KR20210020873A - 재조합 수용체를 발현하는 τ 세포, 관련 폴리뉴클레오티드 및 방법 - Google Patents
재조합 수용체를 발현하는 τ 세포, 관련 폴리뉴클레오티드 및 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20210020873A KR20210020873A KR1020207031922A KR20207031922A KR20210020873A KR 20210020873 A KR20210020873 A KR 20210020873A KR 1020207031922 A KR1020207031922 A KR 1020207031922A KR 20207031922 A KR20207031922 A KR 20207031922A KR 20210020873 A KR20210020873 A KR 20210020873A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- cells
- polynucleotide
- genetically engineered
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 296
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims description 249
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims description 249
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims description 249
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims abstract description 397
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 386
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 329
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 286
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 275
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 210
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 206
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 128
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 91
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 86
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 42
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 102100029452 T cell receptor alpha chain constant Human genes 0.000 claims description 300
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 299
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 298
- 101000634853 Homo sapiens T cell receptor alpha chain constant Proteins 0.000 claims description 230
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 226
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 222
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 174
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 156
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 133
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 103
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 93
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 86
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 86
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 86
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 82
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 82
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 claims description 67
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 57
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 56
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 56
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 54
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 51
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 50
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 49
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 49
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 48
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 46
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 45
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 39
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 38
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 31
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 28
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 28
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 claims description 26
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 claims description 26
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 claims description 26
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 claims description 26
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 25
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 23
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 23
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 23
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 18
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 18
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 18
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 17
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 claims description 16
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 15
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 15
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 13
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 13
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 10
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 10
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 claims description 9
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 9
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 claims description 9
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 9
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 9
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 7
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 5
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 claims description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 5
- 102100032049 E3 ubiquitin-protein ligase LRSAM1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100037272 T cell receptor beta constant 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 5
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 claims description 4
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 claims description 4
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 claims description 4
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 claims description 4
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 claims description 4
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 claims description 4
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 4
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 4
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 102100037298 T cell receptor beta constant 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 101710153660 Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 claims 83
- 101000662909 Homo sapiens T cell receptor beta constant 1 Proteins 0.000 claims 4
- 101000662902 Homo sapiens T cell receptor beta constant 2 Proteins 0.000 claims 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims 4
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 claims 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims 1
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 abstract description 10
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 abstract description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 55
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 54
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 53
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 49
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 49
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 44
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 39
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 35
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 21
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 20
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 20
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 15
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 14
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 14
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 13
- -1 MN-CA IX Proteins 0.000 description 13
- 238000013461 design Methods 0.000 description 12
- 101150053558 TRBC1 gene Proteins 0.000 description 11
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 11
- 230000007035 DNA breakage Effects 0.000 description 10
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 10
- 101150117561 TRBC2 gene Proteins 0.000 description 10
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 10
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 9
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 9
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 9
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 8
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 8
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 102100031437 Cell cycle checkpoint protein RAD1 Human genes 0.000 description 7
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 7
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 7
- 101001130384 Homo sapiens Cell cycle checkpoint protein RAD1 Proteins 0.000 description 7
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 6
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 6
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 6
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 6
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 6
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 6
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 6
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 6
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 5
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 5
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 5
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 101000582254 Homo sapiens Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 5
- 108010014402 tyrosinase-related protein-1 Proteins 0.000 description 5
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 4
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102100033934 DNA repair protein RAD51 homolog 2 Human genes 0.000 description 4
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 4
- 101001132307 Homo sapiens DNA repair protein RAD51 homolog 2 Proteins 0.000 description 4
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 4
- 241001502974 Human gammaherpesvirus 8 Species 0.000 description 4
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 4
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 4
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 4
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 4
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 108010051081 dopachrome isomerase Proteins 0.000 description 4
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 3
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 3
- 241000186805 Listeria innocua Species 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 3
- 108700042076 T-Cell Receptor alpha Genes Proteins 0.000 description 3
- 108700042077 T-Cell Receptor beta Genes Proteins 0.000 description 3
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000032965 negative regulation of cell volume Effects 0.000 description 3
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 3
- 230000009438 off-target cleavage Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 description 2
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 102000008682 Argonaute Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010088141 Argonaute Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 2
- 101001029175 Bacillus subtilis (strain 168) Intracellular iron chaperone frataxin Proteins 0.000 description 2
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 2
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 2
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 2
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 2
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 2
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 2
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- 108010060385 Cyclin B1 Proteins 0.000 description 2
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100036252 Cyclin-dependent kinase 4 Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 2
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 2
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 2
- 101000889900 Enterobacteria phage T4 Intron-associated endonuclease 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100023721 Ephrin-B2 Human genes 0.000 description 2
- 108010044090 Ephrin-B2 Proteins 0.000 description 2
- 101710122228 Epstein-Barr nuclear antigen 2 Proteins 0.000 description 2
- 101710122231 Epstein-Barr nuclear antigen 3 Proteins 0.000 description 2
- 101710122233 Epstein-Barr nuclear antigen 4 Proteins 0.000 description 2
- 101710122229 Epstein-Barr nuclear antigen 6 Proteins 0.000 description 2
- 102100039717 G antigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100032340 G2/mitotic-specific cyclin-B1 Human genes 0.000 description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 2
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 2
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 2
- 101000886137 Homo sapiens G antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001103039 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Proteins 0.000 description 2
- 101001014223 Homo sapiens MAPK/MAK/MRK overlapping kinase Proteins 0.000 description 2
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000623901 Homo sapiens Mucin-16 Proteins 0.000 description 2
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 2
- 101001103036 Homo sapiens Nuclear receptor ROR-alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000687346 Homo sapiens PR domain zinc finger protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000880770 Homo sapiens Protein SSX2 Proteins 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 description 2
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 2
- 101000955067 Homo sapiens WAP four-disulfide core domain protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101800000120 Host translation inhibitor nsp1 Proteins 0.000 description 2
- 101000954493 Human papillomavirus type 16 Protein E6 Proteins 0.000 description 2
- 101000767631 Human papillomavirus type 16 Protein E7 Proteins 0.000 description 2
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100039615 Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 description 2
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 2
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 2
- 101800000517 Leader protein Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- 102100031520 MAPK/MAK/MRK overlapping kinase Human genes 0.000 description 2
- 102000017274 MDM4 Human genes 0.000 description 2
- 108050005300 MDM4 Proteins 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000051089 Melanotransferrin Human genes 0.000 description 2
- 108700038051 Melanotransferrin Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 2
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 2
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 description 2
- 101100508818 Mus musculus Inpp5k gene Proteins 0.000 description 2
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 2
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 description 2
- 101800000512 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 2
- 102100024885 PR domain zinc finger protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100037686 Protein SSX2 Human genes 0.000 description 2
- 101100366438 Rattus norvegicus Sphkap gene Proteins 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 description 2
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 2
- 108010032166 TARP Proteins 0.000 description 2
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 2
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 2
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 2
- 102100031358 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 102000013532 Uroplakin II Human genes 0.000 description 2
- 108010065940 Uroplakin II Proteins 0.000 description 2
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 2
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 102100022748 Wilms tumor protein Human genes 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 2
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 241001600124 Acidovorax avenae Species 0.000 description 1
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000948980 Actinobacillus succinogenes Species 0.000 description 1
- 241000606731 Actinobacillus suis Species 0.000 description 1
- 241001147825 Actinomyces sp. Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241001621924 Aminomonas paucivorans Species 0.000 description 1
- 241000193399 Bacillus smithii Species 0.000 description 1
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 1
- 241000589986 Campylobacter lari Species 0.000 description 1
- 102100039510 Cancer/testis antigen 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000327159 Candidatus Puniceispirillum Species 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241001517050 Corynebacterium accolens Species 0.000 description 1
- 241000158496 Corynebacterium matruchotii Species 0.000 description 1
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000008265 DNA repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101100441545 Drosophila melanogaster Cfp1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 241001026002 Enterococcus italicus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108050008753 HNH endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000000310 HNH endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101000889345 Homo sapiens Cancer/testis antigen 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001036406 Homo sapiens Melanoma-associated antigen C1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 241000411974 Ilyobacter polytropus Species 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 241000589014 Kingella kingae Species 0.000 description 1
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000186780 Listeria ivanovii Species 0.000 description 1
- 241001112727 Listeriaceae Species 0.000 description 1
- 101000912524 Lumbricus rubellus Fibrinolytic enzyme, isozyme C Proteins 0.000 description 1
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100039447 Melanoma-associated antigen C1 Human genes 0.000 description 1
- 241000945786 Methylocystis sp. Species 0.000 description 1
- 241000589351 Methylosinus trichosporium Species 0.000 description 1
- 241000203732 Mobiluncus mulieris Species 0.000 description 1
- 101000988601 Natrialba asiatica (strain ATCC 700177 / DSM 12278 / JCM 9576 / FERM P-10747 / NBRC 102637 / 172P1) Halolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000109432 Neisseria bacilliformis Species 0.000 description 1
- 241000588651 Neisseria flavescens Species 0.000 description 1
- 241000588649 Neisseria lactamica Species 0.000 description 1
- 241001440871 Neisseria sp. Species 0.000 description 1
- 241000086765 Neisseria wadsworthii Species 0.000 description 1
- 241000143395 Nitrosomonas sp. Species 0.000 description 1
- 108091007494 Nucleic acid- binding domains Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 241001386755 Parvibaculum lavamentivorans Species 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 241001464921 Phascolarctobacterium Species 0.000 description 1
- 241000801571 Phascolarctobacterium succinatutens Species 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241001134656 Staphylococcus lugdunensis Species 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 241000194008 Streptococcus anginosus Species 0.000 description 1
- 241000194049 Streptococcus equinus Species 0.000 description 1
- 241001288016 Streptococcus gallolyticus Species 0.000 description 1
- 241000194045 Streptococcus macacae Species 0.000 description 1
- 241001400864 Streptococcus pseudoporcinus Species 0.000 description 1
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241001037423 Subdoligranulum sp. Species 0.000 description 1
- 108700027336 Suppressor of Cytokine Signaling 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100024779 Suppressor of cytokine signaling 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710087279 T cell receptor beta constant 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710087287 T cell receptor beta constant 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 241000694894 Tistrella mobilis Species 0.000 description 1
- 241000589906 Treponema sp. Species 0.000 description 1
- 241001447269 Verminephrobacter eiseniae Species 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026497 Zinc finger protein 654 Human genes 0.000 description 1
- 241000193453 [Clostridium] cellulolyticum Species 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 108010050663 endodeoxyribonuclease CreI Proteins 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000000652 homosexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003142 viral transduction method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/464838—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
면역 세포를 조작하기 위한 방법, 조작된 면역 세포를 함유하는 세포 조성물, 특정 게놈 유전자 좌로 재조합 수용체, 예를 들어 재조합 T 세포 수용체(TCR)의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 표적화하고/거나 상기 게놈 유전자 좌의 유전자 발현을 조절하기 위한 키트 및 제조 물품 및 조작된 T 세포의 입양 전달과 같은 암 면역요법과 관련한 이의 적용이 여기서 제공된다. 일부 측면에서, 상기 핵산 서열은 수용체 암호화 유전자의 유전자 좌에 인프레임(in-frame)으로 통합되고, 일부 측면에서 재조합 수용체 전체의 발현을 초래한다.
Description
본 출원은 면역 세포를 조작하기 위한 방법, 조작된 면역 세포를 함유하는 세포 조성물, 특정 게놈 유전자 좌로 재조합 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 표적화하고/거나 상기 게놈 유전자 좌의 유전자 발현을 조절하기 위한 키트 및 제조 물품 및 조작된 T 세포의 입양 전달을 포함한 암 면역요법과 관련한 이의 적용(application)과 관련된다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 수용체 암호화 유전자의 유전자 좌에 인프레임(in-frame)으로 통합되고, 일부 측면에서 재조합 수용체 전체의 발현을 초래한다.
종양 항원을 인식하도록 재조합으로 발현되는 T 세포 수용체(TCR) 또는 기타 항원 수용체(예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR))를 이용하는 입양 세포 요법은 암 및 기타 질병의 치료를 위한 매력적인 치료 형태를 대표한다. 재조합 TCR 또는 다른 항원 수용체의 발현 및 기능은 세포의 집단에서 제한 및/또는 이질적일 수 있다. 재조합 수용체의 높은 및/또는 균질한 발현 수준 및 기능을 달성하기 위해 개선된 전략이 필요하다. 상기 전략은 예를 들어 암, 전염성 질환 및 자가 면역 질환 치료에서 입양 면역 요법의 사용을 위한 원하는 발현 수준 및/또는 특성을 나타내는 세포의 생성을 촉진할 수 있다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 4월 5일자 출원된 미국 가출원 제62/653,553호(제목 "재조합 수용체를 발현하는 T 세포, 관련 폴리뉴클레오티드 및 방법")의 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 참조로 포함된다.
서열 목록의 참조 포함
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2019년 4월 3일에 생성된 735042015540SeqList.txt라는 제목의 파일로 제공되며, 이의 크기는 181 킬로바이트이다. 전자 형식의 서열 목록 내 정보는 그 전체가 참조로 포함된다.
재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 표적화된 통합에 의해 조작된 재조합 T 세포 수용체(TCR)와 같은 재조합 수용체를 발현하는 유전자 조작된 면역 세포가 여기서 제공된다. 일부 측면에서, 조작된 세포는 변형된(modified) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌 및/또는 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 포함한다. 일부 측면에서, 변형된 TRAC 및/또는 TRBC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부 또는 이의 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 제공된 유전자 조작된 세포는 재조합 TCR의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열과 TCR의 불변 도메인을 암호화하는 유전자의 내인성 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 융합을 함유하는 변형된 TRAC 및/또는 TRBC 유전자 좌를 함유한다. 일부 측면에서, 조작된 T 세포, 관련 세포 조성물을 생산하는 방법, 여기 기재된 조작된 세포를 생산하는데 사용하기 위한 핵산 및 키트가 또한 제공된다.
변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 T 세포가 여기서 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 T 세포가 여기서 제공되고, 상기 변형된 TRAC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 함유하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬 및 (ii) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬을 함유하고, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRβ 및 Vα 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 재조합 TCR의 Cα 도메인의 적어도 일부를 암호화한다.
변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 T 세포가 여기서 제공된다. 일부 측면에서, 변형된 TRAC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬 및 (ii) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRβ 및 Vα 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 재조합 TCR의 Cα 도메인의 적어도 일부를 암호화한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cα의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 짧고; (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키고/거나 여기에서 재조합 TCR의 Cα 및/또는 Cβ는 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함한다.
재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 T 세포가 또한 제공되고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬 및 (ii) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRβ 및 Vα 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 재조합 TCR의 Cα 도메인의 적어도 일부를 암호화하며, 여기에서 전이 유전자 서열은 유전자 조작된 T 세포가 도입된 세포에서 발현될 경우 TCR의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 하나 이상의 이종 또는 조절 제어 요소(들)를 포함한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 상동성 지시 수선(homology directed repair, HDR)을 통해 통합되거나 통합되어 있다. 일부 구현예에서, 변형된 TRAC 유전자 좌는 (i) 전이 유전자 서열 및 (ii) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 인프레임 융합을 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 전이 유전자 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 인프레임이다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 3' 비번역 영역(3′ untranslated region, 3′ UTR) 또는 인트론을 암호화하는 서열을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 3′ UTR 을 함유한다. 일부 구현예에서, Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cα의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 짧다.
일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 인프레임이다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 4개 미만의 엑손, 3개 미만의 엑손, 2개 미만의 엑손, 하나의 엑손 또는 하나의 전체 엑손 미만의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, Cα의 추가 부분은 400개 미만, 300개 미만, 250개 미만, 200개 미만 또는 150개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 전장 오픈 리딩 프레임보다 짧다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 최대 5' 뉴클레오티드의 하류 및 엑손 1의 최대 3' 뉴클레오티드의 상류에 있거나 이에 통합되었다. 일부 구현예에서, Cα의 적어도 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 적어도 엑손 2-4 또는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 적어도 엑손 1의 일부 및 엑손 2-4에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Cα의 적어도 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 전장 미만에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 암호화된 TCRα 사슬은 TCRβ 사슬과 2량체화될 수 있다.
일부 구현예에서, 암호화된 Cα는 서열 번호: 14, 15, 19 또는 24 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 14, 15, 19 또는 24 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 함유한다.
임의의 구현예 중 일부에서, 암호화된 Cα는 서열 번호: 19, 24 및 243-252 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 19, 24 및 243-252 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Cα의 추가 부분 및/또는 Cα의 적어도 일부는 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 400개 미만, 300개 미만, 250개 미만, 200개 미만 또는 150개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 4개 미만의 엑손, 3개 미만의 엑손, 2개 미만의 엑손, 하나의 엑손 또는 하나의 전체 엑손 미만의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 전장 오픈 리딩 프레임보다 짧다. 일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 엑손 1의 5' 부분을 함유한다. 일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 서열 번호: 142에 제시된 서열 또는 서열 번호: 142에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 함유하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시킨다.
임의의 구현예 중 일부에서, 재조합 TCR의 Cα 및/또는 Cβ는 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 하나 이상의 시스테인 잔기의 도입은 비시스테인 잔기의 시스테인 잔기로의 교체를 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 암호화된 Cα 영역은 서열 번호: 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 넘버링으로 48번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함하고/거나; 암호화된 Cβ 영역은 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 넘버링으로 57번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 암호화된 Cα는 서열 번호: 248-252 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다.
제공된 임의의 구현예에서, 조작된 T 세포는 TRBC 유전자 좌에서 유전자 파괴를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 TRBC1 유전자 좌 및/또는 TRBC2 유전자 좌에서 유전자 파괴를 더 함유한다.
일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 함유하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시킨다.
변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 T 세포가 여기서 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 T 세포가 여기서 제공되고, 상기 변형된 TRBC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 함유하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬 및 (ii) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬을 함유하고, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRα 및 Vβ 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 재조합 TCR의 Cβ 도메인의 적어도 일부를 암호화한다.
변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 T 세포가 여기서 또한 제공된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 변형된 TRBC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬 및 (ii) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬을 포함하고, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRα 및 Vβ 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 재조합 TCR의 Cβ 도메인의 적어도 일부를 암호화한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, Cβ의 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cβ의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cβ의 추가 부분은 천연 Cβ의 전장보다 짧고; (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 Cβ의 추가 부분 및/또는 Cα 영역은 천연 Cβ 영역 및/또는 천연 Cα 영역과 비교하여 하나 이상의 변형, 일부 경우에 하나 이상의 아미노산의 교체, 결실 또는 삽입을 포함하고, 일부 경우에 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시킨다.
상기 구현예 중 일부에서, 전이 유전자 서열은 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 통합되거나 통합되었다. 일부 구현예에서, TRBC 유전자 좌는 TRBC1 유전자 좌 및/또는 TRBC2 유전자 좌이다. 일부 구현예에서, 변형된 TRBC 유전자 좌는 (i) 전이 유전자 서열 및 (ii) 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 인프레임 융합을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임이다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 3' 비번역 영역(3′ UTR 또는 인트론을 암호화하는 서열을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 3′ UTR 을 함유한다.
일부 구현예에서, Cβ의 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cβ의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cβ의 추가 부분은 천연 Cβ의 전장보다 짧다.
일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임이다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 최대 5' 뉴클레오티드의 하류 및 엑손 1의 최대 3' 뉴클레오티드의 상류에 있거나 이에 통합되었다.
일부 구현예에서, Cβ의 적어도 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 적어도 엑손 2-4에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Cβ의 적어도 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 적어도 엑손 1의 일부 및 엑손 2-4에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Cβ의 적어도 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 전장 미만에 의해 암호화된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, Cβ의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 4개 미만의 엑손, 3개 미만의 엑손, 2개 미만의 엑손, 하나의 엑손 또는 하나의 전체 엑손 미만의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, Cβ의 추가 부분은 400개 미만, 300개 미만, 250개 미만, 200개 미만 또는 150개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, Cβ의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 TRBC 유전자 좌의 엑손 1의 전장 미만 오픈 리딩 프레임이다.
일부 구현예에서, 암호화된 TCRβ 사슬은 TCRα 사슬과 2량체화될 수 있다.
일부 구현예에서, 암호화된 Cβ는 서열 번호: 16, 17, 20, 21 및 25 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 16, 17, 20, 21 및 25 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 암호화된 Cβ는 서열 번호: 20, 21, 25 및 253-258 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 20, 21, 25 및 253-258 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Cβ의 추가 부분 및/또는 Cβ의 적어도 일부는 서열 번호: 2에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1445번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 2에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1445번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열; 또는 서열 번호: 3에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1486번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 3에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1486번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 400개 미만, 300개 미만, 250개 미만, 200개 미만 또는 150개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 4개 미만의 엑손, 3개 미만의 엑손, 2개 미만의 엑손, 하나의 엑손 또는 하나의 전체 엑손 미만의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 TRBC 유전자 좌의 엑손 1의 전장 미만 오픈 리딩 프레임이거나 또는 엑손 1의 일부는 엑손 1의 5' 부분을 함유한다.
일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 Cβ의 추가 부분 및/또는 Cα 영역은 천연 Cβ 영역 및/또는 천연 Cα 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 함유하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시킨다.
임의의 구현예 중 일부에서, 하나 이상의 시스테인 잔기의 도입은 비시스테인 잔기의 시스테인 잔기로의 교체를 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 암호화된 Cα 영역은 서열 번호: 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 넘버링으로 48번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함하고/거나; 암호화된 Cβ 영역은 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 넘버링으로 57번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 암호화된 Cβ는 서열 번호: 253 및 256-258 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 TRAC 유전자 좌에서 유전자 파괴를 더 함유한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 하나 이상의 다중 시스트론 요소(들)를 함유한다. 상기 구현예 중 일부에서, 다중 시스트론 요소(들)는 TCRα 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 TCRβ 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 다중 시스트론 요소(들)는 TCR 또는 TCR의 일부를 암호화하는 핵산 서열 또는 TCR을 암호화하는 핵산 분자의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 다중 시스트론 요소는 리보솜 건너뛰기 서열, 선택적으로 T2A, P2A, E2A 또는 F2A이거나 이를 함유한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 하나 이상의 이종 조절 또는 제어 요소(들)를 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 유전자 조작된 T 세포가 도입된 세포에서 발현될 경우 TCR의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종 또는 조절 제어 요소(들)를 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 이종 조절 또는 제어 요소는 프로모터, 인핸서(enhancer), 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 컨센서스 서열(Kozak consensus sequence), 스플라이스 수용체 서열 및/또는 스플라이스 공여체 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 이종 조절 또는 제어 요소는 구성적 프로모터, 유도 가능 프로모터, 억제 가능 프로모터 및/또는 조직 특이적 프로모터 중에서 선택된 이종 프로모터와 같은 이종 프로모터를 함유한다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 MND 프로모터 또는 이의 변이체이거나 이를 함유한다.
일부 구현예에서, 재조합 TCR의 Cα 및/또는 Cβ는 하나 이상의 비천연 시스테인을 함유한다.
임의의 제공된 구현예에서, 재조합 TCR은 감염성 질환 또는 장애, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 종양 또는 암과 같은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 항원과 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원은 세균성 항원 또는 바이러스성 항원과 같은 종양 항원 또는 병원성 항원이다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 바이러스성 항원이고, 상기 바이러스성 항원은 선택적으로 A형 간염, B형 간염, C형 간염 바이러스(hepatitis C virus, HCV), 인간 유두종 바이러스(human papilloma virus, HPV), 간염 바이러스 감염, 엡스타인 바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV), 인간 헤르페스 바이러스 8(human herpes virus 8, HHV-8), 인간 T 세포 백혈병 바이러스-1(human T-cell leukemia virus-1, HTLV-1), 인간 T 세포 백혈병 바이러스-2(HTLV-2) 또는 사이토메갈로세포바이러스(cytomegalovirus, CMV) 유래일 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스성 항원은 HPV-16 E6 또는 HPV-16 E7 항원인 HPV-16 항원과 같은 HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 및 HPV-35 중에서 선택된 HPV 유래 항원이다. 일부 구현예에서, 바이러스성 항원은 엡스타인-바 핵 항원(EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA 리더 단백질(EBNA-LP), 잠재성 막 단백질 LMP-1, LMP-2A 및 LMP-2B, EBV-EA, EBV-MA 및 EBV-VCA 중에서 선택된 EBV 항원이다. 일부 구현예에서, 바이러스성 항원은 TAX인 HTLV 항원이다. 일부 구현예에서, 바이러스성 항원은 B형 간염 코어 항원 또는 B형 간염 외피 항원인 HBV 항원이다.
일부 구현예에서, 항원은 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 신경 교종 관련 항원, β-인간 융모막 성선 자극 호르몬, 알파페토프로테인(alphafetoprotein, AFP), 렉틴 반응성 AFP, 다이로글로블린(thyroglobulin), RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스터라제, mut hsp70-2, M-CSF, 멜라닌-A/MART-1, WT-1, S-100, MBP, CD63, MUC1(예를 들어, MUC1-8), p53, Ras, 사이클린 B1, HER-2/neu, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen, CEA), gp100, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A11, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-C1, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5, 티로시나제(예를 들어, 티로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase-related protein 1, TRP-1) 또는 티로시나제 관련 단백질 2(TRP-2)), β-카테닌, NY-ESO-1, LAGE-1a, PP1, MDM2, MDM4, EGVFvIII, Tax, SSX2, 텔로머라제, TARP, pp65, CDK4, 비멘틴, S100, eIF-4A1, IFN 유도성 p78, 멜라노트랜스페린(p97), 우로플라킨(Uroplakin) II, 전립선 특이적 항원(prostate specific antigen, PSA), 인간 칼리크레인(human kallikrein, huK2), 전립선 특이적 막 항원(prostate specific membrane antigen, PSM) 및 전립선산 포스파타아제(prostatic acid phosphatase, PAP), 호중구 엘라스타제, 에프린 B2, BA-46, Bcr-abl, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 카스파제 8, FRa, CD24, CD44, CD133, CD 166, epCAM, CA-125, HE4, 오발(Oval), 에스트로겐 수용체, 프로게스트론 수용체, uPA, PAI-1, CD19, CD20, CD22, ROR1, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, GD-2, 인슐린 성장 인자(insulin growth factor, IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린 중에서 선택된다.
임의의 제공된 구현예에서, T 세포는 대상체로부터 유래된 1차 T 세포일 수 있으며, 선택적으로 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD8+ T 세포 또는 이의 하위 유형 또는 CD4+ T 세포 또는 이의 하위 유형이다. 일부 구현예에서, T 세포는 다능성 또는 만능 세포로부터 유래하고, 이는 선택적으로 iPSC이다.
여기에 제공된 복수의 임의의 조작된 세포와 같은 복수의 유전자 조작된 T 세포를 함유하는 조성물이 또한 여기서 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는 복수의 유전자 조작된 T 세포를 함유하는 조성물이 제공되고, 상기 변형된 TRAC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬 및 (ii) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬을 포함하며, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRβ 및 Vα 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 재조합 TCR의 Cα 도메인의 적어도 일부를 암호화하고, 상기 재조합 TCR은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 항원과 결합할 수 있다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 조성물 중 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 조작된 세포가 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자의 유전자 파괴 또는 상기 유전자에서 유전자 파괴를 포함하고; 조성물 중 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 조작된 세포가 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자의 유전자 생성물을 발현하지 않거나 검출 가능한 수준으로 발현하지 않는다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 조성물 중 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 90% 이상 또는 초과의 세포가 재조합 TCR을 발현하고/거나 항원에 대한 결합을 나타낸다.
변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는 복수의 유전자 조작된 T 세포를 함유하는 조성물이 여기서 또한 제공되고, 상기 변형된 TRAC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬 및 (ii) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRβ 및 Vα 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 재조합 TCR의 Cα 도메인의 적어도 일부를 암호화한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cα의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 짧다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시킨다.
변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 포함하는 복수의 유전자 조작된 T 세포를 함유하는 조성물이 또한 여기서 제공되고, 상기 변형된 TRBC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬 및 (ii) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬을 포함하며, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRα 및 Vβ 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 재조합 TCR의 Cβ 도메인의 적어도 일부를 암호화하고, 상기 재조합 TCR은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 항원과 결합할 수 있다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 조성물 중 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 조작된 세포가 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자의 유전자 파괴 또는 상기 유전자에서 유전자 파괴를 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 조성물 중 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 조작된 세포가 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자의 유전자 생성물을 발현하지 않거나 검출 가능한 수준으로 발현하지 않는다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 조성물 중 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 90% 이상 또는 초과의 세포가 재조합 TCR을 발현하고/거나 항원에 대한 결합을 나타낸다.
변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 포함하는 복수의 유전자 조작된 T 세포를 함유하는 조성물이 또한 여기서 제공되고, 상기 변형된 TRBC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬 및 (ii) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬을 포함하며, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRα 및 Vβ 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 재조합 TCR의 Cβ 도메인의 적어도 일부를 암호화한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, Cβ의 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cβ의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cβ의 추가 부분은 천연 Cβ의 전장보다 짧다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 Cβ의 추가 부분 및/또는 Cα 영역은 천연 Cβ 영역 및/또는 천연 Cα 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시킨다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 재조합 TCR은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 항원과 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 여기에 제공된 복수의 임의의 유전자 조작된 T 세포를 함유하는 조성물이 여기서 제공된다. 임의의 구현예 중 일부에서, 조성물은 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유하고, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:3 내지 3:1, 선택적으로 1:1이다.
일부 구현예에서, 조성물 중 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 조작된 세포가, 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자의 유전자 파괴 또는 상기 유전자에서 유전자 파괴를 함유하고/거나; 조성물 중 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 조작된 세포가, 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자의 유전자 생성물을 발현하지 않거나 검출 가능한 수준으로 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물 중 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 90% 이상 또는 초과의 세포가, 재조합 TCR을 발현하고/거나 항원 결합을 나타낸다(예를 들어, 항원에 대한 결합을 나타낸다).
일부 구현예에서, 세포를 조작하는데 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구현예에서, (a) 재조합 T 세포 수용체(TCR)의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 핵산 서열은 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 함유하는 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬; 및 (ii) T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부;를 암호화하고, 여기서 상기 TCRα 사슬의 일부는 천연 TCRα 사슬 전장보다 더 짧음 - ; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 여기서 상기 하나 이상의 상동성 암은 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 함유함 - ;을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 여기서 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함된다.
(a) 재조합 T 세포 수용체(TCR)의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 핵산 서열은 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬; 및 (ii) T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부;를 암호화하고, 여기서 상기 TCRα 사슬의 일부는 천연 TCRα 사슬의 전장보다 더 짧음 - ; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 여기서 상기 하나 이상의 상동성 암은 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함함 - ;을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 여기서 제공되고; 여기에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우: Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cα의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 짧고; (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시킨다. 일부 측면에서, 재조합 TCR의 Cα 및/또는 Cβ는 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함한다.
(a) 재조합 T 세포 수용체(TCR)의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 핵산 서열은 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬; 및 (ii) T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부;를 암호화하고, 여기서 상기 TCRα 사슬의 일부는 천연 TCRα 사슬의 전장보다 더 짧음 - ; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 여기에서 상기 하나 이상의 상동성 암은 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함함 - ;을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 여기서 제공되고; 여기에서, 상기 전이 유전자 서열은 유전자 조작된 T 세포가 도입된 세포에서 발현될 경우 TCR의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함한 하나 이상의 이종 또는 조절 제어 요소(들)를 포함한다.
일부 구현예에서, TCRα 사슬은 불변 알파 영역(Cα)을 함유하고, 여기에서 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, 상기 Cα의 적어도 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열 및 하나 이상의 상동성 암 중 하나가 함께 천연 Cα의 전장보다 짧은 Cα를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하고, 여기에서 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, Cα의 적어도 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, TCRβ 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 TCRα 사슬의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 상류에 있다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 인트론을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 3' 비번역 영역(3′ UTR UTR)을 암호화하는 서열을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 T 세포, 선택적으로 인간 T 세포의 내인성 게놈 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에 대해 이종성 또는 외인성 서열이다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 하나 이상의 상동성 암에 함유된 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임이다. 일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열은 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1 내 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, TCRα 사슬은 TCRβ 사슬과 2량체화될 수 있다. 일부 구현예에서, TCRα 사슬은 가변 알파(Vα) 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cα의 추가 부분은 (a)의 핵산 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 짧다. 임의의 구현예 중 일부에서, 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 포함한다. 일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Cα는 400개 미만, 300개 미만, 250개 미만, 200개 미만 또는 150개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 4개 미만의 엑손, 3개 미만의 엑손, 2개 미만의 엑손, 하나의 엑손 또는 하나의 전체 엑손 미만의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 엑손 1의 일부가 엑손 1의 5' 부분을 함유하는 것과 같이 엑손 1의 일부는 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 전장 오픈 리딩 프레임보다 짧다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, 암호화된 Cα는 서열 번호: 19, 24 및 243-252 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 19, 24 및 243-252 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, Cα의 적어도 일부는 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 서열 번호: 142에 제시된 서열 또는 서열 번호: 142에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 함유하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시킨다.
임의의 구현예 중 일부에서, 하나 이상의 시스테인 잔기의 도입은 비시스테인 잔기의 시스테인 잔기로의 교체를 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, 암호화된 Cα 영역은 서열 번호: 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 넘버링으로 48번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함하고/거나; 암호화된 Cβ 영역은 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 넘버링으로 57번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함한다.
임의의 구현예 중 일부에서, 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, 암호화된 Cα는 서열 번호: 248-252 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, TCRα 사슬의 일부는 가변 알파(Vα) 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암은 5' 상동성 암 및/또는 3′상동성 암을 함유한다. 일부 구현예에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 표적 부위 주변 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 함유하고, 여기에서 상기 표적 부위는 TRAC 유전자 좌의 엑손 1 내와 같은 TRAC 유전자 좌 내에 있다.
일부 구현예에서, 5' 상동성 암은 a) 서열 번호: 124에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열의 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600 개 (이상)의 인접한 뉴클레오티드를 함유하는 서열; b) 서열 번호: 124에 제시된 서열의 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600 개 (이상)의 인접한 뉴클레오티드를 함유하는 서열; 또는 c) 서열 번호: 124에 제시된 서열;을 함유한다.
일부 구현예에서, 3′상동성 암은 a) 서열 번호: 125에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열의 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600 개 (이상)의 인접한 뉴클레오티드를 함유하는 서열; b) 서열 번호: 125에 제시된 서열의 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600 개 (이상)의 인접한 뉴클레오티드를 함유하는 서열; 또는 c) 서열 번호: 125에 제시된 서열;을 함유한다.
일부 구현예에서, (a) 재조합 T 세포 수용체(TCR)의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 핵산 서열은 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 함유하는 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬; 및 (ii) T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬의 일부;를 암호화하고, 여기에서 상기 TCRβ 사슬의 일부는 천연 TCRβ 사슬 전장보다 더 짧음 - ; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 여기서 상기 하나 이상의 상동성 암은 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 함유함 - ;을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 여기서 제공된다. 상기 구현예 중 일부에서, TCRβ 사슬은 불변 베타(Cβ)를 함유하고, 여기에서 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, 상기 Cβ의 적어도 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열 및 하나 이상의 상동성 암 중 하나가 함께 천연 Cβ의 전장보다 짧은 Cβ를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하고, 여기에서 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, Cβ의 적어도 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, TRBC 유전자 좌는 TRBC1 또는 TRBC2 중 하나 이상이다.
일부 구현예에서, TCRα 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 TCRβ 사슬의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 상류에 있다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 인트론을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 3' 비번역 영역(3′ UTR 을 암호화하는 서열을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 T 세포, 선택적으로 인간 T 세포의 내인성 게놈 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에 대해 이종성 또는 외인성 서열이다.
일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 하나 이상의 상동성 암에 함유된 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임이다. 일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열은 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1 내 서열이거나 이를 함유한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, TCRβ 사슬은 TCRα 사슬과 2량체화될 수 있다. 임의의 구현예 중 일부에서, 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, 암호화된 Cβ는 서열 번호: 20, 21, 25 및 253-258 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 20, 21, 25 및 253-258 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, TCRβ 사슬의 일부는 가변 베타(Vβ) 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, Cβ의 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cβ의 추가 부분은 (a)의 핵산 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cβ의 추가 부분은 천연 Cβ의 전장보다 더 짧다. 임의의 구현예 중 일부에서, 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 포함한다. 상기 구현예 중 일부에서, Cβ의 추가 부분은 서열 번호: 2에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1445번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 2에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1445번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열; 또는 서열 번호: 3에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1486번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 3에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1486번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열;에 의해 암호화된다.
상기 구현예 중 일부에서, Cβ의 추가 부분은 400개 미만, 300개 미만, 250개 미만, 200개 미만 또는 150개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, Cβ의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 4개 미만의 엑손, 3개 미만의 엑손, 2개 미만의 엑손, 하나의 엑손 또는 하나의 전체 엑손 미만의 오픈 리딩 프레임을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Cβ의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 TRBC 유전자 좌의 엑손 1의 전장 미만 오픈 리딩 프레임이다. 일부 구현예에서, TCRα 불변 도메인의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 엑손 1의 5' 부분을 함유한다.
일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 Cβ의 추가 부분 및/또는 Cα 영역은 천연 Cβ 영역 및/또는 천연 Cα 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 함유하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시킨다.
임의의 구현예 중 일부에서, 하나 이상의 시스테인 잔기의 도입은 비시스테인 잔기의 시스테인 잔기로의 교체를 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 암호화된 Cα 영역은 서열 번호: 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 넘버링으로 48번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함하고/거나; 암호화된 Cβ 영역은 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 넘버링으로 57번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 암호화된 Cβ는 서열 번호: 253 및 256-258 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, TCRβ 사슬의 일부는 가변 베타(Vβ) 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암은 5' 상동성 암 및/또는 3′상동성 암을 함유한다. 일부 구현예에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 표적 부위 주변 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 함유하고, 여기에서 상기 표적 부위는 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1 내에 있다.
일부 구현예에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이상의 뉴클레오티드 또는 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 미만의 뉴클레오티드이다. 상기 구현예 중 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 100 내지 (약) 1000 뉴클레오티드, 100 내지 750 뉴클레오티드, 100 내지 600 뉴클레오티드, 100 내지 400 뉴클레오티드, 100 내지 300 뉴클레오티드, 100 내지 200 뉴클레오티드, 200 내지 1000 뉴클레오티드, 200 내지 750 뉴클레오티드, 200 내지 600 뉴클레오티드, 200 내지 400 뉴클레오티드, 200 내지 300 뉴클레오티드, 300 내지 1000 뉴클레오티드, 300 내지 750 뉴클레오티드, 300 내지 600 뉴클레오티드, 300 내지 400 뉴클레오티드, 400 내지 1000 뉴클레오티드, 400 내지 750 뉴클레오티드, 400 내지 600 뉴클레오티드, 600 내지 1000 뉴클레오티드, 600 내지 750 뉴클레오티드 또는 750 내지 1000 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 600 개 또는 약 600 개 미만의 뉴클레오티드 길이이다.
임의의 구현예 중 일부에서, (a)의 핵산 서열은 T 세포, 선택적으로 인간 T 세포의 내인성 게놈 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에 대해 이종성 또는 외인성 서열이다. 임의의 구현예 중 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이상의 뉴클레오티드 또는 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 미만의 뉴클레오티드이다. 임의의 구현예 중 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 100 뉴클레오티드 길이, (약) 100 내지 (약) 250 뉴클레오티드 길이, (약) 250 내지 (약) 500 뉴클레오티드 길이, (약) 500 내지 (약) 750 뉴클레오티드 길이, (약) 750 내지 (약) 1000 뉴클레오티드 길이 또는 (약) 1000 내지 (약) 2000 개의 뉴클레오티드 길이이다. 임의의 구현예 중 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800 개의 뉴클레오티드 길이 또는 상기 중 임의의 사이의 임의의 수치다. 임의의 구현예 중 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 300 개의 뉴클레오티드 길이를 초과하고, 선택적으로 여기서 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 400, 500 또는 600 개의 뉴클레오티드 길이이거나 또는 상기 중 임의의 사이의 임의의 수치다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 300 개의 뉴클레오티드 길이를 초과한다.
일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 하나 이상의 다중 시스트론 요소(들)를 함유한다. 일부 구현예에서, 다중 시스트론 요소(들)는 TCRα 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 TCRβ 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 다중 시스트론 요소(들)는 TCR 또는 TCR의 일부를 암호화하는 핵산 서열 또는 TCR을 암호화하는 핵산 분자의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 다중 시스트론 요소는 리보솜 건너뛰기 서열, 선택적으로 T2A, P2A, E2A 또는 F2A이거나 이를 함유한다.
일부 구현예에서, 제공된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 이종 조절 또는 제어 요소(들)를 더 함유한다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 컨센서스 서열, 스플라이스 수용체 서열 및/또는 스플라이스 공여체 서열과 같이, TCR의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종 또는 조절 제어 요소(들)를 함유한다. 일부 구현예에서, 이종 조절 또는 제어 요소는 구성적 프로모터, 유도 가능 프로모터, 억제 가능 프로모터 및/또는 조직 특이적 프로모터 중에서 선택된 이종 프로모터와 같은 이종 프로모터를 함유한다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 MND 프로모터 또는 이의 변이체이거나 이를 함유한다.
제공된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나가 바이러스 벡터에 함유될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택된 AAV 벡터와 같은 AAV 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV6 벡터이다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 선형 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 선형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 [5' 상동성 암]-[(a)의 핵산 서열]-[3' 상동성 암] 구조를 함유한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 [5' 상동성 암]-[다중 시스트론 요소]-[(a)의 핵산 서열]-[3' 상동성 암] 구조를 함유한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 [5' 상동성 암]-[프로모터]-[(a)의 핵산 서열]-[3' 상동성 암] 구조를 함유한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 재조합 TCR은 감염성 질환 또는 장애, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 종양 또는 암과 같은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 항원과 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원은 종양 항원 또는 병원성 항원이다. 상기 구현예 중 일부에서, 병원성 항원은 박테리아성 항원 또는 바이러스성 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스성 항원이고, 선택적으로 A형 간염, B형 간염, C형 간염 바이러스(HCV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 간염 바이러스 감염, 엡스타인 바 바이러스(EBV), 인간 헤르페스 바이러스 8(HHV-8), 인간 T 세포 백혈병 바이러스-1(HTLV-1), 인간 T 세포 백혈병 바이러스-2(HTLV-2) 또는 사이토메갈로세포바이러스(CMV) 유래 바이러스성 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 HPV-16 E6 또는 HPV-16 E7 항원인 HPV-16 항원과 같은 HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 및 HPV-35 중에서 선택된 HPV 유래 항원이다.
일부 구현예에서, 바이러스성 항원은 엡스타인-바 핵 항원(EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA 리더 단백질(EBNA-LP), 잠재성 막 단백질 LMP-1, LMP-2A 및 LMP-2B, EBV-EA, EBV-MA 및 EBV-VCA 중에서 선택된 EBV 항원이다. 일부 구현예에서, 바이러스성 항원은 TAX인 HTLV 항원이다.
일부 구현예에서, 바이러스성 항원은 B형 간염 코어 항원 또는 B형 간염 외피 항원인 HBV 항원이다.
일부 구현예에서, 항원은 신경 교종 관련 항원, β-인간 융모막 성선 자극 호르몬, 알파페토프로테인(AFP), 렉틴 반응성 AFP, 다이로글로블린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스터라제, mut hsp70-2, M-CSF, 멜라닌-A/MART-1, WT-1, S-100, MBP, CD63, MUC1(예를 들어, MUC1-8), p53, Ras, 사이클린 B1, HER-2/neu, 암배아 항원(CEA), gp100, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A11, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-C1, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5, 티로시나제(예를 들어, 티로시나제 관련 단백질 1(TRP-1) 또는 티로시나제 관련 단백질 2(TRP-2)), β-카테닌, NY-ESO-1, LAGE-1a, PP1, MDM2, MDM4, EGVFvIII, Tax, SSX2, 텔로머라제, TARP, pp65, CDK4, 비멘틴, S100, eIF-4A1, IFN 유도성 p78, 멜라노트랜스페린(p97), 우로플라킨 II, 전립선 특이적 항원(PSA), 인간 칼리크레인(huK2), 전립선 특이적 막 항원(PSM) 및 전립선산 포스파타아제(PAP), 호중구 엘라스타제, 에프린 B2, BA-46, Bcr-abl, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 카스파제 8, FRa, CD24, CD44, CD133, CD 166, epCAM, CA-125, HE4, 오발(Oval), 에스트로겐 수용체, 프로게스트론 수용체, uPA, PAI-1, CD19, CD20, CD22, ROR1, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, GD-2, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린 중에서 선택된 항원과 같은 종양 항원이다.
임의의 구현예 중 일부에서, 제공된 폴리뉴클레오티드는 약 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 7500, 8000, 9000 또는 10000 개의 뉴클레오티드 길이 또는 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 7500, 8000, 9000 또는 10000 개 이상의 뉴클레오티드 길이이거나 또는 상기 중 임의의 사이의 임의의 수치다. 임의의 구현예 중 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 (약) 2500 내지 (약) 5000 뉴클레오티드, (약) 3500 내지 (약) 4500 뉴클레오티드 또는 (약) 3750 뉴클레오티드 내지 (약) 4250 개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, TRAC 유전자 좌에서 유전자 파괴를 함유하는 T 세포에 제공된 뉴클레오티드 중 어느 하나의 도입을 포함한, 변형된 TRAC 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법이 여기서 제공된다.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법이 여기서 제공되고, 상기 방법은 (a) T 세포의 내인성 TRAC 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 T 세포로 도입시키는 단계; 및 (b) T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시키는 단계 - 여기에서 상기 일부는 천연 TCRα 사슬 전장보다 짧고, 여기에서 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 내인성 TRAC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고, 이로써 변형된 TRAC 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 세포가 생산됨 - ;를 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 도입은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후에 수행된다.
유전자 조작된 T 세포 생산 방법과 같은 방법이 또한 여기서 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) T 세포의 내인성 TRAC 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 T 세포로 도입시키는 단계; 및 (b) T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시키는 단계 - 여기에서 상기 일부는 천연 TCRα 사슬 전장보다 짧고, 여기에서 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 내인성 TRAC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고, 이로써 변형된 TRAC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포가 생산됨 - ;를 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 전이 유전자의 표적화된 통합 시, Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cα의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 짧고; (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시킨다. 일부 구현예에서, 재조합 TCR의 Cα 및/또는 Cβ는 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함한다.
변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시키는 것을 포함하고, 상기 T 세포는 T 세포의 내인성 TRAC 유전자 좌 내에 유전자 파괴를 가지며; 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 내인성 TRAC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고; 이로써 변형된 TRAC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포가 생산되며, 여기에서 상기 전이 유전자의 표적화된 통합 시: Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cα의 추가 부분은 상기 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 짧고; (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키고/거나 여기에서 재조합 TCR의 Cα 및/또는 Cβ는 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법이 여기서 제공되고, 상기 방법은 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시키는 것을 함유하고, 상기 T 세포는 T 세포의 내인성 TRAC 유전자 좌 내에 유전자 파괴를 가지며, 여기에서 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 내인성 TRAC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고, 이로써 변형된 TRAC 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 세포가 생산된다. 상기 구현예 중 일부에서, 유전자 파괴는 내인성 TRAC 유전자 좌 내에 하나 이상의 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에 의해 유도되었다.
제공된 방법의 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 여기에 제공된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 유래이다.
제공된 방법의 일부 구현예에서, 변형된 TRAC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유하고, 여기에서, 상기 핵산 서열은 (i) 전이 유전자 서열 및 (ii) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 인프레임 융합을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 3' 비번역 영역(3′ UTR)또는 인트론을 암호화하는 서열을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 3′ UTR을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 인프레임이다.
일부 구현예에서, Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cα의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 짧다. 일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 인프레임이다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 최대 5' 뉴클레오티드의 하류 및 엑손 1의 최대 3' 뉴클레오티드의 상류에 있거나 이에 통합되었다. 일부 구현예에서, Cα의 적어도 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 적어도 엑손 2-4에 의해 암호화된다.
제공된 방법의 일부 구현예에서, 암호화된 Cα는 서열 번호: 14, 15, 19 또는 24 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 14, 15, 19 또는 24 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, Cα의 추가 부분은 서열 번호: 142에 제시된 서열 또는 서열 번호: 142에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성 또는 이의 부분 서열을 나타내는 서열을 함유한다.
제공된 방법의 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 TRBC 유전자 좌에서 유전자 파괴의 유도를 더 함유한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 TRBC1 유전자 좌 및/또는 TRBC2 유전자 좌에서 유전자 파괴를 함유한다.
일부 구현예에서, TRBC 유전자 좌에서 유전자 파괴를 함유하는 T 세포에 여기서 제공된 뉴클레오티드 중 어느 하나의 도입을 함유하는, 변형된 TRBC 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법이 여기서 제공된다.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법이 여기서 제공되고, 상기 방법은 (a) T 세포의 내인성 TRBC 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 T 세포로 도입시키는 단계; 및 (b) T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬 및 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시키는 단계 - 여기에서 상기 일부는 천연 TCRβ 사슬 전장보다 짧고, 여기에서 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 내인성 TRBC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고, 이로써 변형된 TRBC 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 세포가 생산됨 - ;를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법이 여기서 제공되고, 상기 방법은 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬 및 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시키는 것을 함유하고, 상기 T 세포는 T 세포의 내인성 TRBC 유전자 좌 내에 유전자 파괴를 가지며, 여기에서 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 내인성 TRBC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고, 이로써 변형된 TRBC 유전자 좌를 함유하는 유전자 조작된 세포가 생산된다. 상기 구현예 중 일부에서, 유전자 파괴는 내인성 TRBC 유전자 좌 내에 하나 이상의 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에 의해 유도되었다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임이다. 일부 구현예에서, TRBC 유전자 좌는 TRBC1 유전자 좌 및/또는 TRBC2 유전자 좌이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 여기에 제공된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나이다.
제공된 방법의 일부 구현예에서, 변형된 TRBC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유하고, 여기에서 상기 핵산 서열은 (i) 전이 유전자 서열 및 (ii) 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 인프레임 융합을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 3' 비번역 영역(3′ UTR)또는 인트론을 암호화하는 서열을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 3′ UTR을 함유한다. 일부 구현예에서, Cβ의 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cβ의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cβ의 추가 부분은 천연 Cβ의 전장보다 짧다.
일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임이다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 최대 5' 뉴클레오티드의 하류 및 엑손 1의 최대 3' 뉴클레오티드의 상류에 있거나 상기에서 통합되었다.
제공된 방법의 일부 구현예에서, Cβ의 적어도 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 적어도 엑손 2-4에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 암호화된 Cβ는 서열 번호: 16, 17, 20, 21 또는 25 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 16, 17, 20, 21 또는 25에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 함유한다.
제공된 방법의 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 TRAC 유전자 좌에서 유전자 파괴의 유도를 더 함유한다.
제공된 방법의 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)는 표적 부위에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산을 함유한다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제는 (a) DNA 표적화 단백질 및 뉴클레아제를 함유하는 융합 단백질 또는 (b) RNA-가이드 뉴클레아제를 함유한다. 상기 구현예 중 일부에서, DNA 표적화 단백질 또는 RNA 가이드 뉴클레아제는 표적 부위에 특이적인 아연 핑거 단백질(ZFP), TAL 단백질 또는 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬 핵산(CRISPR)-결합 뉴클레아제(Cas)를 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 표적 부위에 특이적으로 결합, 인식 또는 혼성화하는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL-이펙터 뉴클레아제(TALEN) 및/또는 CRISPR-Cas9 조합물을 함유한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제 각각은 하나 이상의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 gRNA 및 Cas9 단백질을 함유하는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로서 도입된다. 일부 구현예에서, RNP는 전기 천공, 입자 총, 인산 칼슘 형질 감염, 세포 압축 또는 압착을 통해 도입된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 gRNA 및/또는 Cas9 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로서 도입된다. 일부 구현예에서, gRNA는 UCUCUCAGCUGGUACACGGC (서열 번호:28), UGGAUUUAGAGUCUCUCAGC (서열 번호:29), ACACGGCAGGGUCAGGGUUC (서열 번호:30), GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (서열 번호:31), GCUGGUACACGGCAGGGUCA (서열 번호:32), CUCAGCUGGUACACGGC (서열 번호:33), UGGUACACGGCAGGGUC (서열 번호:34), GCUAGACAUGAGGUCUA (서열 번호:35), GUCAGAUUUGUUGCUCC (서열 번호:36), UCAGCUGGUACACGGCA (서열 번호:37), GCAGACAGACUUGUCAC (서열 번호:38), GGUACACGGCAGGGUCA (서열 번호:39), CUUCAAGAGCAACAGUGCUG (서열 번호:40), AGAGCAACAGUGCUGUGGCC (서열 번호:41), AAAGUCAGAUUUGUUGCUCC (서열 번호:42), ACAAAACUGUGCUAGACAUG (서열 번호:43), AAACUGUGCUAGACAUG (서열 번호:44), UGUGCUAGACAUGAGGUCUA (서열 번호:45), GGCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC (서열 번호:46), GCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC (서열 번호:47), GGGGAAGAAGGUGUCUUC (서열 번호:48), GUUUUGUCUGUGAUAUACACAU (서열 번호:49), GGCAGACAGACUUGUCACUGGAUU (서열 번호:50), GCAGACAGACUUGUCACUGGAUU (서열 번호:51), GACAGACUUGUCACUGGAUU (서열 번호:52), GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA (서열 번호:53), GAAUAGGCAGACAGACUUGUCA (서열 번호:54), GAGUCUCUCAGCUGGUACACGG (서열 번호:55), GUCUCUCAGCUGGUACACGG (서열 번호:56), GGUACACGGCAGGGUCAGGGUU (서열 번호:57) 및 GUACACGGCAGGGUCAGGGUU (서열 번호:58) 중에서 선택된 서열을 함유하고 TRAC 유전자 좌에 있는 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, gRNA는 GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (서열 번호:31)의 서열을 함유하는 표적화 도메인을 갖는다.
