TW202300522A - 編碼對抗乙醯膽鹼受體自體抗體之嵌合受體之基因 - Google Patents

編碼對抗乙醯膽鹼受體自體抗體之嵌合受體之基因 Download PDF

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長崎智香子
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Abstract

本發明提供一種於重症肌無力症之治療中有用的嵌合受體多肽，其係：包含抗人類菸鹼性乙醯膽鹼受體α1次單元(nAChRα1)抗體可結合的抗原區域的細胞外域、跨細胞膜區域、及包含細胞內訊息傳遞區域的細胞內域，從N末端向C末端依上述順序配置而成的嵌合受體多肽(此處，該抗原區域之胺基酸序列為包含序列識別號2記載之胺基酸序列的區域、或者為包含在序列識別號2記載之胺基酸序列中有一個或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加成的胺基酸序列的區域)；編碼該嵌合受體多肽的多核苷酸、表現該嵌合受體多肽的細胞等。

Description

編碼對抗乙醯膽鹼受體自體抗體之嵌合受體之基因
本發明係關於特異性辨識對菸鹼性乙醯膽鹼受體的自體抗體的嵌合受體多肽、編碼該多肽的多核苷酸、經基因導入有該多核苷酸的細胞、使用該細胞治療自體免疫疾病(特別是重症肌無力症)用的醫療用組成物、治療方法、檢查方法、其用途等。
眾所周知使用使辨識癌細胞特異性抗原的嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Recepter：CAR)表現的T細胞(CAR-T細胞)，而特異性攻擊表現該抗原的癌細胞的細胞治療對於癌治療為有效。又，亦嘗試進行以同樣的途徑將表現自體抗體的病原性B細胞作為標的，藉由使用使特異性辨識該自體抗體的嵌合自體抗體受體(Chimeric AutoAntibody Recepter：CAAR)表現的T細胞(CAAR-T細胞)進行攻擊，而用以治療自體免疫疾病(專利文獻1：WO2016/070061)。
嵌合受體為大致包含：包含對標的分子的結合區域的細胞外域、跨細胞膜區域、及在細胞內傳達刺激的細胞內域之三個區域的分子。使嵌合受體表現的基因修飾T細胞藉由嵌合受體與標的分子結合，而對T細胞傳達活性化刺激，並對表現標的分子的細胞發揮傷害活性(非專利文獻1：Stoiber et al, Cells. 2019 May 17；8(5)：472)。
為了取得表現此種活性的T細胞，有必要設計於T細胞表面上有充分量表現(非專利文獻2：Fujiwara et al, Cells 2020, 9(5), 1182)且具有可表現傷害活性的立體結構及於細胞表面的分布的嵌合受體(非專利文獻1：Stoiber et al, Cells. 2019 May 17；8(5)：472)。作為類似之治療法，使用了單株抗體的抗體醫藥被廣泛採用。單株抗體係基於細胞天然產生的抗體而設計者，在細胞的表現方法已被確立。又，由於是分泌性蛋白質，例如即使每一細胞的表現量少，亦可藉由大規模製造而取得治療所必要的抗體。另一方面，嵌合受體為完全人工性地設計的分子。又，由於在細胞膜上表現，對於其活性而言每一細胞的表現量、在細胞表面的分布等之要素為重要的。如此，乍見時，或許好像一旦確定標的分子時則可容易地製作表現所冀望的嵌合受體的基因修飾細胞，但實際上在製作產生功能性細胞上伴隨著極大困難，有必要對每個各別嵌合受體進行大量的反復試驗和顯著别出心裁的創意。
對於以自體免疫疾病為對象的CAAR-T細胞療法，已有報告關於以對人類Dsg3的自體抗體為原因的尋常性天疱瘡之治療(非專利文獻3：Ellebrecht et al, Science 08 Jul 2016：Vol. 353, Issue 6295, pp. 179-184)。根據此報告，已記載從尋常性天疱瘡患者之血清，辨識為Dsg3的細胞外域的EC1、EC2、EC3、EC4及EC5的自體抗體被檢測出並設計採用作為抗原區域之EC1-EC3、EC1-EC4及EC1-EC5的3種類CAAR，採用EC1-EC3或EC1-EC4的CAAR觀察到良好的細胞表面表現，並顯示適當活性，另一方面，以EC1-EC5作為抗原區域的CAAR於細胞表面的表現有差異，活性亦不充分。
已知對抗菸鹼性乙醯膽鹼受體α1次單元(以下表示為「nAChRα1」或「AChRα」)的自體抗體使存在於神經肌肉接合部的突觸後膜的乙醯膽鹼受體分子減少，並誘發導致肌力減少或易疲勞性或呼吸障礙的重症肌無力症(MG)(非專利文獻4：Luo et al, J Mol Neurosci. 2010 Jan；40(1-2)：217-20；非專利文獻5：Luo et al, J Neurosci. 2009 Nov 4；29(44)：13898-908)。尤其，對於稱為主要免疫原區(Main Immunogenic Region)的區域的自體抗體佔源自患者的自體抗體的一分以上，亦與疾病分數相關，將抗MIR抗體移入至大鼠時，於大鼠誘發MG(Makino et al, PLoS One. 2017 Oct 17；12(10)：e0185976.)。作為MG之治療方法，利用類固醇療法藥或免疫抑制藥的誘導緩解(remission induction)為基本。然而，不僅完全緩解率低至15%以下，而且此等藥劑成為各式各樣的副作用的原因，而顯著阻礙QOL。又，對於類固醇抗藥性的難治例或重症例，雖免疫球蛋白大劑量靜脈注射療法(IVIg)或血液淨化療法顯示一定的有效性，但效果為一時性的，成為醫療現場及患者的沉重負擔。近年來，雖已批准抗補體C5抗體(依庫珠單抗(eculizumab))用於利用此等治療法的症狀管理為困難的情形，但因有腦膜炎雙球菌(meningococcus)感染症的發病風險升高等之合併症，使用門檻高(非專利文獻6：Sanders et al, Neurology. (2016) 87(4), 419-425)。因此，對於重症肌無力症之治療，現狀仍然冀求有效的治療法。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2016/070061 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Stoiber et al, Cells. 2019 May 17；8(5)：472 [非專利文獻2]Fujiwara et al, Cells 2020, 9(5), 1182 [非專利文獻3]Ellebrecht et al, Science 08 Jul 2016：Vol. 353, Issue 6295, pp. 179-184 [非專利文獻4]Luo et al, J Mol Neurosci. 2010 Jan；40(1-2)：217-20 [非專利文獻5]Luo et al, J Neurosci. 2009 Nov 4；29(44)：13898-908. [非專利文獻6]Sanders et al, Neurology. (2016) 87(4), 419-425
[發明欲解決之課題]
本發明之目的係提供一種已導入嵌合受體基因的基因修飾T細胞，主要作用為B細胞及漿細胞的去除，與於對重症肌無力症等之藉由特異性辨識菸鹼性乙醯膽鹼受體α次單元的病原性抗體(自體抗體)之自體組織攻擊所引起的自體免疫疾病的細胞治療為有效的自體抗體產生有關連。為了取得發揮此種功能性T細胞，有必要設計轉殖基因使得T細胞表面上表現充分量的嵌合受體，且可保持適當立體結構用以使細胞膜上的嵌合受體活性表現。
首先，與自體免疫疾病有關連的自體抗體因辨識具有天然立體結構的抗原，而冀望功能性嵌合受體之抗原區域成為接近天然的立體結構。於細胞上使期望的蛋白質表現一定量的情形，若為天然之I型1次跨膜蛋白質，雖可參考天然基因資訊而製作嵌合受體，但如乙醯膽鹼受體之以複數個次單元構成的分子中，即使單獨僅以一個次單元而表現為嵌合受體，亦極難形成與活體內相同的立體結構，為了取得功能性嵌合受體，對於無數的檢討事項一開始有必要反復試驗。又，作為CAAR-T細胞之功能表現上，每個細胞有必要於細胞表面上存在一定數量以上的嵌合受體。若為分泌性蛋白質，雖亦有藉由製造規模的擴大而可解決的情形，但控制細胞膜上的表現量為非常困難的課題。
又，即使目的之受體於細胞表面上表現，為了對標的細胞適當地傳達傷害活性訊息，有必要保持與標的分子的特異性結合用的結合域之立體結構、可於細胞內適當傳達標的分子與結合域的結合資訊的分子全體之立體結構，一般而言，與配置作為結合域之scFv的癌區域之CAR不同，於CAAR中作為標的之每一BCR/自體抗體中結合域的結構因差異極大，因此無法參考另外的CAAR之例，而有必要依據標的而從頭開始進行檢討。 [用以解決課題之手段]
本發明人等為了解決上述課題而不斷潛心研究的結果，發現藉由採用於nAChRα1之細胞外域中導入了胺基酸突變的胺基酸序列作為嵌合受體之結合子區域而在細胞膜上表現，及此種結合子區域與各式各樣的連接子及細胞內域組合的嵌合受體適當地於細胞膜上表現，發揮出細胞傷害活性，藉由進一步進行研究，遂而完成本發明。
本發明提供以下之發明。 [1]一種嵌合受體多肽，其係：包含抗人類菸鹼性乙醯膽鹼受體α1次單元(nAChRα1)抗體可結合的抗原區域的細胞外域、跨細胞膜區域、及包含細胞內訊息傳遞區域的細胞內域，從N末端向C末端依上述順序配置而成的嵌合受體多肽；此處，該抗原區域之胺基酸序列為包含序列識別號2記載之胺基酸序列的區域、或者為包含在序列識別號2記載之胺基酸序列中有一個或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加成的胺基酸序列的區域。 [2]如[1]之多肽，其中抗原區域為包含下列的區域：在序列識別號2記載之胺基酸序列中，可有序列識別號3之Xaa所表示的胺基酸之至少一者被取代，作為進一步追加修飾之於序列識別號3之Xaa所表示的胺基酸以外的位置可有一個或數個胺基酸被刪除、插入及/或加成的胺基酸序列。 [3]如[2]之多肽，其中追加修飾為序列識別號2之N末端及/或C末端中的1～5個胺基酸的刪除或加成。 [4]如[2]或[3]之多肽，其中在序列識別號3之胺基酸序列中，各Xaa為以下所示的胺基酸； Xaa8為疏水性胺基酸或酸性胺基酸， Xaa14為酸性胺基酸或疏水性胺基酸， Xaa70為酸性胺基酸、在側鏈具有醯胺基的胺基酸或疏水性胺基酸， Xaa72為疏水性胺基酸， Xaa112為疏水性胺基酸， Xaa149為親水性胺基酸、疏水性胺基酸， Xaa155為疏水性胺基酸或親水性胺基酸， Xaa146～Xaa148、Xaa150～Xaa154及Xaa156～Xaa159之胺基酸各自獨立為鹼性胺基酸或疏水性胺基酸， Xaa192及Xaa193各自獨立為Cys或Gly。 [於上述，疏水性胺基酸為Val、Ala、Leu、Ile、Gly、Trp、Tyr、Phe、Met或Pro，親水性胺基酸為Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln或Ser，酸性胺基酸為Asp或Glu，鹼性胺基酸為Arg或Lys，在側鏈具有醯胺基的胺基酸為Asn或Gln。] [5]如[4]之多肽，其中在序列識別號3之胺基酸序列中，各Xaa為以下所示的胺基酸； Xaa8為Val或Glu， Xaa14為Asp、Ala或Gly， Xaa70為Asp、Asn或Ala， Xaa72為Tyr或Phe， Xaa112為Tyr或Phe， Xaa149為Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro， Xaa155為Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro， Xaa146～Xaa148、Xaa150～Xaa154及Xaa156～Xaa159之胺基酸各自獨立為序列識別號2中的對應部位的胺基酸或Lys， Xaa192及Xaa193各自獨立為Cys或Gly。 [6]如[5]之多肽，其中在序列識別號3之胺基酸序列中，Xaa149為Trp、Lys、Arg或Pro，Xaa155為Val、Ala、Gly、Lys、Arg、Pro、Met、Asp、Asn、Glu、Gln或Ser。 [7]如[6]之多肽，其中在序列識別號3之胺基酸序列中，Xaa149及Xaa155為Lys或Arg。 [8]如[1]之多肽，其中抗原區域為選自以下之群組中的任一者： 抗原區域：AChRα211、AChRα211/V8E、AChRα211/W149R、AChRα211/W149K、AChRα211/ W149P、AChRα211/V155A、AChRα211/V155K、AChRα211/V155M、AChRα211/V155D、AChRα211/ V155P、AChRα211/C192G、AChRα211/C193G、AChRα211/C192G/C193G、 AChRα211/V8E/W149R、AChRα211/V8E/W149K、AChRα211/V8E/W149P、AChRα211/V8E/V155A、AChRα211/V8E/V155K、AChRα211/V8E/V155M、AChRα211/V8E/V155D、AChRα211/V8E/ V155P、AChRα211/V8E/C192G、AChRα211/V8E/C193G、AChRα211/V8E/C192G/C193G、 AChRα211/W149R/V155A、AChRα211/W149R/ V155K、AChRα211/W149R/V155M、AChRα211/ W149R/V155D、AChRα211/W149R/V155P、AChRα211/ W149R/C192G、AChRα211/W149R/C193G、AChRα211/ W149R/C192G/C193G、 AChRα211/W149K/V155A、AChRα211/W149K/ 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W149R/V155P、AChRα211/D14A/W149R/V155G、AChRα211/D14A/W149K/V155K、AChRα211/D14A/ W149K/V155A、AChRα211/D14A/W149K/V155M、AChRα211/ D14A/W149K/V155D、AChRα211/D14A/ W149K/V155P、AChRα211/D14A/W149K/V155G、AChRα211/D14A/W149P/V155K、AChRα211/D14A/ W149P/V155A、AChRα211/D14A/W149P/V155M、AChRα211/D14A/W149P/V155D、AChRα211/D14A/ W149P/V155P、或、AChRα211/D14A/W149P/V155G [於上述，AChRα211為序列識別號2記載之胺基酸序列，AChRα211之各突變序列表示序列識別號2中對應的胺基酸被右側表示的胺基酸取代的胺基酸序列]。 [9]如[1]～[8]中任一項之多肽，其中細胞內訊息傳遞區域為源自CD3ζ或CD3δ之細胞內域的序列。 [10]如[1]～[8]中任一項之多肽，其中跨細胞膜區域為源自選自nAChRα1、T細胞受體α或β鏈、CD3ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR中的任一者之分子的跨細胞膜區域的胺基酸序列。 [11]如[1]～[10]中任一項之多肽，其中於細胞內域，在細胞內訊息傳遞區域之N末端側進一步包含1～3個之共刺激區域。 [12]如[11]之多肽，其中共刺激區域為源自選自包含CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137(4-1BB)、ICOS、CD154、CITR、TNFR2、DR3、CD30、HVEM、CD27及OX40之群組中的1～3種之分子的細胞內區域的序列。 [13]如[1]～[12]中任一項之多肽，其中於抗原區域和跨細胞膜區域之間進一步含有由100個以下之胺基酸而成的連接子區域。 [14]如[13]之多肽，其中連接子區域為序列識別號5、39、40或41記載之胺基酸序列的一部分或全部。 [15]如[1]之多肽，其中抗原區域為AChRα211/W149R/V155K、AChRα211/W149R/V155A、AChRα211/W149R/V155M、AChRα211/W149R/V155D、AChRα211/W149R/V155P、AChRα211/W149R/V155G、AChRα211/W149K/V155K、AChRα211/W149K/V155A、AChRα211/W149K/V155M、AChRα211/W149K/V155D、AChRα211/W149K/V155P、AChRα211/W149K/V155G、AChRα211/W149P/V155K、AChRα211/W149P/V155A、AChRα211/W149P/V155M、AChRα211/W149P/V155D、AChRα211/W149P/V155P、或、AChRα211/W149P/ V155G、AChRα211/D14G/W149R/V155K、AChRα211/ D14G/W149R/V155A、AChRα211/D14G/W149R/ V155M、AChRα211/D14G/W149R/V155D、AChRα211/ D14G/W149R/V155P、AChRα211/D14G/W149R/ V155G、AChRα211/D14G/W149K/V155K、AChRα211/ D14G/W149K/V155A、AChRα211/D14G/W149K/ V155M、AChRα211/ D14G/W149K/V155D、AChRα211/ D14G/W149K/V155P、AChRα211/D14G/W149K/V155G、AChRα211/ D14G/W149P/V155K、AChRα211/D14G/W149P/V155A、AChRα211/D14G/W149P/V155M、AChRα211/D14G/ W149P/V155D、AChRα211/D14G/W149P/V155P、AChRα211/D14G/W149P/V155G、AChRα211/D14A/ W149R/V155K、AChRα211/D14A/W149R/V155A、AChRα211/D14A/W149R/V155M、AChRα211/D14A/ W149R/V155D、AChRα211/D14A/W149R/V155P、AChRα211/D14A/W149R/V155G、AChRα211/D14A/ W149K/V155K、AChRα211/D14A/W149K/V155A、AChRα211/D14A/W149K/V155M、AChRα211/ D14A/ W149K/V155D、AChRα211/D14A/W149K/V155P、AChRα211/D14A/W149K/V155G、AChRα211/D14A/ W149P/V155K、AChRα211/D14A/W149P/V155A、AChRα211/D14A/W149P/V155M、AChRα211/D14A/ W149P/V155D、AChRα211/D14A/W149P/V155P、或、AChRα211/D14A/W149P/V155G(此處，上述之AChRα211突變體的胺基酸序列係於序列識別號42中Xaa14、Xaa149及Xaa155分別為記載於各突變體名稱的D14、W149及V155的右側的胺基酸的胺基酸序列))，連接子區域為CD8α鉸鏈序列(序列識別號39)、CD28鉸鏈序列(序列識別號40)、或人工連接子序列(序列識別號41)的一部分或全部，跨膜區域為CD8α跨膜區域(序列識別號6)、CD28跨膜區域(序列識別號37)或AChRα跨膜區域(序列識別號38)，共刺激區域為4-1BB共刺激區域(序列識別號7)、CD28共刺激區域(序列識別號25)、GITR共刺激區域(序列識別號26)、TNFR2共刺激區域(序列識別號27)、DR3共刺激區域(序列識別號28)、CD30共刺激區域(序列識別號29)、HVEM共刺激區域(序列識別號30)、CD27共刺激區域(序列識別號31)、或、OX40共刺激區域(序列識別號32)，細胞內訊息傳遞區域為CD3ζ細胞內訊息傳遞區域(序列識別號8)。 [16]如[15]之多肽，其中抗原區域為AChRα211/W149R/V155K(於序列識別號42中Xaa14為Asp、Xaa149為Arg、Xaa155為Lys的胺基酸序列)或AChRα211/W149R/V155A(於序列識別號42中Xaa14為Asp、Xaa149為Arg、Xaa155為Ala的胺基酸序列)、AChRα211/D14G/W149R/V155K(於序列識別號42中Xaa14為Gly、Xaa149為Arg、Xaa155為Lys的胺基酸序列)或AChRα211/D14G/W149R/V155A(於序列識別號42中Xaa14為Gly、Xaa149為Arg、Xaa155為Ala的胺基酸序列)， 連接子區域為CD8α鉸鏈序列(序列識別號39)、從其C末端連續的14個胺基酸(由序列識別號39之第32～45號的胺基酸所構成的胺基酸序列)、人工連接子序列(序列識別號41)或、從其C末端連續的4個胺基酸(由序列識別號41之第11～14號的胺基酸所構成的胺基酸序列)， 跨膜區域為CD8α跨膜區域(序列識別號6)， 共刺激區域為4-1BB共刺激區域(序列識別號7)或OX40共刺激區域(序列識別號32)， 細胞內訊息傳遞區域為CD3ζ細胞內訊息傳遞區域(序列識別號8)。 [17]一種多肽，其係由包含用以使於細胞表面上表現的訊息肽之胺基酸序列及與序列識別號43～47之任一者的胺基酸序列顯示80%以上的序列同一性的嵌合受體之胺基酸序列的胺基酸序列而成的多肽。 [18]如[17]之多肽，其中嵌合受體之胺基酸序列為序列識別號43～47之任一者的胺基酸序列。 [19]一種多核苷酸，其編碼如[1]～[18]中任一項之多肽。 [20]一種載體，其保持如[19]之多核苷酸。 [21]如[20]之載體，其為選自質體載體、反轉錄病毒載體及慢病毒載體之任一者。 [22]如[20]或[21]之載體，其被設計成可表現如[1]～[18]中任一項之多肽。 [23]如[20]或[21]之載體，其為被設計成可產生已封入編碼如[1]～[18]中任一項之多肽的多核苷酸的病毒載體的形態的質體載體。 [24]一種細胞，其經基因導入有如[19]之多核苷酸。 [25]如[24]之細胞，其特徵為在細胞表面上表現如[1]～[18]中任一項之多肽。 [26]如[24]或[25]之細胞，其中細胞為選自T細胞、PBMC、iPS細胞及ES細胞中的任一者。 [27]一種醫藥，其用以治療伴隨產生對抗乙醯膽鹼受體α次單元的自體抗體的疾病，其含有如[24]～[26]中任一項之細胞作為有效成分。 [28]如[27]之醫藥，其中疾病為重症肌無力症。 [29]一種重症肌無力症之治療方法，其包含對治療對象投予治療有效量之如[24]～[26]中任一項之細胞的步驟。 [30]一種如[24]～[26]中任一項之細胞之用途，其係用於重症肌無力症之治療藥的製造。 [發明之效果]
本發明之表現嵌合受體的T細胞因具有對表現對重症肌無力症患者體內之nAChRα1的自體抗體的病原性B細胞的細胞傷害活性，而對重症肌無力症患者具有治療效果。
[用以實施發明的形態]
以下，對於本發明進行詳細地說明。
＜用語＞ 於本說明書，「多肽」係指2個以上之胺基酸通過肽鍵以指定序列連結的分子，其胺基酸序列包含具有特定特性、功能的胺基酸區域、域、肽或蛋白質的胺基酸序列。以與「蛋白質」、「肽」、「寡肽」等之用語相同意義使用。「單離的多肽」、「單離的蛋白質」以與活體內存在的蛋白質區分的目的而使用。未必一定要進行作為蛋白質物理上所進行的分離及純化，亦包含於細胞的培養環境、組織樣品中存在的蛋白質。又，藉由重組DNA技術所生產的情形，意指細胞材料或培養培養基，或經化學合成的情形，係指實質上不包含化學前驅物或其它化學物質的多肽。
於本說明書，「嵌合受體」意指在自體免疫疾病領域中使用的功能為嵌合自體抗體受體的蛋白質，亦稱為CAAR。CAAR為具有從N末端向C末端配置下列3個區域的結構的蛋白質：包含成為自體免疫疾病的原因的可與對抗自體抗原的抗體(自體抗體)結合的抗原區域的細胞外域、跨細胞膜區域、及包含細胞內訊息傳遞區域的細胞內域。於抗原區域的N末端可進一步結合訊息肽序列。於細胞外域，抗原區域和跨膜區域之間可有連接子區域存在。又，於細胞內域，於細胞內訊息傳遞域的N末端側可有細胞內共刺激區域存在。於CAAR所包含的各個區域之間，可透過由0～10個胺基酸所構成的任意間隔區(spacer)而結合。
於本說明書，細胞外域為嵌合受體在細胞上表現的情形時通常其大部分存在於細胞外的域(domain)，沒有必要該域所包含的全部胺基酸都存在於細胞外，依採用的序列及其周邊胺基酸序列，亦有採用相當於細胞外域的序列之C末端側的一部分埋入於細胞膜內的結構的情形。
於本說明書，跨細胞膜區域為嵌合受體在細胞上表現的情形時通常其大部分存在於細胞膜中的區域，沒有必要該區域所包含的全部胺基酸都存在於細胞膜中，依採用的序列及其周邊胺基酸序列，亦有採用相當於跨細胞膜區域的序列之N末端的一部分存在於細胞外、及/或C末端側的一部分存在於細胞內的結構的情形。
於本說明書，細胞內域為嵌合受體在細胞上表現的情形時通常其大部分存在於細胞內的域，沒有必要該域所包含的全部胺基酸都存在於細胞內，依採用的序列及其周邊胺基酸序列，亦有採用相當於細胞內域的序列之N末端側的一部分包埋於細胞膜內的結構的情形。
本發明之嵌合受體可適用基本上於癌症治療領域周知的嵌合抗原受體(CAR)-T細胞中適用的各種技術。就與CAR-T細胞之製作有關的文獻而言，可參照例如，Uckun et al., 2011, Brit. J. Hematol., 153：15-23；US 2012/0141505；以及美國專利第5,484,892、5,573,924、6,379,668、7,744,877、8,362,211、9,023,999、8,822,647、9,328,156、及9,034,324號等。
嵌合受體之抗原區域具有下列功能：具有以成為標的的自體免疫疾病之原因的自體抗原(於本發明中為nAChRα1)的至少一部分為模板的結構，與於產生標的之自體抗體的病原性B細胞及/或漿細胞上表現的B細胞受體(BCR)特異性結合，並將其結合訊息向細胞內訊息傳遞區域傳送的功能。
於本說明書，「nAChRα1」意指人類菸鹼性乙醯膽鹼受體α1次單元或其細胞外域。未特別言及的情形，有使用為包含下述記載之突變型nAChRα1的總稱的情形，亦有意指以天然型的nAChRα1的形態使用的情形。在將由236個胺基酸所構成的天然型nAChRα1細胞外(序列識別號1)與後述之缺失型nAChRα1加以區分的情形下，有使用「AChRα236」的用語。
於本說明書，「缺失型nAChRα1」或「AChRα211」意指於AChRα236之胺基酸序列，從N末端第59～84號的區域有缺失的具有序列識別號2記載之胺基酸序列的nAChRα1。於缺失型nAChRα1中可取代的胺基酸部位以Xaa表示的胺基酸序列示於序列識別號3。又，於AChRα236，序列識別號3之對應Xaa的部位以Xaa表示的胺基酸序列示於序列識別號4(突變型AChRα236)。
於本說明書，「病原性B細胞」意指產生自體抗體的B細胞、漿細胞及/或漿母細胞，該自體抗體辨識成為自體免疫疾病之原因的自體抗原。在此種病原性B細胞的細胞表面，與產生的自體抗體結合，或表現具有與該抗體共通的抗原結合特異性的B細胞受體(BcR)。患者體內的病原性B細胞減少的情形，體內的自體抗體水平會降低，而治療了自體免疫疾病。
於本說明書，「胺基酸」包含全部的天然胺基酸以及修飾胺基酸。 「保存的胺基酸突變(variation)」係不損害其蛋白質的所欲功能或特性的胺基酸殘基被另外的胺基酸殘基取代者。此種關係的胺基酸係若為側鏈的屬於科學上的及/或空間的特性類似的胺基酸群的胺基酸，則可以彼此保存性地取代。此種胺基酸之性質於生物化學、分子生物學領域中被充分解析並為周知。
於本說明書，「疏水性胺基酸」指側鏈具有親水性低、或疏水性高的結構的胺基酸，就天然胺基酸而言，為Val、Ala、Leu、Ile、Gly、Trp、Tyr、Phe、Met或Pro。其中就具有體積大的結構的側鏈的疏水性胺基酸而言，可列舉Trp、Tyr、Phe等，就具有小的側鏈的疏水性胺基酸而言，可列舉Val、Ala、Leu、Ile、Gly等。
於本說明書，「親水性胺基酸」指側鏈具有親水性高的結構的胺基酸，就天然胺基酸而言，係指Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln或Ser。又，酸性胺基酸係指Asp或Glu。鹼性胺基酸為Arg或Lys。又，在側鏈具有醯胺基的胺基酸係指Asn或Gln。
於本說明書，「多核苷酸」意指由天然的鹼基、糖及糖間(主鏈)鍵而成的核苷或核苷酸單體按照指定鹼基序列而連結的核酸。又，於此用語亦包含含有非天然單體或其一部分而成的修飾或取代的核酸。本發明之多核苷酸可為去氧核醣核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或彼等之混合對，包含包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷及尿嘧啶的天然鹼基。又，此等之序列亦可含有修飾鹼基。於此種修飾鹼基之例，包含氮腺嘌呤及去氮腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷及尿嘧啶；及黃嘌呤及次黃嘌呤。
於本說明書，「經單離的核苷酸」於藉由重組DNA技術而生產的情形，意指細胞材料或培養培養基，或於化學合成的情形意指實質上不含化學前驅物或其他化學物質的核酸。又，經單離的核酸亦實質上不包含與源自其核酸的核酸天然上鄰接的序列(即，位於其核酸的5’末端及3’末端的序列)。用語「核酸」包含DNA及RNA，可為雙股或單股之任一者，相當於有義股或反義股。再者，用語「核酸」包含互補的核酸序列，例如cDNA。
於本說明書，「細胞」意指具有特定功能的細胞、或包含該細胞的細胞集團。於細胞，只要包含保持該細胞特性的細胞即可，可為從天然分離的含有細胞的樣品，亦可為混入不同細胞的細胞集團。可為依此種特定特性而分離、濃縮的試料，亦可為依該特性而分離、濃縮的細胞。就細胞而言，可例示例如，從活體採取的細胞(組織細胞、血液細胞、淋巴球、骨髓細胞等)、經株化的細胞、由於基因導入而接受基因修飾的細胞、間葉系幹細胞或造血幹細胞等之成體幹細胞(體性幹細胞)、ES細胞或iPS細胞等之多能性幹細胞、從成體幹細胞或多能性幹細胞人為性地分化誘導的細胞等，但未限定於此等。
於本說明書，「基因修飾細胞」意指有編碼嵌合受體的多核苷酸被基因導入的細胞。基因導入之方法並未特別限定，可適用基因工程、分子生物學領域中一般使用的各式各樣的方法。對象細胞未特別限定。對象細胞為T細胞的基因修飾細胞亦有稱為「CAAR-T細胞」、或「CAAR-T」的情形。 本發明之基因修飾細胞主要被投予或移植至自體免疫疾病之患者。使用於自體細胞治療的情形，細胞使用源自治療對象患者本人的細胞。使用於異體細胞治療的情形，只要可於不易遭受免疫排斥的異體治療所使用的細胞即可，其來源並未限制。細胞可為單一種細胞，亦可為複數細胞種混合存在的細胞集團。
於本說明書，「T細胞」意指具有於本技術領域中被分類為T細胞之生物學、分子生物學、形態構造或遺傳的特徵的細胞或包含此種細胞的細胞集團。就此種T細胞的特徵而言，可列舉例如有T細胞抗原受體(TCR)/CD3複合體等之表面標記表現等。又，不僅T細胞標記，而且其他個別之T細胞集團的標記(例如，CD4、CD8、TCR之亞型等)表現、具有個別之T細胞的功能的細胞集團亦使用作為T細胞。 就T細胞而言，可為包含作為T細胞標記陽性細胞而被分離、濃縮的細胞集團、於T細胞的活體材料(主要為血液或其加工材料)中未施予利用T細胞標記的分離/濃縮處理的細胞集團。就此種細胞集團而言，可列舉血液細胞、血球細胞、末梢血液單核細胞(PBMC)等。又，T細胞亦包含施予從成體幹細胞(造血幹細胞)或多能性幹細胞分化誘導為T細胞的處理的細胞集團。
於本說明書，「基因修飾T細胞」係意指上述之基因修飾細胞中，對象細胞為T細胞或包含T細胞的細胞集團。作為T細胞而施予分離、濃縮處理的情形，不僅T細胞標記，而且使用其他個別之T細胞集團的標記(例如，CD4、CD8等)，而賦予作為個別T細胞的功能的基因修飾T細胞亦包含於本發明中。
於本說明書，「治療」係指對疾病或症狀用以獲得健康上有益的或所冀望的結果的途徑。有益的或所冀望的結果並未被限定，不論是可以檢測或不能檢測，可包含1個以上之症狀或病態的緩和或改善、疾病程度的減輕、疾病狀態的穩定化(即，無惡化)、疾病擴散的防止、疾病進行的延遲或徐緩化、疾病狀態的改善或減輕、及緩解(部分或完全)。又，「治療」亦可意指與未接受治療的情形的預期生存期間相比而延長生存期間。「減輕」疾病或障礙意指與未治療障礙的情形相比，障礙或疾病狀態的程度及/或不欲的臨床表現減輕、以及/或進行的經過徐緩化或拉長。
於本說明書，「源自某分子或區域的胺基酸序列的胺基酸序列或區域」係意指包含以原始的分子或區域的序列為基礎而可有一個或複數個胺基酸突變的胺基酸序列，且保持該原始分子或區域的功能或活性為一定以上的序列。胺基酸突變的態樣並未限定，基於該原始的分子或區域之種類、功能、及序列，發明所屬技術領域中具有通常知識者藉由通常的反復試驗，對於維持此功能、活性而容許合理預測範圍內的突變。就此種突變之例而言，可例示保存的胺基酸取代、取代為具有類似功能或物理化學的性質的胺基酸、於功能或活性的貢獻度低的區域中的胺基酸的取代、缺失、插入或加成、該區域之N末端或C末端側的數個胺基酸中的胺基酸的取代、缺失、插入或加成等，但未限於此等。就突變的胺基酸個數而言，通常為15個以下，較佳為0個以下，更較佳為7個以下，更較佳為5、4、3、2或1個。
＜嵌合受體、多肽＞ 本發明之多肽可具有細胞外域並作為嵌合受體的功能，該細胞外域包含可結合抗nAChRα1抗體的抗原區域。抗原區域為包含於由236個胺基酸構成的天然型nAChRα1之細胞外域(序列識別號1：AChRα236)中由從N末端第59～83號的區域缺失的211個胺基酸所構成的缺失型nAChRα1細胞外域(序列識別號2：AChRα211)的區域、或者包含在序列識別號2記載之胺基酸序列中，有一個或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加成(有時皆稱為「突變」)的胺基酸序列的區域。
就於序列識別號2中成為取代的對象的胺基酸而言，可例示例如於序列識別號3或序列識別號42中以Xaa表示的胺基酸，但只要保持嵌合受體的功能即可，突變之對象部位並未限定於此等。
於本說明書，胺基酸之取代突變係分別以一個字母於序列識別號2中的對象胺基酸編號的左側標記原本的胺基酸，於右側標記突變後的胺基酸而表示的。又，包含複數個胺基酸突變的情形，將各自的突變的表示以「/」區隔而表示。例如，各自於序列識別號2中的8位之Val被取代為Glu，第149號的Trp被取代為Arg，第155號的Val被取代為Ala的抗原區域有表示為如「AChRα211/V8E/W149R/V155A」的情形。
因已確認序列識別號3之Xaa8的胺基酸為Val或Glu的情形有同時作為CAAR的功能，所以容許有各式各樣的胺基酸取代，但較佳為疏水性胺基酸或酸性胺基酸，更佳為具有小的側鏈的疏水性胺基酸或酸性胺基酸，進一步較佳為Val或Glu，最適者為Val。
因已確認序列識別號3或序列識別號42之Xaa14的胺基酸為Asp、Ala或Gly的情形有作為CAAR的功能，所以容許有各式各樣的胺基酸取代，但較佳為酸性胺基酸或疏水性胺基酸，更佳為酸性胺基酸或具有小的側鏈的疏水性胺基酸，進一步較佳為Asp、Ala或Gly。
因已確認序列識別號3之Xaa70的胺基酸為Asp、Asn或Ala的情形，有作為CAAR的功能，所以容許有各式各樣的胺基酸取代，但較佳為酸性胺基酸、在側鏈具有醯胺基的胺基酸或疏水性胺基酸，更佳為Asp、Asn或Ala。
因已確認序列識別號3之Xaa72的胺基酸為Tyr或Phe的情形，有作為CAAR的功能，所以容許有各式各樣的胺基酸取代，但較佳為疏水性胺基酸，更佳為具有體積大的側鏈的疏水性胺基酸，更佳為Tyr或Phe。
因已確認序列識別號3之Xaa112的胺基酸為Tyr或Phe的情形，有作為CAAR的功能，所以容許有各式各樣的胺基酸取代，但較佳為疏水性胺基酸，更佳為具有體積大的側鏈的疏水性胺基酸，更佳為Tyr或Phe。
因已確認序列識別號3或序列識別號42之Xaa149的胺基酸為Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro的情形，有作為CAAR的功能，所以容許有各式各樣的胺基酸取代，但較佳為親水性胺基酸、疏水性胺基酸，更佳為Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro，進一步較佳為Trp、Arg、Lys或Pro。
因已確認序列識別號3或序列識別號42之Xaa155的胺基酸為Val、Arg、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro的情形，有作為CAAR的功能，所以容許有各式各樣的胺基酸取代，但較佳為疏水性胺基酸或親水性胺基酸，更佳為Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro，進一步較佳為Val、Lys、Ala、Met、Asp、Pro或Gly。
序列識別號2之胺基酸編號146～159之區域為富含疏水性胺基酸的區域，但因已確認即使該區域之各自胺基酸被適宜取代為Lys的序列，亦有作為CAAR的功能，於序列識別號3之Xaa146～Xaa159的區域，Xaa149及Xaa155以外的胺基酸容許有各式各樣的胺基酸取代，但較佳為鹼性胺基酸或疏水性胺基酸，更佳為序列識別號2中對應部位的胺基酸或Lys。再者，就序列識別號3之Xaa146～Xaa159的區域的胺基酸序列之具體例而言，可例示序列識別號16～序列識別號23記載之序列。
序列識別號3之Xaa192及Xaa193即使從原序列的Cys取代為Gly的情形亦確認有作為CAAR的功能，所以容許有各式各樣的胺基酸取代。較佳各自獨立為Cys或Gly，進一步較佳為皆為Cys或Gly。
就本發明之嵌合受體的抗原區域之一個態樣而言，為一區域，其包含於序列識別號3中Xaa14為Asp、Ala或Gly，Xaa149為Trp、Arg、Lys或Pro，Xaa155為Lys、Ala、Met、Asp、Pro或Gly的胺基酸序列。 於此情形，其它之Xaa為由上述之記載所選擇的任一者之胺基酸，但為了與病原性B細胞結合，較佳為儘可能接近天然型nAChRα1的序列。因此，於序列識別號3中的Xaa14、Xaa149及Xaa155以外的Xaa中被取代的胺基酸的數目，較佳為10個以下，更佳為5個以下，進一步較佳為3、2或1個，最適者為0個(Xaa14、Xaa149及Xaa155以外的Xaa為序列識別號2中的對應的胺基酸。即序列識別號42之胺基酸序列)。序列識別號3中的Xaa149及Xaa155以外的Xaa被取代的情形，較佳為選自由Xaa8、Xaa70、Xaa72、Xaa192及Xaa193所組成的群組，更佳為選自由Xaa8、Xaa192及Xaa193所組成的。
