KR20210098637A - Cd71을 이용한 자가암항원 반응성 cd8 t 세포 분리방법 및 이의 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 CD71을 이용하여 자가암항원 반응성 CD8 T 세포를 분리하는 방법 및 이의 응용에 대한 것이다.
본 발명의 분리방법을 이용하여 자가암항원 반응성 CD8 T 세포를 분리하는 경우 자가암항원에 특이적인 CD8 T 세포 이외에 다양한 암항원에 반응하는 CD8 T 세포도 함께 분리되므로, 보다 적은 혈액으로도 대량으로 CD8 T 세포수를 증폭시켜 유의적인 항암효과를 제공할 수 있다. 따라서 입양 세포 치료 등 치료를 위해 일시적인 면역결핍을 유도하는 면역치료 등에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 분리방법을 이용하여 자가암항원 반응성 CD8 T 세포를 분리하는 경우 자가암항원에 특이적인 CD8 T 세포 이외에 다양한 암항원에 반응하는 CD8 T 세포도 함께 분리되므로, 보다 적은 혈액으로도 대량으로 CD8 T 세포수를 증폭시켜 유의적인 항암효과를 제공할 수 있다. 따라서 입양 세포 치료 등 치료를 위해 일시적인 면역결핍을 유도하는 면역치료 등에 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 CD71을 이용하여 자가암항원 반응성 CD8 T 세포를 분리하는 방법 및 이의 응용에 대한 것이다.
입양 T 세포 치료(Adoptive T cell therapy)는 암항원 특이적 T 세포를 분리 및 대량배양하여 암환자에게 투여함으로써 암을 치료하는 방법이다. 초기연구에서는 암에 대한 특이성 없이 암환자의 혈액이나 암조직의 T 세포를 대량증식시켜 CIK (cytokine-induced killer cells), LAK(lymphokine-activated killer cell) 또는 TIL(tumor-infiltrating lymphocyte)를 생산한 후 암환자에게 투여함으로써 안전성과 유효성을 평가하였다. 그러나 대부분 암환자에서 안전성은 확인된 반면, 유효성은 없었는데, 임상시험에 사용된 CIK, LAK 및 TIL 세포들의 암에 대한 특이성이 낮은 것이 그 원인으로 판단되었다. 암항원 특이적 T 세포를 분리 및 대량배양하기 위한 배양방법들이 적용된 T 세포치료제의 임상시험들이 순차적으로 진행되었으며, 암세포에 대한 특이성이 부여될 경우 항암효과는 증가하는 것으로 보고되었다. 그러나 암세포 특이적 T 세포를 사용하여도 재발한 암환자를 완치시키는 비율은 극히 낮은 것으로 나타났다. T 세포치료제의 낮은 효력 문제를 해결하기 위한 방법으로, 화학 항암제의 사전투여를 통해 일시적 면역결핍을 유도한 후 T 세포치료제를 투여하는 방법이 사용되고 있다.
현재 개발되었거나 개발중인 항암 T 세포치료제들은 암항원 특이적 T 세포의 분리 및 대량배양 개념을 필수적으로 포함하고 있다. 모든 T 세포치료제가 암세포 특이적 T 세포의 분리 및 투여라는 동일한 목표를 가지고 있지만, T 세포의 분리 및 대량배양과정, 그리고 배양된 T 세포의 특성은 모두 다르다. 혈액이나 암조직내 암항원 특이적 T 세포의 비율이 극히 낮기 때문에, 일반적으로 암항원 특이적 T 세포의 분리전에, 이들 세포의 비율을 높이기 위한 증폭과정을 대부분 필요로 한다. 암항원 특이적 CD8 T 세포를 분리할 수 있는 가장 대표적인 방법은 MHC I/peptide multimer를 이용하여 분리하는 방법이지만, 사용 가능한 MHC I/peptide multimer가 제한적이어서 다양한 환자에게 적용하지는 못하고 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 활성화된 T 세포에서만 선택적으로 발현하는 4-1BB의 특성을 이용한 항원 특이적 T 세포분리공정이 개발되었다(대한민국 등록특허 제10-1503341호).
상기 4-1BB를 이용하는 방법은 이론적으로 모든 종류의 암항원에 대해 적용할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 그러나, 입양 T 세포 치료를 위해 일시적인 면역결핍을 유도할 경우 약 1011개 이상의 림프구가 제거되는데, 상기 방법으로는 하나의 암항원 특이적 CD8 T 세포를 109 개의 규모로 제공하는데 그친다. 이는 암세포의 면역회피 가능성 내지 면역결핍에 따른 부작용이 발생할 가능성을 높일 수 있어 이에 대한 해결책이 요구되는 실정이다.
이에 본 발명자들은 자가암항원에 반응하는 CD8 T 세포를 소량의 혈액에서 분리하여 단기간 내에 세포치료제에 적용할 수 있을 정도의 유의적인 수준으로 증폭하는 방법을 제공하고자 예의 노력한 결과, 자가암항원으로 말초혈액단핵구(PBMC)를 자극하는 경우 자가암항원 특이적 CD8 T 세포 이외에 다양한 암항원에 반응할 수 있는 CD8 T 세포가 함께 증식하고, 이를 CD71를 이용하여 분리해내는 경우 유의적인 항암효과를 제공할 수 있는 CD8 T 세포를 분리 및 증식시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 CD71을 이용하여 자가암항원 반응성 CD8 T 세포를 분리하는 방법 및 이의 응용을 제공하는 것이다.
본 발명은 a) 암 환자의 혈액 유래 PBMC에 자가암항원 유래 펩타이드를 첨가 및 배양한 후, 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식을 유도하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식 수준이 높은 자가암항원 유래 펩타이드를 선별하는 단계;
c) 상기 단계 b)에서 선별된 자가암항원 유래 펩타이드를 상기 단계 a)의 암 환자와 동일한 암 환자의 혈액 유래 PBMC에 첨가 및 배양하는 단계; 및
d) 상기 단계 c)의 배양된 PBMC에서 CD71+CD8+ T 세포를 분리하는 단계;
를 포함하는 자가암항원 반응성 CD8 T 세포 분리방법 및 상기 방법으로 분리된 자가암항원 반응성 CD8 T 세포를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 a)의 암은 위암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 뇌종양, 백혈병, 난소암 및 육종으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 a)의 자가암항원은 hTERT, WT-1, NY-ESO-1 및 MAGE-3 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 b)의 선별은 4-1BB를 발현하는 자가암항원 특이적 CD8 T 세포를 높게 발현하는 자가암항원 유래 펩타이드를 선별하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 c)의 암 환자의 혈액은 10 내지 100 ml 인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 c)의 배양은 12일 내지 17일 동안 수행하는 것이다.
