CN103739667B - 卵巢癌特异的肿瘤抗原肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及卵巢癌特异的肿瘤抗原肽及其制备方法，将细胞HTB161A2在RPMI补充性培养基中贴壁培养收集上清液；收集0.5ml磁珠子并用包被缓冲液洗；将磁珠子重悬、过滤、洗脱，洗脱下的物质收集在离心管中，收集滤出液，所述的滤出液即为抗原肽的溶液，本发明所用的方法是一种称为直接的生化方法，即用免疫亲和方法从肿瘤细胞或组织中纯化MHC/多肽复合分子，并从中洗脱出MHC结合的抗原肽，这些抗原肽可被潜在地用于抗体治疗，或产生卵巢癌特异的CTLs，或制备肿瘤疫苗；也可发展出用于诊断的试剂盒。

Description

卵巢癌特异的肿瘤抗原肽及其制备方法

[技术领域]

本发明涉及肿瘤抗原肽及其制备方法，具体涉及一种卵巢癌特异的肿瘤抗原肽及其制备方法。

[背景技术]

在美国，卵巢癌是最常见的导致死亡的妇科癌症。早期发病只有极小的，非特异性的甚至无任何症状。因此，大多数病人只能在晚期得到诊断。标准的治疗手段包括侵入性的手术治疗并跟随化疗。卵巢癌已有许多组织学的描述，然而，超过90％的恶性肿瘤是上皮肿瘤。每年约22,430个新的卵巢癌病例被确诊。估计表明，在70名妇女中就有1名将会在她的一生中患卵巢癌。卵巢癌占所有癌症新发病例的3.3％。研究人员正在研究金属蛋白酶抑制剂，抗血管生成剂和其他生物导向疗法等治疗卵巢癌的新方法。这些新类型的化合物通过切断肿瘤的血液供应，以及通过干扰需要癌症的生长和扩散的蛋白质和酶。免疫系统可以在卵巢癌中发挥作用。从一半以上的卵巢癌患者中观察到，T细胞是存在于肿瘤周围（Raspollini2005，2003）。晚期卵巢癌患者的肿瘤被T细胞浸润，相比于没有这些肿瘤浸润的T细胞的患者，肿瘤被T细胞浸润的晚期患者有一个更好的临床成果(Dong2006;Raspollini2005;Zhang2003)。具体地说，更多的细胞毒性T细胞，它能够直接识别和杀死肿瘤细胞，并增加肿瘤的上皮细胞中毒性T细胞和辅助T细胞之间的比率，这些都是与提高患者的存活率相关的(Sato2005)。

免疫疗法是卵巢癌的新的治疗策略之一。它的目的是诱导或提高激活肿瘤免疫应答的能力，与标准疗法的抗肿瘤效果合为一体，延缓并可能防止疾病的发展。具体来说，抗原特异性的主动免疫治疗目的是通过给病人设置特异的抗原特异性疫苗，来激活针对特定靶抗原的获得性免疫系统。抗原是一种大分子，通常是蛋白质或多糖，它可以刺激免疫应答。为了获得一个肿瘤特异性免疫应答，免疫治疗利用正常细胞和肿瘤细胞之间抗原表达的差异。卵巢癌中存在许多肿瘤细胞特异性抗原，例如精子蛋白17，MAGE-1，P53，Her-2/neu。关于免疫疗法的安全性的一个主要挑战在于在预防自身免疫，即诱导免疫细胞优先识别和杀死肿瘤细胞，但避免破坏正常的身体细胞。从理论的角度来看，其它可能的副作用包括疫苗成分的过敏反应以及注射部位的炎症反应。现在一些免疫治疗战略已被用在不同的肿瘤抗原。然而，这些研究通常尚未演变成过去的I/II期临床研究。

细胞免疫治疗肿瘤治疗提供了广阔的前景，可以防止或延缓复发转移性疾病。基于诱导肿瘤特异的辅助性T细胞及细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答的免疫治疗可能具有潜在的疗效，但卵巢癌的成功细胞免疫疗法仍有许多障碍。然而，更好地理解肿瘤相关的免疫调节机制为免疫学提供了很好的前景。卵巢癌中肿瘤浸润性T细胞的存在存活率的提高是相关的，这表明T-细胞的免疫治疗可能会受益于临床。