就本發明之嵌合受體中所含的抗原區域之具體例而言，可列舉AChRα211、AChRα211/V8E、AChRα211/W149R、AChRα211/W149K、AChRα211/ W149P、AChRα211/V155A、AChRα211/V155K、AChRα211/ V155M、AChRα211/V155D、AChRα211/ V155P、AChRα211/C192G、AChRα211/C193G、AChRα211/C192G/C193G、 AChRα211/V8E/W149R、AChRα211/V8E/W149K、AChRα211/V8E/W149P、AChRα211/V8E/V155A、AChRα211/V8E/V155K、AChRα211/V8E/V155M、AChRα211/V8E/V155D、AChRα211/V8E/ V155P、AChRα211/V8E/C192G、AChRα211/V8E/C193G、AChRα211/V8E/C192G/C193G、 AChRα211/W149R/V155A、AChRα211/W149R/ V155K、AChRα211/W149R/V155M、AChRα211/W149R/ V155D、AChRα211/W149R/V155P、AChRα211/W149R/ C192G、AChRα211/W149R/C193G、AChRα211/W149R/ C192G/C193G、 AChRα211/W149K/V155A、AChRα211/W149K/ V155K、AChRα211/W149K/V155M、AChRα211/W149K/ V155D、AChRα211/W149K/V155P、AChRα211/W149K/ C192G、AChRα211/W149K/C193G、AChRα211/W149K/ C192G/C193G、 AChRα211/W149P/V155A、AChRα211/W149P/ V155K、AChRα211/W149P/V155M、AChRα211/W149P/ V155D、AChRα211/W149P/V155P、AChRα211/W149P/ C192G、AChRα211/W149P/C193G、AChRα211/W149P/ C192G/C193G、 AChRα211/V8E/W149R/V155A、AChRα211/V8E/ W149R/V155K、AChRα211/V8E/W149R/V155M、AChRα211/V8E/W149R/V155D、AChRα211/V8E/W149R/ V155P、AChRα211/V8E/W149R/C192G、AChRα211/ V8E/W149R/C193G、AChRα211/V8E/W149R/C192G/ C193G、 AChRα211/V8E/W149K/V155A、AChRα211/V8E/ W149K/V155K、AChRα211/V8E/W149K/V155M、AChRα211/V8E/W149K/V155D、AChRα211/V8E/ W149K/V155P、AChRα211/V8E/W149K/C192G、AChRα211/V8E/W149K/C193G、AChRα211/V8E/W149K/ C192G/C193G、 AChRα211/V8E/W149P/V155A、AChRα211/V8E/ W149P/V155K、AChRα211/V8E/W149P/V155M、AChRα211/V8E/W149P/V155D、AChRα211/V8E/ W149P/V155P、AChRα211/V8E/W149P/C192G、AChRα211/V8E/W149P/C193G、AChRα211/V8E/ W149P/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155A/ C192G、AChRα211/W149R/V155K/C192G、AChRα211/W149R/V155M/C192G、AChRα211/W149R/ V155D/C192G、AChRα211/W149R/V155P/C192G、 AChRα211/W149K/V155A/C192G、AChRα211/ W149K/V155K/C192G、AChRα211/W149K/V155M/ C192G、AChRα211/W149K/V155D/C192G、AChRα211/ W149K/V155P/C192G、 AChRα211/W149P/V155A/C192G、AChRα211/ W149P/V155K/C192G、AChRα211/W149P/V155M/ C192G、AChRα211/W149P/V155D/C192G、AChRα211/ W149P/V155P/C192G AChRα211/W149R/V155A/C193G、AChRα211/ W149R/V155K/C193G、AChRα211/W149R/V155M/ C193G、AChRα211/W149R/V155D/C193G、AChRα211/ W149R/V155P/C193G、 AChRα211/W149K/V155A/C193G、AChRα211/ W149K/V155K/C193G、AChRα211/W149K/V155M/ C193G、AChRα211/W149K/V155D/C193G、AChRα211/ W149K/V155P/C193G、 AChRα211/W149P/V155A/C193G、AChRα211/ W149P/V155K/C193G、AChRα211/W149P/V155M/ C193G、AChRα211/W149P/V155D/C193G、AChRα211/ W149P/V155P/C193G、AChRα211/W149R/ V155A/ C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155K/C192G/ C193G、AChRα211/W149R/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155D/C192G/C193G、AChRα211/ W149R/V155P/C192G/C193G、 AChRα211/W149K/V155A/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155K/C192G/C193G、AChRα211/ W149K/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149K/ V155D/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155P/ C192G/C193G、 AChRα211/W149P/V155A/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155K/C192G/C193G、AChRα211/ W149P/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149P/ V155D/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155P/ C192G/C193G、 AChRα211/D14G/W149R/V155K、AChRα211/ D14G/W149R/V155A、AChRα211/D14G/ W149R/V155M、AChRα211/D14G/W149R/V155D、AChRα211/D14G/W149R/V155P、AChRα211/D14G/ W149R/V155G、AChRα211/D14G/W149K/V155K、AChRα211/D14G/W149K/V155A、AChRα211/D14G/ W149K/V155M、AChRα211/ D14G/W149K/V155D、AChRα211/D14G/W149K/V155P、AChRα211/D14G/ W149K/V155G、AChRα211/D14G/W149P/V155K、AChRα211/D14G/W149P/V155A、AChRα211/D14G/ W149P/V155M、AChRα211/D14G/W149P/V155D、AChRα211/D14G/W149P/V155P、AChRα211/D14G/ W149P/V155G、AChRα211/D14A/W149R/V155K、AChRα211/D14A/W149R/V155A、AChRα211/D14A/ W149R/V155M、AChRα211/D14A/W149R/V155D、AChRα211/D14A/W149R/V155P、AChRα211/D14A/ W149R/V155G、AChRα211/D14A/W149K/V155K、AChRα211/D14A/W149K/V155A、AChRα211/D14A/ W149K/V155M、AChRα211/ D14A/W149K/V155D、AChRα211/D14A/W149K/V155P、AChRα211/D14A/ W149K/V155G、AChRα211/D14A/W149P/V155K、AChRα211/D14A/W149P/V155A、AChRα211/D14A/ W149P/V155M、AChRα211/D14A/W149P/V155D、AChRα211/D14A/W149P/V155P、及AChRα211/D14A/ W149P/V155G等。
本發明之嵌合受體所採用的抗原區域只要具有作為嵌合受體之表現於細胞膜上且被抗nACdRα1抗體辨識的功能即可，除了於序列識別號3中Xaa所表示的胺基酸的取代以外，可有一個或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加成(以下，稱為「追加修飾」)。此種追加修飾可施加於序列識別號2之任一位置，但較佳為從N末端及/或C末端起10個胺基酸以內的區域，更佳為5、4、3、2或1個胺基酸以內的部位。變更的胺基酸數目為10個以下，較佳為5、4、3、2或1個。作為抗原區域中的追加修飾的形態，較佳為於序列識別號2之N末端及/或C末端有10個以下的胺基酸缺失或加成，更佳為於C末端有5、4、3、2或1個胺基酸缺失或加成，進一步較佳為於C末端有5、4、3、2或1個胺基酸加成。
本發明之包含抗原區域的CAAR之對抗人類nAChRα1抗體的結合能力，可藉由後述之方法，以公知方法試驗抗nAChRα1抗體對於經基因導入有編碼CAAR的多核苷酸的細胞的結合而確認。就此種方法而言，可例示使用了抗nAChRα1抗體的FACS法、免疫染色法等。就使用的抗體而言，可使用市售之抗nAChRα1抗體、或包含如此的抗體之抗原結合部位的重組蛋白質。如此的重組蛋白質可參考作為抗nAChRα1抗體之已知的mAb35抗體的胺基酸序列(序列識別號33：膜型mAb35、序列識別號35：mAb35 hIgG1、序列識別號36：mAb35 hIgGκ)而適當製作。又，可使用MG患者的血液樣品、或從該樣品將抗體成分分離且濃縮的樣品等之含有抗體的樣品等。已有報告從MG患者的血液所取得的抗nAChRα1抗體在與nAChRα1的結合中，會與mAb35競爭(非專利文獻5：Luo et al, J Neurosci. 2009 Nov 4；29(44)：13898-908.)，mAb35被認為會辨識靠近患者的自體抗體的表位的部位。因此，認為具有與mAb35結合的抗原區域的CAAR會與病原性B細胞結合。
本發明之嵌合受體可包含用以在細胞膜上表現的訊息肽序列。訊息肽序列存在於許多分泌性蛋白質及膜蛋白質的N末端，大多具有約15～30個胺基酸左右的長度的情形，但並未限定。此種訊息肽序列並未阻礙作為嵌合受體的功能，且只要為可於細胞膜上表現的態樣即可，連結的態樣或序列的種類並未限定。就連結的位置而言，較佳為與嵌合受體之N末端連結。就訊息肽序列之具體例而言，可例示例如源自CD8α的訊息肽序列(序列識別號9)、源自nAChRα1的訊息肽序列(序列識別號10)、源自人類免疫球蛋白的訊息肽序列(序列識別號11)等，可採用包含此等的一部分或全部的胺基酸序列作為訊息肽。
於本發明之嵌合受體的細胞外域，可具有發揮將抗原區域與跨膜區域連結的作用之由約300個以下之胺基酸而成的連接子區域。連接子區域之序列只要不會顯著阻礙標的病原性B細胞對抗原區域的特異的結合即可，可採用各式各樣的序列，且可為源自天然蛋白質的連接子或源自鉸鏈區域(CD8、CD28等之鉸鏈區域、源自各種IgG的鉸鏈區域、由4至8個胺基酸所組成的鉸鏈區域(short hinge)等記載於非專利文獻1等之公知文獻)的序列，亦可為人工設計的序列。連接子區域之胺基酸長，例如，300個以下、100個以下、或約50個以下。如後述之實施例8及10所示，本發明之嵌合受體由於即使為採用於源自CD8α(序列識別號39)、CD28(序列識別號40)之鉸鏈區域的序列或於序列識別號41之人工性設計的連接子序列中使N末端側缺失的調節為2個胺基酸以上的各式各樣長度的序列、將有助於雙硫鍵的Cys取代為Ser的序列等之加入各種突變的連接子區域的嵌合受體或不含連接子區域的嵌合受體，仍可維持於細胞膜上抗nAChRα1抗體的結合能力，因此確認了連接子區域並未限定於特定的序列或長度，可容許各式各樣的胺基酸序列。
連接子區域較佳為促進抗原區域與自體抗體或病原性B細胞上的BCR的結合，且具有增強向細胞訊息傳遞的序列。於期待促進結合的胺基酸之例，包含有Cys、帶電荷的胺基酸、以及潛在的醣基化部位內之Ser及Thr，此等之胺基酸可使用作為構成連接子區域的胺基酸。
於本發明之一態樣，嵌合受體所含的連接子區域為源自CD8α(NCBI RefSeq：NP＿001759.3)之胺基酸編號118～178，即CD8α之鉸鏈區域、CD8β(GenBank：AAA35664.1)之胺基酸編號135～195、CD4(NCBI RefSeq：NP＿000607.1)之胺基酸編號315～396、CD28(NCBI RefSeq：NP＿006130.1)之胺基酸編號114～152、或彼等之至少一部分的胺基酸序列。作為連接子區域之序列之較佳者為包含序列識別號5或序列識別號39記載之CD8α之鉸鏈區域所含的4個以上連續的胺基酸序列(更佳為胺基酸編號42～45、胺基酸編號38～45、胺基酸編號36～45、胺基酸編號32～45、胺基酸編號27～45、胺基酸編號21～45、或胺基酸編號1～45之胺基酸序列)的胺基酸序列；或包含序列識別號40記載之CD28之鉸鏈區域所含的4個以上的連續胺基酸(更佳為胺基酸編號36～39、胺基酸編號30～39、胺基酸編號20～39、或胺基酸編號1～39)、或序列識別號41記載之撓性連接子記載之區域所含的4個以上的連續胺基酸序列的胺基酸序列(較佳為胺基酸編號11～14、胺基酸編號8～14、胺基酸編號4～14、或胺基酸編號1～14之胺基酸序列)。
本發明之嵌合受體所含的跨細胞膜區域若為貫通細胞膜者則未特別限定，可源自天然之膜結合蛋白質，或可為人工設計。就本發明之嵌合受體中採用的跨膜區域而言，可例示例如，源自nAChRα1、T細胞受體α或β鏈、CD3ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD27、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR等之跨膜區域的胺基酸序列，但未限定於此等。較佳為CD8α之跨細胞膜區域(序列識別號6)、CD28之跨細胞膜區域(序列識別號37)或nAChRα1之跨細胞膜區域(序列識別號38)。人工設計的跨膜區域具有主要包含疏水性胺基酸的胺基酸序列。例如，可以於合成跨膜區域的各末端見到Phe、Trp及Val之三聯體。
又，於其它態樣，於本發明之嵌合受體採用包含天然之膜型蛋白質的鉸鏈區域之至少C末端側的區域的連接子區域的情形，藉由將本嵌合受體中採用的連接子區域與跨膜區域設為源自相同蛋白質者(例如，CD8α之鉸鏈區域與跨細胞膜區域的組合、CD28之鉸鏈區域與跨細胞膜區域的組合)，可將細胞外域的細胞膜附近的結構作成與天然的蛋白質接近的結構。
本發明之嵌合受體可設計成聚合物，特別是形成二聚體。例如，為了通過雙硫鍵而將嵌合受體彼此聚合(二聚體化)，Cys可被插入連接子區域及/或跨膜區域。於後述之實施例10，確認了作為連接子區域，即使採用源自CD8α及CD28的鉸鏈區域，並採用將所含的Cys取代為Ser(序列識別號39之Xaa27及Xaa44、序列識別號40之Xaa28)的序列，亦維持了作為CAAR的功能。
本發明之嵌合受體的細胞內域具有細胞內訊息傳遞區域，用以向細胞內傳達自體抗體與抗原區域的結合訊息，並活化T細胞的細胞障礙活性。該區域若為源自CAR-T技術領域中通常使用的區域的序列，則可未特別限定地適用。就成為來源的區域的代表例而言，可例示CD3ζ之細胞內訊息傳遞區域(序列識別號8)、CD3δ之細胞內訊息傳遞區域等。
本發明之嵌合受體的細胞內域除了細胞內訊息傳遞區域之外，還可具有用以使該訊息進一步增強的細胞內共刺激區域。該區域若為於CAR-T技術領域中通常使用的分子、或於T細胞表面上表現並增強T細胞的活性化的作用已知的分子之源自細胞內域或共刺激區域的序列，則可未特別被限定而適用。於細胞內共刺激區域之例，包含源自CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137(4-1BB)、ICOS、GITR、TNFR2、DR3、CD30、HVEM、CD27、OX40及CD154之細胞內域、訊息傳遞模體而成的其末端切斷片段、或源自其共刺激區域的序列。就具體例而言，可例示CD2(NCBI RefSeq：NP＿001758.2)之胺基酸編號236～351、CD4(NCBI RefSeq：NP＿000607.1)之胺基酸編號421～458、CD5(NCBI RefSeq：NP＿055022.2)之胺基酸編號402～495、CD8α(NCBI RefSeq：NP＿001759.3)之胺基酸編號207～235、CD8β(GenBank：AAA35664.1)之胺基酸編號196～210、CD28(NCBI RefSeq：NP＿006130.1)之胺基酸編號180～220、CD137(4-1BB、NCBI RefSeq：NP＿001552.2)之胺基酸編號214～255、CD134(OX40、NCBI RefSeq：NP＿003318.1)之胺基酸編號241～277、及ICOS(NCBI RefSeq：NP＿036224.1)之胺基酸編號166～199之序列。又就其它具體例而言，可列舉4-1BB共刺激區域(序列識別號7)、CD28共刺激區域(序列識別號25)、GITR共刺激區域(序列識別號26)、TNFR2共刺激區域(序列識別號27)、DR3共刺激區域(序列識別號28)、CD30共刺激區域(序列識別號29)、HVEM共刺激區域(序列識別號30)、CD27共刺激區域(序列識別號31)、OX40共刺激區域(序列識別號32)等。
本發明之嵌合受體中採用共刺激區域的情形，可單獨採用源自上述之分子之任一者的序列，亦可將任意之複數(例如，2或3種類)組合而採用。就此種組合例而言，於CAR-T領域中，已知例如將源自CD28與4-1BB的共刺激區域組合的例子。
於本發明之嵌合受體中，在後述的實施例9確認了採用源自各式各樣膜蛋白質的共刺激區域的CAAR適當地發揮功能，而確認了與共刺激區域的種類無關均會發揮功能。作為成為本發明之共刺激區域的來源的分子，較佳為4-1BB、CD28、GITR、TNFR2、DR3、CD30、HVEM、CD27或OX40。
本發明之嵌合受體，於其抗原區域以外的各構成區域，可採用CAR-T技術或其它生物技術領域中公知的區域或序列。本說明書記載的序列已知為各區域之代表性的序列，亦已知是一個或數個之胺基酸突變的序列。「源自此種公知序列的序列」意指為與公知序列相同的序列、或於公知序列中有一個或數個胺基酸突變的序列，且保持作為該區域的功能的序列。於此種源自公知的區域中，包含胺基酸的突變的情形，該突變的位置只要保持作為該區域之功能則未特別限定，較佳為以該區域的功能中心以外的胺基酸進行者較佳。
