CN108384795A - 作用于tme免疫效应细胞的人工合成基因及验证方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及作用于TME免疫效应细胞的人工合成基因及验证方法和应用，通过基因合成的方式，将抑制信号受体基因与胞内激活信号功能区基因相结合，组成人工基因结构。表达人工基因结构的靶细胞可以转化抑制功能信号为免疫激活功能信号，从而可以在免疫抑制环境中激活效应免疫细胞，防止细胞衰竭，达到促进免疫反应的目的。方法包含由基因合成的方式把免疫检查点PD‑1与其他胞内激活通路基因结合，通过载体转染入抗原特异性效应细胞，转染的效应细胞会将抑制信号转化为激活信号，可以扩增效应细胞及降低免疫细胞被抑制的功能。本发明人工基因结构转染的效应细胞能克服免疫检查点对免疫细胞的功能抑制，具有激活与增强免疫细胞活性的功能。

Description

作用于TME免疫效应细胞的人工合成基因及验证方法和应用
[技术领域]
本发明涉及一种人工基因的构造设计，属于生物生产及应用技术领域，尤其涉及一种逆转免疫抑制信号的结构及其应用。
[背景技术]
近年来，利用免疫效应细胞回输治疗肿瘤的疗法逐渐得到临床证实，尤其是利用体外扩增与回输肿瘤亲润T细胞和Car-T细胞获得了前所未有的疗效(Clin CancerRes.2011，17:4550–4557)，但是这些疗法在治疗实体瘤的临床应用还存在不足，例如容易被免疫免疫检查点抑制和临床疗效差等(Clin Cancer Res.2014，20:4262–4273)，而肿瘤微环境(Tumor Microenvironment，TME)免疫抑制因素对实体瘤的免疫保护是造成疗效差别的根本原因。TME主要由免疫细胞、间充质细胞和内皮细胞等组成，是实体肿瘤组织为避免免疫细胞杀伤而形成的免疫抑制组织，会导致效应细胞免疫活性降低和免疫细胞杀伤功能衰竭等(J Cell Sci2012，125:5591-5596)。TME中各种免疫抑制细胞和肿瘤细胞广泛高表达的PD-L1(PLoS One.2011，6:e17621)，PD-L1与T细胞表面受体PD-1结合传递抑制信号降低杀伤性细胞因子的分泌，抑制T细胞的功能，使T细胞失去杀伤靶细胞的活性，最终导致肿瘤细胞逃逸(Clin Cancer Res.2012，18:6580)。由于肿瘤侵润性免疫细胞普遍高表达PD-1(Blood.2009，114:1537)，所以会对TME中PD-L1更为敏感，更容易使肿瘤亲润性免疫细胞失去活性，丧失杀伤肿瘤细胞的功能(Curr Opin Immunol.2012，24:207)。肿瘤细胞高表达PD-L1在各种肿瘤中得到广泛验证，并且其表达量与患者临床生存期有明显的负相关性(Clin Cancer Res 2009，15：971)，并与其降低效应细胞的免疫活性相一致。所以如何避免肿瘤微环境的抑制因素，降低抑制信号，增加激活信号，是肿瘤细胞治疗临床应用最为重要的课题。
CD3(cluster of differentiation 3)是T细胞最主要的共同活化受体，T细胞可以通过CD3胞内信号通路被激活(J.Biol.Chem.276:25378–85)，利用CD3抗体体外扩增T细胞已经被广泛应用(Mol Cell Biol.1987，7:650-6)。Dap10是一种T细胞和NK细胞上的受体，是免疫系统共激活组成成分。它与配体NKG2D结合可以激活下游信号通路(J Immunol2005，174:4480-4)，进一步刺激效应细胞的增殖与活性，提高靶细胞的功能性细胞因子合成与释放(Immunol Rev.2009，227:150–160)，抵抗T调节细胞的抑制功能(Mol Immunol2015；63:268-78)。已经证明可以通过激活NKG2D通路增强免疫细胞活性，提高对肿瘤的抑制作用(J Immunol2005；175:2825-33)。CD27信号通路是效应细胞重要的激活信号通路之一，通过CD27的激活可以增加效应细胞的扩增与杀伤功能，但是肿瘤微环境中的效应细胞普遍缺乏CD27配体(B7-1和B7-2)的表达(J.Immunol.152:1762–1773)。MyD88信号通路是免疫系统通过TLR激活的主要途径，可以刺激效应细胞的扩增，细胞因子的产生及抗肿瘤效用(Cancer Res 2010，70:7442-54)，但是正常细胞需要TLR协同作用才会产生激活作用。OX40和GITR是表达在活化T细胞和NK细胞上TNFRSF类的受体，是免疫系统共激活组成成分。TME侵润效应细胞免疫共激活受体OX40与GITR与患者生存成正相关性(Journal of LeukocyteBiology 100，2：275-290；Pathol Res Pract 2010，206:735e9)。这些信号通路的激活可以增加效应细胞的增殖与活性，提高靶细胞功能细胞因子的合成与释放(J Immunol.2004，34:613-22)，抵抗T调节细胞的抑制功能(Journal of immunology.2004，173:5008-20)。已经证明可以通过激活TNFRSF通路增强免疫细胞活性，提高对肿瘤的抑制作用(Journal ofimmunology.2007，179:7365-75；J Immunother 2008，31:235–245)，促进细胞因子分泌，降低TME的抑制作用(Cancer Res.2010，70:9041-52)，并在临床上取得一定疗效(Cancer Res73：7189–98)。通过激活这些受体通路可以刺激效应细胞的活化与扩增，达到增加免疫细胞杀伤肿瘤细胞的功能(Semin Oncol 2015，42:640–55)。
为了克服肿瘤微环境中PD-L1对效应细胞的抑制作用和以上免疫激活因素的限制，本发明利用基因工程的方法，构造一种包含PD-1功能部分和dap10/CD3胞内部分、或CD27胞内部分、或MyD88信号区、或OX40胞内部分、或GITR胞内部分的基因结构，表达该结构蛋白的细胞可以逆转PD-L1抑制作用为激活作用，扩增转染基因结构的免疫效应细胞数量，恢复杀伤肿瘤细胞的能力。本基因结构可以用于肿瘤的临床应用。
[发明内容]
本发明的目的在于克服肿瘤微环境中PD-L1对免疫效应细胞的抑制作用。转染人工基因序列的效应细胞可以转化PD-1抑制信号为免疫激活信号，既可以阻断PD-1与PD-L1/2抑制性信号通路，又能激活免疫细胞共刺激分子信号通路，克服现阶段细胞疗法效果差的缺点，增加免疫细胞杀伤肿瘤靶细胞的功能。
为实现上述目的，本发明设计一种作用于TME免疫效应细胞的人工合成基因，包含识别肿瘤微环境中PD-L1的PD-1功能区，激活共刺激信号通路dap10/CD3、CD27、MyD88、OX40或GITR的胞内激活功能区，两个功能区通过跨细胞膜氨基酸片段连接。