由于肿瘤患者的体内环境能使耐受机制在体内被激活，获得性T细胞治疗的一个优点是，它涉及T细胞在宿主环境中的迁移，这样有助于该类患者群的耐受机制无法响应。CD8+T细胞是过继性T细胞治疗的不错选择，因为它们可以在体外被刺激产生抗原特异性的CTL。采用早期获得性免疫疗法接近于使用活化的淋巴细胞可以作为治疗各种癌症的手段(Rubin et al.,Biological Approaches to Cancer Treatment.Biomodulation(Mitchell,ed.),McGraw-Hill(New York),pp.379-410(1993))。在这些早期的研究中，淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）被使用，以及晚期的肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL），都能在体外被IL-2激活。表现出疗效是模棱两可的，然而，这些早期的对照临床试验中未能显示出一个优点，即体外活化细胞能够越过IL-2对黑色素瘤患者的直接作用。Fred Hutchinson癌症研究中心的Yee(Yee et al.,PNAS,Vol.99,pp.16168-16173,2002)以及NCI的Dudley等的研究((Dudley et al.,Science,Vol.298,pp.850-854,2002)证明了获得性T细胞治疗方法的潜力。这些研究涉及使用MART-1、gp100和低剂量IL-2的特定的T细胞克隆或用异源供给细胞和高剂量IL-2体外扩增的TILs。这些研究证实，获得性免疫疗法有治疗癌症的希望，虽然由于缺乏能够体外产生达到治疗数目的抗原特异性CD8+CTLs的可重复方法，这种方法的全面发展受到阻碍。(Oelke et al.,Nat.Med.,Vol.9:619-624(2003)).

人工抗原呈递细胞（aAPCS）的使用是有前途的新方法，它可重复生成到达治疗数目的抗原特异的CD8+细胞。虽然也可以使用自然产生的，能体外激活的原始T细胞的APCs（例如，树突状细胞，巨噬细胞，B细胞，或自体肿瘤细胞），但由于天然APCs的MHC分子包含许多其他的多肽抗原表位，其激活的效率是低的。导致的结果是，可能有非常小、有选择的抗原决定表位被递呈。另外，大多数这些被递呈的肽是正常的，无害的内源性蛋白。解决这个问题的一种更直接的方法是，特异地激活与战胜疾病有关抗原决定表位的CD8+T细胞。这种方法通过人工抗原提呈细胞（aAPCs）是可行的。

一个这样aAPC已经利用黑腹果蝇（果蝇）胚胎细胞系被开发出来，表达主要组织相容性复合体（MHC）I类分子。由于果蝇缺乏先进的免疫系统，即缺乏人TAP-1和TAP-2肽转运子同源的染色体，该染色体涉及到装载多肽的抗原决定簇到人类的MHC分子上。因此，转染I类分子和II类分子是作为空的管道出现在果蝇细胞表面。通过孵育转染MHC类I或II类MHC编码表达载体的果蝇细胞与结合到特定的MHC分子的外源表达的多肽（即，肿瘤抗原的T细胞多肽表位），所有的可用的MHC分子可能已被MHC限制性的、特定的多肽抗原决定表位所占用。特别是，高密度表达的MHC I类分子呈现单个或多个抗原表位，再加上关键的共刺激分子B7-1（CD80），CD70，LFA-3（CD58），ICAM-1（CD54）到这些果蝇aAPCs上，更够在体外产生针对于特异多肽的，强有力的，自体同源的细胞毒性CD8+T细胞(Cai et al.,Immunol.Rev.,Vol.165,pp,249-265(1998)

细胞疗法的各种改进已经开发出来。例如，三个对晚期恶性黑色素瘤患者的临床研究已进行，从患者自体分离的CD8+T细胞，经体外的刺激和扩增后，作为抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）然后再回输给患者。