일부 구현예에서, gRNA는 CACCCAGAUCGUCAGCGCCG (서열 번호:59), CAAACACAGCGACCUCGGGU (서열 번호:60), UGACGAGUGGACCCAGGAUA (서열 번호:61), GGCUCUCGGAGAAUGACGAG (서열 번호:62), GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (서열 번호:63), GAAAAACGUGUUCCCACCCG (서열 번호:64), AUGACGAGUGGACCCAGGAU (서열 번호:65), AGUCCAGUUCUACGGGCUCU (서열 번호:66), CGCUGUCAAGUCCAGUUCUA (서열 번호:67), AUCGUCAGCGCCGAGGCCUG (서열 번호:68), UCAAACACAGCGACCUCGGG (서열 번호:69), CGUAGAACUGGACUUGACAG (서열 번호:70), AGGCCUCGGCGCUGACGAUC (서열 번호:71), UGACAGCGGAAGUGGUUGCG (서열 번호:72), UUGACAGCGGAAGUGGUUGC (서열 번호:73), UCUCCGAGAGCCCGUAGAAC (서열 번호:74), CGGGUGGGAACACGUUUUUC (서열 번호:75), GACAGGUUUGGCCCUAUCCU (서열 번호:76), GAUCGUCAGCGCCGAGGCCU (서열 번호:77), GGCUCAAACACAGCGACCUC (서열 번호:78), UGAGGGUCUCGGCCACCUUC (서열 번호:79), AGGCUUCUACCCCGACCACG (서열 번호:80), CCGACCACGUGGAGCUGAGC (서열 번호:81), UGACAGGUUUGGCCCUAUCC (서열 번호:82), CUUGACAGCGGAAGUGGUUG (서열 번호:83), AGAUCGUCAGCGCCGAGGCC (서열 번호:84), GCGCUGACGAUCUGGGUGAC (서열 번호:85), UGAGGGCGGGCUGCUCCUUG (서열 번호:86), GUUGCGGGGGUUCUGCCAGA (서열 번호:87), AGCUCAGCUCCACGUGGUCG (서열 번호:88), GCGGCUGCUCAGGCAGUAUC (서열 번호:89), GCGGGGGUUCUGCCAGAAGG (서열 번호:90), UGGCUCAAACACAGCGACCU (서열 번호:91), ACUGGACUUGACAGCGGAAG (서열 번호:92), GACAGCGGAAGUGGUUGCGG (서열 번호:93), GCUGUCAAGUCCAGUUCUAC (서열 번호:94), GUAUCUGGAGUCAUUGAGGG (서열 번호:95), CUCGGCGCUGACGAUCU (서열 번호:96), CCUCGGCGCUGACGAUC (서열 번호:97), CCGAGAGCCCGUAGAAC (서열 번호:98), CCAGAUCGUCAGCGCCG (서열 번호:99), GAAUGACGAGUGGACCC (서열 번호:100), GGGUGACAGGUUUGGCCCUAUC (서열 번호:101), GGUGACAGGUUUGGCCCUAUC (서열 번호:102), GUGACAGGUUUGGCCCUAUC (서열 번호:103), GACAGGUUUGGCCCUAUC (서열 번호:104), GAUACUGCCUGAGCAGCCGCCU (서열 번호:105), GACCACGUGGAGCUGAGCUGGUGG (서열 번호:106), GUGGAGCUGAGCUGGUGG (서열 번호:107), GGGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:108), GGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:109), GCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:110), GGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:111), GGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:112), GCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:113), GGUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (서열 번호:114), GUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (서열 번호:115) 및 GAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (서열 번호:116) 중에서 선택된 서열을 함유하고 TRBC1 및 TRBC2 유전자 중 하나 또는 둘 다에 있는 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, gRNA는 GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (서열 번호:63)의 서열을 함유하는 표적화 도메인을 갖는다.
임의의 구현예 중 일부에서, T 세포는 대상체 유래 1차 T 세포이다. 임의의 구현예 중 일부에서, 대상체는 질병 또는 장애 상태를 갖거나 가질 것으로 짐작된다. 임의의 구현예 중 일부에서, 대상체는 건강하거나 건강한 것으로 짐작된다.
방법 중 일부 구현예에서, T 세포는 CD8+ T 세포 또는 이의 하위 유형이거나 또는 CD4+ T 세포 또는 이의 하위 유형이다. 일부 구현예에서, T 세포는 다능성 또는 만능 세포로부터 유래하고, 이는 선택적으로 iPSC이다. 방법의 일부 구현예에서, T 세포는 대상체에 대해 동종 이계이거나 또는 대상체 자기 유래이다.
방법 중 일부 구현예에서, gRNA 및/또는 Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 벡터(들)에 함유되고, 이는 선택적으로 AAV 벡터와 같은 바이러스 벡터(들)이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV6 벡터와 같은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
방법 중 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드와 같은 선형 폴리뉴클레오티드이다.
제공된 방법의 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 및 주형 폴리뉴클레오티드의 도입은 동시에 또는 순차적으로, 어떠한 순서로든 수행된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 도입은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후 약 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 6 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 60 분, 90 분, 2 시간, 3 시간 또는 4 시간 직후 또는 이내에 도입된다.
일부 구현예에서, 여기 제공된 방법 중 어느 하나를 사용하여 생성된 조작된 T 세포 또는 복수의 조작된 T 세포가 여기서 제공된다.
일부 구현예에서, 여기에 제공된 조작된 T 세포 또는 복수의 조작된 세포를 함유하는 조성물이 여기서 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물은 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유하고, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:3 내지 3:1, 선택적으로 1:1이다.
제공된 조성물의 일부 구현예에서, 조성물 중 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 조작된 세포가, 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자의 유전자 파괴 또는 상기 유전자에서 유전자 파괴를 함유하고/거나; 조성물 중 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 조작된 세포가, 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자의 유전자 생성물을 발현하지 않거나 검출 가능한 수준으로 발현하지 않는다.
제공된 조성물의 일부 구현예에서, 조성물 중 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 90% 이상 또는 초과의 세포가, 재조합 TCR을 발현하고/거나 항원 결합을 나타낸다(예를 들어, 항원에 대한 결합을 나타낸다).
일부 구현예에서, 여기 제공된 조작된 세포 또는 복수의 조작된 세포 또는 조성물 중 어느 하나를 대상체에 투여하는 것을 함유하는 치료 방법이 여기서 제공된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애의 치료를 위한 여기 제공된 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물 중 어느 하나의 용도가 여기서 제공된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서 여기 제공된 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물 중 어느 하나의 용도가 여기서 제공된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 여기 제공된 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물 중 어느 하나의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물이 여기서 제공된다.
일부 구현예에서, 여기 제공된 폴리뉴클레오티드 및 TRAC 유전자 좌 내 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 함유하는 제조 물품 또는 키트가 여기서 제공된다.
일부 구현예에서, (a) T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 여기서 상기 일부는 천연 TCRα 사슬 전장보다 더 짧음 - ; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암(들) - 여기서 상기 하나 이상의 상동성 암(들)은 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 함유하고, 상기 오픈 리딩 프레임은 TCRα 사슬을 암호화함 - ;을 함유하는 폴리뉴클레오티드 및 TRAC 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 함유하는 제조 물품 또는 키트가 여기서 제공된다. 상기 구현예 중 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 여기 제공된 폴리뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 여기 제공된 폴리뉴클레오티드 및 TRBC 유전자 좌 내 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 함유하는 제조 물품이 여기서 제공된다.
일부 구현예에서, (a) T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬 및 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 여기서 상기 일부는 천연 TCRβ 사슬 전장보다 더 짧음 - ; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암(들) - 여기서 상기 하나 이상의 상동성 암(들)은 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 함유하고, 상기 오픈 리딩 프레임은 TCRβ 사슬을 암호화함 - ;을 함유하는 폴리뉴클레오티드; 및 TRBC 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들);를 함유하는 제조 물품이 여기서 제공된다. 일부 구현예에서, TRBC 유전자 좌는 TRBC1 및/또는 TRBC2이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 여기 제공된 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)는 표적 부위에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산을 함유한다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제는 (a) DNA 표적화 단백질 및 뉴클레아제를 함유하는 융합 단백질 또는 (b) RNA-가이드 뉴클레아제를 함유한다. 상기 구현예 중 일부에서, DNA 표적화 단백질 또는 RNA 가이드 뉴클레아제는 표적 부위에 특이적인 아연 핑거 단백질(ZFP), TAL 단백질 또는 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬 핵산(CRISPR)-결합 뉴클레아제(Cas)를 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 표적 부위에 특이적으로 결합, 인식 또는 혼성화하는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL-이펙터 뉴클레아제(TALEN) 및/또는 CRISPR-Cas9 조합물을 함유한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제 각각은 하나 이상의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 gRNA 및 Cas9 단백질을 함유하는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로서 도입된다. 일부 구현예에서, RNP는 전기 천공, 입자 총, 인산 칼슘 형질 감염, 세포 압축 또는 압착을 통해 도입된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 gRNA 및/또는 Cas9 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로서 도입된다. 일부 구현예에서, gRNA는 UCUCUCAGCUGGUACACGGC (서열 번호:28), UGGAUUUAGAGUCUCUCAGC (서열 번호:29), ACACGGCAGGGUCAGGGUUC (서열 번호:30), GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (서열 번호:31), GCUGGUACACGGCAGGGUCA (서열 번호:32), CUCAGCUGGUACACGGC (서열 번호:33), UGGUACACGGCAGGGUC (서열 번호:34), GCUAGACAUGAGGUCUA (서열 번호:35), GUCAGAUUUGUUGCUCC (서열 번호:36), UCAGCUGGUACACGGCA (서열 번호:37), GCAGACAGACUUGUCAC (서열 번호:38), GGUACACGGCAGGGUCA (서열 번호:39), CUUCAAGAGCAACAGUGCUG (서열 번호:40), AGAGCAACAGUGCUGUGGCC (서열 번호:41), AAAGUCAGAUUUGUUGCUCC (서열 번호:42), ACAAAACUGUGCUAGACAUG (서열 번호:43), AAACUGUGCUAGACAUG (서열 번호:44), UGUGCUAGACAUGAGGUCUA (서열 번호:45), GGCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC (서열 번호:46), GCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC (서열 번호:47), GGGGAAGAAGGUGUCUUC (서열 번호:48), GUUUUGUCUGUGAUAUACACAU (서열 번호:49), GGCAGACAGACUUGUCACUGGAUU (서열 번호:50), GCAGACAGACUUGUCACUGGAUU (서열 번호:51), GACAGACUUGUCACUGGAUU (서열 번호:52), GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA (서열 번호:53), GAAUAGGCAGACAGACUUGUCA (서열 번호:54), GAGUCUCUCAGCUGGUACACGG (서열 번호:55), GUCUCUCAGCUGGUACACGG (서열 번호:56), GGUACACGGCAGGGUCAGGGUU (서열 번호:57) 및 GUACACGGCAGGGUCAGGGUU (서열 번호:58) 중에서 선택된 서열을 함유하고 TRAC 유전자 좌에 있는 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, gRNA는 GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (서열 번호:31)의 서열을 함유하는 표적화 도메인을 갖는다.
일부 구현예에서, gRNA는 CACCCAGAUCGUCAGCGCCG (서열 번호:59), CAAACACAGCGACCUCGGGU (서열 번호:60), UGACGAGUGGACCCAGGAUA (서열 번호:61), GGCUCUCGGAGAAUGACGAG (서열 번호:62), GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (서열 번호:63), GAAAAACGUGUUCCCACCCG (서열 번호:64), AUGACGAGUGGACCCAGGAU (서열 번호:65), AGUCCAGUUCUACGGGCUCU (서열 번호:66), CGCUGUCAAGUCCAGUUCUA (서열 번호:67), AUCGUCAGCGCCGAGGCCUG (서열 번호:68), UCAAACACAGCGACCUCGGG (서열 번호:69), CGUAGAACUGGACUUGACAG (서열 번호:70), AGGCCUCGGCGCUGACGAUC (서열 번호:71), UGACAGCGGAAGUGGUUGCG (서열 번호:72), UUGACAGCGGAAGUGGUUGC (서열 번호:73), UCUCCGAGAGCCCGUAGAAC (서열 번호:74), CGGGUGGGAACACGUUUUUC (서열 번호:75), GACAGGUUUGGCCCUAUCCU (서열 번호:76), GAUCGUCAGCGCCGAGGCCU (서열 번호:77), GGCUCAAACACAGCGACCUC (서열 번호:78), UGAGGGUCUCGGCCACCUUC (서열 번호:79), AGGCUUCUACCCCGACCACG (서열 번호:80), CCGACCACGUGGAGCUGAGC (서열 번호:81), UGACAGGUUUGGCCCUAUCC (서열 번호:82), CUUGACAGCGGAAGUGGUUG (서열 번호:83), AGAUCGUCAGCGCCGAGGCC (서열 번호:84), GCGCUGACGAUCUGGGUGAC (서열 번호:85), UGAGGGCGGGCUGCUCCUUG (서열 번호:86), GUUGCGGGGGUUCUGCCAGA (서열 번호:87), AGCUCAGCUCCACGUGGUCG (서열 번호:88), GCGGCUGCUCAGGCAGUAUC (서열 번호:89), GCGGGGGUUCUGCCAGAAGG (서열 번호:90), UGGCUCAAACACAGCGACCU (서열 번호:91), ACUGGACUUGACAGCGGAAG (서열 번호:92), GACAGCGGAAGUGGUUGCGG (서열 번호:93), GCUGUCAAGUCCAGUUCUAC (서열 번호:94), GUAUCUGGAGUCAUUGAGGG (서열 번호:95), CUCGGCGCUGACGAUCU (서열 번호:96), CCUCGGCGCUGACGAUC (서열 번호:97), CCGAGAGCCCGUAGAAC (서열 번호:98), CCAGAUCGUCAGCGCCG (서열 번호:99), GAAUGACGAGUGGACCC (서열 번호:100), GGGUGACAGGUUUGGCCCUAUC (서열 번호:101), GGUGACAGGUUUGGCCCUAUC (서열 번호:102), GUGACAGGUUUGGCCCUAUC (서열 번호:103), GACAGGUUUGGCCCUAUC (서열 번호:104), GAUACUGCCUGAGCAGCCGCCU (서열 번호:105), GACCACGUGGAGCUGAGCUGGUGG (서열 번호:106), GUGGAGCUGAGCUGGUGG (서열 번호:107), GGGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:108), GGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:109), GCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:110), GGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:111), GGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:112), GCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:113), GGUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (서열 번호:114), GUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (서열 번호:115) 및 GAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (서열 번호:116) 중에서 선택된 서열을 함유하고 TRBC1 및 TRBC2 유전자 중 하나 또는 둘 다에 있는 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, gRNA는 GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (서열 번호:63)의 서열을 함유하는 표적화 도메인을 갖는다.
일부 구현예에서, 여기 제공된 제조 물품 및 사용 지침을 함유하는 키트가 여기서 제공된다. 상기 구현예 중 일부에서, 지침은 하나 이상의 제제(들) 및 폴리뉴클레오티드가 세포로 도입되는 것을 명시한다. 일부 구현예에서, 지침은 하나 이상의 제제(들) 및 폴리뉴클레오티드가 동시에 또는 순차적으로, 어떠한 순서로든 도입되는 것을 명시한다. 일부 구현예에서, 지침은 폴리뉴클레오티드의 도입이 하나 이상의 제제(들)의 도입 후에 수행됨을 명시한다. 상기 구현예 중 일부에서, 지침은 폴리뉴클레오티드가 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후 약 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 6 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 60 분, 90 분, 2 시간, 3 시간 또는 4 시간 직후 또는 이내에 도입됨을 명시한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제제의 도입 후 (약) 2 시간에 도입된다.
임의의 구현예 중 일부에서, 방법은 복수의 T 세포에서 수행된다. 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1, 선택적으로 (약) 1:2 내지 (약) 2:1, 선택적으로 (약) 1:1이다.
임의의 구현예 중 일부에서, 방법은 하나 이상의 제제 도입 전에, 하나 이상의 T 세포를 자극 또는 활성화하기 위한 조건 하에서 자극제(들)와 세포를 시험관 내에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 자극제(들)에는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체, 선택적으로 항-CD3/항-CD28 비드가 포함되고, 선택적으로 여기에서 상기 비드 대 세포의 비율은 (약) 1:1이다. 임의의 구현예 중 일부에서, 방법은 하나 이상의 제제를 도입하기 전에 하나 이상의 면역 세포에서 자극제(들)를 제거하는 것을 포함한다.
임의의 구현예 중 일부에서, 방법은 하나 이상의 제제의 도입 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드의 도입 전, 중 또는 후에 세포를 하나 이상의 재조합 사이토카인과 인큐베이션하는 것을 더 포함하고, 선택적으로 여기에서 상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-7 및 IL-15로 이루어진 군에서 선택된다.
임의의 구현예 중 일부에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인은 (약) 10 U/mL 내지 (약) 200 U/mL, 선택적으로 (약) 50 IU/mL 내지 (약) 100 U/mL의 농도에서 선택된 IL-2; 0.5 ng/mL 내지 50 ng/mL, 선택적으로 (약) 5 ng/mL 내지 (약) 10 ng/mL의 농도에서 선택된 IL-7; 및/또는 0.1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 선택적으로 (약) 0.5 ng/mL 내지 (약) 5 ng/mL의 농도에서 선택된 IL-15;의 농도로 첨가된다.
임의의 구현예 중 일부에서, 인큐베이션은 하나 이상의 제제의 도입 및 주형 폴리뉴클레오티드의 도입 후에 최대 또는 약 24 시간, 36 시간, 48 시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 일, 선택적으로 최대 또는 약 7 일 동안 수행된다.
임의의 구현예 중 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 약 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 7500, 8000, 9000 또는 10000 개의 뉴클레오티드 길이 또는 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 7500, 8000, 9000 또는 10000 개 이상의 뉴클레오티드 길이이거나 또는 상기 중 임의의 사이의 임의의 수치다.
임의의 구현예 중 일부에서, 폴리뉴클레오티드는 (약) 2500 내지 (약) 5000 뉴클레오티드, (약) 3500 내지 (약) 4500 뉴클레오티드 또는 (약) 3750 뉴클레오티드 내지 (약) 4250 개의 뉴클레오티드 길이이다.
여기 기재된 방법 중 어느 하나를 사용하여 생성된 세포가 또한 제공된다. 일부 측면에서, 상기 세포를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 여기 제공된 방법 중 어느 하나를 수행하는데 사용하기 위한 제조 물품 및 키트가 또한 제공된다. 여기 기재된 세포를 함유하는 조성물 또는 세포 중 어느 하나의 투여를 포함하는 질병 또는 장애의 치료에서 치료적 용도와 같은 치료적 용도 및 치료 방법이 또한 제공된다.
도 1a 및 1b는 TRAC 유전자 좌에서 HDR에 의한 표적화된 통합 및 발현을 위한 다양한 작제물 - TRAC 유전자 좌로 통합되는, EF1α("SV40 pA EF1α E7 TCR") 또는 MND 프로모터("SV40 pA MND E7 TCR")에 연결된 재조합 TCRα 및 TCRβ 사슬 전체 서열을 암호화하거나 P2A 리보솜 건너뛰기 서열 상류를 통한 내인성 TRAC 프로모터("P2A E7 TCR 3' 암") 또는 MND 프로모터("MND E7 TCR 3' 암")에 연결된 내인성 TRAC 유전자의 엑손 1 서열과 인프레임 통합을 위해 재조합 TCRβ 사슬의 전체 서열 및 재조합 TCRα 사슬의 부분 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 - 을 사용하여, 예시적인 재조합 항-HPV 16 E7 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 조작되고 내인성 TCR 암호화 유전자(TRAC 및 TRBC)가 녹아웃된 T 세포에서, 유세포 분석에 의해 평가된 바와 같은, 재조합 TCR에 의해 인식된 항원(HPV 16 E7(11-19) 펩티드; "HPV E7(11)"로 표시)과 복합체를 이룬 펩티드-MHC 4량체(도 1b) 및 CD8, V베타22(재조합 TCR 특이적 염색; 도 1a)의 세포 표면 염색을 나타내는 히스토그램을 도시한다. 모의 형질 감염된("모의") T 세포는 대조군으로 평가되었다.
도 2는 TRAC 유전자 좌에서 HDR에 의한 표적화된 통합 및 발현을 위한 다양한 작제물 - TRAC 유전자 좌로 통합되는, EF1α("SV40 pA EF1α E7 TCR") 또는 MND 프로모터("SV40 pA MND E7 TCR")에 연결된 재조합 TCRα 및 TCRβ 사슬 전체 서열을 암호화하거나 P2A 리보솜 건너뛰기 서열 상류를 통한 내인성 TRAC 프로모터("P2A E7 TCR 3' 암") 또는 MND 프로모터("MND E7 TCR 3' 암")에 연결된 내인성 TRAC 유전자의 엑손 1 서열과 인프레임 통합을 위해 재조합 TCRβ 사슬의 전체 서열 및 재조합 TCRα 사슬의 부분 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 - 을 사용하여, 예시적인 재조합 항-HPV 16 E7 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 조작되고, 내인성 TCR 암호화 유전자(TRAC 및 TRBC)가 녹아웃된 T 세포에서, 시간에 따른 NucLight Red로 표지된 표적 세포의 용해에 의해 평가된 바와 같은, 5:1의 이펙터 대 표적(E:T) 비율에서 표적 세포와 공배양된 예시적인 재조합 TCR을 발현하는 T 세포의 세포 용해 평가 결과를 나타내는 그래프를 도시한다. 모의 형질 감염("모의")된 T 세포 및 참조 TCR을 발현하는 세포("E7 Ref 마우스")가 대조군으로 사용되었다.
도 3a 내지 도 3b는 HDR 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 AAV 제제로 형질 도입 후 24, 48 및 72 시간(도 3a) 및 96 시간 또는 7 일(도 3b)에 GFP 패턴의 변화로 평가된 바와 같은 테스트된 다양한 상동성 암 길이에 대한 다양한 시점에서의 통합에 대한 결과를 도시한다.
도 4a 내지 도 4b는 4명의 상이한 도너, 도너 1 및 2(도 4a) 및 도너 3 및 4(도 4b)에 대해 24, 48 및 72 및 96 시간 또는 7 일에 다양한 상동성 암 길이를 사용한 HDR에 대한 통합 비율의 변화를 도시한다.
도 2는 TRAC 유전자 좌에서 HDR에 의한 표적화된 통합 및 발현을 위한 다양한 작제물 - TRAC 유전자 좌로 통합되는, EF1α("SV40 pA EF1α E7 TCR") 또는 MND 프로모터("SV40 pA MND E7 TCR")에 연결된 재조합 TCRα 및 TCRβ 사슬 전체 서열을 암호화하거나 P2A 리보솜 건너뛰기 서열 상류를 통한 내인성 TRAC 프로모터("P2A E7 TCR 3' 암") 또는 MND 프로모터("MND E7 TCR 3' 암")에 연결된 내인성 TRAC 유전자의 엑손 1 서열과 인프레임 통합을 위해 재조합 TCRβ 사슬의 전체 서열 및 재조합 TCRα 사슬의 부분 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 - 을 사용하여, 예시적인 재조합 항-HPV 16 E7 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 조작되고, 내인성 TCR 암호화 유전자(TRAC 및 TRBC)가 녹아웃된 T 세포에서, 시간에 따른 NucLight Red로 표지된 표적 세포의 용해에 의해 평가된 바와 같은, 5:1의 이펙터 대 표적(E:T) 비율에서 표적 세포와 공배양된 예시적인 재조합 TCR을 발현하는 T 세포의 세포 용해 평가 결과를 나타내는 그래프를 도시한다. 모의 형질 감염("모의")된 T 세포 및 참조 TCR을 발현하는 세포("E7 Ref 마우스")가 대조군으로 사용되었다.
도 3a 내지 도 3b는 HDR 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 AAV 제제로 형질 도입 후 24, 48 및 72 시간(도 3a) 및 96 시간 또는 7 일(도 3b)에 GFP 패턴의 변화로 평가된 바와 같은 테스트된 다양한 상동성 암 길이에 대한 다양한 시점에서의 통합에 대한 결과를 도시한다.
도 4a 내지 도 4b는 4명의 상이한 도너, 도너 1 및 2(도 4a) 및 도너 3 및 4(도 4b)에 대해 24, 48 및 72 및 96 시간 또는 7 일에 다양한 상동성 암 길이를 사용한 HDR에 대한 통합 비율의 변화를 도시한다.
재조합 T 세포 수용체(TCR)와 같은 재조합 수용체를 발현하는 유전자 조작된 면역 세포가 여기서 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 유전자 조작된 면역 세포는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌 또는 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 포함하는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 T 세포 수용체 알파(TCRα) 불변 도메인을 암호화하는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열과 전이 유전자의 융합이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하고, 여기에서 상기 일부는 전장 TCRα 사슬, 예를 들어 천연 TCRα 사슬 전장보다 더 짧다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 불변 도메인을 암호화하는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열과 전이 유전자의 융합이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 TCRα 사슬 및 TCRβ 사슬의 일부 및 TCRβ 사슬의 일부를 암호화하고, 여기에서 상기 일부는 전장 TCRβ 사슬, 예를 들어 TCRβ 사슬 전장보다 더 짧다. 조작된 T 세포를 생산 또는 생성하는 방법, 관련 세포 조성물, 여기 기재된 조작된 세포를 생산하는데 사용하기 위한 핵산 및 키트가 또한 제공된다.
입양 T 세포 요법과 같은 T 세포 기반 요법(관심 질병 또는 장애에 특이적인 재조합 TCR을 발현하는 조작된 세포의 투여를 수반하는 것을 포함)은 암 및 기타 질병 및 장애의 치료에 효과적일 수 있다. 특정 맥락에서, 입양 세포 요법을 위한 조작된 세포를 생성하기 위한 이용 가능한 접근법이 항상 완전히 만족스럽지 않을 수 있다. 일부 상황에서, 치료 세포 조성물 중의 세포 및/또는 면역 세포 집단과 같은 세포 중에서 수용체의 균일, 균질 및/또는 일관된 발현을 위한 최적의 효능은 투여된 세포가 재조합 수용체를 발현하는 능력에 따라 달라질 수 있다.
특정 측면에서, 현재 사용 가능한 방법, 예를 들어, 바이러스 형질 도입은 완전히 만족스럽지 않다. 예를 들어, 일부 측면에서, 재조합 TCR의 발현 효율은 현재 이용 가능한 방법을 사용하여 조작된 특정 세포 또는 특정 세포 집단에 제한된다. 일부 경우에, 재조합 TCR은 세포 집단 중 특정 세포에서만 발현되고, 재조합 TCR의 발현 수준은 집단의 세포 사이에 매우 다를 수 있다. 특정 측면에서, 재조합 TCR의 발현 수준은 예측, 제어 및/또는 조절하기 어려울 수 있다. 일부 측면에서, 세포의 게놈으로 재조합 TCR을 암호화하는 핵산 서열의 무작위 통합은, 일부 경우에, 게놈에서 원치 않는 위치, 예를 들어, 세포의 활성을 조절하는데 중요한 유전자 또는 필수적인 유전자로 핵산 서열의 통합으로 인한 불리하고/거나 원치 않는 효과를 초래할 수 있다. 일부 경우에, 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 무작위 또는 반무작위 통합은 통합 부위 및/또는 핵산 서열 카피 수에 따라 변화가 많은, 조절되지 않은, 통제되지 않는 및/또는 최적이 아닌 발현 또는 항원 결합, 발암성 형질 전환 및 핵산 서열의 전사 침묵을 초래할 수 있다. 일부 측면에서, T 세포 게놈으로 재조합 TCR의 삽입은 재조합 TCR 사슬 및 천연 TCR 사슬 간의 짝짓기 오류를 초래하고, 이로써 세포에 의해 발현된 기능성 재조합 TCR의 양을 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 재조합 수용체를 암호화하는 서열의 가변적 통합은 일관성 없는 발현, 핵산의 가변적 카피 수, 가능한 삽입 돌연변이 유발 및/또는 수용체 발현의 가변성 및/또는 치료 세포 조성물과 같은 세포 조성물 내에서 유전자 파괴를 초래할 수 있다. 일부 측면에서, 특정 렌티바이러스 벡터와 같은 특정 무작위 통합 벡터를 사용하려면 복제 능력이 있는 렌티바이러스(replication competent lentivirus, RCL) 평가의 수행이 필요하다.
일부 구현예에서, 내인성 TCR 유전자의 유전자 좌 중 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴는 조작된 또는 재조합 TCR 및 내인성 TCR 사슬 사이의 짝짓기 오류의 위험 또는 기회를 감소시킬 수 있다. 잘못 짝지어진 TCR은, 일부 측면에서, 원치 않는 또는 의도하지 않은 항원 인식 및/또는 부작용의 높은 위험을 잠재적으로 초래할 수 있는 새로운 TCR을 생성할 수 있고/거나 원하는 조작된 또는 재조합 TCR의 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 내인성 TCR 발현을 감소 또는 방지하는 것은 TCR의 발현이 감소되거나 방지되지 않는 세포에 비해 T 세포 또는 T 세포 조성물에서 조작된 또는 재조합 TCR의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 TCR 발현은 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 이상 증가할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 조작된 또는 재조합 TCR의 최적이 아닌 발현은 세포 표면에서 복합체의 발현을 허용하는데 관여하는 불변 CD3 신호 전달 분자와 같은 신호 전달 도메인을 두고 내인성 TCR 및/또는 잘못 짝지어진 사슬을 갖는 TCR과의 경쟁으로 인해 발생할 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어 재조합 TCR과 같은 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자를 전달하기 위해 현재 이용 가능한 방법은 재조합 수용체의 비효율적인 통합 및/또는 발현 감소를 나타낼 수 있다. 일부 측면에서, 집단 내의 재조합 수용체의 통합 및/또는 발현의 효율이 낮고/거나 다양할 수 있다.
일부 측면에서, 인간화 및/또는 완전히 인간 재조합 TCR의 개발은 기술적 과제를 제시한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 인간화 및/또는 완전한 인간 재조합 TCR 수용체는 내인성 TCR 복합체와 경쟁하고 내인성 TCRα 또는 TCRβ 사슬과 짝짓기 오류를 형성할 수 있으며, 이는 특정 측면에서 재조합 TCR의 신호 전달, 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있다. 상기 과제를 해결하는 한 가지 방법은 내인성 인간 TCRα 또는 TCRβ 사슬과 짝짓기 오류를 방지하기 위해 마우스 불변 도메인을 갖는 재조합 TCR을 설계하는 것이었다. 그러나, 마우스 서열을 가진 재조합 TCR의 사용은, 일부 측면에서, 면역 반응에 대한 위험을 제시할 수 있다. 제공된 폴리뉴클레오티드, 시약, 제조 물품, 키트 및 방법은 내인성 TCR 유전자 내에 인프레임으로 재조합 TCR의 일부를 삽입하고, 완전한 재조합 TCR을 암호화하는 변경된 유전자 좌를 초래함으로써 상기 과제를 해결한다. 특정 측면에서, 상기 삽입은 완전한 인간화 및/또는 인간 재조합 TCR의 발현을 허용하고, 내인성 TCR 사슬과의 경쟁 또는 짝짓기 오류의 가능성을 감소시키면서, 내인성 TCR 유전자 발현을 파괴하는 역할을 한다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 또한 TCRα 또는 TCRβ 불변 도메인을 암호화하는 내인성 유전자의 오픈 리딩 프레임의 전부 또는 일부를 사용함으로써 기존 방법에 비해 조작을 위해 보다 작은 핵산 서열 단편의 사용을 허용하여 재조합 TCR의 TCRα 또는 TCRβ 사슬 또는 이의 일부를 암호화한다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 도입된 폴리뉴클레오티드에서 재조합 TCR의 전체 길이를 요구하는 전통적인 구현예에 비해 보다 긴 상동성 암의 적응을 허용하고/거나 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열에 대한 길이 요구가 감소하면서, 추가 분자를 암호화하는 핵산 서열의 적응을 허용할 수 있다. 일부 측면에서, 핵산 서열, 예를 들어, 전이 유전자 서열의 생성, 전달 및/또는 상동성 지시 수선(HDR)에 의한 표적화 효율은 제공된 구현예를 사용하여 촉진되거나 개선될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌가 재조합 TCR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포를 생성하거나 생산하는 방법이 여기서 제공된다. 일부 측면에서, 유전자 조작된 세포에서 변형된 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌는 일반적으로 TCRα 또는 TCRβ 불변 도메인을 암호화하는 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌로 통합된, 재조합 TCR의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열(여기서 외인성 또는 이종 핵산 서열로도 지칭)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 재조합 TCR의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드를 사용하여 표적화된 유전자 파괴 및 상동성 의존적 수선(HDR)을 유도하고, 이로써 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌에서 전이 유전자의 통합을 표적화하는 것을 포함한다. 본 방법에 의해 생성된 세포 및 세포 조성물이 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 제공된 폴리뉴클레오티드, 전이 유전자 및/또는 벡터가 면역 세포로 전달될 때, T 세포 활성을 조절할 수 있고 일부 경우에, T 세포 분화 또는 항상성을 조절할 수 있는 재조합 수용체의 발현을 초래한다. 생성된 유전자 조작된 세포 또는 세포 조성물은 입양 세포 치료 방법에 사용될 수 있다.
따라서, 제공된 구현예는 개선된 발현, 기능 및 발현의 균일성 및/또는 다른 바람직한 특징 또는 특성 및 궁극적으로 보다 높은 효능을 나타내는 조작된 세포의 생산을 촉진할 수 있다. 제공된 구현예는 또한 재조합 TCR을 세포로 전달하는데 필요한 벡터, 전이 유전자 및/또는 폴리뉴클레오티드의 길이를 감소시켜, 예를 들어 동일한 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터 내에 추가 요소 및/또는 전이 유전자를 패키징하기 위한 충분한 공간을 허용할 수 있다.
조작된 세포의 설계, 준비 및 생산 방법 및 조작된 세포를 생성하거나 생산하기 위한 키트 및 장치가 또한 제공된다. 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 바이러스 벡터 및 예컨대 형질 도입 또는 전기 천공과 같은 물리적 전달에 의해 상기 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 방법이 제공된다. 예컨대 입양 세포 요법을 위해 대상체에 세포 및 조성물을 투여하기 위한 조작된 세포를 함유하는 조성물, 방법, 키트 및 장치가 또한 제공된다. 일부 측면에서, 세포는 대상체로부터 단리되고, 조작되고, 동일한 대상체에 투여된다. 다른 측면에서, 세포는 한 대상체로부터 단리되고, 조작되고, 다른 대상체에 투여된다.
본 출원에서 언급된 특허 문헌, 과학 논문 및 데이터베이스를 포함한 모든 출판물은 각각의 개별 출판물이 개별적으로 참조로 통합된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 여기에 제시된 정의가 여기에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 출판물에 제시된 정의와 상반되거나 달리 부합하지 않는 경우, 여기에 제시된 정의가 여기에 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
여기에 사용된 섹션 제목은 단지 조직화를 위한 목적이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
Ⅰ. 상동성 지시 수선(HOMOLOGY-DIRECTED REPAIR, HDR)에 의해 재조합 수용체를 발현하는 세포의 생산 방법
입양 세포 요법을 위한 유전자 조작된 면역 세포, 예를 들어, 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법, 관련 조성물, 방법, 용도 및 상기 방법을 수행하는데 사용되는 키트 및 제조 물품이 여기서 제공된다. 제공된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 유전자 조작된 면역 세포를 포함하여 재조합 T 세포 수용체(TCR)와 같은 재조합 수용체를 발현하는 유전자 조작된 면역 세포 및 상기 세포를 함유한 조성물이 또한 제공된다. 면역 세포는 재조합 수용체, 예를 들어 재조합 T 세포 수용체(TCR)와 같은 재조합 분자를 발현하도록 일반적으로 조작된다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 예를 들어 내인성 TCR 유전자의 유전자좌 내 하나 이상의 표적 부위에서 특정 유전자좌로 재조합 수용체, 예를 들어 TCR의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 특이적으로 표적화하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 TCR 유전자의 유전자 좌 내에 인프레임으로 통합되어 전체 재조합 TCR을 암호화하는 변경된 유전자의 유전자 좌를 생성한다.
일부 구현예에서, 입양 세포 요법을 위한 유전자 조작된 면역 세포, 예를 들어, 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 T 세포 수용체 베타(TCRβ)사슬의 도메인 또는 영역을 암호화하는 하나 이상의 유전자(들) 및/또는 T 세포 수용체 알파(TCRα)사슬의 도메인 또는 영역을 암호화하는 유전자 내에서 하나 이상의 표적 부위(들)("표적 위치(target position)", "표적 DNA 서열(target DNA sequence)" 또는 "표적 위치(target location)"로도 공지)의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)(제공된 방법의 측면과 관련하여 전체에서 "하나 이상의 제제들(one or more agents)" 또는 "제제(들)(agent(s))"로도 지칭됨)를 면역 세포로 도입하는 것; 및 면역 세포로 재조합 수용체 또는 이의 사슬을 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드를 도입하고, 여기서 재조합 수용체 또는 이의 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나 또는 근처에서 표적화되는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌가 재조합 TCR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포를 생성하거나 생산하는 방법이 여기서 제공된다. 일부 측면에서, 유전자 조작된 세포에서 변형된 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌는 일반적으로 TCRα 또는 TCRβ 불변 도메인을 암호화하는 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌로 통합된, 재조합 TCR의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열(여기서 외인성 또는 이종 핵산 서열로도 지칭)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 재조합 TCR의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드를 사용하여 표적화된 유전자 파괴 및 상동성 의존적 수선(HDR)을 유도하고, 이로써 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌에서 전이 유전자의 통합을 표적화하는 것을 포함한다. 본 방법에 의해 생성된 세포 및 세포 조성물이 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 재조합 TCR의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열은 TCRα 사슬의 일부 및/또는 TCRβ 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 TCRα 사슬의 일부는 TCRα 사슬의 전장 미만을 포함한다. 특정 구현예에서, TCRα 사슬의 일부는 TCRα 가변 도메인 및 전장 TCR 불변 도메인, 예를 들어 전장 천연 TCRα 불변 도메인보다 짧은 TCRα 불변 도메인의 일부를 함유하거나 TCRα 불변 도메인을 암호화하는 서열을 함유하지 않는다. 일부 측면에서, 내인성 TRAC 유전자 좌로 전이 유전자 서열의 통합 시, 생성된 변형된 TRAC 유전자 좌는 HDR에 의해 표적화된 전이 유전자 및 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 융합에 의해 암호화된 재조합 TCR 수용체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 TCR은 TCRα 사슬, 예를 들어, TCRβ 사슬에 결합할 수 있는 기능성 TCRα 사슬을 함유한다.
특정 구현예에서, 재조합 TCR의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열은 TCRα 사슬 및/또는 TCRβ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 TCRβ 사슬의 일부는 TCRβ 사슬의 전장 미만이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, TCRβ 사슬의 일부는 TCRβ 가변 도메인 및 전장 TCR 불변 도메인, 예를 들어 전장 천연 TCRα 불변 도메인보다 짧은 TCRβ 불변 도메인의 일부를 함유하거나 TCRβ 불변 도메인을 암호화하는 서열을 함유하지 않는다. 일부 측면에서, 내인성 TRBC 유전자 좌, 예를 들어 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌로 전이 유전자 서열의 통합 시, 생성된 변형된 TRBC 유전자 좌는 HDR에 의해 표적화된 전이 유전자 및 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 융합에 의해 암호화된 재조합 TCR 수용체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 재조합 TCR은 TCRβ 사슬, 예를 들어, TCRα 사슬에 결합할 수 있는 기능성 TCRβ 사슬을 함유한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 또는 이의 사슬, 예를 들어, 재조합 TCR 또는 이의 사슬의 단편 및/또는 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 내인성 수용체, 예를 들어, 내인성 TCR 유전자를 암호화하는 유전자의 유전자 좌내에 있는 표적 부위(들)에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 내인성 유전자의 유전자 좌 내에서 인프레임 통합을 위해 표적화된다. 특정 구현예에서, 인프레임 통합은 외인성 및 내인성 핵산 서열의 통합과 같이, 재조합 수용체의 일부 및/또는 단편을 암호화하는 핵산 서열을 수용체의 나머지 부분 및/또는 단편을 암호화하는 유전자의 유전자 좌의 부분 및/또는 단편과 인프레임으로 함유하는 재조합 수용체에 대한 코딩 서열을 초래하여 완전한, 전체의 및/또는 전장 재조합 수용체를 암호화하는 코딩 서열에 도달한다. 특정 구현예에서, 통합은 표적 부위의 유전자에 의해 암호화된 내인성 수용체의 발현을 유전적으로 파괴한다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 HDR을 통해 유전자의 유전자 좌 내에서 표적화된다.
특정 구현예에서, 재조합 수용체는 하나 이상의 가변 도메인 및 하나 이상의 불변 도메인을 함유하는 재조합 TCR 또는 이의 사슬이다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 TCR 불변 도메인을 포함하지 않는 재조합 TCR의 부분 및/또는 단편을 암호화하고, 전이 유전자는 내인성 TCR 불변 도메인을 암호화하는 서열, 예를 들어 게놈 DNA 서열과 인프레임으로 통합된다. 특정 구현예에서, 통합은 완전한, 전체의 및/또는 전장 재조합 TCR 또는 이의 사슬을 암호화하는 코딩 서열을 초래한다. 일부 구현예에서, 코딩 서열은 TCR 또는 이의 사슬의 일부 또는 단편을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 내인성 TCR 불변 도메인을 암호화하는 내인성 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는, 불변 도메인의 일부 및/또는 단편, 예를 들어, 내인성 TCR 불변 도메인과 완전히 또는 부분적으로 동일한 불변 도메인의 일부 또는 단편을 포함하는 재조합 수용체의 일부 및/또는 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는, 전이 유전자에 의해 암호화되지 않는 내인성 TCR 불변 도메인의 일부 및/또는 단편을 암호화하는 서열, 예를 들어 게놈 DNA 서열과 인프레임으로 통합된다. 특정 구현예에서, 통합은 완전한, 전체의 및/또는 전장 재조합 TCR 또는 이의 사슬을 암호화하고, TCR 불변 도메인의 내인성 일부 또는 단편을 암호화는 내인성 서열 및 전이 유전자 서열을 함유하는 코딩 서열을 초래한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 면역 세포로 하나 이상의 제제를 도입하고, 여기서 하나 이상의 제제 각각은 독립적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 내 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있고, 이로써 하나 이상의 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있고; 재조합 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 사슬을 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드를 면역 세포로 도입하고, 여기서 재조합 TCR 또는 이의 항원 결합 단편 또는 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 하나 이상의 표적 부위 중 하나 또는 근처에서 통합을 위해 표적화되는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 표적 부위 또는 근처에서의 통합은, 예를 들어, 코딩 서열 하류의 일부, 예를 들어 표적 부위의 3' 근처 및/또는 표적 부위의 바로 하류와 같은 TRAC 및/또는 TRBC 유전자의 코딩 서열 일부와 인프레임이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나가 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 내에 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나가 T 세포 수용체 베타 불변 1(TRBC1) 또는 T 세포 수용체 베타 불변 2(TRBC2) 유전자 내에 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 부위(들)가 TRAC 유전자 및 TRBC1 및 TRBC2 유전자 중 하나 또는 둘 다의 내에 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 도메인 또는 영역을 암호화하는 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬의 도메인 또는 영역을 암호화하는 하나 이상의 유전자(들) 내의 하나 이상의 표적 부위(들)의 유전자 파괴를 갖는 면역 세포로 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함하고, 여기에서 재조합 수용체 또는 이의 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 HDR을 통해 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나 또는 근처에서 표적화된다.
제공된 구현예에서, 용어 "도입(introducing)"은 시험관 내 또는 생체 내에서 DNA를 세포로 도입하는 다양한 방법을 포괄하며, 상기 방법은 형질 전환, 형질 도입, 형질 감염(예를 들어, 전기 천공) 및 감염을 포함한다. 벡터는 DNA 암호화 분자를 세포로 도입하는데 유용하다. 가능한 벡터에는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터가 포함된다. 바이러스 벡터에는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 관련 벡터와 같은 기타 벡터가 포함된다. 전기 천공과 같은 방법은 또한 예를 들어 표적화 gRNA와 복합체로 Cas9 단백질을 함유하는 단백질 또는 리보뉴클레오단백질(RNP)을 관심 세포로 도입하거나 전달하는데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 여기에 제공된 구현예는 상동성 지시 수선(HDR)에 의해 재조합 수용체(예컨대 재조합 TCR 또는 CAR)를 암호화하는 핵산의 표적화된 녹인과 함께, 유전자 편집 기술에 의한 하나 이상의 내인성 TCR 유전자의 유전자 좌(예컨대 TCRα 및/또는 TCRβ 사슬을 암호화하는 내인성 유전자)에서 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손을 포함한다. 일부 구현예에서, HDR 단계는 표적 게놈 위치의 DNA에서 파손, 예를 들어 이중 가닥 파손을 필요로 한다. 일부 구현예에서, DNA 파손은 유전자 편집 단계, 예를 들어 유전자 편집에 사용되는 표적화된 뉴클레아제에 의해 생성된 DNA 파손의 결과로 발생한다.
일부 구현예에서, 구현예는 유전자 편집 방법 및/또는 표적화된 뉴클레아제를 사용하여 표적화된 DNA 손상을 생성하여, 이후 하나 이상의 주형 폴리뉴클레오티드(들), 예를 들어 상동성 서열 및 하나 이상의 전이 유전자, 예를 들어 재조합 수용체 또는 이의 사슬을 암호화하는 핵산 및/또는 다른 외인성 또는 재조합 핵산을 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드(들)를 기반으로 한 HDR에 의해 재조합 수용체 또는 이의 사슬을 암호화하는 핵산 서열 및/또는 다른 외인성 또는 재조합 핵산을 DNA 파손 또는 그 근처에서 특이적으로 표적화하고 통합하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, HDR에 의한 재조합 수용체 암호화 핵산의 표적화된 유전자 파괴 및 표적화된 통합은 내인성 T 세포 수용체(TCR)의 하나 이상의 도메인, 영역 및/또는 사슬을 암호화하는 내인성 유전자의 하나 이상의 표적 부위(들)("표적 위치(target position)", "표적 DNA 서열(target DNA sequence)" 또는 "표적 위치(target location)"로도 공지)에서 발생한다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 TCRα 유전자에서 유도된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 TCRβ 유전자에서 유도된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 내인성 TCRα 유전자 및 내인성 TCRβ 유전자에서 유도된다. 내인성 TCR 유전자는 TCRα 불변 도메인(인간에서 TRAC에 의해 암호화) 및/또는 TCRβ 불변 도메인(인간에서 TRBC1 또는 TRBC2에 의해 암호화)을 암호화하는 유전자 중 하나 이상을 포함할 수 있다.특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는 TCRα 사슬의 일부 및/또는 단편을 함유하는 재조합 TCR의 일부 및/또는 단편을 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCRα 사슬의 일부 및/또는 단편은 완전한, 전체의 및/또는 전장 TCRα 가변 도메인 및 TCRα 불변 도메인의 일부 및/또는 단편을 함유한다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 TRAC 유전자 내의 표적 부위에 인프레임으로 통합된다. 일부 구현예에서, 인프레임 통합은 전체의, 완전한 및/또는 전장 재조합 TCR 또는 이의 사슬을 암호화하는 코딩 서열을 초래한다. 특정 구현예에서, 전체의, 완전한 및/또는 전장 재조합 수용체는 전체의, 완전한 및/또는 전장 TCRα 사슬을 함유한다. 일부 구현예에서, 전체의, 완전한 및/또는 전장 재조합 수용체는 전체의, 완전한 및/또는 전장 TCRα 불변 도메인을 함유한다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는 TCRβ 사슬의 일부 및/또는 단편을 함유하는 재조합 TCR 또는 이의 사슬의 일부 및/또는 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, TCRβ 사슬의 일부 및/또는 단편은 TCRβ 불변 도메인의 일부 및/또는 단편을 함유한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 TRBC 유전자, 예를 들어 TRBC1 및/또는 TRBC2 내의 표적 부위에 인프레임으로 통합된다. 일부 구현예에서, 인프레임 통합은 전체의, 완전한 및/또는 전장 재조합 TCR 또는 이의 사슬을 암호화하는 코딩 서열을 초래한다. 특정 구현예에서, 전체의, 완전한 및/또는 전장 재조합 수용체는 전체의, 완전한 및/또는 전장 TCRβ 사슬을 함유한다. 일부 구현예에서, 전체의, 완전한 및/또는 전장 재조합 수용체는 전체의, 완전한 및/또는 전장 TCRβ 불변 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들)의 도입 전, 동시에 또는 후에 조작된 세포로 도입된다. 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어, DNA 파손의 존재 하에, 주형 폴리뉴클레오티드는 DNA 수선 주형으로 사용되어, 전이 유전자, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 주형 폴리뉴클레오티드에 포함되어 있는 5' 및/또는 3' 상동성 암 및 표적 부위 주변 내인성 유전자 서열 사이 상동성에 기초하여 HDR에 의한 표적화된 유전자 파괴 부위 또는 근처에서 효과적으로 복제되고 통합될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 및 HDR 단계는 동시에 및/또는 하나의 실험 반응에서 수행된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 및 HDR 단계는 하나 또는 연속적인 실험 반응에서 연속적으로 또는 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 및 HDR 단계는 동시에 또는 상이한 시간에 별도의 실험 반응에서 수행된다.
면역 세포는 T 세포를 함유하는 세포 집단을 포함할 수 있다. 상기 세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 샘플, 비분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분 채집술 생성물 또는 백혈구 성분 채집술 생성물에서 수득된 것과 같은 대상체에서 수득된 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 분리 또는 선택되어 양성 또는 음성 선택 및 농축 방법을 사용하여 집단에서 T 세포가 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, 집단에는 CD4+, CD8+ 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 함유되어 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계 및 제제(예를 들어 Cas9/gRNA RNP)를 도입하는 단계는 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 주형은 제제(들)(예를 들어 Cas9/gRNA RNP)를 도입하는 단계에 의해 유전자 파괴를 유도한 후에 면역 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 주형 및 하나 이상의 제제(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)의 도입 전, 동안 및/또는 후에, 세포는 세포의 증폭 및/또는 증식을 자극하는 조건 하에서 배양되거나 인큐베이션된다.