所述PD-1功能区基因序列是SEQ ID NO：1所示序列中的26-147氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述的跨细胞膜氨基酸片段的基因序列是SEQ ID NO：1所示序列中的171-191氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述CD3胞内功能区序列是指SEQ ID NO：3所示序列中52-163氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述CD27胞内功能区序列是SEQ ID NO：2所示序列中的213-260氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述dap10胞内功能区序列是指SEQ ID NO：4所示序列中70-93氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述MyD88胞内功能区是SEQ ID NO：5所示序列中的54-155氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述OX40胞内功能区序列是SEQ ID NO：6所示序列中的236-277氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述GITR胞内功能区序列是SEQ ID NO：7所示序列中的184-241氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述的人工合成基因的基因构造序列如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示，或为与上述位点大于90％相同的序列突变体。
表达所述人工合成基因的细胞能够将抑制信号转化为激活信号，避免免疫抑制因素。
本发明还包括一种验证上述述人工合成基因的方法，包括以下步骤：
步骤1)构造所述人工合成基因的基因模板，并在pCDNA3.1(-)载体中扩增；
步骤2)将扩增得到的融合蛋白构造基因碱基转入慢病毒表达载体，并与pMD2.G与psPAX2包装质粒同时转染293细胞获取包装的慢病毒颗粒；
步骤3)将所述的慢病毒颗粒感染CD8T细胞中，通过流式细胞仪测定PD1的表达代表转染成功，
步骤4)将感染的CD8T细胞，加入PD-L1蛋白后培养，通过流式细胞仪测定PD-L1对转染细胞的抑制或激活作用。
上述人工基因构造及其衍生物可用于制备肿瘤药物。
优选地，所述应用人为工基因构造与免疫细胞治疗的联合应用，以用于制备克服肿瘤微环境中抑制因素的药物。
优选地，所述肿瘤包括实体肿瘤与血液肿瘤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述的人工基因构造能够转染效应细胞，克服肿瘤微环境中PD-L1的抑制，逆转PD1/PD-L1抑制信号为共刺激信号，激活与扩增肿瘤微环境中的免疫效应细胞；且其临床应用可以增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。
[附图说明]
图1为本发明实施例中人工基因构造转染CD8T细胞前后PD-1表达流式分析图。人工基因结构转染的细胞表达不同程度的PD-1阳性。
图2为本发明实施例中为检查点配体PD-L1对人工基因构造转染CD8T后激活与扩增试验的流式分析图。PD-L1对人工基因转染的细胞有定向扩增作用。
[具体实施方式]
本发明提供了一种人工基因结构，包含与肿瘤微环境中抑制检查点配体PD-L1结合的PD-1胞外识别功能区和与免疫细胞共激活受体的胞内激活功能区，通过慢病毒感染的方式将人工基因转入靶细胞，使靶细胞能够将抑制信号转化为激活信号。本发明还提供了上述人工基因构造在治疗癌症中的应用。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例子仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本实施例提供一种作用于TME免疫效应细胞的融合基因设计，包含识别肿瘤微环境中PD-L1的功能区(PD-1)，激活共刺激信号通路dap10/CD3、CD27、MyD88、OX40或GITR的胞内激活功能区，两个功能区通过跨细胞膜氨基酸片段连接，从而使PD1抑制信号通路转换为免疫激活信号通路。转染人工基因结构的效应细胞高表达PD-1，能与在肿瘤微环境中过度表达的PD-L1结合，通过免疫激活下游信号的作用，促进免疫细胞的激活与扩增，避免效应细胞被微环境中PD-L1的抑制，增加对肿瘤组织的杀伤和清除，发挥效应细胞的杀伤靶细胞功能。
优选地，所述人工基因构造中细胞检查点表面受体是PD-1(GenBank:L27440.1)，所述PD-1完整的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示序列，所述人工基因构造包含以上序列部分为1-191位点氨基酸片段。
优选地，所述人工基因构造中刺激信号受体的一种为CD27(GenBank:NM_001242.4)，所述CD27完整的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示序列，所述人工基因构造包含以上序列部分为213-260位点氨基酸片段。
优选地，所述人工基因构造中共刺激信号受体的一种为CD3(GenBank:AK313946.1)，所述CD3完整的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示序列，所述人工基因构造包含以上序列部分为52-163位点氨基酸片段。
优选地，所述人工基因构造中共刺激信号受体的一种为dap10(GenBank:AF072845.1)，所述dap10完整的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示序列，所述人工基因构造包含以上序列部分为70-93位点氨基酸片段。
优选地，所述人工基因构造中共刺激信号受体的一种为MyD88(GenBank:KR709328.1)，所述MyD88完整的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示序列，所述人工基因构造包含以上序列部分为54-155位点氨基酸片段。
优选地，所述人工基因构造中共刺激信号受体的一种为OX40(GenBank:NM_003327.3)，所述OX40完整的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示序列，所述人工基因构造包含以上序列部分为236-277位点氨基酸片段。
优选地，所述人工基因构造中共刺激信号受体的一种为GITR(GenBank:NM_004195.2)，所述GITR完整的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示序列，所述人工基因构造包含以上序列部分为184-241位点氨基酸片段。
