JP2020124214A - 自己癌抗原特異的ｃｄ８＋ｔ細胞の分離及び増殖方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離方法及び大量培養方法の提供。【解決手段】癌患者血液内に存在する自己癌抗原ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを選別する工程、該癌患者の血液から分離されたＰＢＭＣを該エピトープのペプチド及びＩＬ−２と共に培養する工程、該エピトープのペプチドにより４−１ＢＢ発現を誘導する工程、及び４−１ＢＢ発現が誘導された細胞を抗−４−１ＢＢ抗体がコートされた培養プレートで培養し付着しなかった細胞を除去する工程を含む、自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離方法、及び該自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と放射線照射された同種異系ＰＢＭＣとをＩＬ−２、抗−ＣＤ３抗体及び自己血漿が含まれた培地にて培養することを含む自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大量培養方法。【選択図】なし
Description
本発明は、自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離及び増殖方法に関し、詳しくは、癌患者個々人の血液内に存在する自己癌抗原からＣＤ８＋Ｔ細胞により認識されるエピトープを選別し、選別されたエピトープのペプチドを用いて、自己癌抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を分離する方法、及びこれを用いたＣＤ８＋Ｔ細胞の大量増殖方法に関するものである。
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、樹枝状細胞、ＣＤ４＋Ｔ、ＮＫ細胞のような他の細胞に比べて、比較的単純な機能を有しているため、抗癌免疫治療時期待しなかった副作用が現れる可能性が少ない。一般に、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチドマルチマーを用いて、抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を分離しているが、この方法の場合、細胞分離後、細胞自殺による死滅率が高く、十分な量の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生産するために、長期間培養をしなければならない短所があった。従って、ＴＣＲ（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を刺激するＭＨＣ ｍｕｌｔｉｍｅｒを代替して、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離することができるサロゲートマーカー（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｍａｒｋｅｒ）が必要とされており、これに対し、本発明者らは、長期間、免疫調節タンパク質である４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）と関連した研究を行ってきた。
４−１ＢＢは、誘導性共同刺激分子であり、活性化されたＴ細胞で発現されている。特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を増進させるだけでなく、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｆｌ−１等のような抗−アポトーシス分子（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の発現を増加し、活性後、細胞死（ＡＩＣＤ； ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）を抑制する機能を示すものとして知られている。このような４−１ＢＢ刺激の特性は、癌治療に適した特性などであり、これをベースに、抗−４−１ＢＢ ｍＡｂを用いた癌治療効果に対して、動物モデルを利用して検証した。これに対し、本発明者らは、従来の研究から抗原特異的に活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の４−１ＢＢの発現を用いて、抗−４−１ＢＢ抗体を用いた抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離及び増殖方法（特許文献１）を確立したが、抗体の場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長く、Ｆｃ受容体を通したシグナル伝達結果と抗体が認識する標的タンパク質を通したシグナル伝達の効果が統合され、全体結果が示されるようになる。また、同じ抗原に対して、多様な抗体が存在する場合が多く、これらが互いに少しずつ違う効果が示されるようになる。このような限界点を克服するために、五量体であるＣＯＭＰ−４−１ＢＢＬタンパク質を用いて、成功的に抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離及び増殖する方法を開発した（特許文献２）。
この特許文献１、２は、外来抗原であるウイルス抗原（ＥＢＶ／ＬＭＰ２Ａ、ＣＭＶ／ｐｐ６５）特異的ＣＤ８Ｔ細胞を分離／大量培養する技術であり、体内でこれら細胞の比率が高く、比較的簡単に実現が可能である。しかし、多くの癌細胞は、体を構成する細胞から形成されるので、体を構成するタンパク質であるが、正常細胞では、低い比率で存在し、癌細胞では過発現されている自己癌抗原（ｓｅｌｆ ｔｕｍｏｒ Ａｇ）を認識するＣＤ８Ｔ細胞の選択的分離及び大量培養が必要とされる。
４−１ＢＢは、誘導性共同刺激分子であり、活性化されたＴ細胞で発現されている。特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を増進させるだけでなく、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｆｌ−１等のような抗−アポトーシス分子（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の発現を増加し、活性後、細胞死（ＡＩＣＤ； ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）を抑制する機能を示すものとして知られている。このような４−１ＢＢ刺激の特性は、癌治療に適した特性などであり、これをベースに、抗−４−１ＢＢ ｍＡｂを用いた癌治療効果に対して、動物モデルを利用して検証した。これに対し、本発明者らは、従来の研究から抗原特異的に活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の４−１ＢＢの発現を用いて、抗−４−１ＢＢ抗体を用いた抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離及び増殖方法（特許文献１）を確立したが、抗体の場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長く、Ｆｃ受容体を通したシグナル伝達結果と抗体が認識する標的タンパク質を通したシグナル伝達の効果が統合され、全体結果が示されるようになる。また、同じ抗原に対して、多様な抗体が存在する場合が多く、これらが互いに少しずつ違う効果が示されるようになる。このような限界点を克服するために、五量体であるＣＯＭＰ−４−１ＢＢＬタンパク質を用いて、成功的に抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離及び増殖する方法を開発した（特許文献２）。
この特許文献１、２は、外来抗原であるウイルス抗原（ＥＢＶ／ＬＭＰ２Ａ、ＣＭＶ／ｐｐ６５）特異的ＣＤ８Ｔ細胞を分離／大量培養する技術であり、体内でこれら細胞の比率が高く、比較的簡単に実現が可能である。しかし、多くの癌細胞は、体を構成する細胞から形成されるので、体を構成するタンパク質であるが、正常細胞では、低い比率で存在し、癌細胞では過発現されている自己癌抗原（ｓｅｌｆ ｔｕｍｏｒ Ａｇ）を認識するＣＤ８Ｔ細胞の選択的分離及び大量培養が必要とされる。
