有卵巢癌、膀胱癌或基底樣乳癌之患者，約12%之患有PDAC之患者，及5-10%之患有肺癌、胃癌、子宮頸癌、子宮癌或頭頸癌之患者(圖3)。實例 2. 材料及方法
細胞系. 使用基於癌細胞系百科全書(CCLE)微陣列之基因表現分析鑑別展現VGLL1 mRNA表現之人類癌細胞系。表現HLA-A*0101之癌細胞系PANC10.05、CAPAN-1 OAW28、HT1197、HT1376、BXPC3、UBCL-1及原代細胞系係自商業來源(ATCC及Sigma-Aldrich)獲得。患者源類器官細胞系MP015- Org (hMIA2D)係由Tuveson實驗室在Cold Spring Harbor Labs如前所述產生33 。患者源類器官細胞系MP081-Org係由Maitra實驗室從源自自楔形生檢之腫瘤組織產生。胃癌細胞系GT-5及MKN74係來自Lee Ellis博士之一種禮物。在含有10%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素(Pen-Strep) (Cellgrow)及1%胰島素-轉鐵蛋白-Seleum-A (GIBCO)之RPMI 1640培養基(GIBCO)中培養WM793、MKN74、PANC1005、GT-5及OAW28細胞。在具有FBS、Pen-Strep及1%丙酮酸鈉(GIBCO)之等份DMEM F12K及MEM α中培養BT20及膀胱細胞系。所有其他細胞系皆在RPMI 1640、FBS及Penn-Strep中培養，並添加HEPES (GIBCO)及Glutamax (GIBCO)。
慢病毒轉導. 如先前所述，用慢病毒基因轉移載體轉導天然表現VGLL1蛋白之一些HLA-A*0101陰性腫瘤細胞系，以表現由人類PGK啟動子驅動之HLA-A*0101 (Bradley等人，2015)。藉由用抗人類HLA-A1-生物素及鏈黴抗生物素蛋白-FITC (US Biological)染色並使用FACScanton II流式細胞計數器(BD Biosciences)量測螢光來評價A*0101之異位細胞表面表現。藉由細胞分選分離出表現生理及相當含量之表面HLA-A*0101之腫瘤細胞，並用於隨後之實驗。
VGLL1 蛋白表現 . 藉由西方墨點分析確認所有細胞系中之VGLL1蛋白表現。製備來自腫瘤及原代細胞系之細胞溶解物，並使用BCA方法(Thermo-Fisher)正規化蛋白質含量。使用標準西方墨點技術，藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳運行細胞溶解物，轉移，並用VGLL1特異性兔多株抗體(TA322329，OriGene)探測膜。使用酶聯抗兔mAb用Scientific Pierce Fast西方墨點套組根據製造商之說明書可視化VGLL1蛋白。
肽鑑別、選擇及驗證. 使用Triton X-100溶解患者源腹腔鏡楔形生檢、異種移植物(PDX)或細胞系，且將細胞溶解物在4℃下與每10 mg蛋白1 μg泛HLA-ABC特異性mAb W6/32一起培育過夜。使用蛋白A/G Ultralink樹脂珠粒免疫沈澱HLA I類分子，且然後用0.1M乙酸溶析HLA結合肽。藉由西方墨點分析確認HLA-A、B、C分離，然後藉由串聯質譜法(MS/MS)分析HLA陽性溶析物。藉由以0 (不可檢測)至4 (最高強度)之標度對西方墨點帶強度進行評級來半定量評價HLA I類蛋白之回收率。將腫瘤相關之HLA結合肽注射至HPLC系統(Dionex 3000 RSLC)上，並在MS/MS發現階段藉由在1.8 μm C18 (Agilent Technologies)上在0.1%甲酸水-乙腈中反相層析來分離。在Orbitrap Elite質譜儀(Thermo-Fisher)上使用數據依賴性採集來分析肽。為了分析獲得之MS/MS譜，利用Mascot算法對照SwissProt完全人類蛋白質數據庫(9/2018更新)搜索譜，其提供與習用注釋肽之潛在匹配。
藉由參照多個正交參數對個別肽匹配進行品質評價，該等正交參數包括Mascot Ion得分、MS1量測之與計算之肽質量之差異(Δ質量)、以及藉由高解析度基因測序及NetMHC及NetMHCpan算法確定之預測之與患者HLA同種異型之結合。藉由BLAST搜索分析高置信度肽匹配以鑑別所有潛在來源基因，然後將其與源自個別腫瘤樣品之RNAseq數據交叉參考以提供肽一致性之進一步驗證(驗證需要0.3個轉錄本/百萬之最小來源基因表現，TPM)。藉由應用連續RNA轉錄表現濾器以消除由於正常組織表現最可能引發自體免疫毒性之肽，針對作為潛在CTL靶之安全性篩選溶析之TAA肽(GTex Portal RNAseq數據)。除睪丸及胎盤外，在非必需組織中允許30 TPM最大值之來源基因轉錄本表現，在「注意」組織中允許10 TPM，在「風險」組織中允許3 TPM，且在高度必需之「危險」組織(例如心臟及腦)中允許1 TPM。經由分析TCGA RNAseq數據，亦篩選推定之TAA基因在不同癌症類型中之表現及盛行率。在選擇之情形下，實施靶向之MS/MS分析以確認TAA肽一致性。對於該等分析，藉由合成肽之MS分析預先確定13 C/15 N同位素標記之合成肽標準物之滯留時間窗，然後使用每一m/z附近3 Da之質量窗構築用於搜索TAA肽之靶向方法。