본 발명은 또한, 상기 분리된 자가암항원 반응성 CD8 T 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, a) 암 환자의 혈액 유래 PBMC에 자가암항원 유래 펩타이드를 첨가 및 배양한 후, 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식을 유도하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식 수준이 높은 자가암항원 유래 펩타이드를 선별하는 단계;
c) 상기 단계 b)에서 선별된 자가암항원 유래 펩타이드를 상기 단계 a)의 암 환자와 동일한 암 환자의 혈액 유래 PBMC에 첨가 및 배양하는 단계;
d) 상기 단계 c)의 배양된 PBMC에서 CD71+CD8+ T 세포를 분리하는 단계; 및
e) 상기 단계 d)에서 분리된 CD71+CD8+ T 세포를 증폭하는 단계;
를 포함하는 항암 세포치료제용 조성물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 항암 세포치료제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 d)의 분리는 PBMC에서 CD71+CD8+ T 세포의 비율이 1 내지 25% 인 경우 수행하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 e)의 증폭은 12일 내지 17일 동안 수행하여 CD71+CD8+ T 세포가 109 내지 1011 개가 되도록 증폭하는 것이다.
본 발명의 분리방법을 이용하여 자가암항원 반응성 CD8 T 세포를 분리하는 경우 자가암항원에 특이적인 CD8 T 세포 이외에 다양한 암항원에 반응하는 CD8 T 세포도 함께 분리되므로, 보다 적은 혈액으로도 대량으로 CD8 T 세포수를 증폭시켜 유의적인 항암효과를 제공할 수 있다. 따라서 입양 세포 치료 등 치료를 위해 일시적인 면역결핍을 유도하는 면역치료 등에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 증식하는 Melan-A 특이적이고 방관자 활성화된 CD8+ T 세포에서 4-1BB 및 CD71 발현을 나타낸다.
도 2는 Melan-A 펩티드의 존재 하에 방관자 활성화에 의해 증식된 CD8+ T 세포는 인간-종양-반응성 CD8 + T 세포를 포함함을 나타낸다.
(A) 배양된 PBMC를 PE-conjugated Melan-A peptide/MHC class I multimer(pMelan) 및 anti-CD8-PE-Cy5로 염색 하였다. 게이팅된 CD8+ 세포를 CFSE 대 pMelan으로 플롯팅하고 표시된 CD8+ T 세포를 유세포분석한 결과를 나타낸다. (B-C) pMelan+ CD8 T(R1), CFSE-pMelan-CD8 T(R2) 및 CFSE+ CD8 T(R3) 세포의 3 가지 상이한 CD8+ T 세포를 rapid expansion method를 사용하여 증폭시켜 anti-CD8-PE-Cy5 및 anti-CD25-PE로 염색한 후 유세포분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 확장된 CD71+ CD8+ T 세포로 Melan-A+ 및 Melan-A- 흑색종 세포의 사멸을 나타낸다.
도 4는 hTERT 펩티드에 의해 활성화된 CD8+ T 세포에서 4-1BB 및 CD71의 발현을 나타낸다. 빨간 점선 박스는 더 높은 백분율의 4-1BB+CD8+ T 세포를 포함하는 PBMC를 의미하며, 상기 PBMC는 최종적으로 CD71+CD8+ T 세포를 분류하는데 사용하였다.
도 5는 분류된 CD71+ CD8+ T 세포의 확장 및 이의 표현형을 나타낸다. (A)선택된 PBMC를 풀링하고 CD71+CD8+ T 세포를 유세포분석한 결과를 나타낸다. (B)분류된 CD71+ CD8+ T 세포를 rapid expansion method을 사용하여 증식시켜, 5×105 세포는 13 일 이내에 >1×109 세포가 되었다. (C)확장된 CD8+ T 세포를 anti-CD8-PE-Cy5와 함께 PE-접합된 anti-CD45RA, anti-CD45RO, anti-CD57 또는 anti-PD-1로 염색하였다. (D)확장된 CD8 T 세포를 Anexin V-FITC 및 PI로 염색하여 이의 생존력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 CD71+ CD8+ T 세포는 WT1 펩티드-특이적 CD8 + T 세포를 포함하는 것을 나타낸다.
도 7의 (A)HLA-A*0201 대립 유전자를 갖는 건강한 지원자의 PBMC로부터 Melan-A CTL 펩티드를 이용하여 Melan-A-양성 또는 음성 CD8+ T 세포를 분리하였다. (B)확장된 pMelan+ 및 pMelan-CD8+ T 세포를 상이한 비율로 혼합하고, pMelan-CD8+ T 세포를 자동 세포 분류기(Tyto)를 사용하여 5106 개의 세포 혼합물로부터 분류 및 계수하여 유세포분석하였다. (C) (B)의 결과로부터 pMelan+ CD8+ T 세포의 순도 및 회수율(recovery rate)을 계산한 결과를 나타낸다.
도 8은 암 환자의 혈액으로부터 hTERT-특이적 CD8 T 세포를 포함하는 종양-반응성 CD8 T 세포를 생산하기 위한 작업 흐름을 나타낸다.
도 2는 Melan-A 펩티드의 존재 하에 방관자 활성화에 의해 증식된 CD8+ T 세포는 인간-종양-반응성 CD8 + T 세포를 포함함을 나타낸다.
(A) 배양된 PBMC를 PE-conjugated Melan-A peptide/MHC class I multimer(pMelan) 및 anti-CD8-PE-Cy5로 염색 하였다. 게이팅된 CD8+ 세포를 CFSE 대 pMelan으로 플롯팅하고 표시된 CD8+ T 세포를 유세포분석한 결과를 나타낸다. (B-C) pMelan+ CD8 T(R1), CFSE-pMelan-CD8 T(R2) 및 CFSE+ CD8 T(R3) 세포의 3 가지 상이한 CD8+ T 세포를 rapid expansion method를 사용하여 증폭시켜 anti-CD8-PE-Cy5 및 anti-CD25-PE로 염색한 후 유세포분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 확장된 CD71+ CD8+ T 세포로 Melan-A+ 및 Melan-A- 흑색종 세포의 사멸을 나타낸다.