제공된 방법의 특정 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 도입은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후에 수행된다. 하나 이상의 제제(들)를 도입하는 임의의 방법은 유전자 파괴를 유도하는데 사용되는 특정 제제(들)에 따라 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 파괴는 파괴될 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌에 특이적인 CRISPR-Cas9 시스템과 같은 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬 핵산(CRISPR)-Cas 시스템과 같은 RNA 가이드 뉴클레아제를 사용하는 것과 같은 유전자 편집에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, TRAC 또는 TRBC 유전자 좌 영역을 표적화하는 표적화 도메인을 함유하는 Cas9 및 가이드 RNA(gRNA)를 함유하는 제제가 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 제제는 TRAC/TRBC-표적 표적화 도메인을 함유하는 Cas9 및 gRNA의 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체(Cas9/gRNA RNP)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 도입은 시험관 내에서 세포와 제제 또는 이의 일부를 접촉시키는 것을 포함하며, 이는 최대 24, 36 또는 48시간 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 동안 세포 및 제제를 배양 또는 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 도입은 세포로 제제의 전달을 달성하는 것을 더 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시에 따른 방법, 조성물 및 세포는 예를 들어 전기 천공에 의해 세포로 Cas9 및 gRNA의 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체의 직접적인 전달을 이용한다. 일부 구현예에서, RNP 복합체는 3' 폴리-A 꼬리 및 5' ARCA(Anti-Reverse Cap Analog) 캡을 포함하도록 변경된 gRNA를 포함한다. 일부 경우에, 변경될 세포의 전기 천공은 세포의 전기 천공 후 및 플레이팅 전에, 예를 들어, 32 ℃에서의 세포의 저온 충격을 포함한다.
제공된 방법의 상기 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 전기 천공을 통해 도입된 Cas9/gRNA RNP와 같은 하나 이상의 제제(들)를 도입한 후 세포내로 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후 즉시 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후 (약) 30 초 이내, (약) 1 분 이내, (약) 2 분 이내, (약) 3 분 이내, (약) 4 분 이내, (약) 5 분 이내, (약) 6 분 이내, (약) 6 분 이내, (약) 8 분 이내, (약) 9 분 이내, (약) 10 분 이내, (약) 15 분 이내, (약) 20 분 이내, (약) 30 분 이내, (약) 40 분 이내, (약) 50 분 이내, (약) 60 분 이내, (약) 90 분 이내, (약) 2 시간 이내, (약) 3 시간 이내 또는 (약) 4 시간 이내에 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제제(들) 도입 후 (약) 15 분 내지 (약) 4 시간, 예컨대 (약) 15 분 내지 (약) 3 시간, (약) 15 분 내지 (약) 2 시간, (약) 15 분 내지 (약) 1 시간, (약) 15 분 내지 (약) 30 분, (약) 30 분 내지 (약) 4 시간, (약) 30 분 내지 (약) 3 시간, (약) 30 분 내지 (약) 2 시간, (약) 30 분 내지 (약) 1 시간, (약) 1 시간 내지 (약) 4 시간, (약) 1 시간 내지 (약) 3 시간, (약) 1 시간 내지 (약) 2 시간, (약) 2 시간 내지 (약) 4 시간, (약) 2 시간 내지 (약) 3 시간 또는 (약) 3 시간 내지 (약) 4 시간의 시기에 세포로 도입된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제제의 도입 후 (약) 2 시간에 도입된다.
주형 폴리뉴클레오티드를 도입하는 임의의 방법이 세포로 주형 폴리뉴클레오티드 전달을 위해 사용되는 특정 방법에 따라 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 예시적인 방법에는 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 형질 도입, 트랜스포손 및 전기천공을 통한 것을 포함하여 수용체를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 방법이 포함된다. 특정 구현예에서, 바이러스 형질 도입 방법이 사용된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포내로 전달되거나 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다(예를 들어 문헌[Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557] 참조). 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV2 또는 AAV6과 같은 AAV이다.
일부 구현예에서, 세포와 제제를 접촉하기 전, 동안 또는 이후 및/또는 전달을 달성(예를 들어 전기 천공)하기 전, 동안 또는 이후에, 제공된 방법은 사이토카인, 자극제 및/또는 면역 세포(예를 들어 T 세포)의 증식, 자극 또는 활성화를 유도할 수 있는 제제의 존재 하에 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 항-CD3/항-CD28 비드와 같은 CD28 및/또는 사이토카인에 특이적인 항체, CD3에 특이적인 항체이거나 이를 포함하는 자극제의 존재 하에 진행된다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 하나 이상의 재조합 IL-2, 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15와 같은 사이토카인의 존재 하에 진행된다. 일부 구현예에서, Cas9/gRNA RNP와 같은 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드를 예를 들어 전기 천공을 통해 도입하기 전 또는 후 최대 8 일, 예컨대 최대 24 시간, 36 시간 또는 48 시간 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 일 동안 인큐베이션한다.
일부 구현예에서, 방법은 제제, 예를 들어 Cas9/gRNA RNP 및 폴리뉴클레오티드 주형을 도입하기 전 자극제(예를 들어 항-CD3/항-CD28 항체)로 세포를 활성화 또는 자극하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9/gRNA RNP와 같은 하나 이상의 제제(들)를 예를 들어 전기 천공을 통해 도입하기 전 자극제(예를 들어 항-CD3/항-CD28)의 존재 하에 6 시간 내지 96 시간, 예컨대 24-48 시간 또는 24-36 시간 동안 인큐베이션한다. 일부 구현예에서, 자극제와의 인큐베이션은 하나 이상의 재조합 IL-2, 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15와 같은 사이토카인의 존재를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 재조합 사이토카인, 예컨대 IL-2(예를 들어 1 U/mL 내지 500 U/mL, 예컨대 10 U/mL 내지 200 U/mL, 예를 들어 약 50 U/mL 또는 100 U/mL 또는 50 U/mL 또는 100 U/mL 이상), IL-7(예를 들어 0.5 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 예를 들어, 약 5 ng/mL 또는 10 ng/mL 또는 5 ng/mL 또는 10 ng/mL 이상) 또는 IL-15(예를 들어 0.1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 0.5 ng/mL 내지 25 ng/mL, 예를 들어, 약 1 ng/mL 또는 5 ng/mL 또는 1 ng/mL 또는 5 ng/mL 이상)의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 자극제(들)(예를 들어 항-CD3/항-CD28 항체)는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), Cas9/gRNA RNP 및/또는 폴리뉴클레오티드 주형을 세포로 도입 또는 전달하기 전에 세척되거나 또는 세포로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 제제(들) 도입 전에, 예를 들어 임의의 자극제 또는 활성제를 제거함으로써 세포는 정치된다. 일부 구현예에서, 제제(들) 도입 전에, 자극제 또는 활성제 및/또는 사이토카인은 제거되지 않는다.
일부 구현예에서, 제제(들), 예를 들어 Cas9/gRNA 및/또는 폴리뉴클레오티드 주형의 도입 후에, 세포는 하나 이상의 재조합 IL-2, 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15와 같은 재조합 사이토카인의 존재 하에 인큐베이션, 경작 또는 배양된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 재조합 사이토카인, 예컨대 IL-2(예를 들어 1 U/mL 내지 500 U/mL, 예컨대 10 U/mL 내지 200 U/mL, 예를 들어 약 50 U/mL 또는 100 U/mL 또는 50 U/mL 또는 100 U/mL 이상), IL-7(예를 들어 0.5 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 예를 들어, 약 5 ng/mL 또는 10 ng/mL 또는 5 ng/mL 또는 10 ng/mL 이상) 또는 IL-15(예를 들어 0.1 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예컨대 0.5 ng/mL 내지 25 ng/mL, 예를 들어, 약 1 ng/mL 또는 5 ng/mL 또는 1 ng/mL 또는 5 ng/mL 이상)의 존재 하에 수행된다. 세포는 세포의 증식 또는 증폭을 유도하기 위한 조건 하에서 인큐베이션 또는 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 수확을 위한 세포의 역치 수, 예를 들어 치료적 유효 용량이 달성될 때까지 인큐베이션 또는 배양될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 과정의 임의의 일부 또는 모든 과정 동안 30℃ ± 2℃ 내지 39℃ ± 2℃, 예컨대 (약) 30℃ ± 2℃, 32℃ ± 2℃, 34℃ ± 2℃ 또는 37℃ ± 2℃ 이상의 온도에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 30℃ ± 2℃이고, 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 37℃ ± 2℃이다.
일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌에 존재하는 핵산 서열은 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열과 HDR에 의해 표적화된 전이 유전자의 융합을 포함한다. 일부 측면에서, 변형된 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌에 존재하는 핵산 서열은 TCRα 또는 TCRβ 불변 도메인을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 함유하는 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌에서 통합된 전이 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, 그리고 표적화된 통합 또는 융합, 예를 들어 인프레임 융합 시, 외인성 서열의 일부 및 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 일부는 함께 재조합 TCRα 또는 TCRβ 사슬을 암호화한다. 따라서, 제공된 구현예는 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 전부 또는 일부를 사용하여 재조합 TCR의 전체 TCRα 또는 TCRβ 사슬을 암호화한다.
특정 구현예에서, 변형된 TRAC 유전자 좌에 존재하는 핵산 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열과 HDR에 의해 표적화된 전이 유전자의 융합이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 TRAC 유전자 좌에 존재하는 핵산 서열은 TCRα 불변 도메인을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 함유하는 내인성 TRAC 유전자 좌에 통합된 전이 유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, 표적화된 통합 또는 융합, 예를 들어 인프레임 융합 시, 외인성 서열의 일부 및 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 일부는 함께 재조합 TCRα 사슬 및/또는 TCRα 불변 도메인을 함유하는 단백질을 암호화한다. 특정 구현예에서, TCRα 사슬 및/또는 TCRα 불변 도메인을 함유하는 단백질은 기능성 TCRα 불변 도메인, 예를 들어 TCRβ 사슬에 결합할 수 있는 TCRα 불변 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, 변형된 TRBC 유전자 좌, 예를 들어 변형된 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌에 존재하는 핵산 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열과 HDR에 의해 표적화된 전이 유전자의 융합이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 TRBC 유전자 좌에 존재하는 핵산 서열은 TCRβ 불변 도메인을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 함유하는 내인성 TRAC 유전자 좌에 통합된 전이 유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, 표적화된 통합 또는 융합, 예를 들어 인프레임 융합 시, 외인성 서열의 일부 및 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 일부는 함께 재조합 TCRβ 사슬 및/또는 TCRβ 불변 도메인을 함유하는 단백질을 암호화한다. 특정 구현예에서, TCRβ 사슬 및/또는 TCRβ 불변 도메인을 함유하는 단백질은 기능성 TCRβ 불변 도메인, 예를 들어 TCRβ 사슬에 결합할 수 있는 TCRβ 불변 도메인을 함유한다.
A. 유전자 파괴
일부 구현예에서, 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴(들)가 내인성 TCRα 유전자 및/또는 내인성 TCRβ 유전자에서 유도된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 TCRα 불변 도메인(TCRα 불변 영역으로도 공지; 인간에서 TRAC에 의해 암호화) 및/또는 TCRβ 불변 도메인(TCRβ 불변 영역으로도 공지; 인간에서 TRBC1 또는 TRBC2에 의해 암호화)을 암호화하는 하나 이상의 유전자에서 유도된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 TRAC, TRBC1 및 TRBC2 유전자 좌에서 유도된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 인트론, 예를 들어, TRAC, TRBC1 또는 TRBC2 인트론에서 유도된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 엑손, 예를 들어, TRAC, TRBC1 또는 TRBC2 엑손에서 유도된다.
일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 DNA 손상 또는 닉(nick)을 초래한다. 일부 구현예에서, DNA 손상 부위에서, 세포의 DNA 수선 기제의 작용은 이중 대립 유전자 프레임 이동 돌연변이, 유전자 전체 또는 일부의 결실과 같은 녹아웃, 삽입, 미스센스(missense) 또는 프레임 이동 돌연변이를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 제1 또는 제2 엑손 내와 같은 유전자의 하나 이상의 엑손 또는 이의 일부에 대해 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나의 근처 영역에 있는 서열에 특이적으로 결합하거나 이와 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산이 표적화된 파괴를 위해 사용된다. 일부 측면에서, HDR 파괴에 대한 외인성 주형 폴리뉴클레오티드의 부재하에, 표적화된 유전자 파괴는 유전자의 엑손 내에서 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 초래한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체 및 상동성 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드가 여기, 예를 들어 섹션 I.B.에 기재된 임의의 통합과 같은 HDR에 의한 유전자 파괴 부위 또는 근처에서 재조합 수용체 암호화 서열의 표적화된 통합을 위해 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 도입함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 제제에는 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산이 포함된다. 일부 구현예에서, 제제에는 DNA 표적화 단백질 및 뉴클레아제 또는 RNA 가이드 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질과 같은 다양한 성분이 포함된다. 일부 구현예에서, 제제는 예를 들어, TRAC 유전자 및 TRBC1 및 TRBC2 유전자 중 하나 또는 둘 다에서 하나 이상의 표적 위치를 표적화할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 표적 부위("표적 위치(target position)", "표적 DNA 서열" 또는 "표적 위치(target location)"로도 지칭 및/또는 공지)에서 발생한다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어 표적 부위를 지정하는 gRNA와 복합체를 이룬 Cas9 분자에 의해 변경되는 표적 DNA(예를 들어 게놈 DNA) 상의 부위이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 표적 부위는 절단 또는 DNA 손상이 발생하는 DNA 예를 들어, 내인성 TRAC, TRBC 유전자 좌에 있는 위치를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, HDR에 의한 핵산 서열의 통합은 표적 부위 또는 표적 서열 또는 근처에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 하나 이상의 뉴클레오티드가 첨가되는 DNA 상에 2개의 뉴클레오티드, 예를 들어 인접한 뉴클레오티드 사이의 부위일 수 있다. 표적 부위는 주형 폴리뉴클레오티드에 의해 변경되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 표적 서열(예를 들어, gRNA가 결합하는 서열) 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 표적 서열의 상류 또는 하류에 있다.
1. 내인성 T 세포 수용체(TCR) 암호화 유전자에 있는 표적 부위
일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 내인성 T 세포 수용체(TCR)의 하나 이상의 도메인, 영역 및/또는 사슬을 암호화하는 내인성 유전자에서 발생한다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 TCRα 및/또는 TCRβ를 암호화하는 내인성 유전자의 유전자 좌에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 TCRα 불변 도메인(인간의 경우 TRAC) 및/또는 TCRβ 불변 도메인(인간의 경우 TRBC1 또는 TRBC2)을 암호화하는 유전자에서 표적화된다.
일부 구현예에서, 내인성 TCR을 포함하여 "T 세포 수용체(T cell receptor)" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ로도 공지) 또는 가변 γ 및 δ 사슬(각각 TCRγ 및 TCRδ로도 공지) 또는 이의 항원 결합 부분을 함유하는 분자이고, 이는 MHC 분자에 결합된 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태이다. 전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이를 발현하는 T 세포는 별개의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. 전형적으로 하나의 T 세포는 한 가지 유형의 TCR을 발현한다. TCR은 세포 표면에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로 TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견되며, 이는 일반적으로 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원의 인식을 담당한다.
일부 구현예에서, TCR은 가변 도메인 및 불변 도메인(불변 영역으로도 공지), 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다(예를 들어, 문헌[Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997] 참조). 일부 구현예에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어, 주어진 TCR 사슬(예를 들어, TCRα 사슬 또는 TCRβ 사슬)의 세포 외 부분은 세포막에 인접한 2개의 면역 글로불린 유사 도메인, 예컨대 가변 도메인(예를 들어, Vα 또는 Vβ; 전형적으로 Kabat 넘버링(Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.)에 기초한 1 내지 116 아미노산) 및 불변 도메인(예를 들어, α 사슬 불변 도메인 또는 TCR Cα, 전형적으로 Kabat 넘버링에 기초한 사슬의 117 내지 259 위치 또는 β 사슬 불변 도메인 또는 TCR Cβ, 전형적으로 Kabat에 기초한 사슬의 117 내지 295 위치)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포 외 부분은 2개의 막 근위 불변 도메인과 2개의 막 원위 가변 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, 내인성 TCR Cα는 TRAC 유전자(IMGT 명명법)에 의해 암호화된다. 인간 T 세포 수용체 알파 불변 사슬(TRAC) 유전자의 유전자 좌의 예시적인 뉴클레오티드 서열이 서열 번호: 1에 제시된다(NCBI 참조 서열: NG_001332.3, TRAC). 일부 구현예에서, 암호화된 내인성 Cα는 서열 번호: 19 또는 24(UniProtKB Accession No. P01848 또는 Genbank Accession No. CAA26636.1)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
인간의 경우, TRAC의 예시적인 게놈 유전자 좌는 4개의 엑손 및 3개의 인트론을 함유하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. TRAC의 예시적인 mRNA 전사물은 인간 게놈 버전 GRCh38(UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly)을 참조하여 정방향 가닥으로 염색체 14: 22,547,506-22,552,154 좌표에 해당하는 서열을 포괄할 수 있다. 표 1은 예시적인 인간 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 및 인트론의 좌표 및 전사물의 비번역 영역을 제시한다.
[표 1]
특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRAC 유전자 좌에서, 근처 또는 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에서, 근처 또는 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TCRα 불변 도메인을 암호화하는 오픈 리딩 프레임에서, 근처 또는 내에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 서열 번호: 1에 제시된 핵산 서열 또는 서열 번호: 1에 제시된 핵산 서열의 전부 또는 일부, 예를 들어 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500 또는 4,000 개의 인접한 뉴클레오티드 또는 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500 또는 4,000 개 이상의 인접한 뉴클레오티드에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 또는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 유전자 좌에서, 근처 또는 내에서 표적화된다.
인간의 경우, TRBC1의 예시적인 게놈 유전자 좌는 4개의 엑손 및 3개의 인트론을 함유하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. TRBC1의 예시적인 mRNA 전사물은 인간 게놈 버전 GRCh38(UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly)을 참조로 정방향 가닥 상의 염색체 7: 142,791,694-142,793,368의 좌표에 해당하는 서열을 포괄할 수 있다. 표 2는 예시적인 인간 TRBC1 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 및 인트론의 좌표 및 전사물의 비번역 영역을 제시한다.
[표 2]
인간의 경우, TRBC2의 예시적인 게놈 유전자 좌는 4개의 엑손 및 3개의 인트론을 함유하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. TRBC2의 예시적인 mRNA 전사물은 인간 게놈 버전 GRCh38(UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly)을 참조로 정방향 가닥 상의 염색체 7: 142,801,041-142,802,748의 좌표에 해당하는 서열을 포괄할 수 있다. 표 3는 예시적인 인간 TRBC2 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 및 인트론의 좌표 및 전사물의 비번역 영역을 제시한다.
[표 3]
일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드 내의 전이 유전자(예를 들어, 외인성 핵산 서열)가 사용되어 표적 부위 및/또는 상동성 암의 위치를 안내할 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 파괴의 표적 부위가 가이드로서 사용되어 HDR을 위해 사용되는 주형 폴리뉴클레오티드 및/또는 상동성 암을 설계할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 전이 유전자 서열(예를 들어, 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화)의 표적화된 통합의 바람직한 부위 근처에서 표적화될 수 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 인트론 내에 있다.
일부 구현예에서, 내인성 TCR Cβ는 TRBC1 또는 TRBC2 유전자(IMGT 명명법)에 의해 암호화된다. 인간 T 세포 수용체 베타 불변 사슬 1(TRBC1) 유전자의 유전자 좌의 예시적인 뉴클레오티드 서열이 서열 번호: 2(NCBI 참조 서열: NG_001333.2, TRBC1)에 제시되고; 인간 T 세포 수용체 베타 불변 사슬 2(TRBC2) 유전자의 유전자 좌의 예시적인 뉴클레오티드 서열이 서열 번호: 3(NCBI 참조 서열: NG_001333.2, TRBC2)에 제시된다. 일부 구현예에서, 암호화된 Cβ는 서열 번호: 20, 21 또는 25(Uniprot Accession No. P01850, A0A5B9 또는 A0A0G2JNG9)에 제시된 아미노산 서열을 갖거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC1 유전자의 유전자 좌에서, 근처 또는 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC1 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에서, 근처 또는 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TCRβ 불변 도메인을 암호화하는 오픈 리딩 프레임에서, 근처 또는 내에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 서열 번호: 2에 제시된 핵산 서열 또는 서열 번호: 2에 제시된 핵산 서열의 전부 또는 일부, 예를 들어 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500 또는 4,000 개의 인접한 뉴클레오티드 또는 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500 또는 4,000 개 이상의 인접한 뉴클레오티드에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 또는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 유전자 좌에서, 근처 또는 내에서 표적화된다.
특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC2 유전자 좌에서, 근처 또는 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC2 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에서, 근처 또는 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TCRβ 불변 도메인을 암호화하는 오픈 리딩 프레임에서, 근처 또는 내에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 서열 번호: 3에 제시된 핵산 서열 또는 서열 번호: 3에 제시된 핵산 서열의 전부 또는 일부, 예를 들어 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500 또는 4,000 개의 인접한 뉴클레오티드 또는 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500 또는 4,000 개 이상의 인접한 뉴클레오티드에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 또는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 유전자 좌에서, 근처 또는 내에서 표적화된다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어, DNA 손상은 코딩 영역의 시작 또는 이에 근접하여(예를 들어, 초기 코딩 영역, 예를 들어, 시작 코돈 또는 나머지 코딩 서열에서 500bp 이내, 예를 들어, 시작 코돈에서 처음 500bp 하류) 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 전사 시작 부위 바로 다음 서열, 코딩 서열의 첫 번째 엑손 내 또는 전사 시작 부위의 500bp 이내(예를 들어, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만) 또는 시작 코돈의 500 bp 이내(예를 들어, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만)를 포함하여, 관심 유전자, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 의 초기 코딩 영역에서 표적화된다.
일부 구현예에서, 표적 부위는 내인성 TRAC 유전자 좌의 엑손 내에 있다. 특정 구현예에서, 표적 부위는 내인성 TRAC 유전자 좌의 인트론 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 TRAC 유전자 좌의 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 5' 비번역 영역(UTR) 또는 3' UTR 내에 있다. 특정 측면에서, 표적 부위는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내에 있다. 특정 구현예에서, 표적 부위는 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내 엑손 내에 있다.
특정 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 관심 유전자 또는 유전자 좌, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2의 오픈 리딩 프레임에서 또는 내에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 관심 유전자 또는 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내 인트론에서 또는 인트론 내에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 관심 유전자 또는 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내 엑손 내에서 표적화된다.
특정 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 인트론에서 또는 인트론 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 엑손에서 또는 엑손 내에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 관심 유전자, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2의 엑손에서 또는 엑손 내에서 표적화된다.
특정 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 TRBC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌, 예를 들어 TRBC1 및/또는 TRBC2의 엑손 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 제1 엑손, 제2 엑손, 제3 엑손 또는 제4 엑손 내에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 제1 엑손 내에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 제1 엑손, 제2 엑손, 제3 엑손 또는 제4 엑손 내에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 엑손 1의 최대 5' 뉴클레오티드 및 엑손 1의 최대 3' 뉴클레오티드의 상류 사이에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 제1 엑손 내에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제1 엑손의 5' 말단에서 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp 또는 50 bp 하류 내에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제1 엑손의 5' 말단에서 1 bp 내지 400 bp, 50 내지 300 bp, 100 bp 내지 200 bp 또는 100 bp 내지 150 bp(각각의 수치 포함) 사이 하류에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제1 엑손의 5' 말단에서 100 bp 내지 150 bp(수치 포함) 사이 하류에 있다.
특정 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 TRBC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌, 예를 들어 TRBC1 및/또는 TRBC2의 엑손 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 제1 엑손, 제2 엑손, 제3 엑손 또는 제4 엑손 내에서이다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 제1 엑손 내에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 제1 엑손, 제2 엑손, 제3 엑손 또는 제4 엑손 내에서이다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 엑손 1의 5' 뉴클레오티드와 엑손 1의 3' 뉴클레오티드의 상류 사이에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 제1 엑손 내에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제1 엑손의 5' 말단에서 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp 또는 50 bp 하류 내에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제1 엑손의 5' 말단에서 1 bp 내지 400 bp, 50 내지 300 bp, 100 bp 내지 200 bp 또는 100 bp 내지 150 bp(각각의 수치 포함) 사이 하류에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRBC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제1 엑손의 5' 말단에서 100 bp 내지 150 bp(수치 포함) 사이 하류에 있다.
2. 유전자 파괴 방법
여기에 기재된 것을 포함하여 유전자 파괴를 생성하는 방법은 내인성 DNA의 유전자 파괴, 절단 및/또는 이중 가닥 손상(double strand break, DSB) 또는 표적 부위 또는 표적 위치에서의 닉(nick)을 유도하는 조작된 시스템과 같은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 사용을 포함할 수 있어서 NHEJ(non-homologous end joining)와 같은 오류 발생 프로세스에 의한 손상의 수선 또는 HDR을 통한 주형 수선을 이용한 수선은 표적 부위 또는 위치에서 또는 근처에서 유전자의 녹아웃 및/또는 관심 서열(예를 들어, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 외인성 핵산 서열 또는 전이 유전자)의 삽입을 초래할 수 있다. 여기에 제공된 방법에 사용하기 위한 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)가 또한 제공된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들)가 전이 유전자 서열의 상동성 지시 수선(HDR) 매개 표적화된 통합을 위해 여기에 제공된 주형 뉴클레오티드와 조합하여 사용될 수 있다(예를 들어, 여기에서 섹션 I.B에 기재됨).
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에는 게놈의 특정 부위 또는 위치, 예를 들어 표적 부위 또는 표적 위치에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산이 포함된다. 일부 측면에서, TCR을 암호화하는 내인성 유전자의 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 손상 또는 절단은 키메라 또는 융합 단백질에서와 같이 유전자 편집 뉴클레아제에 결합되거나 이와 복합체를 형성한 단백질 또는 핵산을 사용하여 달성된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에는 DNA 표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질 또는 RNA-가이드 뉴클레아제가 포함된다.
일부 구현예에서, 제제에는 RNA 가이드 뉴클레아제 또는 DNA 표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질과 같은 다양한 성분이 포함된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 엔도뉴클레아제와 같은 뉴클레아제에 융합된 하나 이상의 아연 핑거 단백질(ZFP) 또는 전사 활성화제 유사 이펙터(transcription activator-like effector, TALE)와 같은 DNA 결합 단백질을 포함하는 DNA 표적화 분자를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬 핵산(CRISPR) 결합 뉴클레아제(Cas) 시스템(Cas 및/또는 Cfp1 포함)과 같은 RNA 가이드 뉴클레아제를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 하나 이상의 표적 부위(들), 유전자 또는 이의 일부의 서열에 표적화되도록 특이적으로 설계된 DNA 결합 표적화된 뉴클레아제 및 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)와 같은 유전자 편집 뉴클레아제 및 CRISPR 결합 뉴클레아제(Cas) 시스템과 같은 RNA 가이드 뉴클레아제를 포함한 서열 특이적 또는 표적화된 뉴클레아제와 같은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제를 사용하여 수행된다. 예시적인 ZFN, TALE 및 TALEN이 예를 들어, 문헌[Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4(221): 1-7 (2013)]에 기재되어 있다.
아연 핑거 단백질(ZFP), 전사 활성화제 유사 이펙터(TALE) 및 CRISPR 시스템 결합 도메인은, 예를 들어 자연적으로 발생하는 ZFP 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작(engineered)"될 수 있다. 조작된 DNA 결합 단백질(ZFP 또는 TALE)은 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. 설계에 대한 합리적인 기준에는 기존 ZFP 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 대체 규칙 및 전산화된 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; 또한 국제 출원 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 미국 공개 번호 20110301073]을 참조한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들)는 예를 들어, 관심 유전자, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2에서 또는 근처에서 하나 이상의 표적 부위(들)를 특이적으로 표적화한다. 일부 구현예에서, 제제에는 표적 부위(들)에 특이적으로 결합, 인식 또는 혼성화하는 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9 조합물이 포함된다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas9 시스템은 특정 절단을 가이드하도록 조작된 crRNA/tracr RNA("단일 가이드 RNA(single guide RNA)")를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제에는 Argonaute 시스템(예를 들어, 'TtAgo', (Swarts et al. (2014) Nature 507(7491): 258-261)로 공지되고, T. thermophilus 유래)에 기초한 뉴클레아제가 포함된다. 여기에 기재된 임의의 뉴클레아제 시스템을 사용한 표적화된 절단이 개발되어 HDR 또는 NHEJ 매개 프로세스를 이용하여 전이 유전자 서열, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 예를 들어 내인성 TCR 유전자에서 특정 표적 위치로 삽입시킬 수 있다.
일부 구현예에서, "아연 핑거 DNA 결합 단백질(zinc finger DNA binding protein)"(또는 결합 도메인)은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화된 결합 도메인 내 아미노산 서열 영역인, 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 보다 큰 단백질 내 도메인이거나 단백질이다. 아연 핑거 DNA 결합 단백질 용어는 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP(zinc finger protein)로 축약된다. ZFP 중에 전형적으로 9-18 뉴클레오티드 길이이고, 개별 핑거의 조립에 의해 생성된, 특정 DNA 서열을 표적화하는 인공 ZFP 도메인이 있다. ZFP는 단일 핑거 도메인이 약 30 개의 아미노산 길이이며 단일 베타 턴의 두 개의 시스테인과 아연을 통해 배위된 두 개의 불변 히스티딘 잔기를 함유하고 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 핑거를 갖는 알파 나선을 함유하는 것을 포함한다. 일반적으로, ZFP의 서열 특이성은 아연 핑거 인식 나선 상의 4개의 나선 위치(-1, 2, 3 및 6)에서 아미노산 치환을 함으로써 변경될 수 있다. 따라서, 예를 들어, ZFP 또는 ZFP 함유 분자는 자연적으로 발생하지 않고, 예를 들어, 선택 표적 부위에 결합하도록 조작된다.
일부 경우에, DNA 표적화 분자는 DNA 절단 도메인에 융합된 아연 핑거 DNA 결합 도메인이거나 이를 포함하여 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 형성한다. 예를 들어, 융합 단백질은 하나 이상의 IIS 유형 제한 효소의 절단 도메인(또는 절단 하프 도메인) 및 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함하며, 이는 조작되거나 조작되지 않을 수 있다. 일부 경우에, 절단 도메인은, 일반적으로 하나의 가닥 상의 제한 부위로부터 9 뉴클레오티드 및 다른 가닥 상의 제한 부위로부터 13 뉴클레오티드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매하는, IIS 유형 제한 엔도뉴클레아제 FokI 유래이다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 978-982]을 참조한다. 일부 유전자 특이적으로 조작된 아연 핑거가 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 수 천개의 표적에 대해 특이적으로 표적화된 아연 핑거를 제공하고, 아연 핑거 작제물에 대해 CompoZr로 명명되는 플랫폼이 이용 가능하다. 예를 들어, 문헌[Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405]을 참조한다. 일부 경우에, 상업적으로 이용 가능한 아연 핑거가 사용되거나 맞춤 설계된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 내 하나 이상의 표적 부위(들)가 조작된 ZFN에 의한 유전자 파괴를 위해 표적화될 수 있다. 내인성 T 세포 수용체(TCR) 유전자를 표적화하는 예시적인 ZFN은 예를 들어, 문헌[US 2015/0164954, US 2011/0158957, US 2015/0056705, US 8956828 및 Torikawa et al. (2012) Blood 119:5697-5705]에 기재된 것(이의 개시 전체가 참조로 포함됨) 또는 서열 번호: 213-224(TRAC) 또는 서열 번호: 225 및 226(TRBC) 중 어느 하나에 제시된 것을 포함한다.
전사 활성화제 유사 이펙터(TALE)는 Xanthomonas 세균 종 유래 단백질이고, 다수의 반복 서열을 포함하며, 각각의 반복은 핵산 표적화 서열의 각 뉴클레오티드 염기에 특이적인 12 및 13 위치에서 2개의 잔기(RVD)를 포함한다. 유사한 모듈의 염기 당 염기 핵산 결합 특성을 가진 결합 도메인(MBBBD)은 상이한 세균 종으로부터 또한 유래될 수 있다. 새로운 모듈 단백질은 TAL 반복보다 더 많은 서열 가변성을 나타내는 장점이 있다. 일부 구현예에서, 상이한 뉴클레오티드 인식에 관련된 RVD는 C 인식을 위한 HD, T 인식을 위한 NG, A 인식을 위한 NI, G 또는 A 인식을 위한 NN, A, C, G 또는 T 인식을 위한 NS, T 인식을 위한 HG, T 인식을 위한 IG, G 인식을 위한 NK, C 인식을 위한 HA, C 인식을 위한 ND, C 인식을 위한 HI, G 인식을 위한 HN, G 인식을 위한 NA, G 또는 A 인식을 위한 SN 및 T 인식을 위한 YG, A 인식을 위한 TL, A 또는 G 인식을 위한 VT 및 A 인식을 위한 SW이다. 일부 구현예에서, 중요한 아미노산 12 및 13은 A, T, C 및 G 뉴클레오티드에 대한 특이성을 조절하고 특히 상기 특이성을 향상시키기 위해 다른 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다.
일부 구현예에서, "TALE DNA 결합 도메인(TALE DNA binding domain)" 또는 "TALE"은 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩티드이다. 반복 가변 2잔기(repeat variable diresidue, RVD)를 각각 포함하는 반복 도메인은 코그니트(cognate) 표적 DNA 서열에 대한 TALE의 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위(repeat unit)"("반복(repeat)"으로도 지칭)는 전형적으로 33-35 개의 아미노산 길이이며 자연적으로 발생하는 TALE 단백질 내 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. TALE 단백질은 반복 단위 내에서 정규 또는 비정규 RVD를 사용하여 표적 부위에 결합하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 8,586,526 및 9,458,205]을 참조한다.
일부 구현예에서, "TALE 뉴클레아제(TALE-nuclease)"(TALEN)은 전사 활성화제 유사 이펙터(TALE)로부터 전형적으로 유래된 핵산 결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하는 뉴클레아제 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 촉매 도메인은 예를 들어 I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-I과 같은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 도메인 또는 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, TALE 도메인은 예를 들어 I-CreI 및 I-OnuI과 같은 메가뉴클레아제 또는 이의 기능적 변이체에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, TALEN은 단량체성 TALEN이다. 단량체성 TALEN은 문헌[국제 출원 WO2012138927]에 기재된 I-TevI의 촉매 도메인과 조작된 TAL 반복의 융합과 같이 특이적 인식 및 절단을 위해 2량체화가 필요없는 TALEN이다. TALEN은 유전자 표적화 및 유전자 변형을 위해 설명되었고 사용되었다(예를 들어, 문헌[Boch et al. (2009) Science 326(5959): 1509-12.; Moscou and Bogdanove (2009) Science 326(5959): 1501; Christian et al. (2010) Genetics 186(2): 757-61; Li et al. (2011) Nucleic Acids Res 39(1): 359-72] 참조).
일부 구현예에서, TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자가 조작된 TALEN에 의한 유전자 파괴를 위해 표적화될 수 있다. 내인성 T 세포 수용체(TCR) 유전자를 표적화하는 예시적인 TALEN에는, 예를 들어 문헌[국제 출원 WO 2017/070429, WO 2015/136001, 미국 출원 US20170016025 및 US20150203817]에 기재된 것(이의 개시 전체가 참조로 포함됨)이 포함된다.
일부 구현예에서, "TtAgo"는 유전자 침묵에 관여하는 것으로 생각되는 원핵 생물 아르고누테(Argonaute) 단백질이다. TtAgo는 Thermus thermophilus 세균으로부터 유래된다. 예를 들어, 문헌[Swarts et al(2014) Nature 507(7491): 258-261; G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652]을 참조한다. "TtAgo 시스템(TtAgo system)"은 예를 들어, TtAgo 효소에 의해 절단하기 위한 가이드 DNA를 포함하여 필요한 모든 성분이다.
일부 구현예에서, 조작된 아연 핑거 단백질, TALE 단백질 또는 CRISPR/Cas 시스템은 자연에서 발견되지 않으며 이의 생산은 파지 디스플레이, 상호 작용 트랩 또는 하이브리드 선택과 같은 경험적 공정으로부터 주로 발생한다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 5,789,538; 미국 특허 번호 5,925,523; 미국 특허 번호 6,007,988; 미국 특허 번호 6,013,453; 미국 특허 번호 6,200,759; 국제 출원 WO 95/19431; 국제 출원 WO 96/06166; 국제 출원 WO 98/53057; 국제 출원 WO 98/54311; 국제 출원 WO 00/27878; 국제 출원 WO 01/60970; 국제 출원 WO 01/88197 및 국제 출원 WO 02/099084]을 참조한다.
아연 핑거 및 TALE DNA 결합 도메인은, 예를 들어 자연적으로 발생하는 아연 핑거 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 또는 DNA 결합에 관여하는(반복 가변 2잔기 또는 RVD 영역) 아미노산의 조작에 의해 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 조작된 아연 핑거 단백질 또는 TALE 단백질은 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. 아연 핑거 단백질 및 TALE 조작을 위한 비제한적인 방법의 예는 설계 및 선택이다. 설계된 단백질은 이의 설계/구성이 주로 합리적인 기준에서 발생하는 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계에 대한 합리적인 기준에는 기존 ZFP 또는 TALE 설계(정규 및 비정규 RVD) 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 대체 규칙 및 전산화된 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 9,458,205; 8,586,526; 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; 또한 국제 출원 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496]을 참조한다.
게놈 DNA의 표적화된 절단을 위한 다양한 방법 및 조성물이 기재되었다. 상기 표적화된 절단 이벤트는, 예를 들어 표적화된 돌연변이 유발을 유도하고, 세포 DNA 서열의 표적화된 결실을 유도하고, 미리 결정된 염색체 유전자 좌에서 표적화된 재조합을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 9,255,250; 9,200,266; 9,045,763; 9,005,973; 9,150,847; 8,956,828; 8,945,868; 8,703,489; 8,586,526; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,067,317; 7,262,054; 7,888,121; 7,972,854; 7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861; 미국 특허 공개 번호 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983; 20130196373; 20140120622; 20150056705; 20150335708; 20160030477 및 20160024474]을 참조한다(이의 개시 전체가 참조로 삽입됨). 유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제가 또한 제공된다. 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들) 중 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 핵산 분자)가 또한 제공된다.
a. Crispr/Cas9
일부 구현예에서, 인간의 경우 TRAC 및 TRBC1 또는 TRBC2와 같은 TCR을 암호화하는 내인성 유전자의 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 손상은 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬 반복(CRISPR) 및 CRISPR 결합(Cas) 단백질을 사용하여 수행된다. 문헌[Sander and Joung, (2014) Nature Biotechnology, 32(4): 347-355]을 참조한다.
일반적으로, "CRISPR 시스템(CRISPR system)"은 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr(트랜스 활성화(trans-activating) CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 부분 활성 tracrRNA), tracr-메이트 서열("동향 반복(direct repeat)" 및 내인성 CRISPR 시스템의 상황에서 tracrRNA 프로세싱된 부분 동향 반복을 포괄), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템 상황에서 "스페이서(spacer)"로도 지칭) 및/또는 CRISPR 유전자 좌의 다른 서열 및 전사물을 포함하여, CRISPR 결합("Cas") 유전자의 발현 또는 이의 활성을 지시하는데 관여하는 전사물 및 다른 요소를 총괄하여 지칭한다.
일부 측면에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 DNA에 서열 특이적으로 결합하는 비코딩 가이드 RNA(gRNA) 및 뉴클레아제 기능을 갖는 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)을 포함한다.
1) 가이드 RNA(gRNA)
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들)는, TRAC 유전자의 표적 부위와 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA); TRBC1 및 TRBC2 유전자 중 하나 또는 둘 다의 표적 부위와 상보적인 표적화 도메인을 갖는 gRNA; 또는 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 핵산; 중 하나 이상을 포함한다.
일부 측면에서,"gRNA 분자(gRNA molecule)"는 세포의 게놈 DNA 상의 유전자 좌와 같은 표적 핵산에 대해 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 특이적 표적화 또는 귀소를 촉진하는 핵산에 관한 것이다. gRNA 분자는 단분자(단일 RNA 분자를 가짐)일 수 있고, 때로는 여기에서 "키메라(chimeric)" gRNA 또는 모듈식(하나 이상 및 전형적으로 두 개의, 분리된 RNA 분자를 포함)으로 지칭될 수 있다. 일반적으로, 가이드 서열, 예를 들어 가이드 RNA는 인간에서 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자와 같은 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 표적 부위의 표적 서열과 혼성화하고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시하기에 충분한 상보성을 갖는 적어도 서열 일부를 포함하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, CRISPR 복합체 형성의 정황에서, "표적 서열(target sequence)"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서 표적 서열과 가이드 RNA의 도메인, 예를 들어 표적화 도메인 사이의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 일반적으로 가이드 서열 내에서 2 차 구조의 정도가 감소되도록 가이드 서열이 선택된다. 2 차 구조는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 표적 유전자 좌(예를 들어, 인간에서 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌에서)에 특이적인 가이드 RNA(gRNA)가 RNA 가이드 뉴클레아제, 예를 들어 Cas에 대해 사용되어 표적 부위 또는 표적 위치에서 DNA 파손을 유도한다. gRNA 및 예시적인 표적화 도메인을 설계하는 방법은 예를 들어, 문헌[PCT 국제 출원 공개 번호 WO2015/161276, WO2017/193107 및 WO2017/093969, 미국 출원 US2016/272999 및 US2015/056705]에 기재된 것들을 포함할 수 있다.
그 위에 표시된 도메인과 함께 몇몇 예시적인 gRNA 구조가 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A-1G]에 기재되어 있다. gRNA 활성 형태의 3차원 구조 또는 가닥 내 또는 가닥 간 상호 작용에 관하여 이론에 구속되길 바라지 않으면서, 높은 상보성 영역은 때로 국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A-1G 및 여기 제공된 다른 도면에서 이중 영역(duplexes)으로 표시된다.
일부 경우에, gRNA는 5'에서 3' 방향으로, TRAC 유전자 좌로부터의 서열(서열 번호: 1에 제시된 인간 TRAC 유전자 유전자 좌의 예시적인 뉴클레오티드 서열; NCBI 참조 서열: NG_001332.3, TRAC; 여기 표 1에 기재된 예시적인 게놈 서열) 내에서와 같은 표적 부위 또는 위치를 표적화하는 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인(제1 상보성 도메인에 상보적임); 근위 도메인; 및 선택적으로 꼬리 도메인;을 포함하는 단분자 또는 키메라 gRNA이다. 일부 경우에, gRNA는 5'에서 3' 방향으로, TRBC1 또는 TRBC2 유전자 좌로부터의 서열(서열 번호: 2에 제시된 인간 TRBC1 유전자 유전자 좌의 예시적인 뉴클레오티드 서열; NCBI 참조 서열: NG_001332.2, TRBC1; 여기 표 2에 기재된 예시적인 게놈 서열; 서열 번호: 3에 제시된 인간 TRBC2 유전자 유전자 좌의 예시적인 뉴클레오티드 서열; NCBI 참조 서열: NG_001332.2, TRBC2; 여기 표 3에 기재된 예시적인 게놈 서열) 내에서와 같은 표적 부위 또는 위치를 표적화하는 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인(제1 상보성 도메인에 상보적임); 근위 도메인; 및 선택적으로 꼬리 도메인;을 포함하는 단분자 또는 키메라 gRNA이다.
다른 경우에, gRNA는 제1 및 제2 가닥을 포함하는 모듈식 gRNA이다. 상기 경우에, 제1 가닥은 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로, 표적화 도메인(TRAC 유전자 좌(서열 번호: 1에 제시된 인간 TRAC 유전자 유전자 좌의 예시적인 뉴클레오티드 서열; NCBI 참조 서열: NG_001332.3, TRAC; 여기 표 1에 기재된 예시적인 게놈 서열) 또는 TRBC1 또는 TRBC2 유전자 좌(서열 번호: 2에 제시된 인간 TRBC1 유전자 유전자 좌의 예시적인 뉴클레오티드 서열; NCBI 참조 서열: NG_001333.2, TRBC11; 여기 표 2에 기재된 예시적인 게놈 서열; 서열 번호: 3에 제시된 인간 TRBC2 유전자 유전자 좌의 예시적인 뉴클레오티드 서열; NCBI 참조 서열: NG_001333.2, TRBC2)로부터의 서열 내에서와 같은 표적 부위 또는 위치를 표적화함); 및 제1 상보성 도메인;을 포함한다. 제2 가닥은 일반적으로 5'에서 3' 방향으로, 선택적으로 5' 연장 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 선택적으로 꼬리 도메인;을 포함한다.
A) 표적화 도메인
표적화 도메인의 배치의 예는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어 그 안의 도 1A-1G]에 기재된 것들을 포함한다. 표적화 도메인은 표적 핵산 상의 표적 서열에 대해 상보적, 예를 들어 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 상보적, 예를 들어 완전히 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 표적 서열을 포함하는 표적 핵산의 가닥은 여기에서 표적 핵산의 "상보적 가닥"으로 지칭된다. 표적화 도메인 선택에 대한 지침은, 예를 들어, 문헌[Fu Y et al., Nat Biotechnol 2014 (doi: 10.1038/nbt.2808) 및 Sternberg SH et al., Nature 2014 (doi: 10.1038/nature13011)]에서 찾을 수 있다.
표적화 도메인은 RNA 분자의 일부이며, 따라서 우라실 염기(U)을 포함하게 되는 반면, gRNA 분자를 암호화하는 임의의 DNA는 티민 염기(T)을 포함할 것이다. 이론에 구속되길 바라지 않으면서, 일부 구현예에서, 표적 서열을 가진 표적화 도메인의 상보성은 표적 핵산을 가진 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 상호작용의 특이성에 기여하는 것으로 여겨진다. 표적화 도메인 및 표적 서열 쌍에서, 표적화 도메인의 우라실 염기는 표적 서열의 아데닌 염기와 쌍을 이룰 것임이 이해된다. 일부 구현예에서, 표적 도메인 자체는 5'에서 3' 방향으로, 선택적인 제2 도메인 및 코어 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 코어 도메인은 표적 서열과 완전히 상보적이다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 5 내지 50개의 뉴클레오티드 길이이다. 표적화 도메인이 상보적인 표적 핵산의 가닥은 여기에서 상보적 가닥으로 지칭된다. 도메인의 전부 또는 일부 뉴클레오티드는, 예를 들어, 분해에 덜 취약하게 되고 생체 적합성을 개선시키는 등의 변경을 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 표적 도메인의 백본(backbone)은 포스포로티오에이트로 변경되거나 다른 변경(들)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 표적화 도메인의 뉴클레오티드는 2' 변경, 예를 들어, 2-아세틸화, 예를 들어, 2' 메틸화 또는 기타 변경(들)을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 표적화 도메인은 16-26 개의 뉴클레오티드 길이(즉, 16 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 17 개의 뉴클레오티드 길이 또는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 뉴클레오티드 길이)이다.
B) 예시적인 표적화 도메인
인간 TRAC, TRBC1 또는 TRBC2의 유전자 파괴를 표적화하기 위한 gRNA 내에 함유된 예시적인 표적화 도메인은, 예를 들어, 문헌[국제 출원 WO2015/161276, WO2017/193107, WO2017/093969, 미국 출원 US2016/272999 및 US2015/056705]에 기재된 것들 또는 상기에 기재된 표적화 서열에 결합할 수 있는 표적화 도메인을 포함한다. S. pyogenes 또는 S. aureus Cas9을 이용하여 인간 TRAC 유전자 좌의 유전자 파괴를 표적화하기 위한 gRNA 내에 함유된 예시적인 표적화 도메인은 표 4에 제시된 것들 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
[표 4]
S. pyogenes 또는 S. aureus Cas9를 이용하여 인간 TRBC1 또는 TRBC2 유전자 좌의 유전자 파괴를 표적화하기 위한 gRNA 내에 함유된 예시적인 표적화 도메인은 표 5에 제시된 것들 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
[표 5]
일부 구현예에서, TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2를 표적화하기 위한 gRNA는 여기에 기재되거나, 예를 들어, 다른 곳 문헌[국제 출원 WO2015/161276, WO2017/193107, WO2017/093969, 미국 출원 US2016/272999 및 US2015/056705]에 기재된 어느 하나 또는 상기에 기재된 표적화 서열에 결합할 수 있는 표적화 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자의 유전자 좌에서 CRISPR/Cas9 gRNA에 의해 표적화된 서열은 GAGAATCAAAATCGGTGAAT(서열 번호:163) 또는 ATTCACCGATTTTGATTCTC(서열 번호:117)과 같은 서열 번호: 117, 163 및 165-211 중 어느 하나에 제시된다. 일부 구현예에서, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자의 유전자 좌에서 CRISPR/Cas9 gRNA에 의해 표적화된 서열은 GGCCTCGGCGCTGACGATCT(서열 번호:164) 또는 GATCGTCAGCGCCGAGGCC(서열 번호:118)과 같은 서열 번호: 118, 164 및 212에 제시된다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자의 유전자 좌에서 표적 부위를 표적화하기 위한 gRNA 표적화 도메인 서열은 GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU(서열 번호:31)이다. 일부 구현예에서, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자의 유전자 좌에서 표적 부위를 표적화하기 위한 gRNA 표적화 도메인 서열은 GGCCUCGGCGCUGACGAUCU(서열 번호: 63)이다.
일부 구현예에서, TRAC 유전자의 유전자 좌를 표적화하기 위한 gRNA는 AGCGCTCTCGTACAGAGTTGGCATTATAATACGACTCACTATAGGG GAGAATCAAAATCGGTGAAT GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(서열 번호: 26에 제시; 굵고 밑줄친 부분은 TRAC 유전자 좌의 표적 부위에 상보적) 서열의 시험관 내 전사에 의해 수득되거나 화학적으로 합성될 수 있고, 여기서 상기 gRNA는 5'- GAG AAU CAA AAU CGG UGA AU G UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGU UAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UGC UUU U -3'(서열 번호: 27에 제시; 문헌[Osborn et al., Mol Ther. 24(3):570-581 (2016)] 참조) 서열을 갖는다. TCR 도메인 또는 영역, 예를 들어, TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2를 암호화하는 내인성 유전자의 유전자 파괴를 생성하기 위한 다른 예시적인 gRNA 서열은, 예를 들어 문헌[PCT 국제 출원 공개 번호 WO2015/161276]에 기재되어 있다. 내인성 TCR 유전자 좌의 유전자 편집을 위한 예시적인 방법에는, 예를 들어 문헌[미국 출원 공개 번호 US2011/0158957, US2014/0301990, US2015/0098954,US2016/0208243; US2016/272999 및 US2015/056705; PCT 국제 출원 공개 번호 WO2014/191128, WO2015/136001, WO2015/161276, WO2016/069283, WO2016/016341; 및 Osborn et al. (2016) Mol. Ther. 24(3):570-581]에 기재된 것들이 포함된다. TCR 도메인 또는 영역을 암호화하는 내인성 유전자의 유전자 파괴를 생성하기 위해 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있고 여기에 제공된 구현예에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인에는 S. pyogenes Cas9 또는 N. meningitidis Cas9를 사용하여 TRAC, TRBC1 및 /또는 TRBC2 유전자 좌에서 유전자 파괴를 도입하기 위한 것들이 포함된다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인에는 S. pyogenes Cas9를 사용하여 TRAC, TRBC1 및 /또는 TRBC2 유전자 좌에서 유전자 파괴를 도입하기 위한 것들이 포함된다. 임의의 표적화 도메인이 이중 가닥 파손(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일 가닥 파손(Cas9 닉카제)을 생성하는 S. pyogenes Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 이중 표적화가 사용되어 맞은편 DNA 가닥에 상보적인 2개의 표적화 도메인을 갖는 S. pyogenes Cas9 닉카제를 사용함으로써 맞은편 DNA 가닥 상에 2개의 닉을 형성한다(예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 쌍을 이룰 수 있다). 일부 구현예에서, 2개의 gRNA는 PAM이 바깥쪽으로 향하고 gRNA의 5' 말단 사이의 거리가 0-50bp이도록 DNA 상에 배향된다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA가, 예를 들어, 표적 도메인의 맞은편 가닥 상에 2개의 단일 가닥 파손을 가진 표적 도메인을 절단하기 위하여 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드된 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 쌍을 사용하여 2개의 Cas9 뉴클레아제 또는 2개의 Cas9 닉카제를 표적화하도록 사용된다. 일부 구현예에서, 2개의 Cas9 닉카제는 HNH 활성을 갖는 분자, 예를 들어, 비활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 D10, 예를 들어, D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자, RuvC 활성을 갖는 분자, 예를 들어 비활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 H840, 예를 들어 H840A에서 돌연변이를 갖는 Cas9 분자 또는 RuvC 활성을 갖는 분자, 예를 들어, 비활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, N863, 예를 들어, N863A에서 돌연변이를 갖는 Cas9 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA 각각은 D10A Cas9 닉카제와 복합체를 이룬다.