そこで、本発明の目的は、体内に極めて低い比率で存在する自己癌抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を３１日内に選択的に分離し、大量培養することができる、自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離及び増殖方法を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、
ａ）癌患者血液内に存在する自己癌抗原ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを選別する工程；ｂ）癌患者の血液から分離されたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を前記エピトープのペプチド及びＩＬ−２と共に培地で培養する工程；ｃ）前記培養された細胞を工程ｂ）と同じペプチドを添加して、４−１ＢＢ発現を誘導する工程；及びｄ）４−１ＢＢ発現が誘導された細胞を抗−４−１ＢＢ抗体がコートされた培養プレートで培養した後、付着しなかった細胞を除去する工程；を含む自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離方法を提供する。
本発明の分離方法において、前記工程ａ）の自己癌抗原は、ｈＴＥＲＴ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ１及びＭＡＧＥ−Ａ３で構成された群から選ばれる。
本発明の分離方法において、前記工程ｂ）で、エピトープは、配列番号１〜１５で構成された群から選ばれたアミノ酸配列からなるペプチドである。
本発明の分離方法において、前記工程ｃ）の発現誘導は、１２〜３６時間培養することを特徴とする。
本発明の分離方法において、前記工程ｄ）の培養は、１〜２０分間行われる。
また、本発明は、前記方法で分離された自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と放射線照射された同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）ＰＢＭＣとをＩＬ−２、抗−ＣＤ３抗体及び自己血漿が含まれた培地で懸濁した後、培養バッグに注入し、前記培地を更に注入して、培養することを含む自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大量培養方法を提供する。
本発明の大量培養方法において、前記ＰＢＭＣは、正常供与者から分離されたものである。
本発明の大量培養方法において、前記培養は、４〜１５日間行われる。
ａ）癌患者血液内に存在する自己癌抗原ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを選別する工程；ｂ）癌患者の血液から分離されたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を前記エピトープのペプチド及びＩＬ−２と共に培地で培養する工程；ｃ）前記培養された細胞を工程ｂ）と同じペプチドを添加して、４−１ＢＢ発現を誘導する工程；及びｄ）４−１ＢＢ発現が誘導された細胞を抗−４−１ＢＢ抗体がコートされた培養プレートで培養した後、付着しなかった細胞を除去する工程；を含む自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離方法を提供する。
本発明の分離方法において、前記工程ａ）の自己癌抗原は、ｈＴＥＲＴ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ１及びＭＡＧＥ−Ａ３で構成された群から選ばれる。
本発明の分離方法において、前記工程ｂ）で、エピトープは、配列番号１〜１５で構成された群から選ばれたアミノ酸配列からなるペプチドである。
本発明の分離方法において、前記工程ｃ）の発現誘導は、１２〜３６時間培養することを特徴とする。
本発明の分離方法において、前記工程ｄ）の培養は、１〜２０分間行われる。
また、本発明は、前記方法で分離された自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と放射線照射された同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）ＰＢＭＣとをＩＬ−２、抗−ＣＤ３抗体及び自己血漿が含まれた培地で懸濁した後、培養バッグに注入し、前記培地を更に注入して、培養することを含む自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大量培養方法を提供する。
本発明の大量培養方法において、前記ＰＢＭＣは、正常供与者から分離されたものである。
本発明の大量培養方法において、前記培養は、４〜１５日間行われる。
本発明によれば、外来抗原でない癌患者の個々人の血液に存在する自己癌抗原ＣＤ８Ｔ細胞エピトープのペプチドを用いて、自己癌抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を分離することができる。従って、本発明の方法で分離された、健常人において極めて低い比率で存在する自己癌抗原を認識するＴ細胞を用いれば、癌患者自身の細胞から由来した癌細胞を効果的に選択して、除去することができる。
癌細胞は、体を構成する細胞から由来するので、癌細胞を選択的に除去するためには、癌細胞で過発現される自己癌抗原（ｓｅｌｆ ｔｕｍｏｒ Ａｇ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的分離及び大量培養が必要である。しかし、自己癌抗原を認識するＴ細胞は、健常人の場合、比率が極めて低く存在するだけでなく、免疫寛容（ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）により活性が抑制された状態で存在する。従って、癌患者の血液から自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に分離し、大量培養する規格化された工程は未だに開発されていない。これに対し、本発明者らは、抗−４−１ＢＢ抗体を用い、体内に極めて低い比率で存在するｈＴＥＲＴ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ１、及びＭＡＧＥ−Ａ３のような自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を３１日内に選択的に分離及び大量培養することができる規格化された工程技術を開発した。
従って、本発明は、自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離方法を提供する。具体的に、本発明の自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離方法は、ａ）癌患者血液内に存在する自己癌抗原ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを選別する工程；ｂ）癌患者の血液から分離されたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を前記エピトープのペプチド及びＩＬ−２と共に培地で培養する工程；ｃ）前記培養された細胞を工程ｂ）と同じペプチドを添加して、４−１ＢＢ発現を誘導する工程；及びｄ）４−１ＢＢ発現が誘導された細胞を抗−４−１ＢＢ抗体がコートされた培養プレートで培養した後、付着しなかった細胞を除去する工程；を含む。