도 4는 hTERT 펩티드에 의해 활성화된 CD8+ T 세포에서 4-1BB 및 CD71의 발현을 나타낸다. 빨간 점선 박스는 더 높은 백분율의 4-1BB+CD8+ T 세포를 포함하는 PBMC를 의미하며, 상기 PBMC는 최종적으로 CD71+CD8+ T 세포를 분류하는데 사용하였다.
도 5는 분류된 CD71+ CD8+ T 세포의 확장 및 이의 표현형을 나타낸다. (A)선택된 PBMC를 풀링하고 CD71+CD8+ T 세포를 유세포분석한 결과를 나타낸다. (B)분류된 CD71+ CD8+ T 세포를 rapid expansion method을 사용하여 증식시켜, 5×105 세포는 13 일 이내에 >1×109 세포가 되었다. (C)확장된 CD8+ T 세포를 anti-CD8-PE-Cy5와 함께 PE-접합된 anti-CD45RA, anti-CD45RO, anti-CD57 또는 anti-PD-1로 염색하였다. (D)확장된 CD8 T 세포를 Anexin V-FITC 및 PI로 염색하여 이의 생존력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 CD71+ CD8+ T 세포는 WT1 펩티드-특이적 CD8 + T 세포를 포함하는 것을 나타낸다.
도 7의 (A)HLA-A*0201 대립 유전자를 갖는 건강한 지원자의 PBMC로부터 Melan-A CTL 펩티드를 이용하여 Melan-A-양성 또는 음성 CD8+ T 세포를 분리하였다. (B)확장된 pMelan+ 및 pMelan-CD8+ T 세포를 상이한 비율로 혼합하고, pMelan-CD8+ T 세포를 자동 세포 분류기(Tyto)를 사용하여 5106 개의 세포 혼합물로부터 분류 및 계수하여 유세포분석하였다. (C) (B)의 결과로부터 pMelan+ CD8+ T 세포의 순도 및 회수율(recovery rate)을 계산한 결과를 나타낸다.
도 8은 암 환자의 혈액으로부터 hTERT-특이적 CD8 T 세포를 포함하는 종양-반응성 CD8 T 세포를 생산하기 위한 작업 흐름을 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 ‘자가암항원 반응성 CD8 T 세포’는, 자가암항원을 포함하여 다양한 암항원에 반응할 수 있는 CD8 T 세포를 의미한다.
본 발명의 ‘방관자 활성화(bystander activation)’는 특정 항원에 대한 면역반응 동안 다른 항원에 특이적인 T 세포가 활성화되는 것을 의미한다.
본 발명의 ‘세포치료제’는 개체로부터 분리, 배양 또는 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로, 치료, 진단 또는 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 또는 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
상기 기재한 바와 같이, 기존 세포치료시 사용되는 CD8 T 세포 증폭방법은 세포치료를 위해 유도된 면역 결핍을 회복하기에는 증폭되는 CD8 T 세포의 양이 부족하고, 하나의 암항원에만 특이적으로 반응하는 경우가 많아 유의적인 항암효과를 얻기에는 부족하였다.
본 발명의 자가암항원 반응성 CD8 T 세포 분리방법을 사용하는 경우, 50 내지 100 ㎖의 암환자 혈액으로부터 약 25일간의 배양과정을 통해 >1010 개의 항암 CD8 T 세포를 배양할 수 있으므로, CD8 T 세포의 항암효과를 높이기 위해 항암제 투여를 통해 grade 3-4 수준의 림프구감소증(lymphopenia)이 발생하여 대량의 림프구가 제거되어도 이를 보완할 수 있는 수준으로 투여 가능한 항암 CD8 T 세포를 생산할 수 있다.
hTERT 및 WT1은 대표적인 자가암항원으로 건강한 사람의 체내에서는 극히 낮은 비율로 존재하여 증식이 어려우나, 암환자는 hTERT를 포함하여 다양한 암항원에 대한 CD8 T 세포반응이 활성화되어 있어 건강한 사람과는 다르게 hTERT와 같은 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식 및 분리가 가능하다. 다만, 자가암항원으로부터 유래된 펩타이드를 이용하여 항암 CD8 T 세포를 배양하는 과정은, 암환자의 체내에 이들 세포가 충분히 높은 비율로 존재할 경우에만 배양이 가능하다.
본 발명은 CD71+CD8 T 세포 분리를 통해, CD8 T 세포 증식에 사용한 hTERT 또는 WT1 펩타이드 특이적 CD8 T 세포뿐 아니라, 암환자 스스로 암세포의 증식에 대응하여 지속적으로 높여온 자가암항원 특이적 CD8 T 세포 중 일부를 방관자 활성화(bystander activation)를 통해 증식 및 분리할 수 있다. 따라서 최종 배양된 항암 CD8 T 세포들은 hTERT 또는 WT1와 함께 암환자가 스스로 증식시킨 또 다른 암항원 특이적 CD8 T 세포들을 포함하고 있으므로 매우 우수한 항암효과를 유발할 수 있다.