일부 구현예에서, 표적 서열(표적 도메인)은 여기 서열 번호: 1-3에 제시되거나 표 1-3에 기재된 TRAC, TRBC1 및/또는TRBC2 코딩 서열 중 임의의 부분과 같은 TRAC, TRBC1 및/또는TRBC2 유전자 좌 또는 이의 근처이다. 일부 구현예에서, 표적 도메인에 상보적인 표적 핵산은 TRAC, TRBC1 및/또는TRBC2와 같은 관심 유전자의 초기 코딩 영역에 위치한다. 초기 코딩 영역의 표적화는 관심 유전자의 유전자 파괴(즉, 발현 제거)에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 유전자의 초기 코딩 영역은 시작 코돈(예를 들어, ATG) 직후의 서열 또는 시작 코돈의 500bp 이내(예를 들어, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 bp, 40bp, 30bp, 20bp, 또는 10bp 미만)의 서열을 포함한다. 특정 예에서, 표적 핵산은 시작 코돈의 200bp, 150bp, 100bp, 50bp, 40bp, 30bp, 20bp 또는 10bp 이내에 있다. 일부 예에서, gRNA의 표적화 도메인은 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌에 있는 표적 핵산과 같은 표적 핵산 상의 표적 서열에 대해 상보적, 예를 들어 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 상보적, 예를 들어 완전히 상보적이다.
일부 측면에서, gRNA는 내인성 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 내 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 인트론 내 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌의 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터 내 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA에 의해 표적화되는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌의 표적 부위는 여기, 예를 들어 섹션 I.A.1.에 기재된 임의의 표적 부위일 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 엑손 1, 2 또는 3 내, 엑손 1, 2 또는 3의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 이내 또는 전사 시작 부위 직후 서열을 포함하거나, 내인성 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 초기 코딩 영역, 예를 들어 엑손 1, 2 또는 3에 해당하는 엑손 내 또는 이에 근접한 부위를 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 엑손 2의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만 내 또는 내인성 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌의 엑손 2 부위 또는 이의 근처를 표적화할 수 있다.
C) 제1 상보성 도메인
제1 상보성 도메인의 예에는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어 그 안의 도 1A-1G]에 기재된 것들이 포함된다. 제1 상보성 도메인은 여기에 기재된 제2 상보성 도메인과 상보적이며, 일반적으로 제2 상보성 도메인과 충분한 상보성을 가지고 있어서 적어도 일부 생리적 조건 하에서 이중 영역(duplexed region)을 형성한다. 제1 상보성 도메인은 전형적으로 5 내지 30 개의 뉴클레오티드 길이이고, 5 내지 25 개의 뉴클레오티드 길이, 7 내지 25 개의 뉴클레오티드 길이, 7 내지 22 개의 뉴클레오티드 길이, 7 내지 18 개의 뉴클레오티드 길이 또는 7 내지 15 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 다양한 구현예에서, 제1 상보성 도메인은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 개의 뉴클레오티드 길이이다.
전형적으로, 제1 상보성 도메인은 제2 상보성 도메인 표적과 정확한 상보성을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인은 제2 상보성 도메인의 해당 뉴클레오티드와 상보적이지 않은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 상보성 도메인의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6(예를 들어, 3)개의 뉴클레오티드 세그먼트는 이중 영역에서 쌍을 이루지 못할 수 있으며, 비-이중 영역 또는 루프 아웃 영역을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 쌍을 이루지 못한 또는 루프 아웃 영역, 예를 들어, 3개의 뉴클레오티드의 루프 아웃이 제2 상보성 도메인에 존재한다. 상기 쌍을 이루지 못한 영역은 선택적으로 제 2 상보성 도메인의 5' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5 또는 6, 예를 들어, 4번째 뉴클레오티드에서 시작한다.
제1 상보성 도메인에는 5'에서 3' 방향으로 5' 하위 도메인, 중앙 하위 도메인 및 3' 하위 도메인인 3개의 하위 도메인이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 하위 도메인은 4 내지 9, 예를 들어 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 중앙 하위 도메인은 1, 2 또는 3, 예를 들어, 1개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 3' 하위 도메인은 3 내지 25, 예를 들어, 4-22, 4-18 또는 4 내지 10 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 이중 영역인 경우, 제1 및 제2 상보성 도메인은, 예를 들어, gRNA 서열에서 11 쌍의 뉴클레오티드를 포함한다(쌍을 이룬 가닥에서 하나는 밑줄, 하나는 굵게 표시): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열 번호:144).
일부 구현예에서, 이중 영역인 경우, 제1 및 제2 상보성 도메인은, 예를 들어, gRNA 서열에서 15 쌍의 뉴클레오티드를 포함한다(쌍을 이룬 가닥에서 하나는 밑줄, 하나는 굵게 표시): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열 번호:145).
일부 구현예에서, 이중 영역인 경우, 제1 및 제2 상보성 도메인은, 예를 들어, gRNA 서열에서 16 쌍의 뉴클레오티드를 포함한다(쌍을 이룬 가닥에서 하나는 밑줄, 하나는 굵게 표시): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열 번호:146).
일부 구현예에서, 이중 영역인 경우, 제1 및 제2 상보성 도메인은, 예를 들어, gRNA 서열에서 21 쌍의 뉴클레오티드를 포함한다(쌍을 이룬 가닥에서 하나는 밑줄, 하나는 굵게 표시): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열 번호:147).
일부 구현예에서, 뉴클레오티드가 예를 들어, gRNA 서열에서 폴리-U 트랙을 제거하도록 교환된다(교환된 뉴클레오티드 밑줄): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUAUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAUAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열 번호:148); NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열 번호:149); 및 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUAUUAGAGCUAUGCUGUAUUGGAAACAAUACAGCAUAGCAAGUUAAUAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열 번호:150).
제1 상보성 도메인은 자연적으로 발생하는 제1 상보성 도메인과 상동성을 공유하거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 여기 개시된 제1 상보성 도메인, 예를 들어 S. pyogenes, S. aureus, N. meningtidis 또는 S. thermophilus 제1 상보성 도메인과 50% 이상의 상동성을 갖는다.
제1 상동성 도메인의 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 심지어 모든 뉴클레오티드가 표적화 도메인에 대해 여기에서 논의된 방침에 따라 변형될 수 있다는 점에 유의해야 한다.
D) 연결 도메인
연결 도메인의 예에는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어 그 안의 도 1A-1G]에 기재된 것들이 포함된다. 단분자 또는 키메라 gRNA에서, 연결 도메인은 단분자 gRNA의 제2 상보성 도메인과 제1 상보성 도메인을 연결하는 역할을 한다. 연결 도메인은 제1 및 제2 상보성 도메인을 공유 또는 비공유적으로 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 연결은 공유적이다. 일부 구현예에서, 연결 도메인은 제1 및 제2 상보성 도메인을 공유적으로 연결하고, 예를 들어, 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1B-1E]을 참조한다. 일부 구현예에서, 연결 도메인은 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인 사이에 개재된 공유 결합이거나 이를 포함한다. 전형적으로 연결 도메인은 하나 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오티드를 포함하나, 다양한 구현예에서 링커는 20, 30, 40, 50 또는 심지어 100 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
모듈식 gRNA 분자에서, 2개의 분자는 상보성 도메인의 혼성화를 통해 연결되고 연결 도메인은 존재하지 않을 수 있다. 예를 들어, 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어 그 안의 도 1A]을 참조한다.
다양한 연결 도메인이 단분자 gRNA 분자에서 사용하기에 적합하다. 연결 도메인은 공유 결합으로 구성될 수 있거나, 1 또는 몇 개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드 길이만큼 짧을 수 있다. 일부 구현예에서, 연결 도메인은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 연결 도메인은 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 20, 2 내지 10 또는 2 내지 5 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 연결 도메인은 자연적으로 발생하는 서열, 예를 들어 제2 상보성 도메인에 대해 5'인 tracrRNA 서열과 상동성을 공유하거나 이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 연결 도메인은 여기에 개시된 연결 도메인과 50% 이상의 상동성을 갖는다.
제1 상보성 도메인과 관련하여 여기에 논의된 바와 같이, 연결 도메인의 전부 또는 일부 뉴클레오티드는 변경을 포함할 수 있다.
E) 5' 연장 도메인
일부 경우에, 모듈식 gRNA는 여기에서 5' 연장 도메인으로 지칭되는 제2 상보성 도메인에 대해 5' 추가 서열을 포함할 수 있다(국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A). 일부 구현예에서, 5' 연장 도메인은 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5 또는 2-4 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 5' 연장 도메인은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이상의 뉴클레오티드 길이이다.
F) 제2 상보성 도메인
제2 상보성 도메인의 예에는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어 그 안의 도 1A-1G]에 기재된 것들이 포함된다. 제2 상보성 도메인은 제1 상보성 도메인과 상보적이며, 일반적으로 제2 상보성 도메인과 충분한 상보성을 가지고 있어서 적어도 일부 생리학적 조건 하에서 이중 영역을 형성한다. 일부 경우에, 예를 들어, 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A-1B]에 나타낸 바와 같이, 제2 상보성 도메인은 제1 상보성 도메인과 상보성이 결여된 서열, 예를 들어, 이중 영역으로부터 루프 아웃된 서열을 포함할 수 있다.
제2 상보성 도메인은 5 내지 27 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 일부 경우에 제1 상보성 영역보다 더 길 수 있다. 예를 들어, 제2 상보성 도메인은 7 내지 27 개의 뉴클레오티드 길이, 7 내지 25 개의 뉴클레오티드 길이, 7 내지 20 개의 뉴클레오티드 길이 또는 7 내지 17 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 보다 일반적으로, 상보성 도메인은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 상보성 도메인에는 5'에서 3' 방향으로 5' 하위 도메인, 중앙 하위 도메인 및 3' 하위 도메인인 3개의 하위 도메인이 포함된다. 일부 구현예에서, 5' 하위 도메인은 3 내지 25, 예를 들어, 4 내지 22, 4 내지 18 또는 4 내지 10 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 중앙 하위 도메인은 1, 2, 3, 4 또는 5, 예를 들어, 3 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 3' 하위 도메인은 4 내지 9, 예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인의 5' 하위 도메인 및 3' 하위 도메인은 각각 제2 상보성 도메인의 3' 하위 도메인 및 5' 하위 도메인과 상보적, 예를 들어 완전히 상보적이다.
제2 상보성 도메인은 자연적으로 발생하는 제2 상보성 도메인과 상동성을 공유하거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 여기 개시된 제2 상보성 도메인, 예를 들어 S. pyogenes, S. aureus, N. meningtidis 또는 S. thermophilus 제1 상보성 도메인과 50% 이상의 상동성을 갖는다.
제2 상보성 도메인의 전부 또는 일부 뉴클레오티드는 변경, 예를 들어 여기에 기재된 변경을 가질 수 있다.
G) 근위 도메인
근위 도메인의 예에는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어 그 안의 도 1A-1G]에 기재된 것들이 포함된다. 일부 구현예에서, 근위 도메인은 5 내지 20 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 근위 도메인은 자연적으로 발생하는 근위 도메인과 상동성을 공유하거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 여기 개시된 근위 도메인, 예를 들어 S. pyogenes, S. aureus, N. meningtidis 또는 S. thermophilus 근위 도메인과 50% 이상의 상동성을 갖는다.
근위 도메인의 전부 또는 일부 뉴클레오티드는 여기 기재된 방침에 따라 변경을 가질 수 있다.
H) 꼬리 도메인
꼬리 도메인의 예에는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어 그 안의 도 1A-1G]에 기재된 것들이 포함된다. 국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A 및 도 1B-1F에서 꼬리 도메인의 조사에 의해 알 수 있는 바와 같이, 광범위한 꼬리 도메인이 gRNA 분자에 사용하기에 적합하다. 다양한 구현예에서, 꼬리 도메인은 0(부재), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 구현예에서, 꼬리 도메인 뉴클레오티드는 자연 발생 꼬리 도메인의 5' 말단으로부터 유래하거나 이와 상동성을 공유한다(예를 들어, 국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1D 또는 1E 참조). 꼬리 도메인은 또한 선택적으로 서로 상보적이고, 적어도 일부 생리적 조건하에서 이중 영역을 형성하는 서열을 포함한다.
꼬리 도메인은 자연적으로 발생하는 근위 꼬리 도메인과 상동성을 공유하거나 이로부터 유래될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 개시의 다양한 구현예에 따라 주어진 꼬리 도메인은 여기에 개시된 자연적으로 발생하는 꼬리 도메인, 예를 들어 S. Pyogenes, S. aureus, N. meningtidis 또는 S. thermophilus 꼬리 도메인과 함께 50% 이상의 상동성을 공유할 수 있다.
특정 경우에, 꼬리 도메인은 시험관 내 또는 생체 내 전사의 방법과 관련된 3' 말단에 뉴클레오티드를 포함한다. T7 프로모터가 gRNA의 시험관 내 전사에 사용될 경우, 상기 뉴클레오티드는 DNA 주형의 3' 말단 앞에 존재하는 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. U6 프로모터가 생체 내 전사에 사용될 경우, 상기 뉴클레오티드는 UUUUUU 서열일 수 있다. 대안적인 pol-III 프로모터가 사용될 경우, 상기 뉴클레오티드는 다양한 숫자 또는 우라실 염기일 수 있거나 대안적인 염기를 포함할 수 있다.
비제한적인 예로서, 다양한 구현예에서, 근위 및 꼬리 도메인은 함께 AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(서열 번호:151), AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGGUGC(서열 번호:152), AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCGGAUC(서열 번호:153), AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG(서열 번호:154), AAGGCUAGUCCGUUAUCA(서열 번호:155) 또는 AAGGCUAGUCCG(서열 번호:156) 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 꼬리 도메인은 예를 들어, U6 프로모터가 전사에 사용될 경우, 3' 서열 UUUUUU를 포함한다. 일부 구현예에서, 꼬리 도메인은 예를 들어, H1 프로모터가 전사에 사용될 경우, 3' 서열 UUUU를 포함한다. 일부 구현예에서, 꼬리 도메인은 예를 들어, 사용되는 pol-III 프로모터의 종결 신호에 따라 다양한 수의 3' U를 포함한다. 일부 구현예에서, 꼬리 도메인은 T7 프로모터가 사용될 경우, DNA 주형으로부터 유래된 가변적인 3' 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 꼬리 도메인은, 예를 들어, RNA 분자를 생성하기 위해 시험관 내 전사가 사용될 경우, DNA 주형으로부터 유래된 가변적인 3' 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 꼬리 도메인은, 예를 들어, pol-II 프로모터가 전사를 구동하기 위해 사용될 경우, DNA 주형으로부터 유래된 가변적인 3' 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, gRNA는 5' [표적화 도메인]-[제1 상보성 도메인]-[연결 도메인]-[제2 상보성 도메인]-[근위 도메인]-[꼬리 도메인]-3' 구조를 갖고, 여기에서 표적화 도메인은 코어 도메인 및 선택적으로 제2 도메인을 포함하고 10 내지 50 개의 뉴클레오티드 길이이며; 제1 상보성 도메인은 5 내지 25 개의 뉴클레오티드 길이이고, 일부 구현예에서 여기 개시된 참조 제1 상보성 도메인과 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상의 상동성을 가지며; 연결 도메인은 1 내지 5 개의 뉴클레오티드 길이이며; 근위 도메인은 5 내지 20 개의 뉴클레오티드 길이이고, 일부 구현예에서 여기 개시된 참조 근위 도메인과 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상의 상동성을 가지며; 꼬리 도메인은 부재하거나 뉴클레오티드 서열은 1 내지 50 개의 뉴클레오티드 길이이고, 일부 구현예에서 여기 개시된 참조 꼬리 도메인과 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상의 상동성을 가진다.
I) 예시적인 키메라 gRNA
일부 구현예에서, 단분자 또는 키메라 gRNA는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적화 도메인(표적 핵산에 대해 상보적); 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인(제1 상보성 도메인에 대해 상보적); 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하고, 여기에서 (a) 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 또는 53 개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; (b) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오티드에 대해 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 또는 53 개 이상의 3' 뉴클레오티드가 존재하거나; 또는 (c) 제1 상보성 도메인의 해당 뉴클레오티드에 대해 상보적인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오티드에 대해 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 또는 54 개 이상의 3' 뉴클레오티드가 존재한다.
일부 구현예에서, (a), (b) 또는 (c)로부터의 서열은 자연적으로 발생하는 gRNA의 해당 서열 또는 여기 기재된 gRNA와 60, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 이상의 상동성을 갖는다. 일부 구현예에서, 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 또는 53 개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오티드에 대해 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 또는 53 개 이상의 3' 뉴클레오티드가 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인의 해당 뉴클레오티드에 대해 상보적인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오티드에 대해 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 또는 54 개 이상의 3' 뉴클레오티드가 존재한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인(예를 들어, 표적화 도메인이 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 뉴클레오티드 길이임)과 상보성을 갖는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 뉴클레오티드(예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 연속적인 뉴클레오티드)를 포함하거나 이를 갖거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 단분자 또는 키메라 gRNA 분자(표적화 도메인, 제1 상보성 도메인, 연결 도메인, 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함)는 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU(서열 번호:157) 서열을 포함하고, 여기에서 표적화 도메인은 20 N으로 표시되되 임의의 서열일 수 있고 16 내지 26 개의 뉴클레오티드 길이 범위일수 있으며, gRNA 서열은 U6 프로모터에 대한 종결 신호로 작용하나 부재하거나 보다 작은 수일 수 있는 6 U 뒤에 존재한다. 일부 구현예에서, 단분자 또는 키메라 gRNA 분자는 S. pyogenes gRNA 분자이다.
일부 구현예에서, 단분자 또는 키메라 gRNA 분자(표적화 도메인, 제1 상보성 도메인, 연결 도메인, 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함)는 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUUU(서열 번호:158) 서열을 포함하고, 여기서 표적화 도메인은 20 N으로 표시되되 임의의 서열일 수 있고 16 내지 26개의 뉴클레오티드 길이 범위일수 있으며, gRNA 서열은 U6 프로모터에 대한 종결 신호로 작용하나 부재하거나 보다 작은 수일 수 있는 6 U 뒤에 존재한다. 일부 구현예에서, 단분자 또는 키메라 gRNA 분자는 S. aureus gRNA 분자이다. 예시적인 키메라 gRNA의 서열 및 구조가 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도10A-10B]에 또한 제시된다.
J) 예시적인 모듈식 gRNA
일부 구현예에서, 모듈식 gRNA는 제1 및 제2 가닥을 포함한다. 제1 가닥은 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인을 포함한다. 제2 가닥은 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로, 선택적으로 5' 확장 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하고, 여기서 (a) 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 또는 53 개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; (b) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오티드에 대해 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 또는 53 개 이상의 3' 뉴클레오티드가 존재하거나; 또는 (c) 제1 상보성 도메인의 해당 뉴클레오티드에 대해 상보적인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오티드에 대해 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 또는 54 개 이상의 3' 뉴클레오티드가 존재한다.
일부 구현예에서, (a), (b) 또는 (c)로부터의 서열은 자연적으로 발생하는 gRNA의 해당 서열 또는 여기 기재된 gRNA와 60, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 이상의 상동성을 갖는다. 일부 구현예에서, 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 또는 53 개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오티드에 대해 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50 또는 53 개 이상의 3' 뉴클레오티드가 존재한다.
일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인의 해당 뉴클레오티드에 대해 상보적인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오티드에 대해 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51 또는 54 개 이상의 3' 뉴클레오티드가 존재한다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인(예를 들어, 표적화 도메인은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 뉴클레오티드 길이임)과 상보성을 갖는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 뉴클레오티드(예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 연속적인 뉴클레오티드)를 갖거나 이로 구성된다.
K) gRNA 설계 방법
표적화 도메인을 선택, 설계 및 유효성을 검사하는 방법을 포함하여, gRNA를 설계하는 방법이 여기에 기재되어 있다. 예시적인 표적화 도메인도 여기에 제공된다. 여기에 논의된 표적화 도메인은 여기 기재된 gRNA로 통합될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 유전자(예를 들어, 인간에서 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2)에 특이적인 가이드 RNA(gRNA)가 RNA 가이드 뉴클레아제, 예를 들어 Cas에 대해 사용되어 표적 부위 또는 표적 위치에서 DNA 파손을 유도한다. gRNA 및 예시적인 표적화 도메인을 설계하는 방법은 예를 들어, 문헌[PCT 국제 출원 공개 번호 WO2015/161276]에 기재된 것들을 포함할 수 있다. 표적화 도메인은 Cas9 뉴클레아제를 표적 부위 또는 표적 위치로 표적화하는데 사용되는 gRNA에 통합될 수 있다.
표적 서열의 선택 및 유효성 검사를 위한 방법 및 표적 외 분석이, 예를 들어, 문헌[Mali et al., 2013 Science 339(6121): 823-826; Hsu et al. Nat Biotechnol, 31(9): 827-32; Fu et al., 2014 Nat Biotechnol, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574; Heigwer et al., 2014 Nat Methods 11(2):122-3. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216; Bae et al., 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24463181; Xiao A et al., 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24389662]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 소프트웨어 툴이 사용되어 예를 들어, 게놈에 걸쳐 총 표적 외 활성을 최소화하기 위해 사용자의 표적 서열 내에서 gRNA의 선택을 최적화할 수 있다. 절단이 아닌 표적 외 활성이 있을 수 있다. 예를 들어, S. pyogenes Cas9를 사용한 각각의 가능한 gRNA 선택에 대해, 소프트웨어 툴이 최대 특정 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 잘못 짝지어진 염기 쌍을 함유하는 게놈에 걸쳐 모든 가능한 표적 외 서열(NAG 또는 NGG PAM 앞)을 확인할 수 있다. 각 표적 외 서열에서 절단 효율이 예를 들어, 실험적으로 유래된 가중치 체계를 사용하여 예측될 수 있다. 이후 각 가능한 gRNA는 이의 총 예측 표적 외 절단에 따라 순위가 매겨질 수 있고; 최상위 gRNA는 가장 큰 표적 상 및 최소한의 표적 외 절단을 가질 가능성의 것들을 나타낸다. 다른 기능, 예를 들어, gRNA 벡터 작제를 위한 자동화된 시약 설계, 표적 상 측량자 분석을 위한 프라이머 설계, 차세대 염기 서열 분석을 통한 표적 외 절단의 고처리량 검출 및 정량화를 위한 프라이머 설계도 툴에 포함될 수 있다. 후보 gRNA 분자는 여기에 기재된 바와 같은 또는 당업계에 공지된 방법으로 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, S. pyogenes, S. aureus 및 N. meningitidis Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA는 DNA 서열 검색 알고리즘, 예를 들어, 공개 툴인 cas-offinder(Bae et al. Bioinformatics. 2014; 30(10): 1473-1475)를 기반으로 한 사용자 지정 gRNA 설계 소프트웨어를 사용하여 확인된다. 사용자 지정 gRNA 설계 소프트웨어 점수는 게놈 전체 표적 외 성향을 계산한 후 안내한다. 전형적으로, 완벽한 매치에서 7개의 미스매치 범위의 매치가 17 내지 24개의 길이 범위 가이드로 간주된다. 일부 측면에서, 표적 외 부위가 계산으로 결정되면, 각 가이드에 대해 집계 점수가 계산되고 웹 인터페이스를 사용하여 표로 정리한 출력물로 요약된다. PAM 서열에 인접한 잠재적 gRNA 부위를 확인하는 것 외에도, 소프트웨어는 또한 선택된 gRNA 부위와 1, 2, 3 이상의 뉴클레오티드 차이로 상이한 모든 PAM 인접 서열을 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 각 유전자에 대한 게놈 DNA 서열은 UCSC 게놈 브라우저로부터 수득되며 서열은 공개적으로 이용 가능한 RepeatMasker 프로그램을 사용하여 반복 요소에 대해 선별될 수 있다. RepeatMasker는 반복 요소 및 복잡성이 낮은 영역에 대해 입력 DNA 서열을 검색한다. 결과는 주어진 의문의 서열에 존재하는 반복의 상세한 주석이다.
확인 후, gRNA는 표적 부위까지의 거리, 이의 직교성 및 5' G의 존재(관련된 PAM, 예를 들어, S. pyogenes의 경우 NGG PAM 및 S. aureus의 경우 NNGRR(예를 들어, NNGRRT 또는 NNGRRV) PAM 및 N. meningtidis의 경우 NNNNGATT 또는 NNNNGCTT PAM을 함유하는 인간 게놈 중 가까운 매치의 확인에 기초) 중 하나 이상에 기초하여 층으로 순위가 매겨질 수 있다. 직교성은 표적 서열에 대한 최소 수의 미스매치를 함유하는 인간 게놈의 서열 수를 지칭한다. "높은 수준의 직교성(high level of orthogonality)" 또는 "좋은 직교성(good orthogonality)"은 예를 들어, 의도된 표적 외에 인간 게놈의 동일한 서열을 갖지 않거나 또는 표적 서열에서 하나 또는 두 개의 미스매치를 함유하는 임의의 서열을 갖지도 않는 20-mer 표적화 도메인을 지칭할 수 있다. 좋은 직교성을 가진 표적화 도메인이 선택되어 표적 외 DNA 절단을 최소화한다. 상기는 비제한적인 예이며, 다양한 전략이 S. pyogenes, S. aureus 및 N. meningitidis 또는 기타 Cas9 효소와 함께 사용하기 위해 gRNA를 확인하는데 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, S. pyogenes Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA는 공개적으로 이용 가능한 웹 기반 ZiFiT 서버(Fu et al., Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 2014 Jan 26. doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574, 최초 참조를 위해 문헌[Sander et al., 2007, NAR 35:W599-605; Sander et al., 2010, NAR 38: W462-8]을 참조)를 사용하여 확인될 수 있다. PAM 서열에 인접한 잠재적 gRNA 부위를 확인하는 것 외에도, 소프트웨어는 또한 선택된 gRNA 부위와 1, 2, 3 이상의 뉴클레오티드 차이로 상이한 모든 PAM 인접 서열을 확인한다. 일부 측면에서, 각 유전자에 대한 게놈 DNA 서열은 UCSC 게놈 브라우저로부터 수득될 수 있고 서열은 공개적으로 이용 가능한 RepeatMasker 프로그램을 사용하여 반복 요소에 대해 선별될 수 있다. RepeatMasker는 반복 요소 및 복잡성이 낮은 영역에 대해 입력 DNA 서열을 검색한다. 결과는 주어진 의문의 서열에 존재하는 반복의 상세한 주석이다.
확인 후, S. pyogenes Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA는 층, 예를 들어 5 층으로 순위가 매겨질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 표적 부위까지의 거리, 이의 직교성 및 5' G의 존재(NGG PAM을 함유하는 인간 게놈 중 가까운 매치의 ZiFiT 확인에 기초)에 기초하여 선택된다. 일부 구현예에서, 17-mer 및 20-mer gRNA 둘 다가 표적을 위해 설계된다. 일부 측면에서, gRNA는 또한 단일 gRNA 뉴클레아제 절단 및 이중 gRNA 닉카제 전략 둘 다를 위해 선택된다. gRNA를 선택하는 기준 및 어떤 gRNA가 어느 전략을 위해 사용될 수 있는지에 대한 결정은 몇 가지 고려 사항에 기초하여 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 gRNA 뉴클레아제 절단 및 이중 gRNA 페어링된 "닉카제(nickase)" 전략 둘 다를 위한 gRNA가 확인된다. 이중 gRNA 페어링된 "닉카제" 전략을 위해 어떤 gRNA가 사용될 수 있는지에 대한 결정을 포함하여 gRNA를 선택하기 위한 일부 구현예에서, gRNA 쌍은 PAM이 바깥 쪽을 향하고 D10A Cas9 닉카제로의 절단이 5' 오버행을 초래하도록 DNA 상에 배향되어야 한다. 일부 측면에서, 이중 닉카제 쌍으로의 절단은 적절한 빈도로 전체 개재 서열의 결실을 초래할 것이라고 가정할 수 있다. 그러나, 이중 닉카제 쌍으로의 절단은 종종 gRNA 중 하나의 부위에서만 인델(indel) 돌연변이를 초래할 수도 있다. 후보 쌍 멤버는 하나의 gRNA 부위에서 인델 돌연변이를 단지 야기하는지 대 전체 서열을 얼마나 효율적으로 제거하는지에 대해 테스트될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 (1) 표적 위치까지의 적절한 거리, 예를 들어 시작 코돈의 코딩 서열 하류의 처음 500bp 이내, (2) 높은 수준의 직교성 및 (3) 5' G의 존재에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 층 gRNA의 선택에 대해, 5'G에 대한 요건은 제거될 수 있으나, 거리 제한이 필요하고 높은 수준의 직교성이 요구되었다. 일부 구현예에서, 제3 층 선택은 동일한 거리 제한 및 5'G에 대한 요건을 이용하나 좋은 직교성의 요건을 제거한다. 일부 구현예에서, 제4 층 선택은 동일한 거리 제한을 사용하나 좋은 직교성의 요건을 제거하고 5'G에서 시작한다. 일부 구현예에서, 제5 층 선택은 좋은 직교성 및 5'G의 요건을 제거하고, 보다 긴 서열(예를 들어, 나머지 코딩 서열, 예를 들어, 전사 표적 부위에 대한 추가 500bp 상류 또는 하류)이 스캔된다. 특정 경우에, 어떤 gRNA도 특정 층의 기준에 기초하여 확인되지 않는다.
일부 구현예에서, 단일 gRNA 뉴클레아제 절단 및 이중 gRNA 페어링된 "닉카제(nickase)" 전략을 위해 gRNA가 확인된다.
일부 측면에서, N. meningitidis 및 S. aureus Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA는 PAM 서열의 존재에 대해 게놈 DNA 서열을 스캔함으로서 수동으로 확인될 수 있다. 상기 gRNA는 2개의 층으로 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 층 gRNA의 경우, 표적화 도메인은 시작 코돈의 하류에 있는 코딩 서열의 처음 500bp 내에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 층 gRNA의 경우, 표적화 도메인은 나머지 코딩 서열(처음 500bp의 하류) 내에서 선택된다. 특정 경우에, 어떤 gRNA도 특정 층의 기준에 기초하여 확인되지 않는다.
일부 구현예에서, S. pyogenes, S. aureus 및 N. meningtidis Cas9와 함께 사용하기 위한 가이드 RNA(gRNA)를 확인하기 위한 또 다른 전략은 DNA 서열 검색 알고리즘을 이용할 수 있다. 일부 측면에서, 가이드 RNA 설계는 공개 툴인 cas-offinder(Bae et al. Bioinformatics. 2014; 30(10): 1473-1475)를 기반으로 한 사용자 지정 가이드 RNA 설계 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 상기 사용자 지정 가이드 RNA 설계 소프트웨어 점수는 게놈 전체 표적 외 성향을 계산한 후 안내한다. 전형적으로, 완벽한 매치에서 7개의 미스매치 범위의 매치가 17 내지 24개의 길이 범위 가이드로 간주된다. 표적 외 부위가 계산으로 결정되면, 각 가이드에 대해 집계 점수가 계산되고 웹 인터페이스를 사용하여 표로 정리한 출력물로 요약된다. PAM 서열에 인접한 잠재적 gRNA 부위를 확인하는 것 외에도, 소프트웨어는 또한 선택된 gRNA 부위와 1, 2, 3 이상의 뉴클레오티드 차이로 상이한 모든 PAM 인접 서열을 확인한다. 일부 구현예에서, 각 유전자에 대한 게놈 DNA 서열은 UCSC 게놈 브라우저로부터 수득되며 서열은 공개적으로 이용 가능한 RepeatMasker 프로그램을 사용하여 반복 요소에 대해 선별된다. RepeatMasker는 반복 요소 및 복잡성이 낮은 영역에 대해 입력 DNA 서열을 검색한다. 결과는 주어진 의문의 서열에 존재하는 반복의 상세한 주석이다.
일부 구현예에서, 확인 후, gRNA는 표적 부위까지의 거리 또는 이의 직교성(관련된 PAM, 예를 들어, S. pyogenes의 경우 NGG PAM 및 S. aureus의 경우 NNGRR(예를 들어, NNGRRT 또는 NNGRRV) PAM 및 N. meningtidis의 경우 NNNNGATT 또는 NNNNGCTT PAM을 함유하는 인간 게놈 중 가까운 매치의 확인에 기초)에 기초하여 층으로 순위가 매겨진다. 일부 측면에서, 좋은 직교성을 가진 표적화 도메인이 선택되어 표적 외 DNA 절단을 최소화한다.
예로서, S. pyogenes 및 N. meningtidis 표적에 대해, 17-mer 또는 20-mer gRNA가 설계될 수 있다. 또 다른 예로서, S. aureus 표적에 대해, 18-mer, 19-mer, 20-mer, 21-mer, 22-mer, 23-mer 및 24-mer gRNA가 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, 단일 gRNA 뉴클레아제 절단 및 이중 gRNA 페어링된 "닉카제(nickase)" 전략 둘 다를 위한 gRNA가 확인된다. 이중 gRNA 페어링된 "닉카제" 전략을 위해 어떤 gRNA가 사용될 수 있는지에 대한 결정을 포함하여 gRNA를 선택하기 위한 일부 구현예에서, gRNA 쌍은 PAM이 바깥 쪽을 향하고 D10A Cas9 닉카제로의 절단이 5' 오버행을 초래하도록 DNA 상에 배향되어야 한다. 일부 측면에서, 이중 닉카제 쌍으로의 절단은 적절한 빈도로 전체 개재 서열의 결실을 초래할 것이라고 가정할 수 있다. 그러나, 이중 닉카제 쌍으로의 절단은 종종 gRNA 중 하나의 부위에서만 인델(indel) 돌연변이를 초래할 수도 있다. 후보 쌍 멤버는 하나의 gRNA 부위에서 인델 돌연변이를 단지 야기하는지 대 전체 서열을 얼마나 효율적으로 제거하는지에 대해 테스트될 수 있다.
유전자 파괴에 대한 전략을 설계하기 위한 일부 구현예에서, S. pyogenes에 대한 1 층 gRNA 분자를 위한 표적화 도메인은 표적 부위까지의 거리 및 이의 직교성(PAM은 NGG)에 기초하여 선택된다. 일부 경우에, 1 층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 (1) 표적 위치까지의 적절한 거리, 예를 들어 시작 코돈의 코딩 서열 하류의 처음 500bp 이내 및 (2) 높은 수준의 직교성에 기초하여 선택된다. 일부 측면에서, 2 층 gRNA의 선택을 위해 높은 수준의 직교성이 요구되지 않는다. 일부 경우에, 3 층 gRNA는 우수한 직교성의 요건을 제거하고 보다 긴 서열(예를 들어, 나머지 코딩 서열)이 스캔될 수 있다. 특정 경우에, 어떤 gRNA도 특정 층의 기준에 기초하여 확인되지 않는다.
유전자 파괴에 대한 전략을 설계하기 위한 일부 구현예에서, N. meningtidis에 대한 1 층 gRNA 분자를 위한 표적화 도메인은 코딩 서열의 처음 500bp 이내에서 선택되었고 높은 수준의 직교성을 가졌다. N. meningtidis에 대한 2 층 gRNA 분자를 위한 표적화 도메인은 코딩 서열의 처음 500bp 이내에서 선택되었고 높은 직교성을 요구하지 않았다. N. meningtidis에 대한 3 층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 500bp의 하류에 있는 코딩 서열의 나머지 내에서 선택되었다. 층은 포함되지 않음(각 gRNA는 한 번만 나열됨)에 유의한다. 특정 경우에, 어떤 gRNA도 특정 층의 기준에 기초하여 확인되지 않았다.
유전자 파괴에 대한 전략을 설계하기 위한 일부 구현예에서, S. aureus에 대한 1 층 gRNA 분자를 위한 표적화 도메인은 코딩 서열의 처음 500bp 이내에서 선택되고, 높은 수준의 직교성을 가지며, NNGRRT PAM을 함유한다. 일부 구현예에서, S. aureus에 대한 2 층 gRNA 분자를 위한 표적화 도메인은 코딩 서열의 처음 500bp 이내에서 선택되고, 어떤 수준의 직교성도 요구되지 않으며, NNGRRT PAM을 함유한다. 일부 구현예에서, S. aureus에 대한 3 층 gRNA 분자를 위한 표적화 도메인은 코딩 서열 하류의 나머지 내에서 선택되고, NNGRRT PAM을 함유한다. 일부 구현예에서, S. aureus에 대한 4 층 gRNA 분자를 위한 표적화 도메인은 코딩 서열의 처음 500bp 내에서 선택되고, NNGRRV PAM을 함유한다. 일부 구현예에서, S. aureus에 대한 5 층 gRNA 분자를 위한 표적화 도메인은 코딩 서열 하류의 나머지 내에서 선택되고, NNGRRV PAM을 함유한다. 특정 경우에, 어떤 gRNA도 특정 층의 기준에 기초하여 확인되지 않는다.
2) Cas9
다양한 종의 Cas9 분자가 여기에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. S. pyogenes, S. aureus, N. meningitidis 및 S. thermophilus Cas9 분자가 여기에서 많은 개시의 주제이지만, 여기에 열거된 다른 종의 Cas9 단백질에 기초하거나 이로부터 유래되거나 이의 Cas9 분자 역시 사용될 수 있다. 즉, 여기에서 다수의 기재가 S. pyogenes, S. aureus, N. meningitidis 및 S. thermophilus Cas9 분자를 사용하나, 다른 종 유래 Cas9 분자가 이를 대체할 수 있다. 상기 종에는 Acidovorax avenae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus suis, Actinomyces sp., Cycliphilusdenitrificans, Aminomonas paucivorans, Bacillus cereus, Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacteroides sp., Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp., Brevibacillus laterosporus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candidatus puniceispirillum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium perfringens, Corynebacterium accolens, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium matruchotii, Dinoroseobacter shibae, Eubacterium dolichum, Gammaproteobacterium, Gluconacetobacter diazotrophicus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum, Helicobacter canadensis, Helicobacter cinaedi, Helicobacter mustelae, Ilyobacter polytropus, Kingella kingae, Lactobacillus crispatus, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeriaceae bacterium, Methylocystis sp., Methylosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacilliformis, Neisseria cinerea, Neisseria flavescens, Neisseria lactamica, Neisseria meningitidis, Neisseria sp., Neisseria wadsworthii, Nitrosomonas sp., Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutens, Ralstonia syzygii, Rhodopseudomonas palustris, Rhodovulum sp., Simonsiella muelleri, Sphingomonas sp., Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus sp., Subdoligranulum sp., Tistrella mobilis, Treponema sp. 또는 Verminephrobacter eiseniae가 포함된다. Cas9 분자의 예에는 예를 들어, 문헌[국제 출원 WO2015/161276, WO2017/193107, WO2017/093969, 미국 출원 US2016/272999 및 US2015/056705]에 기재된 것들이 포함될 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같은 용어, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 gRNA 분자와 상호작용할 수 있고, 표적 도메인 및 PAM 서열을 포함하는 부위로 gRNA 분자와 함께 귀소 또는 국소화하는 분자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 여기에서 사용된 바와 같은 용어, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 자연적으로 발생하는 Cas9 분자를 지칭하고, 참조 서열 예를 들어, 가장 유사한 자연적으로 발생하는 Cas9 분자와 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 조작된, 변경된 또는 변형된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드를 지칭한다.
2개의 상이한 자연적으로 발생하는 세균의 Cas9 분자(Jinek et al., Science, 343(6176):1247997, 2014) 및 가이드 RNA를 갖는 S. pyogenes Cas9(예를 들어, crRNA 및 tracrRNA의 합성 융합)(Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014; 및 Anders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038/nature13579)에 대한 결정 구조가 결정되었다.
자연적으로 발생하는 Cas9 분자는 2개의 로브(lobe), 즉 인식(recognition, REC) 로브 및 뉴클레아제(nuclease, NUC) 로브를 포함하고; 이들 각각은 여기 기재된 도메인을 더 포함한다. 1차 구조에서 중요한 Cas9 도메인 조직의 예시적인 개략도가 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어 그 안에 있는 도 8A-8B]에 기재되어 있다. 상기 개시 전체에 사용된 각각의 도메인에 포함된 아미노산 잔기의 도메인 명명법 및 넘버링은 문헌[Nishimasu et al]에 기재된 바와 같다. 아미노산 잔기의 넘버링은 S. pyogenes 유래 Cas9에 관한 것이다.
REC 로브는 아르기닌이 풍부한 가교 나선(bridge helix, BH), REC1 도메인 및 REC2 도메인을 포함한다. REC 로브는 다른 공지된 단백질과 구조적 유사성을 공유하지 않으며, 이는 Cas9 특이적 기능성 도메인임을 나타낸다. BH 도메인은 긴 α-나선 및 아르기닌이 풍부한 영역이며, S. pyogenes Cas9 서열의 60-93 아미노산을 포함한다. REC1 도메인은 반복:항-반복 이중 영역, 예를 들어 gRNA 또는 tracrRNA의 인식에 중요하며, 따라서 표적 서열을 인식함으로써 Cas9 활성에 중요하다. REC1 도메인은 S. pyogenes Cas9 서열의 94 내지 179 및 308 내지 717 아미노산에서 2 개의 REC1 모티브를 포함한다. 상기 2 개의 REC1 도메인은 선형 1차 구조에서 REC2 도메인에 의해 분리되나 삼차 구조에서 모여 REC1 도메인을 형성한다. REC2 도메인 또는 이의 부분은 반복:항-반복 이중 영역의 인식에 역할을 할 수도 있다. REC2 도메인은 S. pyogenes Cas9 서열의 180-307 아미노산을 포함한다.
NUC 로브는 RuvC 도메인(여기에서 RuvC 유사 도메인으로도 지칭), HNH 도메인(여기에서 HNH 유사 도메인으로도 지칭) 및 PAM-상호작용(PAM-interacting, PI) 도메인을 포함한다. RuvC 도메인은 레트로바이러스 인테그라제 슈퍼패밀리(superfamily) 멤버와 구조적 유사성을 공유하고 단일 가닥, 예를 들어, 표적 핵산 분자의 비상보성 가닥을 절단한다. RuvC 도메인은 S. pyogenes Cas9 서열의 1-59, 718-769 및 909-10983 아미노산에 각각 있는 3 개의 분할 RuvC 모티프(종종 일반적으로 RuvCI 도메인 또는 N 말단 RuvC 도메인, RuvCII 도메인 및 RuvCIII 도메인으로 지칭되는 RuvC I, RuvCII 및 RuvCIII)로부터 조립된다. REC1 도메인과 유사하게, 3 개의 RuvC 모티프는 1차 구조에서 다른 도메인에 의해 선형적으로 분리되나, 3차 구조에서 3 개의 RuvC 모티프가 모이고 RuvC 도메인을 형성한다. HNH 도메인은 HNH 엔도뉴클레아제와 구조적 유사성을 공유하고 단일 가닥, 예를 들어, 표적 핵산 분자의 상보성 가닥을 절단한다. HNH 도메인은 RuvC II-III 모티프 사이에 있으며 S. pyogenes Cas9의 서열의 775-908 아미노산을 포함한다. PI 도메인은 표적 핵산 분자의 PAM과 상호 작용하고, S. pyogenes Cas9 서열의 1099-1368 아미노산을 포함한다.
A) RuvC 유사 도메인 및 HNH 유사 도메인
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 HNH 유사 도메인 및 RuvC 유사 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 활성은 RuvC 유사 도메인 및 HNH 유사 도메인에 의존한다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는, RuvC 유사 도메인 및 HNH 유사 도메인 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드이고, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는 RuvC 유사 도메인, 예를 들어, 여기에 기재된 RuvC 유사 도메인 및/또는 HNH 유사 도메인, 예를 들어 여기에 기재된 HNH 유사 도메인을 포함한다.
B) RuvC 유사 도메인
일부 구현예에서, RuvC 유사 도메인은 단일 가닥, 예를 들어, 표적 핵산 분자의 비상보성 가닥을 절단한다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 하나 이상의 RuvC 유사 도메인(예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개 이상의 RuvC 유사 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RuvC 유사 도메인은 5, 6, 7, 8 개 이상의 아미노산 길이이나 20, 19, 18, 17, 16 또는 15 개 이내의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 약 10 내지 20 개의 아미노산, 예를 들어 약 15 개의 아미노산 길이의 N 말단 RuvC 유사 도메인을 포함한다.
C) N 말단 RuvC 유사 도메인
일부 자연적으로 발생하는 Cas9 분자는 N 말단 RuvC 유사 도메인에 의존하여 절단하는 하나 이상의 RuvC 유사 도메인을 포함한다. 따라서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 N 말단 RuvC 유사 도메인을 포함할 수 있다.
구현예에서, N 말단 RuvC 유사 도메인은 절단 능력이 있다.
구현예에서, N 말단 RuvC 유사 도메인은 절단 능력이 없다.
일부 구현예에서, N 말단 RuvC 유사 도메인은 여기, 예를 들어 국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어 그 안의 도 3A-3B 또는 도 7A-7B에 개시된 N 말단 RuvC 유사 도메인의 서열과 1 내지 2, 3, 4 또는 5 개의 잔기 이내만큼 많이 상이하다. 일부 구현예에서, 국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 3A-3B 또는 도 7A-7B에서 확인된 매우 보존된 잔기 중 1, 2 또는 3 개 모두가 존재한다.
일부 구현예에서, N 말단 RuvC 유사 도메인은 여기, 예를 들어 국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어 그 안의 도 4A-4B 또는 도 7A-7B에 개시된 N 말단 RuvC 유사 도메인의 서열과 1 내지 2, 3, 4 또는 5 개의 잔기 이내만큼 많이 상이하다. 일부 구현예에서, 국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 4A-4B 또는 도 7A-7B에서 확인된 매우 보존된 잔기 중 1, 2, 3 또는 4 개 모두가 존재한다.
D) 추가 RuvC 유사 도메인
N 말단 RuvC 유사 도메인 이외에, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는 하나 이상의 추가 RuvC 유사 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 2개의 추가 RuvC 유사 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가 RuvC 유사 도메인은 5 개 이상의 아미노산 길이이며, 예를 들어 15 개 미만의 아미노산 길이, 예를 들어 5 내지 10 개의 아미노산 길이, 예를 들어 8 개의 아미노산 길이이다.
E) HNH 유사 도메인
일부 구현예에서, HNH 유사 도메인은 단일 가닥 상보성 도메인, 예를 들어, 이중 가닥 핵산 분자의 상보성 가닥을 절단한다. 일부 구현예에서, HNH 유사 도메인은 15, 20, 25 개 이상의 아미노산 길이이나 40, 35 또는 30 개 이내의 아미노산 길이, 예를 들어 20 내지 35 개의 아미노산 길이, 예를 들어 25 내지 30 개의 아미노산 길이이다. 예시적인 HNH 유사 도메인이 여기에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, HNH 유사 도메인은 절단 능력이 있다.
일부 구현예에서, HNH 유사 도메인은 절단 능력이 없다.
일부 구현예에서, HNH 유사 도메인은 여기, 예를 들어 국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어 그 안의 도 5A-5C 또는 도 7A-7B에 개시된 HNH 유사 도메인의 서열과 1 내지 2, 3, 4 또는 5 개의 잔기 이내만큼 많이 상이하다. 일부 구현예에서, 국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 5A-5C 또는 도 7A-7B에서 확인된 매우 보존된 잔기 중 1 또는 둘 다가 존재한다.
일부 구현예에서, HNH 유사 도메인은 여기, 예를 들어 국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어 그 안의 도 6A-6B 또는 도 7A-7B에 개시된 HNH 유사 도메인의 서열과 1 내지 2, 3, 4 또는 5 개의 잔기 이내만큼 많이 상이하다. 일부 구현예에서, 국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 6A-6B 또는 도 7A-7B에서 확인된 매우 보존된 잔기 중 1, 2, 3 개 모두가 존재한다.
F) 뉴클레아제 및 헬리카제 활성
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 표적 핵산 분자를 절단할 수 있다. 전형적으로, 야생형 Cas9 분자는 표적 핵산 분자의 두 가닥 모두를 절단한다. Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩티드는 뉴클레아제 절단(또는 다른 특성)이 변경되도록 조작될 수 있어서, 예를 들어, 닉카제이거나 또는 표적 핵산을 절단하는 능력이 없는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드를 제공한다. 표적 핵산 분자를 절단할 수 있는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 여기에서 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드로 지칭된다.
일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는, 닉카제 활성, 즉 단일 가닥, 예를 들어 핵산 분자의 비상보성 가닥 또는 상보성 가닥을 절단하는 능력; 이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉 이중 가닥 핵산의 양쪽 가닥을 절단하고 이중 가닥 파손을 형성하는 능력 - 이는 일부 구현예에서 2개의 닉카제 활성의 존재임 - ; 엔도뉴클레아제 활성; 엑소뉴클레아제 활성; 및 헬리카제 활성, 즉 이중 가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 능력; 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 효소적 활성 또는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는 양쪽 가닥을 모두 절단하고 이중 가닥 파손을 초래한다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자는 하나의 가닥, 예를 들어 gRNA가 혼성화하는 가닥 또는 gRNA가 혼성화하는 가닥에 대해 상보적인 가닥만을 절단한다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는 HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는 N 말단 RuvC 유사 도메인과 관련된 절단 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는 HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성 및 N 말단 RuvC 유사 도메인과 관련된 절단 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는 활성 또는 절단 능력이 있는 HNH 유사 도메인 및 비활성 또는 절단 능력이 없는 N 말단 RuvC 유사 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는 비활성 또는 절단 능력이 없는 HNH 유사 도메인 및 활성 또는 절단 능력이 있는 N 말단 RuvC 유사 도메인을 포함한다.
일부 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 gRNA 분자와 상호 작용하는 능력 및 gRNA 분자와 함께 코어 표적 도메인으로 국소화하는 능력을 가지나 표적 핵산을 절단할 수 없거나 효율적인 속도로 절단할 수 없다. 절단 활성이 없거나 실질적인 절단 활성이 없는 Cas9 분자를 여기에서 eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩티드로 지칭한다. 예를 들어, eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩티드는 절단 활성이 없거나 또는 보다 적은 활성, 예를 들어, 여기에 기재된 분석에 의해 측정된 바와 같이, 참조 Cas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩티드 절단 활성의 20, 10, 5, 1 또는 0.1% 미만을 가질 수 있다.
G) 표적화 및 PAM
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 가이드 RNA(gRNA) 분자와 상호작용할 수 있고, 표적 도메인 및 PAM 서열을 포함하는 부위로 gRNA 분자와 함께 국소화할 수 있는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드가 표적 핵산과 상호 작용하고 표적 핵산을 절단하는 능력은 PAM 서열에 의존한다. PAM 서열은 표적 핵산에 있는 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 핵산의 절단은 PAM 서열의 상류에서 발생한다. 상이한 세균 종 유래 eaCas9 분자는 상이한 서열 모티프(예를 들어, PAM 서열)를 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, S. pyogenes의 eaCas9 분자는 NGG, NAG, NGA 서열 모티프를 인식하고 상기 서열에서 1 내지 10, 예를 들어, 3 내지 5 개의 염기쌍 상류에 있는 표적 핵산 서열의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Mali et al., Science 2013; 339(6121): 823-826]을 참조한다. 일부 구현예에서, S. thermophilus의 eaCas9 분자는 NGGNG 및/또는 NNAGAAW(W = A 또는 T) 서열 모티프를 인식하고, 상기 서열에서 1 내지 10, 예를 들어, 3 내지 5 개의 염기쌍 상류에 있는 표적 핵산 서열의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Horvath et al., Science 2010; 327(5962):167-170 및 Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400]을 참조한다. 일부 구현예에서, S. mutans의 eaCas9 분자는 NGG 및/또는 NAAR(R = A 또는 G) 서열 모티프를 인식하고 상기 서열에서 1 내지 10, 예를 들어, 3 내지 5 개의 염기쌍 상류에 있는 코어 표적 핵산 서열의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400]을 참조한다. 일부 구현예에서, S. aureus의 eaCas9 분자는 NNGRR(R = A 또는 G) 서열 모티프를 인식하고 상기 서열에서 1 내지 10, 예를 들어, 3 내지 5 개의 염기쌍 상류에 있는 표적 핵산 서열의 절단을 지시한다. 일부 구현예에서, S. aureus의 eaCas9 분자는 NNGRRT(R = A 또는 G) 서열 모티프를 인식하고 상기 서열에서 1 내지 10, 예를 들어, 3 내지 5 개의 염기쌍 상류에 있는 표적 핵산 서열의 절단을 지시한다. 일부 구현예에서, S. aureus의 eaCas9 분자는 NNGRRV(R = A 또는 G) 서열 모티프를 인식하고 상기 서열에서 1 내지 10, 예를 들어, 3 내지 5 개의 염기쌍 상류에 있는 표적 핵산 서열의 절단을 지시한다. 일부 구현예에서, N. meningitidis의 eaCas9 분자는 NNNNGATT 또는 NNNGCTT(R = A 또는 G, V = A, G 또는 C) 서열 모티프를 인식하고, 상기 서열에서 1 내지 10, 예를 들어, 3 내지 5 개의 염기쌍 상류에 있는 표적 핵산 서열의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6]을 참조한다. PAM 서열을 인식하는 Cas9 분자의 능력은 예를 들어, 문헌[Jinek et al., Science 2012 337:816]에 기재된 형질 전환 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 상기 구현예에서, N은 임의의 뉴클레오티드 잔기, 예를 들어, A, G, C 또는 T 중 어느 하나일 수 있다.