本発明の分離方法において、前記工程ａ）の自己癌抗原は、癌患者自身の体内に存在するいかなる癌抗原であってもよく、癌腫に応じて適した自己癌抗原を選択して使うことができる。好ましくは、抗癌免疫治療に用いられている代表的な自己癌抗原としては、ｈＴＥＲＴ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＢＡＣ１１０１０．１）、ＷＴ１ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＯ６１０８８．１）、ＮＹ−ＥＳＯ１ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＣＡＡ０５９０８．１）、ＭＡＧＥ−Ａ３ （ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００５３５３．１）等が挙げられる。前記ｈＴＥＲＴは、染色体末端でテロメアＤＮＡ（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ＤＮＡ）を合成する酵素であり、癌細胞は、この酵素を過度に活性化させ、テロメア依存的細胞死滅を回避することができるように機能し、肺癌、胃癌、膵臓癌を含む多様な固形癌の標的抗原として知られている（Ｋｉｍ ＮＷ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９４； ２６６： ２０１１−２０１５）。前記ＷＴ１は、Ｗｉｌｍｓ ｔｕｍｏｒと関連した遺伝子であり、亜鉛フィンガー転写因子を暗号化し、細胞の増殖と分化、アポトーシス、器官の発生に関与をするタンパク質であり、脳脊髄癌、肺癌などの標的抗原として知られている（Ｃａｌｌ ＫＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． １９９０． ６０：５０９−５２０； Ｎａｋａｈａｒａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｔｈｏｌ． ２００４． ２１：１１３−６）。 また、前記ＮＹ−ＥＳＯ１は、癌精巣抗原ｎ （ＣＴＡ）に属するタンパク質中の一つであり、主に生殖細胞（ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）と肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、乳癌を含む多様な癌細胞に発現するものとして知られているが、これら細胞で、どのような機能をするのかについてはよく知られていない（Ｇｎｊａｔｉｃ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００６； ９５：１−３０）。 前記ＭＡＧＥ−Ａ３は、メラノーマ関連抗原ファミリーに属するタンパク質であり、正常細胞でどのような機能を行うかついては知らされたのがないが、肺癌、肉腫及び黒色腫を含む多様な癌細胞に過発現するものとして知られており、癌の免疫治療に適した標的抗原と評価されている（Ｄｅｃｏｓｔｅｒ Ｌ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１２ Ｊｕｎ；２３（６）：１３８７−９３）。
本発明の分離方法において、前記工程ｂ）において、エピトープは、配列番号１〜１５で構成された群から選ばれたアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする。
本発明の分離方法において、前記工程ｂ）の培地は、自己血漿が含まれた培地であることを特徴とし、また、前記工程ｂ）の培養は、１２〜１６日間行われることを特徴とする。
本発明の分離方法において、前記工程ｃ）の発現誘導は、１２〜３６時間培養することを特徴とし、前記工程ｄ）の培養は、１〜２０分間行われることを特徴とする。
また、本発明は、前述した分離方法で分離された自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と放射線照射された同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）ＰＢＭＣとをＩＬ−２、抗−ＣＤ３抗体及び自己血漿が含まれた培地で懸濁した後、培養バッグに注入し、前記培地を更に注入し、培養することを含む自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大量培養方法を提供する。
本発明の大量培養方法において、前記ＰＢＭＣは、正常供与者から分離されたことを特徴とし、前記培養は４〜１５日間行われることを特徴とする。特に、前記培養期間中、培養４日、７日、９日、１１日及び１４日目に培地を更に注入することができる。
以下、本発明の自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離及び増殖方法を工程別に説明する。
（１）エピトープスクリーニング（事前選別検査）
本発明は、ペプチドを用いて自己由来癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を選択的に増殖及び分離された。ＣＤ８Ｔ細胞により認識される自己癌抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）は、患者個々人のＨＬＡ−Ａタイプ及び状態によりそれぞれ違うので、エピトープスクリーニングを通して癌患者個々人の血液内に存在する自己癌抗原ＣＤ８Ｔ細胞エピトープを選別し、Ｔ細胞治療剤製造用ペプチド３−４種類を選別した。
本発明は、ペプチドを用いて自己由来癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を選択的に増殖及び分離された。ＣＤ８Ｔ細胞により認識される自己癌抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）は、患者個々人のＨＬＡ−Ａタイプ及び状態によりそれぞれ違うので、エピトープスクリーニングを通して癌患者個々人の血液内に存在する自己癌抗原ＣＤ８Ｔ細胞エピトープを選別し、Ｔ細胞治療剤製造用ペプチド３−４種類を選別した。
（２）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖
自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、血液内０．１％以下で存在するので、血液から分離されたＰＢＭＣに製造用ペプチド３−４種及びＩＬ−２を添加し、１４日間、培養することで、自己癌抗原から由来したペプチドに特異的なＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘導した。培養１４日目に全細胞を回収し、同じペプチドで２４時間、再活性化することでペプチド−特異的ＣＤ８Ｔ細胞が、同時に４−１ＢＢを発現するように誘導した。
自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、血液内０．１％以下で存在するので、血液から分離されたＰＢＭＣに製造用ペプチド３−４種及びＩＬ−２を添加し、１４日間、培養することで、自己癌抗原から由来したペプチドに特異的なＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘導した。培養１４日目に全細胞を回収し、同じペプチドで２４時間、再活性化することでペプチド−特異的ＣＤ８Ｔ細胞が、同時に４−１ＢＢを発現するように誘導した。
（３）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の選択的分離
抗−４−１ＢＢ抗体がコートされた培養プレートに、ペプチドで再活性化させた細胞を分注し、１０分間培養することで、４−１ＢＢを発現するＣＤ８Ｔ細胞が付着するようにし、付着されていない細胞は全部洗浄して除去した。以後、ＩＬ−２が含まれた培地を添加し、２日間、培養することで、分離されたＴ細胞が増殖すると共に培養プレートに落ちるようにした。
抗−４−１ＢＢ抗体がコートされた培養プレートに、ペプチドで再活性化させた細胞を分注し、１０分間培養することで、４−１ＢＢを発現するＣＤ８Ｔ細胞が付着するようにし、付着されていない細胞は全部洗浄して除去した。以後、ＩＬ−２が含まれた培地を添加し、２日間、培養することで、分離されたＴ細胞が増殖すると共に培養プレートに落ちるようにした。
（４）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の大量培養