따라서, 본 발명은 a) 암 환자의 혈액 유래 PBMC에 자가암항원 유래 펩타이드를 첨가 및 배양한 후, 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식을 유도하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식 수준이 높은 자가암항원 유래 펩타이드를 선별하는 단계;
c) 상기 단계 b)에서 선별된 자가암항원 유래 펩타이드를 상기 단계 a)의 암 환자와 동일한 암 환자의 혈액 유래 PBMC에 첨가 및 배양하는 단계; 및
d) 상기 단계 c)의 배양된 PBMC에서 CD71+CD8+ T 세포를 분리하는 단계;
를 포함하는 자가암항원 반응성 CD8 T 세포 분리방법 및 상기 분리방법으로 분리된 자가암항원 반응성 CD8 T 세포를 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 a)의 암은 위암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 뇌종양, 백혈병, 난소암 및 육종으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 a)의 자가암항원은 hTERT, WT-1, NY-ESO-1 및 MAGE-3 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 hTERT 및 WT-1 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 자가암항원 유래 펩타이드는 hTERT, WT-1, NY-ESO-1 및 MAGE-3 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 자가암항원에서 유래된 펩타이드일 수 있으나, 바람직하게는 hTERT 또는 WT-1에서 유래된 펩타이드일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 2 내지 서열번호 59의 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 b)의 선별은 4-1BB를 발현하는 자가암항원 특이적 CD8 T 세포를 높게 발현하는 자가암항원 유래 펩타이드를 선별하는 것일 수 있다. 구체적으로, 전체 CD8 T 세포 중 4-1BB를 발현하는 CD8 T 세포의 비율이 10% 이상인 자가암항원 유래 펩타이드를 선별하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 c)의 암 환자의 혈액은 10 내지 100 ㎖ 인 것일 수 있다. 바람직하게는 암 환자의 혈액은 20 내지 80 ㎖인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 30 내지 50 ㎖인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 c)의 배양은 12일 내지 17일 동안 수행하는 것일 수 있다. 바람직하게는 13일 내지 16일 동안 수행하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 14일 내지 15일 동안 수행하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 분리된 자가암항원 반응성 CD8 T 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또한,a) 암 환자의 혈액 유래 PBMC에 자가암항원 유래 펩타이드를 첨가 및 배양한 후, 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식을 유도하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식 수준이 높은 자가암항원 유래 펩타이드를 선별하는 단계;
c) 상기 단계 b)에서 선별된 자가암항원 유래 펩타이드를 상기 단계 a)의 암 환자와 동일한 암 환자의 혈액 유래 PBMC에 첨가 및 배양하는 단계;
d) 상기 단계 c)의 배양된 PBMC에서 CD71+CD8+ T 세포를 분리하는 단계; 및
e) 상기 단계 d)에서 분리된 CD71+CD8+ T 세포를 증폭하는 단계;
를 포함하는 항암 세포치료제용 조성물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 항암 세포치료제용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 d)의 분리는 PBMC에서 CD71+CD8+ T 세포의 비율이 1 내지 25% 인 경우 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 비율이 4 내지 25% 인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10 내지 25%인 것이 바람직하다. PBMC에서 CD71+CD8+ T 세포의 비율이 10% 를 초과하는 경우, PBMC에서 분리되는 CD71+CD8+ T 세포의 순도와 유사한 수준의 회수율(recovery rate)를 안정적으로 얻을 수 있다(실시예 6).
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 단계 e)의 증폭은 12일 내지 17일 동안 수행하여 CD71+CD8+ T 세포가 109 내지 1011 개가 되도록 증폭하는 것이다. 상기 단계 e)의 증폭은 바람직하게 13일 내지 16일 동안 수행하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 14일 내지 15일 동안 수행하는 것일 수 있다. 상기 CD71+CD8+ T 세포가 바람직하게 109 내지 1010 개가 되도록 증폭하는 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
CD8 T 세포에서 CD71 발현 측정
자가항원인 Melan-A 특이적 CD8 T 세포를 이용하여 CD8 T 세포 증식용 펩타이드에 의해 증식하는 CD8 T 세포들이 CD71을 발현하는지 증명하고자 하였다. 모든 혈액 샘플은 HLA-A*02 대립형질(allele)을 가지고 있으며, HLA-A0201/Melan-A26-35(서열번호 1: ELAGIGILTV) multimer(pentamer) 양성인 CD8 T 세포를 가진 건강한 자원자로부터 연구에 대한 서면동의 후 제공 받았다.
구체적으로, Melan-A26-35 특이적 CD8 T 세포는 Melan-A 항원의 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphoycte, CTL) 에피토프인 Melan-A26-35(서열번호 1: ELAGIGILTV) 펩타이드를 이용하여 증식유도 하였다. 상기 건강한 자원자(Donor #1 및 #2)의 혈액을 10㎖ BD Vacutainer Heparin Tube(BD Bioscience)에 채혈하였다. 채혈한 혈액으로부터 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)를 분리하기 위해 15㎖ conical tube에 5㎖ Ficoll-Paque(GE Healthcare) 첨가한 후, 채혈된 혈액 10㎖을 Ficoll 용액 상층에 천천히 분주하였다. 800×g, no brake, 20분간 원심분리한 후, 맨 상층의 혈장은 수거하여 0.2 μM syringe filter로 여과시켜 자가혈장으로 사용하였으며, PBMC 들은 수거하여 RPMI1640 배지로 2회 세척하여 배양에 사용하였다.
상기 분리한 PBMC를 10 μM CFSE(CellTrace CFSE Cell Proliferation kit, Thermo Fisher)로 5분간 염색하였다. CFSE-labeled PBMC는 3% 자가혈장이 포함된 RPMI1640 배지에 1×106 cells/㎖ 농도로 현탁하였으며, 14㎖ 둥근 원심관(round tube, BD Bioscience)에 1㎖씩 분주하였다. 각 튜브에 2㎍/㎖ 농도로 상기 Melan-A26-35 펩타이드를 2 ㎍/㎖ 농도로 첨가한 후, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 이틀째, 100 IU/㎖ IL-2와 3% 자가혈장이 포함된 RPMI1640 배지를 1㎖씩 각 튜브에 첨가하였다. 배양 7, 9, 11 또는 13일째에 각 튜브에서 1㎖ 배지를 제거한 후, 100 IU/㎖ IL-2와 3% 자가혈장이 포함된 새로운 RPMI1640 배지를 1㎖ 첨가하여 14일 동안 배양하였다. 배양 7, 9, 11 또는 14일에 튜브의 PBMC를 수거하여 RPMI1640 배지로 1회 세척한 후, anti-CD8-PE-Cy5와 함께 pMelan-PE, anti-4-1BB-PE, 또는 anti-CD71-PE 항체로 염색하여 FACSCalibur(BD Bioscience)로 유세포분석하였다.
그 결과, [도 1]에서 나타나는 바와 같이, 배양 7일째 대부분의 pMelan+CD8 T 세포들은 9회 이상 세포분열이 발생하여 CFSE-negative 상태가 되었으며, 동시에 방관자 활성화(bystander activation)된 CFSE-pMelan-CD8 T 세포들도 높은 비율로 발견되었다. Donor #1은 pMelan+CD8 T 세포의 비율이 높게 검출된 자원자로 CD8 T 세포의 증식율 역시 높게 나타났으며, Donor #2는 pMelan+CD8 T 세포의 비율이 낮게 검출된 자원자로 pMelan+CD8 T 세포의 증식율이 낮게 나타났다. 배양 11일까지 pMelan+CD8 T 세포의 비율이 꾸준히 증가하였지만, 배양 14일에는 부분적으로 감소하는 것으로 확인되었다(도 1의 왼쪽). 배양 7일째, 증식 중인 CFSE-CD8 T 세포 중 일부에서 4-1BB의 발현이 검출되었지만, 9일 이후에는 검출되지 않았다(도 1의 중간). CD8 T 세포의 증식이 진행되어 CFSE 형광 값이 감소할수록 CD71의 발현이 증가하는 것으로 나타났으며, 배양 14일째 9-10회 이상 증식한 CD8 T 세포 대부분이 CD71을 발현하고 있는 것으로 확인되었다(도 1의 오른쪽).