基因表現分析及患者存活. 使用Illumina TruSeq Straned Total RNA套組對源自所有PDAC腫瘤樣本、異種移植物及類器官細胞系之RNA實施全轉錄體測序(RNAseq)分析，該套組具有Ribo-Zero Gold，每一腫瘤RNA樣品(Avera Institute for Human Genetics)具有大約200百萬個末端配對讀數。藉由編譯源自正常人類原代組織(GTex Portal)及腫瘤組織(TCGA)之RNAseq數據來確定VGLL1 及其他癌症胎盤抗原之基因表現譜。當藉由腫瘤VGLL1 轉錄本表現分層時，自TCGA癌症患者之存活數據產生Kaplan-Meier曲線。
VGLL1 特異性CD8 T 細胞之分離及擴增. 如先前所述(Li等人，2005)產生腫瘤抗原特異性CTL。藉由用VGLL1231-240 肽LSELETPGKY (SEQ ID NO: 93)脈衝之自體樹突細胞(DC)刺激兩次HLA-A*0101陽性患者或健康供體源PBMC。第二次DC刺激後六天，用VGLL1231-240 肽/HLA-A*0101–PE結合之定製四聚體(Fred Hutchinson Cancer Research Center)染色培養之細胞，洗滌，且然後用APC結合之CD8抗體染色。洗滌細胞並藉由流式細胞術(LSRFortessa X-20分析儀)分析。藉由ARIA II分選CD8及四聚體雙陽性細胞，且使用快速擴增方案(REP)用PBMC及LCL飼養細胞擴增VGLL1特異性CD8 T細胞。使用IOTest β標記TCR-Vβ 組庫套組評價擴增之CD8 T細胞之TCR Vβ 組庫。
細胞毒性 T 細胞分析 . 使用標準鉻-51 (51 Cr)釋放分析評價藉由VGLL1特異性CD8+ T細胞之抗腫瘤殺死。用100 μL51 Cr標記靶細胞1小時，然後洗滌並一式三份以每孔2,000個靶細胞鋪板。將VGLL1特異性CD8+ T細胞與靶細胞以各種效應物對靶(E:T)細胞比培育四小時。培養時段後，自孔收集上清液，且用γ射線計數器量測51 Cr。校正背景51 Cr釋放及相對於藉由Triton X-100溶解之靶細胞量測之最大51 Cr釋放，計算特異性靶細胞溶解之百分比。
統計學分析 . 使用GraphPad Prism7.03版實施數據分析。使用參數測試(ANOVA或未配對t測試)分析正態分佈數據。藉由對數秩測試分析Kaplan-Meier存活曲線。若P＜0.05，則認為測試差異係統計學顯著的。實例 3-T 細胞受體之開發及表徵
選殖VGLL1 TCR並針對靶細胞之殺死效率進行表徵。用VGLL1 TCR轉導PBMC以靶向用肽脈衝之Mel888HLAA1細胞。發現表現TCR之T細胞可有效地殺死用肽脈衝之Mel888HLAA1細胞(圖1)。此外，選殖之VGLL1 TCR顯示可識別內源性表現之抗原(圖2)。
為了選殖T細胞受體，藉由RNeasy套組(QIAGEN, 74104)自VGLL1特異性T細胞分離總RNA，且使用用5’-RACE技術(cDNA端之快速擴增，Takara，634859)合成cDNA。然後，藉由使用特異性結合至TCRα或TCRβ恆定區之3'端引子之PCR分開擴增TCRα及TCRβ鏈。在cDNA合成期間添加與共同序列互補之5'端引子。然後將PCR產物選殖至TOPO選殖載體(Invitrogen, 450641)中，並對30個DNA純系進行測序以確定α或β鏈中之每一者。在使用IMGT數據庫進行基因對準後，鑑別出一個TCRβ(TRBVC1 5-6*01 J1-1)及4個主要TCRα純系(TRAV19*01 J56*01、TRAV13-1*02 J10、TRAV13-1*02 J1301、TRAV23 J12)。對於功能性測試，藉由將TCRβ與不同TCRα配對設計4個TCRα/β純系，且α及β鏈中之每一者由含弗林蛋白酶(Furin)及P2A裂解位點之連接體連接。全長基因由Twist Company合成，且然後選殖至pMSGV1載體中，該載體藉由將TCR DNA片段插入SalI及NotI位點而用於若干臨床試驗。
用於TCR 轉導之反轉錄病毒顆粒之產生： 基於pMSGV1之編碼4種不同VGLL1特異性TCR之反轉錄病毒載體使用包裝細胞系293GP用於產生反轉錄病毒顆粒，以RT114作為包膜蛋白以增強T細胞轉導效率。轉導自MD Anderson血庫獲得之正常PBMC，並連續培養5天。然後藉由流式細胞術分選出VGLL1肽四聚體及CD8雙陽性T細胞。該等T細胞直接用於細胞毒性分析，或者在分選後根據細胞數目進行T細胞複製。
VGLL1-TCR 表現介導CTL 細胞毒性： 黑色素瘤細胞系mel888表現內源性HLAA1，但不表現可檢測位準之VGLL1蛋白。用10微克肽脈衝Mel888，並與TCR轉導之效應T細胞以不同比率共培養。基於鉻-51釋放量測T細胞介導之靶細胞死亡。表現TCR純系1號及3號之效應T細胞在培育4小時內可以低至1.25:1之效應物:靶標比率溶解20-30%之靶腫瘤細胞且以40:1比率溶解70-80%靶細胞。VGLL1 TCR純系2號及4號似乎稍弱，但在所有四個TCR純系中差異不顯著(圖16)。
進一步測定VGLL1-TCR識別及溶解表現內源VGLL1之腫瘤細胞之效率。在該分析中，將mel888細胞系及表現HLAA1及VGLL1二者之胰臟細胞系與TCR-4轉導之T細胞以40:1及5:1之比率共培養不同時間點。培育3.5小時後，30%之胰臟細胞溶解，且5小時後，50%被殺死(圖17)。因此，VGLL1-TCR表現介導經轉導之T細胞之細胞毒性活性。 *  *  *