１Ｌ培養バッグ（ｃｕｌｔｕｒｅ ｂａｇ）に、分離されたＣＤ８Ｔ細胞５×１０５細胞、放射線照射された（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）ＰＢＭＣｓ １×１０８細胞、１０００Ｕ／ｍＬＩＬ−２、４０ｎｇ抗−ＣＤ３ ｍＡｂを混合し、１４日間、定期的に培地を添加して、〜１０９細胞／Ｌ水準に細胞を大量培養し、癌患者に投与可能な水準に増殖させた。
１Ｌ培養バッグ（ｃｕｌｔｕｒｅ ｂａｇ）に、分離されたＣＤ８Ｔ細胞５×１０５細胞、放射線照射された（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）ＰＢＭＣｓ １×１０８細胞、１０００Ｕ／ｍＬＩＬ−２、４０ｎｇ抗−ＣＤ３ ｍＡｂを混合し、１４日間、定期的に培地を添加して、〜１０９細胞／Ｌ水準に細胞を大量培養し、癌患者に投与可能な水準に増殖させた。
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本発明を具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
実験例．エピトープスクリーニング工程
アルゴリズムを通じて自己癌抗原のＣＤ８Ｔ細胞エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を選別した。癌患者の血液内に存在するＴ細胞がどのＣＤ８Ｔ細胞のエピトープに反応するかを確認するために、癌患者の血液からＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を分離し、洗浄した後、ＣＴＬ培地（ＲＰＭＩ１６４０培地＋４ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋５０μＭ ２−メルカプトエタノール＋３％自己血漿）に、１×１０６細胞／ｍＬで懸濁し、１４ ｍＬチューブ（ｒｏｕｎｄ ｔｕｂｅ）に１ ｍＬずつ分注した。アルゴリズムを通じて分析し、選別された各エピトープのペプチドを各チューブに１μｇ／ｍＬ濃度で添加し、ＣＯ２インキュベーターで培養を開始した。培養２日目に、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２が含まれたＣＴＬ培地を各チューブに１ｍＬずつ添加した。培養７、９、１１、及び１３日目に、１ｍＬ培地を除去した後、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２が含まれたＣＴＬ培地を添加した。培養１４日目に、各チューブにＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を３回洗浄した。洗浄された細胞に１ｍＬのＣＴＬ培地を懸濁した後、同じペプチドを５μｇ／ｍＬ濃度で添加して、培養した。２４時間後、各チューブの細胞を回収し、抗−ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ５及び抗−４−１ＢＢ−ＰＥ抗体で染色し、乳細胞分析し、４−１ＢＢを発現するＣＤ８Ｔ細胞の比率を分析することで、どのペプチドに反応して、ＣＤ８Ｔ細胞が活性化されたかを分析した。図２は、本発明に係るエピトープスクリーニング過程の工程流れを示した図である。
実験に用いられた抗−ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ５、抗−４−１ＢＢ−ＰＥは、ｅバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から購入した。ＲＰＭＩ１６４０、Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、２−メルカプトエタノールは、インビトロジエン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から購入した。
実施例１． 自己癌抗原選別及びＣＤ８Ｔ細胞エピトープ選別
各癌腫別に、どの癌抗原が癌の免疫治療に適しているかを評価した論文（Ｓｃａｎｌａｎ ＭＪ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２００２ Ｏｃｔ． １８８：２２−３２；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ． １９９８． ５８：６２２−６２５；Ｎａｋａｈａｒａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｔｈｏｌ． ２００４． ２１（３）： １１３−６）をもとに、韓国人発癌及び難治性癌（胃癌、肺癌、膵臓癌など）の免疫治療に適した自己癌抗原を選別した。ｈＴＥＲＴ（ＧｅｎＢａｎｋ： ＢＡＣ１１０１０．１）、ＷＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＯ６１０８８．１）、ＮＹ−ＥＳＯ１（ＧｅｎＢａｎｋ： ＣＡＡ０５９０８．１）、ＭＡＧＥ−Ａ３（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００５３５３．１）は、多様な方式で抗癌免疫治療に利用されている代表的な自己癌抗原であり、これら４種類の癌抗原の適用が可能な癌腫を選別し、下記表１に示した。
選別された自己癌抗原のアミノ酸配列を、アルゴリズムを通じて分析し、ＣＤ８Ｔ細胞エピトープと推定されるアミノ酸配列を決定した（ＣＴＬＰｒｅｄ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｃｔｌｐｒｅｄ／， ＮｅｔＣＴＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＣＴＬ／， ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／）、選別されたエピトープを対象に、ペプチドを化学合成（Ｐｅｐｔｒｏｎ Ｉｎｃ； ｗｗｗ．ｐｅｐｔｒｏｎ．ｃｏｍ）して、エピトープスクリーニングに用いた。各自己癌抗原から選別されたＣＤ８Ｔ細胞エピトープは、下記表２〜５に示した。
実施例２． 臨床癌患者を対象としたエピトープスクリーニング
実施例１で選別されたｈＴＥＲＴ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＭＡＧＥ−Ａ３自己癌抗原のＣＤ８Ｔ細胞エピトープが実際の臨床癌患者の血液に存在するＣＤ８Ｔ細胞増殖を誘導することができるか否かを検証するために、図２に示されたエピトープスクリーニングを行った。ｈＴＥＲＴエピトープスクリーニングは、胃癌、肺癌、膵臓癌を主対象として行っており、ＷＴ１エピトープスクリーニングは、脳脊髄癌及び肺癌、ＮＹ−ＥＳＯ１エピトープスクリーニングは卵巣癌及び肉腫、また、ＭＡＧＥ−Ａ３エピトープスクリーニングは、肉腫及び肺癌を主対象として行った。
図３は、健常人から得たＰＢＭＣを用いたｈＴＥＲＴエピトープスクリーニング結果を示す図である。
図４は、健常人から得たＰＢＭＣを用いたＷＴ１エピトープスクリーニング結果を示す図である。
図３と４に示されるように、ｈＴＥＲＴ及びＷＴ１のＣＤ８Ｔ細胞エピトープは、健常人の血液から分離されたＰＢＭＣからＴ細胞反応を誘導することができなかった。従って、本発明の選別されたエピトープは、健常人のＴ細胞が認識できないものと確認された。
図５〜７は、それぞれ、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）及び膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）患者から得たＰＢＭＣを用いたｈＴＥＲＴエピトープスクリーニング結果を示す図である。
図８及び９は、それぞれ、脳腫瘍（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）及び肺癌患者から得たＰＢＭＣを用いたＷＴ１エピトープスクリーニング結果を示す図である。
図１０及び１１は、それぞれ、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）及び肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）患者から得たＰＢＭＣを用いたＮＹ−ＥＳＯ１エピトープスクリーニング結果を示す図である。
図１２及び１３は、それぞれ、肉腫及び肺癌患者から得たＰＢＭＣを用いたＭＡＧＥ−Ａ３エピトープスクリーニング結果を示す図である。