於本發明之嵌合受體中，各區域之間，可插入有將彼等連結的一個或複數個胺基酸而成的間隔區序列。例如，可使用具有2～10個胺基酸長的間隔區序列。特別是可使用具有甘胺酸-絲胺酸連續序列的間隔區序列。
就本發明之嵌合受體之例而言，從N末端向C末端，包含下列各區域之多肽：序列識別號2之AChRα211或序列識別號3或序列識別號42之突變型AChRα211(未經取代的Xaa為序列識別號2中對應位置的胺基酸)所表示的序列的抗原區域、源自選自nAChRα1、T細胞受體α鏈、T細胞受體β鏈、CD3ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154及GITR中的任一者的跨細胞膜區域的序列所構成的跨細胞膜區域、包含源自CD3ζ或CD3δ之細胞內訊息傳遞區域的序列的細胞內訊息傳遞區域，較佳為一種多肽，從N末端向C末端，包含：選自AChRα211/W149R/V155K、AChRα211/ W149R/V155A、AChRα211/W149R/V155M、AChRα211/ W149R/V155D、AChRα211/W149R/V155P、AChRα211/ W149R/V155G、AChRα211/W149K/V155K、AChRα211/ W149K/V155A、AChRα211/W149K/V155M、AChRα211/ W149K/V155D、AChRα211/W149K/V155P、AChRα211/ W149K/V155G、AChRα211/W149P/V155K、AChRα211/ W149P/V155A、AChRα211/W149P/V155M、AChRα211/ W149P/V155D、AChRα211/W149P/V155P、AChRα211/ W149P/V155G、AChRα211/D14G/W149R/V155K、AChRα211/D14G/W149R/V155A、AChRα211/D14G/ W149R/V155M、AChRα211/D14G/W149R/V155D、AChRα211/D14G/W149R/V155P、AChRα211/D14G/ W149R/V155G、AChRα211/D14G/W149K/V155K、AChRα211/D14G/W149K/V155A、AChRα211/D14G/ W149K/V155M、AChRα211/ D14G/W149K/V155D、AChRα211/D14G/W149K/V155P、AChRα211/D14G/ W149K/V155G、AChRα211/D14G/W149P/V155K、AChRα211/D14G/W149P/V155A、AChRα211/D14G/ W149P/V155M、AChRα211/D14G/W149P/V155D、AChRα211/D14G/W149P/V155P、AChRα211/D14G/ W149P/V155G、AChRα211/D14A/W149R/V155K、AChRα211/D14A/W149R/V155A、AChRα211/D14A/ W149R/V155M、AChRα211/D14A/W149R/V155D、AChRα211/D14A/W149R/V155P、AChRα211/D14A/ W149R/V155G、AChRα211/D14A/W149K/V155K、AChRα211/D14A/W149K/V155A、AChRα211/D14A/ W149K/V155M、AChRα211/ D14A/W149K/V155D、AChRα211/D14A/W149K/V155P、AChRα211/D14A/ W149K/V155G、AChRα211/D14A/W149P/V155K、AChRα211/D14A/W149P/V155A、AChRα211/D14A/ W149P/V155M、AChRα211/D14A/W149P/V155D、AChRα211/D14A/W149P/V155P、及AChRα211/D14A/ W149P/V155G的抗原區域；選自CD8α跨膜區域(序列識別號6)、CD28跨膜區域(序列識別號37)及AChRα跨膜區域(序列識別號38)任一者之跨膜區域；選自-1BB共刺激區域(序列識別號7)、CD28共刺激區域(序列識別號25)、GITR共刺激區域(序列識別號26)、TNFR2共刺激區域(序列識別號27)、DR3共刺激區域(序列識別號28)、CD30共刺激區域(序列識別號29)、HVEM共刺激區域(序列識別號30)、CD27共刺激區域(序列識別號31)、及OX40共刺激區域(序列識別號32)之任一者的共刺激區域；以及為CD3ζ細胞內訊息傳遞區域(序列識別號8)的細胞內訊息傳遞區域，且於抗原區域和跨膜區域之間可包含連接子區域(CD8α鉸鏈序列(序列識別號39)、CD28鉸鏈序列(序列識別號40)、或人工連接子序列(序列識別號41)的一部分或全部之序列)。
又，作為本發明之嵌合受體之一態樣，可列舉一種多肽，包含與序列識別號43～47之任一者的胺基酸序列顯示80%以上(較佳為85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)之序列同一性的胺基酸序列，且保持作為本發明之CAAR的功能。此種多肽通常於其N末端可含有用以使向細胞表面表現的訊息肽序列，進一步可將確認於細胞表面的表現用之標籤肽等直接或透過間隔區而與序列識別號43～47之任一者的胺基酸序列之N末端連結。此種多肽中所含的嵌合受體之胺基酸序列可為於其胺基酸序列中，有數個(20個以下，較佳為15個以下、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個)之胺基酸被取代、缺失、插入及/或加成的胺基酸序列而成的多肽。作為此種多肽所包含的嵌合受體之胺基酸序列，較佳為於序列識別號第43～47號中，第1～160號(較佳為第1～170號，更佳為第1～180號、第1～190號、第1～200號、第1～211號)之胺基酸被維持，於此以外的區域中胺基酸可以指定比率變更。作為此種嵌合受體之胺基酸序列的最佳為序列識別號43～47之任一者之胺基酸序列。
＜基因＞ 本發明提供包含編碼上述之嵌合受體多肽的區域的多核苷酸。本發明之多核苷酸可為包含前述區域的核苷酸片段、mRNA等，可為適合用以使上述之嵌合受體於細胞膜上表現的基因導入的質體、載體、病毒等之形態。
構成本發明之多核苷酸的核苷酸可為具有天然結構的DNA或RNA，可為具有化學修飾的結構的修飾核酸。例如，本發明之多核苷酸以mRNA的形式提供給細胞的情形，為了賦予對RNase所致的分解的耐性，已使用修飾核酸。修飾擴散較佳為鹼基部分被修飾者，例如，可為5位經取代的嘧啶核苷酸、1位可經取代的假尿苷，具體而言，可例示5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、假尿苷、1-烷基假尿苷。又，就1-烷基假尿苷而言，可為1-(C1-C6烷基)假尿苷，較佳為1-甲基假尿苷或1-乙基假尿苷。
編碼本發明之嵌合受體的多核苷酸可藉由通常方法從所示胺基酸序列而容易地製作。編碼胺基酸序列的核苷酸序列可基於序列標記載之胺基酸序列而取得。又，可從與各區域之胺基酸序列有關的上述之NCBI RefSeq ID或GenBank受託編號而取得，且可使用標準的分子生物學的及/或化學的程序而製作本發明之多核苷酸。例如，可基於核苷酸序列而合成核酸，藉由組合從cDNA庫使用聚合酶連鎖反應(PCR)而獲得的DNA片段而製作本發明之多核苷酸。
本發明之多核苷酸可與另外的核酸連結使得在適合的啟動子控制下表現。於啟動子之例包含藉由構成上促進基因或可操作連結的構築物之表現的啟動子、藥物等(例如，四環黴素(tetracycline)或阿黴素(doxorubicin))之作用，誘導基因或可操作連結的構築物的表現的啟動子。又，為了獲得核酸有效率的轉錄，本揭示的核酸亦可與包含啟動子或與轉錄起始位點，例如增強子序列或終止子序列，協同作用的其它調節元件的核酸連接。除了本發明之多核苷酸外，亦可併入可成為用以確認多核苷酸的表現的標記的基因(例如，耐藥性基因、編碼報導子酵素的基因、或編碼GFP、BFP等之螢光蛋白質的基因)或標籤序列(FLAG、His標籤等)。
本發明之多核苷酸可為用以於特定宿主細胞中表現的密碼子經最佳化的核苷酸序列。此種經最佳化的核苷酸序列可藉由應用周知算法、軟體而取得目的之胺基酸序列。
本發明提供一種組成物，其同時含有有效量之本發明之多核苷酸與藥學上可許容的賦形劑。適合的藥學上可容許的賦形劑為發明所屬技術領域中具有通常知識者所周知的。於藥學上可容許的於賦形劑之例，可含有磷酸緩衝生理食鹽水(例如，0.01M磷酸鹽、0.138M NaCl、0.0027M KCl、pH7.4)、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、或硫酸鹽等之無機酸鹽的水溶液、生理食鹽水、二醇或乙醇之溶液、及乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或苯甲酸鹽等之有機酸之鹽。濕潤劑或乳化劑、及pH緩衝劑等之佐劑亦可能使用。就藥學上可容許的賦形劑而言，可適當使用Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N.J. 1991)(藉由引用而被視為本說明書的一部分)記載的賦形劑。本揭示之組成物可非經口投予，例如，可調配成適合注射或輸注的已知形態。再者，本揭示之組成物可含有沉澱防止劑、保存劑、穩定劑及/或分散劑等之製劑添加劑、以及用以延長保存中之有效性的保存劑。本組成物亦可為用以於使用前以適當無菌液體再構成的乾燥形態。為了通過微粒子的投予，顯微鏡大小的金粒子等之粒子可以用DNA塗覆。
本發明之多核苷酸於體外被導入至細胞的情形，例如，除了上述之賦形劑外，本發明之多核苷酸可與促進向細胞導入核酸的物質之脂質體或陽離子脂質等之用以導入核酸的試藥組合。或者，如後述，攜帶本發明之多核苷酸的載體亦為有用。
為了對nAChRα1的自體抗體所導致的自體免疫疾病(特別是重症肌無力症)之治療，可投予含有本發明之多核苷酸作為有效成分的組成物。含有本發明之核酸作為有效成分的組成物可經非經口投予，例如，注射或輸注而投予至皮內、肌肉內、皮下、腹膜內、鼻腔內、動脈內、靜脈內、腫瘤內、或輸入淋巴管，或可適當開處方用於彼等之投予，但投予路徑未特別限定。
就包含本發明之多核苷酸的載體而言，若為基因工程領域中一般可使用的載體，則未特別限定，可採用質體載體、病毒載體、非病毒載體等。本發明提供此種包含本發明之多核苷酸的載體。
就本發明中採用的病毒載體而言，可使用例如，反轉錄病毒載體(包含托羅病毒(Torovirus)載體、慢病毒(Lentivirus)載體、及假型(pseudotype)載體)、腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、猴病毒(simian virus)載體、痘瘡病毒(Vaccinia virus)載體、仙台病毒(Sendai virus)載體、艾司坦-巴爾病毒病毒(Epstein-Barr virus)(EBV)載體、及HSV載體等之病毒載體。例如，可使用欠缺複製能力的病毒載體而於感染細胞內不能自行複製。
就非病毒載體而言，例如，如WO96/10038、WO97/18185、WO97/25329、WO97/30170及WO97/31934(藉由引用而被視為本說明書的一部分)記載，可使用包含脂質體或陽離子脂質等的微粒子等。又，可使用Jin et al, EMBO Mol Med. 2016 Jul；8(7)：702-711.等記載的導入支架/基質附著區域元件(scaffold/matrix attachment region element)表現的游離型載體(episomal vector)的方法，可使用Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Dec 22；8：131-140.記載的使用對PiggyBac法等的轉位子(transposon)系統之導入方法中採用的病毒粒子進行放射線照射而破壞內容的外殼等。
於病毒載體之製作，設計成於使該病毒感染的細胞中本發明之多肽被適當表現的形式之併入了編碼本發明嵌合受體的序列及封入病毒上必要的序列(例如，LTR序列等)的質體，導入至適當細胞(特別是包裝細胞)，藉由將病毒部分回收、濃縮而製造。本發明提供於此種病毒載體之製造上所使用的質體。
病毒製作用之質體可利用市售的套組，按照所附步驟說明書而製作。此種套組因應病毒種類已販售有各式各樣者。例如，作為慢病毒用之質體製作套組可列舉pLVSIN EF1α pur(Takara, 6186)，作為反轉錄病毒用可列舉pQCXIX(Takara, Z1515N)，作為腺相關病毒用可列舉pAAV-CMV(Takara, 6651)等。
作為一態樣，封入了本發明之多核苷酸的病毒可藉由將上述之病毒製作用質體導入至於病毒粒子形成上有導入必要的構成基因的包裝細胞中，回收該細胞之培養液而製作。於包裝細胞之例，可使用PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP＋E-86及GP＋envAm-12(美國專利第5,278,056號)、Psi-Crip[Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 85, pp. 6460-6464 (1988)]等。
作為其它態樣，封入了本發明之多核苷酸的病毒可藉由將上述之病毒製作用質體與於病毒粒子形成所必要的構成基因表現載體一起導入至細胞，並回收該細胞的培養液而製作。包裝訊息序列導入試藥因應病毒種類、或按照製作套組的步驟說明書，可適當選擇。慢病毒的情形，可使用例如Lentiviral High Titer Packaging Mix(Takara, 6194)等。作為細胞，可使用例如，293細胞或具有高轉染效率的293T細胞(具體而言，Lenti-X 293T Cell Line(Takara, 632180))。於質體之導入時，可添加導入輔助試藥(例如，Opti-MEM I Reduced Serum Media(Thermo Fisher Scientific, 31985070))。
本發明之病毒可使用已導入上述之質體的細胞之培養上清液，又，可將病毒濃縮而使用。於病毒之濃縮，可因應病毒種而使用適當套組(例如，Lenti-X concentrator(Takara, 631232))。
本發明之質體通常以保持於適當細胞中的形式被保管，於病毒作成時，將保持質體的細胞進行培養而使增殖後，藉由施加引發病毒產生的刺激而被產生，藉由從培養液將病毒成分分離、濃縮而可取得。就此種保存用之質體保持細胞而言，並未特別限定，可適用於公知技術中使用的種類的細胞。
病毒係將病毒製作用質體，與Lentiviral High Titer Packaging Mix(Takara, 6194)及TransIT-293 Transfection Reagent(Takara, MIR2704)與Opti-MEM I Reduced Serum Media(Thermo Fisher Scientific, 31985070)混合並培育15分鐘後添加到事前培養至半融合之的Lenti-X 293T Cell Line(Takara, 632180)中，添加後24-48小時回收所含的培養液。培養液中所含的病毒使用Lenti-X concentrator(Takara, 631232)，按照步驟說明書而濃縮。
＜細胞及其製造方法＞
本發明提供保持編碼上述之嵌合受體的多核苷酸的宿主細胞。
就本發明中使用的細胞而言，可採用源自哺乳動物的細胞，例如，人類細胞、或源自猴、小鼠、大鼠、豬、馬、或狗等之非人類哺乳動物的細胞。較佳為人類細胞。
本發明中使用的細胞之種類並未特別限定，可使用任一種類的細胞。可使用例如，從體液、組織或器官，例如，從血液(末梢血、臍帶血等)或骨髓所採取、單離、或純化的細胞、或使上述之細胞分化、或iPS細胞、ES細胞等之多能性幹細胞(例如，參照Themeli et al 2013)。末梢血液單核細胞(PBMC)、免疫細胞(例如，包含T細胞、樹狀細胞、B細胞、造血幹細胞、巨噬細胞、單核球、NK細胞或造血細胞(嗜中性球、嗜鹼性球))、臍帶血液單核細胞、纖維母細胞、脂肪細胞前驅物、肝細胞、皮膚角質細胞、間葉幹細胞、脂肪幹細胞、各種之癌細胞株、或神經幹細胞。可使用例如，NK細胞或T細胞、T細胞之前驅細胞(造血幹細胞、淋巴球前驅細胞等)或含有彼等的細胞集團。於T細胞之例，包含CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、控制性T細胞、細胞毒性T細胞、及腫瘤浸潤淋巴球。於含有T細胞及T細胞之前驅細胞的細胞集團，有包含PBMC。上述之細胞可從活體採取，亦可藉由從活體採取的細胞的擴大培養而獲得，或可建立為細胞株。冀望將製作的CAAR表現細胞或從製作的CAAR表現細胞所分化的細胞移植至活體的情形，可將本發明之多核苷酸導入至從該活體本身或從其同種的活體所採取的細胞中。
於一態樣中，本發明之基因修飾細胞為於細胞膜上表現了上述之嵌合受體的細胞。此種細胞具有於嵌合受體的抗原區域與特定之病原性B細胞結合，並藉由將該結合訊息向細胞內訊息傳遞區域傳遞，細胞被活性化的特性。表現本發明之嵌合受體的細胞之活性化依宿主細胞的種類及嵌合受體中所含的細胞內域而異，可基於作為指標之例如細胞激素的釋放、細胞增殖速度的提升、或細胞表面分子的變化等而確認。
本發明之基因修飾細胞的宿主細胞為T細胞的情形，此種細胞亦稱為CAAR-T細胞。宿主細胞為T細胞的情形，由上述訊息傳遞而活性化的細胞釋放細胞毒性細胞激素(腫瘤壞死因子、淋巴毒素等)，並發揮對標的細胞的標記細胞活性、或細胞毒性。除此之外，細胞激素的釋放或細胞表面分子的變化刺激其它免疫細胞，例如，B細胞、樹狀細胞、NK細胞、及巨噬細胞。藉由此作用，可從體內減少或排除產生對nAchRα1的自體抗體的細胞，並可治療由於自體抗體所引起的疾病、症狀。
用以製作本發明之基因修飾細胞的方法包含將本發明之多核苷酸導入至細胞中的步驟。此步驟可於活體外或活體內進行。例如，按照通常方法可於體外(ex vivo)或試管內(in vitro)使用攜帶本發明之多核苷酸的病毒載體或非病毒載體，進行基因導入而將細胞製作為表現本發明之嵌合受體的細胞。
將本發明之多核苷酸導入至細胞的方法為所屬技術領域中已知的。製作CAR-T細胞的方法典型地有適用標準的基因工程及分子生物學的手法。本發明之多核苷酸可使用所屬技術領域中周知的各式各樣轉染技術等而導入至目的細胞。又，就其它態樣而言，本發明之多核苷酸，利用例如使用CRISPR/Cas9或鋅指核酸酶(zinc finger nuclease)的基因體編集技術，可導入至目的細胞的基因體(例如，美國專利第8,956,828號)。
於一態樣中，於本發明之基因修飾T細胞，於細胞表面上表現的嵌合受體可與源自患者的抗體或mAb35抗體結合。
又，於一態樣中，本發明之基因修飾T細胞對產生mAb35的融合瘤，顯示細胞傷害活性。
本發明之一態樣提供包含將本發明之多核苷酸或載體向細胞導入的基因修飾細胞之製作方法。
本發明之方法適用於自體細胞治療的情形，可採用包含以下步驟的方法。 a)從治療對象個體採取對象細胞的步驟； b)將採取的細胞以包含本發明之多核苷酸的載體進行基因導入的步驟；及 c)將包含嵌合受體表現細胞的細胞集團進行擴大培養的步驟。