여기에서 논의된 바와 같이, Cas9 분자를 조작하여 Cas9 분자의 PAM 특이성을 변경시킬 수 있다.
자연적으로 발생하는 예시적인 Cas9 분자가 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재되어 있다. 상기 Cas9 분자에는 클러스터 1 - 78 세균 패밀리의 Cas9 분자가 포함된다.
자연적으로 발생하는 예시적인 Cas9 분자에는 클러스터 1 세균 패밀리의 Cas9 분자가 포함된다. 예에는 S. pyogenes(예를 들어, 균주명 SF370, MGAS10270, MGAS10750, MGAS2096, MGAS315, MGAS5005, MGAS6180, MGAS9429, NZ131 및 SSI-1), S. thermophilus(예를 들어, 균주명 LMD-9), S. pseudoporcinus(예를 들어, 균주명 SPIN 20026), S. mutans(예를 들어, 균주명 UA159, NN2025), S. macacae(예를 들어, 균주명 NCTC11558), S. gallolyticus(예를 들어, 균주명 UCN34, ATCC BAA-2069), S. equines(예를 들어, 균주명 ATCC 9812, MGCS 124), S. dysdalactiae(예를 들어, 균주명 GGS 124), S. bovis(예를 들어, 균주명 ATCC 700338), S. anginosus(예를 들어, 균주명 F0211), S. agalactiae(예를 들어, 균주명 NEM316, A909), Listeria monocytogenes(예를 들어, 균주명 F6854), Listeria innocua(L. innocua, 예를 들어, 균주명 Clip11262), Enterococcus italicus(예를 들어, 균주명 DSM 15952) 또는 Enterococcus faecium(예를 들어, 균주명 1,231,408)의 Cas9 분자가 포함된다. 다른 예시적인 Cas9 분자는 Neisseria meningitidis의 Cas9 분자이다(Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6).
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는 여기에 기재된 임의의 Cas9 분자 서열 또는 자연적으로 발생하는 Cas9 분자 서열, 예를 들어, 여기에 열거(예를 들어, 서열 번호: 159-162, 227 및 228)되거나 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737; Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6]에 기재된 종 유래 Cas9 분자와 동일하거나; 상기와 1, 2, 5, 10 또는 20 개 이상의 아미노산이나 100, 80, 70, 60, 50, 40 또는 30 개 이내의 아미노산이 상이하거나; 상기와 비교할 경우 2, 5, 10, 15, 20, 30 또는 40% 이내의 아미노산 잔기가 상이하거나; 또는 상기와 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 갖는; 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 닉카제 활성; 이중 가닥 절단 활성(예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 헬리카제 활성; 또는 gRNA 분자와 함께 표적 핵산으로 귀소하는 능력; 중 하나 이상의 활성을 포함한다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]의 컨센서스 서열의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 "*"는 S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans 및 L. innocua Cas9 분자의 아미노산 서열 중 해당 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 나타내고 "-"는 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 서열 번호: 159-162, 227 및 228의 컨센서스 서열 또는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 컨센서스 서열의 서열과 1 이상이나 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이내의 아미노산 잔기가 상이하다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 서열 번호: 228 또는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 7A-7B]에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 "*"는 S. pyogenes 또는 N. meningitidis Cas9 분자의 아미노산 서열 중 해당 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 나타내고 "-"는 임의의 아미노산을 나타내며 "-"는 임의의 아미노산 또는 부재를 나타낸다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 서열 번호: 227 또는 228 또는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 7A-7B]에 기재된 바와 같은 서열과 1 이상이나 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이내의 아미노산 잔기가 상이하다.
많은 Cas9 분자의 서열 비교는 특정 영역이 보존되고 있음을 나타낸다. 상기는 영역 1(1 내지 180 개의 잔기 또는 영역 1'의 경우 120 내지 180 개의 잔기); 영역 2(360 내지 480 개의 잔기); 영역 3(660 내지 720 개의 잔기); 영역 4(817 내지 900 개의 잔기); 및 영역 5(900 내지 960 개의 잔기);로 여기서 확인된다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 생물학적 활성 분자, 예를 들어 여기에 기재된 하나 이상의 활성을 갖는 Cas9 분자를 제공하기에 충분한 추가 Cas9 분자 서열과 함께 영역 1-5를 포함한다. 일부 구현예에서, 영역 1-6 각각은 독립적으로, 여기에 기재, 예를 들어 서열 번호: 159-162, 227 및 228에 제시된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드의 해당 잔기 또는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G 또는 도 7A-7B]에 개시된 서열과 50%, 60%, 70% 또는 80%의 상동성을 갖는다.
H) 조작되거나 변경된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩티드
여기에 기재된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩티드, 예를 들어, 자연적으로 발생하는 Cas9 분자는, 닉카제 활성, 뉴클레아제 활성(예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 헬리카제 활성; gRNA 분자와 기능적으로 결합하는 능력; 핵산 상의 부위를 표적화(또는 국소화)하는 능력(예를 들어, PAM 인식 및 특이성);을 포함한 다수의 특성 중 어느 하나를 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 상기 특성의 전부 또는 하위 세트를 포함할 수 있다. 전형적인 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 gRNA 분자와 상호 작용하고 gRNA 분자와 협력하여 핵산 부위로 국소화하는 능력을 갖는다. 다른 활성, 예를 들어 PAM 특이성, 절단 활성 또는 헬리카제 활성은 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩티드에서 보다 광범위하게 변할 수 있다.
Cas9 분자는 조작된 Cas9 분자 및 조작된 Cas9 폴리펩티드를 포함한다(상기 문맥에서 사용된 바와 같이 "조작된(engineered)"은 단지 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드가 참조 서열과 상이하며 프로세스 또는 기원 제한을 암시하지 않음을 의미함). 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 변경된 효소 특성, 예를 들어 변경된 뉴클레아제 활성(자연 발생 또는 다른 참조 Cas9 분자와 비교) 또는 변경된 헬리카제 활성을 포함할 수 있다. 여기에서 논의된 바와 같이, 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 닉카제 활성(이중 가닥 뉴클레아제 활성과 반대)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 이의 크기를 변경하는 변경, 예를 들어 하나 이상 또는 임의의 Cas9 활성에 대한 상당한 영향없이 이의 크기를 감소시키는 예를 들어, 아미노산 서열의 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 PAM 인식에 영향을 미치는 변경을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조작된 Cas9 분자는 내인성 야생형 PI 도메인에 의해 인식되는 것이 아닌 PAM 서열을 인식하도록 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 자연 발생 Cas9 분자와 서열이 상이할 수 있으나 하나 이상의 Cas9 활성에 있어 상당한 변경을 갖지 않을 수 있다.
원하는 특성을 갖는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 다양한 방식으로, 예를 들어 모체, 예를 들어 자연 발생 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드의 변경에 의해 만들어져 원하는 특성을 갖는 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 예를 들어, 모 Cas9 분자, 예를 들어 자연 발생 또는 조작된 Cas9 분자와 비교하여 하나 이상의 돌연변이 또는 차이가 도입될 수 있다. 상기 돌연변이 및 차이는 치환(예를 들어, 보존적 치환 또는 비필수 아미노산의 치환); 삽입; 또는 결실;을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 참조, 예를 들어 모체 Cas9 분자와 비교하여 하나 이상의 돌연변이 또는 차이, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50 개 이상의 돌연변이나 200, 100 또는 80 개 미만의 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 Cas9 활성, 예를 들어 여기에 기재된 Cas9 활성에 실질적인 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 Cas9 활성, 예를 들어 여기에 기재된 Cas9 활성에 실질적인 영향을 미친다.
I) 비절단 및 변경 절단 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩티드
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 자연 발생 Cas9 분자와 상이한, 예를 들어 가장 가까운 상동성을 갖는 자연 발생 Cas9 분자와 상이한 절단 특성을 포함한다. 예를 들어, 조절 능력, 예를 들어, 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, S. pyogenes의 Cas9 분자)에 비해 이중 가닥 핵산의 예를 들어, 증가 또는 감소된 절단(엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 조절 능력, 예를 들어, 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, S. pyogenes의 Cas9 분자)에 비해 핵산의 단일 가닥, 예를 들어, 핵산 분자의 비상보적 가닥 또는 핵산 분자의 상보적 가닥의 예를 들어, 증가 또는 감소된 절단(닉카제 활성); 또는 핵산 분자, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자를 절단하는 능력이 제거될 수 있는 것;과 같이, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 자연 발생 Cas9 분자, 예를 들어 S. pyogenes의 Cas9 분자와 상이할 수 있다.
J) 변경 절단 eaCas9 분자 및 eaCas9 폴리펩티드
일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는 N 말단 RuvC 유사 도메인과 관련된 절단 활성; HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성; HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성 및 N 말단 RuvC 유사 도메인과 관련된 절단 활성; 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는 활성 또는 절단 능력이 있는 HNH 유사 도메인 및 비활성 또는 절단 능력이 없는 N 말단 RuvC 유사 도메인을 포함한다. 예시적인 비활성 또는 절단 능력이 없는 N 말단 RuvC 유사 도메인은 N 말단 RuvC 유사 도메인에서 아스파르트산의 돌연변이를 가질 수 있는데, 예를 들어, 서열번호: 159-162, 227 및 228의 컨센선스 서열 또는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 컨센서스 서열의 9번 위치 아스파르트산 또는 서열번호: 228의 10번 위치에서 아스파르트산이 알라닌으로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 N-말단 RuvC 유사 도메인에서 야생형과 상이하며, 예를 들어 여기 기재된 평가에 의해 측정된 바와 같이, 표적 핵산을 절단하지 않거나 또는 예를 들어, 참조 Cas9 분자의 20, 10, 5, 1 또는 0.1% 미만의 절단 활성으로 상당히 보다 낮은 효율로 절단한다. 참조 Cas9 분자는 자연 발생 비변형 Cas9 분자, 예를 들어, S. pyogenes 또는 S. thermophilus의 Cas9 분자와 같은 자연 발생 Cas9 분자에 의할 수 있다. 일부 구현예에서, 참조 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 자연 발생 Cas9 분자이다.
일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는 비활성 또는 절단 능력이 없는 HNH 도메인 및 활성 또는 절단 능력이 있는 N 말단 RuvC 유사 도메인을 포함한다. 예시적인 비활성 또는 절단 능력이 없는 HNH 유사 도메인은 하기 중 하나 이상에서 돌연변이를 가질 수 있다: HNH 유사 도메인의 히스티딘, 예를 들어, 서열 번호: 159-162, 227 및 228의 컨센서스 서열 또는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 컨센서스 서열의 856번 위치에 나타낸 히스티딘이 예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있고; HNH 유사 도메인에서 하나 이상의 아스파라긴, 예를 들어, 서열 번호: 159-162, 227 및 228의 컨센서스 서열 또는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 컨센서스 서열의 870번 위치 및/또는 서열 번호: 159-162, 227 및 228의 컨센서스 서열 또는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 컨센서스 서열의 879번 위치에 나타낸 아스파라긴이 예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, eaCas9은 HNH 유사 도메인에서 야생형과 상이하며, 예를 들어 여기 기재된 분석에 의해 측정된 바와 같이, 표적 핵산을 절단하지 않거나 또는 예를 들어, 참조 Cas9 분자의 20, 10, 5, 1 또는 0.1% 미만의 절단 활성으로 상당히 보다 낮은 효율로 절단한다. 참조 Cas9 분자는 자연 발생 비변형 Cas9 분자, 예를 들어, S. pyogenes 또는 S. thermophilus의 Cas9 분자와 같은 자연 발생 Cas9 분자에 의할 수 있다. 일부 구현예에서, 참조 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 자연 발생 Cas9 분자이다.
일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드는 비활성 또는 절단 능력이 없는 HNH 도메인 및 활성 또는 절단 능력이 있는 N 말단 RuvC 유사 도메인을 포함한다. 예시적인 비활성 또는 절단 능력이 없는 HNH 유사 도메인은 하기 중 하나 이상에서 돌연변이를 가질 수 있다: HNH 유사 도메인의 히스티딘, 예를 들어, 서열 번호: 159-162, 227 및 228의 컨센서스 서열 또는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 컨센서스 서열의 856번 위치에 나타낸 히스티딘이 예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있고; HNH 유사 도메인에서 하나 이상의 아스파라긴, 예를 들어, 서열 번호: 159-162, 227 및 228의 컨센서스 서열 또는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 컨센서스 서열의 870번 위치 및/또는 서열 번호: 159-162, 227 및 228의 컨센서스 서열 또는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 컨센서스 서열의 879번 위치에 나타낸 아스파라긴이 예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, eaCas9은 HNH 유사 도메인에서 야생형과 상이하며, 예를 들어 여기 기재된 분석에 의해 측정된 바와 같이, 표적 핵산을 절단하지 않거나 또는 예를 들어, 참조 Cas9 분자의 20, 10, 5, 1 또는 0.1% 미만의 절단 활성으로 상당히 보다 낮은 효율로 절단한다. 참조 Cas9 분자는 자연 발생 비변형 Cas9 분자, 예를 들어, S. pyogenes 또는 S. thermophilus의 Cas9 분자와 같은 자연 발생 Cas9 분자에 의할 수 있다. 일부 구현예에서, 참조 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 자연 발생 Cas9 분자이다.
K) 표적 핵산의 하나 또는 양쪽 가닥 모두를 절단하는 능력의 변경
일부 구현예에서, 예시적인 Cas9 활성은 PAM 특이성, 절단 활성 및 헬리카제 활성 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 RuvC 유사 도메인, 예를 들어, N 말단 RuvC 유사 도메인; HNH 유사 도메인; RuvC 유사 도메인 및 HNH 유사 도메인의 외부 영역;에 돌연변이(들)가 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, RuvC 유사 도메인, 예를 들어, N 말단 RuvC 유사 도메인에 돌연변이(들)가 존재한다. 일부 구현예에서, HNH 유사 도메인에 돌연변이(들)가 존재한다. 일부 구현예에서, RuvC 유사 도메인, 예를 들어, N 말단 RuvC 유사 도메인 및 HNH 유사 도메인 모두에 돌연변이가 존재한다.
S. pyogenes 서열과 관련하여 RuvC 도메인 또는 HNH 도메인에서 이루어질 수 있는 예시적인 돌연변이에는 D10A, E762A, H840A, N854A, N863A 및/또는 D986A가 포함된다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 참조 Cas9 분자와 비교했을 때, RuvC 도메인 및/또는 HNH 도메인에서 하나 이상의 차이를 포함하는 eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩티드이고, eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드는 핵산을 절단하지 않거나 또는 예를 들어, 여기 기재된 바와 같이 예를 들어, 절단 평가에서 야생형과 비교했을 때, 야생형의 절단보다 상당히 덜 효율적으로 절단하고, 여기 기재된 평가에 의해 측정된 바와 같이, 참조 Cas9 분자의 50, 25, 10 또는 1% 미만으로 절단한다.
특정 서열, 예를 들어, 치환이 표적화 활성, 절단 활성 등과 같은 하나 이상의 활성에 영향을 미칠 수 있는지 여부는, 예를 들어, 돌연변이가 보존적인지 여부를 평가함으로써 평가 또는 예측될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자의 상황에서 사용되는 바와 같은 "비필수(non-essential)" 아미노산 잔기는 Cas9 활성(예를 들어, 절단 활성)을 없애지 않거나 보다 바람직하게는 실질적으로 변경하지 않으면서, Cas9 분자, 예를 들어, 자연 발생 Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기인 반면, "필수(essential)" 아미노산 잔기의 변경은 활성(예를 들어, 절단 활성)의 실질적인 상실을 초래한다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩티드는 자연 발생 Cas9 분자와 상이한, 예를 들어 가장 가까운 상동성을 갖는 자연 발생 Cas9 분자와 상이한 절단 특성을 포함한다. 예를 들어, 조절 능력, 예를 들어, 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, S aureus, S. pyogenes 또는 C. jejuni의 Cas9 분자)에 비해 이중 가닥 핵산의 예를 들어, 증가 또는 감소된 절단(엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 조절 능력, 예를 들어, 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, S aureus, S. pyogenes 또는 C. jejuni의 Cas9 분자)에 비해 핵산의 단일 가닥, 예를 들어, 핵산 분자의 비상보적 가닥 또는 핵산 분자의 상보적 가닥의 예를 들어, 증가 또는 감소된 절단(닉카제 활성); 또는 핵산 분자, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자를 절단하는 능력이 제거될 수 있는 것;과 같이, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 자연 발생 Cas9 분자, 예를 들어 S aureus, S. pyogenes 또는 C. jejuni의 Cas9 분자와 상이할 수 있다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 RuvC 도메인과 관련된 절단 활성; HNH 도메인과 관련된 절단 활성; HNH 도메인과 관련된 절단 활성 및 RuvC 도메인과 관련된 절단 활성; 중 하나 이상을 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 핵산 분자(이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자 중 하나)를 절단하지 않거나 또는 예를 들어 여기 기재된 분석에 의해 측정된 바와 같이, 예를 들어, 참조 Cas9 분자의 20, 10, 5, 1 또는 0.1% 미만의 절단 활성으로 상당히 보다 낮은 효율로 핵산 분자를 절단하는 eiCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이다. 참조 Cas9 분자는 자연 발생 비변형 Cas9 분자, 예를 들어, S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus, C. jejuni 또는 N. meningitidis의 Cas9 분자와 같은 자연 발생 Cas9 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 참조 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 자연 발생 Cas9 분자이다. 일부 구현예에서, eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩티드는 HNH 도메인과 관련된 절단 활성 및 RuvC 도메인과 관련된 실질적인 절단 활성이 없다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G ]에 개시된 컨센서스 서열에 나타낸 S. pyogenes의 고정 아미노산 잔기를 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드이고, 문헌[국제 출원 WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G ]에 개시된 컨센서스 서열에서 "-"로 나타낸 잔기 또는 서열 번호: 164에서 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 70, 80, 90, 100, 200 개의 아미노산 잔기)에서 S. pyogenes의 아미노산 서열과 상이한(예를 들어, 치환을 가짐) 하나 이상의 아미노산을 갖는다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드, 예를 들어, eaCas9 분자는, 융합, 예를 들어, 상이한 종의 2 개 이상의 자연 발생 Cas9 분자의 융합, 예를 들어 2 개 이상의 상이한 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드의 융합일 수 있다. 예를 들어, 한 종의 자연 발생 Cas9 분자의 단편은 두 번째 종의 Cas9 분자의 단편에 융합될 수 있다. 예로서, N 말단 RuvC 유사 도메인을 포함하는 S. pyogenes의 Cas9 분자 단편은 HNH 유사 도메인을 포함하는 S pyogenes이 아닌 종(예를 들어, S. Thermophilus)의 Cas9 분자 단편에 융합될 수 있다.
L) 변경된 PAM 인식 또는 PAM 인식을 못하는 Cas9 분자
자연 발생 Cas9 분자는 특정 PAM 서열, 예를 들어, S. pyogenes, S. thermophilus, S. mutans, S. aureus 및 N. meningitidis에 대한 예를 들어, 여기 기재된 PAM 인식 서열을 인식할 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 자연 발생 Cas9 분자와 동일한 PAM 특이성을 갖는다. 다른 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 자연 발생 Cas9 분자와 결합하지 않는 PAM 특이성 또는 가장 가까운 서열 상동성을 갖는 자연 발생 Cas9 분자와 결합하지 않는 PAM 특이성을 갖는다. 예를 들어, 자연 발생 Cas9 분자는 변경, 예를 들어 PAM 인식이 변경될 수 있는데, 예를 들어, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드가 인식하는 PAM 서열의 표적 외 부위 감소 및/또는 특이성 개선; 또는 PAM 인식 요구를 제거하도록 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 예를 들어, PAM 인식 서열의 길이를 증가시키고/거나 Cas9 특이성을 높은 수준의 동일성으로 개선하도록 변경되어 표적 외 부위를 감소시키고 특이성을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 인식 서열의 길이는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15 개의 아미노산 길이이다.
상이한 PAM 서열을 인식하고/거나 표적 외 활성이 감소된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 유도 진화를 이용하여 생성될 수 있다. Cas9 분자의 유도 진화에 사용될 수 있는 예시적인 방법 및 시스템이 예를 들어, 문헌[Esvelt et al. Nature 2011, 472(7344): 499-503]에 기재되어 있다. 후보 Cas9 분자는 예를 들어, 여기에 기재된 방법에 의해 평가될 수 있다.
PAM 인식을 매개하는 PI 도메인의 변경이 여기에서 논의된다.
M) 변경된 PI 도메인을 갖는 합성 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩티드
현재 게놈 편집 방법은 활용된 Cas9 분자에 의해 인식되는 PAM 서열에 의해 표적화될 수 있는 표적 서열의 다양성에 있어 제한적이다. 여기에서 사용되는 바와 같은 용어, 합성 Cas9 분자(또는 Syn-Cas9 분자) 또는 합성 Cas9 폴리펩티드(또는 Syn-Cas9 폴리펩티드)는, 하나의 세균 종 유래 Cas9 코어 도메인 및 Cas9 코어 도메인과 자연적으로 연합하는 PI 도메인이 아닌, 예를 들어, 상이한 세균 종 유래의 변경된 기능성 PI 도메인을 포함하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드를 지칭한다.
일부 구현예에서, 변경된 PI 도메인은 Cas9 코어 도메인이 유래된 자연 발생 Cas9에 의해 인식되는 PAM 서열과 상이한 PAM 서열을 인식한다. 일부 구현예에서, 변경된 PI 도메인은 Cas9 코어 도메인이 유래된 자연 발생 Cas9에 의해 인식되는 PAM 서열과 동일하나 상이한 친화도 또는 특이성으로 PAM 서열을 인식한다. Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩티드는 각각 Syn-eaCas9 분자 또는 Syn-eaCas9 폴리펩티드 또는 Syn-eiCas9 분자, Syn-eiCas9 폴리펩티드일 수 있다.
예시적인 Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩티드는 a) Cas9 코어 도메인, 예를 들어 Cas9 코어 도메인, 예를 들어 S. aureus, S. pyogenes 또는 C. jejuni Cas9 코어 도메인; 및 b) 종 X Cas9 서열 유래 변경된 PI 도메인;을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 변경된 PI 도메인의 RKR 모티프(PAM 결합 모티프)는 Cas9 코어 도메인과 연관된 천연 또는 내인성 PI 도메인의 RKR 모티프 서열과 비교하여, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 잔기 차이; 제1, 제2 또는 제3 위치에서 아미노산 서열의 차이; 제1 및 제2 위치, 제1 및 제3 위치 또는 제2 및 제3 위치에서 아미노산 서열의 차이;를 포함한다.
일부 구현예에서, Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩티드는 또한 크기 최적화될 수 있으며, 예를 들어, Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩티드는 하나 이상의 결실 및 선택적으로, 상기 결실 측면에 있는 아미노산 잔기 사이에 배치된 하나 이상의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩티드는 REC 결실을 포함한다.
N) 크기 최적화된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩티드
여기에 기재된 조작된 Cas9 분자 및 조작된 Cas9 폴리펩티드는 원하는 Cas9 특성, 예를 들어 본질적으로 천연 형태, Cas9 뉴클레아제 활성 및/또는 표적 핵산 분자의 인식을 여전히 보유하는 반면, 분자의 크기를 감소시키는 결실을 포함하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 하나 이상의 결실 및 선택적으로 하나 이상의 링커를 포함하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리 펩타이드가 여기에서 제공되며, 여기서 링커는 결실 측면에 있는 아미노산 잔기 사이에 배치된다. 참조 Cas9 분자에서 적합한 결실을 확인하는 방법, 결실 및 링커를 갖는 Cas9 분자를 생성하는 방법 및 상기 Cas9 분자를 사용하는 방법은 본 문서 검토 시에 명백해질 것이다.
결실을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어 S. aureus, S. pyogenes 또는 C. jejuni Cas9 분자는 상응하는 자연 발생 Cas9 분자보다 더 작으며, 예를 들어 감소된 아미노산 수를 갖는다. 보다 작은 Cas9 분자의 크기는 전달 방법에 대한 유연성을 증가시키고, 이로써 게놈 편집에 대한 유용성을 증가시킨다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 여기에 기재된 생성된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드의 활성에 실질적으로 영향을 주거나 이를 감소시키지 않는 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다. 여기에 기재된 바와 같은 결실을 포함하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드에 보유된 활성에는, 닉카제 활성, 즉 단일 가닥, 예를 들어 핵산 분자의 비상보성 가닥 또는 상보성 가닥을 절단하는 능력; 이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉 이중 가닥 핵산의 양쪽 가닥을 절단하고 이중 가닥 파손을 형성하는 능력 - 이는 일부 구현예에서 2개의 닉카제 활성의 존재임 - ; 엔도뉴클레아제 활성; 엑소뉴클레아제 활성; 및 헬리카제 활성, 즉 이중 가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 능력; 및 핵산 분자, 예를 들어 표적 핵산 또는 gRNA의 인식 활성; 중 하나 이상이 포함된다.
여기에 기재된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드의 활성은 여기에 기재되거나 또는 공지된 활성 분석을 이용하여 평가될 수 있다.
O) 결실에 적합한 영역 확인
결실에 적합한 Cas9 분자 영역은 다양한 방법으로 확인될 수 있다. 다양한 박테리아 종 유래 자연 발생 직교성(orthologous) Cas9 분자를 S. pyogenes Cas9의 결정 구조(Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014)로 모델링하여 단백질의 3 차원 입체 형태와 관련하여 선택된 Cas9 직교성(orthologs)에 걸친 보존 수준을 검사할 수 있다. Cas9 활성에 관련된 영역, 예를 들어 표적 핵산 분자 및/또는 gRNA와의 인터페이스로부터 공간적으로 떨어져 위치하는 덜 보존되거나 보존되지 않은 영역은 Cas9 활성에 실질적으로 영향을 주거나 이를 감소시키지 않으면서 결실을 위한 후보 영역 또는 도메인을 나타낸다.
P) REC 최적화된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩티드
여기에 사용된 바와 같은 용어 REC-최적화 Cas9 분자 또는 REC-최적화 Cas9 폴리펩티드는 REC2 도메인 및 RE1CT 도메인(집합적으로 REC 결실) 중 하나 또는 둘 모두에서 결실을 포함하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드를 지칭하고, 여기서 결실은 같은 기원의 도메인에 있는 아미노산 잔기 중 10 % 이상을 포함한다. REC-최적화 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드 또는 eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩티드일 수 있다. 예시적인 REC-최적화 Cas9 분자 또는 REC-최적화 Cas9 폴리펩티드는 a) i) REC2 결실; ii) REC1CT 결실; 또는 iii) REC1SUB 결실;에서 선택된 결실을 포함한다.
선택적으로, 링커는 결실 측면에 있는 아미노산 잔기 사이에 배치된다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 단 하나의 결실 또는 2 개의 결실만을 포함한다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 REC2 결실 및 REC1CT 결실을 포함할 수 있다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드는 REC2 결실 및 REC1SUB 결실을 포함할 수 있다.
일반적으로, 결실은 같은 기원 도메인에 있는 아미노산 중 10 % 이상을 함유할 것이며, 예를 들어, REC2 결실은 REC2 도메인에 있는 아미노산 중 10 % 이상을 포함할 것이다. 결실은, 이의 같은 기원 도메인의 아미노산 잔기 중 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 % 이상; 이의 같은 기원 도메인의 모든 아미노산 잔기; 이의 같은 기원 도메인 외부의 아미노산 잔기; 이의 같은 기원 도메인 외부에 있는 복수의 아미노산 잔기; 이의 같은 기원 도메인에 대해 N 말단 직후의 아미노산 잔기; 이의 같은 기원 도메인에 대해 C 말단 직전의 아미노산 잔기; 이의 같은 기원 도메인에 대해 N 말단 직후의 아미노산 잔기 및 이의 같은 기원 도메인에 대해 C 말단 직전의 아미노산 잔기; 이의 같은 기원 도메인에 대해 다수, 예를 들어, 최대 5, 10, 15 또는 20 개의 N 말단 아미노산 잔기; 이의 같은 기원 도메인에 대해 다수, 예를 들어, 최대 5, 10, 15 또는 20 개의 C 말단 아미노산 잔기; 이의 같은 기원 도메인에 대해 다수, 예를 들어, 최대 5, 10, 15 또는 20 개의 N 말단 아미노산 잔기 및 이의 같은 기원 도메인에 대해 다수, 예를 들어, 최대 5, 10, 15 또는 20 개의 C 말단 아미노산 잔기;를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 결실은 이의 같은 기원 도메인; 이의 같은 기원 도메인의 N 말단 아미노산 잔기; 이의 같은 기원 도메인의 C 말단 아미노산 잔기;를 넘어 확장되지 않는다.
REC-최적화 Cas9 분자 또는 REC-최적화 Cas9 폴리펩티드는 결실 측면에 있는 아미노산 잔기 사이에 배치된 링커를 포함할 수 있다. REC-최적화 Cas9 분자에서 REC 결실 측면에 있는 아미노산 잔기 사이에 사용에 적합한 링커가 여기에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, REC-최적화 Cas9 분자 또는 REC-최적화 Cas9 폴리펩티드는, 임의의 REC 결실 및 관련 링커가 아닌, 자연 발생 Cas9, 예를 들어, S. aureus Cas9 분자, S. pyogenes Cas9 분자 또는 C. jejuni Cas9 분자의 아미노산 서열과 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 % 이상 또는 100 % 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, REC-최적화 Cas9 분자 또는 REC-최적화 Cas9 폴리펩티드는, 임의의 REC 결실 및 관련 링커가 아닌, 자연 발생 Cas9, 예를 들어, S. aureus Cas9 분자, S. pyogenes Cas9 분자 또는 C. jejuni Cas9 분자의 아미노산 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 개 이내의 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, REC-최적화 Cas9 분자 또는 REC-최적화 Cas9 폴리펩티드는, 임의의 REC 결실 및 관련 링커가 아닌, 자연 발생 Cas9, 예를 들어, S. aureus Cas9 분자, S. pyogenes Cas9 분자 또는 C. jejuni Cas9 분자의 아미노산 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 % 이내의 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 테스트 서열이 비교되는 참조 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 테스트 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 하위 서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개 변수를 지정한다. 기본 프로그램 매개 변수를 사용할 수 있거나, 대안적인 매개 변수를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개 변수에 기초하여 참조 서열과 비교한 테스트 서열에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법이 잘 알려져 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은, 예를 들어 문헌[Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 검색 방법에 의해, 상기 알고리즘의 컴퓨터화된 구현(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)에 의해 또는 수동 정렬 및 시각적 검사(예를 들어, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 백분율 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 두 가지 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이는 문헌[Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402]; 및 문헌[Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보센터를 통해 공개적으로 이용 가능하다.
두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 또한 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller(1988, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)의 알고리즘을 사용하고, PAM120 중량 잔기표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 사용 가능)에서 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch(1970, J. Mol. Biol. 48:444-453) 알고리즘을 사용하고, Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 하나, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하여 결정될 수 있다.
예시적인 REC 결실에 대한 서열 정보는 예를 들어, 문헌[PCT 국제 출원 공개 번호 WO2015/161276, WO2017/193107 및 WO2017/093969]에 기재된 83개의 자연 발생 Cas9 직교성에 대해 제공된다.
Q) Cas9 분자를 암호화하는 핵산
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 여기에 제공된 임의의 구현예와 관련하여 사용될 수 있다.
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드를 암호화하는 예시적인 핵산은 문헌[Cong et al., Science 2013, 399(6121):819-823; Wang et al., Cell 2013, 153(4):910-918; Mali et al., Science 2013, 399(6121):823-826; Jinek et al., Science 2012, 337(6096):816-821 및 WO2015/161276, 예를 들어 그안의 도 8]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 합성 핵산 서열일 수 있다. 예를 들어, 합성 핵산 분자는 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 mRNA는 캡핑, 폴리아데닐화, 5-메틸시티딘 및/또는 슈도유리딘으로의 치환 중 하나 이상의(예를 들어, 모두) 특징을 갖는다.
또한 또는 대안적으로, 합성 핵산 서열은 코돈 최적화될 수 있으며, 예를 들어, 하나 이상의 비일반적인 코돈 또는 덜 일반적인 코돈이 일반적인 코돈으로 대체되었다. 예를 들어, 합성 핵산은 최적화된 메신저 mRNA, 예를 들어, 포유류 발현 시스템에서의 발현에 최적화된, 예를 들어, 여기에 기재된 합성을 지시할 수 있다.
또한 또는 대안적으로, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 핵 국소화 서열(nuclear localization sequence, NLS)을 포함할 수 있다. 핵 국소화 서열이 공지되어 있다.
임의의 Cas9 서열이 C-말단에서 펩티드 또는 폴리펩티드와 융합되는 경우, 정지 코돈이 제거될 것으로 이해된다.
R) 기타 Cas 분자 및 Cas 폴리펩티드
다양한 유형의 Cas 분자 또는 Cas 폴리펩티드가 여기에 개시된 발명을 실행하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유형 II Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 다른 구현예에서, 다른 Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 예를 들어, 유형 I 또는 유형 III Cas 분자가 사용될 수 있다. 예시적인 Cas 분자(및 Cas 시스템)가 예를 들어, 문헌[Haft et al., PLoS Computational Biology 2005, 1(6): e60 및 Makarova et al., Nature Review Microbiology 2011, 9:467-477]에 기재되어 있고, 두 참조의 내용 전체가 여기에 참조로 통합되어 있다. 예시적인 Cas 분자(및 Cas 시스템)도 표 6에 도시된다.
[표 6]
3) Cpf1
일부 구현예에서, 가이드 RNA 또는 gRNA는 세포 내 게놈 또는 에피솜 서열과 같은 표적 서열에 대한 Cas9 또는 Cpf1과 같은 RNA 가이드 뉴클레아제의 특이적 결합 표적화를 촉진한다. 일반적으로, gRNA는 단분자(단일 RNA 분자를 포함하고, 대안적으로 키메라로 지칭) 또는 모듈식(crRNA 및 tracrRNA와 같은 하나 이상 및 전형적으로 2 개의 분리된 RNA 분자를 포함하며, 이는 보통 예를 들어 이중화에 의해 서로 연관됨)일 수 있다. gRNA 및 이의 성분 부분은 예를 들어, 참조로 통합된 문헌[Briner et al. (Molecular Cell 56(2), 333-339, October 23, 2014 (Briner)] 및 문헌[Cotta-Ramusino] 전체에 기재되어 있다.
단분자이든 모듈식이든 가이드 RNA는 일반적으로 표적에 완전히 또는 부분적으로 상보적인 표적화 도메인을 포함하고, 전형적으로 10-30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 특정 구현예에서는 16-24 개의 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 개의 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 측면에서, 표적화 도메인은 Cas9 gRNA의 경우 gRNA의 5' 말단 또는 그 근처에 있으며, Cpf1 gRNA의 경우 3' 말단 또는 그 근처에 있다. 상기 설명은 Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA에 초점을 맞춘 반면, 상기 의미로 기재된 것과 어떤 면에서 상이한 gRNA를 활용하는 다른 RNA 가이드 뉴클레아제가 발견되었거나(또는 미래에 발견될 수 있음) 발명되었다는 것이 인식되어야 한다. 예를 들어, Cpf1("Prevotella 및 Franciscella1 유래 CRISPR")은 기능에 tracrRNA를 필요로하지 않는 최근에 발견된 RNA 가이드 뉴클레아제이다(여기에 참조로 통합된 Zetsche et al., 2015, Cell 163, 759-771 October 22, 2015 (Zetsche I)). Cpf1 게놈 편집 시스템에서 사용하기 위한 gRNA는 일반적으로 표적화 도메인 및 상보성 도메인을 포함한다(교대로 "핸들(handle)"로 지칭). 또한 Cpf1과 함께 사용하기 위한 gRNA에서, 표적화 도메인은 보통 Cas9 gRNA와 관련하여 상기 기재된 바와 같이 5' 말단이 아닌 3' 말단에 또는 그 근처에 존재한다는 점에 유의해야 한다 (핸들은 Cpf1 gRNA의 5' 말단에 있거나 그 근처에 있음).
상이한 원핵 생물 종 유래 gRNA 사이에 또는 Cpf1과 Cas9 gRNA 사이에 구조적 차이가 존재할 수 있다 하더라도, gRNA가 작동하는 원리는 일반적으로 일관적이다. 이러한 작동의 일관성 때문에, gRNA는 광범위한 관점에서 표적화 도메인 서열에 의해 정의될 수 있으며, 당업자는 주어진 표적화 도메인 서열이, 단분자 또는 키메라 gRNA 또는 하나 이상의 화학적 변경 및/또는 순차적 변경 (치환, 추가 뉴클레오티드, 절단 등)을 포함하는 gRNA를 포함한 임의의 적합한 gRNA에 통합될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 개시의 일부 측면에서, gRNA는 이의 표적화 도메인 서열의 관점에서만 기재될 수 있다.
보다 일반적으로, 본 개시의 일부 측면은 다중 RNA 가이드 뉴클레아제를 사용하여 구현될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것이다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 gRNA는 임의의 RNA 가이드 뉴클레아제와 함께 사용될 수 있는 임의의 적합한 gRNA 및 특정 종의 Cas9 또는 Cpf1과 양립 가능한 gRNA를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예시를 통해, 용어 gRNA는, 특정 구현예에서, 유형 II 또는 유형 V 또는 CRISPR 시스템과 같은 클래스 2 CRISPR 시스템에서 발생하는 임의의 RNA 가이드 뉴클레아제 또는 이로부터 유래되거나 개조된 RNA 가이드 뉴클레아제와 함께 사용하기 위한 gRNA를 포함한다.
본 섹션에서 논의된 특정 예시적인 변형은 비제한적으로 5' 말단에서 또는 이의 근처(예를 들어, 5' 말단의 1-10, 1-5 또는 1-2 뉴클레오티드 내) 및/또는 3' 말단에서 또는 이의 근처(예를 들어, 3' 말단의 1-10, 1-5 또는 1-2 뉴클레오티드 내)를 포함한 gRNA 서열 내 임의의 위치에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 변경은 Cas9 gRNA의 반복-항-반복 이중 영역, Cas9 또는 Cpf1 gRNA의 줄기 루프 구조 및/또는 gRNA의 표적 도메인과 같은 기능성 모티프 내에 배치된다.
RNA 가이드 뉴클레아제에는 Cas9 및 Cpf1과 같은 자연 발생 클래스 2 CRISPR 뉴클레아제뿐만 아니라 이로부터 유래되거나 이로부터 수득된 다른 뉴클레아제가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 기능적 측면에서, RNA 가이드 뉴클레아제는 (a) gRNA와 상호 작용(예를 들어 이와 복합체를 형성)하고; (b) gRNA와 함께, (i) gRNA의 표적화 도메인에 대해 상보적인 서열 및 선택적으로 (ii) 하기에서 보다 자세하게 설명될 "프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif)" 또는 "PAM"으로 지칭되는 추가 서열을 포함하는 DNA 표적 영역과 결합 및 선택적으로 이를 절단 또는 변경하는; 뉴클레아제로 정의된다. 하기 예로 설명되는 바와 같이, RNA 가이드 뉴클레아제는, 동일한 PAM 특이성 또는 절단 활성을 공유하는 개별 RNA 가이드 뉴클레아제 사이에 변이가 존재할 수 있다 하더라도, 광범위하게 이의 PAM 특이성 및 절단 활성에 의해 정의될 수 있다. 당업자는 본 개시의 일부 측면이 특정 PAM 특이성 및/또는 분열 활성을 갖는 임의의 적합한 RNA 가이드 뉴클레아제를 사용하여 구현될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물과 관련이 있음을 인식할 것이다. 상기 이유로, 달리 명시되지 않는 한, 용어 RNA 가이드 뉴클레아제는 일반적인 용어로 이해되어야 하며, RNA 가이드 뉴클레아제의 임의의 특정 유형(예를 들어 Cas9 대 Cpf1), 종(예를 들어 S. pyogenes 대 S. aureus) 또는 변이(예를 들어 전체 길이 대 절단형 또는 분할; 자연 발생 PAM 특이성 대 조작된 PAM 특이성 등)로 제한돼서는 않된다.
PAM 및 프로토스페이서의 특정 연속적 방향을 인식하는 것 외에도, 일부 구현예에서 RNA 가이드 뉴클레아제는 특이적 PAM 서열을 또한 인식할 수 있다. S. aureus Cas9는 예를 들어, 일반적으로 NNGRRT 또는 NNGRRV의 PAM 서열을 인식하며, 여기서 N 잔기는 gRNA 표적화 도메인에 의해 인식되는 영역의 3' 바로 앞이다. S. pyogenes Cas9는 일반적으로 NGG PAM 서열을 인식한다. 그리고 F. novicida Cpf1은 일반적으로 TTN PAM 서열을 인식한다.
TTTN PAM 서열을 포함하면서 crRNA 및 이중 가닥(ds) DNA 표적과 복합체를 이룬 Acidaminococcus sp. Cpf1의 결정 구조가 문헌[여기에 참조로 통합된 Yamano et al. (Cell. 2016 May 5; 165(4): 949-962 (Yamano)]에서 밝혀졌다. Cas9와 같이 Cpf1에는 2개의 로브: REC(인식) 로브 및 NUC(뉴클레아제) 로브가 있다. REC 로브에는 임의의 공지된 단백질 구조와 유사성이 없는 REC1 및 REC2 도메인이 포함된다. 한편, NUC 로브에는 3개의 RuvC 도메인(RuvC-I, -II 및 -III)과 BH 도메인이 포함된다. 그러나, Cas9와는 대조적으로, Cpf1 REC 로브에는 HNH 도메인이 없고, 공지된 단백질 구조와 유사성이 또한 없는 다른 도메인: 구조적으로 유일한 PI 도메인, 3개의 웨지(Wedge, WED) 도메인(WED-I, -II 및 -III) 및 뉴클레아제(Nuc) 도메인이 포함된다.
Cas9 및 Cpf1은 구조와 기능에 있어 유사성을 공유하나, 특정 Cpf1 활성은 어떠한 Cas9 도메인과도 유사하지 않은 구조 도메인에 의해 매개된다는 점이 인식되어야 한다. 예를 들어, 표적 DNA의 상보적 가닥의 절단은 Cas9의 HNH 도메인과 결과적으로 및 공간적으로 상이한 Nuc 도메인에 의해 매개되는 것으로 보인다. 또한, Cpf1 gRNA(핸들)의 비표적화 부분은 Cas9 gRNA에서 반복:항반복 이중 영역에 의해 형성된 줄기 루프 구조가 아닌 의사 매듭 구조를 채택한다.
RNA 가이드 뉴클레아제 예를 들어, Cas9, Cpf1 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산이 여기에 제공된다. RNA 가이드 뉴클레아제를 암호화하는 예시적인 핵산이 상기에 기재되었다(예를 들어, 문헌[Cong 2013; Wang 2013; Mali 2013; Jinek 2012] 참조).
3. 유전자 파괴를 위한 제제의 전달
일부 구현예에서, 인간에서 TRAC 및 TRBC1 또는 TRBC2와 같은 TCR을 암호화하는 내인성 유전자의 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어, DNA 손상은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어, Cas9 및/또는 gRNA 성분을, 세포로 도입 또는 전달하기 위한 많은 공지된 전달 방법 또는 비히클 중 어느 하나를 사용하여, 예를 들어, Cas9 분자 및 gRNA를 전달하기 위한 바이러스, 예를 들어, 렌티바이러스 전달 벡터 또는 임의의 공지된 방법 또는 비히클을 사용하여, 세포로 전달 또는 도입함으로써 수행된다. 예시적인 방법이 예를 들어, 문헌[Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; 및 Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손을 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 하나 이상의 성분을 암호화하는 핵산 서열이 예를 들어, 여기 기재되거나 공지된 세포로 핵산을 도입하는 임의의 방법에 의해 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, CRISPR 가이드 RNA 및/또는 Cas9 효소와 같은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 성분을 암호화하는 벡터가 세포로 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어 Cas9/gRNA인 하나 이상의 제제(들)가 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로 세포에 도입된다. RNP 복합체에는 RNA 또는 gRNA 분자와 같은 리보뉴클레오티드의 서열 및 Cas9 단백질 또는 이의 변이체와 같은 단백질이 포함된다. 예를 들어, Cas9 단백질은 Cas9 단백질 및 표적 서열을 표적화하는 gRNA 분자를 포함하는 RNP 복합체로서 예를 들어, 전기천공 또는 기타 물리적 전달 방법을 이용하여 전달된다. 일부 구현예에서, RNP는 전기 천공 또는 기타 물리적 수단, 예를 들어 입자 총, 인산 칼슘 형질 감염, 세포 압축 또는 압착을 통해 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, RNP는 추가 전달 제제(예를 들어, 소분자 제제, 지질 등)를 필요로 하지 않고 세포의 혈장 막을 가로지를 수 있다. 일부 구현예에서, RNP로서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어, CRISPR/Cas9의 전달은, 표적화된 파괴가 예를 들어, RNP가 도입되는 세포에서 세포의 자손으로 제제가 전달되지 않으면서 일시적으로 발생한다는 이점을 제공한다. 예를 들어, RNP에 의한 전달은 제제가 자손으로 유전되는 것을 최소화하고, 이로써 자손에서 표적 외 유전자 파괴의 가능성을 줄인다. 상기 경우에, 유전자 파괴 및 표적화된 녹인(섹션 I.B에서 더 논의됨)은 제제 자체없이 자손 세포로 유전될 수 있고, 이는 자손 세포로 전달되면서 표적 외 유전자 파괴를 더 도입할 수 있다.
유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들) 및 성분, 예를 들어, Cas9 분자 및 gRNA 분자는 표 7 및 표 8에 제시된 바와 같은 다양한 전달 방법 및 제형 또는 예를 들어, 문헌[국제 출원 WO 2015/161276; 미국 출원 US 2015/0056705, US 2016/0272999, US 2017/0211075; 또는 US 2017/0016027]에 기재된 방법을 사용하여 다양한 형태로 표적 세포에 도입될 수 있다. 여기에 더 기재된 바와 같이, 전달 방법 및 제형은 여기에 기재된 방법의 이전 또는 후속 단계에서 세포에 주형 폴리뉴클레오티드 및/또는 다른 제제를 전달하는데 사용될 수 있다.
[표 7]
[표 8]
일부 구현예에서, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 DNA 또는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 포함하는 RNP 복합체는 공지된 방법에 의해 또는 여기에 기재된 바와 같이 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9 암호화 및/또는 gRNA 암호화 DNA는, 예를 들어, 벡터(예를 들어, 바이러스 또는 비바이러스성 벡터), 비벡터 기반 방법(예를 들어, 있는 그대로의 DNA 또는 DNA 복합체 사용) 또는 이의 조합물에 의해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 이의 제제(들) 및/또는 성분을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터/바이러스 또는 플라스미드)에 의해 전달된다. 상기 벡터는 여기에 기재된 임의의 것일 수 있다.
일부 측면에서, 가이드 서열과 조합하여(및 선택적으로 이와의 복합체로) CRISPR 효소(예를 들어, Cas9 뉴클레아제)가 세포로 전달된다. 예를 들어, CRISPR 시스템 중 하나 이상의 요소는 I 유형, II 형 또는 III 유형 CRISPR 시스템에서 유래된다. 예를 들어, CRISPR 시스템 중 하나 이상의 요소는 Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus 또는 Neisseria meningitides와 같은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체에서 유래된다.
일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제(예를 들어, Staphylococcus aureus 유래 또는 Streptococcus pyogenes 유래 mRNA에 의해 암호화됨, 예를 들어 pCW-Cas9, Addgene #50661, Wang et al. (2014) Science, 3:343-80-4; 또는 카탈로그 번호 K002, K003, K005 또는 K006으로 Applied Biological Materials (ABM; Canada)로부터 구매 가능한 뉴클레아제 또는 닉카제 렌티바이러스 벡터) 및 표적 유전자(예를 들어, 인간에서 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2)에 특이적인 가이드 RNA가 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자와 같은 특정 유전자의 표적 부위를 표적화하는 표적화 도메인 서열이거나 이를 포함하는 gRNA 서열이 설계되거나 확인된다. CRISPR 게놈 편집을 위한 게놈 전체 gRNA 데이터베이스가 공개적으로 이용 가능하고, 이는 인간 게놈 또는 마우스 게놈에서 유전자의 구성적 엑손을 표적화하는 예시적인 단일 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 서열을 함유한다(예를 들어, genescript.com/gRNA-database.html 참조; 또한, Sanjana et al. (2014) Nat. Methods, 11:783-4 참조). 일부 측면에서, gRNA 서열은 비표적 부위 또는 위치에 대한 최소한의 표적 외 결합을 갖는 서열이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 이의 제제(들) 및/또는 성분을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또는 RNP 복합체가 비벡터 기반 방법(예를 들어, 있는 그대로의 DNA 또는 DNA 복합체 사용)에 의해 전달된다. 예를 들어, DNA 또는 RNA 또는 단백질 또는 이의 조합물, 예를 들어, 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체는 예를 들어, 유기적으로 변형된 실리카 또는 규산염(Ormosil), 전기 천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어, 문헌[Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27, Kollmannsperger et al (2016) Nat Comm 7, 10372 doi:10.1038/ncomms10372)]에 기재된 바와 같음), 유전자 총, 소노포레이션(sonoporation), 자성 감염, 지질 매개 형질 감염, 덴드리머(dendrimer), 무기 나노 입자, 인산 칼슘 또는 이의 조합물에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 전기 천공을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 Cas9- 및/또는 gRNA- 암호화 DNA 또는 RNP 복합체와 세포를 혼합하고 정의된 지속 시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극을 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기 천공을 통한 전달은, 카트리지, 챔버 또는 큐벳으로 혼합물을 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)에 연결된 용기에서 Cas9- 및/또는 gRNA- 암호화 DNA와 세포가 혼합되는 시스템을 사용하여 수행되며, 여기서 정의된 지속시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극이 적용되고, 이후 세포가 제2 용기로 전달된다.