상기 결과는 Melan-A 펩타이드 특이적 및 비특이적으로 증식한 CD8 T 세포 대부분이 CD71을 발현하고 있음을 의미하는 것으로 판단하였다.
Melan-A 유래 CTL 펩타이드에 의한 CD8 T 세포 활성화
상기 <실시예 1>에서 확인된 방관자 활성화(Bystander activation)를 통해 증식한 CD8 T 세포들이 흑색종을 인식할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>의 배양된 PBMC들을 모두 수거하여 pMelan-PE와 anti-CD8-PE-Cy5로 염색한 후, FACSAria(BD Bioscience)를 이용하여 gated CD8 T 세포 중 pMelan+CD8 T(R1), CFSE-pMelan-CD8 T(R2) 및 CFSE+CD8 T(R3) 세포를 각각 분리하였다. 분리된 세 종류의 CD8 T 세포는 rapid expansion method를 이용하여 14일간 배양하여 >109 수준으로 대량증식시켰다. 50㎖ ALyS505N(CSTI, Japan) 배지에 최종 분리된 CD8 T 세포 5×105 개, 1×108 irradiated allogeneic PBMCs, 40ng/㎖ anti-human CD3 mAb, 1,000 IU/㎖ rhIL-2, 및 3% 자가혈장을 혼합한 후, 배양 4일째 50㎖, 7일째 100㎖, 배양 9일째 300㎖, 11일에 500㎖ 첨가하여 1L culture bag(Nipro, Japan)에 주입하여 14 일간 배양하였다. 최종 배양된 CD8 T 세포 2×106 개와 사람 흑색종 세포주인 SK-Mel-5 2×105 개(10:1)를 24 well culture plate에 분주한 후 100 IU/㎖ rhIL-2와 3% 자가혈장이 포함된 상태에서 24시간 배양하였으며, 음성대조군으로는 SK-Mel-5 없이 CD8 T 세포만을 배양하였다. 배양 후 세포를 수거하여 anti-CD8-PE-Cy5와 anti-CD25-PE 항체로 염색 및 FACSCalibur(BD Bioscience)로 분석하여 SK-Mel-5에 의해 활성화된 CD8 T 세포의 비율을 결정하였다.
그 결과, [도 2]에서 나타나는 바와 같이, pMelan+CD8 T 세포의 증식과 함께 일부 pMelan-CD8 T 세포들이 방관자 활성화를 통해 함께 증식함을 확인할 수 있었다(도 2의 A). pMelan+CD8 T (R1), CFSE-pMelan-CD8 T (R2) 및 CFSE+CD8 T (R3) 세포만을 24시간 배양할 경우, 활성 마커인 CD25의 발현은 3-5%대로 낮은 수준을 유지하였다. 그러나 HLA-A*02+ SK-Mel-5 세포와 CD8 T 세포를 하루 동안 공동배양한 경우, pMelan+CD8 T 세포는 빠르게 활성화되어 CD25를 발현하는 세포의 비율이 60% 수준으로 나타났다. 따라서 HLA-A*02+ SK-Mel-5 세포는 정상적으로 Melan-A 펩타이드를 MHC class I에 탑재하여 세포표면에 나열함으로써, CD8 T 세포의 활성을 유도할 수 있는 것으로 판단하였다. 동시에 R2 및 R3에 해당되는 CD8 T 세포 중에도 SK-Mel-5와의 공동배양 후 CD25 발현이 증가하였으며, non-dividing CD8 T 세포인 CFSE+CD8 T 세포 보다는 CFSE-pMelan-CD8 T 세포에 SK-Mel-5에 반응하는 세포의 비율이 높은 것을 확인할 수 있었다(도 2의 C).
상기 결과는 Melan-A 펩타이드의 방관자 활성화 효과에 의해 증식한 CD8 T 세포에는 암항원 특이적 CD8 T 세포가 높은 비율로 포함되어 있음을 의미하는 것으로 판단하였다.
CD71
+
CD8
+
T 세포의 암세포 제거능력 확인
HLA-A*0201-제한 Melan-A-특이적 CD8+ T 세포를 가지고 있는 건강한 자원자의 PBMC에 Melan-A CTL 펩타이드를 첨가하여 14일간 배양한 후 CD71+CD8+ 및 4-1BB+CD8+ T 세포를 분리하여 대량배양한 후, Melan-A-양성인 SK-Mel-5 세포주와 Melan-A-음성인 A375 세포주와 공동배양하여 암세포 제거능력을 비교하고자 하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 배양한 PBMC에서, 배양 14일째 CD71+CD8+ T 세포를 cell sorter(FACSAria, BD Bioscience)로 분리하였다. 4-1BB+CD8+ T 세포의 경우, 배양 14일째 세포를 수거하여 RPMI1640 배지로 두 번 세척한 후, 2×106 cells/㎖로 CTL media에 세포 현탁하여 12 well culture plate에 분주하였으며, 동일한 Melan-A CTL 펩타이드를 5 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 하루 동안 재자극하여 4-1BB+CD8+ T 세포를 분리하였다. 분리된 4-1BB+CD8+ T 및 CD71+CD8+ T 세포는 rapid expansion method를 통해 14일간 대량배양하였다.
HLA-A*0201 대립형질을 가지고 있으며 Melan-A-양성 SK-Mel-5 세포주 또는 Melan-A-음성 A375 세포주를 10 μM CFSE로 5분간 염색하여 형광표지한 후 RPMI1640 배지로 세척하여 표적세포를 준비하였다. 1×105 개의 형광표지된 SK-Mel-5 또는 A375 세포주와 상기 최종 배양된 4-1BB+CD8+ T 및 CD71+CD8+ T 세포를 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1 또는 5배 비율로 혼합하였으며, 100 IU/㎖ rhIL-2와 3% 자가혈장이 포함된 CTL 배지 상태로 6시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양. 배양 완료 후 세포를 annexin-PE로 염색하여 유세포분석 하여 사멸되는 세포의 비율을 분석하였다.