根據本揭示內容無需過多實驗即可獲得並執行本文所揭示及主張之所有方法。儘管本發明之組合物及方法已根據較佳實施例闡述，但熟習此項技術者應明瞭，可對該等方法及本文所述方法之步驟或步驟順序作出改變，此並不背離本發明之概念、精神及範圍。更具體而言，應明瞭，可用某些在化學上及生理上相關之試劑替代本文所述之試劑，同時將獲得相同或類似結果。對彼等熟習此項技術者顯而易見之所有該等類似替代物及修改皆視為在由隨附申請專利範圍所界定之本發明之精神、範圍及概念內。參考文獻 下列參考文獻明確地以引用方式併入本文中，從而提供實例性程序或其他補充本文所闡述者之細節。 Austin-Ward及Villaseca,Revista Medica de Chile , 126(7):838-845, 1998。 Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology , Wiley & Sons, NY, 1994。 Bradley等人，Cancer Immunol Res 3, 602-609, doi:10.1158/2326-6066.CIR-15-0030, 2015。 Bukowski等人，Clinical Cancer Res ., 4(10):2337-2347, 1998。 Camacho等人 (2004)J Clin Oncology 22(145): 摘要號2505, 2004。 Chothia等人，EMBO J. 7:3745, 1988。 Christodoulides等人，Microbiology , 144(Pt 11):3027-3037, 1998。 Cohen等人J Immunol . 175:5799-5808, 2005。 Davidson等人，J. Immunother ., 21(5):389-398, 1998。 Davila等人PLoS ONE 8(4): e61338, 2013。  European Patent Application No. EP2537416  Fedorov等人，Sci. Transl. Medicine , 5(215), 2013。  Janeway等人，Immunobiology: The Immune System in Health and Disease , 第3版, 當前  Hanibuchi等人，Int. J. Cancer , 78(4):480-485, 1998。 Heemskerk等人Hum Gene Ther. 19:496-510, 2008。 Hellstrand等人，Acta Oncologica , 37(4):347-353, 1998。 Hollander,Front. Immun. , 3:3, 2012。 Hui及Hashimoto,Infection Immun., 66(11):5329-5336, 1998。 Hurwitz等人，Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071, 1998。 國際專利公開案第WO 00/37504號 國際專利公開案第WO1995001994號 國際專利公開案第WO1998042752號 國際專利公開案第WO2000037504號 國際專利公開案第WO200014257號  國際專利公開案第WO2001014424號 國際專利公開案第WO2010/027827號 國際專利公開案第WO2011/066342號 國際專利公開案第WO2012/129514號  國際專利公開案第WO2013/071154號  國際專利公開案第WO2013/123061號  國際專利公開案第WO2013/166321號  國際專利公開案第WO2013126726號  國際專利公開案第WO2014/055668號  國際專利公開案第WO2014031687號  國際專利公開案第WO2015016718號 國際專利公開案第WO2018/067869號 Johnson等人Blood 114:535-46, 2009。 Jores等人，PNAS U.S.A . 87:9138, 1990。 Lefranc等人，Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003。 Li等人，J Immunol 175, 2261-2269, 2005。 Mokyr等人Cancer Res 58:5301-5304, 1998。 Pardoll,Nature Rev Cancer 12:252-264, 2012。 Parkhurst等人Clin Cancer Res . 15: 169-180, 2009。 Qin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 95(24):14411-14416, 1998。 Rizvi等人，Science 348, 124-128, doi:10.1126/science.aaa1348, 2015。 Sadelain等人，Cancer Discov . 3(4): 388-398, 2013。  Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Press, Strobel等人，Nat Rev Clin Oncol 16, 11-26, doi:10.1038/s41571-018-0112-1, 2019。 Terakura等人Blood .1:72- 82, 2012。 Turtle等人，Curr. Opin. Immunol ., 24(5): 633-39, 2012。  