一个这样的细胞疗法，包括自体免疫产物的制备与体外激活的自体CD8+的CTLs，对黑色素瘤相关抗原中6个选定的HLA-A2.1限制的多肽的表现出特异性。细胞治疗产品的活性成分是患者自身的CD8+细胞，并已通过暴露于抗原肽负载的aAPCs上被激活，至少对6个HLA-A2.1限制性肽中的1个有特异性。这些CTL来自于自体天然的T细胞，是从临床的淋巴细胞提取的样本中分离得到，用果蝇细胞作为aAPCs，在体外用黑色素瘤抗原肽表位诱导产生。在白介素-2（IL-2）和白介素7（IL-7）的存在下，用负载黑色素瘤抗原表位的自体单核细胞再刺激使之扩增，接着再用OKT3进行非特异的扩增，收获，洗涤，重新悬浮在最终输液中，再输注到原患者体内。再次输注的最终产物有：300mL的乳酸林格氏注射液中有1-10×10⁹CTL细胞（76％v/v），5％葡萄糖在生理盐水中（D5NS）（4％v/v），和人的血清白蛋白（HSA）（20％v/v）。

利用特定抗原体外激活自体CD8+CTLs是用于治疗或预防癌症的新免疫疗法，这为目前治疗不治之症的癌症提供了一个有前途且令人兴奋的发展与战略。

[发明内容]

为了解决现有技术中的上述不足和缺陷，本发明提供一种卵巢癌特异的肿瘤抗原肽的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

i.将细胞HTB161A2在RPMI补充性培养基中贴壁培养，培养基中加入10%胎牛血清，将细胞的浓度调节在0.5×10⁶个/ml；

ii.倒去培养液，用预冷的1xPBS缓冲液洗细胞3次，用3ml细胞裂解缓冲液将裂解液冲洗和收集细胞，且在4℃下旋转反应1小时。悬液以高速15Krpm，20分钟下离心，收集上清液保存在-80℃备用；

iii.收集0.5ml磁珠子并用包被缓冲液洗4次；

iv.将磁珠子与0.42ml，4.8mg/ml的BB7.2抗体孵育,加2.08ml，3M的(NH4)₂SO₄，在3.26ml包被缓冲液中室温孵育72小时；

v.用磁力集中器移走上清液，磁珠子里加入相同体积的含0.5%BSA与0.05%Tween20的PBS并在室温中再孵育48小时；

vi.用0.1%BSA和0.05%Tween20的PBS清洗磁珠子，将磁珠子重悬在2ml含有0.02%叠氮化钠的PBS中备用；

vii.1×10⁹个在裂解液中的卵巢癌细胞，以100,000×g，离心1小时，丢弃沉淀，将上清用0.22-μm过滤器过滤后与BB7.2抗体连接的磁珠子在4℃旋转孵育24小时，装柱后用50ml洗液洗4遍；

viii.将洗后的珠子用2ml10%的HAC洗脱BB7.2抗体连接的磁珠子；

ix.洗脱下的物质收集在离心管中，加10%HAC后煮沸5分钟；

x.把洗脱下的物质转移到预湿的孔径为5kDa的Ultrafree-CL膜上，3500×g在4℃离心5小时，收集滤出液，所述的滤出液即为抗原肽的溶液。

所述的细胞裂解缓冲液为pH8.0的50mM Tris，150mM NaCl，1%CHAPS，5uM EDTA，0.2%叠氮化钠，17.4μg/ml PMSF，蛋白酶抑制剂。

所述的BB7.2通过杂交瘤细胞株的培养上清纯化而来。

本发明所用的方法是一种称为直接的生化方法，即用免疫亲和方法从肿瘤细胞或组织中纯化MHC/多肽复合分子，并从中洗脱出MHC结合的抗原肽，这些抗原肽可被潜在地用于抗体治疗，或产生卵巢癌特异的CTLs，或制备肿瘤疫苗；也可发展出用于诊断的试剂盒。

[附图说明]

图1为亲和层析纯化MHC/多肽复合物的洗脱峰示意图；

图2为Bioanalyzer分析滞留物的层析和电泳图；

图3为液相色谱串联质谱图；

图4为MS/MS测定多肽的氨基酸序列示意图；

图5为合成的多肽结合细胞表面MHC I的能力示意图；

图6为测定CTL毒性示意图。

[具体实施方式]