일부 구현예에서, 전달 비히클은 비바이러스성 벡터이다. 일부 구현예에서, 비바이러스성 벡터는 무기 나노입자이다. 예시적인 무기 나노 입자에는 예를 들어, 자성 나노 입자(예를 들어, Fe3MnO2) 및 실리카가 포함된다. 나노입자의 외부 표면은 페이로드(payload)의 부착(예를 들어, 접합 또는 포집)을 허용하는 양전하 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리세린)로 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 비바이러스성 벡터는 유기 나노입자이다. 예시적인 유기 나노입자에는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)로 코팅된 중성 헬퍼 지질과 함께 양이온 지질을 함유하는 SNALP 리포좀 및 지질로 코팅된 프로타민(protamine) 핵산 복합체가 포함된다. 예시적인 지질 및/또는 중합체는 공지되어 있으며 제공된 구현예에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 비히클은 표적 세포가 나노입자 및 리포솜의 갱신을 증가시키도록 표적화 변형, 예를 들어, 세포 특이적 항원, 단클론성 항체, 단일 사슬 항체, 압타머, 중합체, 설탕 및 세포 침투성 펩타이드(예를 들어, 미국 출원 2016/0272999에 기재)를 갖는다. 일부 구현예에서, 비히클은 융합생성(fusogenic) 및 엔도솜 불안정화 펩티드/중합체를 사용한다. 일부 구현예에서, 비히클은 산 유발성 구조적 변화(예를 들어, 카고의 엔도솜 탈출을 가속화하도록)를 겪는다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 세포 구획 내에서 방출을 위해 자극 절단 가능 중합체가 사용된다. 예를 들어, 환원성 세포 환경에서 절단되는 이황화물 기반 양이온성 중합체를 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 전달 비히클은 생물학적 비바이러스성 전달 비히클이다. 일부 구현예에서, 비히클은 약화된 세균(예를 들어, 침투적이나 발병 및 전이 유전자의 발현을 방지하도록 약화된 자연적 또는 인위적으로 조작된, 예를 들어, Listeria monocytogenes, 특정 Salmonella 균주, Bifidobacterium longum 및 변형된 Escherichia coli), 특정 세포를 표적화하도록 영양 및 조직 특이적 친화성(tropism)을 갖는 세균, 표적 세포 특이성을 변경하도록 변형된 표면 단백질을 갖는 세균이다. 일부 구현예에서, 비히클은 유전자 변형 박테리오파지(예를 들어, 대형 패키징 용량, 보다 작은 면역원성을 갖고, 포유류 플라스미드 보유 서열을 함유하고 통합된 표적화 리간드를 갖는 조작된 파지)이다. 일부 구현예에서, 비히클은 포유류 바이러스 유사 입자이다. 예를 들어, 변형된 바이러스 입자는 (예를 들어, "빈(empty)" 입자의 정제 후 원하는 카고를 갖는 바이러스의 생체 외 조립에 의해) 생성될 수 있다. 비히클은 또한 표적화 리간드를 통합하도록 조작되어 표적 조직 특이성이 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 비히클은 생물학적 리포솜(liposome)이다. 예를 들어, 생물학적 리포솜은 인간 세포(예를 들어 대상체로부터 유래된 구형 구조로 파괴된 적혈구인 적혈구 고스트(예를 들어, 조직 표적화는 다양한 조직 또는 세포 특이적 리간드의 부착에 의해 달성될 수 있음)) 유래 인지질 기반 입자 또는 분비성 엑소좀 - 식균 작용 기원의 대상체 유래 막 결합 나노소포체(30-100 nm)(예를 들어, 다양한 세포 유형에서 제조될 수 있고 따라서 표적화 리간드 필요없이 세포에 의해 흡수될 수 있음) - 이다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 RNA는 공지된 방법에 의해 또는 여기에 기재된 바와 같이 세포, 예를 들어 여기에 기재된 표적 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9 암호화 및/또는 gRNA 암호화 RNA는, 예를 들어, 미세 주입법, 전기 천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어, 문헌[Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27)]에 기재된 바와 같음), 지질 매개 형질 감염, 펩티드 매개 전달 또는 이의 조합물에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 전기 천공을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 Cas9 분자를 암호화하는 RNA 및/또는 gRNA 분자를 세포와 혼합하고 정의된 지속 시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극을 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기 천공을 통한 전달은, 카트리지, 챔버 또는 큐벳으로 혼합물을 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)에 연결된 용기에서 Cas9 분자를 암호화하는 RNA 및/또는 gRNA 분자가 세포와 혼합되는 시스템을 사용하여 수행되며, 여기서 정의된 지속시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극이 적용되고, 이후 세포는 제2 용기로 전달된다.
일부 구현예에서, Cas9 분자는 공지된 방법에 의해 또는 여기에 기재된 바와 같이 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9 단백질 분자는, 예를 들어, 미세 주입법, 전기 천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어, 문헌[Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27)]에 기재된 바와 같음), 지질 매개 형질 감염, 펩티드 매개 전달 또는 이의 조합물에 의해 전달될 수 있다. 전달은 gRNA를 암호화하는 DNA 또는 gRNA를 동반할 수 있다.
일부 구현예에서, 전기 천공을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 gRNA 분자를 갖는 Cas9 분자 또는 gRNA 분자를 갖지 않는 Cas9 분자와 세포를 혼합하고 정의된 지속 시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극을 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기 천공을 통한 전달은, 카트리지, 챔버 또는 큐벳으로 혼합물을 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)에 연결된 용기에서 gRNA 분자를 갖는 Cas9 분자 또는 gRNA 분자를 갖지 않는 Cas9 분자와 세포가 혼합되는 시스템을 사용하여 수행되며, 여기서 정의된 지속시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극이 적용되고, 이후 세포는 제2 용기로 전달된다.
일부 구현예에서, 이의 제제(들) 및/또는 성분을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 벡터 및 비-벡터 기반 방법의 조합에 의해 전달된다. 예를 들어, 비로솜(virosome)은 불활성화 바이러스(예를 들어, HIV 또는 인플루엔자 바이러스)와 결합된 리포솜을 포함하며, 이는 바이러스 방법 또는 리포솜 방법 중 어느 하나 단독보다 더 효율적인 유전자 전달을 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 이의 제제(들) 및/또는 성분이 세포로 전달된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 게놈, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌에서 2 이상의 위치의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들)가 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 이의 제제(들) 및 성분이 한가지 방법을 사용하여 전달된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌의 유전자 파괴를 유도하는 제제(들)는 유전자 파괴를 위한 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서 전달된다. 일부 구현예에서, 하나의 폴리뉴클레오티드는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌를 표적화하는 제제를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 2 이상의 상이한 폴리뉴클레오티드는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌를 표적화하는 제제를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로서 전달될 수 있고, 2 이상의 상이한 RNP 복합체는 혼합물로서 함께 또는 개별적으로 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들) 및/또는 이의 성분, 예를 들어 Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분이 아닌 하나 이상의 핵산 분자, 예컨대 HDR-지시 통합을 위한 주형 폴리뉴클레오티드(예컨대 여기, 예를 들어, 여기 섹션 I-B에 기재된 임의의 주형 폴리뉴클레오티드)가 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자, 예를 들어 주형 폴리 뉴클레오타이드는 Cas 시스템의 하나 이상의 성분과 동시에 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 하나 이상의 성분이 전달되기 전 또는 후(예를 들어, 약 1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 6 시간, 9 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 1 주, 2 주 또는 4 주 미만)에 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드는 Cas 시스템의 하나 이상의 성분, 예를 들어 Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분과 상이한 수단에 의해 전달된다. 핵산 분자, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드는 여기에 기재된 임의의 전달 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스에 의해 전달될 수 있고, Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분은 전기 천공에 의해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 전이 유전자, 예를 들어 재조합 TCR, 재조합 CAR 및/또는 다른 유전자 생성물을 암호화하는 전이 유전자를 포함한다.
B. 상동성 지시 수선(Homology Directed Repair, HDR)을 통한 표적화된 통합
여기에 제공된 일부 구현예에서, 상동성 지시 수선(HDR)이, 전이 유전자, 예를 들어 게놈, 예를 들어, TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌의 특정 위치에서 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드의 특정 부분의 표적화된 통합을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴(예를 들어, 섹션 I.A에 기재된 바와 같은 DNA 손상) 및 하나 이상의 상동성 암(예를 들어, 상기 유전자 파괴 주변 서열에 상동성인 핵산 서열을 함유)을 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드의 존재는 HDR을 유도 또는 지시할 수 있고, 상동성 서열이 DNA 수선을 위한 주형으로 작용한다. 유전자 파괴를 둘러싼 내인성 유전자 서열과 주형 폴리뉴클레오티드에 포함된 5' 및/또는 3' 상동성 암 사이의 상동성에 기반하여, 세포 DNA 수선 기계는 주형 폴리뉴클레오티드를 사용하여 DNA 손상을 수선하고 유전자 파괴의 부위에서 유전 정보를 재합성할 수 있고, 이로써 유전자 파괴 부위 또는 그 근처에서 주형 폴리뉴클레오티드에 전이 유전자 서열을 효과적으로 삽입하거나 통합할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌에서의 유전자 파괴는 여기에 기재된 표적화된 유전자 파괴를 생성하기 위한 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
또한 여기에 기재된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리뉴클레오티드는 내인성 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌에서 재조합 수용체, 예를 들어, 재조합 TCR의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 표적화하기 위해, 예를 들어 HDR을 포함한 여기에 기재된 방법에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 또는 이의 일부(예를 들어, 재조합 수용체의 하나 이상의 사슬(들), 영역(들) 또는 도메인(들))를 암호화하는 전이 유전자(외인성 또는 이종 핵산 서열) 및 내인성 게놈 부위, 예를 들어 내인성 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌 또는 그 근처 서열에 상동성인 상동성 서열(예를 들어, 상동성 암)을 함유하는 폴리뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 선형 DNA 단편으로 도입되거나 벡터에 포함된다. 일부 측면에서, 유전자 파괴를 유도하는 단계 및 표적화된 통합을 위한 단계(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드의 도입에 의해)는 동시에 또는 순차적으로 수행된다.
1. 상동성 지시 수선(Homology-Directed Repair, HDR)
일부 구현예에서, 상동성 지시 수선(HDR)은 게놈, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌의 하나 이상의 표적 부위(들)에서 하나 이상의 핵산 서열, 예를 들어, 전이 유전자 서열의 표적화된 통합 또는 삽입을 위해 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제-유도 HDR을 사용하여 표적 서열 변경, 특정 표적 위치에서 전이 유전자의 통합 및/또는 특정 표적 유전자에서 돌연변이의 편집 또는 수선을 할 수 있다.
표적 부위에서 핵산 서열의 변경은 외인성으로 제공된 주형 폴리뉴클레오티드(도너 폴리뉴클레오티드 또는 주형 서열로도 지칭)를 사용하여 HDR에 의해 발생할 수 있다. 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는 주형 폴리뉴클레오티드 내에 함유된 전이 유전자의 삽입과 같은 표적 서열의 변경을 제공한다. 일부 구현예에서, 플라스미드 또는 벡터가 상동성 재조합을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 선형 DNA 단편이 상동성 재조합을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 서열과 주형 폴리뉴클레오티드 사이의 상동성 지시 수선의 대안적인 방법(예를 들어, 단일 가닥 어닐링)에 의해 표적 서열의 변경을 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 표적 서열의 주형 폴리뉴클레오티드로 달성된 변경은 뉴클레아제, 예를 들어 CRISPR/Cas9와 같은 표적화된 뉴클레아제에 의한 절단에 의존한다. 뉴클레아제에 의한 절단은 이중 가닥 파손 또는 2 개의 단일 가닥 파손을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, "재조합(recombination)"은 2 개의 폴리뉴클레오티드 사이의 유전 정보 교환 과정을 지칭한다. 일부 구현예에서, "상동성 재조합(homologous recombination, HR)"은, 예를 들어, 상동성-지시 수선 기제를 통해 세포에서 이중 가닥 파손 수선 동안 발생하는 상기 교환의 특화된 형태를 지칭한다. 상기 과정은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하고, 표적 DNA(즉, 예를 들어 내인성 유전자의 표적 부위에서 이중 가닥 파손을 경험한 DNA)의 주형 수선을 위해 주형 폴리뉴클레오티드를 사용하며, 주형 폴리뉴클레오티드에서 표적으로 유전 정보를 전달하기 때문에 "비-교차 유전자 전환(non-crossover gene conversion)" 또는 "짧은 트랙 유전자 전환(short tract gene conversion)"으로 다양하게 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 전달은 파손된 표적과 주형 폴리뉴클레오티드 사이에 형성되는 이종 이중체 DNA의 미스매치 교정 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드가 사용되어 표적 및/또는 관련 프로세스의 일부가 될 유전 정보를 재합성하는 "합성 의존적 가닥 어닐링(synthesis-dependent strand annealing)"을 포함할 수 있다. 상기 특화된 HR은 종종 표적 분자 서열의 변경을 초래하여 주형 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오티드에 통합된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 전이 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 상동성 독립적 기제를 통해 세포의 게놈으로 통합된다. 본 방법은 세포의 게놈에서 이중 가닥 파손(double-stranded break, DSB)을 생성하고 뉴클레아제를 사용하여 주형 폴리뉴클레오티드 분자를 절단하여, 주형 폴리뉴클레오티드가 DSB 부위에서 통합된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 비상동성 의존적 방법(예를 들어, NHEJ)을 통해 통합된다. 생체 내 절단시 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 방식으로 DSB 위치에서 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드는 DSB를 생성하는데 사용되는 하나 이상의 뉴클레아제에 대해 하나 이상의 동일한 표적 부위를 포함할 수 있다. 따라서, 주형 폴리뉴클레오티드는 통합이 요청되는 내인성 유전자를 절단하는데 사용되는 하나 이상의 동일한 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 DSB를 유도하는데 사용되는 뉴클레아제와 상이한 뉴클레아제 표적 부위를 포함한다. 여기에 기재된 바와 같이, 표적 부위 또는 표적 위치의 유전자 파괴는 ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9 시스템 또는 TtAgo 뉴클레아제와 같은 임의의 기제에 의해 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, DNA 수선 기제는 (1) 단일 이중 가닥 파손, (2) 2 개의 단일 가닥 파손, (3) 표적 부위 각각의 측면 상에 발생하는 파손이 있는 2 개의 이중 가닥 파손, (4) 표적 부위 각각의 측면 상에 발생하는 이중 가닥 파손 및 2 개의 단일 가닥 파손이 있는 1 개의 이중 가닥 파손 및 2 개의 단일 가닥 파손, (5) 표적 부위 각각의 측면 상에 발생하는 한 쌍의 단일 가닥 파손이 있는 4 개의 단일 가닥 파손 또는 (6) 1 개의 단일 가닥 파손 후에 뉴클레아제에 의해 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오티드가 사용되며 표적 부위는 대안적인 HDR에 의해 변경될 수 있다.
표적 부위의 주형 폴리뉴클레오티드로 달성된 변경은 뉴클레아제 분자에 의한 절단에 따라 달라진다. 뉴클레아제에 의한 절단은 닉, 이중 가닥 파손 또는 2 개의 단일 가닥 파손, 예를 들어 표적 부위의 각각의 DNA 가닥 상에 하나를 포함할 수 있다. 표적 부위 상에 손상이 도입된 후, 파손 말단에서 절제가 발생하여 단일 가닥의 돌출된 DNA 영역을 초래한다.
정규 HDR에서, 표적 부위에 직접 통합되거나 전이 유전자를 삽입하거나 표적 부위의 서열을 수정하기 위한 주형으로 사용될 표적 부위에 대해 상동성 서열을 포함하는 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드가 도입된다. 파손에서 절제 후, 상이한 경로, 예를 들어, 이중 홀리데이 접점 모델(또는 이중 가닥 파손 수선, DSBR, 경로) 또는 합성 의존적 가닥 어닐링(synthesis-dependent strand annealing, SDSA) 경로에 의해 수선이 진행될 수 있다.
이중 홀리데이 접점 모델에서, 주형 폴리뉴클레오티드에서 상동성 서열에 대해 표적 부위의 2개의 단일 가닥 오버행에 의한 가닥 침입이 발생하고, 2개의 홀리데이 접합을 갖는 중간체 형성을 초래한다. 새로운 DNA가 침입 가닥의 말단에서 합성되면서 접점이 이동하여 절제에서 발생하는 간격을 채운다. 새로 합성된 DNA의 말단은 절제된 말단에 결찰되고, 접점이 풀어져, 대상 부위에서의 삽입, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드에 전이 유전자의 삽입을 초래한다. 주형 폴리뉴클레오티드와의 교차는 접점이 풀어질 때 발생할 수 있다.
SDSA 경로에서, 하나의 단일 가닥 오버행만이 주형 폴리뉴클레오티드를 침입하고 새로운 DNA가 침입 가닥의 말단에서 합성되어 절제에서 발생하는 간격을 채운다. 이어서 새로 합성된 DNA가 남은 단일 가닥 오버행에 어닐링하고, 새로운 DNA가 합성되어 간격을 채우고, 상기 가닥들이 결찰되어 변형된 DNA 이중 영역을 생성한다.
대안적인 HDR에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드가 도입된다. 원하는 표적 부위를 변경하기 위한 표적 부위에서의 닉, 단일 가닥 파손 또는 이중 가닥 파손이 뉴클레아제 분자에 의해 매개되고, 손상에서의 절제가 발행하여 단일 가닥 오버행을 드러낸다. 여기에 기재된 바와 같이, DNA의 표적 부위를 정정 또는 변경하기 위한 주형 폴리뉴클레오티드 서열의 통합은 전형적으로 SDSA 경로에 의해 발생한다.
일부 구현예에서, "대안적인 HDR(Alternative HDR)" 또는 대안적인 상동성 지시 수선은 상동성 핵산(예를 들어, 내인성 상동성 서열, 예를 들어, 자매 크로마티드 또는 외인성 핵산, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드)을 사용하여 DNA 손상을 수선하는 과정을 지칭한다. 대안적인 HDR은 상기 과정이 정규 HDR과 상이한 경로를 이용하며, 정규 HDR 매개자, RAD51 및 BRCA2에 의해 억제될 수 있다는 점에서 정규 HDR과 구별된다. 또한 대안적인 HDR은 파손의 수선을 위해 단일 가닥 또는 닉형 상동성 핵산을 사용한다. 일부 구현예에서, "정규 HDR(Canonical HDR)" 또는 정규 상동성 지시 수선은 상동성 핵산(예를 들어, 내인성 상동성 서열, 예를 들어, 자매 크로마티드 또는 외인성 핵산, 예를 들어, 주형 핵산)을 사용하여 DNA 손상을 수선하는 과정을 지칭한다. 정규 HDR은 전형적으로 이중 가닥 파손에 상당한 절제가 존재할 경우, 하나 이상의 단일 가닥 DNA 부분을 형성하면서 작용한다. 정상 세포에서, HDR은 전형적으로 파손의 인식, 파손의 안정화, 절제, 단일 가닥 DNA의 안정화, DNA 교차 중간체의 형성, 교차 중간체의 풀어짐 및 결찰과 같은 일련의 단계를 포함한다. 상기 과정은 RAD51 및 BRCA2를 필요로 하며 상동성 핵산은 전형적으로 이중 가닥이다. 달리 명시하지 않는 한, 일부 구현예에서 용어 "HDR"은 정규 HDR 및 대안적인 HDR을 포괄한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 절단은 뉴클레아제, 예를 들어, HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성 및 RuvC 유사 도메인, 예를 들어 N 말단 RuvC 유사 도메인과 관련된 절단 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, 야생형 Cas9에 의해 달성된다. 상기 구현예는 단일 gRNA만을 필요로 한다.
일부 구현예에서, 하나의 단일 가닥 파손 또는 닉은 닉카제 활성을 갖는 뉴클레아제 분자, 예를 들어, Cas9 닉카제에 의해 달성된다. 표적 부위의 닉 DNA는 대안적인 HDR을 위한 기질이 될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 단일 가닥 파손 또는 닉은, 뉴클레아제, 예를 들어, 닉카제 활성, 예를 들어 HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성 또는 N 말단 RuvC 유사 도메인과 관련된 절단 활성을 갖는 Cas9 분자에 의해 달성된다. 상기 구현예는 일반적으로 각각의 단일 가닥 파손의 배치를 위해 하나씩, 2 개의 gRNA를 필요로 한다. 일부 구현예에서, 닉카제 활성을 갖는 Cas9 분자는 gRNA가 혼성화하는 가닥을 절단하나 gRNA가 혼성화하는 가닥에 대해 상보적인 가닥은 절단하지 않는다. 일부 구현예에서, 닉카제 활성을 갖는 Cas9 분자는 gRNA가 혼성화하는 가닥을 절단하지 않고, 그보다 gRNA가 혼성화하는 가닥에 대해 상보적인 가닥을 절단한다. 일부 구현예에서, 닉카제는 HNH 활성, 예를 들어, 불활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, D10에서의 돌연변이, 예를 들어, D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자를 갖는다. D10A는 RuvC를 불활성화하고; 따라서, Cas9 닉카제는 HNH 활성(만)을 가지며 gRNA가 혼성화하는 가닥(예를 들어, 그것에 NGG PAM이 없는 상보적 가닥)을 절단할 것이다. 일부 구현예에서, H840, 예를 들어, H840A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자는 닉카제로서 사용될 수 있다. H840A는 HNH를 불활성화하고; 따라서, Cas9 닉카제는 RuvC 활성(만)을 가지며 비상보적인 가닥(예를 들어, NGG PAM을 갖는 가닥이고 이의 서열은 gRNA와 동일함)을 절단한다.
일부 구현예에서, Cas9 분자는 N-말단 RuvC 유사 도메인 닉카제이며, 예를 들어, Cas9 분자는 N863, 예를 들어, N863A에서 돌연변이를 포함한다.
닉카제와 2 개의 gRNA가 2 개의 단일 가닥 닉을 배치하는데 사용되는 일부 구현예에서, 하나의 닉은 표적 DNA의 + 가닥 상에 있고, 하나의 닉은 - 가닥 상에 있다. PAM은 바깥쪽으로 향하고 있다. gRNA는, gRNA가 약 0-50, 0-100 또는 0-200 개의 뉴클레오티드만큼 분리되도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 2 개의 gRNA의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열 사이에 중복이 없다. 일부 구현예에서, gRNA는 중복되지 않고, 50, 100 또는 200 개의 뉴클레오티드만큼 분리된다. 일부 구현예에서, 2 개의 gRNA의 사용은, 예를 들어, 표적 외 결합을 감소시킴으로써 특이성을 증가시킬 수 있다(Ran et al., Cell 2013).
일부 구현예에서, 단일 닉을 사용하여 HDR, 예를 들어 대안적인 HDR을 유도할 수 있다. 여기에서 단일 닉을 사용하여 주어진 절단 부위, 예를 들어 표적 부위에서 NHEJ에 대한 HR의 비율을 높일 수 있음이 고려된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 파손이 상기 gRNA의 표적화 도메인에 상보적인 표적 부위의 DNA 가닥에 형성된다. 다른 구현예에서, 단일 가닥 파손이, 상기 gRNA의 표적화 도메인에 상보적인 가닥이 아닌 표적 부위의 DNA 가닥에 형성된다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 어닐링(ingle strand annealing, SSA), 단일 가닥 파손 수선(single-stranded break repair, SSBR), 미스매치 수선(mismatch repair, MMR), 염기 절제 수선(base excision repair, BER), 뉴클레오티드 절제 수선(nucleotide excision repair, NER), 가닥 내 교차 연결(intrastrand cross-link, ICL), 손상 통과 합성(translesion synthesis, TLS), 무오류 사후 복제 수선(postreplication repair, PRR)과 같은 기타 DNA 수선 경로가 세포에 의해 이용되어 뉴클레아제에 의해 형성된 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손을 수선할 수 있다.
2. 유전자 파괴(예를 들어, DNA 가닥 파손)의 배치
표적화 통합은 게놈에 있는 특정 유전자 또는 유전자 좌로 통합된 전이 유전자를 초래한다. 전이 유전자는 게놈에서 표적 부위 또는 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나 또는 그 근처 어디에서나 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나 또는 그 근처에서, 예를 들어, 절단 부위의 상류 또는 하류에서 300, 250, 200, 150, 100, 50, 10, 5, 4, 3, 2, 1 개 이하의 염기쌍 이내, 예컨대 표적 부위의 어느 한쪽의 100, 50, 10, 5, 4, 3, 2, 1 개 염기쌍 이내, 예컨대 표적 부위의 어느 한쪽의 50, 10, 5, 4, 3, 2, 1 개 염기쌍 이내에서 통합된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자를 포함하는 통합 서열은 임의의 벡터 서열(예를 들어, 바이러스 벡터 서열)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 통합 서열은 벡터 서열(예를 들어, 바이러스 벡터 서열)의 일부를 포함한다.
가닥 중 하나에서 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손은, 원하는 영역에서 변경이 생성(예를 들어, 전이 유전자의 삽입 또는 돌연변이의 정정 발생)되도록 표적화된 통합을 위한 부위에 충분히 가까이 있어야 한다. 일부 구현예에서, 거리는 10, 25, 50, 100, 200, 300, 350, 400 또는 500 개의 뉴클레오티드 이내이다. 일부 구현예에서, 파손이 말단 절제 중에 엑소뉴클레아제 매개 제거되는 영역 내에 있도록 파손이 표적화된 통합을 위한 부위에 충분히 가까이 있어야 할 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은, 절단 이벤트, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손이 변경, 예를 들어 표적화된 삽입을 위한 부위가 될 바람직한 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 350, 400 또는 500 개의 뉴클레오티드 내에 위치하도록 구성된다. 파손, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은, 변경, 예를 들어 표적화된 삽입을 위한 부위가 될 바람직한 영역의 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 변경될 바람직한 영역 내, 예를 들어 2 개 이상의 돌연변이 뉴클레오티드에 의해 정의된 영역 내에 파손이 위치한다. 일부 구현예에서, 변경될 바람직한 영역에 바로 인접한, 예를 들어 표적화된 삽입을 위한 부위의 바로 상류 또는 하류에 파손이 위치한다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 파손은 제2 gRNA 분자에 의해 배치된 추가 단일 가닥 파손에 동반된다. 예를 들어, 표적화 도메인은, 절단 이벤트, 예를 들어, 2 개의 단일 가닥 파손이 표적화된 삽입을 위한 부위의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 350, 400 또는 500 개의 뉴클레오티드 내에 위치하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 gRNA 분자는 Cas9 닉카제를 안내할 때, 단일 가닥 파손이 원하는 영역의 변경을 초래하도록 서로 충분히 가깝고, 제2 gRNA에 의해 위치되고, 추가 단일 가닥 파손이 동반되도록 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 gRNA 분자는, 예를 들어, Cas9가 닉카제인 경우, 상기 제2 gRNA에 의해 위치된 단일 가닥 파손이 상기 제1 gRNA 분자에 의해 위치된 파손의 10, 20, 30, 40 또는 50 개 뉴클레오티드 내에 존재하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 2 개의 gRNA 분자는, 예를 들어, 본질적으로 이중 가닥 파손을 모방한, 상이한 가닥 상에 동일한 위치 또는 서로 몇 개의 뉴클레오티드 이내에 절단이 위치하도록 구성된다.
gRNA(단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA) 및 Cas9 뉴클레아제가 HDR 매개 전이 유전자의 삽입 또는 정정을 유도하기 위한 목적으로 이중 가닥 파손을 유도하는 일부 구현예에서, 절단 부위는 표적화된 통합을 위한 부위에서 0-200 bp(예를 들어, 0-175, 0 내지 150, 0 내지 125, 0 내지 100, 0 내지 75, 0 내지 50, 0 내지 25, 25 내지 200, 25 내지 175, 25 내지 150, 25 내지 125, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 200, 50 내지 175, 50 내지 150, 50 내지 125, 50 내지 100, 50 내지 75, 75 내지 200, 75 내지 175, 75 내지 150, 75 내지 125, 75 내지 100 bp) 떨어져 있다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 표적화된 통합을 위한 부위에서 0-100 bp(예를 들어, 0 내지 75, 0 내지 50, 0 내지 25, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 100, 50 내지 75 또는 75 내지 100 bp) 떨어져 있다.
일부 구현예에서, 오버행을 갖는 파손을 생성하기 위해 닉카제를 사용함으로써 HDR을 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행의 단일 가닥 특성은 예를 들어 NHEJ와는 반대로 세포가 HDR에 의한 파손을 수선할 가능성을 향상시킬 수 있다.
구체적으로, 일부 구현예에서, HDR은 제1 표적 부위에 대해 제1 닉카제를 표적화하는 제1 gRNA 및 제1 표적 부위로부터 반대 DNA 가닥 상에 있고 제1 닉을 상쇄하는, 제2 표적 부위에 대해 제2 닉카제를 표적화하는 제2 gRNA를 선택함으로서 촉진된다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 절단 이벤트가 미리 선택된 뉴클레오티드, 예를 들어, 코딩 영역의 뉴클레오티드로부터 충분히 멀리 떨어져 위치하도록 구성되어 뉴클레오티드가 변경되지 않는다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 인트론의 절단 이벤트가 인트론/엑손 경계 또는 자연적으로 발생하는 스플라이스 신호로부터 충분히 멀리 떨어져 위치하도록 구성되어 엑손 서열의 변경 또는 원하지 않는 스플라이스 이벤트를 방지한다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 초기 엑손에 위치하도록 구성되어, 내인성 유전자의 결실 또는 녹아웃을 허용하고/거나 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나 또는 그 근처에서 전이 유전자의 인-프레임 통합을 허용한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 파손은 제2 gRNA 분자에 의해 위치된, 추가 이중 가닥 파손을 동반할 수 있다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 파손은 제2 gRNA 분자 및 제3 gRNA 분자에 의해 위치된, 2개의 추가 단일 가닥 파손을 동반할 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA는, 표적화된 통합을 위한 부위의 양쪽 모두에 이중 가닥 파손이 위치하도록 구성된다.
3. 주형 폴리뉴클레오티드
내인성 DNA에서 하나 이상의 표적 부위(들) 또는 그 근처 서열과 상동성을 갖는 주형 폴리뉴클레오티드를 사용하여 표적 DNA의 구조를 변경, 예를 들어, 전이 유전자의 표적화된 삽입을 할 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 삽입을 위해 전이 유전자, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열 측면에 상동성 서열(예를 들어, 상동성 암)을 함유한다. 일부 구현예에서, 상동성 서열은 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌 중 하나 이상에서 전이 유전자를 표적화한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 상동성 암 사이에 추가 서열(코딩 또는 비코딩 서열), 예컨대 조절 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서, 스플라이스 공여체 및/또는 수용체 부위, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 리보솜 건너뛰기 요소(예를 들어, 2A 펩티드)를 암호화하는 서열, 마커 및/또는 SA 부위 및/또는 하나 이상의 추가 전이 유전자를 포함한다.
주형 폴리뉴클레오티드에서 관심 서열은 프로모터가 있거나 없는 기능성 폴리펩티드(예를 들어, cDNA)를 암호화하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드에 함유된 전이 유전자는 세포 표면 수용체(예를 들어, 재조합 수용체) 또는 이의 사슬, 항체, 항원, 효소, 성장 인자, 핵 수용체, 호르몬, 림포카인, 사이토카인, 리포터, 여기 기재된 것들 중 어느 하나의 기능성 단편 또는 기능성 변이체 및 조합물을 암호화하는 서열을 포함한다. 전이 유전자는 암 치료에 유용한 하나 이상의 단백질, 예를 들어, 하나 이상의 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 섹션 IV에 기재된 임의의 재조합 수용체 또는 이의 임의의 사슬, 영역 및/또는 도메인을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 재조합 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 임의의 사슬, 영역 및/또는 도메인을 암호화한다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체, 예를 들어, 재조합 TCR 또는 이의 사슬의 단편 및/또는 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하고/거나 포함한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 내인성 수용체, 예를 들어, 내인성 TCR 유전자를 암호화하는 유전자, 유전자 좌 또는 오픈 리딩 프레임 내에 있는 표적 부위(들)에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 완전한, 전체의 및/또는 전장 재조합 수용체를 암호화하는 코딩 서열을 초래하도록 유전자의 유전자 좌 내에서 인프레임 통합을 위해 표적화된다.
특정 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 가변 도메인 및 하나 이상의 불변 도메인을 함유하는 재조합 TCR 또는 이의 사슬인 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자, 전이 유전자의 일부 및/또는 핵산을 포함하거나 함유한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 재조합 TCR 불변 도메인은 내인성 TCR 불변 도메인에 대해 완벽한 예를 들어, (약) 100% 동일성을 공유한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 불변 도메인을 포함하지 않는 재조합 TCR의 일부 및/또는 단편을 암호화하고, 전이 유전자는 내인성 TCR 불변 도메인을 암호화하는 서열, 예를 들어 게놈 DNA 서열과 인프레임으로 통합된다. 특정 구현예에서, 통합은 완전한, 전체의 및/또는 전장 재조합 TCR 또는 이의 사슬을 암호화하는 코딩 서열을 초래한다. 일부 구현예에서, 코딩 서열은 TCR 또는 이의 사슬의 일부 또는 단편을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 내인성 TCR 불변 도메인을 암호화하는 내인성 서열을 함유한다.
특정 구현예에서, 재조합 TCR 또는 이의 사슬은 내인성 TCR 불변 도메인의 전부 또는 일부 및/또는 단편에 대해, 완벽한 예를 들어, (약) 100% 동일성을 공유하는 하나 이상의 불변 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는, 불변 도메인의 일부 및/또는 단편, 예를 들어, 내인성 TCR 불변 도메인과 완전히 또는 부분적으로 동일한 불변 도메인의 일부 또는 단편을 포함하는 재조합 수용체의 일부 및/또는 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는, 상기 전이 유전자에 의해 암호화되지 않는 내인성 TCR 불변 도메인의 일부 및/또는 단편을 암호화하는 서열, 예를 들어 게놈 DNA 서열과 인프레임으로 통합된다. 특정 구현예에서, 통합은 완전한, 전체의 및/또는 전장 재조합 TCR 또는 이의 사슬을 암호화하고, TCR 불변 도메인의 내인성 일부 또는 단편을 암호화는 내인성 서열 및 전이 유전자 서열을 함유하는 코딩 서열을 초래한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 TCR 사슬의 일부를 암호화하고, 여기에서 상기 TCR 사슬의 일부는 천연 TCR 사슬 전장보다 더 짧다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 천연 TCRα 사슬, 예를 들어 인간 TCRα 사슬 전장보다 더 짧은 TCRα 사슬의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, TCRα 사슬의 일부는 TCRα 가변 도메인, 예를 들어 전장 TCRα 가변 도메인 및 TCRα 불변 도메인의 일부이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 TCR 가변 도메인 및 TCRα 불변 도메인을 암호화하는 전장 천연 뉴클레오티드 서열보다 짧은 TCRα 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이거나 이를 함유한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 TCRα 도메인을 암호화하는 유전자, 유전자 좌 또는 오픈 리딩 프레임의 4 개 미만의 엑손, 3 개의 전체 엑손, 3 개 미만의 엑손, 2 개의 전체 엑손, 2 개 미만의 엑손, 1 개의 엑손 또는 1 개 미만의 엑손이거나 이를 포함하는 TCRα 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다.
특정 구현예에서, 전이 유전자는 TCR 사슬의 일부, 예를 들어 TCRα 사슬의 일부 또는 TCRβ 사슬의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 TCR 불변 도메인의 일부, 예를 들어 TCRα 불변 도메인 또는 TCRβ 불변 도메인의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 특정 구현예에서, TCR 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 4,600 개의 뉴클레오티드, 4,500 개의 뉴클레오티드, 4,000 개의 뉴클레오티드, 3,500 개의 뉴클레오티드, 3,000 개의 뉴클레오티드, 2,500 개의 뉴클레오티드, 2,000 개의 뉴클레오티드, 1,800 개의 뉴클레오티드, 1,600 개의 뉴클레오티드, 1,500 개의 뉴클레오티드, 1,400 개의 뉴클레오티드, 1,300 개의 뉴클레오티드, 1,200 개의 뉴클레오티드, 1,100 개의 뉴클레오티드, 1,000 개의 뉴클레오티드, 800 개의 뉴클레오티드, 700 개의 뉴클레오티드, 600 개의 뉴클레오티드, 500 개의 뉴클레오티드, 450 개의 뉴클레오티드, 400 개의 뉴클레오티드, 350 개의 뉴클레오티드, 300 개의 뉴클레오티드, 250 개의 뉴클레오티드, 200 개의 뉴클레오티드, 150 개의 뉴클레오티드, 100 개의 뉴클레오티드 또는 50 개의 뉴클레오티드 길이이거나 4,600 개의 뉴클레오티드, 4,500 개의 뉴클레오티드, 4,000 개의 뉴클레오티드, 3,500 개의 뉴클레오티드, 3,000 개의 뉴클레오티드, 2,500 개의 뉴클레오티드, 2,000 개의 뉴클레오티드, 1,800 개의 뉴클레오티드, 1,600 개의 뉴클레오티드, 1,500 개의 뉴클레오티드, 1,400 개의 뉴클레오티드, 1,300 개의 뉴클레오티드, 1,200 개의 뉴클레오티드, 1,100 개의 뉴클레오티드, 1,000 개의 뉴클레오티드, 800 개의 뉴클레오티드, 700 개의 뉴클레오티드, 600 개의 뉴클레오티드, 500 개의 뉴클레오티드, 450 개의 뉴클레오티드, 400 개의 뉴클레오티드, 350 개의 뉴클레오티드, 300 개의 뉴클레오티드, 250 개의 뉴클레오티드, 200 개의 뉴클레오티드, 150 개의 뉴클레오티드, 100 개의 뉴클레오티드 또는 50 개의 뉴클레오티드 길이보다 짧다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 서열 번호: 1, 2 또는 3에 제시된 핵산 서열의 전부 또는 일부에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 또는 이상의 서열 동일성을 갖는 서열의 (약) 4,600, 4,500, 4,000, 3,500, 3,000, 2,500, 2,000, 1,800, 1,600, 1,500, 1,400, 1,300, 1,200, 1,100, 1,000, 800, 700, 600, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 개 또는 4,600, 4,500, 4,000, 3,500, 3,000, 2,500, 2,000, 1,800, 1,600, 1,500, 1,400, 1,300, 1,200, 1,100, 1,000, 800, 700, 600, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 개 미만의 인접한 뉴클레오티드를 갖는 TCR 불변 도메인의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다.
특정 구현예에서, 전이 유전자는 천연 TCRβ 사슬, 예를 들어, 인간 TCRβ 사슬 전장보다 더 짧은 TCRβ 사슬의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, TCRβ 사슬의 일부는 TCRβ 가변 도메인, 예를 들어 TCRβ 가변 도메인 전장 및 TCRβ 불변 도메인의 일부이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 TCR 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 TCRβ 불변 도메인을 암호화하는 천연 뉴클레오티드 서열 전장보다 더 짧은 TCRβ 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부이거나 이를 함유한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 TCRβ 도메인을 암호화하는 유전자, 유전자 좌 또는 오픈 리딩 프레임의 4 개 미만의 엑손, 3 개의 전체 엑손, 3 개 미만의 엑손, 2 개의 전체 엑손, 2 개 미만의 엑손, 1 개의 엑손 또는 1 개 미만의 엑손이거나 이를 포함하는 TCRβ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다.
구현예 중 일부에서, 전이 유전자는 코돈 최적화된 TCRα 사슬의 일부 및/또는 TCRα 불변 도메인의 일부를 암호화하는 서열을 함유한다. 구현예 중 일부에서, 전이 유전자는 코돈 최적화된 TCRβ 사슬의 일부 및/또는 TCRβ 불변 도메인의 일부를 암호화하는 서열을 함유한다.
특정 구현예에서, 전이 유전자는 임의의 인트론, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 인트론 또는 이의 일부를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 TCRα 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 특정 구현예에서, TCRα 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 임의의 인트론 또는 이의 일부를 함유하지 않는다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 TCRβ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCRβ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 임의의 인트론을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 천연 또는 내인성 TCRα 사슬의 해당 부분에 대해 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 TCRα 사슬의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, TCRα 사슬의 일부는 해당 천연 또는 내인성 TCRα 사슬의 일부에 대해 (약) 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99% 초과 또는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99% 초과의 동일성이나 100% 미만의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 천연 또는 내인성 TCRα 불변 도메인의 해당 부분에 대해 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 TCRα 불변 도메인의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, TCRα 불변 도메인의 일부는 해당 천연 또는 내인성 TCRα 사슬의 일부에 대해 (약) 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99% 초과 또는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99% 초과의 동일성이지만 100% 미만의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다.
특정 구현예에서, 전이 유전자는 천연 또는 내인성 TCRβ 사슬의 해당 부분에 대해 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 TCRβ 사슬의 일부를 암호화한다. 특정 구현예에서, TCRβ 사슬의 일부는 해당 천연 또는 내인성 TCRα 사슬의 일부에 대해 (약) 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99% 초과 또는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99% 초과의 동일성이지만 100% 미만의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 천연 또는 내인성 TCRβ 불변 도메인의 해당 부분에 대해 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 TCRβ 불변 도메인의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, TCRβ 불변 도메인의 일부는 해당 천연 또는 내인성 TCRβ 사슬의 일부에 대해 (약) 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99% 초과 또는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99% 초과의 동일성이지만 100% 미만의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다.
특정 구현예에서, 전이 유전자는 하나 이상의 변형(들)을 함유하여 TCRα 사슬과 TCRβ 사슬 사이의 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 넘버링을 갖는 48 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 함유하는 TCRα 불변 도메인을 함유하는 TCRα 사슬의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 알파 불변 도메인의 일부는, TCRβ 사슬과 비천연 이황화물 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하면서, 서열 번호: 19 또는 24 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 이에 대해 (약) 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 TCRα 불변 도메인의 일부를 함유한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 넘버링을 갖는 57번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 함유하는 TCRβ 불변 도메인의 일부를 함유하는 TCRβ 사슬의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 알파 불변 도메인의 일부는, TCRα 사슬과 비천연 이황화물 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하면서, 서열 번호: 20, 21 또는 25 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 이에 대해 (약) 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 TCRα 불변 도메인의 일부를 함유한다.
특정 구현예에서, 전이 유전자는 하나 이상의 변형을 함유하는 TCRα 사슬 및/또는 TCRα 불변 도메인의 일부를 암호화하여 하나 이상의 이황화물 결합을 도입한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 하나 이상의 변형을 갖는 TCRα 사슬 및/또는 TCRα 불변 도메인의 일부를 암호화하여, 예를 들어, TCRα 및 베타 사슬 사이의 천연 이황화물 결합을 제거 또는 방지한다. 일부 구현예에서, 천연 사슬 간 이황화물 결합을 형성하고/거나 형성할 수 있는 하나 이상의 천연 시스테인은 다른 잔기, 예를 들어, 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 구현예에서, TCRα 사슬 및/또는 TCRα 불변 도메인의 일부가 변경되어 하나 이상의 비시스테인 잔기가 시스테인으로 교체된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비천연 시스테인 잔기는, 예를 들어, TCRβ 사슬과 비천연 이황화물 결합을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 24에 제시된 TCRα 불변 도메인의 넘버링을 참조하여 Thr48, Thr45, Tyr10, Thr45 및 Ser15 잔기 중 하나 이상에 시스테인이 도입된다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 20에 제시된 TCRβ 사슬의 넘버링을 참조하여 TCR β 사슬의 Ser57, Ser77, Ser17, Asp59, Glu15 잔기에 시스테인이 도입될 수 있다. TCR의 예시적인 비천연 이황화물 결합은 문헌[국제 출원 PCT 공개 번호 WO2006/000830, WO2006/037960 및 Kuball et al. (2007) Blood, 109:2331-2338]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 하나 이상의 변형을 함유하는 TCRα 사슬 및/또는 TCRα 불변 도메인의 일부를 암호화하여 하나 이상의 이황화물 결합을 도입한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 하나 이상의 변형을 갖는 TCRα 사슬 및/또는 TCRα 불변 도메인의 전부 또는 일부를 암호화하여, 예를 들어, 전이 유전자에 암호화된 TCRα 사슬과 내인성 TCRβ 사슬 사이의 천연 이황화물 결합을 제거 또는 방지한다. 일부 구현예에서, 천연 사슬 간 이황화물 결합을 형성하고/거나 형성할 수 있는 하나 이상의 천연 시스테인은 다른 잔기, 예를 들어, 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 구현예에서, TCRα 사슬 및/또는 TCRα 불변 도메인의 일부가 변경되어 하나 이상의 비시스테인 잔기가 시스테인으로 교체된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비천연 시스테인 잔기는, 예를 들어, 전이 유전자에 의해 암호화된 TCRβ 사슬과 비천연 이황화물 결합을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 하나 이상의 변형을 갖는 TCRβ 사슬 및/또는 TCRβ 불변 도메인의 전부 또는 일부를 암호화하여, 예를 들어, 전이 유전자에 의해 암호화된 TCRβ 사슬과 내인성 TCRα 사슬 사이의 천연 이황화물 결합을 제거 또는 방지한다. 일부 구현예에서, 천연 사슬 간 이황화물 결합을 형성하고/거나 형성할 수 있는 하나 이상의 천연 시스테인은 다른 잔기, 예를 들어, 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 구현예에서, TCRβ 사슬 및/또는 TCRβ 불변 도메인의 일부가 변경되어 하나 이상의 비시스테인 잔기가 시스테인으로 교체된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비천연 시스테인 잔기는, 예를 들어, 전이 유전자에 의해 암호화된 TCRα 사슬과 비천연 이황화물 결합을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상이한 주형 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 상이한 표적 부위에서 전이 유전자의 표적화 통합을 위해 사용된다. 상이한 표적 부위에서 표적화 통합을 위해, 하나 이상의 유전자 파괴(예를 들어, DNA 파손)가 하나 이상의 표적 부위에서 생성되고; 하나 이상의 상이한 상동성 서열이 각각의 표적 부위로 전이 유전자의 표적화 통합을 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 각 부위에 삽입된 전이 유전자는 동일하거나 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 각 부위에 삽입된 전이 유전자는 상이하다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 상이한 도메인 또는 단백질 사슬을 암호화하는 2 개 이상의 상이한 전이 유전자가 하나 이상의 표적 부위에 삽입된다. 일부 구현예에서, 재조합 TCR 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 재조합 TCR 중 하나의 사슬을 암호화하고, 제2 전이 유전자는 상기 재조합 TCR의 상이한 사슬을 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 TCR 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 재조합 TCR의 알파(α) 사슬을 암호화하고, 제2 전이 유전자는 재조합 TCR의 베타(β) 사슬을 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 상이한 도메인을 암호화하는 2개 이상의 전이 유전자는 2개 이상의 표적 부위에서 통합을 위해 표적화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 재조합 TCRα 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 TRAC 유전자 좌에서 통합을 위해 표적화되며, 재조합 TCRβ 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌에서 통합을 위해 표적화된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 부위는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌 중 하나 이상 또는 그 근처에 있다. 일부 구현예에서, 제1 표적 부위는 TRAC 유전자의 유전자 좌의 코딩 서열 또는 그 근처에 있고, 제2 표적 부위는 TRBC1 유전자의 유전자 좌의 코딩 서열 또는 그 근처에 있다. 일부 구현예에서, 제1 표적 부위는 TRAC 유전자의 유전자 좌의 코딩 서열 또는 그 근처에 있고, 제2 표적 부위는 TRBC2 유전자의 유전자 좌의 코딩 서열 또는 그 근처에 있다. 일부 구현예에서, 제1 표적 부위는 TRAC 유전자 유전자 좌의 코딩 서열 또는 그 근처에 있고, 제2 표적 부위는, 예를 들어, TRBC1 및 TRBC2 사이에 보존되는 서열에서 TRBC1 및 TRBC2 유전자 좌 둘 다의 코딩 서열 또는 그 근처에 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상이한 DNA 부위, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌가 표적화되고, 하나 이상의 전이 유전자가 각 부위에 삽입된다. 일부 구현예에서, 각 부위에 삽입된 전이 유전자는 동일하거나 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 각 부위에 삽입된 전이 유전자는 상이하다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 표적 부위 중 하나(예를 들어, TRAC 유전자 좌)에만 삽입되고, 다른 표적 부위는 유전자 편집(예를 들어, 녹아웃)을 위해 표적화된다.
일부 구현예에서, 여기에 기재된 어느 하나와 같이, 상동성 암의 길이 및 위치 및 표적 부위(들)에 대한 상대적인 위치 중 어느 하나는 또한 하나 이상의 제2 주형 폴리뉴클레오티드(들)에 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레아제-유도 HDR은 표적화된 삽입을 위한 전이 유전자의 발현을 위한 전이 유전자("외인성 서열(exogenous sequence)" 또는 "전이 유전자 서열(transgene sequence)"로도 명명)의 삽입을 초래한다. 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 전형적으로 그것이 배치된 게놈 서열과 동일하지 않다. 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 관심 위치에서 효율적인 HDR을 허용하도록 2개의 상동성 영역이 측면에 있는 비상동성 서열을 함유할 수 있다. 또한, 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 세포 염색질에서 관심 영역과 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 세포 염색질에 대해 여러 불연속적인 상동성 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 관심 영역에 정상적으로 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열은 전이 유전자에 존재할 수 있고 관심 영역의 서열에 대한 상동성 영역이 측면에 있을 수 있다.
삽입을 위한 폴리뉴클레오티드는 또한 "전이 유전자(transgene)" 또는 "외인성 서열(exogenous sequences)" 또는 "도너(donor)" 폴리뉴클레오티드 또는 분자로 지칭될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드는 DNA, 단일 가닥 및/또는 이중 가닥일 수 있으며 선형 또는 원형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 문헌[미국 특허 공개 번호 20100047805 및 20110207221]을 또한 참조한다. 주형 폴리뉴클레오티드는 또한 DNA 형태로 도입될 수 있으며, 이는 원형 또는 선형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되는 경우, 주형 폴리뉴클레오티드의 말단은 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 엑소뉴클레오리틱(exonucleolytic) 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 추가되고/거나 자기 상보성 올리고뉴클레오티드가 한쪽 또는 양쪽 말단에 결찰된다. 예를 들어, 문헌[Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 외인성 폴리뉴클레오티드를 분해로부터 보호하기 위한 추가 방법은 말단 아미노기(들)의 첨가 및 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오티드 내 연결의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이중 가닥 형태로 도입되는 경우, 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레아제 표적 부위(들), 예를 들어 세포의 게놈에 통합될 전이 유전자 측면에 있는 뉴클레아제 표적 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 20130326645]을 참조한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드는 길이가 1kb 초과, 예를 들어 2 내지 200kb, 2 내지 10kb(또는 이들 사이의 임의의 수치)의 서열(예를 들어, 코딩 서열, 전이 유전자로도 지칭)를 포함한다. 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어 하나 이상의 뉴클레아제 표적 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 한 쌍의 ZFN 또는 TALEN을 위한 2개 이상의 표적 부위를 포함한다. 전형적으로, 뉴클레아제 표적 부위는 전이 유전자 절단을 위해 전이 유전자 서열 외부에, 예를 들어 전이 유전자 서열에 대해 5' 및/또는 3'에 있다. 뉴클레아제 절단 부위(들)는 임의의 뉴클레아제(들)에 대한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드에 함유된 뉴클레아제 표적 부위(들)는 절단된 주형 폴리뉴클레오티드가 상동성-독립적 방법을 통해 통합되는 내인성 표적을 절단하는데 사용된 동일한 뉴클레아제(들)에 대한 것이다.
일부 구현예에서, 핵산 주형 시스템은 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 핵산 주형 시스템은 단일 가닥이다. 일부 구현예에서, 핵산 주형 시스템은 단일 가닥 부분 및 이중 가닥 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 5' 및 3' 말단 상에 상동성 서열("상동성 암(homology arm)"으로도 명명)이 측면에 있는 전이 유전자, 예를 들어, 재조합 수용체 암호화 핵산 서열을 함유하여 DNA 수선 기구, 예를 들어, 상동성 재조합 기구가 수선을 위한 주형으로 주형 폴리뉴클레오티드를 사용하게 하고, 게놈에 있는 통합의 표적 부위로 전이 유전자를 효과적으로 삽입한다. 상동성 암은, 예를 들어, 절제된 단일 가닥 오버행이 주형 폴리 뉴클레오티드 내에서 상보적 영역을 찾을 수 있도록 말단 절제가 발생할 수 있는 영역을 적어도 가능한 멀리 연장하여야 한다. 전체 길이는 플라스미드 크기 또는 바이러스 패키징 한계와 같은 파라미터에 의해 제한될 수 있다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 반복된 요소, 예를 들어 ALU 반복 또는 LINE 반복으로까지 확장되지 않는다.