美國專利第4,870,287號 美國專利第5,739,169號 美國專利第5,760,395號 美國專利第5,801,005號 美國專利第5,824,311號 美國專利第5,830,880號 美國專利第5,844,905號 美國專利第5,846,945號 美國專利第5,885,796號 美國專利第6,207,156號 美國專利第6,410,319號  美國專利第6,451,995號  美國專利第7,070,995號  美國專利第7,265,209號  美國專利第7,354,762號  美國專利第7,446,179號  美國專利第7,446,190號  美國專利第7,446,191號  美國專利第8,008,449號 美國專利第8,017,114號 美國專利第8,119,129號 美國專利第8,252,592號  美國專利第8,324,353號  美國專利第8,329,867號 美國專利第8,339,645號  美國專利第8,354,509號 美國專利第8,398,282號  美國專利第8,479,118號  美國專利第8,735,553號 美國專利公開案第2002/131960號  美國專利公開案第2011/0008369號 美國專利公開案第2013/0149337號  美國專利公開案第2013/287748號  美國專利公開案第2014/022021號 美國專利公開案第2014/0294898號 Varela-Rohena等人Nat Med . 14: 1390-1395, 2008。 Wang等人J Immunother . 35(9):689-701, 2012。 Wu等人，Cancer , 18(2): 160-75, 2012。  Yarchoan等人，N Engl J Med 377, 2500-2501, doi:10.1056/NEJMc1713444, 2017。 Young等人，Ther Adv Med Oncol 10, 1758835918816281, doi:10.1177/1758835918816281, 2018。
下列圖式構成本說明書之一部分且包括其以進一步闡釋本發明之某些態樣。可藉由參照該等圖式中之一或多者結合本文所呈現具體實施例之詳細說明來更佳地理解本發明。
圖1A-1C ：免疫肽體分析揭示由兩個PDAC 患者源類器官系表現之VGLL1 源肽。( 圖1A) 自源自35個M.D. Anderson PDAC患者之39個腫瘤樣本鑑別PDAC腫瘤特異性之HLA I類結合肽之實驗策略。( 圖1B) 自溶析之PDAC相關肽鑑別潛在可靶向之TAA之生物資訊學篩選策略。與42個GTex Portal正常組織中之轉錄本表現之比較，評價編碼肽之基因之PDAC腫瘤RNAseq表現。排除睪丸，將正常組織分成4個類別(非必需、注意、風險及危險組織)，其反映自針對不同組織之腫瘤外殺死活性預期之潛在毒性。使用四個相應嚴格性遞增之表現臨限值(30、10、3及1 TPM，由綠色虛線指示)連續過濾所有編碼肽之基因，以消除在CTL療法之背景中最可能引發自體免疫毒性之候選TAA (紅色虛線)。繪示自PDAC患者MP015及MP081之腫瘤類器官細胞系分離之高置信度肽之篩選，顯示很少溶析之肽滿足該等嚴格準則。( 圖1C) 自兩種不同之PDAC類器官細胞系MP015及MP081(前2個圖)分離之HLA-A *0101限制性VGLL1源肽之質譜。患者源肽與合成同位素標記之VGLL1肽LSELETPGK Y (SEQ ID NO:93) (含有13 C/15 N標記之離胺酸殘基)之MS片段化譜共溶析並匹配，其中標記之y+ 片段離子系列展現預期之8個原子質量單位之位移(下圖)。
圖2 ：VGLL1 在多種腫瘤類型中過表現。 如藉由RNaseq分析確定之在正常組織(有色點，GTex Portal數據庫)及人類癌症(黑色點，TCGA數據庫)中之VGLL1轉錄本表現。每一點代表一個正常供體或患者腫瘤樣品。顏色對應於圖1中定義之4種正常組織類別：綠色，非必需組織；黃色，注意組織；橙色，風險組織；紅色，危險組織。儘管大於95%之正常GTex注意、風險及危險組織樣品降至低於3個轉錄本/百萬(TPM，虛線)，但大量TCGA癌症患者展現VGLL1轉錄本表現高於該臨限值(框)。
圖3 ：VGLL1 與 胰臟 患者存活差相關。頂部 ：Kaplan-Meier曲線顯示TCGA PDAC患者藉由腫瘤VGLL1轉錄本表現分層之總體存活(OS) (n = 178)。P-值指示對3組VGLL1表現患者與VGLL1表現低或不存在之患者之OS進行比較之對數秩顯著性測試結果。底部： 來自MD Anderson轉移性PDAC患者腫瘤之獨立同類群組(n =37)之患者源異種移植物(PDX)在免疫缺陷小鼠中生長後進行RNAseq分析。圖顯示對應於OS時間及相應VGLL1轉錄本表現分層成3個組之PDX樣本。
圖4A-4D ：自患者MP015 之外周血產生VGLL1 抗原特異性CTL 。( 圖4A) 概述自人類供體PBMC產生VGLL1特異性CD8+ T細胞之實驗程序之示意圖。( 圖 4B) 用自體LSELETPGKY (SEQ ID NO: 93)肽脈衝之樹突細胞(DC)刺激藉由白血球分離術自PDAC患者MP015分離之PBMC。在兩次刺激(頂行)後，分選CD8+ 及VGLL1四聚體陽性細胞，並使用標準快速擴增方案(REP)進行擴增。重新分選VGLL1特異性T細胞，且由於第一次REP後抗原特異性細胞之數量低，進行第二次擴增。第二次REP產生19.6 × 109 個VGLL1特異性CTL，患者MP015在個人化ETC療法同情IND方案下以輸注形式安全地接受該等VGLL1特異性CTL。( 圖4C) 使用對應於24種不同特異性之Vβ抗體實施擴增之VGLL1特異性CTL之TCR組庫分析。( 圖4D) 在標準51 Cr釋放分析中測試自患者MP015擴增之VGLL1特異性T細胞之功能性，以評價以5:1效應物對靶標(E:T)比率用滴定量之LSELETPGKY (SEQ ID NO: 93)肽脈衝之Mel888黑色素瘤細胞(VGLL1陰性HLA-A *0101陽性)之特異性溶解。