그 결과, [도 3]에서 나타나는 바와 같이 Melan-A-특이적 CD8 T 세포만을 포함하고 있는 4-1BB+CD8+ T 세포는 Melan-A+ SK-Mel-5 세포주만을 선택적으로 제거하였으며, Melan-A-특이적 CD8 T 세포와 함께 방관자 활성화된 CD8 T 세포를 포함하고 있는 CD71+CD8+ T 세포의 경우 Melan-A+ SK-Mel-5 세포주뿐 아니라, Melan-A- A375 세포주를 모두 제거하는 것을 확인할 수 있었다.
hTERT 유래 CTL 펩타이드에 의한 CD8 T 세포 활성화
암환자의 PBMC에서도 hTERT로부터 유래된 CTL 펩타이드들을 이용하여 hTERT 특이적 및 방관자 활성화(bystander activation) 된 CD8 T 세포들을 증식할 수 있는지 조사하고자 하였다.
| 명칭 | 서열 | 서열목록 |
| hTERT 1 | AAFRALVAQCL | 서열번호 2 |
| hTERT 2 | CLKELVARV | 서열번호 3 |
| hTERT 3 | LAFGFALL | 서열번호 4 |
| hTERT 4 | VGDDVLVH | 서열번호 5 |
| hTERT 5 | FVLVAPSCA | 서열번호 6 |
| hTERT 6 | GAATQARP | 서열번호 7 |
| hTERT 7 | SGTRHSH | 서열번호 8 |
| hTERT 8 | KEQLRPSFLLSSLRPSL | 서열번호 9 |
| hTERT 9 | PLFLELL | 서열번호 10 |
| hTERT 10 | AAVTPAA | 서열번호 11 |
| hTERT 11 | QSIGIRQ | 서열번호 12 |
| hTERT 12 | IVNMDYV | 서열번호 13 |
| hTERT 13 | RPGLLGASV | 서열번호 14 |
| hTERT 14 | TLTDLQP | 서열번호 15 |
| hTERT 15 | LLCSLCYG | 서열번호 16 |
| hTERT 16 | LVRGVPEYGCVVNLR | 서열번호 17 |
| hTERT 17 | YSSYARTSIRASL | 서열번호 18 |
| hTERT 18 | IYKILLLQAY | 서열번호 19 |
| hTERT 19 | LGAKGAA | 서열번호 20 |
| hTERT 20 | YVPLLGSL | 서열번호 21 |
| hTERT 21 | QTQLSRKLP | 서열번호 22 |
| hTERT 22 | ALEAAANPAL | 서열번호 23 |
| hTERT 23 | ILAKFLHWL | 서열번호 24 |
| hTERT 24 | RLVDDFLLV | 서열번호 25 |
| hTERT 25 | EARPALLTSRLRFIPK | 서열번호 26 |
| hTERT 26 | RLFFYRKSV | 서열번호 27 |
| hTERT 27 | YLFFYRKSV | 서열번호 28 |
| hTERT 28 | DLQVNSLQTV | 서열번호 29 |
| hTERT 29 | YLQVNSLQTV | 서열번호 30 |
| hTERT 30 | GLLGASVLGL | 서열번호 31 |
| hTERT 31 | ALLTSRLRFI | 서열번호 32 |
| hTERT 32 | RLTSRVKAL | 서열번호 33 |
| hTERT 33 | TYVPLLGSL | 서열번호 34 |
| hTERT 34 | CYGDMENKL | 서열번호 35 |
| hTERT 35 | AYQVCGPP | 서열번호 36 |
| hTERT 36 | VYGFVRACL | 서열번호 37 |
| hTERT 37 | VYAETKHFL | 서열번호 38 |
| hTERT 38 | DYVVGARTF | 서열번호 39 |
구체적으로, 표준치료에 불응하여 재발한 폐암환자의 30㎖ 혈액으로부터 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 분리한 PBMC를 상기 [표 1]의 38 종류의 hTERT로부터 유래된 CTL 펩타이드와 함께 14일간 배양하였다. 배양 14일째 동일한 펩타이드로 하루 동안 재자극하였으며, 배양 15일째 각 튜브의 PBMC 중 일부를 anti-4-1BB-PE 또는 anti-CD71-PE와 anti-CD8-PE-Cy5로 염색하였다. 유세포분석을 통해 4-1BB+CD8+ T 세포를 포함하고 있으며, 동시에 CD71+CD8+ T 세포의 비율이 높게 나타나는 hTERT 펩타이드들을 선별하였다. 선별된 튜브의 PBMC들을 풀링(pooling)한 후, CD71+CD8+ T 세포를 FACSAria를 이용하여 분리하고, 분리된 CD8 T 세포는 상기 rapid expansion method를 이용하여 14일간 대량배양하였으며, 최종 배양된 CD8 T 세포는 ani-CD45RA, anti-CD45RO, anti-CD57 또는 anti-PD-1 항체를 이용하여 표현형을 분석하였다.
또한, 이와는 별도로 최종 선별한 8개 튜브의 PBMC들을 풀링하였으며, FACSAria를 이용하여 CD71+CD8+ T 세포 분리하여 anexin V-FITC와 PI로 염색하여 세포의 생존률을 결정하였다(도 5의 A).
그 결과, [도 4]에서 나타나는 바와 같이 다양한 hTERT 펩타이드 자극에 의해 4-1BB+CD8 T 세포가 증가함을 확인할 수 있었다.
4-1BB+CD8+ T 세포는 첨가된 펩타이드에 특이적으로 활성화된 CD8 T 세포임을 기존 연구를 통해 규명하였으며, 선별된 튜브의 PBMC(빨간 점선 박스)들은 4-1BB 뿐 아니라 더 높은 비율로 CD71을 발현하고 있어, 첨가된 hTERT 펩타이드 특이적 및 방관자 활성화된 CD8 T 세포를 포함하고 있는 것으로 판단하였다.
또한, [도 5]의 B에서 나타나는 바와 같이 분리된 CD71+CD8+ T 세포를 rapid expansion method를 이용하여 14일간 대량증식시켰을 때, 14일 내에 5×105 세포가 1-3×109 세포로 증식하였다. 최종 증식시킨 CD8 T 세포들은 CD45RA-CD45RO+로 memory type의 세포이고, CD57을 발현하는 노화된 세포의 비율은 15% 이내이며, PD-1을 발현하는 고갈성(exhausted) CD8 T 세포의 비율은 10% 이내인 것으로 확인하였다(도 5의 C). Anexin V와 PI 염색을 통해 세포 생존율을 측정하였을 때, 사멸된 세포의 비율은 5% 이내인 것으로 확인하였다(도 5의 D).