図５〜１３に示されるように、臨床癌患者の血液から分離されたＰＢＭＣを対象にエピトープスクリーニングを行い、ｈＴＥＲＴ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ１、及びＭＡＧＥ−Ａ３に対するＣＤ８Ｔ細胞反応性を調べた結果、健常人とは違って、選択された自己癌抗原に対するＴ細胞反応が高く現れることが確認された。従って、胃癌、肺癌、膵臓癌、肉腫、卵巣癌などを対象に、それぞれの自己癌抗原に対する反応性を、エピトープスクリーニングを繰り返し行って確認した。
また、前記エピトープスクリーニング結果を客観的に分析するために、スコアリングシステム（ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を下記表６に示す通りに作製した。
前記表６の基準に従って、エピトープスクリーニング結果を分析した。その結果は下記表７〜１５に示した。
下記表７は、胃癌患者から得たＰＢＭＣを用いたｈＴＥＲＴエピトープスクリーニングを分析した結果である。
下記表８は、肺癌患者から得たＰＢＭＣを用いたｈＴＥＲＴエピトープスクリーニングを分析した結果である。
下記表９は、膵臓癌患者から得たＰＢＭＣを用いたｈＴＥＲＴエピトープスクリーニングを分析した結果である。
下記表１０は、脳腫瘍患者から得たＰＢＭＣを用いたＷＴ１エピトープスクリーニングを分析した結果である。
下記表１１は、肺癌患者から得たＰＢＭＣを用いたＷＴ１エピトープスクリーニングを分析した結果である。
下記表１２は、卵巣癌患者から得たＰＢＭＣを用いたＮＹ−ＥＳＯ１エピトープスクリーニングを分析した結果である。
下記表１３は、肉腫患者から得たＰＢＭＣを用いたＷＴ１エピトープスクリーニングを分析した結果である。
下記表１４は、肉腫患者から得たＰＢＭＣを用いたＭＡＧＥ−Ａ３エピトープスクリーニングを分析した結果である。
下記表１５は、肺癌患者から得たＰＢＭＣを用いたＭＡＧＥ−Ａ３エピトープスクリーニングを分析した結果である。
前記表７〜１３に示されるように、スコア３以上でＣＤ８Ｔ細胞がペプチド刺激により４−１ＢＢを発現する場合、抗−４−１ＢＢ抗体を用い、効果的にこれら細胞を分離することができた。各癌腫で、スコア３以上で自己癌抗原にＴ細胞が反応する比率４０−５０％水準であったので、選別された自己癌抗原のエピトープを用いて、Ｔ細胞治療剤を製造することができると判断した。選別されたペプチドは、ｈＴＥＲＴペプチド：ＣＬＫＥＬＶＡＲＶ（配列番号１）、ＰＬＦＬＥＬＬ （配列番号２）、ＡＡＶＴＰＡＡ（配列番号３）；ＷＴ１ペプチド：ＳＬＧＥＱＱＶＳＶ（配列番号４）、ＲＭＦＰＮＡＰＶＬ（配列番号５）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号６）、ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（配列番号７）；ＮＹ−ＥＳＯ１ペプチド：ＳＩＳＳＣＬＱＱＬ（配列番号８）、ＲＬＬＥＦＹＬＡＭ（配列番号９）、ＧＶＬＬＫＥＦＴＶ（配列番号１０）、ＩＬＴＩＲＬＴＡＡ（配列番号１１）；及びＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド：ＬＬＩＩＶＬＡＩＩ（配列番号１２）、ＫＩＷＥＥＬＳＶＬ（配列番号１３）、ＬＶＦＧＩＥＬＭＥＶ（配列番号１４）、ＳＬＰＴＴＭＮＹＰＬ（配列番号１５）である。
実施例３． 自己癌抗原特異的Ｔ細胞治療剤の試験製造
エピトープスクリーニングを通してＴ細胞治療剤製造に適した各自己癌抗原に対する３−４種のエピトープのペプチドを選別した後、これらペプチドを用いて、ｈＴＥＲＴ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ１、及びＭＡＧＥ−Ａ３特異的Ｔ細胞治療剤の試験生産を行った。Ｔ細胞治療剤の生産は、自己由来抗癌Ｔ細胞の１次増殖、分離、大量培養の３工程で構成されている。
（１）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖
エピトープスクリーニングを通してスコア３以上のエピトープが一つ以上存在することを確認した癌患者から５０ｍＬの血液を分離された。
１）患者の血液からＰＢＭＣ分離：７ｍＬフィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ）が満たされた１５ｍＬチューブ（コニカルチューブ）に、７ｍＬの血液をゆっくり流し、フィコールを溶液上層にオーバーレイした。チューブを室温、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、フィコールと血漿と間に位置した白色の細胞層だけを回収し、洗浄し、ＰＢＭＣとして用いた。
２）分離されたＰＢＭＣをＣＴＬ培地（ＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍ ＋ ４ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ＋ １２．５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＋ ５０ μＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ ＋ ３％ ａｕｔｏｐｌａｓｍａ）に１×１０６細胞／ｍＬで懸濁し、エピトープスクリーニングを通して本発明で選別された３−４種のペプチドがそれぞれ１μｇ／ｍＬ濃度になるように添加した。これら細胞懸濁液を１４ｍＬチューブ（ｒｏｕｎｄ ｔｕｂｅ）に１ｍＬずつ分注し、ＣＯ２インキュベーターで培養した。
３）培養２日目に５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｎｏｖａｔｉｓ）が含まれたＣＴＬ培地を各チューブに１ｍＬずつ添加した。
４）培養７、９、１１、及び１３日目に、１ｍＬ上層培地を除去した後、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２が含まれたＣＴＬ培地を添加した。
５）培養１４日目に、各チューブの細胞を５０ｍＬコティコルチューブに回収した後、ＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を洗浄した。この過程を２回さらに繰り返した。
６）洗浄された細胞を２×１０６細胞／ｍＬの濃度でＣＴＬ培地を懸濁した後、同じペプチド３−４種それぞれを５μｇ／ｍＬ濃度で添加し、培養した。
エピトープスクリーニングを通してスコア３以上のエピトープが一つ以上存在することを確認した癌患者から５０ｍＬの血液を分離された。
１）患者の血液からＰＢＭＣ分離：７ｍＬフィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ）が満たされた１５ｍＬチューブ（コニカルチューブ）に、７ｍＬの血液をゆっくり流し、フィコールを溶液上層にオーバーレイした。チューブを室温、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、フィコールと血漿と間に位置した白色の細胞層だけを回収し、洗浄し、ＰＢＭＣとして用いた。
２）分離されたＰＢＭＣをＣＴＬ培地（ＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍ ＋ ４ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ＋ １２．５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＋ ５０ μＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ ＋ ３％ ａｕｔｏｐｌａｓｍａ）に１×１０６細胞／ｍＬで懸濁し、エピトープスクリーニングを通して本発明で選別された３−４種のペプチドがそれぞれ１μｇ／ｍＬ濃度になるように添加した。これら細胞懸濁液を１４ｍＬチューブ（ｒｏｕｎｄ ｔｕｂｅ）に１ｍＬずつ分注し、ＣＯ２インキュベーターで培養した。
３）培養２日目に５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｎｏｖａｔｉｓ）が含まれたＣＴＬ培地を各チューブに１ｍＬずつ添加した。