圖5A-5B ：VGLL1 特異性CTL 識別並殺死多種同種異體胰臟癌細胞系。( 圖5A) 在標準51 Cr釋放分析中共培養來自患者MP015之擴增之VGLL1特異性CD8+ T細胞與一組HLA-A*0101陽性PDAC腫瘤細胞系，以量測在不同效應物對靶標(E:T)細胞比下之細胞毒性活性。WM793黑色素瘤細胞(VGLL1陰性HLA-A*0101陽性)用作陰性對照系。VGLL1-CTL強力地殺死VGLL1肽最初所分離自之自體類器官細胞系MP015，且亦展現針對四種表現HLA-A*0101之同種異體PDAC細胞系之細胞毒性活性。結果顯示六個重複樣品之平均值及標準偏差，且數據代表最少4個重複實驗。( 圖5B) 西方墨點分析顯示所有五種測試之PDAC細胞系中VGLL1蛋白之表現。
圖6A-6D ：VGLL1 特異性T 細胞識別及殺死多種腫瘤類型，但對原代組織細胞系之識別降低。( 圖6A) 在標準51 Cr釋放分析中共培養VGLL1特異性CD8+ T細胞與13種不同之表現HLA-A*0101之腫瘤細胞系，以量測在不同效應物對靶標(E:T)細胞比下之細胞毒性活性，該等腫瘤細胞系源自卵巢癌、肺癌、乳癌、膀胱癌或胃癌。將五種HLA-A*0101陰性細胞系(EBC1、HT1197、HT1376、GT-5及MKN74)慢病毒轉導，以穩定表現HLA-A*0101；與HLA-A*0101轉導之對應體(黑色線)相比，顯示親代細胞系(灰色線)之VGLL1-CTL殺死。( 圖6B) 顯示VGLL1蛋白在源自卵巢癌、肺癌、乳癌、膀胱癌或胃癌之腫瘤細胞系中之表現的西方墨點分析。( 圖6C) 在標準51 Cr釋放試驗中共培養VGLL1特異性CTL與表現HLA-A*0101之原代組織細胞，以量測細胞毒性活性，該等細胞源自膀胱、乳房、肺氣道或皮膚黑色素細胞。VGLL1-CTL分析結果顯示六個重複樣品之平均值及標準偏差，且數據代表最少2個重複實驗。( 圖6D) 如藉由西方墨點分析評價之原代細胞系中之VGLL1蛋白表現。
圖7 ：免疫沈澱之HLA I 類之量與PDAC 腫瘤樣本重量相關。 對PDAC患者(n =34)或患者源異種移植物(n=3)之手術腫瘤切除物進行稱重，之後使用mAb W6/32對總HLA I類進行組織溶解及免疫沈澱。藉由在0 (未檢測到)至4 (檢測到之最高程度)之標度上評價HLA I類條帶強度(預期大小42-44 KD)，基於西方墨點分析對回收之HLA I類進行定量。圖顯示藉由西方墨點條帶強度繪製之樣本重量；虛線描繪具有低於預期HLA I類回收率之樣品，指示減少之腫瘤HLA表現。
圖8 ：檢測到之PDAC 相關肽之總數與回收之HLA I 類之量相關。 藉由在0 (未檢測到)至4 (檢測到之最高程度)之標度上評價HLA I類條帶強度(大小42-44 KD)藉由西方墨點分析定量自PDAC患者源手術切除物(n =34)、異種移植物(n =3)或類器官細胞系(n =2)回收之HLA I類。藉由串聯MS分析自免疫沈澱之HLA I類溶析之肽，並利用SwissProt人類蛋白質體數據庫進行搜索。圖顯示針對HLA I類強度(如藉由西方墨點分析)繪製之獨特、高品質肽匹配之數目。
圖9 ：自PANC-1005 細胞系溶析VGLL1 源肽。 自PDAC細胞系PANC10.05 (上圖)分離之HLA-A *0101限制性VGLL1源肽之質譜。天然肽與含有13 C/15 N標記之離胺酸殘基之合成同位素標記之肽LSELETPGK Y (SEQ ID NO: 93)之MS片段化譜共溶析並匹配(下圖)。
圖10 ：與其他乳癌亞型相比，VGLL1 優先 在基底樣乳癌中表現。 將TCGA乳癌患者細分為5個主要亞型(LumA、LumB、基底樣、HER2過表現及正常樣)，並藉由RNAseq分析來分析腫瘤VGLL1表現。每一點代表一個TCGA患者樣品，且VGLL1轉錄本表現以每百萬映射讀數之每千鹼基轉錄本之片段(FPKM)表示。
圖11 ：VGLL1 基因在源自多種癌症類型之腫瘤細胞系中之表現。 來自癌細胞系百科全書(Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE)之腫瘤細胞系之多種陣列(n =679)之基因表現微陣列分析顯示除了顯著百分比之乳癌、胃癌、卵巢癌及肺癌細胞系外，VGLL1亦由大多數PDAC及膀胱癌細胞系表現。在源自黑色素瘤、甲狀腺癌或造血系統癌症之細胞系中未發現VGLL1表現。VGLL1抗原陽性之臨限值係背景信號之3倍。
圖12A-12D ：高腫瘤VGLL1 表現與多種癌症類型中降低之存活相關。 根據如藉由RNAseq分析確定之腫瘤VGLL1表現將TCGA癌症患者分層成三組。Kaplan-Meier曲線顯示( 圖12A) 胃腺癌(＞10 TPM顯示最低總體存活且＜1.5顯示最高總體存活)、( 圖12B) 乳癌(＞50 TPM顯示最低總體存活且＜1.5顯示最高總體存活)、( 圖12C) 卵巢漿液腺癌及( 圖12D) 膀胱尿路上皮癌患者之每一組之總體存活(OS)。P值指示比較具有最低及最高VGLL1表現之組之OS之對數秩顯著性測試結果。