为了使本发明更加清楚，结合附图和实施例对本发明做进一步说明，应当理解，本实施例并不用于限定本发明的保护范围。

实施例1：卵巢癌特异的肿瘤抗原肽的制备

1.细胞培养

用于抗原肽鉴定的细胞株是HTB161A2。细胞在RPMI补充性培养基(Invitrogen)中贴壁培养，培养基中加入10%胎牛血清(FCS)(Invitrogen)。第一天，将细胞的浓度调节在0.5×10⁶个/ml，一般说来，当细胞浓度到达2×10⁶个/ml时（3～4天）细胞会分裂。

2.细胞收集

从T75培养瓶中倒去培养液，用预冷的1×PBS缓冲液洗细胞3次，用3ml细胞裂解缓冲液将裂解液[50mMTris(pH8.0)，150mMNaCl，1%CHAPS(Aldrich,Cat.No.226947)，5uMEDTA，0.2%叠氮化钠，17.4μg/ml PMSF(Calbiochem-Novabiochem)，蛋白酶抑制剂(Roche,Cat.No.1697498)]，冲洗和收集细胞，且在4℃下旋转反应1小时，悬液以高速15Krpm，20分钟下离心，收集上清液保存在-80℃备用。

3.将HLA-A2抗体链接在磁珠上

抗HLA-A2抗体（BB7.2）通过杂交瘤细胞株[ Number:HB-82^TM(Parham andBrodsky,Hum Immunol.3(4):277-99(1981))]的培养上清纯化而来。BB7.2抗体是鼠单克隆抗HLA-A2的抗体并且是IgG_2b表型。抗体是识别人HLA-A2组织相容性抗原中C端的α-2螺旋上的抗原决定簇并且打开其中一个潜在的β折叠。BB7.2会识别所有的HLA-A2亚型，HLA-A2.1代表了90%的A2亚型,剩余的10%主要包括A2.2,A2.3,A2.5和A2.7。在连接BB7.2（HLA-A2抗体）之前,收集0.5ml MyOne^TMTosylactivated磁珠子( Biotech,Cat.No.655.01)并用包被缓冲液(0.1M硼酸钠缓冲液，pH9.5)洗4次。接着将珠子与0.42ml，4.8mg/ml的BB7.2抗体孵育,加2.08ml，3M的(NH₄)₂SO₄，在3.26ml包被缓冲液中室温孵育72小时。用 MPC^TM-1磁力集中器(Dynal Biotech ASA,OSLO,Norway)移走上清，珠子里加入相同体积的含0.5%BSA与0.05%Tween20的PBS并在室温中再孵育48小时。用0.1%BSA和0.05%Tween20的PBS清洗珠子，将珠子重悬在2ml含有0.02%叠氮化钠的PBS中备用。

4.分离HLA-A2连接的抗原肽

1×10⁹个在裂解液中的卵巢癌细胞，以100,000×g，离心1小时。丢弃沉淀，将上清用0.22-μm过滤器过滤后与BB7.2抗体连接的(1mg BB7.2抗体/25mg)在4℃旋转孵育24小时，装柱后用50ml以下4种不同的洗液洗4遍。

洗液1:50mMTris(pH8.0),150mMNaCl,0.05%CHAPS,5uM EDTA,0.2%叠氮化钠,17.4μg/ml PMSF

洗液2:50mM Tris(pH8.0),150mM NaCl

洗液3:50mM Tris(pH8.0),450mM NaCl

洗液4:50mM Tris(pH8.0)

将洗后的珠子用2ml，10%HAC洗脱，将MHC/多肽复合分子从BB7.2抗体连接的上洗脱下来（图1）。洗脱下的物质收集在离心管中，为了进一步从I类MHC分离HLA-A2重链结合的多肽，将样品加10%HAC后煮沸5分钟。

为了将多肽与共纯化下来的重链及β2微球蛋白分离开来，将样品用孔径为5kDa的Ultrafree-CL膜(Amicon,Cat.No.UFC4LCC25,Millipore Corporation,Bedford,Mass.)离心。使用前，将Ultrafree-CL膜用1ml10%的醋酸预湿，离心1小时后，丢弃所有的液体。把从珠子上洗脱下的物质转移到预湿的Ultrafree-CL膜上，3500×g在4℃离心5小时。收集过滤物和滞留物，滞留物是无抗原肽的成分，包括I类MHC的HLA-A2分子，滞留物用做SDS-PAGE分析。该成分分别是44kDa的I类MHC重链以及12kDa的β2微球蛋白（图2）。滤出液也就是抗原肽溶液。