예시적인 상동성 암 길이는 (약) 50, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000 또는 5000 개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 암 길이는 50-100, 100-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000 또는 4000-5000 개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암은 TCR의 일부, 예를 들어, 알파 또는 베타 TCR과 같은 TCR 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암은 전이 유전자와 인프레임으로 연결되거나 결합된다. 따라서, 일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암과 전이 유전자는 전이 유전자 단독으로 암호화된 TCR 사슬의 일부보다 더 큰 TCR 사슬의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암과 전이 유전자의 조합은 TCR 불변 도메인, 예를 들어 TCRα 또는 TCRβ 불변 도메인을 암호화하는 유전자, 유전자 좌 또는 오픈 리딩 프레임의 전체 엑손을 암호화한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암은 인트론, 예를 들어 TRAC, TRBC1 또는 TRBC2 인트론의 전부 또는 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 표적 부위("표적 위치(target position)", "표적 DNA 서열(target DNA sequence)" 또는 "표적 위치(target location)"로도 공지)는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어 Cas9 분자에 의해 변경된 표적 DNA(예를 들어, 염색체) 상의 부위를 지칭한다. 예를 들어, 표적 부위는 표적 부위에서 변경된 Cas9 분자의 DNA 절단 및 표적 부위에서 주형 폴리뉴클레오티드 지시 변경, 예를 들어 전이 유전자의 표적화된 삽입일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 하나 이상의 뉴클레오티드가 첨가되는 DNA 상에 2개의 뉴클레오티드, 예를 들어 인접한 뉴클레오티드 사이의 부위일 수 있다. 표적 부위는 주형 폴리뉴클레오티드에 의해 변경되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 표적 서열(예를 들어, gRNA가 결합하는 서열) 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 표적 서열(예를 들어, gRNA가 결합하는 서열)의 상류 또는 하류에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위의 각 측면 상에서 한 쌍의 단일 가닥 파손(예를 들어, 닉)이 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 내인성 유전자에서 표적 부위의 양쪽에 약 500 내지 1000, 예를 들어, 600 내지 900 또는 700 내지 800개의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 5', 표적 부위의 3' 또는 표적 부위의 5' 및 3' 둘 다에 약 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 특정 구현예에서, 표적 부위는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자, 유전자 좌 또는 오픈 리딩 프레임 내에 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 3'에 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000 개의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 3'에 약 100 내지 500, 200 내지 400 또는 250 내지 350 개의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 5'에 약 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15 또는 10 개 미만의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자, 유전자 좌 또는 오픈 리딩 프레임 내에 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 5'에 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000 개의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 5'에 약 100 내지 500, 200 내지 400 또는 250 내지 350 개의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 3'에 약 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15 또는 10 개 미만의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 특정 구현예에서, 표적 부위는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자, 유전자 좌 또는 오픈 리딩 프레임 내에 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 구조를 변경시키기 위해 유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제(들)와 함께 사용될 수 있는 핵산 서열에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 변경되어, 전형적으로 절단 부위(들) 또는 그 근처에 있는 주형 폴리뉴클레오티드의 서열 중 일부 또는 전부를 갖는다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 DNA, 예를 들어, 이중 가닥 DNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 DNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 Cas9 및 gRNA와 동일한 벡터 백본, 예를 들어, AAV 게놈, 플라스미드 DNA 상에 암호화된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 생체 내에서, 예를 들어 gRNA 인식 서열이 측면에 있는 벡터 백본으로부터 절제된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 Cas9 및 gRNA와 별도의 폴리뉴클레오티드 분자 상에 있다. 일부 구현예에서, Cas9 및 gRNA는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체의 형태로 도입되고, 주형 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 분자, 예를 들어 벡터로 도입된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 상동성 지시 수선 이벤트에 참여함으로써, 예를 들어, 전이 유전자의 삽입으로 표적 부위의 구조를 변경한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 서열을 변경한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에 의해 절단되는 표적 서열상 부위에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 도입할 수 있는 제1 제제로 절단되는 표적 서열 상 제1 부위, 유전자 파괴를 도입할 수 있는 제2 제제로 절단되는 표적 서열 상 제2 부위 및 둘 다에 상응하는 서열을 포함한다.
주형 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 [5' 상동성 암]-[전이 유전자]-[3' 상동성 암] 성분을 포함한다. 상동성 암은 염색체로의 재조합을 제공하고, 따라서 절단 부위, 예를 들어, 표적 부위(들) 또는 근처에서 DNA로 전이 유전자의 삽입을 제공한다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 가장 먼 절단 부위 측면에 있다.
일부 구현예에서, 5' 상동성 암의 3' 말단은 전이 유전자의 5' 말단 옆에 위치한다. 일부 구현예에서, 5' 상동성 암은 전이 유전자의 5' 말단으로부터 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000 개 또는 그 이상의 5' 뉴클레오티드까지 확장될 수 있다.
일부 구현예에서, 3' 상동성 암의 5' 말단은 전이 유전자의 3' 말단 옆에 위치한다. 일부 구현예에서, 3' 상동성 암은 전이 유전자의 3' 말단으로부터 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000개 이상의 3' 뉴클레오티드까지 확장될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화된 삽입을 위해, 상동성 암, 예를 들어, 5' 및 3' 상동성 암은 가장 먼 gRNA 측면에 있는 서열 중 약 1000개의 염기 쌍(bp)(예를 들어, 돌연변이 양쪽 서열의 1000 bp)을 각각 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 전이 유전자를 포함하는 하나 이상의 제2 주형 폴리뉴클레오티드가 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 하나 이상의 표적 부위 중 하나 또는 그 근처에서 통합을 위해 표적화된다.
일부 구현예에서, 제2 주형 폴리뉴클레오티드는 [제2 5' 상동성 암]-[하나 이상의 제2 전이 유전자]-[제2 3' 상동성 암] 구조를 포함한다. 상동성 암은 염색체로의 재조합을 제공하고, 따라서 절단 부위, 예를 들어, 표적 부위(들) 또는 근처에서 DNA로 전이 유전자의 삽입을 제공한다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 가장 먼 절단 부위 측면에 있다. 일부 구현예에서, 제2 5' 상동성 암 및 제2 3' 상동성 암은 하나 이상의 표적 부위 주변 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 5' 상동성 암은 표적 부위의 제2 5' 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 3' 상동성 암은 표적 부위의 제2 3' 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 5' 상동성 암 및 제2 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이상의 염기 쌍 또는 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 미만의 염기 쌍이다. 일부 구현예에서, 제2 5' 상동성 암 및 제2 3' 상동성 암은 독립적으로 약 50 내지 100, 100 내지 250, 250 내지 500, 500 내지 750, 750 내지 1000, 1000 내지 2000 개의 염기 쌍이다. 일부 구현예에서, 제2 5' 상동성 암 및 제2 3' 상동성 암은 독립적으로 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개의 염기 쌍이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 전이 유전자는 TRAC 유전자에 있는 표적 부위 또는 근처에서 통합을 위해 표적화된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 전이 유전자는 TRBC1 유전자 또는 TRBC2 유전자에 있는 표적 부위 또는 근처에서 통합을 위해 표적화된다.
여기에서 상동성 암 하나 또는 둘 다가 특정 서열 반복 요소, 예를 들어, Alu 반복 또는 LINE 요소를 포함하지 않도록 짧아질 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 서열 반복 요소를 피하기 위해 5' 상동성 암이 짧아질 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 반복 요소를 피하기 위해 3' 상동성 암이 짧아질 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' 상동성 암 둘 다는 특정 서열 반복 요소를 포함하지 않도록 짧아질 수 있다. 표적화된 삽입을 위한 주형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 단일 가닥 올리고디옥시뉴클레오티드(single-stranded oligodeoxynucleotide, ssODN)로서의 사용을 위해 설계될 수 있음이 여기서 고려된다. ssODN을 사용하는 경우, 5' 및 3' 상동성 암은 최대 약 200 염기 쌍(bp) 길이, 예를 들어, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 또는 200 bp 이상의 길이 범위일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 합성이 지속적으로 이루어지기 위한 개선으로서 ssODN에 대해 보다 긴 상동성 암이 또한 고려된다. 일부 구현예에서, 보다 긴 상동성 암은 화학 합성이 아닌 방법에 의해, 예를 들어, 긴 이중 가닥 핵산을 변성시키고 가닥 중 하나를 정제함으로써, 예를 들어, 고체 기질에 고정된 가닥 특이적 서열에 대한 친화도에 의해 제조된다.
일부 구현예에서, 대안적인 HDR은 주형 폴리뉴클레오티드가 표적 부위에 대해(즉, 표적 부위 가닥의 5' 방향으로) 연장된 5' 상동성을 가질 경우 보다 효율적으로 진행된다. 따라서, 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 보다 긴 상동성 암 및 보다 짧은 상동성 암을 가지며, 여기서 보다 긴 상동성 암이 표적 부위의 5'에 어닐링할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위에 대해 5'에서 어닐링할 수 있는 암은 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 또는 3' 말단으로부터 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 또는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000 개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 표적 부위에 대해 5'에서 어닐링할 수 있는 암은, 표적 부위에 대해 3'에서 어닐링할 수 있는 암보다 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 더 길다. 일부 구현예에서, 표적 부위에 대해 5'에서 어닐링할 수 있는 암은, 표적 부위에 대해 3'에서 어닐링할 수 있는 암보다 2x, 3x, 4x 또는 5x 이상 더 길다. ssDNA 주형이 손상되지 않은 가닥 또는 표적 부위 가닥에 어닐링할 수 있는지 여부에 따라, 표적 부위에 대해 5'에서 어닐링하는 상동성 암은 각각 ssDNA 주형의 5' 말단 또는 ssDNA 주형의 3' 말단이 될 수 있다.
유사하게, 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 5'상동성 암, 전이 유전자 및 3' 상동성 암을 가져서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 5'에 대해 연장된 상동성을 함유한다. 예를 들어, 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 실질적으로 동일한 길이일 수 있으나, 전이 유전자는 표적 부위의 3'보다 표적 부위의 5'에서 보다 멀리 연장될 수 있다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 표적 부위의 3' 말단보다 표적 부위의 5' 말단에 대해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 2x, 3x, 4x 또는 5x 이상 더 연장된다.
일부 구현예에서, 대안적인 HDR은 주형 폴리뉴클레오티드가 표적 부위 상에 집중될 때 보다 효율적으로 진행된다. 따라서, 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 동일한 크기의 2개의 상동성 암을 가지고 있다.
예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드의 제1 상동성 암은 주형 폴리뉴클레오티드의 제2 상동성 암의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이내의 길이를 가질 수 있다.
유사하게, 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 5'상동성 암, 전이 유전자 및 3' 상동성 암을 가져서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위의 양쪽에서 실질적으로 동일한 거리까지 연장된다. 예를 들어, 상동성 암은 상이한 길이를 가질 수 있으나, 이를 보상하도록 전이 유전자가 선택될 수 있다. 예를 들어, 전이 유전자는 표적 부위의 3'에서보다 표적 부위로부터 5'에서 더 연장될 수 있으나, 보상을 위해 표적 부위의 5' 상동성 암이 표적 부위의 3' 상동성 암보다 더 짧다. 반대도 가능하여, 예를 들어, 전이 유전자는 표적 부위의 5'에서보다 표적 부위로부터 3'에서 더 연장될 수 있으나, 보상을 위해 표적 부위의 3' 상동성 암이 표적 부위의 5' 상동성 암보다 더 짧다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 핵산이다. 다른 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 핵산이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 DNA에 추가되거나 표적 DNA에서 변화의 주형이 될 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위를 변경하는데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 DNA, 예를 들어, 표적 부위의 야생형 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
주형 폴리뉴클레오티드는 전이 유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 5' 상동성 암을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 핵산은 3' 상동성 암을 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 선형 이중 가닥 DNA이다. 길이는 예를 들어, 약 200-5000 염기 쌍, 예를 들어, 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000 개의 염기 쌍일 수 있다. 길이는 예를 들어, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000 개 이상의 염기 쌍일 수 있다. 일부 구현예에서, 길이는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000 개 이하의 염기 쌍이다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드는 약 160개의 염기 쌍, 예를 들어, 약 200-4000, 300-3500, 400-3000, 500-2500, 600-2000, 700-1900, 800-1800, 900-1700, 1000-1600, 1100-1500 또는 1200-1400 개의 염기 쌍 길이를 갖는다.
주형 폴리뉴클레오티드는 선형 단일 가닥 DNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 (i) 표적 DNA의 닉 가닥에 어닐링할 수 있는 선형 단일 가닥 DNA, (ii) 표적 DNA의 손상되지 않은 가닥에 어닐링할 수 있는 선형 단일 가닥 DNA, (iii) 표적 DNA의 전사 가닥에 어닐링할 수 있는 선형 단일 가닥 DNA, (iv) 표적 DNA의 비-전사 가닥에 어닐링할 수 있는 선형 단일 가닥 DNA 또는 상기 중 하나 이상이다.
길이는 예를 들어, 약 200-5000 염기 쌍, 예를 들어, 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000 개의 뉴클레오티드일 수 있다. 길이는 예를 들어, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000 개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 길이는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000 개 이하의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오티드는 약 160개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 약 200-4000, 300-3500, 400-3000, 500-2500, 600-2000, 700-1900, 800-1800, 900-1700, 1000-1600, 1100-1500 또는 1200-1400 개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 원형 이중 가닥 DNA, 예를 들어, 플라스미드이다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 양쪽에 약 500 내지 1000 개의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이상의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이내의 상동성 염기 쌍을 포함한다.
일부 구현예에서, 임의의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드의 길이는, 예를 들어, (약) 200-10000 개의 뉴클레오티드, 예를 들어, (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10000 개의 뉴클레오티드 또는 상기 중 임의의 사이의 수치일 수 있다. 일부 구현예에서, 길이는, 예를 들어, (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10000 개 이상의 뉴클레오티드 또는 상기 중 임의의 사이의 수치일 수 있다. 일부 구현예에서, 길이는, (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10000 개 이하의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 길이는 (약) 200-4000, 300-3500, 400-3000, 500-2500, 600-2000, 700-1900, 800-1800, 900-1700, 1000-1600, 1100-1500 또는 1200-1400 개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 (약) 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 7500, 8000, 9000 또는 10000 개 이상의 뉴클레오티드 길이이거나 또는 상기 중 임의의 사이의 임의의 수치다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 (약) 2500 내지 (약) 5000 개의 뉴클레오티드, (약) 3500 내지 (약) 4500 개의 뉴클레오티드 또는 (약) 3750 개의 뉴클레오티드 내지 (약) 4250 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 (약) 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 7500, 8000, 9000 또는 10000 개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 내인성 TRAC 유전자 좌(서열 번호: 1에 제시된 인간 TRAC 유전자 유전자 좌의 예시적인 뉴클레오티드 서열; NCBI 참조 서열: NG_001332.3, TRAC)를 표적화하기 위한 상동성 암을 함유한다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자 좌의 유전자 파괴는, 전사 시작 부위 바로 다음 서열, 코딩 서열의 첫 번째 엑손 내 또는 전사 시작 부위의 500bp 이내(예를 들어, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만) 또는 시작 코돈의 500 bp 이내(예를 들어, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만)를 포함하여, 유전자의 초기 코딩 영역에 도입된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 여기, 예를 들어 I.A. 섹션에 기재된 표적화된 뉴클레아제 및/또는 gRNA 중 어느 하나를 사용하여 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 뉴클레아제 및/또는 gRNA에 의해 도입된 유전자 파괴의 양쪽에 약 500 내지 1000, 예를 들어, 600 내지 900 또는 700 내지 800 개의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 약 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 염기 쌍의 5' 상동성 암 서열(이는 유전자 파괴(예를 들어, TRAC 유전자 좌)의 5' 서열의 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 개의 염기 쌍에 대해 상동성), 전이 유전자 및 약 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 염기 쌍의 3' 상동성 암 서열(이는 유전자 파괴(예를 들어, TRAC 유전자 좌)의 3' 서열의 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 개의 염기 쌍에 대해 상동성)을 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 내인성 TRBC1 또는 TRBC2 유전자 좌(서열 번호: 2에 제시된 인간 TRBC1 유전자 유전자 좌의 예시적인 뉴클레오티드 서열; NCBI 참조 서열: NG_001333.2, TRBC1; 서열 번호: 3에 제시된 인간 TRBC2 유전자 유전자 좌의 예시적인 뉴클레오티드 서열; NCBI 참조 서열: NG_001333.2, TRBC2)를 표적화하기 위한 상동성 암을 함유한다. 일부 구현예에서, TRBC1 또는 TRBC2 유전자 좌의 유전자 파괴는, 전사 시작 부위 바로 다음 서열, 코딩 서열의 첫 번째 엑손 내 또는 전사 시작 부위의 500bp 이내(예를 들어, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만) 또는 시작 코돈의 500 bp 이내(예를 들어, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만)를 포함하여, 유전자의 초기 코딩 영역에 도입된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 여기, 예를 들어 I.A. 섹션에 기재된 표적화된 뉴클레아제 및/또는 gRNA 중 어느 하나를 사용하여 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 뉴클레아제 및/또는 gRNA에 의해 도입된 유전자 파괴의 양쪽에 약 500 내지 1000, 예를 들어, 600 내지 900 또는 700 내지 800 개의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 약 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 개의 염기 쌍의 5' 상동성 암 서열(이는 유전자 파괴(예를 들어, TRBC1 또는 TRBC2 유전자 좌)의 5' 서열의 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 개의 염기 쌍에 대해 상동성), 전이 유전자 및 약 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 개의 염기 쌍의 3' 상동성 암 서열(이는 유전자 파괴(예를 들어, TRBC1 또는 TRBC2 유전자 좌)의 3' 서열의 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 개의 염기 쌍에 대해 상동성)을 포함한다.
일부 구현예에서, 여기에 기재된 어느 하나와 같이, 상동성 암의 길이 및 위치 및 표적 부위(들)에 대한 상대적인 위치 중 어느 하나는 또한 하나 이상의 제2 주형 폴리뉴클레오티드(들)에 적용될 수 있다.
일부 경우에, 주형 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 예를 들어, 표적 유전자 좌 또는 그 근처에 존재하지 않고/거나 외인성인 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 특정 세포 유형(예를 들어, T 세포 또는 B 세포 또는 NK 세포 특이적 프로모터)에서만 발현을 구동한다. 기능성 폴리펩티드 암호화 서열이 프로모터가 없는 일부 구현예에서, 이후 통합된 전이 유전자의 발현은 관심 영역에서 내인성 프로모터 또는 다른 제어 요소에 의해 구동된 전사에 의해 보장된다.
재조합 수용체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 이의 사슬을 암호하하는 전이 유전자 및/또는 하나 이상의 제2 전이 유전자를 포함한 전이 유전자는 이의 발현이 통합 부위의 내인성 프로모터, 즉 전이 유전자가 삽입된 내인성 유전자(예를 들어, TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2)의 발현을 구동하는 프로모터에 의해 구동되도록 삽입될 수 있다. 예를 들어, 전이 유전자의 코딩 서열은 프로모터 없이 내인성 표적 유전자의 코딩 서열과 인-프레임으로 삽입될 수 있어서, 통합된 전이 유전자의 발현은 통합 부위에서 내인성 프로모터의 전사에 의해 제어된다. 일부 구현예에서, 재조합 TCR 또는 이의 항원 결합 단편 또는 사슬을 암호화하는 전이 유전자 및/또는 하나 이상의 제2 전이 유전자는 독립적으로 표적 부위에 있는 유전자의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 2A 요소와 같은 리보솜 건너뛰기 요소/자기 절단 요소는 전이 유전자 코딩 서열의 상류에 배치되어, 리보솜 건너뛰기 요소/자기 절단 요소가 내인성 유전자와 인-프레임으로 배치된다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 TCRα 사슬 또는 이의 일부 및 TCRβ 사슬 또는 이의 일부를 갖는 TCR 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 TCRα 사슬 및 TCRβ 사슬은 링커 또는 스페이서 영역에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, TCRα 및 TCRβ 사슬을 연결하는 링커 서열이 포함되어 단일 폴리펩티드 가닥을 형성한다. 일부 구현예에서, 링커는 α 사슬의 C 말단과 β 사슬의 N 말단(또는 그 반대) 사이의 거리를 가로지르기에 충분한 길이인 반면, 링커 길이가 표적 펩티드 MHC 복합체에 대한 결합을 차단하거나 감소시킬 정도로 길지 않은 것을 또한 보장한다. 일부 구현예에서, 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩티드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 (약) 10 내지 45 개의 아미노산, 예컨대 10 내지 30 개의 아미노산 또는 26 내지 41 개의 아미노산 잔기, 예를 들어 29, 30, 31 또는 32 개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 화학식 -PGGG-(SGGGG)n-P-를 갖고, 여기서 n은 5 또는 6이고, P는 프롤린이고, G는 글리신이며 S는 세린이다(서열 번호: 22). 일부 구현예에서, 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS(서열 번호: 23)을 갖는다. 일부 구현예에서, TCRα 사슬 또는 이의 일부 및 TCRβ 사슬 또는 이의 일부 사이의 링커 또는 스페이서는 프로테아제에 의해 인식되고/거나 이에 의해 절단될 수 있다. 특정 구현예에서, TCRα 사슬 또는 이의 일부 및 TCRβ 사슬 또는 이의 일부 사이의 링커 또는 스페이서는 리보솜 건너뛰기 요소 또는 자기 절단 요소를 함유한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 [TCRβ 사슬]-[링커]-[TCRα 사슬의 일부] 구조이거나 이를 포함하는 뉴클레오티드 서열이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 [TCRβ 사슬]-[자기 절단 요소]-[TCRα 사슬의 일부] 구조이거나 이를 포함하는 뉴클레오티드 서열이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 [TCRβ 사슬]-[리보솜 건너뛰기 서열]-[TCRα 사슬의 일부] 구조이거나 이를 포함하는 뉴클레오티드 서열이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 [TCRα 사슬]-[링커]-[TCRβ 사슬의 일부] 구조이거나 이를 포함하는 뉴클레오티드 서열이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 [TCRα 사슬]-[자기 절단 요소]-[TCRβ 사슬의 일부] 구조이거나 이를 포함하는 뉴클레오티드 서열이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 [TCRα 사슬]-[리보솜 건너뛰기 서열]-[TCRβ 사슬의 일부] 구조이거나 이를 포함하는 뉴클레오티드 서열이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 구조는 5'에서 3' 방향으로 단일 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 가닥에 의해 암호화된다.
일부 경우에, T2A와 같은 리보솜 건너뛰기 요소/자기 절단 요소는 2A 요소의 C-말단에서 펩티드 결합의 합성을 리보솜이 건너뛰도록 유발(리보솜 건너뛰기)할 수 있어서, 2A 서열의 말단과 다음 펩티드 하류 사이의 분리로 이어진다(예를 들어, de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) 및 de Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004) 참조). 상기는 삽입된 전이 유전자가 통합 부위의 내인성 프로모터, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 프로모터의 전사에 의해 제어 가능하게 한다. 예시적인 리보솜 건너뛰기 요소/자기 절단 요소는 문헌[미국 특허 공개 번호 제20070116690호]에 기재된 바와 같은 구제역 바이러스(F2A, 예를 들어, 서열번호: 11), 말 비염 A 바이러스(E2A, 예를 들어, 서열번호: 10), 토세아 아시그나 바이러스(T2A, 예를 들어, 서열번호: 6 또는 7) 및 돼지 테스코 바이러스-1(P2A, 예를 들어, 서열번호: 8 또는 9) 유래 2A 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 전이 유전자, 예를 들어, 재조합 수용체 암호화 핵산의 상류에 P2A 리보솜 건너뛰기 요소(서열 번호: 8 또는 9에 제시된 서열)를 포함한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이거나 이를 포함한다. 예시적인 구성적 프로모터는 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 사이토메갈로바이러스 초기 직후 프로모터(CMV), 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 인간 신장 인자 1α 프로모터(EF1α), 마우스 포스포글리세레이트 키나제 1 프로모터(PGK) 및 CMV 초기 인핸서와 결합된 닭 β-액틴 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 구성적 프로모터는 합성 또는 변경된 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 MND 프로모터, 골수 증식 육종 바이러스 인핸서를 갖는 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터이거나 이를 포함한다(서열 번호: 18 또는 126에 제시된 서열; 문헌[Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2):748-755] 참조). 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 비바이러스 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터(서열 번호:4 또는 5에 제시된 서열) 또는 이의 변경된 형태(HTLV1 인핸서를 갖는 EF1α 프로모터; 서열 번호: 127에 제시된 서열) 또는 MND 프로모터(서열 번호:18 또는 126에 제시된 서열) 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 조절 요소, 예를 들어, 프로모터를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, "탠덤(tandem)" 카세트가 선택 부위로 통합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 "탠덤" 카세트는 하나 이상의 폴리펩티드 또는 인자를 암호화하며, 각각 독립적으로 조절 요소에 의해 제어되거나 모두가 다중시스트론 발현 시스템으로 제어된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드가 제1 및 제2 핵산 서열을 함유하는 것과 같이 상이한 폴리펩티드 사슬 각각을 암호화하는 코딩 서열은 동일하거나 상이할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 2개 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬의 발현을 구동하는 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 분자는 다중시스트론(이중시스트론 또는 삼중시스트론, 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 제6,060,273호] 참조)일 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 단위는 단일 프로모터로부터의 메시지에 의한 유전자 생성물의 공발현을 허용하는 IRES(내부 리보솜 진입 부위)를 함유하는 이중시스트론 단위로 조작될 수 있다. 대안적으로, 일부 경우에, 단일 프로모터는 여기 기재된 바와 같은 자기 절단 펩티드(예를 들어, 2A 서열) 또는 프로테아제 인식 부위(예를 들어, 푸린)를 암호화하는 서열에 의해 서로 분리된, 2 개 또는 3 개의 폴리펩티드를 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 함유하는 RNA의 발현을 지시할 수 있다. 따라서, ORF는 번역 동안(T2A의 경우) 또는 후에 개별적인 단백질로 프로세싱되는 단일 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, "탠덤 카세트(tandem cassette)"는 프로모터가 없는 서열 뒤에 전사 종결 서열을 포함하는 카세트의 제1 성분 및 자율식 발현 카세트 또는 다중시스트론 발현 서열을 암호화하는 제2 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 탠덤 카세트는 2 개 이상의 상이한 폴리펩티드 또는 인자, 예를 들어 재조합 수용체의 2 개 이상의 사슬 또는 도메인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 2 개 이상의 사슬 또는 도메인을 암호화하는 핵산 서열이 하나의 표적 DNA 통합 부위에 탠덤 발현 카세트 또는 이중 또는 다중 시스트론 카세트로서 도입된다.
전이 유전자가 내인성 유전자에 삽입될 수 있어서 내인성 유전자의 전부, 일부가 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는다. 일부 구현예에서, 전이 유전자(예를 들어, 펩티드 암호화 서열이 있거나 없는)는 임의의 내인성 유전자 좌로 통합된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자의 유전자 좌로 통합된다.
일부 구현예에서, 외인성 서열은 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 절연체, 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩티드 및/또는 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 또한, 관심 유전자의 제어 요소가 리포터 유전자에 작동 가능하게 연결되어 키메라 유전자(예를 들어, 리포터 발현 카세트)를 생성할 수 있다. 추가로, 스플라이스 수용체 서열이 포함될 수 있다. 공지된 예시적인 스플라이스 수용체 부위 서열은 예를 들어, CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG(서열 번호: 119, 인간 HBB 유전자 유래) 및 TTTCTCTCCACAG(서열 번호: 120, 인간 면역 글로불린-감마 유전자 유래)를 포함한다.
예시적인 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 TRAC 유전자 좌에서 표적화하기 위한 상동성 암, 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및 재조합 수용체, 예를 들어 TCR을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 예시적인 구현예에서, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌에서 표적화하기 위한 상동성 암, 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및 다른 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 추가 주형 폴리뉴클레오티드가 이용된다.
일부 구현예에서, 예시적인 주형 폴리뉴클레오티드는 내인성 표적 유전자의 유전자 좌(예를 들어, TRAC)로부터 재조합 TCR의 발현을 구동하기 위해 HTLV1 인핸서를 갖는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터(서열 번호: 127에 제시된 서열) 또는 MND 프로모터(서열 번호: 126에 제시된 서열)의 작동 가능한 제어 하에 또는 P2A 리보솜 건너뛰기 요소(서열 번호 : 8에 제시된 서열)를 암호화하는 핵산 서열에 연결된 재조합 T 세포 수용체를 암호화하는 전이 유전자, 인간 TCR α 불변 영역(TRAC) 유전자의 엑손 1에 있는 표적 통합 부위 주변 서열에 대해 상동성인 약 800 bp의 5' 상동성 암 서열(예를 들어, 서열 번호: 124에 제시), 약 800 bp의 3' 상동성 암 서열(예를 들어, 서열 번호: 125에 제시)을 함유한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 다른 핵산 서열, 예를 들어 마커, 예를 들어 표면 마커 또는 선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 더 함유한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터 서열, 예를 들어 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터 서열을 더 함유한다.
여기에 기재된 주형 폴리뉴클레오티드에 함유된 전이 유전자는 PCR과 같은 공지된 표준 기술을 사용하여 플라스미드, 세포 또는 기타 공급원으로부터 단리될 수 있다. 사용을 위한 주형 폴리뉴클레오티드는 원형 슈퍼코일(circular supercoiled), 원형 풀린(circular relaxed), 선형 등을 포함한 다양한 유형의 토폴로지(topology)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 이들은 표준 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 주형 폴리뉴클레오티드는 메틸화될 수 있거나 메틸화가 없을 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드는 세균 또는 효모 인공 염색체(BAC 또는 YAC)의 형태일 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 예를 들어 복제 기점, 프로모터 및 항생제 내성을 암호화하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 또한, 주형 폴리뉴클레오티드는 있는 그대로의 핵산으로, 리포솜, 나노입자 또는 폴록사머와 같은 물질과 복합체를 이룬 핵산으로 도입될 수 있거나 또는 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결함 렌티바이러스(integrase defective lentivirus, IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
다른 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 바이러스 및/또는 비바이러스 유전자 전달 방법에 의해 전달된다. 바람직한 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 통해 세포로 전달된다. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 및 이들의 조합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 AAV 벡터가 사용될 수 있다. 일부 경우에, AAV는 캡시드 혈청형과 비교하여 이종 혈청형의 LTR을 포함한다(예를 들어, AAV5, AAV6 또는 AAV8 캡시드를 갖는 AAV2 ITR). 주형 폴리뉴클레오티드는 뉴클레아제 전달에 사용된 것과 동일한 유전자 전달 시스템(동일한 벡터 포함)을 사용하여 전달될 수 있거나 뉴클레아제에 대해 사용된 상이한 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)를 사용하여 전달되고 뉴클레아제(들)는 mRNA 형태로 전달된다. 세포는 또한 바이러스 벡터(예를 들어, 뉴클레아제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 운반)를 전달하기 전, 동시에 및/또는 후에 여기 기재된 바와 같이 세포 표면 수용체에 바이러스 벡터의 결합을 억제하는 하나 이상의 분자로 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함되고, (약) 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 7500, 8000, 9000 또는 10000 개 이상 또는 상기 중 임의의 사이의 임의의 수치의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함되고, (약) 2500 내지 (약) 5000 개의 뉴클레오티드, (약) 3500 내지 (약) 4500 개의 뉴클레오티드 또는 (약) 3750 개의 뉴클레오티드 내지 (약) 4250 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함되고, (약) 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 7500, 8000, 9000 또는 10000 개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 아데노바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 벡터, 예를 들어 AAV 캡시드로 패키징될 수 있게 하는 길이 및 서열의 ssDNA 분자이다. 벡터는 예를 들어 5kb 미만일 수 있으며, 캡시드로의 패키징을 촉진하는 ITR 서열을 함유할 수 있다. 벡터는 통합 결함(integration-deficient)일 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 양쪽에 약 150 내지 1000 개의 상동성 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 약 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 최대 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 렌티바이러스 벡터, 예를 들어 IDLV(integration deficiency lentivirus, 통합 결함 렌티바이러스)이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 양쪽에 약 500 내지 1000 개의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 약 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이상의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5', 표적 부위 또는 전이 유전자의 3' 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5' 및 3' 둘 다에 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이내의 상동성 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 Cas9가 주형 폴리뉴클레오티드를 인식하고 절단하는 것을 방해하는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 침묵 돌연변이를 포함한다. 주형 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 변경될 세포의 게놈에서 상응하는 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30 개 이상의 침묵 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 변경될 세포의 게놈에서 상응하는 서열에 대해 최대 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 또는 50 개의 침묵 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, cDNA는 Cas9가 주형 폴리뉴클레오티드를 인식하고 절단하는 것을 방해하는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 침묵 돌연변이를 포함한다. 주형 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 변경될 세포의 게놈에서 상응하는 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30 개 이상의 침묵 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 변경될 세포의 게놈에서 상응하는 서열에 대해 최대 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 또는 50 개의 침묵 돌연변이를 포함한다.
여기에 기재된 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 비천연 염기 및/또는 백본을 포함할 수 있다. 특히, 메틸화된 시토신을 갖는 주형 폴리뉴클레오티드의 삽입이 여기 기재된 방법을 사용하여 수행되어 관심 영역에서 전사 정지 상태를 달성할 수 있다.
주형 폴리뉴클레오티드는 임의의 관심 전이 유전자(외인성 서열)를 포함할 수 있다. 예시적인 외인성 서열은 임의의 폴리펩티드 코딩 서열(예를 들어, cDNA 또는 이의 단편), 프로모터 서열, 인핸서 서열, 에피토프 태그, 마커 유전자, 절단 효소 인식 부위 및 다양한 유형의 발현 작제물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 마커 유전자는 항생제 내성(예를 들어, 암피실린 내성, 네오마이신 내성, G418 내성, 퓨로마이신 내성)을 매개하는 단백질을 암호화하는 서열, 유색 또는 형광 또는 발광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질, 강화 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시퍼라제) 및 강화된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질(예를 들어, 디하이드로폴레이트 환원 효소)을 암호화하는 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 에피토프 태그는, 예를 들어, FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 임의의 검출 가능한 아미노산 서열 중 하나 이상의 카피를 포함한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 항체, 항원, 효소, 수용체(세포 표면 또는 핵), 호르몬, 림포카인, 사이토카인, 리포터 폴리펩티드, 성장 인자 및 상기 중 어느 하나의 기능성 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 세포에서의 발현이 바람직한 임의의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 서열(전이 유전자)은 하나 이상의 재조합 수용체(들), 예를 들어, 기능성 비-TCR 항원 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR) 및 T 세포 수용체(TCR), 예컨대 전이 유전자 TCR, 조작된 TCR 또는 재조합 TCR 및 상기 중 어느 하나의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 코딩 서열은 예를 들어 cDNA일 수 있다. 외인성 서열은 또한 내인성 유전자 관심 서열과 연결하기 위한 전이 유전자의 단편일 수 있다. 예를 들어, 관심 유전자의 3' 말단 서열을 포함하는 전이 유전자의 단편이, 삽입 또는 교체를 통해, 내인성 유전자 서열의 3' 말단에 있는 돌연변이를 암호화하는 서열의 수정을 위해 이용될 수 있다. 유사하게, 단편은 상기 내인성 서열을 수정 또는 변경하기 위한 내인성 서열의 삽입/교체를 위한 내인성 유전자의 5' 말단과 유사한 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 단편은 융합 단백질을 생성하기 위해 내인성 유전자 서열에 대한 원위치 연결을 위한 관심 기능성 도메인(촉매, 분비 등)을 암호화할 수 있다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 하나 이상의 마커(들)를 더 암호화한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 마커(들)는 형질 도입 마커, 대리 마커 및/또는 선택 마커이다.
일부 구현예에서, 마커는 형질 도입 마커 또는 대리 마커이다. 형질 도입 마커 또는 대리 마커는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질 도입 마커는 세포의 변형을 나타내거나 확증할 수 있다. 일부 구현예에서, 대리 마커는 재조합 수용체, 예를 들어, TCR 또는 CAR과 함께 세포 표면 상에 공발현되도록 제조된 단백질이다. 특정 구현예에서, 상기 대리 마커는 거의 또는 전혀 활성을 갖지 않도록 변형된 표면 단백질이다. 특정 구현예에서, 대리 마커는 재조합 수용체를 암호화하는 동일한 폴리뉴클레오티드 상에 암호화된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 선택적으로 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 분리된 마커를 암호화하는 핵산 서열 또는 자기 절단 펩티드 또는 리보솜 건너뛰기를 야기하는 펩티드, 예컨대 2A 서열, 예컨대, T2A, P2A, E2A 또는 F2A를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 외인성 마커 유전자는 일부 경우에, 세포의 검출 또는 선택을 허용하도록 조작된 세포와 관련하여 사용될 수 있고, 일부 경우에 세포의 자살을 촉진하도록 조작된 세포와 관련하여 또한 사용될 수 있다.
예시적인 대리 마커는 세포 표면 폴리펩티드의 절단 형태, 예컨대 비기능적이며 전장 형태의 세포 표면 폴리펩티드에 의한 신호 또는 이에 의해 일반적으로 전달되는 신호를 전달할 수 없거나 전달하지 않고/거나 내재화될 수 없거나 내재화되지 않는 절단 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 절단형 세포 표면 폴리펩티드에는 성장 인자 또는 다른 수용체의 절단 형태, 예컨대 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 2(truncated human epidermal growth factor receptor 2, tHER2), 절단된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR, 서열 번호: 12 또는 13에 제시된 예시적인 tEGFR 서열) 또는 전립선 특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA) 또는 이의 변형된 형태가 포함된다. tEGFR은 항체 세툭시맙(Erbitux®) 또는 다른 치료용 항-EGFR 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 함유할 수 있으며, 이는 tEGFR 작제물 및 암호화된 외인성 단백질로 조작된 세포를 확인 또는 선택하기 위해 및/또는 암호화된 외인성 단백질을 발현하는 세포를 제거 또는 분리하기 위해 사용될 수 있다. 문헌[미국 특허 번호 8,802,374 및 Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434]을 참조한다. 일부 측면에서, 마커, 예를 들어, 대리 마커에는 CD34의 전부 또는 일부(예를 들어, 절단 형태), NGFR, CD19 또는 절단형 CD19, 예를 들어 절단형 비인간 CD19 또는 표피 성장 인자 수용체(예를 들어, tEGFR)가 포함된다. 일부 구현예에서, 마커는 형광 단백질, 예컨대 그린 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 강화된 그린 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 예컨대 슈퍼-폴드 GFP(super-fold GFP, sfGFP), 레드 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 예컨대 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 블루 그린 형광 단백질(blue green fluorescent protein, BFP), 강화된 블루 형광 단백질(enhanced blue fluorescent protein, EBFP) 및 옐로우 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP) 및 형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체 및 코돈-최적화된 및/또는 강화된 변이체를 포함한 이의 변이체이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커는 효소, 예컨대 루시퍼라제, 대장균 유래 lacZ 유전자, 알칼리 포스파타제, 분비 배아 알칼리 포스파타제(secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyl transferase, CAT)이거나 이를 포함한다. 예시적인 발광 리포터 유전자는 루시퍼라제(luciferase, luc), β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase, GUS) 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 외인성 제제 또는 약물에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 저항 유전자이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 포유류 세포에 대해 항생제 저항을 부여하는 항생제 저항 유전자이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 퓨로마이신 저항 유전자, 히그로마이신 저항 유전자, 블라스티사이딘 저항 유전자, 네오마이신 저항 유전자, 게네티신 저항 유전자 또는 제오신 저항 유전자 또는 이의 변형된 형태이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 마커를 암호화하는 핵산은 링커 서열, 예컨대 절단 가능한 링커 서열, 예를 들어 T2A를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 마커 및 선택적으로 링커 서열은 문헌[PCT 공개 번호 WO2014031687]에 개시된 어느 하나일 수 있다. 예를 들어, 마커는 링커 서열, 예컨대 T2A 절단 가능한 링커 서열에 선택적으로 연결된 절단형 EGFR(tEGFR)일 수 있다. 절단형 EGFR(예를 들어 tEGFR)에 대한 예시적인 폴리펩티드는 서열 번호: 12 또는 13에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 12 또는 13에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 분자, 예를 들어 T 세포에서 자연적으로 발견되지 않거나 또는 T 세포 표면에서 자연적으로 발견되지 않는 세포 표면 단백질 또는 이의 일부이다.
일부 구현예에서, 분자는 비자기 분자, 예를 들어 비자기 단백질, 즉 세포가 입양으로 전달될 숙주의 면역 시스템에 의해 "자기(self)"로 인식되지 않는 것이다.
일부 구현예에서, 마커는 치료 기능을 제공하지 않고/거나 유전자 조작, 예를 들어 성공적으로 조작된 세포를 선택하기 위한 마커로서 사용되는 것이 아닌 다른 효과를 생성하지 않는다. 기타 구현예에서, 마커는 치료적 분자 또는 달리 일부 원하는 효과를 나타내는 분자, 예컨대 생체 내에서 세포가 조우하게 될 리간드, 예컨대 입양 전달 및 리간드와의 조우 시 세포의 반응을 강화하고/거나 약화시키는 공자극 또는 면역 체크 포인트 분자일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 전이 유전자는 T2A 리보솜 건너뛰기 요소 및/또는 예를 들어, TCR의 하나의 사슬을 암호화하는 서열의 하류에 tEGFR과 같은 마커를 암호화하는 서열, 예컨대 서열 번호: 12 또는 13에 각각 제시된 서열 또는 서열 번호: 12 또는 13에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 T 세포의 기능을 지시하는 역할을 하는 재조합 수용체를 암호화한다. 예시적인 상기 암호화된 재조합 수용체에는 재조합 T 세포 수용체(TCR)가 포함된다. 일부 경우에, 키메라 항원 수용체(CAR)가 암호화된다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 세포 표면에 발현된 특정 분자 표적에 대해 면역 세포를 표적화하도록 설계된 분자이다. 가장 기본적인 형태로, 이들은 세포 외부에서 발현되는 특이성 도메인을 세포 내부의 신호 전달 경로에 연결하여 특이성 도메인이 표적과 상호 작용할 때 세포가 활성화되도록 세포에 도입된 수용체이다. 종종 CAR은 scFv 또는 일부 유형의 수용체와 같은 특이성 도메인이 TCR의 신호 전달 도메인에 융합되는 T 세포 수용체(TCR)의 변이체로 만들어진다. 이어서, 상기 작제물의 T 세포에의 도입은 표적 항원을 발현하는 세포의 존재하에 T 세포가 활성화되게 하고, 비-MHC 의존적 방식으로 활성화된 T 세포에 의한 표적 세포 공격을 초래한다(문헌[Chicaybam et at (2011) Int Rev Immunol 30:294-311] 참조). 대안적으로, CAR 발현 카세트가 후기 생착을 위해 면역 세포로 도입될 수 있어서 CAR 카세트는 T 세포 특이적 프로모터(예를 들어, FOXP3 프로모터, 문헌[Mantel et. Al (2006) J. Immunol 176: 3593-3602] 참조)의 제어 하에 존재한다.
예시적인 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 내인성 TRAC 유전자의 엑손 1에서 표적화하기 위한 재조합 TCR을 암호화하는 핵산 서열의 5' 및 3' 쪽에 각각 800 개의 염기쌍의 상동성 암이 측면에 있는, 구성적 프로모터의 제어 하에 재조합 TCRα 및 TCRβ 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 작제물에 포함된다. TRAC에서 표적화하기 위한 예시적인 5' 상동성 암은 서열 번호: 124에 제시된 서열을 포함한다. TRAC에서 표적화하기 위한 예시적인 3' 상동성 암은 서열 번호: 125에 제시된 서열을 포함한다.
본 명세서의 교시 후 상기 발현 카세트의 작제는 분자 생물학에서 공지된 방법론을 사용한다(예를 들어, Ausubel 또는 Maniatis 참조). 전이 유전자 동물을 생성하기 위해 발현 카세트를 사용하기 전에, 발현 카세트를 적절한 세포주(예를 들어, 1차 세포, 형질 전환된 세포 또는 불멸화된 세포주)에 도입하여 선택된 대조군 요소와 관련된 스트레스 유도제에 대한 발현 카세트의 반응성을 테스트할 수 있다.
비-코딩 핵산 서열의 표적화된 삽입도 달성될 수 있다. 안티센스 RNA, RNAi, shRNA 및 마이크로 RNA(miRNA)를 암호화하는 서열도 표적화된 삽입에 사용될 수 있다. 추가 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 추가 뉴클레아제 설계를 위한 특이적 표적 부위인 비-코딩 서열을 포함할 수 있다. 후속적으로, 추가 뉴클레아제가 세포에서 발현될 수 있어서, 다른 관심 주형 폴리뉴클레오티드의 삽입에 의해 원래의 주형 폴리뉴클레오티드가 절단되고 변경된다. 상기 방식으로, 특정 관심 유전자 좌, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자의 유전자 좌에서 특성 스태킹을 허용하는 주형 폴리뉴클레오티드의 반복적 통합이 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 [5' 상동성 암]-[전이 유전자 서열]-[3' 상동성 암] 구조를 함유한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 [5' 상동성 암]-[다중 시스트론 요소]-[전이 유전자 서열]-[3' 상동성 암] 구조를 함유한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 [5' 상동성 암]-[프로모터]-[전이 유전자 서열]-[3' 상동성 암] 구조를 함유한다.
4. 주형 폴리뉴클레오티드의 전달
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 키메라 수용체를 암호화하는 주형 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 형태, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로서 세포 내로 도입된다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유한다.
일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어, 뉴클레아제 및/또는 gRNA외에 조작을 위해 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드가 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드(들)는 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들)가 세포로 도입되기 전, 동시에 또는 후에 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드(들)는 제제와 동시에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제 전에, 예를 들어 제제 전 1 내지 60 분(또는 그 사이의 임의의 시간), 제제 전 1 내지 24 시간(또는 그 사이의 임의의 시간) 또는 제제 전 24 시간 이상을 포함 하나 이에 제한되지 않는 제제 전 수 초 내지 수 시간 내지 수 일에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제 전달 후 즉시, 예를 들어, 제제 전달 후 1 분 내지 4 시간, 예컨대 약 10 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 60 분, 90 분, 2 시간, 3 시간 또는 4 시간 및/또는 바람직하게는 제제 전달 후 4 시간 이내를 포함한, 제제 후 수 초 내지 수 시간 내지 수 일에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제 전달 4 시간 이상 후에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 제제 후 1 초 내지 60 분 이내(또는 그 사이의 임의의 시간), 제제 후 1 내지 4 시간 이내(또는 그 사이의 임의의 시간) 또는 제제 후 4 시간 이상을 포함하나 이에 제한되지 않고 제제 후에 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어, 뉴클레아제 및/또는 gRNA와 동일한 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어, 뉴클레아제 및/또는 gRNA와 상이한 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제(들)와 동시에 전달된다. 기타 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제(들)의 전달 전 또는 후, 상이한 시간에 전달된다. 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어, 뉴클레아제 및/또는 gRNA에서 핵산의 전달을 위해 여기에, 예를 들어 섹션 I.A.3, 예컨대 표 6 및 7에 기재된 임의의 전달 방법은 주형 폴리뉴클레오티드 전달에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드는 동일한 형식 또는 방법으로 전달된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드 둘 다는 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터에 포함된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 Cas9 및 gRNA와 동일한 벡터 백본, 예를 들어, AAV 게놈, 플라스미드 DNA 상에 암호화된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드는 상이한 형식, 예를 들어 Cas9-gRNA 제제에 대해 리보 핵산-단백질 복합체(RNP) 및 주형 폴리뉴클레오티드에 대해 선형 DNA 형식이나 이들은 동일한 방법을 사용하여 전달된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드는 상이한 형식인데, 예를 들어 Cas9-gRNA 제제에 대한 리보 핵산-단백질 복합체(RNP) 및 주형 폴리뉴클레오티드는 AAV 벡터에 함유되고, RNP는 물리적 전달 방법(예를 들어, 전기 천공)을 이용하여 전달되고, 주형 폴리뉴클레오티드는 AAV 바이러스 제제의 형질 도입을 통해 전달된다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제제(들)의 전달 직후, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60 분 이내에 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 선형 또는 원형 DNA 또는 선형 RNA와 같은 선형 또는 원형 핵산 분자이고, 핵산 분자를 세포로 전달하기 위해 여기 섹션 I.A.3에 기재된 임의의 방법(예를 들어, 표 6 및 7)을 사용하여 전달될 수 있다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 비바이러스 벡터로 또는 비바이러스 벡터 내 뉴클레오티드 형태로 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 비바이러스 벡터는 예컨대 미세 주입, 전기 천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어, 문헌[Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27]에 기재된 바와 같음), 지질 매개 형질 감염, 펩티드 매개 전달, 예를 들어, 세포-침투 펩티드 또는 이의 조합물로 제한되지 않는, 유전자 전달을 위한 임의의 적합한 및/또는 공지된 비바이러스 방법에 의한 형질 도입 및/또는 형질 감염에 적합한 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 비바이러스 폴리뉴클레오티드는 여기 표 7에 열거된 비바이러스 방법과 같이 여기에 기재된 비바이러스 방법에 의해 세포 내로 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA의 관심 영역과 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어, dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어, ssRNA 또는 dsRNA 바이러스)이다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스에는 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, 폭스바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 여기 다른 곳에 기재된 임의의 바이러스가 포함된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포 내로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터(예를 들어, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557 참조) 또는 HIV-1 유래 렌티바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(long terminal repeat sequence, LTR), 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수 증식 육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV), 뮤린 배아 줄기 세포 바이러스(murine embryonic stem cell virus, MESV), 뮤린 줄기 세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV), 비장 초점 형성 바이러스(spleen focus forming virus, SFFV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터를 갖는다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유류 세포 출처로부터 유래된 것을 포함한다. 레트로바이러스는 전형적으로 인간을 포함하여 몇몇 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미하는, 암포트로픽(amphotropic)이다. 일 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스의 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 문헌[예를 들어, 미국 특허 번호 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레아제는 동일한 벡터, 예를 들어 AAV 벡터(예를 들어, AAV6) 상에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 AAV 벡터를 사용하여 전달되고, 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어, 뉴클레아제 및/또는 gRNA는 상이한 형태, 예를 들어, 뉴클레아제 및/또는 gRNA를 암호화하는 mRNA로 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레아제는 예를 들어 바이러스 벡터이나 별개의 벡터로 동일한 유형의 방법을 사용하여 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제, 예를 들어, 뉴클레아제 및/또는 gRNA와 상이한 전달 시스템으로 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 생체 내에서, 예를 들어 gRNA 인식 서열이 측면에 있는 벡터 백본으로부터 절제된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 Cas9 및 gRNA와 별도의 폴리뉴클레오티드 분자 상에 있다. 일부 구현예에서, Cas9 및 gRNA는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체의 형태로 도입되고, 주형 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 분자, 예를 들어 벡터 또는 선형 핵산 분자, 예를 들어 선형 DNA로 도입된다. 전달을 위한 핵산 및 벡터 유형에는 여기 섹션 III에 기재된 것 중 어느 하나가 포함된다.
5. 유전자 변경 유전자 좌
일부 구현예에서, 여기에 제공된 방법, 조성물, 제조 물품 및/또는 키트는, 변경된 유전자의 유전자 좌를 갖거나 함유하는 유전자 조작된 세포, 예를 들어 유전자 조작된 면역 세포 및/또는 T 세포를 생성, 제조 또는 생산하는데 유용하다. 특정 구현예에서, 여기에 제공된 방법은 변경된 유전자의 유전자 좌를 갖거나 함유하는 유전자 조작된 세포를 초래한다. 특정 구현예에서, 변경된 유전자 좌는 전이 유전자, 예를 들어, 섹션 I.B에 기재된 전이 유전자 및 내인성 유전자의 오픈 리딩 프레임의 융합이거나 이를 함유한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 재조합 단백질의 일부를 암호화하고 내인성 유전자의 오픈 리딩 프레임에 인프레임으로 삽입되어 전체 재조합 단백질을 암호화하는 변경된 유전자 좌를 초래한다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질은 재조합 수용체이다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질은 재조합 TCR이다.
특정 구현예에서, 전이 유전자는 재조합 TCR의 일부를 암호화하고, TCR 불변 도메인을 암호화하는 내인성 오픈 리딩 프레임 내에 인프레임으로 삽입된다. 일부 구현예에서, 변경된 유전자 좌는 전체 재조합 TCR을 암호화한다. 특정 구현예에서, 암호화된 재조합 TCR의 일부는 전이 유전자에 존재하는 핵산 서열에 의해 암호화되고, 재조합 TCR의 나머지 부분은 내인성 유전자의 오픈 리딩 프레임에 존재하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 변경된 유전자 좌의 전사는 재조합 TCR을 암호화하는 mRNA를 초래한다. 특정 구현예에서, mRNA의 일부는 전이 유전자에 존재하는 핵산 서열로부터 전사되고, mRNA의 나머지 부분은 내인성 유전자의 오픈 리딩 프레임에 존재하는 핵산 서열로부터 전사된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 재조합 TCR의 나머지 부분을 암호화하는 오픈 리딩 프레임의 영역 또는 부분의 바로 상류에 있는 표적 부위에 및 이와 인프레임으로 통합된다.
일부 구현예에서, 변경된 유전자 좌에서 전사된 mRNA는 내인성 유전자에 의해 암호화되고/거나 내인성 유전자, 예를 들어 내인성 및/또는 비변경 TRAC 또는 TRBC 유전자에서 전사된 mRNA의 3'UTR과 동일한 3'UTR을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 TCR의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 상류, 예를 들어, 바로 상류에 리보솜 건너뛰기 요소를 함유한다. 특정 구현예에서, 변경된 유전자 좌의 전사는 재조합 TCR을 암호화하는 mRNA를 초래한다. 일부 구현예에서, 재조합 TCR을 암호화하는 mRNA는 내인성 유전자에 의해 암호화되고/거나 내인성 유전자, 예를 들어 내인성 및/또는 비변경 TRAC 또는 TRBC 유전자에서 전사된 mRNA의 5'UTR과 동일한 5'UTR을 함유한다.