圖13A-13B ：自多個正常供體PBMC 產生 HLA-A*0101 限制性VGLL1 抗原特異性CTL 。( 圖13A) 誘導來自兩個健康供體之PBMC之VGLL1特異性CD8 T細胞。在2週內用LSELETPGKY (SEQ ID NO: 93)肽脈衝之樹突細胞刺激表現HLA-A *0101之供體PBMC兩次。藉由ARIA分選器分選VGLL1四聚體陽性CD8+ T細胞(上圖)，且使用標準快速擴增方案(REP)擴增分選之T細胞。( 圖13B) 使用對應於24種不同特異性之Vβ抗體實施擴增之VGLL1特異性CTL之TCR組庫分析。
圖14 ：PDAC 患者MP015 在VGLL1-CTL 療法之前顯示VGLL1 抗原表現喪失。 來自PDAC患者MP015之肺腫瘤轉移之RNAseq分析揭示在2013年11月與2015年12月之間VGLL1轉錄本表現之喪失。
圖15 ：藉由流式細胞術在靶細胞系上確認之HLA-A*0101 表面表現。 將本研究中使用之所有腫瘤細胞系及正常原代細胞用螢光團標記之HLA-A*0101特異性mAb染色，並藉由流式細胞術分析以確認天然內源性HLA-A*0101表面表現(灰色直方圖)，之後在VGLL1特異性CTL分析中用作靶標。使用慢病毒表現載體轉導五種腫瘤細胞系以表現HLA-A*0101 (紅色直方圖)。
圖16 ：用HLA I 類特異性抗體阻斷VGLL1-CTL 殺死。 在標準51 Cr釋放分析中共培養擴增之VGLL1特異性CD8+ T細胞與HLA-A*0101陽性PDAC腫瘤細胞系PANC10.05，以量測在不同效應物對靶標(E:T)細胞比下之細胞毒性活性。添加HLA I類阻斷抗體W6/32大大消除VGLL1-CTL殺死，展現抗腫瘤CTL活性係HLA I類限制性的。
圖17 ：表現TCR之T細胞可有效地殺死用肽脈衝之Mel888HLAA1細胞。用VGLL1 TCR轉導PBMC以靶向用肽脈衝之Mel888HLAA1細胞。
圖18 ： 選殖之VGLL1 TCR可識別內源性表現之抗原。Mel888A1細胞係HLA+ VGLL1- 且Panc細胞係HLAA1+ VGLL1+ 。
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Claims (79)

  1. 一種工程化T細胞受體(TCR)，其中該TCR特異性結合退變樣蛋白1 (Vestigial 1, VGLL1)且包含： (a) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:10)、CDR2 (SEQ ID NO:11)及CDR3 (SEQ ID NO:12)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:21)、CDR2 (SEQ ID NO:22)及CDR3 (SEQ ID NO:23)； (b) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:33)、CDR2 (SEQ ID NO:34)及CDR3 (SEQ ID NO:35)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:44)、CDR2 (SEQ ID NO:45)及CDR3 (SEQ ID NO:46)； (c) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:56)、CDR2 (SEQ ID NO:57)及CDR3 (SEQ ID NO:58)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:67)、CDR2 (SEQ ID NO:68)及CDR3 (SEQ ID NO:69)；或 (d) α鏈CDR1 (SEQ ID NO:79)、CDR2 (SEQ ID NO:80)及CDR3 (SEQ ID NO:81)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:90)、CDR2 (SEQ ID NO:91)及CDR3 (SEQ ID NO:92)。
  2. 如請求項1之TCR，其中該TCR包含α鏈CDR1 (SEQ ID NO:10)、CDR2 (SEQ ID NO:11)及CDR3 (SEQ ID NO:12)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:21)、CDR2 (SEQ ID NO:22)及CDR3 (SEQ ID NO:23)。
  3. 如請求項2之TCR，其中該TCR包含與SEQ ID NO:15之胺基酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:20之胺基酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之β鏈可變區。
  4. 如請求項2或3之TCR，其中該TCR包含SEQ ID NO:15之α鏈可變區及SEQ ID NO:20之胺基酸序列之β鏈可變區。
  5. 如請求項1至4中任一項之TCR，其中該TCR包含與SEQ ID NO:3之核苷酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:9之核苷酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之β鏈可變區。
  6. 如請求項1至5中任一項之TCR，其中該TCR包含含有SEQ ID NO:3之核苷酸序列之α鏈可變區及包含SEQ ID NO:9之核苷酸序列之β鏈。
  7. 如請求項1至6中任一項之TCR，其中除該等CDR外之該TCR與SEQ ID NO:13具有至少90%一致性。