於一態樣中，採取的對象細胞(較佳為包含T細胞的細胞集團，更佳為PBMC、或CD3陽性細胞部分)於基因導入前，以可溶型或膜結合型之抗CD3抗體(例如，OKT3或mOKT3)及/或APC(例如，人工APC(aAPC)、表現膜型之抗CD3單株抗體的APC)刺激。
又，於其它態樣，用於基因導入的對象細胞係懸浮成一定的細胞濃度(例如，0.1-2x10 6cells/mL)，並添加至病毒結合盤。病毒結合盤，係可藉由於塗覆5-10 ng/mL之CD3抗體(殖株名：OKT3)及20-100 μg/mL之RetroNectin的盤上，添加上述之病毒濃縮液而製作。
就基因導入中使用的培養基而言，可採用例如添加了血清或血清代替物、IL-2等之細胞激素的培養基(例如，AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific, 12055083)。有細胞添加的病毒結合盤可進行離心處理。
上述b)之基因導入步驟可重覆複數次。例如，轉形導入步驟可進行至達成充分的表現水平為止。例如，轉形導入步驟可進行2～10次，較佳為2、3、4或5次。
於一態樣中，基因導入步驟可繼續培養連續2日以上，例如，連續2日、連續3日、或連續4日。又，使用病毒結合盤的情形，每2～3日進行培養基交換，可連續培養5～20日。
於一態樣中，將本發明之基因修飾細胞以表現抗nAChRα1抗體或辨識nAChRα1的BcR的照射細胞進行刺激。例如，以效應遺傳因子(effector)：標的比100：1、75：1、50：1、25：1、20：1、15：1、10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：15、1：20、1：25、1：50或1：100，用照射細胞刺激本發明之基因修飾T細胞。
本發明之基因修飾細胞適用於異體細胞治療的情形，可藉由通常之基因導入方法、基因編集方法，將本發明之多核苷酸導入至細胞(例如，ES細胞、iPS細胞等之多能性幹細胞、從彼等之細胞分化誘導為血球系統的細胞的細胞、對體細胞或血球系細胞施加免疫排斥回避處理的細胞等)。例如，對ES細胞或iPS細胞等之多能性肝細胞，使用基因體編集技術而將本發明之多核苷酸導入至基因體，並製作適當地基因導入的多能性肝細胞。多能性幹細胞因可增幅，可於必要時期增幅必要量，並施予向T細胞的分化誘導，而適用於異體治療。 ＜醫藥組成物、治療方法＞
本發明之基因修飾細胞可適用於起因於對nAchRα1的自體抗體的自體免疫疾病之治療。又，利用本發明之基因修飾細胞的治療係藉由減少表現對象的抗nAChRα1自體抗體的病原性B細胞之數而達成。本發明提供含有此種基因修飾細胞作為有效成分的自體免疫疾病之治療藥、利用投予該細胞的自體免疫疾病之治療方法等。就此種自體免疫疾病之典型例而言，可列舉重症肌無力症(MG)。
本說明書所使用的CAAR-T細胞之有效量意指不對人類患者招致毒性且帶來期望的治療終點(例如，症狀的減少、改善或除去、人類患者的自體抗體或同種抗體的減少或除去)的量。作為此一例，對人類患者投予的CAAR-T細胞之有效量有時意指人類患者之每公斤體重約10 4～約10 9個之CAAR-T細胞(例如，約10 5～約10 6個之CAAR-T細胞)。
含有本發明之細胞作為有效成分的治療藥可藉由非經口投予，例如，藉由注射或輸注，而投予至皮內、肌肉內、皮下、腹膜內、鼻腔內、動脈內、靜脈內、腫瘤內、或輸入淋巴管，但投予路徑並未限定。較佳為靜脈內投予。
接受利用本發明之細胞的治療的患者可被施予於CAR-T細胞領域中公知的各式各樣前處置。
本發明之細胞，藉由於患者體內與抗nAChRα1自體抗體結合，自體抗體所辨識的細胞由於體內之巨噬細胞而遭受到排除，有藥理效果減少的可能性。因此，接受利用本發明之細胞的治療的患者，可於投予前進行前處理，使成為暫時性地減少血中抗nAChRα1自體抗體量的狀態、或使血中之IgG量增加的狀態，於本發明之細胞與病原性B細胞可結合的環境中，投予本發明之細胞。就此種前處理之例而言，本發明之細胞可對透析後之患者投予。患者藉由接受透析，血液的血漿成分被去除，血中之抗AChRα1抗體水平被遞減。
再者，於特定章節記載的定義及實施形態，如發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解，旨在也適用於記載彼等為適合的本說明書之其它實施形態。例如，以下之章節中更詳細定義本發明之各種概貌。如此定義的各概貌只要沒有並非如此，可與其它任一個或複數個概貌組合。尤其，作為較佳或有利者所示的任一特徵亦可與作為較佳或有利者所示的其它任一個或複數個特徵組合。
上述之揭示概括地說明本申請案。參照以下之實施例可獲得更完全的理解。此等之例僅用於例示而記載，並未限定本申請案之範圍。若暗示或呈示狀況適合，亦考慮形態的變化及等價物的取代。於本說明書中雖使用特定之用語，但此種用語旨在表示描述性意義，並非以限定為目的。 [實施例] 於以下之實施例所使用的AChRα211突變體(序列識別號3)之標記，於未對序列識別號3中Xaa所示的胺基酸明示為特定之胺基酸的情形，表示為與原序列的序列識別號2之該部位相同的胺基酸(例如，Xaa8為V，Xaa14為D，Xaa70為D，Xaa72為Y，Xaa112為Y，Xaa192為C，Xaa193為C)。又，於AChRα236突變體(序列識別號4)之標記，於未對序列識別號3中Xaa所示的胺基酸明示為特定之胺基酸的情形，表示為與原序列的序列識別號1之該部位相同的胺基酸。
於以下之實施例之含有各種AChRα的細胞外區域作為抗原區域的嵌合受體(AChRα-CAAR)之記載，於未特別明示的情形，使用源自人類的序列，分別就連接子區域而言，採用源自CD8α的連接子區域(序列識別號5)，就跨細胞膜區域而言採用源自CD8α的跨膜區域(序列識別號6)，就細胞內共刺激區域而言採用源自4-1BB的共刺激區域(序列識別號7)，就細胞內訊息區域而言採用源自CD3ζ的細胞內訊息區域(序列識別號8)。又，就訊息肽序列而言，使用CD8α訊息肽序列(序列識別號9)。為了確認CAAR表現，FLAG標籤序列通過3個胺基酸的間隔區(GSG)而配置於AChRα-CAAR之N末端側。為了確認基因導入，通過3個胺基酸的間隔區(GSG)而配置自切割肽T2A及螢光基因BFP於AChRα-CAAR之C末端側。
於以下之實施例，作為各實驗手法，採用以下之方法。 [CAAR表現用病毒載體構築] 構築用以表現AChRα-CAAR(圖1)的慢病毒載體，其係從N末端側依序配置抗原區域、連接子區域、跨膜區域、細胞內共刺激區域及細胞內訊息區域。又，於AChRα-CAAR之N末端側配置訊息肽。因應確認表現等之必要，於AChRα-CAAR之N末端側配置FLAG標籤序列及3個胺基酸之間隔區(GSG)，於C末端側配置自切割肽T2A及螢光基因BFP。將如前述配置的基因序列導入至pLVSIN EF1α pur(Takara, 6186)之多重選殖位(Multiple cloning site)，而製作用以表現AChRα-CAAR的慢病毒用質體載體。
[AChRα CAAR-T細胞之製作] 按照pLVSIN EF1α pur之步驟說明書，將慢病毒用質體載體、Lentiviral High Titer Packaging Mix(Takara, 6194)及TransIT-293 Transfection Reagent(Takara, MIR2704)與Opti-MEM I Reduced Serum Media(Thermo Fisher Scientific, 31985070)混合，培育15分鐘後添加至已預培養至半融合的Lenti-X 293T Cell Line(Takara, 632180)中，翌日交換培養基後，回收進一步培養24小時的上清液。培養液中所含的病毒使用Lenti-X concentrator(Takara, 631232)而按照步驟說明書進行濃縮。病毒濃縮液按照RetroNectin(Takara, T100B)之步驟說明書，藉由添加至已塗布5-10 ng/mL之CD3抗體(殖株名：OKT3)及20-100 μg/mL之RetroNectin的盤中，而製作病毒結合盤。接著，使用於包含5%胎牛血清(FBS)的AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific, 12055083)(下文，表示為基礎培養基)中添加100 U/mL IL-2的培養基(下文，表示為增殖用培養基)而將源自人類的末梢血液單核球懸浮成0.1-2x10 6cells/mL，添加至病毒結合盤中而以1000 g進行離心30-60分鐘後，移至培育箱培養。藉由每2-3日交換至新的增殖用培養基，并培養7-14日而製備有AChRα-CAAR導入的T細胞(AChRα CAAR-T)。因應必要，回收的細胞使用CELLBANKER1(Takara, CB011)進行冷凍保存。於實驗使用冷凍細胞的情形，融解後於培養基中培育1日後使用。
[確認細胞中的CAAR之表現方法] 將抗AChRα抗體(mAb35，從源自ATCC的融合瘤(TIB-175)製備)於FACS Buffer(包含0.5% BSA、2mM EDTA及0.09% Azide的磷酸鹽緩衝鹽水)中懸浮成1-10 μg/mL後，添加至細胞而使於4℃反應10-20分鐘，以FACS Buffer洗淨。將APC抗人類IgG Fc抗體(Biolegend, 409306)以FACS Buffer稀釋20-100倍後，添加至細胞，於4℃反應10-20分鐘，以FACS Buffer洗淨。依據試驗，APC抗FLAG標籤抗體(Biolegend, 637308)以FACS Buffer稀釋20-100倍後，添加至細胞而於4℃反應10-20分鐘，以FACS Buffer洗淨。抗體染色完的細胞懸浮於含有1-10 μg/mL 7-胺基放線菌素D(actinomycin D)的FACS Buffer而使用流式細胞儀(MACSQUANT Analyzer10)進行測定。輸出為FCS檔案後，使用FLOW JO軟體，於FSC/SSC圖選擇細胞流份，選擇7-胺基放線菌素D染色為陰性的活細胞組。接著，活細胞組以X軸：BFP/Y軸：APC展開，將BFP陰性組中的APC之螢光設為陰性對照組以4分割線表示。依據必要，對活細胞組各自分劃為BFP陽性細胞組或BFP陰性細胞組，疊加各組後，展開為X軸：APC。
＜實施例1：作為CAAR之可於細胞膜表現的抗原區域之檢討＞ 以探索作為於重症肌無力症之治療中使用的CAAR的適當結構(圖1)為目的，製作作為訊息肽、抗原區域、連接子區域及跨膜區域序列採用以下序列的CAAR表現用病毒載體，評價於細胞膜上的表現。於本實驗中，共刺激區域採用源自4-1BB的細胞內訊息序列(序列識別號7)，細胞內訊息區域採用CD3ζ(序列識別號8)。 (1)使用將天然型AChRα之細胞膜外序列(序列識別號1)作為抗原區域，配置源自CD8α的連接子區域(序列識別號5)、源自CD8α的跨膜區域(序列識別號6)的CAAR，與源自CD8α的訊息肽(序列識別號9)連結的載體而製備的慢病毒(圖2A)。 (2)使用將天然型AChRα之細胞膜外序列(序列識別號1)作為抗原區域，配置源自CD8α的連接子區域(序列識別號5)、源自AChRα1的跨膜區域(序列識別號38)的CAAR，與源自CD8α的訊息肽(序列識別號9)連結的載體而製備的慢病毒(圖2A)。 (3)使用將天然型AChRα之細胞膜外序列(序列識別號1)作為抗原區域，配置源自CD8α的連接子區域(序列識別號5)及跨膜區域(序列識別號6)的CAAR，與源自AChRα的訊息肽(序列識別號10)連結的載體而製備的慢病毒(圖2B)。 (4)使用將天然型AChRα之細胞膜外序列(序列識別號1)作為抗原區域，配置源自CD8α的連接子區域(序列識別號5)及跨膜區域(序列識別號6)的CAAR，與源自免疫球蛋白的訊息肽(序列識別號11)連結的載體而製備的慢病毒(圖2B)。
(5)除了(1)、(3)及(4)記載之載體，使表現以T2A連結全長AChRβ(序列識別號12)、全長AChRδ(序列識別號13)、全長AChRε(序列識別號14)及GFP之各組分的複合體的載體共同表現而製備的慢病毒(圖2C)。一般而言，即使使多聚體中所含的組分單獨表現，亦難以獲得穩定的膜表現，因為組分彼此的結合面露出，於活體內，AChR呈5聚體而表現。為了研究是否可藉由使AChRα以外的組分表現而膜表現，已有報告特別是胎兒型AChR(α、α、β、δ、ε)係細胞株中的表現量高(Lozier et al, Am J Clin Pathol. 2015 Feb；143(2)：186-92； quiz 305.)。
(6)使用將重症肌無力症病態模型發病所使用的主要免疫原區肽(序列識別號15)作為抗原區域，使配置源自CD8α的連接子區域(序列識別號5)及跨膜區域(序列識別號6)的CAAR與源自CD8α的訊息肽(序列識別號9)連結的載體而製備的慢病毒(圖2D)。 (7)於AChRα・mAb35抗體・銀環蛇毒(bungarotoxin)(α-Btx)複合體的立體結構解析中(Noridomi et al, Elife. 2017 Apr 25；6：e23043.)，對於AChRα之細胞膜外序列(236胺基酸)，以從酵母製備的蛋白質之結晶化為目的而已記載4處突變(Δ59-83、V8E、W174R、V180A)。其中，將導入3處(V8E/W174R/V180A)之突變的序列設為抗原區域，使用使配置源自CD8α的連接子區域(序列識別號5)及跨膜區域(序列識別號6)的CAAR與源自CD8α的訊息肽(序列識別號9)連結的載體而製備的慢病毒(圖2E)。 (8)將導入前述之4處(Δ59-83、V8E、W174R、V180A)之突變的序列設為抗原區域，使用使配置源自CD8α的連接子區域(序列識別號5)及跨膜區域(序列識別號6)的CAAR與源自CD8α的訊息肽(序列識別號9)連結的載體而製備的慢病毒(圖2E)。
[結果] 在(1)～(5)、(7)中，與BFP陰性細胞組比較，未確認BFP陽性細胞組中的CAAR的細胞膜表現，在(6)中，CAAR於細胞膜表現但沒有mAb35抗體反應性。僅於(8)之導入4處突變的情形，與BFP陰性組比較，確認BFP陽性細胞組有伴隨mAb35抗體反應性的CAAR的膜表現。關於(6)所採用的複合體之結晶化的論文，確認使用酵母的蛋白質表現，但未確認於動物細胞的細胞膜上的表現，再者，亦沒有AChRα以單體的型式表現的。又，在該論文中，藉由添加與AChRα結合的α-Btx，而成功地實現高解析度的結晶化，但從安全性的觀點來看，於CAAR-T治療使用α-Btx等蛇毒素是無法被容許的。由此等來看，於(6)之載體中，AChRα-CAAR的膜表現被確認，為令人驚訝的結果。
[考察] 在(1)～(5)、(7)中，與BFP陰性細胞組比較，由於BFP陽性細胞組中的CAAR無法確認膜表現，因此天然型AChRα的細胞外域被認為作為嵌合受體無法進行膜表現的。於(6)之結果，於BFP陽性細胞中抗FLAG抗體雖反應了，但mAb35抗體未反應。此可知mAb35抗體至少沒有辨識直鏈狀之主要免疫原區，無法使用於病原性B細胞的去除。
關於AChRα細胞外區域之突變體，在以下之實施例中，將細胞外序列全長(236個胺基酸)稱為AChRα236，將於AChRα236之序列中包含Δ59-83之缺失的突變體稱為AChRα211。又胺基酸之取代突變以「/」區隔顯示。又，第84號以後的胺基酸編號以AChRα211之序列中的對應胺基酸編號(AChRα236之W174及V180各自相當於AChRα211之W149及V155)表示。即，包含(8)所採用的4處突變的突變體表示成AChRα211/V8E/W149R/V155A。
＜實施例2：適用於CAAR的AChRα突變體之檢討-1＞ 以進一步提升CAAR之膜表現量為目的，除了實施例1之(8)之載體所採用的4處突變(AChRα211/V8E/W149R/V155A)之外，研究另外的突變。結晶化文獻所採用的α-Btx，由與AChRα211的C192及C193結合而穩定化複合體之結構來看，於實施例1之(8)中AChRα211之C192及C193被認為是游離狀態，有膜表現成為不穩定的可能性。因此，構築將使C192及C193突變成甘胺酸的AChRα211/ V8E/W149R/V155A/C192G/C193G作為抗原區域的AChRα-CAAR表現載體(於抗原區域：序列識別號3中Xaa8為E，Xaa149為R，Xaa155為A，Xaa192-193為GG，其它Xaa為對應序列識別號2的位置之胺基酸的胺基酸序列)，評價於細胞膜的表現(圖3)。
[結果] 本突變確認與AChRα211/V8E/W149R/V155A同程度的膜表現。
＜實施例3：適用於CAAR的AChRα突變體之檢討-2＞ 由於藉由4處的突變導入而AChRα-CAAR於細胞膜上表現，為了評價各胺基酸突變對膜表現的貢獻度，構築表現如以下表所示組合4處的突變而導入的突變型AChRα-CAAR的載體(抗原區域：以下之表所示的胺基酸序列，序列識別號3的情形，Xaa8、Xaa149及Xaa155為以下之表所明示的胺基酸，其它之Xaa為序列識別號2中對應位置的胺基酸的胺基酸序列，序列識別號4的情形，Xaa8、Xaa174及Xaa180為以下之表所明示的胺基酸，其它之Xaa為序列識別號1中對應位置的胺基酸的胺基酸序列)，評價於細胞膜的發現(圖4)。
[表1]
名稱 抗原 區域 Xaa8 Xaa149 (Xaa174) Xaa155 (Xaa180)
AChRα236 序列識別號1 - - -
AChRα236/V8E 序列識別號4 E W V
AChRα236/W149R 序列識別號4 V R V
AChRα236/V155A 序列識別號4 V W A
AChRα236/V8E/W149R 序列識別號4 E R V
AChRα236/V8E/X155A 序列識別號4 E W A
AChRα236/W149R/V155A 序列識別號4 V R A
AChRα236/V8E/W149R/V155A 序列識別號4 E R A
AChRα211 序列識別號2 - - -
AChRα211/V8E 序列識別號3 E W V
AChRα211/W149R 序列識別號3 V R V
AChRα211/V155A 序列識別號3 V W A
AChRα211/V8E/W149R 序列識別號3 E R V
AChRα211/V8E/X155A 序列識別號3 E W A
AChRα211/W149R/V155A 序列識別號3 V R A
AChRα211/V8E/W149R/V155A 序列識別號3 E R A
[結果] 辨明Δ59-83之突變導入係AChRα-CAAR之於細胞膜上表現所必要的突變。再者，出乎意料地發現V8E之突變使膜表現降低，W149R及V155A之突變顯著增加膜表現強度。
＜實施例4：適用於CAAR的AChRα突變體之檢討-3＞ 對W149及V155的突變對於AChRα211於膜表現的增加為有效的，由於皆為從疏水性胺基酸提高親水性的突變，因此認為對包含此等胺基酸的周邊部位的離胺酸取代於膜表現為有效的。因此，研究了在AChRα211的富含疏水性胺基酸的區域146-159區域中同樣地取代為離胺酸是否可獲得相同的效果。構築將作為由AChRα211之146-159區域的代表性胺基酸的147、149、151、153、155、157、159之各胺基酸取代為離胺酸的AChRα-CAAR表現載體(抗原區域：於序列識別號3中Xaa146-159為以下之表2的序列，其它之Xaa為序列識別號2之對應位置的胺基酸的胺基酸序列)，評價於細胞膜的表現(圖5)。
[表2]
名稱 Xaa146-159
AChRα211/G147K LKTWTYDGSVVAIN(序列識別號16)
AChRα211/W149K LGTKTYDGSVVAIN(序列識別號17)
AChRα211/Y151K LGTWTKDGSVVAIN(序列識別號18)
AChRα211/G153K LGTWTYDKSVVAIN(序列識別號19)