４）培養７、９、１１、及び１３日目に、１ｍＬ上層培地を除去した後、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２が含まれたＣＴＬ培地を添加した。
５）培養１４日目に、各チューブの細胞を５０ｍＬコティコルチューブに回収した後、ＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を洗浄した。この過程を２回さらに繰り返した。
６）洗浄された細胞を２×１０６細胞／ｍＬの濃度でＣＴＬ培地を懸濁した後、同じペプチド３−４種それぞれを５μｇ／ｍＬ濃度で添加し、培養した。
（２）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の選別
１）培養２４時間目に、１日間再活性化させたＰＢＭＣを回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した後、５×１０６細胞／ｍＬの濃度でＣＴＬ培地を懸濁し、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。
２）抗−４−１ＢＢ抗体を５０μｇ／ｍＬの濃度で１日間コーティングした６ウェル又は１２ウェル プレート（ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ）に、これら細胞を１ｍＬずつ添加し、１０分間、ＣＯ２インキュベーターで培養した。
３）培養１０分後、プレートに付着しなかった細胞を全部洗浄し、除去した後、１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２が含まれたＣＴＬ培地２−４ｍＬを各ウェルに添加し、ＣＯ２インキュベーターで２日間、培養した。
１）培養２４時間目に、１日間再活性化させたＰＢＭＣを回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した後、５×１０６細胞／ｍＬの濃度でＣＴＬ培地を懸濁し、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。
２）抗−４−１ＢＢ抗体を５０μｇ／ｍＬの濃度で１日間コーティングした６ウェル又は１２ウェル プレート（ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ）に、これら細胞を１ｍＬずつ添加し、１０分間、ＣＯ２インキュベーターで培養した。
３）培養１０分後、プレートに付着しなかった細胞を全部洗浄し、除去した後、１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２が含まれたＣＴＬ培地２−４ｍＬを各ウェルに添加し、ＣＯ２インキュベーターで２日間、培養した。
（３）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の大量培養
１）抗−４−１ＢＢ抗体に分離し、２日間培養した細胞を全部回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄して、計数した。
２）正常供与者からＰＢＭＣを分離し、１×１０８細胞／ｍＬで懸濁した後、３０００ｒａｄで放射線照射し、細胞の死滅を誘導した後、Ｔ細胞の増殖誘導に必要な同時刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）を提供可能な培養添加物として用いた。
３）５０ｍＬの円錐チューブに分離されたＣＤ８Ｔ細胞５×１０５細胞と照射された同種異系のＰＢＭＣｓ１×１０８細胞を添加した後、１，０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、４０ｎｇ／ｍＬ抗−ＣＤ３ ｍＡｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び３％自己血漿（ａｕｔｏｐｌａｓｍａ）が含まれたＡＬｙＳ５０５Ｎ培地（ＣＥＬＬ ＳＣＩＥＮＣＥ ＆ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＩＮＳＴ．， ＩＮＣ． （ＣＳＴＩ））を５０ｍＬまで添加した。
４）５０ｍＬ細胞懸濁液を１Ｌ培養バッグ（ｃｕｌｔｕｒｅ ｂａｇ）に注入した後、ＣＯ２インキュベーターで培養した。
５）培養４日目に、１，０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、３％自己血漿が含まれたＡＬｙＳ５０５Ｎ培地５０ｍＬを１Ｌ培養バッグにさらに注入した。
６）培養７日目に、１，０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、３％自己血漿が含まれたＡＬｙＳ５０５Ｎ培地１００ｍＬを１Ｌ培養バッグにさらに注入した。
７）培養９日目に、１，０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、３％自己血漿が含まれたＡＬｙＳ５０５Ｎ培地３００ｍＬを１Ｌ培養バッグにさらに注入した。
８）培養１１日目に、１，０００ Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、３％自己血漿が含まれたＡＬｙＳ５０５Ｎ培地５００ｍＬを１Ｌ培養バッグにさらに注入した。
９）培養１４日目に、１Ｌ培養バッグのすべての細胞を回収し、注射用生理食塩水で３回洗浄し、５％アルブミンが含まれた注射用生理食塩水に細胞を懸濁し、完成品Ｔ細胞治療剤を充填した。
１）抗−４−１ＢＢ抗体に分離し、２日間培養した細胞を全部回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄して、計数した。
２）正常供与者からＰＢＭＣを分離し、１×１０８細胞／ｍＬで懸濁した後、３０００ｒａｄで放射線照射し、細胞の死滅を誘導した後、Ｔ細胞の増殖誘導に必要な同時刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）を提供可能な培養添加物として用いた。
３）５０ｍＬの円錐チューブに分離されたＣＤ８Ｔ細胞５×１０５細胞と照射された同種異系のＰＢＭＣｓ１×１０８細胞を添加した後、１，０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、４０ｎｇ／ｍＬ抗−ＣＤ３ ｍＡｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び３％自己血漿（ａｕｔｏｐｌａｓｍａ）が含まれたＡＬｙＳ５０５Ｎ培地（ＣＥＬＬ ＳＣＩＥＮＣＥ ＆ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＩＮＳＴ．， ＩＮＣ． （ＣＳＴＩ））を５０ｍＬまで添加した。
４）５０ｍＬ細胞懸濁液を１Ｌ培養バッグ（ｃｕｌｔｕｒｅ ｂａｇ）に注入した後、ＣＯ２インキュベーターで培養した。
５）培養４日目に、１，０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、３％自己血漿が含まれたＡＬｙＳ５０５Ｎ培地５０ｍＬを１Ｌ培養バッグにさらに注入した。
６）培養７日目に、１，０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、３％自己血漿が含まれたＡＬｙＳ５０５Ｎ培地１００ｍＬを１Ｌ培養バッグにさらに注入した。
７）培養９日目に、１，０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、３％自己血漿が含まれたＡＬｙＳ５０５Ｎ培地３００ｍＬを１Ｌ培養バッグにさらに注入した。
８）培養１１日目に、１，０００ Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、３％自己血漿が含まれたＡＬｙＳ５０５Ｎ培地５００ｍＬを１Ｌ培養バッグにさらに注入した。
９）培養１４日目に、１Ｌ培養バッグのすべての細胞を回収し、注射用生理食塩水で３回洗浄し、５％アルブミンが含まれた注射用生理食塩水に細胞を懸濁し、完成品Ｔ細胞治療剤を充填した。