상기 결과는 암환자의 혈액 내에 존재하는 PBMC 내에 hTERT 특이적 CD8 T 세포가 존재할 경우, 이들의 증식과 함께 방관자 활성화된 CD8 T 세포가 증가하며, CD71을 이용하여 hTERT 특이적 CD8 T 세포와 함께 hTERT 펩타이드에 의해 방관자 활성화된 CD8 T 세포를 분리 및 대량배양하는 것이 가능함을 의미하는 것으로 판단하였다.
WT1 유래 CTL 펩타이드에 의한 CD8 T 세포 활성화
hTERT의 경우와 유사하게 WT1 암항원으로부터 유래된 CTL 펩타이드들을 이용하여 암환자의 PBMC로부터 WT1 특이적 및 방관자 활성화(bystander activation)된 CD8 T 세포들을 증식시킬 수 있는지 조사하고자 하였다.
| 명칭 | 서열 | 서열목록 |
| WT1 1 | ALLPAVPSL | 서열번호 40 |
| WT1 2 | DLNALLPAV | 서열번호 41 |
| WT1 3 | SLGEQQYSV | 서열번호 42 |
| WT1 4 | RMFPNAPYL | 서열번호 43 |
| WT1 5 | GVFRGIQDV | 서열번호 44 |
| WT1 6 | CMTWNQMNL | 서열번호 45 |
| WT1 7 | SGQFTGTAGA | 서열번호 46 |
| WT1 8 | VLDFAPPGA | 서열번호 47 |
| WT1 9 | AYPGCNKRYF | 서열번호 48 |
| WT1 10 | QYRIHTHGVF | 서열번호 49 |
| WT1 11 | AFTVHFSGQF | 서열번호 50 |
| WT1 12 | RWPSCQKKF | 서열번호 51 |
| WT1 13 | RVPGVAPTL | 서열번호 52 |
| WT1 14 | DFKDCERRF | 서열번호 53 |
| WT1 15 | RTPYSSDNL | 서열번호 54 |
| WT1 16 | TSEKPFSCR | 서열번호 55 |
| WT1 17 | FSRSDQLKR | 서열번호 56 |
| WT1 18 | LSHLQMHSR | 서열번호 57 |
| WT1 19 | YMFPNAPYL | 서열번호 58 |
| WT1 20 | CYTWNQMNL | 서열번호 59 |
구체적으로, 상기 <실시예 4> 와 동일한 방법으로 연구에 서면동의한 난소암환자의 혈액으로부터 분리한 PBMC를 상기 [표 2]의 WT1 아미노산 서열로부터 유래된 20종류의 CTL 펩타이드들과 함께 14일 동안 배양하고, 배양 14일째 동일한 펩타이드로 하루동안 재자극하였다. 배양 15일째 각 튜브의 PBMC를 anti-4-1BB-PE 또는 anti-CD71-PE와 anti-CD8-PE-Cy5로 염색하고 유세포분석을 통해 4-1BB+CD8+ T 세포를 포함하고 있으며, 동시에 CD71+CD8+ T 세포의 비율 분석하였다.
그 결과, [도 6]에서 나타나는 바와 같이 다양한 WT1 펩타이드 자극에 의해 4-1BB+CD8 T 세포가 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, 배양 15일째 CD8 T 세포만을 gating하여 CD71 및 4-1BB의 발현을 유세포분석 결과, 4-1BB와 CD71의 발현이 비례적인 4-1BB+CD71+CD8 T 세포가 대부분인 경우(red), 4-1BB+CD71+CD8 T 세포를 포함하여 방관자 활성화된 4-1BB-CD71+CD8 T 세포가 상대적으로 다수 포함된 경우(yellow), 방관자 활성화된 4-1BB-CD71+CD8 T 세포가 대부분인 경우(blue)가 관찰됨으로써, 난소암 환자의 상태와 WT1 펩타이드의 종류에 따라 WT1 펩타이드-특이적 CD8 T 세포의 증식과 함께 방관자 활성화된 CD8 T 세포의 증식이 서로 다르게 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
자동세포분리기를 이용한 항원 특이적 CD8 T 세포 분리
항원 특이적 CD8+ T 세포를 무균상태에서 고순도로 분리하기 위해, 자동세포분리기를 이용한 분리 과정 확립하고자 하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 자가항원인 Melan-A 특이적 CD8 T 세포를 가지고 있는 HLA-A*0201 양성 자원자로부터 혈액을 채혈하여 PBMC를 분리한 후, melan-A CTL 펩타이드를 첨가하여 14일간 펩타이드-특이적 CD8 T 세포로 1차 증식시켰다. 1차 배양된 PBMC를 PE-conjugated Melan-A peptide/MHC class I multimer(pMelan)와 anti-CD8-PE-Cy5로 염색하였으며, Melan-A-specific(pMelan+) 및 Melan-A-nonspecific(pMelan-) CD8+ T 세포를 cell sorter (BD Bioscience, FACSAria)를 이용하여 분리하였다. 분리된 pMelan+CD8+ T 세포와 pMelan-CD8+ T 세포는 각각 rapid expansion method에 의해 14일간 대량증식시켰다(도 7의 A). 최종 배양된 pMelan+CD8+ T 세포와 pMelan-CD8+ T 세포를 다양한 비율로 혼합하여 pMelan+CD8+ T 세포의 비율을 조절하였으며, 이들을 무균상태로 자동세포분리가 가능한 Tyto(Miltenyi Biotec)를 이용하여 pMelan+CD8+ T 세포를 분리함으로써, pMelan+CD8+ T 세포의 비율에 따라 최종 분리되는 pMelan+CD8+ T 세포의 순도 recovery rate를 결정하였다.
그 결과, [도 7]의 B에서 나타나는 바와 같이 최종 배양된 pMelan+CD8+ T 세포와 pMelan-CD8+ T 세포는 각각 63%와 3% 수준으로 확인되었다.