AChRα211/V155K LGTWTYDGSKVAIN(序列識別號20)
AChRα211/A157K LGTWTYDGSVVKIN(序列識別號21)
AChRα211/N159K LGTWTYDGSVVAIK(序列識別號22)
[結果] 確認全部的突變型AChRα-CAAR於細胞膜上表現。尤其是對G147、W149、V155、A157、N159的胺基酸取代使表現強度增加。
＜實施例5：適用於AChRα-CAAR的AChRα突變體之檢討-4＞ 對於AChRα211，為了將對W149及V155的胺基酸取代最佳化，構築以下之表3所示突變型AChRα-CAAR表現載體(抗原區域：於序列識別號3中Xaa149及Xaa155為以下之表所示的胺基酸，其它之Xaa為序列識別號2中對應的位置之胺基酸的胺基酸序列)，評價於細胞膜的表現(圖6及7)。
[表3]
名稱 Xaa149 Xaa155
AChRα211 W V
AChRα211/W149A A V
AChRα211/W149K K V
AChRα211/W149D D V
AChRα211/W149S S V
AChRα211/W149G G V
AChRα211/W149N N V
AChRα211/W149I I V
AChRα211/W149F F V
AChRα211/W149M M V
AChRα211/W149P P V
AChRα211/W149R R V
AChRα211/V155R W R
AChRα211/V155K W K
AChRα211/V155D W D
AChRα211/V155S W S
AChRα211/V155G W G
AChRα211/V155N W N
AChRα211/V155I W I
AChRα211/V155F W F
AChRα211/V155M W M
AChRα211/V155P W P
AChRα211/V155A W A
AChRα211/W149R/V155K R K
[結果] 確認全部的突變型AChRα-CAAR於細胞膜上表現。其中，尤以藉由對於W149進行R、K、P之胺基酸取代，對於V155進行K、A、M、D、P、G之胺基酸取代，而表現量增加。又，觀察到W149R及V155K之雙重突變增加了單獨突變約10倍的表現。
＜實施例6：AChRα-CAAR-T細胞對抗AChRα抗體產生融合瘤的殺細胞活性之評價＞ 研究表現於上述之實施例中確認有於細胞膜上表現的突變型AChRα被配置於抗原區域的AChRα-CAAR的CAAR-T細胞，對於為標的細胞的抗AChRα抗體產生融合瘤的殺細胞活性及反應中的增殖性(圖8)。
(1)細胞之製備 於抗原區域配置AChRα211、AChRα211/ V8E/W149R/V155A、AChRα211/W149R、AChRα211/ V155K或AChRα211/W149R/V155K的CAAR-T細胞，按照上述之各實施例而製作，並懸浮於基礎培養基。就標的細胞而言，使用產生為抗AChRα抗體的mAb35的融合瘤(ATCC, TIB-175)。為了檢測出標的細胞的生存狀態，藉由與CAAR基因導入的相同方法，製備有併入GFP基因的慢病毒，並使感染mAb35產生融合瘤，利用極限稀釋法進行次選殖(subcloning)，建立為有GFP基因導入的融合瘤細胞株。於融合瘤之培養使用了ClonaCell-HY Medium E(StemCELL, 3805)。
(2)殺細胞活性之評價 使用流式細胞儀，測定BFP陽性細胞數(CAAR-T細胞)，並以使CAAR-T細胞成為0.25x10 3～2x10 4個細胞/孔的方式，以使GFP陽性融合瘤成為1x10 4個細胞/孔的方式，各自添加於96孔盤中。培養使用基礎培養基及ClonaCell-HY Medium E的半培養基。3日後，懸浮於含有1-10 μg/mL的7-胺基放線菌素D的FACS Buffer中而使用流式細胞儀進行測定。輸出為FCS檔案後，使用FLOW JO軟體，於FSC/SSC圖中選擇細胞流份，選擇7-胺基放線菌素D染色為陰性的活細胞組。接著，活細胞組以X軸：BFP/Y軸：GFP展開，選擇BFP陽性組作為CAAR-T細胞，選擇GFP陽性組作為標的細胞，測定測定液中所含的細胞數。殺細胞活性係表示為將未添加CAAR-T細胞的孔中的細胞數設為100%的情形下殘存的標的細胞數。CAAR-T細胞之增殖係將反應開始前之細胞數設為100%而表示。
[結果] 與為陰性對照的T細胞之殺細胞活性比較可知，任一者之突變型CAAR-T細胞皆具有明確的殺細胞活性。又，即使為任一突變型，於反應結束時維持了CAAR-T細胞數，尤其於配置了AChRα211/V155K、AChRα211/V149R/V155K的CAAR-T細胞具有高增殖性。
＜實施例7：CAAR結構改變所致的殺細胞活性之改善＞ 實施例1-6中的檢討之結果，終將AChRα211/ W149R/V155K設為代表性的抗原區域。為了強化使用本抗原區域的CAAR-T之殺細胞活性，進行目前為止更進一步的位置突變的研究。已有報告在標的細胞上表現的抗原與CAR結構體scFv的親和性會對癌區域之CAR-T的藥效表現有影響(Benmebarek et al, Int J Mol Sci. 2019 Mar；20(6)：1283.)。又，藉由mAb35抗體和AChRα的立體結構解析(Noridomi et al, Elife. 2017 Apr 25；6：e23043.)，作為此等相互作用的胺基酸可列舉D14、D70、Y72及Y112。因此，為了使mAb35抗體與AChRα的距離拉開而使親和性降低，構築對AChRα211/W149R/V155K之與前述抗體結合有關連的胺基酸導入突變的CAAR表現用病毒載體(抗原區域：於序列識別號3中Xaa14、Xaa70、Xaa72及Xaa112為下表中所示的胺基酸，Xaa146-159為序列識別號23之胺基酸序列，其它Xaa為序列識別號2之對應位置的胺基酸的胺基酸序列)，而製作CAAR-T細胞，並評價殺細胞活性(圖9)。殺細胞活性之評價係以下列方法實施。
[表4]
名稱 Xaa14 Xaa70 Xaa72 Xaa112
AChRα211/W149R/V155K D D Y Y
AChRα211/D14A/W149R/V155K A D Y Y
AChRα211/D14G/W149R/V155K G D Y Y
AChRα211/D70N/W149R/V155K D N Y Y
AChRα211/D70A/W149R/V155K D A Y Y
AChRα211/Y72F/W149R/V155K D D F Y
AChRα211/Y112F/W149R/V155K D D Y F
(1)標的細胞(膜型mAb35-scFv表現RAJI細胞)之建立 將編碼於源自mAb35的scFv中配置源自CD8α的訊息分泌序列、連接子區域及跨膜區域的胺基酸序列(序列識別號24)的基因導入pLVSIN EF1α IRES-ZsGreen1 (Takara, 6192)。使用本載體，藉由與CAAR基因導入相同的方法而製備有併入本基因的慢病毒，使感染K562細胞(ATCC，CCL-243)及RAJI細胞(ATCC，CCL-86)，利用極限稀釋法進行次選殖，各別建立表現膜型mAb35抗體的細胞株。於株化細胞的培養，使用含有10%FBS的RPMI1640培養基(Thermo Fisher Scientific, 61870-036)。
(2)殺細胞活性之評價 於重症肌無力症患者之體內，為病因的抗AChRα抗體存在於血中。投予的CAAR-T細胞為了顯示藥理效果，AChRα-CAAR有必要與病原性B細胞等之BCR結合，但由於血中之抗AChRα抗體與CAAR結合，而有競爭性抑制與BCR的結合的可能性。又，對CAR結構物的持續性刺激被稱為強直傳訊(Tonic signaling)，已知為導致投予細胞衰亡的原因(非專利文獻：Long et al, Nat Med. 2015 Jun；21(6)：581-90. doi：10.1038/nm.3838.)。因此，評價了於為抗AChRα抗體的mAb35抗體之存在/非存在下的殺細胞活性。
使用流式細胞儀而測定製作的CAAR-T細胞之FLAG陽性率(CAAR發現率)而算出CAAR-T細胞數，將CAAR-T細胞及膜型mAb35-scFv表現K562細胞懸浮於增殖用培養基使各自成為7x10 5個細胞/孔，接種於6孔盤而培養7日。培養基交換係每2-3日以基礎培養基實施。對培養液進行採樣，以流式細胞儀測定，確認無ZsGreen1陽性細胞表示的膜型mAb35-scFv表現K562細胞殘留後，測定FLAG陽性細胞數作為CAAR-T細胞數。接著，各自使用含有10%FBS的RPMI1640培養基，將膜型mAb35-scFv表現RAJI細胞成為1x10 4個細胞/孔、CAAR-T細胞成為1x10 3、1x10 4或2x10 4個細胞/孔的方式，接種於96孔盤。於一部分盤中，以終濃度成為10 μg/mL的方式添加mAb35抗體(ATCC，源自TIB-175)。次日，將等量添加含有1-10 μg/mL 之7-胺基放線菌素D的FACS Buffer使用流式細胞儀測定。輸出為FCS檔案後，使用FLOW JO軟體，於FSC/SSC圖中選擇細胞流份，選擇7-胺基放線菌素D染色為陰性的活細胞組。接著，活細胞組以X軸：BFP/Y軸： ZsGreen1展開，選擇BFP陽性組作為CAAR-T細胞，選擇ZsGreen1陽性組作為標的細胞，測定在測定液中所含的細胞數。殺細胞活性表示為未添加CAAR-T細胞的孔中的標的細胞數設為100%的情形之殘存標的細胞數。
[結果] 得知無論是否存在mAb35抗體，CAAR-T細胞在所有突變體中皆具有殺細胞活性。
＜實施例8：利用CAAR結構的調節的殺細胞活性之改善-1＞ 已知連接子區域在癌領域中scFv作為結合子的CAR-T細胞的活性中發揮重要作用。因此，於作為抗原區域採用AChRα211/W149R/V155K的AChRα-CAAR中，針對從N末端缺損了作為連接子區域之源自CD8α的連接子區域(序列識別號5)或人工設計的撓性連接子(序列識別號41)的各AChRα-CAAR，構築病毒載體(抗原區域：AChRα211/W149R/V155K(於序列識別號3中，Xaa146-159為序列識別號23之胺基酸序列，其它Xaa為序列識別號2之對應位置的胺基酸的胺基酸序列)、連接子區域：下表之序列)，製作CAAR-T細胞，將該殺細胞活性以實施例7的方法評價(圖10)。
[表5]
名稱 序列
CD8(45) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(序列識別號5)
CD8(19) CRPAAGGAVHTRGLDFACD(序列識別號5之27-45)
CD8(14) GGAVHTRGLDFACD(序列識別號5之32-45)
CD8(8) RGLDFACD(序列識別號5之38-45)
CD8(4) FACD(序列識別號5之42-45)
CD8(2) CD(序列識別號5之44-45)
撓性連接子(14) ASGGGGSGGGGSSG(序列識別號41)
撓性連接子(8) SGGGGSSG(序列識別號41之7-14)
撓性連接子(4) GSSG(序列識別號41之11-14)
[結果] 確認了無論是否有mAb35抗體存在，全部的突變體於CAAR-T細胞皆具有殺細胞活性。暗示於採用細胞膜外區域的全長作為抗原區域的AChRα-CAAR，連接子的存在可能不重要。
＜實施例9：適用於AChRα-CAAR的共刺激區域之檢討＞ 已知共刺激區域於CAR-T之功能表現發揮重要作用。因此，探討利用以下方法的AChRα-CAAR中的各種共刺激區域之效果。 (1)CAAR-T細胞之製備 構築於採用作為抗原區域之AChRα211/ W149R/V155K、作為連接子區域之FACD(序列識別號5之42-45)或FASD(序列識別號39之42-45、Xaa44=S)的AChRα-CAAR中，共刺激區域置換為CAR-T中公知之各式各樣的序列或為與T細胞的長壽有關連的TNF受體超家族已知的各式各樣序列的病毒載體(抗原區域：源自AChRα211/W149R/V155K(於序列識別號3，Xaa146-159為序列識別號23之胺基酸序列，其它Xaa為序列識別號2中對應位置的胺基酸的胺基酸序列)、共刺激區域：4-1BB(序列識別號7)、CD28(序列識別號25)、GITR(序列識別號26)、TNFR2(序列識別號27)、DR3(序列識別號28)、CD30(序列識別號29)、HVEM(序列識別號30)、CD27(序列識別號31)或OX40(序列識別號32)的序列)。使複數個之源自供予者的人類末梢血液單核球感染上述之各種AChRα-CAAR發現用病毒載體，而製作CAAR-T細胞，以下列方法評價殺細胞活性(圖11)。
(2)標的細胞(膜型mAb35表現RAJI細胞)之建立 將編碼胺基酸序列(序列識別號33)的基因導入pLVSIN EF1α IRES-ZsGreen1，其中該胺基酸序列係將mAb35抗體(源自大鼠)之H鏈恆定區取代為膜型人類IgG1的肽與將mAb35之L鏈恆定區取代為人類Igκ的肽以T2A連結的胺基酸序列。又，由於膜型抗體之穩定表現需要CD79a及CD79b的共同表現，故將編碼全長CD79a及全長CD79b以T2A連結的胺基酸序列(序列識別號34)的基因導入pLVSIN EF1α pur。使用此等載體，利用與CAAR基因導入之相同方法，各自製備有併入此等基因的慢病毒，使其感染RAJI細胞(ATCC，CCL-86)，利用極限稀釋法進行次選殖，建立表現膜型mAb35抗體及CD79a/CD79b的細胞株。於株化細胞之培養，使用含有10%FBS的RPMI1640培養基。於活性評價時，使用事先取代為基礎培養基而馴化的細胞株。
(3)殺細胞活性之評價 於如上述製備的各種CAAR-T細胞，使用流式細胞儀，測定BFP陽性細胞數(CAAR-T細胞)，以成為1x10 3個細胞/孔的方式，標的細胞成為1x10 4個細胞/孔的方式，各自接種於96孔盤。培養基使用增殖用培養基。2日後，以標的細胞成為1x10 5個細胞/孔的方式追加接種，進一步培養4日。等量添加含有1-10 μg/mL的7-胺基放線菌素D的FACS Buffer而使用流式細胞儀進行測定。輸出為FCS檔案後，使用FLOW JO軟體，於FSC/SSC圖中選擇細胞流份，選擇7-胺基放線菌素D染色為陰性的活細胞組。接著，活細胞組以X軸：BFP/Y軸：ZsGreen1展開，選擇BFP陽性組作為CAAR-T細胞，選擇ZsGreen1陽性組作為標的細胞，測定測定液中所含的細胞數。殺細胞活性係表示為將未添加CAAR-T細胞的孔中的細胞數設為100%的情形下殘存的標的細胞數。
[結果] 配置任何共刺激分子的AChRα-CAAR皆無由於供予者之間所致的差異，與為陰性對照的T細胞比較，具有顯著高的殺細胞活性(Dunnett’s-test, p＜0.01)。由此可確認，本發明之AChRα-CAAR可採用於CAR-T領域所採用的各式各樣的共刺激區域、源自屬於TNF受體超家族的各式各樣的受體之細胞內域的序列等之各式各樣的序列作為共刺激區域。
＜實施例10：利用CAAR結構之調結的殺細胞活性之改善-2＞ 進行以下研究以進一步研究關於共刺激分子及連接子區域/跨膜區域。 構築分別採用作為抗原區域之AChRα211/ W149R/V155K(序列識別號3)、作為共刺激分子之HVEM的AChRα-CAAR中採用以下之表中所示的連接子區域的病毒載體(抗原區域：AChRα211/ W149R/V155K(於序列識別號3，Xaa146-159為序列識別號23之胺基酸序列，其它之Xaa為序列識別號2之對應的位置之胺基酸的胺基酸序列)，連接子區域：以下之表的序列、跨膜區域：以下之表的序列、共刺激區域：HVEM(序列識別號30)，而製作CAAR-T細胞，該殺細胞活性使用膜型mAb35-scFv表現RAJI細胞而以實施例9之方法評價(圖12)。
[表6]
名稱 連接子區域 跨膜 區域
CD8(+/+45) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (序列識別號39之1-45：Xaa27,44=C) 序列識別號6
CD8(+/-45) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFASD (序列識別號39之1-45：Xaa27=C、Xaa44=S) 序列識別號6
CD8(-/+45) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFACD (序列識別號39之1-45：Xaa27＝S,Xaa44=C) 序列識別號6
CD8(-/-45) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFASD (序列識別號39之1-45：Xaa27,44=S) 序列識別號6
CD8(+/+25) SLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (序列識別號39之21-45：Xa27,a44=C) 序列識別號6
CD8(+/-25) SLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFASD (序列識別號39之21-45：Xaa27=C, Xaa44=S) 序列識別號6
CD8(-/+25) SLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFACD (序列識別號39之21-45：Xaa27=S,Xaa44=C) 序列識別號6
CD8(-/-25) SLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFASD (序列識別號39之21-45：Xaa27,44=S) 序列識別號6
CD8(+10) HTRGLDFACD (序列識別號39之36-45：(Xaa44=C) 序列識別號6
CD8(-10) HTRGLDFASD (序列識別號39之36-45：Xaa44=S) 序列識別號6
CD28(+39) IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (序列識別號40：Xaa28=C) 序列識別號37
CD28(-39) IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLSPSPLFPGPSKP (序列識別號40：Xaa28=S) 序列識別號37
(-) 無連接子 序列識別號6
[結果] 配置任何連接子區域/跨膜區域的AChRα-CAAR皆無由於供予者之間所致的差異，具有顯著殺細胞活性(Dunnett’s-test, p＜0.01)。由此可確認，於本發明之CAAR中連接子區域的有無對活性並無影響，又與連接子區域之序列、長度無關，皆發揮作為CAAR的功能。
＜實施例11：CAAR-T細胞之體內的殺細胞活性評價＞ 為了評價CAAR-T細胞之體內的殺細胞活性，進行使用為免疫不全小鼠的NOG小鼠(NOD/Shi-scid, IL-2Rγ＜null＞)的藥理試驗。於重症肌無力症患者之體內為病因的抗AChRα抗體存在於血中，推測抗AChRα抗體會與投予的CAAR-T細胞之AChRα-CAAR結合，且有可能由於抗體依賴性細胞傷害活性而蒙受從體內排除。即使於NOG小鼠中NK細胞活性低，但因有巨噬細胞存在，而有蒙受相同的排除的可能性，為了抑制這種情況，認為有必要用大量γ球蛋白(IVIg)等之處理。由於IVIg源自人類，因此認為為了該抑制作用的表現，抗AChRα抗體(mAb35抗體)之恆定區亦源自人類者為反映實際臨床，而於本試驗中，使用人類化mAb35抗體(mAb35-hIgG1)，進行以下之實驗。