  8. 如請求項1至7中任一項之TCR，其中該TCR包含SEQ ID NO:13。
  9. 如請求項1之TCR，其中該TCR包含α鏈CDR1 (SEQ ID NO:33)、CDR2 (SEQ ID NO:34)及CDR3 (SEQ ID NO:35)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:44)、CDR2 (SEQ ID NO:45)及CDR3 (SEQ ID NO:46)。
  10. 如請求項9之TCR，其中該TCR包含與SEQ ID NO:38之胺基酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:43之胺基酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之β鏈可變區。
  11. 如請求項9或10之TCR，其中該TCR包含SEQ ID NO:38之α鏈可變區及SEQ ID NO:43之胺基酸序列之β鏈可變區。
  12. 如請求項9至11中任一項之TCR，其中該TCR包含與SEQ ID NO:26之核苷酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:32之核苷酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之β鏈可變區。
  13. 如請求項9至12中任一項之TCR，其中該TCR包含含有SEQ ID NO:26之核苷酸序列之α鏈可變區及包含SEQ ID NO:32之核苷酸序列之β鏈可變區。
  14. 如請求項9至13中任一項之TCR，其中除該等CDR外之該TCR與SEQ ID NO:36具有至少90%一致性。
  15. 如請求項9至14中任一項之TCR，其中該TCR包含SEQ ID NO:36。
  16. 如請求項1之TCR，其中該TCR包含α鏈CDR1 (SEQ ID NO:56)、CDR2 (SEQ ID NO:57)及CDR3 (SEQ ID NO:58)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:67)、CDR2 (SEQ ID NO:68)及CDR3 (SEQ ID NO:69)。
  17. 如請求項16之TCR，其中該TCR包含與SEQ ID NO:61之胺基酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:66之胺基酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之β鏈可變區。
  18. 如請求項16或17之TCR，其中該TCR包含SEQ ID NO:61之α鏈可變區及SEQ ID NO:66之胺基酸序列之β鏈可變區。
  19. 如請求項16至18中任一項之TCR，其中該TCR包含與SEQ ID NO:49之核苷酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:55之核苷酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之β鏈可變區。
  20. 如請求項16至19中任一項之TCR，其中該TCR包含含有SEQ ID NO:49之核苷酸序列之α鏈可變區及包含SEQ ID NO:55之核苷酸序列之β鏈。
  21. 如請求項16至20中任一項之TCR，其中除該等CDR外之該TCR與SEQ ID NO:59具有至少90%一致性。
  22. 如請求項16至21中任一項之TCR，其中該TCR包含SEQ ID NO:59。
  23. 如請求項1之TCR，其中該TCR包含α鏈CDR1 (SEQ ID NO:79)、CDR2 (SEQ ID NO:80)及CDR3 (SEQ ID NO:81)及β鏈CDR1 (SEQ ID NO:90)、CDR2 (SEQ ID NO:91)及CDR3 (SEQ ID NO:92)。
  24. 如請求項23之TCR，其中該TCR包含與SEQ ID NO:84之胺基酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:89之胺基酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之β鏈可變區。
  25. 如請求項23或24之TCR，其中該TCR包含SEQ ID NO:84之α鏈可變區及SEQ ID NO:89之胺基酸序列之β鏈可變區。
  26. 如請求項23至25中任一項之TCR，其中該TCR包含與SEQ ID NO:72之核苷酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之α鏈可變區及與SEQ ID NO:78之核苷酸序列具有至少90%一致性的除CDR外之β鏈可變區。
  27. 如請求項23至26中任一項之TCR，其中該TCR包含含有SEQ ID NO:72之核苷酸序列之α鏈可變區及包含SEQ ID NO:78之核苷酸序列之β鏈。
  28. 如請求項23至27中任一項之TCR，其中除該等CDR外之該TCR與SEQ ID NO:82具有至少90%一致性。
  29. 如請求項23至28中任一項之TCR，其中該TCR包含SEQ ID NO:82。
  30. 如請求項1至29中任一項之TCR，其中該工程化TCR結合HLA-A*0101。