优选地，所述人工基因构造的氨基酸序列SEQ ID NO：8所示序列，完整的表达基因N端包含序列SEQ ID NO：1中1-191位点氨基酸片段，C端包含SEQ ID NO：2中213-260位点氨基酸片段。
优选地，所述人工基因构造的氨基酸序列SEQ ID NO：9所示序列，完整的表达基因N端包含序列SEQ ID NO：1中1-191氨基酸片段，C端包含SEQ ID NO：4中70-93位点氨基酸片段和SEQ ID NO：3中52-163位点氨基酸片段。
优选地，所述人工基因构造的氨基酸序列SEQ ID NO：10所示序列，完整的基因表达N端包含序列SEQ ID NO：1中1-191位点氨基酸片段，C端包含SEQ ID NO：5中54-155位点氨基酸片段。
优选地，所述人工基因构造的氨基酸序列SEQ ID NO：11所示序列，完整的基因表达N端包含序列SEQ ID NO：1中1-191位点氨基酸片段，C端包含SEQ ID NO：6中236-277位点氨基酸片段。
优选地，所述人工基因构造的氨基酸序列SEQ ID NO：12所示序列，完整的基因表达N端包含序列SEQ ID NO：1中1-191位点氨基酸片段，C端包含SEQ ID NO：5中184-241位点氨基酸片段。
人工基因构造的构建：
通过基因合成的方法合成人工基因构造碱基，然后转入扩增表达载体pcDNA3.1(-)。通过基因酶切和进一步克隆，将人工基因构造转入慢病毒表达载体PHAGE-CMV-MCS-IZS。最后将以上载体与慢病毒包装载体共同转染到293细胞进行病毒包装成含有人工基因的慢病毒颗粒，纯化的慢病毒颗粒用于转染CD8T细胞。转染后的细胞用于针对PD-1的流式抗体染色，洗涤后经流式细胞仪分析。结果如图1所示。图中流式细胞仪分析结果表明，没有转染之前的T细胞基本不表达PD-1，而慢病毒转染后，转染基因构造的CD8T细胞表达不同程度的PD-1。
PD-L1对表达人工基因构造细胞的影响：
人工基因构造转染后的细胞分成两组，每孔5x105细胞于1ml X-vivo培养基置于24孔板中，实验组加入PD-L1蛋白至终浓度为1μg/ml。混匀后置于37℃、5％CO2的孵箱中培养48小时。细胞收集后用PBS洗涤一次，然后用针对PD-1的流式抗体染色20分钟，洗涤后用流式细胞仪进行测定和数据分析。图2中显示，与未加PD-L1蛋白组相比，PD-L1蛋白处理能够明显增加转染细胞PD-1阳性细胞的比例，证明PD-L1与PD-1的结合不但没有抑制PD-1阳性的细胞扩增，反而可以促进PD-1阳性细胞比例的增加。可以推论，肿瘤微环境中的PD-L1会对人工基因转染的效应细胞有激活作用，从而可以克服TME中的抑制因素，具有癌症临床治疗推广的应用价值。
本实施例为人工基因构造的制备和功能验证。上述人工基因构造可与免疫细胞治疗组成联合应用，转化TME中的PD-L1抑制因素为激活因素，避免效应细胞的功能缺失和衰竭。
由上述实施例可知，本发明所述的人工基因构造转染的效应细胞，既能识别抗原阳性的肿瘤细胞，又能被肿瘤微环境中免疫抑制信号PD-L1激活，增加免疫细胞杀伤抗原阳性细胞的功能。由于肿瘤的发生与扩散是由于肿瘤中免疫细胞表达PD-1而被TME中PD-L1失活的结果，而人工基因构造既可以阻断肿瘤的免疫抑制通路，又可以促使免疫细胞激活与扩增。因此，上述发明的临床应用可以增强免疫细胞功能，避免受PD-L1抑制后的衰竭，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，根据本方明的技术原理，在不脱离本发明的精神和范围下所作的变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 江苏西迪尔生物技术有限公司
<120> 作用于TME免疫效应细胞的人工合成基因及验证方法和应用
<150> 2017109532962
<151> 2017-10-13
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 288
<212> PRT
<213> PD-1
<400> 1
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Ser Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 2
<211> 220
<212> PRT
<213> CD27
<400> 2
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180 185 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
<210> 3
<211> 260
<212> PRT
<213> CD3
<400> 3
Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val
1 5 10 15
Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr
20 25 30
Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe
35 40 45
Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro
50 55 60
Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His
65 70 75 80
Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys
85 90 95
Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys
100 105 110
Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu
115 120 125
Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His
130 135 140
Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met
145 150 155 160
Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr
165 170 175
His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile
180 185 190
Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala
195 200 205
Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser
210 215 220
Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu
225 230 235 240
Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro
245 250 255
Ala Cys Ser Pro
260
<210> 4
<211> 93
<212> PRT
<213> dap10
<400> 4
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
35 40 45
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
50 55 60
Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
85 90
<210> 5
<211> 296
<212> PRT
<213> MyD88
<400> 5
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro
115 120 125
Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu
130 135 140
Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg
145 150 155 160
Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile Gln Phe Val Gln
165 170 175
Glu Met Ile Arg Gln Leu Glu Gln Thr Asn Tyr Arg Leu Lys Leu Cys
180 185 190
Val Ser Asp Cys Asp Val Leu Pro Gly Thr Cys Val Trp Ser Ile Ala
195 200 205
Ser Glu Leu Ile Glu Lys Arg Cys Arg Arg Met Val Val Val Val Ser
210 215 220
Asp Asp Tyr Leu Gln Ser Lys Glu Cys Asp Phe Gln Thr Lys Phe Ala
225 230 235 240
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala His Gln Lys Arg Leu Ile Pro Ile Lys
245 250 255
Tyr Lys Ala Met Lys Lys Glu Phe Pro Ser Ile Leu Arg Phe Ile Thr
260 265 270
Val Cys Asp Tyr Thr Asn Pro Cys Thr Lys Ser Trp Phe Trp Thr Arg
275 280 285
Leu Ala Lys Ala Leu Ser Leu Pro
290 295
<210> 6
<211> 277
<212> PRT
<213> OX40
<400> 6
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 7
<211> 241
<212> PRT
<213> GITR
<400> 7
Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys
100 105 110
Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro
130 135 140
Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala
145 150 155 160
Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys
165 170 175
Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu
180 185 190
Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val
195 200 205
Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu
210 215 220
Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp
225 230 235 240
Val
<210> 8
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Gln
180 185 190
Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala
195 200 205
Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile
210 215 220
Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
225 230 235
<210> 9
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ile Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Leu
180 185 190
Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr
195 200 205
Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
210 215 220
Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
225 230 235 240
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
245 250 255
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
260 265 270
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