또한, pMelan+CD8+ T 세포와 pMelan-CD8+ T 세포를 다양한 비율로 혼합하여 pMelan+CD8+ T 세포의 비율이 3 내지 20% 되도록한 후, Tyto를 이용하여 분리된 pMelan+CD8+ T 세포의 순도를 재확인한 결과, pMelan+CD8+ T 세포의 비율이 높은 샘플일수록 분리된 세포내 pMelan+CD8+ T 세포의 비율이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 5×106 cells/㎖ 조건으로 pMelan+CD8+ T 세포를 분리한 후, 소팅전 샘플에 포함된 pMelan+CD8+ T 세포의 숫자와 최종분리된 pMelan+CD8+ T 세포의 총 숫자를 비교하여 recovery rate를 결정하였다. 분석결과 소팅 전 샘플내 pMelan+CD8+ T 세포의 비율이 4% 이상일 경우 안정적으로 40% 이상의 세포가 세포분리 후 회수되는 것으로 나타났다(도 7의 C).
종합적으로, >65% purity, >40% recovery rate를 표적세포 분리를 위한 최소 기준으로 고려할 경우, 세포분리 전 CD71+CD8+ T 세포의 비율이 약 4% 이상이 되어야 하는 것으로 판단하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> NATIONAL CANCER CENTER
<120> Method for isolation of autologous cancer antigen-specific CD8 T
cell by using CD71 and uses thereof
<130> 1065682
<160> 59
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HLA-A0201/Melan-A26-35
<400> 1
Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 1
<400> 2
Ala Ala Phe Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 2
<400> 3
Cys Leu Lys Glu Leu Val Ala Arg Val
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 3
<400> 4
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 4
<400> 5
Val Gly Asp Asp Val Leu Val His
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 5
<400> 6
Phe Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 6
<400> 7
Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 7
<400> 8
Ser Gly Thr Arg His Ser His
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 8
<400> 9
Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser
1 5 10 15
Leu
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 9
<400> 10
Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 10
<400> 11
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 11
<400> 12
Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 12
<400> 13
Ile Val Asn Met Asp Tyr Val
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 13
<400> 14
Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val
1 5
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 14
<400> 15
Thr Leu Thr Asp Leu Gln Pro
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 15
<400> 16
Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly
1 5
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 16
<400> 17
Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val Val Asn Leu Arg
1 5 10 15
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 17
<400> 18
Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 18
<400> 19
Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln Ala Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 19
<400> 20
Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 20
<400> 21
Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 21
<400> 22
Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro
1 5
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 22
<400> 23
Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu
1 5 10
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 23
<400> 24
Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 24
<400> 25
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val
1 5
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 25
<400> 26
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys
1 5 10 15
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 26
<400> 27
Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 27
<400> 28
Tyr Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val
1 5
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 28
<400> 29
Asp Leu Gln Val Asn Ser Leu Gln Thr Val
1 5 10
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 29
<400> 30
Tyr Leu Gln Val Asn Ser Leu Gln Thr Val
1 5 10
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 30
<400> 31
Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 31
<400> 32
Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
1 5 10
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 32
<400> 33
Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 33
<400> 34
Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 34
<400> 35
Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn Lys Leu
1 5
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 35
<400> 36
Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 36
<400> 37
Val Tyr Gly Phe Val Arg Ala Cys Leu
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 37
<400> 38
Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hTERT 38
<400> 39
Asp Tyr Val Val Gly Ala Arg Thr Phe
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 1
<400> 40
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 2
<400> 41
Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 3
<400> 42
Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 4
<400> 43
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 5
<400> 44
Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 6
<400> 45
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 7
<400> 46
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 8
<400> 47
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
1 5
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 9
<400> 48
Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe
1 5 10
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 10
<400> 49
Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
1 5 10
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 11
<400> 50
Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe
1 5 10
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 12
<400> 51
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe
1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 13
<400> 52
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 14
<400> 53
Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 15
<400> 54
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 16
<400> 55
Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 17
<400> 56
Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 18
<400> 57
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 19
<400> 58
Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> WT1 20
<400> 59
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
Claims (12)
- a) 암 환자의 혈액 유래 PBMC에 자가암항원 유래 펩타이드를 첨가 및 배양한 후, 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식을 유도하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식 수준이 높은 자가암항원 유래 펩타이드를 선별하는 단계;
c) 상기 단계 b)에서 선별된 자가암항원 유래 펩타이드를 상기 단계 a)의 암 환자와 동일한 암 환자의 혈액 유래 PBMC에 첨가 및 배양하는 단계; 및
d) 상기 단계 c)의 배양된 PBMC에서 CD71+CD8+ T 세포를 분리하는 단계;
를 포함하는 자가암항원 반응성 CD8 T 세포 분리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 a)의 암은 위암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 뇌종양, 백혈병, 난소암 및 육종으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 자가암항원 반응성 CD8 T 세포 분리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 a)의 자가암항원은 hTERT, WT-1, NY-ESO-1 및 MAGE-3 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 자가암항원 반응성 CD8 T 세포 분리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 선별은 4-1BB를 발현하는 자가암항원 특이적 CD8 T 세포를 높게 발현하는 자가암항원 유래 펩타이드를 선별하는 것을 특징으로 하는 자가암항원 반응성 CD8 T 세포 분리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 암 환자의 혈액은 10 내지 100 ㎖ 인 것을 특징으로 하는 자가암항원 반응성 CD8 T 세포 분리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 배양은 12일 내지 17일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 자가암항원 반응성 CD8 T 세포 분리방법.
- 제1항의 방법으로 분리된 자가암항원 반응성 CD8 T 세포.
- 제7항의 자가암항원 반응성 CD8 T 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- a) 암 환자의 혈액 유래 PBMC에 자가암항원 유래 펩타이드를 첨가 및 배양한 후, 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식을 유도하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식 수준이 높은 자가암항원 유래 펩타이드를 선별하는 단계;
c) 상기 단계 b)에서 선별된 자가암항원 유래 펩타이드를 상기 단계 a)의 암 환자와 동일한 암 환자의 혈액 유래 PBMC에 첨가 및 배양하는 단계;
d) 상기 단계 c)의 배양된 PBMC에서 CD71+CD8+ T 세포를 분리하는 단계; 및
e) 상기 단계 d)에서 분리된 CD71+CD8+ T 세포를 증폭하는 단계;
를 포함하는 항암 세포치료제용 조성물의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 단계 d)의 분리는 PBMC에서 CD71+CD8+ T 세포의 비율이 1 내지 25% 인 경우 수행하는 것을 특징으로 하는 항암 세포치료제용 조성물의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 단계 e)의 증폭은 12일 내지 17일 동안 수행하여 CD71+CD8+ T 세포가 109 내지 1011 개가 되도록 증폭하는 것을 특징으로 하는 항암 세포치료제용 조성물의 제조방법.
- 제9항의 제조방법으로 제조된 항암 세포치료제용 조성물.
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