前記の通りに、臨床癌患者から本発明のエピトープスクリーニングを通してＴ細胞反応を誘導しうるスコア３以上のペプチド３−４種を選別した後、５０ｃｃ血液を用いて、ｈＴＥＲＴ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＭＡＧＥ−Ａ３ Ｔ細胞治療剤の試験生産を行った。その結果を図６〜９に示した。
図１４は、ｈＴＥＲＴ Ｔ細胞治療剤のパイロット生産過程を説明する図である。
図１４は、ＨＬＡ−Ａ＊２４ ａｌｌｅｌｅを有する胃癌患者の５０ｃｃ血液からＰＢＭＣを分離し、３種類のｈＴＥＲＴペプチド［ＣＬＫＥＬＶＡＲＶ（配列番号１）、ＰＬＦＬＥＬＬ（配列番号２）、ＡＡＶＴＰＡＡ（配列番号３）］を、それぞれ１μｇ／ｍＬ濃度で添加した後、前記実施例３の「（１）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖」に記述された過程に従って培養した。培養１４日目に、すべての細胞を回収し、「（２）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の選別」過程に従ってｈＴＥＲＴペプチドに反応し、増殖したＴ細胞を分離／増殖した。分離されたＴ細胞は、「（３）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の大量培養」過程を通じて癌患者に投与可能な水準に大量培養しており、最終培養された細胞は低い老化度と作用機能を有している特定ＴＣＲＶｂタイプのＴ細胞であるものと乳細胞分析された。
図１５は、ＷＴ１ Ｔ細胞治療剤のパイロット生産過程を説明する図である。
図１５は、ＨＬＡ−Ａ＊０２ ａｌｌｅｌｅを有する悪性神経膠腫患者の５０ｃｃ血液からＰＢＭＣを分離し、４種類のＷＴ１ペプチド［ＳＬＧＥＱＱＶＳＶ（配列番号４）、ＲＭＦＰＮＡＰＶＬ（配列番号５）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号６）、ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（配列番号７）］を、それぞれ１μｇ／ｍＬ濃度で添加した後、前記実施例３の「（１）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖」に記述された過程に従って培養した。培養１４日目に、すべての細胞を回収し、「（２）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の選別」過程に従ってＷＴ１ペプチドに反応し、増殖したＴ細胞を分離／増殖した。分離されたＴ細胞は、「（３）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の大量培養」過程を通じて癌患者に投与可能な水準に大量培養しており、最終培養された細胞は低い老化度と作用機能を有している特定ＴＣＲＶｂタイプのＴ細胞であるものと乳細胞分析された。
図１６は、ＮＹ−ＥＳ０１ Ｔ細胞治療剤のパイロット生産過程を説明する図である。
図１６は、ＨＬＡ−Ａ＊０２ ａｌｌｅｌｅを有する卵巣癌患者の５０ｃｃ血液からＰＢＭＣを分離し、４種類のＮＹ−ＥＳＯ１ペプチド［ＳＩＳＳＣＬＱＱＬ（配列番号８）、ＲＬＬＥＦＹＬＡＭ（配列番号９）、ＧＶＬＬＫＥＦＴＶ（配列番号１０）、ＩＬＴＩＲＬＴＡＡ（配列番号１１）］を、それぞれ１μｇ／ｍＬ濃度で添加した後、前記実施例３の「（１）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖」に記述された過程に従って培養した。培養１４日目に、すべての細胞を回収し、「（２）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の選別」過程に従って、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドに反応し、増殖したＴ細胞を分離／増殖した。分離されたＴ細胞は、「（３）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の大量培養」過程を通じて癌患者に投与可能な水準に大量培養しており、最終培養された細胞は低い老化度と作用機能を有している特定ＴＣＲＶｂタイプのＴ細胞であるものと乳細胞分析された。
図１７は、ＭＡＧＥ−Ａ３ Ｔ細胞治療剤のパイロット生産過程を説明する図である。
図１７は、ＨＬＡ−Ａ＊０２ ａｌｌｅｌｅを有する肉腫患者の５０ｃｃ血液からＰＢＭＣを分離し、４種類のＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド［ＬＬＩＩＶＬＡＩＩ（配列番号１２）、ＫＩＷＥＥＬＳＶＬ（配列番号１３）、ＬＶＦＧＩＥＬＭＥＶ（配列番号１４）、ＳＬＰＴＴＭＮＹＰＬ（配列番号１５）］を、それぞれ１μｇ／ｍＬ濃度で添加した後、前記実施例３の「（１）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖」に記述された過程に従って培養した。培養１４日目に、すべての細胞を回収し、「（２）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の選別」過程に従ってＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドに反応し、増殖したＴ細胞を分離／増殖した。分離されたＴ細胞は、「（３）自己癌抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の大量培養」過程を通じて癌患者に投与可能な水準に大量培養しており、最終培養された細胞は低い老化度と作用機能を有している特定ＴＣＲＶｂタイプのＴ細胞であるものと乳細胞分析された。
以上で、本発明について、その好ましい実施例を中心に説明した。本発明が属する技術分野における通常の知識を有した者は、本発明が本発明の本質的な特性から逸脱しない範囲で変形された形態で具現され得ることを理解することができる。従って、開示された実施例は、限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は前述した説明でなく特許請求ｍｐ範囲に示されており、それと同等な範囲内にある全ての差は本発明に含まれるものとして解釈しなければならない。
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本発明を具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
以下、参考形態の例を付記する。
１． 下記工程を含む自己癌抗原特異的ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞の分離方法：
ａ）癌患者血液内に存在する自己癌抗原ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞エピトープを選別する工程；
ｂ）癌患者の血液から分離されたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を前記エピトープのペプチド及びＩＬ−２と共に培地で培養する工程；
ｃ）前記培養された細胞を工程ｂ）と同じペプチドを添加して、４−１ＢＢ発現を誘導する工程；及び
ｄ）４−１ＢＢ発現が誘導された細胞を抗−４−１ＢＢ抗体がコートされた培養プレートで培養した後、付着しなかった細胞を除去する工程。
２． 前記工程ａ）の自己癌抗原は、ｈＴＥＲＴ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＢＡＣ１０１０．１）、ＷＴ１ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＯ６１０８８．１）、ＮＹ−ＥＳＯ１ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＣＡＡ０５９０８．１）、及びＭＡＧＥ−Ａ３（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００５３５３．１）で構成された群から選ばれたことを特徴とする１．に記載の方法。
３． 前記工程ｂ）で、エピトープは、配列番号１〜１５で構成された群から選ばれたアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする１．に記載の方法。