275 280 285
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
290 295 300
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
305 310 315 320
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
325
<210> 10
<211> 293
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Met
180 185 190
Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr Gln Ala Asp Pro
195 200 205
Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro Gly Ala Ser Val
210 215 220
Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg Asp Asp Val Leu
225 230 235 240
Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln Lys Tyr Ile Leu
245 250 255
Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln Val Ala Ala Val
260 265 270
Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly Ile Thr Thr Leu
275 280 285
Asp Asp Pro Leu Gly
290
<210> 11
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Ala
180 185 190
Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys
195 200 205
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala
210 215 220
Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
225 230
<210> 12
<211> 249
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Gln
180 185 190
Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg
195 200 205
Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg
210 215 220
Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu
225 230 235 240
Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val
245

Claims (8)

1.一种作用于TME免疫效应细胞的人工合成基因，其特征在于包含识别肿瘤微环境中PD-L1的PD-1功能区，激活共刺激信号通路dap10/CD3、CD27、MyD88、OX40或GITR的胞内激活功能区，两个功能区通过跨细胞膜氨基酸片段连接。
2.根据权利要求1所述的人工合成基因，其特征在于所述PD-1功能区基因序列是SEQID NO：1所示序列中的26-147氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
3.根据权利要求1所述的人工合成基因，其特征在于所述的跨细胞膜氨基酸片段的基因序列是SEQ ID NO：1所示序列中的171-191氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
4.根据权利要求1所述的人工合成基因，其特征在于：
所述CD3胞内功能区序列是指SEQ ID NO：3所示序列中52-163氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述CD27胞内功能区序列是SEQ ID NO：2所示序列中的213-260氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述dap10胞内功能区序列是指SEQ ID NO：4所示序列中70-93氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述MyD88胞内功能区是SEQ ID NO：5所示序列中的54-155氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述OX40胞内功能区序列是SEQ ID NO：6所示序列中的236-277氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述GITR胞内功能区序列是SEQ ID NO：7所示序列中的184-241氨基酸位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
5.根据权利要求1所述的人工合成基因，其特征在于基因构造序列如SEQ ID NO：
8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示，或与上述位点大于90％相同的序列突变体。
6.根据权利要求1～5任一所述的人工合成基因，其特征在于表达所述人工合成基因的细胞能够将抑制信号转化为激活信号，避免免疫抑制因素。
7.一种验证权利要求1～6任一所述人工合成基因的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1)构造所述人工合成基因的基因模板，并在pCDNA3.1(-)载体中扩增；
步骤2)将扩增得到的融合蛋白构造基因碱基转入慢病毒表达载体，并与pMD2.G与psPAX2包装质粒同时转染293细胞获取包装的慢病毒颗粒；
步骤3)将所述的慢病毒颗粒感染CD8T细胞中，通过流式细胞仪测定PD1的表达代表转染成功，
步骤4)将感染的CD8T细胞，加入PD-L1蛋白后培养，通过流式细胞仪测定PD-L1对转染细胞的抑制或激活作用。
8.一种如权利要求1～6中任一所述的人工基因构造及其衍生物在制备肿瘤药物中的应用。
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