实施例2：抗原肽的检测

如图2所示，上述滞留物1μl加入蛋白质份分析的板中，用Bioanalyzer分析，根据对照比较，左图给出层析图，右图给出电泳图，均显示分子量为44kD的MHC I的存在。

5.液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS)

从HLA-A2连接的多肽中分离并过滤出的多肽溶液，用1%三氟乙酸(TFA)酸化。每个样品中注入10μl EksigentnanoLC(Eksigent Technologies,Inc.)脱盐及捕获过程如下：捕获柱=LC填充的C18Pepmap100,5u,100A,300um id×5mm;捕获移动相=水,2%甲醇,0.05%TFA;捕获流量率=5μl/min;分析柱=Vydac;Everest C18,5u,300A,75um id×150mm;分析移动相：A=水,2%甲醇,0.1%乙酸;B=10%水,90%乙腈,0.1%蚁酸;流率=0.2μl/min.;分析斜率=0-80min;10-30%B,80-120min30-60%。分离的每个多肽作为一个LC-MS峰，由串联在一起的质谱分析，基于每一个峰的强度和离子电荷，MS/MS测定多肽的氨基酸顺序（图3）。

5.抗原肽的序列测定

由于不完整的肽碎片，用LC/MS/MS重头测序法得到的多肽序列通常是不明确的，当一个肽段与氩气碰撞后，不是每一个可能的片段都会产生。事实上，有些多肽键可能是一直保持连接状态。而且，由于各种原因（如共洗脱，离子抑制，或者是片段不带有正电荷），不是所有的多肽片段能被质谱所检测。因此，某些特定肽的LC/MS/MS光谱可能不够完全。在本发明中，含糊不清的多肽序列用ProteinLynx2.0测序工具筛选，接着，将LC/MS/MS中至少5个重复的分析中的3个有类似大小峰值的肽序列，与人类蛋白序列数据库进行比对（Deduced peptide sequence）。图4是举例样品经质谱后其中的一个质谱图。

用这种方法，测定了35个肽序列，每个多肽有9～12个氨基酸序列，用生物信息方法分析其中7个多肽可以在数据库中找到相应的蛋白（表一）。

表一：质谱和生物信息分析可能的抗原肽

合成这7个多肽，并用HLA-A2稳定性分析来验证，以及用标准的⁵¹Cr释放分析这些多肽负载抗原提呈细胞后产生并激活CTL的能力。

6.HLA-A2稳定性分析

对于肽结合在主要组织相容性复合体(MHC/HLA-A2)分子的研究分析基于肽对果蝇APCs(668)细胞上I类MHC的稳定能力。在96孔V型板上1：10稀释多肽，使最终肽浓度分别为200uM,20uM,2uM,200nM,20nM,2nM,同时设置无肽孔为阴性对照。将果蝇APCs(668)细胞置于V底96孔板中，每孔加入100μl培养基，细胞密度达到1×10⁶个/ml，于26℃，5%CO₂条件下培养，18h后移至37℃，5%CO2继续培养2h。随后将细胞用FACS缓冲液(PBS,2.5%FCS,1%NaN₃)洗涤一次，接着每孔加入1μl FITC标记的鼠抗人HLA-A2抗体(BD Pharmingen,Cat.No.551285)和1μl PI染色，4℃培养30min，染色后将细胞重新悬浮于200μl FACS缓冲液并将细胞转移至96个微型管中。样本用FACScan流式细胞仪测定，CellQuest软件分析。

选定7个肽并合成，分析7种肽在果蝇APCs(668)细胞中整合稳定HLA-A2分子的能力，即平均荧光强度MFI/肽浓度。图5显示经流式细胞仪分析总结的肽链的结合MHC I的1能力；肽链的亲和力在表2中分别表示为强S，中等M，弱W，无N四种。