mAb35-hIgG1係分別製作將mAb35抗體之H鏈恆定區取代為人類IgG1的多肽(序列識別號35)之表現質體、mAb35抗體之L鏈恆定區取代為Igκ的多肽(序列識別號36)之表現質體，並將其進行基因導入至HEK293細胞，將回收的培養上清液以Protein A純化而製備。又，將作為訊息肽及標籤肽之序列識別號48之胺基酸序列配置於N末端，構築用以表現採用作為抗原區域之AChRα211/W149R/V155K的AChRα-CAAR(序列識別號43)的病毒載體，而製作CAAR-T細胞。
於試驗開始前日，將IVIg(Baxter, 4987456506071,Gammagard靜脈注射用2.5g)以10 mg/頭，mAb35-hIgG1以20 μg/頭尾靜脈投予。將實施例7所製作的膜型mAb35-scFv表現RAJI細胞5x10 5個細胞/頭進行尾靜脈投予。4小時後，將上述之CAAR-T細胞以6x10 6個細胞/頭進行尾靜脈投予。14日後安樂死，採取血液、脾臓及骨髓(單側的大腿骨及脛骨)，並機械性地分散。
採取的各組織使用RBC Lysis Buffer (Thermo Fisher Scientific、00-4333-57)而溶血後，將APC anti-DYKDDDDK Tag Antibody(抗FLAG抗體，Biolegend，637308)及PE anti-human CD3(Biolegend，317308)以FACS Buffer稀釋100倍後，添加於細胞而於4℃反應15分鐘，以FACS Buffer洗淨。已抗體染色的細胞懸浮於含有1 μg/mL 7-胺基放線菌素D的FACS Buffer並使用流式細胞儀進行測定。輸出為FCS檔案後，使用FLOW JO軟體，於FSC/SSC圖中選擇細胞流份，選擇7-胺基放線菌素D染色為陰性的活細胞組。接著，活細胞組以X軸：ZsGreen1/Y軸：SSC展開，將ZsGreen1陽性組設為膜型mAb35-scFv表現RAJI細胞而測定(圖13)。
[結果] 與對照T細胞投予組比較，血液、脾臓、骨髓中的膜型mAb35-scFv表現RAJI細胞數於AChRα-CAAR-T投予組中顯著地被抑制(T-test, p＜0.01)。
＜實施例12：AChRα-CAAR-T細胞對源自AChRα敏感性小鼠的抗AChRα抗體產生B細胞的殺細胞活性的評價＞ 為了治療抗AChRα抗體之產生成為原因的重症肌無力症，有必要去除與自體抗體產生有關的病原性B細胞。因此作為反映實際臨床的標的細胞，製備含有與AchRα蛋白質敏感的小鼠之脾臓中所含的抗AChRα抗體產生有關連的B細胞的脾細胞，AChRα-CAAR-T細胞之殺細胞活性以培養上清液中所含的抗AChRα抗體量作為指標進行檢討。
(1)CAAR-T細胞之製備 構築將作為訊息肽及標籤肽的序列識別號48之胺基酸序列配置於N末端，用以使表現作為抗原區域之採用AChRα211/W149R/V155K的2種類之AChRα-CAAR(AChRα/W149R/V155K＞4aa＞4-1BB：序列識別號44、AChRα/W149R/V155K ＞14aa＞OX40：序列識別號47)的慢病毒載體。使上述之AChRα-CAAR表現用病毒載體感染人類末梢血液單核球，而製作CAAR-T細胞。
(2)脾細胞(抗AChRα抗體產生B細胞)之製備 為了製備作為標的細胞之抗AChRα抗體產生細胞，將包含與為佐劑的Alhydrogel(註冊商標) adjuvant 2% (invivogen, vac-alu-250) 1：1混合的5-10μg之重組AChRα蛋白質的溶液100 μL對C57BL/6J小鼠進行皮下接種。14日後，同樣地追加5-10μg之重組AChRα蛋白質而皮下接種。再7日後將相同小鼠安樂死後，採取脾臓。脾臓細切後，於40 μm之細胞過濾器上磨碎，懸浮於基礎培養基，並製備包含抗AChRα抗體產生B細胞的脾細胞懸浮液。
(3)殺細胞活性之評價 對於如上述製備的各種CAAR-T細胞，使用APC anti-DYKDDDDK抗體及流式細胞儀，測定FLAG陽性細胞數(CAAR-T細胞)，各自以成為1x10 5個細胞/孔、脾細胞成為1x10 5個細胞/孔的方式，接種於96孔盤。培養基使用於增殖用培養基中添加0.001%之1-硫代甘油(Sigma, M6145)的培養基。為了促進抗體產生而以終濃度成為1 μM的方式添加為TLR9配位體的K3(Ajinomoto Bio-Pharma, CN-65003)。培養8日後，回收培養上清液。為了測定培養上清液中之抗AChRα抗體量，在96孔盤中接種AChRα表現Jurkat細胞使成為4x10 4cells /孔，添加40 μL培養上清液而於4℃反應10～20分鐘，以FACS Buffer洗淨。將APC anti-mouse IgG Antibody(Biolegend, 405308)以FACS Buffer稀釋100倍後，添加至細胞而於4℃反應10～20分鐘，以FACS Buffer洗淨。等量添加含有2 μg/mL的7-胺基放線菌素D的FACS Buffer而使用流式細胞儀測定。輸出為FCS檔案後，使用FLOW JO軟體，於FSC/SSC圖中選擇細胞流份，選擇7-胺基放線菌素D染色為陰性的活細胞組。接著，活細胞組以X軸：APC/Y軸：細胞數展開，測定作為培養上清液中所含的抗AChRα抗體量的平均螢光強度(MFI)，並間接地測定由於AChRα-CAAR-T細胞的抗AChRα抗體產生B細胞之殺細胞活性。將結果示於圖14。
[結果] 與對照T細胞投予組比較，培養上清液中所含的抗AChRα抗體量，於AChRα-CAAR(4aa/4-1BB及14aa/OX40)-T細胞投予組中被抑制。由此結果暗示本發明之AChRα-CAAR-T細胞以產生抗AChRα抗體的B細胞為標的而殺傷該B細胞。
＜序列表非關鍵詞文字＞ 序列識別號1：AChRα236(人類天然型AChRα次單元細胞外域) 序列識別號2：AChRα211 (Δ59-74人類AChRα次單元細胞外域) 序列識別號3：AChRα211-突變體(Xaa：8、14、70、72、112、146-159、192、193) 序列識別號4：AChRα236 突變體(Xaa：8、171-184) 序列識別號5：CD8a連接子區域 序列識別號6：CD8a跨膜區域序列 序列識別號7：4-1BB共刺激區域 序列識別號8：CD3ζ細胞內訊息區域 序列識別號9：CD8α訊息肽序列 序列識別號10：人類AChRα訊息肽序列 序列識別號11：人類免疫球蛋白訊息肽序列 序列識別號12：AChRβ 序列識別號13：AChRδ 序列識別號14：AChRε 序列識別號15：主要免疫原區 序列識別號16：疏水性區域(146-159)、G147K突變 序列識別號17：疏水性區域(146-159)、W149K突變 序列識別號18：疏水性區域(146-159)、Y151K突變 序列識別號19：疏水性區域(146-159)、G153K突變 序列識別號20：疏水性區域(146-159)、V155K突變 序列識別號21：疏水性區域(146-159)、A157K突變 序列識別號22：疏水性區域(146-159)、N159K突變 序列識別號23：疏水性區域(146-159)、V155K突變 序列識別號24：膜型mAb35-scFv 序列識別號25：CD28共刺激區域 序列識別號26：GITR共刺激區域 序列識別號27：TNFR2共刺激區域 序列識別號28：DR3共刺激區域 序列識別號29：CD30共刺激區域 序列識別號30：HVEM共刺激區域 序列識別號31：CD27共刺激區域 序列識別號32：OX40共刺激區域 序列識別號33：人類化膜型mAb35 序列識別號34：CD79a/CD79b 序列識別號35：mAb35-hIgG1 序列識別號36：mAb35-hIgGκ 序列識別號37：CD28跨膜區域 序列識別號38：AChR跨膜區域 序列識別號39：CD8α連接子區域(Xaa27、44= C或S) 序列識別號40：CD28連接子區域(Xaa28= C或S) 序列識別號42：AChRα/W149X/V155X 序列識別號43～47：AChRα-CAAR全長序列 序列識別號48：訊息-FLAG-肽
無
[圖1] (A)AChRα-CAAR之模式圖：使抗原區域(AChRα)、連接子區域(Linker)、跨膜區域(TM，Transmembrane)、細胞內共刺激分子(Co-stimulatory domain)及細胞內訊息分子(Signaling domain)連結。(B)AChRα-CAAR之胺基酸全長序列：顯示關於作為典型的AChRα-CAAR之AChRα211/W149R/V155K的序列。 [圖2-1] 圖2為人類T細胞中的各種AChRα-CAAR之膜表現進行流式細胞儀解析的結果。 圖2(A)以訊息肽(CD8α)、抗原區域(AChRα236)、共刺激分子(4-1BB)及訊息分子(CD3ζ)為共通，連接子區域及跨膜區域使用源自AChRα或CD8α，而構築並表現AChRα-CAAR。使FLAG標籤肽結合於CAAR，並使用BFP作為基因導入之報導子。各自於X軸呈示BFP的表現，Y軸呈示FLAG標籤的表現。以BFP陰性細胞組為基準的以4分割線為輔助線的散布圖表示，並以粗邊框表示BFP陽性/CAAR(FLAG)陽性表現細胞分離(cell fractionation)。 圖2(B)係將以抗原區域(AChRα236)、連接子區域(CD8α)、跨膜區域(CD8α)、共刺激分子(4-1BB)及訊息分子(CD3ζ)為共通，訊息肽使用源自CD8α、AChRα或IgE而構築並表現AChRα-CAAR的情形，(A)以訊息肽(CD8α)、抗原區域(AChRα236)、共刺激分子(4-1BB)及訊息分子(CD3ζ)為共通，連接子區域及跨膜區域使用源自AChRα或CD8α而構築並表現ChRα-CAAR的情形之AChRα陽性細胞以直方圖表示的圖。 [圖2-2] 圖2(C)係除了與圖2(B)相同的AChRα-CAAR之外，將使其它AChR次單元(AChRβ、AChRδ及AChRε)共同表現的情形之AChRα陽性細胞以直方圖表示的圖。(-○-)表示非基因導入T細胞，(-Δ-)表示AChRα236-CAAR導入T細胞，(-□-)表示AChRβ、AChRδ及AChRε導入T細胞，(-◇-)表示AChRα236-CAAR、AChRβ、AChRδ及AChRε導入T細胞。 圖2(D)係將主要免疫原區作為抗原區域，採用訊息肽(CD8α)、連接子區域(CD8α)、跨膜區域(CD8α)、共刺激分子(4-1BB)及訊息分子(CD3ζ)，而構築並表現AChRα-CAAR的情形之CAAR的表現，以與圖2(A)同樣的散布圖表示。 圖2(E)係將AChRα236/V8E/W174R/V180A(左圖)或AChRα236/△59-83/V8E/W174R/V180A(AChRα211/V8E/W149R/V155A、右圖)作為抗原區域，採用訊息肽(CD8α)、連接子區域(CD8α)、跨膜區域(CD8α)、共刺激分子(4-1BB)及訊息分子(CD3ζ)，而構築並表現AChRα-CAAR的情形之CAAR的表現，以與圖2(A)同樣的散布圖表示。 [圖3] 圖3係將對AChRα211或AChRα236各自導入V8E、W149R及/或V155A突變的AChRα-CAAR之人類T細胞中的表現，以藉由抗FLAG抗體反應的螢光強度評價。使用螢光蛋白質作為基因導入的報導子，以BFP陰性細胞組為基準的將4分割線作為輔助線表示的散布圖表示。於圖中呈示X軸及Y軸的參數及對應的CAAR-T細胞。 [圖4] 圖4係以流式細胞儀解析對AChRα211或AChRα236各自導入V8E、W149R及/或V155A突變的AChRα-CAAR之人類T細胞中的表現。(A)將使用螢光蛋白質作為基因導入之報導子，以BFP陰性細胞組為基準的以4分割線作為輔助線的散布圖表示，將BFP陽性CAAR陽性表現細胞分離以粗邊框表示。X軸呈示BFP之螢光強度，Y軸呈示mAb35抗體反應。(B)將(A)中的各基因導入T細胞之BFP陽性細胞組進行閘控，將mAb35抗體反應性以平均螢光強度(Mean Fluorescent Intensity (MFI))表示。 [圖5] 圖5係以流式細胞儀解析使用對AChRα211各自導入G147K、W149K、Y151K、G153K、V155K、A157K或N159K突變的抗原區域的AChRα-CAAR之人類T細胞中的表現。(A)使用螢光蛋白質作為基因導入之報導子，以BFP陰性細胞組為基準的以4分割線作為輔助線的散布圖表示，將BFP陽性CAAR陽性表現細胞分離以粗邊框表示。X軸呈示BFP之螢光強度，Y軸呈示FLAG抗體反應。(B)將(A)中的各基因導入T細胞之BFP陽性細胞組進行閘控，將FLAG抗體反應性以平均螢光強度(MFI)表示。 [圖6] 圖6係以流式細胞儀解析使用對AChRα211各自導入W149A、W149K、W149D、W149S、W149G、W149N、W149I、W149F、W149M、W149P、W149R、V155R、V155K、V155D、V155S、V155G、V155N、V155I、V155F、V155M、V155P、V155A突變的抗原區域的AChRα-CAAR之人類T細胞的表現。(A)使用螢光蛋白質作為基因導入之報導子，以BFP陰性細胞組為基準的以4分割線作為輔助線的散布圖表示，將BFP陽性CAAR陽性表現細胞分離以粗邊框表示。X軸呈示BFP之螢光強度，Y軸呈示FLAG抗體反應。(B)將(A)中的各基因導入T細胞之BFP陽性細胞組進行閘控，將FLAG抗體反應性以平均螢光強度(MFI)表示。 [圖7] 圖7係以流式細胞儀解析使用對AChRα211各自導入W149R、V155K、W149R/V155K或V8E/W149R/V155A突變的抗原區域的AChRα-CAAR之人類T細胞中的表現。(A)使用螢光蛋白質作為基因導入之報導子，以BFP陰性細胞組為基準的以4分割線作為輔助線的散布圖表示，將BFP陽性CAAR陽性表現細胞分離以粗邊框表示。X軸呈示BFP之螢光強度，Y軸呈示FLAG抗體反應。(B)將(A)中的各基因導入T細胞之BFP陽性細胞組進行閘控，將FLAG抗體反應性以平均螢光強度(MFI)表示。 [圖8] (A)顯示使用於圖7製作的CAAR-T細胞，對融合瘤的殺細胞活性的折線圖：X軸表示效應子(Effector(CAAR-T細胞))與標的(Target(融合瘤))之混合細胞數比(E/T比率)，Y軸表示將未添加CAAR-T細胞的融合瘤的終點的細胞數設為100%的殘餘。(B)表示(A)所示的殺細胞試驗中的各CAAR-T細胞之增殖的長條圖：Y軸表示將反應開始時之細胞數設為100%的增殖。圖中之2、1、0.5、0.25、0.125表示對應的E/T。 [圖9] 圖9於人類T細胞中表現使用對AChRα211/W149R/V155K導入D14A、D14G、D70N、D70A、Y72F或Y112F之突變的抗原區域的AChRα-CAAR，評價對膜型mAb35-scFv表現細胞的殺細胞活性。左圖為未添加mAb35抗體之條件下的數據，右圖為添加mAb35抗體之條件下的數據。圖中之2、1、0.1表示E/T(效應子/標的)比。Y軸表示未添加CAAR-T細胞的標的細胞之終點中的細胞數設為100%的殘存數。 [圖10] 圖10將AChRα211/W149R/V155K作為抗原區域，使採用源自CD8α的連接子(A)或撓性連接子(B&C)的AChRα-CAAR於人類T細胞中表現，評價對膜型mAb35-scFv表現細胞的殺細胞活性。圖中之2、1、0.1表示E/T(效應子/標的)比。Y軸表示未添加CAAR-T細胞的標的細胞之終點的細胞數設為100%的殘存。 [圖11] 圖11係將AChRα211/W149R/V155K設為抗原區域，使用源自CD8α的4個胺基酸(導入FACD或CS突變的FASD)作為連接子區域，作為共刺激分子，將採用CD28、GITR、TNFR2、DR3、CD30、HVEM、CD27、4-1BB或OX40的AChRα-CAAR基因導入至源自複數個T細胞而構築CAAR-T細胞，將對膜型mAb35表現RAJI細胞的殺細胞活性作為箱形圖表示。Y軸表示未添加CAAR-T細胞的標的細胞之終點的細胞數設為100%的殘存。 [圖12] 圖12係對將AChRα211/W149R/V155K設為抗原區域，採用HVEM作為共刺激分子的AChRα-CAAR，使作為連接子區域之源自CD28或CD8α的連接子的胺基酸進行各種缺損或突變，基因導入至源自複數個供予者的T細胞而構築CAAR-T細胞，對膜型mAb35表現RAJI細胞的殺細胞活性以箱形圖表示。X軸表示各AChRα-CAAR之連接子區域的來源及突變，括弧內的數字表示連接子的長度，±表示半胱胺酸之絲胺酸取代的部位及數目(表6)。Y軸表示將未添加CAAR-T細胞的標的細胞之終點的細胞數設為100%的殘存。 [圖13] 圖13係對將AChRα211/W149R/V155K設為抗原區域的CAAR-T細胞(Vector#53)之膜型mAb35-scFv表現RAJI細胞的殺細胞活性，使用NOG小鼠的Xenograft模型而評價的箱形圖。CAAR-T細胞投予14日後之血中40μL、全部脾臓、大腿骨及脛骨(各一側)中的膜型mAb35-scFv表現RAJI細胞之細胞數。對照組T表示非基因導入T細胞。 [圖14] 圖14係呈示對與抗AChRα抗體產生有關連的B細胞的殺細胞活性的圖，該B細胞係包含在使於實施例12使用的AChRα-CAAR表現的T細胞之以AchRα蛋白質敏感化的小鼠之脾臓中。Y軸呈示平均螢光強度(MFI)作為培養上清液中所含的抗AChRα抗體量。對照組T表示非基因導入T細胞。分別地表示「4aa/4-1BB」將AChRα/W149R/V155K＞4aa＞4-1BB，「14aa/OX40」將AChRα/W149R/V155K＞14aa＞OX40，表現為AChRα-CAAR的T細胞的結果。 [圖15] 圖15為呈示本發明之嵌合受體的全長胺基酸序列的圖。 [圖16] 圖16為呈示本發明之嵌合受體的全長胺基酸序列的圖。
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無。

Claims (31)

  1. 一種嵌合受體多肽，其係：包含抗人類菸鹼性乙醯膽鹼受體α1次單元(nAChRα1)抗體可結合的抗原區域的細胞外域、跨細胞膜區域、及包含細胞內訊息傳遞區域的細胞內域，從N末端向C末端依上述順序配置的嵌合受體多肽；此處，該抗原區域之胺基酸序列為包含序列識別號2記載之胺基酸序列的區域、或者為包含在序列識別號2記載之胺基酸序列中有一個或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或加成的胺基酸序列的區域。
  2. 如請求項1之多肽，其中抗原區域為包含下列的區域：在序列識別號2記載之胺基酸序列中，可有序列識別號3之Xaa所表示的胺基酸之至少一者被取代，作為進一步追加修飾之於序列識別號3之Xaa所表示的胺基酸以外的位置可有一個或數個胺基酸被刪除、插入及/或加成的胺基酸序列。
  3. 如請求項2之多肽，其中追加修飾為序列識別號2之N末端及/或C末端中的1～5個胺基酸的刪除或加成。
  4. 如請求項2或3之多肽，其中在序列識別號3之胺基酸序列中，各Xaa為以下所示的胺基酸； Xaa8為疏水性胺基酸或酸性胺基酸， Xaa14為酸性胺基酸或疏水性胺基酸， Xaa70為酸性胺基酸、在側鏈具有醯胺基的胺基酸或疏水性胺基酸， Xaa72為疏水性胺基酸， Xaa112為疏水性胺基酸， Xaa149為親水性胺基酸、疏水性胺基酸， Xaa155為疏水性胺基酸或親水性胺基酸， Xaa146～Xaa148、Xaa150～Xaa154及Xaa156～Xaa159之胺基酸各自獨立為鹼性胺基酸或疏水性胺基酸， Xaa192及Xaa193各自獨立為Cys或Gly； [於上述，疏水性胺基酸為Val、Ala、Leu、Ile、Gly、Trp、Tyr、Phe、Met或Pro；親水性胺基酸為Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln或Ser；酸性胺基酸為Asp或Glu；鹼性胺基酸為Arg或Lys；在側鏈具有醯胺基的胺基酸為Asn或Gln]。