  31. 如請求項1至30中任一項之TCR，其中該TCR進一步定義為可溶性TCR，其中該可溶性TCR不包含跨膜結構域。
  32. 如請求項1至31中任一項之TCR，其進一步包含可檢測之標記。
  33. 如請求項1至32中任一項之TCR，其中該TCR共價結合至治療劑。
  34. 如請求項33之TCR，其中該治療劑係免疫毒素或化學治療劑。
  35. 一種多價TCR複合物，其包含複數個如請求項1至34中任一項之TCR。
  36. 如請求項35之複合物，其中該多價TCR包含2、3、4或更多個彼此連接之TCR。
  37. 如請求項35或36之複合物，其中該多價TCR存在於脂質雙層、脂質體中，或連接至奈米顆粒。
  38. 如請求項36至38中任一項之複合物，其中該等TCR經由連接體分子彼此連接。
  39. 一種編碼如請求項1至38中任一項之TCR的多肽。
  40. 一種編碼如請求項39之多肽的多核苷酸。
  41. 一種編碼如請求項1至38中任一項之TCR的表現載體。
  42. 如請求項41之表現載體，其中編碼該TCR之該序列在啟動子之控制下。
  43. 如請求項41或42之表現載體，其中該表現載體係病毒載體。
  44. 如請求項43之表現載體，其中該病毒載體係反轉錄病毒載體。
  45. 如請求項41至44中任一項之表現載體，其中該載體進一步編碼連接體結構域。
  46. 如請求項45之表現載體，其中該連接體結構域位於α鏈與β鏈之間。
  47. 一種經工程化以表現如請求項1至34中任一項之TCR的宿主細胞。
  48. 如請求項47之宿主細胞，其中該細胞係T細胞、NK細胞、不變NK細胞、NKT細胞、間質幹細胞(MSC)或誘導性多潛能幹(iPS)細胞。
  49. 如請求項47或48之宿主細胞，其中該宿主細胞係免疫細胞。
  50. 如請求項47至49中任一項之宿主細胞，其中該宿主細胞係分離自臍帶。
  51. 如請求項48至50中任一項之宿主細胞，其中該T細胞係CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或γδ T細胞。
  52. 如請求項48至51中任一項之宿主細胞，其中該T細胞係調節性T細胞(Treg)。
  53. 如請求項47至53中任一項之宿主細胞，其中該細胞係自體的。
  54. 如請求項47至53中任一項之宿主細胞，其中該細胞係同種異體的。
  55. 一種工程化如請求項47之宿主細胞之方法，其包含使該免疫細胞與如請求項1至34中任一項之TCR或如請求項41至46中任一項之表現載體接觸。
  56. 如請求項55之方法，其中該免疫細胞係T細胞或外周血淋巴球。
  57. 如請求項55或56之方法，其中接觸進一步定義為轉染或轉導。
  58. 如請求項55至57中任一項之方法，其中轉染包含將編碼如請求項1至34中任一項之TCR之RNA電穿孔至該免疫細胞中。
  59. 如請求項55至58中任一項之方法，其進一步包含在轉導該免疫細胞之前自如請求項41之表現載體產生病毒上清液。
  60. 如請求項55至59中任一項之方法，其中該免疫細胞係經刺激之淋巴球。
  61. 如請求項60之方法，其中該經刺激之淋巴球係人類淋巴球。
  62. 如請求項60或61之方法，其中刺激包含使免疫細胞與OKT3及/或IL-2接觸或在OKT3及/或IL-2中培育該免疫細胞。
  63. 如請求項55至62中任一項之方法，其進一步包含分選該等免疫細胞以分離TCR工程化T細胞。
  64. 如請求項63之方法，其進一步包含藉由連續稀釋實施T細胞選殖。
  65. 如請求項63或64之方法，其進一步包含藉由快速擴增方案擴增T細胞純系。
  66. 一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項47至53中任一項之TCR工程化細胞。
  67. 如請求項66之方法，其中該個體經鑑別具有HLA-A*0101等位基因。
  68. 如請求項66或67之方法，其中該TCR工程化細胞係T細胞或外周血淋巴球。
  69. 如請求項66之方法，其中該T細胞係CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或Treg。
  70. 如請求項66至69中任一項之方法，其中該癌症係胰臟癌、卵巢癌、胃癌、乳癌、膀胱癌、子宮癌或子宮頸癌。
  71. 如請求項66至70中任一項之方法，其中該個體係人類。
  72. 如請求項66至71中任一項之方法，其中該等TCR工程化細胞係自體的。
  73. 如請求項66至72中任一項之方法，其中該等TCR工程化細胞係同種異體的。
  74. 如請求項66至73中任一項之方法，其進一步包含在投與VGLL1特異性T細胞之前對該個體進行淋巴清除。
  75. 如請求項74之方法，其中淋巴清除包含投與環磷醯胺(cyclophosphamide)及/或氟達拉濱(fludarabine)。
  76. 如請求項66至75中任一項之方法，其進一步包含投與第二抗癌療法。
  77. 如請求項76之方法，其中該療法係化學療法、免疫療法、手術、放射療法或生物療法。
  78. 如請求項66至77中任一項之方法，其中該等TCR工程化細胞及/或至少第二治療劑係經靜脈內、腹膜內、氣管內、腫瘤內、肌內、內視鏡、病灶內、經皮、皮下、區域性地或藉由直接注射或灌注來投與。
  79. 如請求項66至78中任一項之方法，其中該個體經確定具有過表現VGLL1之癌細胞。
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