表二：多肽稳定细胞表面MHC的能力总结

a.GenBank or Swiss Prot databases

7.细胞毒性T淋巴细胞CTL的产生

果蝇aAPC起源于Schneider S2细胞（S2细胞），根据出版程序(Schneider,J.Embryol.Exp.Morph.1972Vol27,pp.353-365)，最初在1969年从数百野生黑腹果蝇(Oregon-R)胚胎(美国标准菌种库(ATCC)CRL-1963)中建立起来，并储存在ATCC(CRL10974)中。S2细胞在商业的Schneider's果蝇介质（另补充10%热灭活胎牛血清）中生长。为了生成aAPCs，人编码HLA-A2.1,B7.1和ICAM-1基因的cDNA分别插入到pRmHa-3载体中，并将HLA-A2.1,B7.1和ICAM-1质粒DNAs以及phshneo质粒(参照U.S.Pat.No.6,225,042和pRMHa质粒载体中有关说明)的混合物用磷酸钙沉淀法转染S2细胞。人类cDNAs由标准反转录技术得到，引物序列来源于已发表的序列，即K562细胞的HLA-A2.1，B7.1和ICAM-1。K562细胞是人类白血病细胞系；稳定的转染细胞能够被培养在Schneider培养基中的遗传霉素筛选出来。在细胞扩增之前，添加CuSO₄可以诱导转染基因的表达。表达量的评估借助于抗HLA-A2.1、抗B7.1和抗ICAM-1抗体，由流式细胞仪测定。

为了在体外高效地激活CD8+淋巴细胞，高于30%的果蝇细胞必须能够表达HLA-A2.1分子。果蝇细胞通常分子表达量为70-90%。果蝇aAPC洗涤后在室温培养4h，培养中添加10μM不同的混合肽或单个肽液（参照例如美国专利Nos.6,225,042,6,355,479,6,362,001和6,790,662；美国专利Nos.2009/0017000and2009/0004142；国际期刊No.WO2007/103009）。从HLA-A2阳性捐献者中得到的人类CD8⁺T细胞后，和负载肽链的果蝇APC于37℃,5%CO₂培养5天，在第五天加入人类IL-2(20U/ml,R&D体系)和IL-7(30U/ml,R&D体系)，并于第7天和第15天，用从同一个捐赠者的PBMC中的非CD8粘附细胞，在多肽存在的条件下，重复刺激CD8+T细胞两次。

从不同捐赠者及不同混合肽（包括单一肽）的混合肽组合中得到的CD8⁺T细胞，可产生大量不同的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。例如，将7种筛选到的肽配成单一肽液（P1-P7），产生负载肽的果蝇APC。合成的负载肽果蝇APC和来自4个捐赠者的CD8⁺T细胞可以生成7批不同的CTL(Donor P1，P2，P3，P4，P5，P6和P7)。

8.铬（⁵¹Cr）释放试验与CTL活性分析

CTL（效应物）活性用标准的铬（⁵¹Cr）释放试验来衡量，负载单一肽的T2细胞（靶目标）作为靶细胞(Brunner et al.,Immunology.1968February;14(2):181-96)。利用1:5的CTL（效应物）系列稀释倍数产生的剂量应答，得到最高效应物（E）和靶目标（T）比率为50:1。在试验之前，靶细胞（3×10⁶cells/100μl T2细胞放置在含有4%FCS的1×PBS中）用100μl⁵¹Cr（Perkin Elmer）标记并于37℃培养1h。结束后标记的靶细胞用含有2.5%马血清(Invitrogen)的1×Hank's平衡盐溶液(Invitrogen)洗4次，于4℃1200-1500rpm离心8min，重新悬浮在15ml新鲜MLR培养基（含10%FCS，1%谷氨酰胺，1%青霉素-链霉素，1%HEPES和1%MEM非必须氨基酸的RPMI-1640溶液）中。标记的T2细胞最终浓度定为0.2×10⁶个/ml。试验前，标记的T2细胞用10uM单一肽于室温下负载30min；100μl CTL（初浓度为5×10⁶个/ml）用MLR培养基在圆底96孔板中连读稀释1:5，每个效应细胞浓度设1个重复。在每个孔中含有不同稀释倍数的CTL100μl，加入50μl K562细胞(4×10⁶个/ml)( Number：CCL-243^TM)和50μl负载肽的⁵¹Cr标记的T2靶细胞（0.2×10⁶个/ml），于37℃，5%CO培养4h，900rpm离心5min，每孔取100μl上清液至⁵¹Cr计数管中计数。⁵¹Cr释放试验显示出7种肽（P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7）中4种可以至少在三种常见供体中诱导产生CTL（图6和表3）。