  5. 如請求項4之多肽，其中在序列識別號3之胺基酸序列中，各Xaa為以下所示的胺基酸； Xaa8為Val或Glu， Xaa14為Asp、Ala或Gly， Xaa70為Asp、Asn或Ala， Xaa72為Tyr或Phe， Xaa112為Tyr或Phe， Xaa149為Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro， Xaa155為Trp、Arg、Ala、Lys、Asp、Ser、Gly、Asn、Ile、Phe、Met或Pro， Xaa146～Xaa148、Xaa150～Xaa154及Xaa156～Xaa159之胺基酸各自獨立為序列識別號2中的對應部位的胺基酸或Lys， Xaa192及Xaa193各自獨立為Cys或Gly。
  6. 如請求項5之多肽，其中在序列識別號3之胺基酸序列中，Xaa149為Trp、Lys、Arg或Pro，Xaa155為Val、Ala、Gly、Lys、Arg、Pro、Met、Asp、Asn、Glu、Gln或Ser。
  7. 如請求項6之多肽，其中在序列識別號3之胺基酸序列中，Xaa149及Xaa155為Lys或Arg。
  8. 如請求項1之多肽，其中抗原區域為選自以下之群組中的任一者： 抗原區域：AChRα211、AChRα211/V8E、AChRα211/ W149R、AChRα211/W149K、AChRα211/ W149P、AChRα211/V155A、AChRα211/V155K、AChRα211/V155M、AChRα211/V155D、AChRα211/ V155P、AChRα211/C192G、AChRα211/C193G、AChRα211/C192G/C193G、 AChRα211/V8E/W149R、AChRα211/V8E/W149K、AChRα211/V8E/W149P、AChRα211/V8E/V155A、AChRα211/V8E/V155K、AChRα211/V8E/V155M、AChRα211/V8E/V155D、AChRα211/V8E/ V155P、AChRα211/V8E/C192G、AChRα211/V8E/C193G、AChRα211/V8E/C192G/C193G、 AChRα211/W149R/V155A、AChRα211/W149R/ V155K、AChRα211/W149R/V155M、AChRα211/W149R/ V155D、AChRα211/W149R/V155P、AChRα211/W149R/ C192G、AChRα211/W149R/C193G、AChRα211/W149R/ C192G/C193G、 AChRα211/W149K/V155A、AChRα211/W149K/ V155K、AChRα211/W149K/V155M、AChRα211/W149K/ V155D、AChRα211/W149K/V155P、AChRα211/W149K/ C192G、AChRα211/W149K/C193G、AChRα211/W149K/ C192G/C193G、 AChRα211/W149P/V155A、AChRα211/W149P/ V155K、AChRα211/W149P/V155M、AChRα211/W149P/ V155D、AChRα211/W149P/V155P、AChRα211/W149P/ C192G、AChRα211/W149P/C193G、AChRα211/W149P/ C192G/C193G、 AChRα211/V8E/W149R/V155A、AChRα211/V8E/ W149R/V155K、AChRα211/V8E/W149R/V155M、AChRα211/V8E/W149R/V155D、AChRα211/V8E/W149R/ V155P、AChRα211/V8E/W149R/C192G、AChRα211/ V8E/W149R/C193G、AChRα211/V8E/W149R/C192G/ C193G、 AChRα211/V8E/W149K/V155A、AChRα211/V8E/ W149K/V155K、AChRα211/V8E/W149K/V155M、AChRα211/V8E/W149K/V155D、AChRα211/V8E/ W149K/V155P、AChRα211/V8E/W149K/C192G、AChRα211/V8E/W149K/C193G、AChRα211/V8E/W149K/ C192G/C193G、 AChRα211/V8E/W149P/V155A、AChRα211/V8E/ W149P/V155K、AChRα211/V8E/W149P/V155M、AChRα211/V8E/W149P/V155D、AChRα211/V8E/W149P/ V155P、AChRα211/V8E/W149P/C192G、AChRα211/V8E/W149P/C193G、AChRα211/V8E/W149P/ C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155A/C192G、AChRα211/W149R/V155K/C192G、AChRα211/W149R/ V155M/C192G、AChRα211/W149R/V155D/C192G、AChRα211/W149R/V155P/C192G、 AChRα211/W149K/V155A/C192G、AChRα211/ W149K/V155K/C192G、AChRα211/W149K/V155M/ C192G、AChRα211/W149K/V155D/C192G、AChRα211/ W149K/V155P/C192G、 AChRα211/W149P/V155A/C192G、AChRα211/ W149P/V155K/C192G、AChRα211/W149P/V155M/ C192G、AChRα211/W149P/V155D/C192G、AChRα211/ W149P/V155P/C192G AChRα211/W149R/V155A/C193G、AChRα211/ W149R/V155K/C193G、AChRα211/W149R/V155M/ C193G、AChRα211/W149R/V155D/C193G、AChRα211/ W149R/V155P/C193G、 AChRα211/W149K/V155A/C193G、AChRα211/ W149K/V155K/C193G、AChRα211/W149K/V155M/ C193G、AChRα211/W149K/V155D/C193G、AChRα211/ W149K/V155P/C193G、 AChRα211/W149P/V155A/C193G、AChRα211/ W149P/V155K/C193G、AChRα211/W149P/V155M/ C193G、AChRα211/W149P/V155D/C193G、AChRα211/ W149P/V155P/C193G、AChRα211/W149R/ V155A/ C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155K/C192G/ C193G、AChRα211/W149R/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149R/V155D/C192G/C193G、AChRα211/ W149R/V155P/C192G/C193G、 AChRα211/W149K/V155A/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155K/C192G/C193G、AChRα211/ W149K/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149K/ V155D/C192G/C193G、AChRα211/W149K/V155P/ C192G/C193G、 AChRα211/W149P/V155A/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155K/C192G/C193G、AChRα211/ W149P/V155M/C192G/C193G、AChRα211/W149P/ V155D/C192G/C193G、AChRα211/W149P/V155P/ C192G/C193G、AChRα211/D14G/W149R/V155K、AChRα211/D14G/W149R/V155A、AChRα211/D14G/ W149R/V155M、AChRα211/D14G/W149R/V155D、AChRα211/D14G/W149R/V155P、AChRα211/D14G/ W149R/V155G、AChRα211/D14G/W149K/V155K、AChRα211/D14G/W149K/V155A、AChRα211/D14G/ W149K/V155M、AChRα211/ D14G/W149K/V155D、AChRα211/D14G/W149K/V155P、AChRα211/D14G/ W149K/V155G、AChRα211/D14G/W149P/V155K、AChRα211/D14G/W149P/V155A、AChRα211/D14G/ W149P/V155M、AChRα211/D14G/W149P/V155D、AChRα211/D14G/W149P/V155P、AChRα211/D14G/ W149P/V155G、AChRα211/D14A/W149R/V155K、AChRα211/D14A/W149R/V155A、AChRα211/D14A/ W149R/V155M、AChRα211/D14A/W149R/V155D、AChRα211/D14A/W149R/V155P、AChRα211/D14A/ W149R/V155G、AChRα211/D14A/W149K/V155K、AChRα211/D14A/W149K/V155A、AChRα211/D14A/ W149K/V155M、AChRα211/ D14A/W149K/V155D、AChRα211/D14A/W149K/V155P、AChRα211/D14A/ W149K/V155G、AChRα211/D14A/W149P/V155K、AChRα211/D14A/W149P/V155A、AChRα211/D14A/ W149P/V155M、AChRα211/D14A/W149P/V155D、AChRα211/D14A/W149P/V155P、或、AChRα211/D14A/ W149P/V155G [於上述，AChRα211為序列識別號2記載之胺基酸序列，AChRα211之各突變序列表示序列識別號2中對應的胺基酸被右側表示的胺基酸取代的胺基酸序列]。
  9. 如請求項1至8中任一項之多肽，其中細胞內訊息傳遞區域為源自CD3ζ或CD3δ之細胞內域的序列。
  10. 如請求項1至8中任一項之多肽，其中跨細胞膜區域為源自選自nAChRα1、T細胞受體α或β鏈、CD3ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR中的任一者之分子的跨細胞膜區域的胺基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之多肽，其中於細胞內域，在細胞內訊息傳遞區域之N末端側進一步包含1～3個之共刺激區域。
  12. 如請求項11之多肽，其中共刺激區域為源自選自包含CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137(4-1BB)、ICOS、CD154、CITR、TNFR2、DR3、CD30、HVEM、CD37及OX40之群組中的1～3種之分子的細胞內區域的序列。
  13. 如請求項1至12中任一項之多肽，其中於抗原區域和跨細胞膜區域之間進一步含有由100個以下之胺基酸而成的連接子區域。
  14. 如請求項13之多肽，其中連接子區域為序列識別號5、39、40或41記載之胺基酸序列的一部分或全部。
  15. 如請求項1之多肽，其中抗原區域為AChRα211/W149R/V155K、AChRα211/W149R/V155A、AChRα211/W149R/V155M、AChRα211/W149R/V155D、AChRα211/W149R/V155P、AChRα211/W149R/V155G、AChRα211/W149K/V155K、AChRα211/W149K/V155A、AChRα211/W149K/V155M、AChRα211/W149K/V155D、AChRα211/W149K/V155P、AChRα211/W149K/V155G、AChRα211/W149P/V155K、AChRα211/W149P/V155A、AChRα211/W149P/V155M、AChRα211/W149P/V155D、AChRα211/W149P/V155P、AChRα211/W149P/V155G、AChRα211/D14G/W149R/V155K、AChRα211/D14G/ W149R/V155A、AChRα211/D14G/W149R/V155M、AChRα211/D14G/W149R/V155D、AChRα211/D14G/ W149R/V155P、AChRα211/D14G/W149R/V155G、AChRα211/D14G/W149K/V155K、AChRα211/D14G/ W149K/V155A、AChRα211/D14G/W149K/V155M、AChRα211/ D14G/W149K/V155D、AChRα211/D14G/ W149K/V155P、AChRα211/D14G/W149K/V155G、AChRα211/D14G/W149P/V155K、AChRα211/D14G/ W149P/V155A、AChRα211/D14G/W149P/V155M、AChRα211/D14G/W149P/V155D、AChRα211/D14G/ W149P/V155P、AChRα211/D14G/W149P/V155G、AChRα211/D14A/W149R/V155K、AChRα211/D14A/ W149R/V155A、AChRα211/D14A/W149R/V155M、AChRα211/D14A/W149R/V155D、AChRα211/D14A/ W149R/V155P、AChRα211/D14A/W149R/V155G、AChRα211/D14A/W149K/V155K、AChRα211/D14A/ W149K/V155A、AChRα211/D14A/W149K/V155M、AChRα211/ D14A/W149K/V155D、AChRα211/D14A/ W149K/V155P、AChRα211/D14A/W149K/V155G、AChRα211/D14A/W149P/V155K、AChRα211/D14A/ W149P/V155A、AChRα211/D14A/W149P/V155M、AChRα211/D14A/W149P/V155D、AChRα211/D14A/ W149P/V155P、或AChRα211/D14A/W149P/V155G (此處，上述之AChRα211突變體的胺基酸序列係於序列識別號42中Xaa14、Xaa149及Xaa155分別為記載於各突變體名稱的D14、W149及V155的右側的胺基酸的胺基酸序列))， 連接子區域為CD8α鉸鏈序列(序列識別號39)、CD28鉸鏈序列(序列識別號40)、或人工連接子序列(序列識別號41)的一部分或全部， 跨膜區域為CD8α跨膜區域(序列識別號6)、CD28跨膜區域(序列識別號37)或AChRα跨膜區域(序列識別號38)， 共刺激區域為4-1BB共刺激區域(序列識別號7)、CD28共刺激區域(序列識別號25)、GITR共刺激區域(序列識別號26)、TNFR2共刺激區域(序列識別號27)、DR3共刺激區域(序列識別號28)、CD30共刺激區域(序列識別號29)、HVEM共刺激區域(序列識別號30)、CD27共刺激區域(序列識別號31)、或OX40共刺激區域(序列識別號32)， 細胞內訊息傳遞區域為CD3ζ細胞內訊息傳遞區域(序列識別號8)。
  16. 如請求項15之多肽，其中抗原區域為AChRα211/W149R/V155K(於序列識別號42中Xaa14為Asp、Xaa149為Arg、Xaa155為Lys的胺基酸序列)、AChRα211/W149R/V155A(於序列識別號42中Xaa14為Asp、Xaa149為Arg、Xaa155為Ala的胺基酸序列)、AChRα211/D14G/W149R/V155K(於序列識別號42中Xaa14為Gly、Xaa149為Arg、Xaa155為Lys的胺基酸序列)或AChRα211/D14G/W149R/V155A(於序列識別號42中Xaa14為Gly、Xaa149為Arg、Xaa155為Ala的胺基酸序列)， 連接子區域為CD8α鉸鏈序列(序列識別號39)、從其C末端連續的14個胺基酸(由序列識別號39之第32～45號的胺基酸所構成的胺基酸序列)、人工連接子序列(序列識別號41)、或從其C末端連續的4個胺基酸(由序列識別號41之第11～14號的胺基酸所構成的胺基酸序列)， 跨膜區域為CD8α跨膜區域(序列識別號6)， 共刺激區域為4-1BB共刺激區域(序列識別號7)或OX40共刺激區域(序列識別號32)， 細胞內訊息傳遞區域為CD3ζ細胞內訊息傳遞區域(序列識別號8)。
  17. 一種多肽，其係由包含用以使於細胞表面上表現的訊息肽之胺基酸序列及與序列識別號43～47之任一者的胺基酸序列顯示80%以上的序列同一性的嵌合受體之胺基酸序列的胺基酸序列而成的多肽。
  18. 如請求項17之多肽，其中嵌合受體之胺基酸序列係由序列識別號43～47之任一者的胺基酸序列而成。
  19. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至18中任一項之多肽。
  20. 一種載體，其保持如請求項19之多核苷酸。
  21. 如請求項20之載體，其為選自質體載體、反轉錄病毒載體及慢病毒載體之任一者。
  22. 如請求項20或21之載體，其被設計成可表現如請求項1至18中任一項之多肽的形態。
  23. 如請求項20或21之載體，其為被設計成可產生已封入編碼如請求項1至18中任一項之多肽的多核苷酸的病毒載體的形態的質體載體。
  24. 一種細胞，其經基因導入有如請求項19之多核苷酸。
  25. 如請求項24之細胞，其中在細胞表面上表現如請求項1至18中任一項之多肽。
  26. 如請求項24或25之細胞，其中細胞為選自T細胞、PBMC、iPS細胞、ES細胞中的任一者。
  27. 一種醫藥，其用以治療伴隨產生對抗乙醯膽鹼受體α次單元的自體抗體的疾病，其含有如請求項24至26中任一項之細胞作為有效成分。
  28. 如請求項27之醫藥，其中疾病為重症肌無力症。
  29. 一種重症肌無力症之治療方法，其包含對治療對象投予治療有效量之如請求項24至26中任一項之細胞的步驟。
  30. 一種用以使用於重症肌無力症之治療的如請求項24至26中任一項之細胞。
  31. 一種如請求項24至26中任一項之細胞之用途，其係用於重症肌無力症之治療藥的製造。
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