４． 前記工程ｂ）の培地は、自己血漿が含まれた培地であることを特徴とする１．に記載の方法。
５． 前記工程ｂ）の培養は、１２〜１６日間行われることを特徴とする１．に記載の方法。
６． 工程の発現誘導は、１２〜３６時間培養することを特徴とする１．に記載の方法。
７． 前記工程ｄ）の培養は、１〜２０分間行われることを特徴とする１．に記載の方法。
８． １．に記載の方法で分離された自己癌抗原特異的ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞と放射線照射された同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）ＰＢＭＣとをＩＬ−２、抗−ＣＤ３抗体及び自己血漿が含まれた培地で懸濁した後、培養バッグに注入し、前記培地を更に注入して、培養することを含む自己癌抗原特異的ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞の大量培養方法。
９． 前記ＰＢＭＣは、正常供与者から分離されたものであることを特徴とする８．に記載の方法。
１０． 前記培養は、４〜１５日間行われることを特徴とする８．に記載の方法。
１１． 前記培養は、培養４日、７日、９日、１１日及び１４日目に培地を更に注入することを特徴とする１０．に記載の方法。
以下、参考形態の例を付記する。
１． 下記工程を含む自己癌抗原特異的ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞の分離方法：
ａ）癌患者血液内に存在する自己癌抗原ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞エピトープを選別する工程；
ｂ）癌患者の血液から分離されたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を前記エピトープのペプチド及びＩＬ−２と共に培地で培養する工程；
ｃ）前記培養された細胞を工程ｂ）と同じペプチドを添加して、４−１ＢＢ発現を誘導する工程；及び
ｄ）４−１ＢＢ発現が誘導された細胞を抗−４−１ＢＢ抗体がコートされた培養プレートで培養した後、付着しなかった細胞を除去する工程。
２． 前記工程ａ）の自己癌抗原は、ｈＴＥＲＴ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＢＡＣ１０１０．１）、ＷＴ１ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＯ６１０８８．１）、ＮＹ−ＥＳＯ１ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＣＡＡ０５９０８．１）、及びＭＡＧＥ−Ａ３（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００５３５３．１）で構成された群から選ばれたことを特徴とする１．に記載の方法。
３． 前記工程ｂ）で、エピトープは、配列番号１〜１５で構成された群から選ばれたアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする１．に記載の方法。
４． 前記工程ｂ）の培地は、自己血漿が含まれた培地であることを特徴とする１．に記載の方法。
５． 前記工程ｂ）の培養は、１２〜１６日間行われることを特徴とする１．に記載の方法。
６． 工程の発現誘導は、１２〜３６時間培養することを特徴とする１．に記載の方法。
７． 前記工程ｄ）の培養は、１〜２０分間行われることを特徴とする１．に記載の方法。
８． １．に記載の方法で分離された自己癌抗原特異的ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞と放射線照射された同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）ＰＢＭＣとをＩＬ−２、抗−ＣＤ３抗体及び自己血漿が含まれた培地で懸濁した後、培養バッグに注入し、前記培地を更に注入して、培養することを含む自己癌抗原特異的ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞の大量培養方法。
９． 前記ＰＢＭＣは、正常供与者から分離されたものであることを特徴とする８．に記載の方法。
１０． 前記培養は、４〜１５日間行われることを特徴とする８．に記載の方法。
１１． 前記培養は、培養４日、７日、９日、１１日及び１４日目に培地を更に注入することを特徴とする１０．に記載の方法。
Claims (11)
- 下記工程を含む自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離方法：
ａ）癌患者血液内に存在する自己癌抗原ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを選別する工程；
ｂ）癌患者の血液から分離されたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を前記エピトープのペプチド及びＩＬ−２と共に培地で培養する工程；
ｃ）前記培養された細胞を工程ｂ）と同じペプチドを添加して、４−１ＢＢ発現を誘導する工程；及び
ｄ）４−１ＢＢ発現が誘導された細胞を抗−４−１ＢＢ抗体がコートされた培養プレートで培養した後、付着しなかった細胞を除去する工程。 - 前記工程ａ）の自己癌抗原は、ｈＴＥＲＴ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＢＡＣ１０１０．１）、ＷＴ１ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＯ６１０８８．１）、ＮＹ−ＥＳＯ１ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＣＡＡ０５９０８．１）、及びＭＡＧＥ−Ａ３（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００５３５３．１）で構成された群から選ばれたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記工程ｂ）で、エピトープは、配列番号１〜１５で構成された群から選ばれたアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記工程ｂ）の培地は、自己血漿が含まれた培地であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記工程ｂ）の培養は、１２〜１６日間行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 工程の発現誘導は、１２〜３６時間培養することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記工程ｄ）の培養は、１〜２０分間行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法で分離された自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と放射線照射された同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）ＰＢＭＣとをＩＬ−２、抗−ＣＤ３抗体及び自己血漿が含まれた培地で懸濁した後、培養バッグに注入し、前記培地を更に注入して、培養することを含む自己癌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大量培養方法。
- 前記ＰＢＭＣは、正常供与者から分離されたものであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
- 前記培養は、４〜１５日間行われることを特徴とする請求項８に記載の方法。
- 前記培養は、培養４日、７日、９日、１１日及び１４日目に培地を更に注入することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
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