如图6所示，HLA-A2阳性捐献者的白细胞中分离得到CD8⁺T细胞后，和多肽负载的果蝇APC于37℃,5%CO₂培养5天，在第五天加入人类IL-2(20U/ml,R&D体系)和IL-7(30U/ml,R&D体系)，并于第7天和第15天，用第一天冻存的从同一个捐赠者的PBMC中的非CD8粘附细胞，在多肽存在的条件下，重复刺激CD8+T细胞两次，产生大量不同的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。我们用7种筛选到的多肽（P1-P7）分别负载到果蝇APC，分别与4个捐赠者的CD8⁺T细胞共培养，可以生成7批不同的CTLs(Donor P1，P2，P3，P4，P5，P6和P7)。第二十天，CTL（效应物）活性用标准的铬（⁵¹Cr）释放试验来衡量。在测试用的96孔板上，不加CTL的标记的T2细胞作为阴性对照，用2%Tween-20代替CTL加到有标记的T2细胞的孔作为阳性对照。细胞毒性通过测试反应结束后的上清液中⁵¹Cr值来表示，通常用%of lysis。横坐标表示7个不同的多肽产生的CTLs，纵坐标是指细胞毒性（%of lysis）。

%of lysis=（样品平均值–阴性对照平均值/阳性对照平均值-样品平均值）×100%

表3.4个捐献者产生CTL的能力及多肽亲和性总结

结论：我们从卵巢癌细胞中制备了新的卵巢癌特异的抗原肽：Topoisomerase,MAGE-B2,r-Catenin,H-RYK。

Claims (1)

1.一种卵巢癌特异的肿瘤抗原肽的制备方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：

i.将细胞HTB161A2在RPMI补充性培养基中贴壁培养，培养基中加入10％胎牛血清，将细胞的浓度调节在0.5×10⁶个/ml；

ii.倒去培养液，用预冷的1×PBS缓冲液洗细胞3次，用3ml细胞裂解缓冲液将裂解液冲洗和收集细胞，且在4℃下旋转反应1小时，所述的细胞裂解缓冲液为pH8.0的50mMTris，150mMNaCl，1％CHAPS，5uM EDTA，0.2％叠氮化钠，17.4μg/ml PMSF，蛋白酶抑制剂，悬液以高速15Krpm，20分钟下离心，收集上清液保存在-80℃备用；

iii.收集0.5ml磁珠子并用包被缓冲液洗4次；

iv.将磁珠子与0.42ml，4.8mg/ml的BB7.2抗体孵育,加2.08ml，3M的(NH₄)₂SO₄，在3.26ml包被缓冲液中室温孵育72小时，所述的BB7.2通过杂交瘤细胞株的培养上清纯化而来；

v.用磁力集中器移走上清液，磁珠子里加入相同体积的含0.5％BSA与0.05％Tween 20的PBS并在室温中再孵育48小时；

vi.用0.1％BSA和0.05％Tween 20的PBS清洗磁珠子，将磁珠子重悬在2ml含有0.02％叠氮化钠的PBS中备用；

vii.1×10⁹个在裂解液中的卵巢癌细胞，以100,000×g，离心1小时，丢弃沉淀，将上清用0.22-μm过滤器过滤后与BB7.2抗体连接的磁珠子在4℃旋转孵育24小时，装柱后用50ml洗液洗4遍；

viii.将洗后的珠子用2ml 10％的HAC洗脱BB7.2抗体连接的磁珠子；

ix.洗脱下的物质收集在离心管中，加10％HAC后煮沸5分钟；

x.把洗脱下的物质转移到预湿的孔径为5kDa的Ultrafree-CL膜上，3500×g在4℃离心5小时，收集滤出液，所述的滤出液即为抗原肽的溶液。