특정 구현예에서, 변경된 유전자 좌는, 유전자 좌 예를 들어, 내인성 및/또는 천연 TCR을 암호화하는 내인성 또는 비변경 유전자 좌보다 인트론이 적은 재조합 TCR을 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 특정 구현예에서, 재조합 TCR을 암호화하는 핵산 서열은, 천연 및/또는 내인성 TCR을 암호화하는 비변경 유전자 좌, 예를 들어 내인성 유전자 좌 내 또는 이의 핵산 서열보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 개 이상 인트론이 더 적다. 특정 구현예에서, 재조합 TCR을 암호화하는 핵산 서열은 비변경 TRAC 유전자 좌보다 더 적은 인트론을 갖는다. 특정 구현예에서, 재조합 TCR을 암호화하는 핵산 서열은 비변경 TRBC 유전자 좌, 예를 들어 TRBC1 및/또는 TRBC2보다 더 적은 인트론을 갖는다.
특정 구현예에서, 변경된 유전자 좌는 재조합 TCR을 암호화하는 핵산 서열을 함유하고, 핵산 서열은 1 개 이상, 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상 또는 10 개 이상의 인트론을 함유한다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 1 개의 인트론을 함유한다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 2 개의 인트론을 함유한다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 3 개의 인트론을 함유한다. 일부 구현예에서, 인트론은 전이 유전자의 핵산 서열 내에 있지 않다.
일부 구현예에서, 변경된 유전자 좌는 변형된 TRAC 유전자 좌이다. 일부 구현예에서, 변형된 TRAC 유전자 좌는 전이 유전자 및 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 융합이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 변경된 유전자 좌는 완전한, 전체의 및/또는 전장 재조합 TCR 수용체를 암호화하고, 이의 일부는 전이 유전자, 예를 들어 전이 유전자 또는 전이 유전자 내의 핵산 서열에 의해 암호화되며, 이의 나머지 부분은 내인성 TRAC 유전자의 오픈 리딩 프레임, 예를 들어 내인성 TRAC 유전자의 오픈 리딩 프레임 내 또는 내인성 TRAC 유전자의 오픈 리딩 프레임 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 TCRα 사슬의 일부를 암호화하고, 오픈 리딩 프레임은 TCRα 사슬의 나머지 부분을 암호화한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 TCRβ 사슬 및 TCRα 사슬의 일부를 암호화하고, 오픈 리딩 프레임은 TCRα 사슬의 나머지 부분을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 TCRα 사슬의 가변 도메인을 암호화하고, 오픈 리딩 프레임은 TCRα 사슬의 불변 영역을 암호화한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 TCRα 사슬의 가변 도메인 및 TCRα 사슬의 불변 도메인의 일부를 암호화하고, 오픈 리딩 프레임은 TCRα 불변 도메인의 나머지 부분을 암호화한다.
일부 구현예에서, 변경된 유전자 좌는 변형된 TRBC 유전자 좌, 예를 들어 TRBC1 또는 TRBC2이다. 일부 구현예에서, 변형된 TRBC 유전자 좌는 전이 유전자 및 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 융합이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 변경된 유전자 좌는 완전한, 전체의 및/또는 전장 재조합 TCR 수용체를 암호화하고, 이의 일부는 전이 유전자, 예를 들어 전이 유전자 또는 전이 유전자 내의 핵산 서열에 의해 암호화되며, 이의 나머지 부분은 내인성 TRBC 유전자의 오픈 리딩 프레임, 예를 들어 내인성 TRAC 유전자의 오픈 리딩 프레임 내 또는 내인성 TRAC 유전자의 오픈 리딩 프레임 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 TCRβ 사슬의 일부를 암호화하고, 오픈 리딩 프레임은 TCRβ 사슬의 나머지 부분을 암호화한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 TCRα 사슬 및 TCRβ 사슬의 일부를 암호화하고, 오픈 리딩 프레임은 TCRβ 사슬의 나머지 부분을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 TCRβ 사슬의 가변 도메인을 암호화하고, 오픈 리딩 프레임은 TCRβ 사슬의 불변 영역을 암호화한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 TCRβ의 가변 도메인 및 TCRβ 사슬의 불변 도메인의 일부를 암호화하고, 오픈 리딩 프레임은 TCRβ 불변 도메인의 나머지 부분을 암호화한다.
일부 구현예에서, 변경된 유전자 좌에 의해 암호화된 재조합 TCR은 기능성 TCR이다. 일부 구현예에서, 변경된 유전자 좌에 의해 암호화된 재조합 TCR은 표적 항원에 결합하고/거나 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련, 이에 특이적 및/또는 이에서 발현된다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 종양 또는 암이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 종양 항원 또는 병원성 항원이다. 특정 구현예에서, 병원성 항원은 박테리아성 항원 또는 바이러스성 항원이다. 특정 구현예에서, 변형된 TRAC 유전자 좌에 의해 암호화된 TCRα 사슬은 TCRβ 사슬에 결합하고/거나 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 TRBC 유전자 좌, 예를 들어, TRBC1 또는 TRBC2 유전자 좌에 의해 암호화된 TCRβ 사슬은 TCRα 유전자 좌에 결합할 수 있다.
II. 핵산, 벡터 및 전달
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 재조합 수용체 및/또는 TCR을 암호화하는 주형 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드는, 뉴클레오티드 형태, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로서 세포 내에 도입된다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 및/또는 TCR을 암호화하는 전이 유전자를 함유한다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴를 위한 하나 이상의 제제(들)는 핵산 형태, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터로서 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 조작을 위한 성분은, 예를 들어, 섹션 I에 기재된 바와 같이, 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 다양한 전달 방법을 사용하여 다양한 형태로 전달될 수 있다. 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들) 중 하나 이상의 성분을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 핵산 분자) 및/또는 전이 유전자를 함유하는 하나 이상의 주형 폴리뉴클레오티드 및 전이 유전자의 표적화된 통합을 위한 유전자 조작 세포를 위한 벡터가 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 특정 게놈 표적 위치, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 유전자 좌에서 전이 유전자를 표적화하기 위한 주형 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구현예에서, 여기 예를 들어, 섹션 I.B에 기재된 임의의 주형 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 또는 기타 폴리펩티드 및/또는 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 전이 유전자 및 표적화된 통합을 위한 상동성 암을 함유한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 벡터에 함유될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제가 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 암호화될 수 있다. 일부 구현예에서, 제제의 성분, 예를 들어 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 암호화될 수 있고 세포로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 벡터에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 예를 들어, Cas9 분자 서열에 융합된 신호 펩티드(예를 들어, 핵 국소화, 핵인 국소화, 미토콘드리아 국소화를 위한)를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 Cas9 분자를 암호화하는 서열에 융합된 핵 국소화 서열(예를 들어, SV40 유래)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 조절/제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 컨센선스(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 2A 서열 및 스플라이스 수용체 또는 공여체가 벡터에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA pol I, pol II 또는 pol III 프로모터 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 II(예를 들어, CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터)에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 III(예를 들어, U6 또는 H1 프로모터)에 의해 인식된다.
특정 구현예에서, 프로모터는 조절 프로모터(예를 들어, 유도 가능 프로모터)이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도 가능 프로모터 또는 억제 가능 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 Lac 오퍼레이터 서열, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열, 갈락토오스 오퍼레이터 서열 또는 독시사이클린 오퍼레이터 서열을 포함하거나 또는 이의 유사체이거나 Lac 억제제 또는 테트라사이클린 억제제 또는 이의 유사체를 인식하거나 이와 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이거나 이를 포함한다. 예시적인 구성적 프로모터는 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 사이토메갈로바이러스 초기 직후 프로모터(CMV), 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 인간 신장 인자 1α 프로모터(EF1α), 마우스 포스포글리세레이트 키나제 1 프로모터(PGK) 및 CMV 초기 인핸서와 결합된 닭 β-액틴 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 구성적 프로모터는 합성 또는 변경된 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 MND 프로모터, 골수 증식 육종 바이러스 인핸서를 갖는 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터이거나 이를 포함한다(서열 번호: 18 또는 126에 제시된 서열; 문헌[Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2):748-755] 참조). 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 비바이러스 프로모터이다. 일부 구현예에서, 예시적인 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터(서열 번호:4 또는 5에 제시된 서열) 또는 이의 변형된 형태(HTLV1 인핸서를 갖는 EF1α 프로모터; 서열 번호: 127에 제시된 서열) 또는 MND 프로모터(서열 번호:18 또는 126에 제시된 서열)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터는 조절 요소, 예를 들어, 프로모터를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 재조합 수용체 및/또는 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 비바이러스 벡터로서 또는 비바이러스 벡터 내의 뉴클레오티드 형태로 세포 내에 도입된다. 일부 구현예에서, 비바이러스 벡터는 예컨대 미세 주입, 전기 천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어, 문헌[Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27]에 기재된 바와 같음), 지질 매개 형질 감염, 펩티드 매개 전달 또는 이의 조합물로 제한되지 않는, 유전자 전달을 위한 임의의 적합한 및/또는 공지된 비바이러스 방법에 의한 형질 도입 및/또는 형질 감염에 적합한 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 비바이러스 폴리뉴클레오티드는 표 7에 열거된 비바이러스 방법과 같이 여기에 기재된 비바이러스 방법에 의해 세포 내로 전달된다.
일부 구현예에서, 벡터 또는 전달 비히클은 바이러스 벡터(예를 들어, 재조합 바이러스의 생성을 위한)이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어, dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어, ssRNA 바이러스)이다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스에는 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, 폭스바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 여기 다른 곳에 기재된 임의의 바이러스가 포함된다.
일부 구현예에서, 바이러스는 분열 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 비분열 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 분열 및 비분열 세포 모두를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 숙주 게놈으로 통합될 수 있다. 다른 구현예에서, 바이러스는 예를 들어, 인간에서 면역을 감소시키도록 조작된다. 다른 구현예에서, 바이러스는 복제능력이 있다. 다른 구현예에서, 바이러스는 예를 들어 비리온 복제의 추가 라운드 및/또는 패키징에 필요한 유전자에 대한 하나 이상의 코딩 영역이 다른 유전자로 대체되었거나 결실된 복제 결함이다. 다른 구현예에서, 바이러스는 유전자 파괴의 일시적인 유도를 목적으로 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 일시적인 발현을 일으킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 오래 지속되는 예를 들어, 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년 또는 영구적인 발현을 일으킨다. 바이러스의 패키징 용량은, 예를 들어, 약 4 kb 이상 내지 약 30 kb 이상, 예를 들어, 약 5 kb, 10 kb, 15 kb, 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb, 45 kb 또는 50 kb 이상으로 다양할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 레트로바이러스에 의해 전달된다. 다른 구현예에서, 레트로바이러스(예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스)는 예를 들어, 숙주 게놈 내로의 통합을 허용하는 역전사 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 복제능력이 있다. 다른 구현예에서, 레트로바이러스는 예를 들어 비리온 복제의 추가 라운드 및 패키징에 필요한 유전자에 대한 하나 이상의 코딩 영역이 다른 유전자로 대체되었거나 결실된 복제 결함이다.
일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 렌티바이러스에 의해 전달된다. 예를 들어, 렌티바이러스는 예를 들어, 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 유전자를 포함하지 않는 복제 결함이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 HIV 유래 렌티바이러스이다.
일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 아데노바이러스에 의해 전달된다. 다른 구현예에서, 아데노바이러스는 인간에서 면역을 감소시키도록 조작된다.
일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 AAV에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, AAV는 숙주 세포, 예를 들어, 여기 기재된 바와 같이 표적 세포의 게놈에 자신의 게놈을 통합할 수 있다. 다른 구현예에서, AAV는 자기 상보적 아데노 관련 바이러스(self-complementary adeno-associated virus, scAAV), 예를 들어, 이중 가닥 DNA를 형성하기 위해 서로 어닐링하는 양쪽 가닥을 패키징하는 scAAV이다. 개시된 방법에 사용될 수 있는 AAV 혈청형에는 AAV1, AAV2, 변경된 AAV2 (예를 들어, Y444F, Y500F, Y730F 및/또는 S662V에서 변경), AAV3, 변경된 AAV3 (예를 들어, Y705F, Y731F 및/또는 T492V에서 변경), AAV4, AAV5, AAV6, 변경된 AAV6 (예를 들어, S663V 및/또는 T492V에서 변경), AAV7, AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV.rh10, 변경된 AAV.rh10, AAV.rh32/33, 변경된 AAV.rh32/33, AAV.rh43, 변경된 AAV.rh43, AAV.rh64R1, 변경된 AAV.rh64R1 및 위형(pseudotyped) AAV, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5가 포함되고, AAV2/6도 개시된 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 하이브리드 바이러스, 예를 들어 여기에 기재된 바이러스 중 하나 이상의 하이브리드에 의해 전달된다.
패키징 세포는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 사용된다. 상기 세포에는 아데노바이러스를 패키징할 수 있는 293 세포 및 레트로바이러스를 패키징할 수 있는 ø2 세포 또는 PA317 세포가 포함된다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터는 보통 핵산 벡터를 바이러스 입자로 패키징하는 생산자 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 또는 표적 세포로의 후속 통합(적용 가능한 경우)에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질, 예를 들어 Cas9를 암호화하는 발현 카세트로 대체된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 숙주 또는 표적 세포에서 패키징 및 유전자 발현에 필요한 AAV 게놈의 역말단 반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열만을 보유한다. 누락된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 이후 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap을 암호화하나 ITR 서열이 없는 헬퍼 플라스미드를 함유하는 세포주에서 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 벡터의 복제 및 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 부족으로 인해 상당한 양으로 패키징되지 않는다. 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열처리에 의해 아데노바이러스에 의한 오염을 줄일 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 인식 능력을 갖는다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 상이한/대안적인 바이러스 외피 당단백질로 위형화(pseudotyped); 세포 유형 특이적 수용체로 조작(예를 들어, 펩티드 리간드, 단일 사슬 항체, 성장 인자와 같은 표적화 리간드를 통합하도록 바이러스 외피 당단백질의 유전자 변경); 및/또는 하나의 말단이 바이러스 당 단백질을 인식하고 다른 하나의 말단이 표적 세포 표면의 모이어티를 인식하는 이중 특이성을 갖는 분자 가교를 갖도록 조작(예를 들어, 리간드-수용체, 단클론성 항체, 아비딘-비오틴 및 화학적 접합);될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 특이적 발현을 달성한다. 예를 들어, 조직 특이적 프로모터는 특정 표적 세포에서만 전이 유전자(Cas9 및 gRNA)의 발현을 제한하도록 작제될 수 있다. 벡터의 특이성은 또한 전이 유전자 발현의 마이크로 RNA 의존적 제어에 의해 매개될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 및 표적 세포막의 융합 효율이 증가되었다. 예를 들어, 융합 능력이 있는 혈구 응집소(hemagglutinin, HA)와 같은 융합 단백질이 세포로의 바이러스 흡수를 증가시키도록 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 핵 국소화 능력을 갖는다. 예를 들어, 핵막의 파괴를 필요로 하고(세포 분열 중) 따라서 비분열 세포를 감염시키지 않는 바이러스는 바이러스의 매트릭스 단백질에 핵 국소화 펩티드를 통합하도록 변경될 수 있고 이로써 비증식 세포로의 형질 도입이 가능하다.
III. 유전자 조작을 위한 세포
제공된 구현예 중 일부에서, 조작을 위한 세포는 T 세포와 같은 면역 세포이다. 하나 이상의 세포가 하나 이상의 내인성 TCR 유전자의 녹아웃 및 하나 이상의 내인성 TCR 유전자로 통합된 재조합 수용체 암호화 핵산 및/또는 다른 전이 유전자를 함유하는 유전자 조작된 세포 또는 세포 집단이 제공된다. 상기 세포 집단 또는 상기 세포의 조성물, 상기 세포를 함유하는 조성물 및/또는 제공된 방법을 사용하여 조작된 세포로 농축된 조성물이 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 조작을 위한 세포에는 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 가능성, 증폭, 재순환, 국소화 및/또는 지속성 용량, 항원 특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 구획에의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로필 및/또는 분화 정도에 의해 정의되는 것과 같은 이의 하위 집단과 같은 T 세포 또는 다른 세포 유형의 하나 이상의 하위세트가 포함된다. 치료될 대상체와 관련하여, 세포는 동종 이계 및/또는 자가 조직일 수 있다. 상기 방법 중에는 기성품 방법이 포함된다. 일부 측면에서, 예컨대 기성품 기술에 대해 세포는 다능성 및/또는 다분화능, 예컨대 줄기 세포, 예컨대 유도된 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 대상체로부터 세포를 단리하고, 세포를 제조, 프로세싱, 배양 및/또는 조작하고, 동결 보존 전 또는 후에 동일한 환자에게 세포를 재도입하는 것을 포함한다.
T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 하위-유형 및 하위 집단 중에는 나이브 T(na
ve T, TN) 세포, 이펙터 T 세포(effector T cell, TEFF), 기억 T 세포 및 이의 하위-유형, 예컨대 줄기 세포 기억 T(stem cell memory T, TSCM), 중앙 기억 T(central memory T, TCM), 이펙터 기억 T(effector memory T, TEM) 또는 말단 분화된 이펙터 기억 T 세포, 종양-침윤성 림프구(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포 독성 T 세포, 점막-관련 불변 T(mucosa-associated invariant T, MAIT) 세포, 천연 발생 및 적응성 조절 T(regulatory T, Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및 델타/감마 T 세포가 있다. 일부 구현예에서, 세포는 조절 T 세포(Treg)이다. 일부 구현예에서, 세포는 재조합 FOXP3 또는 이의 변이체를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하고 이로써 상기 핵산의 재조합 또는 유전자 조작된 생성물을 발현한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이종 기원이다, 즉 예를 들어, 조작된 세포 및/또는 상기 세포가 유래한 유기체에서 보통 발견되지 않는 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 것과 같이 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에는 정상적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 발생이 아니고, 예컨대 다수의 상이한 세포 유형으로부터 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합을 포함하는 것을 포함한, 자연계에서 발견되지 않는 핵산이다.
일부 구현예에서, 조작된 세포의 제조는 하나 이상의 배양 및/또는 제조 단계를 포함한다. 조작을 위한 세포는, 예를 들어, 대상체로부터 수득되거나 유래된 생물학적 샘플과 같은 샘플로부터 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 단리되는 대상체는 질병 또는 병태를 갖거나 세포 요법이 필요하거나 또는 세포 요법이 투여될 대상체이다. 일부 구현예에서 대상체는 세포가 단리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법과 같은 특정한 치료적 개입이 필요한 인간이다.
따라서, 일부 구현예에서 세포는 1차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 샘플에는 대상체로부터 직접 채취한 조직, 유체 및 기타 샘플뿐만 아니라 분리, 원심분리, 유전적 조작(예를 들어 바이러스 벡터로 형질 도입), 세척 및/또는 배양과 같은 하나 이상의 가공 단계에서 생성된 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 수득된 샘플 또는 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플에는 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플 (이로부터 유래된 가공 샘플 포함)이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 세포가 유래되거나 단리된 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나, 성분 채집술 또는 백혈구 성분 채집술 생성물이거나 이로부터 유래된다. 예시적인 샘플에는 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 내장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선 또는 기타 기관 및/또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 샘플은 세포 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법의 맥락에서 자가 및 동종이계 공급원으로부터의 샘플을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주, 예를 들어 T 세포주로부터 유래된다. 일부 구현예에서 세포는 이종성 공급원, 예를 들어 마우스, 랫트, 비인간 영장류 또는 돼지로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 세포의 단리는 하나 이상의 제조 및/또는 비친화성 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 예에서, 세포는 하나 이상의 시약의 존재 하에 세척, 원심 분리 및/또는 인큐베이션되어, 예를 들어 원치 않는 성분의 제거, 원하는 성분의 농축, 특정 시약에 민감한 세포를 용해시키거나 제거한다. 일부 예에서, 세포는 하나 이상의 특성, 예컨대 밀도, 부착 특성, 크기, 특정 성분에 대한 민감성 및/또는 저항성에 기초하여 분리된다.
일부 예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포는 예를 들어 성분 채집술 또는 백혈구 성분 채집술에 의해 수득된다. 일부 측면에서 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 핵 형성 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 포함한 림프구를 함유하고, 일부 측면에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 대상체로부터 수집된 혈액 세포는 세척되어, 예를 들어 혈장 분획을 제거하고 후속 가공 단계를 위한 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 배치한다. 일부 구현예에서, 세포는 인산 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 세척 용액에는 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 2가 양이온이 결여되어 있다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 반자동 "플로우-쓰루(flow-through)" 원심 분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)로 달성된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 접선 흐름 여과(tangential flow filtration, TFF)에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충액, 예를 들어 Ca++/Mg++이 없는 PBS에 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분이 제거되고 세포는 배양 배지에 직접 재현탁된다.
일부 구현예에서, 방법은 적혈구를 용해시켜 말초 혈액로부터 백혈구를 준비하고 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심 분리와 같은 밀도 기반 세포 분리 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리 방법은 표면 마커, 예를 들어, 표면 단백질, 세포 내 마커 또는 핵산과 같은 하나 이상의 특정 분자의 세포에서의 발현 또는 존재에 기초한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 마커에 기초한 분리를 위한 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리는 친화도- 또는 면역 친화도 기반 분리이다. 예를 들어, 일부 측면에서 단리는 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 세포의 발현 또는 발현 수준에 기초하여, 예를 들어 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션 후 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너와 결합하지 않은 세포로부터 항체 또는 결합 파트너와 결합한 세포의 분리에 의한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함한다.
상기 분리 단계는 시약에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 유지되는 양성 선택 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포가 유지되는 음성 선택에 기초할 수 있다. 일부 예에서 두 분획 모두 추가 사용을 위해 유지된다. 일부 측면에서, 음성 선택은 이질적인 집단에서 세포 유형을 특이하게 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우에 특히 유용할 수 있어서, 상기 분리는 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현된 마커에 기초하여 가장 잘 수행된다.
분리는 특정 마커를 발현하는 특정 세포 집단 또는 세포의 100% 농축 또는 제거를 초래할 필요가 없다. 예를 들어, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선택 또는 농축은 상기 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하나, 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 초래할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 상기 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 지칭하나, 상기 모든 세포의 완전한 제거를 초래할 필요는 없다.
일부 예에서, 여러 라운드의 분리 단계가 수행되고, 여기서 한 단계에서 양성 또는 음성 선택된 분획은 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계를 거친다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는 예컨대 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 배양함으로써 동시에 복수의 마커를 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있으며, 각각 음성 선택을 위해 표적화된 마커에 대해 특이적이다. 마찬가지로, 다중 세포 유형은 다양한 세포 유형에서 발현되는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 배양함으로써 동시에 양성 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 측면에서, T 세포의 특정 하위 집단, 예컨대 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포를 높은 수준으로 발현하거나 이에 양성인 세포가 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리된다.
예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 항-CD3/항-CD28 접합 자성 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)를 사용하여 양성 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 단리는 양성 선택에 의한 특정 세포 집단에 대한 농축 또는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택은 각각 양성 또는 음성 선택된 세포 상에서 상대적으로 보다 높은 수준으로 발현(마커고)되거나 발현된(마커+) 하나 이상의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 세포를 배양함으로써 달성된다.
일부 구현예에서, T 세포는 B 세포, 단핵구 또는 다른 백혈구, 예컨대 CD14와 같은 비-T 세포 상에서 발현되는 마커의 음성 선택에 의한 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리하기 위해 사용된다. 상기 CD4+ 및 CD8+ 집단은, 하나 이상의 나이브(naive), 기억 및/또는 이펙터 T 세포 하위 집단에서 상대적으로 보다 높은 정도로 발현되거나 발현된 마커에 대해 양성 또는 음성 선택에 의해 하위 집단으로 추가 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 또한 예컨대 각각의 하위 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해 나이브, 중앙 기억, 이펙터 기억 및/또는 중앙 기억 줄기 세포에 대해 농축되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포에 대한 농축은 효능을 증가시키기 위해, 예컨대 투여 후의 장기간 생존, 증폭 및/또는 생착을 개선하기 위해 수행되며, 이는 일부 측면에서 상기 하위 집단에서 특히 견고하다. 문헌[Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]을 참조한다. 일부 구현예에서, TCM-농축 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 결합하면 효능이 더욱 강화된다.
일부 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브세트 모두에 존재한다. PBMC는 예컨대 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하여 CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획에 대해 농축되거나 고갈될 수 있다.
일부 구현예에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포의 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 및/또는 CD127의 양성 또는 높은 표면 발현에 기초하고; 일부 측면에서, 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B를 발현하거나 높게 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기초한다. 일부 측면에서, TCM 세포에 대해 농축된 CD8+ 집단의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 일 측면에서, 중앙 메모리 T(TCM) 세포에 대한 농축은 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여 수행되며, 이는 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택, CD62L에 기초한 양성 선택이 적용된다. 일부 측면에서, 상기 선택은 동시에 수행되며, 다른 측면에서, 순차적으로, 어떠한 순서로든 수행된다. 일부 측면에서, CD8+ 세포 집단 또는 하위 집단을 제조하는데 사용된 동일한 CD4 발현 기반 선택 단계는 또한 CD4+ 세포 집단 또는 하위 집단을 생성하는데 사용되어, CD4 기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획 모두가 유지되고 선택적으로 하나 이상의 추가적인 양성 또는 음성 선택 단계 후에 상기 방법의 후속 단계에서 사용된다.
특정 예에서, PBMC 샘플 또는 다른 백혈구 샘플은 음성 및 양성 분획이 모두 유지되는 CD4+ 세포의 선택에 노출된다. 이어서 음성 분획은 CD14 및 CD45RA 또는 ROR1의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L 또는 CCR7과 같은 중앙 메모리 T 세포에 특징적인 마커에 기초한 양성 선택에 노출되고, 양성 및 음성 선택은 어느 순서로든 수행된다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 확인해서 나이브, 중앙 기억 및 이펙터 세포로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중앙 메모리 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
일 예에서, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단클론성 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위한 세포의 분리가 가능하도록 자성 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 및 세포 집단은 면역자성(또는 자성친화도) 분리 기술(Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In vitro and In vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ에서 검토됨)을 사용하여 분리되거나 단리된다.
일부 측면에서, 분리될 세포 샘플 또는 세포 조성물은 작고, 자화 가능 또는 자성 반응 물질, 예컨대 자성 반응 입자 또는 미세입자, 예컨대 상자성 비드(예를 들어, Dynalbeads 또는 MACS 비드)와 함께 인큐베이션된다. 자기 반응성 물질, 예를 들어 입자는 일반적으로 분리가 바람직한, 예를 들어 음성 또는 양성 선택이 바람직한 세포 또는 세포 집단에 존재하는 분자, 예를 들어 표면 마커에 특이적으로 결합하는 결합 파트너, 예를 들어 항체에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특정 결합 부재에 결합된 자성 반응성 물질을 포함한다. 자성 분리 방법에 사용되는 잘 알려진 많은 자성 반응성 재료가 있다. 적합한 자성 입자는 문헌[여기에 참조로 통합된 Molday, 미국 특허 번호 4,452,773 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B]에 기재된 것을 포함한다. 콜로이드 크기의 입자, 예컨대 문헌[Owen 미국 특허 번호 4,795,698 및 Liberti et al., 미국 특허 번호 5,200,084]에 기재된 것이 다른 예이다.
항체 또는 결합 파트너 또는 분자, 예컨대 자성 입자 또는 비드에 부착된 상기 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 다른 시약이 샘플 내의 세포에 존재하는 경우 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건하에서 인큐베이션이 일반적으로 수행된다.
일부 측면에서, 샘플은 자기장에 배치되고, 이에 부착된 자성 반응 또는 자화 가능 입자를 갖는 상기 세포는 자석에 끌리고 표지되지 않은 세포로부터 분리될 것이다. 양성 선택에 대해서는 자석에 끌린 세포가 유지되고; 음성 선택에 대해서는 끌리지 않은 세포(비표지 세포)가 유지된다. 일부 측면에서, 양성 및 음성 선택의 조합이 동일한 선택 단계 동안 수행되며, 양성 및 음성 분획은 유지되고 추가적으로 가공되거나 추가적인 분리 단계에 노출된다.
특정 구현예에서, 자성 반응 입자는 1차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘으로 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자는 하나 이상의 마커에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 특정 구현예에서, 비드보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지되고, 이어서 세포 유형 특이적 이차 항체- 또는 다른 결합 파트너(예를 들어, 스트렙타비딘)-코팅된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘 코팅된 자성 입자는 비오티닐화된 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 자성 반응 입자는 후속적인 인큐베이션, 배양 및/또는 조작될 세포에 부착되어 남아있고; 일부 측면에서, 상기 입자는 환자에게 투여하기 위한 세포에 부착되어 남아있다. 일부 구현예에서, 자화 가능 또는 자성 반응 입자는 세포로부터 제거된다. 세포에서 자화 가능 입자를 제거하는 방법은 공지되어 있고, 예를 들어 경쟁 비-표지 항체, 절단 가능 링커에 접합된 자화 가능 입자 또는 항체 등의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 자화 가능 입자는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 친화도 기반 선택은 자성 활성화 세포 분류(MACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 통한 것이다. 자성 활성화 세포 분류(MACS) 시스템은 이에 부착된 자화된 입자를 갖는 세포를 고순도로 선택할 수 있다. 특정 구현예에서, MACS는 외부 자기장의 적용 후에 비 표적 종 및 표적 종이 순차적으로 용리되는 모드로 작동한다. 즉, 자화 입자에 부착된 세포는 부착되지 않은 종이 용리되는 동안 제자리에 유지된다. 이어서, 상기 제1 용출 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되고 용리되는 것이 방지된 종은 이들이 용리 및 회수될 수 있도록 상당한 방식으로 해제된다. 특정 측면에서, 비표적 세포는 표지되고 이종 세포 집단으로부터 고갈된다.
특정 구현예에서, 단리 또는 분리는 상기 방법의 단리, 세포 제조, 분리, 가공, 인큐베이션, 배양 및/또는 제형화 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 디바이스 또는 장치를 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 시스템이 예를 들어 오류, 사용자 취급 및/또는 오염을 최소화하기 위해 폐쇄 또는 멸균 환경에서 상기 단계 각각을 수행하는데 사용된다. 일 예에서, 시스템은 문헌[국제 PCT 공개 번호 WO2009/072003 또는 미국 출원 20110003380 A1]에 기재된 바와 같은 시스템이다.
일부 구현예에서, 시스템 또는 장치는 통합되거나 독립적인 시스템 및/또는 자동화되거나 프로그램 가능한 방식으로 단리, 가공, 조작 및 제형화 단계 중 하나 이상, 예를 들어 모두를 수행한다. 일부 측면에서, 시스템 또는 장치는 사용자가 가공, 단리, 조작 및 제형화 단계의 결과를 프로그램, 제어, 평가 및/또는 가공, 단리, 조작 및 제형화 단계의 다양한 측면을 조정할 수 있도록 상기 시스템 또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
일부 측면에서, 분리 및/또는 다른 단계는 예를 들어 폐쇄 및 멸균 시스템에서 임상 규모 수준으로 세포의 자동 분리를 위해 CliniMACS 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 구성 요소에는 통합 마이크로 컴퓨터, 자기 분리 유닛, 연동 펌프 및 다양한 핀치 밸브가 포함될 수 있다. 일부 측면에서 통합 컴퓨터는 기기의 모든 구성 요소를 제어하고 시스템이 표준화된 순서로 반복된 절차를 수행하도록 지시한다. 일부 측면에서 자기 분리 유닛은 이동 가능한 영구 자석 및 선택 칼럼을 위한 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 튜빙 세트 전체의 유량을 제어하고 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충액의 흐름 제어와 세포의 지속적인 서스펜션을 보장한다.
일부 측면에서 CliniMACS 시스템은 멸균, 비발열성 용액으로 공급되는 항체 결합 자화 가능 입자를 사용한다. 일부 구현예에서, 자성 입자로 세포를 표지한 후 세포를 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 이어서, 세포 제조 백은 배관 세트에 연결되고, 이는 차례로 완충액을 함유하는 백 및 세포 수집 백에 연결된다. 배관 세트는 사전 컬럼 및 분리 컬럼을 포함한 사전 조립된 멸균 배관으로 구성되며 일회용이다. 분리 프로그램이 시작된 후, 시스템은 세포 샘플을 분리 컬럼에 자동으로 적용한다. 표지된 세포는 컬럼 내에 유지되는 반면, 표지되지 않은 세포는 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 여기에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되지 않고 칼럼에 유지되지 않는다. 일부 구현예에서, 여기에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고 칼럼에 유지된다. 일부 구현예에서, 여기에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 자기장을 제거한 후 칼럼으로부터 용리되고, 세포 수집 백 내에 수집된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 다른 단계는 CliniMACS Prodigy 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 일부 측면에서 CliniMACS Prodigy 시스템에는 원심 분리에 의해 세포의 자동 세척 및 세포의 분획화를 가능하게 하는 세포 가공 유닛이 구비되어 있다. CliniMACS Prodigy 시스템에는 공급원 세포 생성물의 거시적인 층을 식별하여 최적의 세포 분획화 종점을 결정하는 온보드 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어도 포함될 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액은 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 자동 분리될 수 있다. CliniMACS Prodigy 시스템에는 또한 예를 들어, 세포 분화 및 증폭, 항원 로딩 및 장기 세포 배양과 같은 세포 배양 프로토콜을 달성하는 통합 세포 배양 챔버가 포함될 수 있다. 입력 포트는 배지의 멸균 제거 및 보충을 가능하게 할 수 있고 통합 현미경을 사용하여 세포를 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82 및 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]을 참조한다.
일부 구현예에서, 여기에 기재된 세포 집단은 유동 세포 분석법을 통해 수집 및 농축(또는 고갈)되고, 여기서 다중 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포는 유체 스트림으로 운반된다. 일부 구현예에서, 여기에 기재된 세포 집단은 분취 규모(FACS) 분류를 통해 수집 및 농축(또는 고갈)된다. 특정 구현예에서, 여기에 기재된 세포 집단은 FACS 기반 검출 시스템과 조합된 미세전자기계 시스템(microelectromechanical system, MEMS) 칩을 사용하여 수집 및 농축(또는 고갈)된다(예를 들어, 문헌[국제 출원 WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; 및 Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376] 참조). 두 경우 모두, 세포는 고순도로 잘 정의된 T 세포 서브세트의 단리를 가능하게 하는 복수의 마커로 표지될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 하나 이상의 검출 가능한 마커로 표지되어, 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이하게 한다. 예를 들어, 분리는 형광 표지된 항체에 대한 결합에 기초할 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적인 항체 또는 다른 결합 파트너의 결합에 기초한 세포의 분리는 예를 들어 유동 세포 분석 검출 시스템과 조합하여 예컨대 분취 규모(FACS) 및/또는 미세전자기계 시스템(MEMS) 칩을 포함하는 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS)에 의해 유체 스트림에서 수행된다. 상기 방법은 복수의 마커에 기초하여 양성 및 음성 선택을 동시에 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 단리, 인큐베이션 및/또는 조작 전이든 후이든 세포를 동결, 예를 들어, 동결 보존하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어, 혈장 및 혈소판을 제거하기 위해 세척 단계 후에 동결 용액에 현탁된다. 일부 측면에서 공지된 다양한 동결 용액 및 파라미터 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 일 예는 20 % DMSO 및 8 % 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 PBS 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함한다. 이어서, 상기를 DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10 % 및 4 %가 되도록 배지로 1:1로 희석시킨다. 이어서 세포를 분당 1°의 속도로 -80 ℃까지 동결시키고 액체 질소 저장 탱크의 기상에서 저장한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 사육(cultivation), 인큐베이션, 배양 및/또는 유전적 조작 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 고갈된 세포 집단 및 배양-개시 조성물을 인큐베이션 및/또는 조작하는 방법이 제공된다.
따라서, 일부 구현예에서, 세포 집단은 배양-개시 조성물에서 인큐베이션된다. 인큐베이션 및/또는 조작은 배양 용기, 예컨대 유닛, 챔버, 웰, 컬럼, 튜브, 튜브 세트, 밸브, 바이알, 배양 접시, 백 또는 세포 배양 또는 육성을 위한 다른 컨테이너에서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작과 관련하여 또는 그 전에 인큐베이션 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양, 사육, 자극, 활성화 및/또는 번식을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에 인큐베이션된다. 상기 조건에는 집단에서 세포의 증식, 증폭, 활성화 및/또는 생존을 유도하고/거나, 항원 노출을 모방하고/거나 재조합 수용체, 예를 들어 재조합 TCR을 암호화하는 핵산의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 프라이밍하도록 설계된 것이 포함된다.
조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 제제에는 TCR 복합체의 세포 내 신호 전달 영역을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 제제, 예를 들어, 리간드가 포함된다. 일부 측면에서, 상기 제제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 켜거나 개시한다. 상기 제제는 항체, 예컨대 TCR에 특이적인 것, 예를 들어 항-CD3을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 공자극 수용체, 예를 들어 항-CD28을 자극할 수 있는 하나 이상의 제제, 예를 들어 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제 및/또는 리간드는 고체 지지체 예컨대 비드 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합될 수 있다. 선택적으로, 증폭 방법은 배양 배지에 항-CD3 및/또는 항 CD28 항체를 첨가(예를 들어 약 0.5 ng/ml 이상의 농도)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 제제는 IL-2, IL-15 및/또는 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, IL-2 농도는 약 10 유닛/mL 이상이다.
일부 측면에서, 인큐베이션은 예컨대 문헌[미국 특허 번호 6,040,1 77(Riddell et al.), Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 기재된 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, T 세포는 배양-개시 조성물 배양보조 세포, 예컨대 비분할 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 첨가하고(예를 들어, 생성된 세포 집단은 증폭될 초기 집단의 각각의 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40 이상의 PBMC 배양보조 세포를 함유); 상기 배양물을 인큐베이션(예를 들어 T 세포 수를 증폭하기에 충분한 시간 동안)하여 증폭된다. 일부 측면에서, 상기 비분할 배양보조 세포는 감마 조사된 PBMC 배양보조 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 PBMC는 약 3000 내지 3600 라드(rad) 범위의 감마선을 조사하여 세포 분열이 방지된다. 일부 측면에서, 상기 배양보조 세포는 T 세포 집단에 첨가하기 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예를 들어, 약 섭씨 25도 이상, 일반적으로 약 30도 이상 및 일반적으로 (약) 섭씨 37도를 포함한다. 선택적으로, 인큐베이션은 배양보조 세포로서 비분할 EBV 형질 전환 림프모구 세포(LCL)를 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 라드 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. 일부 측면에서 LCL 배양보조 세포는 임의의 적합한 양, 예컨대 약 10:1 이상의 LCL 배양보조 세포 대 초기 T 림프구의 비율로 제공된다.
일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포, 예컨대 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 항원으로 나이브 또는 항원 특이적 T 림프구를 자극하여 수득된다. 예를 들어, 항원 특이적 T 세포주 또는 클론은 감염된 대상체로부터 T 세포를 단리하고 같은 항원으로 시험관 내에서 세포를 자극함으로써 사이토메갈로바이러스 항원에 대해 생성될 수 있다.
유전자 조작 성분, 예를 들어, 유전자 파괴를 유도하는 제제 및/또는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR 또는 TCR을 암호화하는 핵산의 도입을 위한 다양한 방법이 공지되어 있고 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 방법에는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 비바이러스 벡터 또는 트랜스포손, 예를 들어 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포손 시스템을 통한 것을 포함하여 폴리펩티드 또는 수용체를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 방법이 포함된다. 유전자 전달 방법에는 형질 도입, 전기 천공 또는 세포로 유전자 전달을 초래하는 기타 방법 또는 섹션 I.A에 기재된 임의의 전달 방법이 포함될 수 있다. 재조합 생성물을 암호화하는 핵산 전달을 위한 기타 접근법 및 벡터에는 예를 들어, 문헌[국제 출원 WO2014055668 및 미국 특허 번호 제7,446,190호]에 기재된 것이 있다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전기 천공을 통해 T 세포로 전달된다(예를 들어, 문헌[Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437] 참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전위를 통해 T 세포로 전달된다(예를 들어, 문헌[Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126] 참조). 면역 세포에서 유전 물질을 도입하고 발현시키는 다른 방법은 인산칼슘 형질 감염(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에 기재된 바와 같음), 원형질체 융합, 양이온성 리포좀-매개 형질 감염; 텅스텐 입자 촉진 미세 입자 충격(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공침전(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 전달은 예를 들어, 활성화된 세포의 형질 도입 및 임상 적용에 충분한 수로 배양에서의 증폭 후에 사이토카인 또는 활성화 마커의 발현에 의해 측정된 바와 같이, 세포를 먼저 자극함으로써, 예컨대 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극과 조합하여 달성된다.
일부 상황에서, 자극 인자(예를 들어, 림포카인 또는 사이토카인)의 과발현이 대상체에서 독성과 관련된 인자와 같은 대상체에서 원하지 않는 결과 또는 보다 낮은 효능을 잠재적으로 초래할 수 있는 가능성으로부터 보호하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 상황에서, 조작된 세포는 예컨대 입양 면역 요법에 투여 시 생체 내에서 세포를 음성 선택에 취약하게 하는 유전자 분절을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 세포는 이들이 투여되는 환자의 생체 내 조건의 변화의 결과로서 제거될 수 있도록 조작된다. 음성 선택 가능한 표현형은 투여된 제제, 예를 들어 화합물에 대한 감수성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 초래될 수 있다. 음성 선택 가능한 유전자는 간시클로비르(ganciclovir) 감수성을 부여하는 헤르페스 심플렉스 바이러스 유형 I 티미딘 키나제(HSV-I TK) 유전자(Wigler et al., Cell 11:223, 1977); 세포성 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(hypoxanthine phosphribosyltransferase, HPRT) 유전자, 세포성 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(adenine phosphoribosyltransferase, APRT) 유전자, 세균성 시토신 디아미나제(Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992))를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포는 증폭 중 또는 후에 조작될 수 있다. 원하는 폴리펩티드 또는 수용체의 유전자 도입을 위한 상기 조작은 예를 들어 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다. 이어서 유전자 변경 세포 집단은 초기 자극(예를 들어, CD3/CD28 자극)으로부터 자유로울 수 있으며, 후속적으로 제2 유형의 자극(예를 들어, 새로이 도입된 수용체를 통해)으로 자극될 수 있다. 상기 제2 유형의 자극은 새로운 수용체의 프레임워크 내에서 직접 결합하는(예를 들어 수용체 내의 불변 영역을 인지함으로써) 유전자 도입된 수용체의 펩티드/MHC 분자, 즉 동종(교차 결합) 리간드(예를 들어 CAR의 천연 리간드) 또는 임의의 리간드(예컨대 항체) 형태의 항원 자극을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cheadle et al, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 또는 Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)]을 참조한다.
추가 핵산 중에서, 예를 들어 도입을 위한 유전자는 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진함으로써와 같은 치료의 효능을 개선하기 위한 유전자; 생체 내에서 생존 또는 국소화를 평가하기 위한 것과 같이 세포의 평가 및/또는 선택을 위한 유전자 마커를 제공하기 위한 유전자; 문헌[Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기재된 바와 같이 예를 들어 생체 내에서 음성 선택에 세포를 예민하게 만들어 안정성을 개선하기 위한 유전자가 있고; 또한 우성 양성 선택 가능한 마커를 음성 선택 가능한 마커와 융합시켜 유래된 2작용성 선택 가능 융합 유전자의 용도를 기술하는 문헌[국제 출원 공보 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601 by Lupton et al.]을 참조한다. 예를 들어, 문헌[Riddell et al., 미국 특허 번호 6,040,177의 14-17 열]을 참조한다.
일부 구현예에서, 여기에 기재된 바와 같이, 세포는 유전자 조작과 관련하여 또는 그 전에 인큐베이션 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양, 사육, 자극, 활성화, 번식 및/또는 보존을 위한 동결, 예를 들어, 동결 보존을 포함할 수 있다.
Ⅳ. 재조합 T 세포 수용체(TCR)
일부 구현예에서, 세포에 도입되는 재조합 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일부 구현예에서, 표적화된 통합을 위한 전이 유전자는 재조합 수용체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 사슬을 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 재조합 항원 수용체 또는 항원에 결합하는 재조합 수용체이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 재조합 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR)이다. 일부 측면에서, 재조합 TCR은 T 세포에 의해 암호화된 내인성 TCR과 상이하다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 방법, 제조 물품 및/또는 키트는 재조합 TCR 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 세포를 조작하는데 유용하다.
일부 구현예에서, 제공된 재조합 수용체, 예를 들어, TCR 또는 CAR은 암 또는 종양과 같은 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 연관, 이에 특이적 및/또는 이에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합 또는 인식하는 것과 같이 결합 또는 인식할 수 있다. 일부 측면에서, 항원은 펩티드의 형태이며, 예를 들어, 펩티드 항원 또는 펩티드 에피토프이다. 일부 구현예에서, 제공된 TCR은 주요 조직 적합성(MHC) 분자 상황의 펩티드인 항원에 특이적으로 결합하는 것과 같이 결합한다.
재조합 수용체가 항원, 예를 들어 펩티드 항원에 결합하거나 항원, 예를 들어 펩티드 항원에 특이적으로 결합한다는 관찰이 반드시 모든 종의 항원에 결합한다는 것을 의미하지는 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항원, 예를 들어 MHC 상황의 펩티드 항원에 결합하는 특성, 예컨대 이에 대해 특이적으로 결합하는 능력 및/또는 참조 결합 분자 또는 수용체와 이에 대해 결합하기 위해 경쟁하는 능력 및/또는 특정 친화도로 결합하는 능력 또는 특정 정도로 경쟁하는 능력은, 일부 구현예에서, 인간 항원에 관한 능력을 지칭하고 재조합 수용체는 다른 종, 예컨대 마우스 유래 항원에 관하여 상기 특성을 갖지 않을 수 있다. 일부 측면에서, 관련되지 않은 항원 또는 단백질, 예컨대 관련되지 않은 펩티드 항원에 대한 재조합 수용체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합 정도는, 예를 들어, 방사면역분석(radioimmunoassay, RIA), 펩티드 적정 분석 또는 리포터 분석에 의해 측정된 바와 같이 재조합 수용체 또는 이의 항원 결합 단편의 항원, 예를 들어, 같은 기원(cognate)의 항원에 대한 결합의 (약) 10 % 미만이다.
A. T 세포 수용체(TCR)
일부 구현예에서, "T 세포 수용체(T cell receptor)" 또는 "TCR"은 α 및 β 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ로도 공지) 또는 가변 γ 및 δ 사슬(각각 TCRγ 및 TCRδ로도 공지) 또는 이의 항원 결합 부분을 함유하는 분자이고 이는 MHC 분자에 결합된 항원, 예를 들어, 펩티드 항원 또는 펩티드 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태이다. 전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이를 발현하는 T 세포는 별개의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로 TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견되며, 이는 일반적으로 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원의 인식을 담당한다. 일부 구현예에서, TCR에 의해 특이적으로 결합 또는 인식되는 것과 같이 결합 또는 인식되는 항원은 펩티드이다. 일부 측면에서, TCR에 의해 특이적으로 결합 또는 인식되는 것과 같이 결합 또는 인식되는 펩티드는 항원 유래 펩티드이다. 일부 측면에서, TCR에 의해 결합 또는 인식된 "항원(antigen)"은 펩티드를 포함한다.
전형적으로, 예를 들어 MHC와의 복합체에서 펩티드 에피토프에 대한 재조합 수용체, 예를 들어 TCR의 특이적 결합은 하나 이상의 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)을 함유하는 항원 결합 부위의 존재에 의해 지배된다. 일반적으로, 특이적 결합은, 예를 들어 MHC와 복합체의 특정 펩티드 에피토프가 다른 분자와의 비특이적 결합 상호 작용이 또한 발생할 수 있기 때문에, MHC 펩티드 분자가 결합할 수 있는 유일한 것임을 의미하지 않는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, MHC 분자의 상황에서 펩티드에 대한 재조합 수용체의 결합은 상기 다른 분자, 예를 들어, MHC 분자의 상황에서 다른 펩티드 또는 MHC 분자의 상황에서 관련 없는(대조) 펩티드에 대한 결합보다 더 높은 친화도, 예컨대 상기 다른 분자에 대한 결합 친화도보다 약 2 배 이상, 약 10 배 이상, 약 20 배 이상, 약 50 배 이상 또는 약 100 배 이상 더 높다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 TCR은 다수의 공지된 스크리닝 평가 중 어느 하나를 사용하여 안전성 또는 표적 외 결합 활성에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 재조합 수용체, 예를 들어 TCR에 대한 면역 반응의 생성은 표적 펩티드 에피토프를 발현하지 않는 것으로 공지된 세포, 예컨대 정상 조직(들) 유래 세포, 하나 이상의 상이한 MHC 유형을 발현하는 동종 이계 세포주 또는 기타 조직 또는 세포 공급원의 존재 하에 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 또는 조직은 정상 세포 또는 조직을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포에 대한 결합은 2 차원 배양에서 테스트될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포에 대한 결합은 3 차원 배양에서 테스트될 수 있다. 일부 구현예에서, 대조군으로서, 조직 또는 세포는 표적 에피토프를 발현하는 것으로 공지된 것일 수 있다. 면역 반응은, 예컨대 T 세포와 같은 면역 세포의 활성화(예를 들어, 세포 독성 활성), 사이토카인(예를 들어, 인터페론 감마) 생성 또는 신호 전달 캐스케이드의 활성화를 평가함으로써, 예컨대 리포터 평가에 의해 직접 또는 간접적으로 평가될 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "TCR"은 전체 TCR뿐만 아니라 항원 결합 부분 또는 이의 항원 결합 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, TCR은 알파(α) 사슬 및 베타(β) 사슬을 함유하는 TCR과 같은 온전한 또는 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 전장 미만의 TCR이지만 MHC 펩티드 복합체에 결합하는 것과 같이 MHC 분자에 결합된 특정 펩티드에 결합하는 항원 결합 부분이다. 일부 경우에, TCR의 항원 결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 함유할 수 있으나, 그럼에도 전체 TCR이 결합하는 MHC 펩티드 복합체와 같은 펩티드 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 부분은 특정 MHC 펩티드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 도메인, 예컨대 TCR의 가변 α(Vα) 사슬 및 가변 β(Vβ) 사슬 또는 이의 항원 결합 단편을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR의 가변 도메인은 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하며, 이는 일반적으로 펩티드, MHC 및/또는 MHC 펩티드 복합체의 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 대한 1차 기여자이다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR 또는 이의 조합물은 주어진 TCR 분자의 항원 결합 부위의 전부 또는 실질적으로 전부를 형성한다. TCR 사슬의 가변 영역 내의 다양한 CDR은 일반적으로 CDR에 비해 TCR 분자 중에서 일반적으로 가변성을 덜 나타내는 프레임워크 영역(FR)으로 분리된다(예를 들어, Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988 참조; 또한 Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003 참조). 일부 구현예에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성을 담당하는 주요 CDR이거나, 항원 인식 및/또는 펩티드 MHC 복합체의 가공된 펩티드 부분과의 상호 작용을 위한 주어진 TCR 가변 영역에서 3개의 CDR 중 가장 중요하다. 일부 상황에서, α 사슬의 CDR1은 특정 항원 펩티드의 N-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, β 사슬의 CDR1은 펩티드의 C-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, CDR2는 MHC 펩티드 복합체의 MHC 부분과의 상호 작용 또는 인식을 담당하는 1차 CDR이거나 이에 가장 강력하게 기여한다. 일부 구현예에서, β 사슬의 가변 영역은 추가의 초 가변 영역(CDR4 또는 HVR4)을 함유할 수 있으며, 이는 일반적으로 항원 인식이 아닌 초 항원 결합에 관여한다(Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
일부 구현예에서, TCR의 TCRα 사슬 및/또는 TCRβ 사슬은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다(예를 들어, 문헌[Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997] 참조). 일부 측면에서, TCR 각 사슬(예를 들어, 알파 또는 베타)은 1개의 N 말단 면역 글로불린 가변 도메인, 1개의 면역 글로불린 불변 도메인, 막관통 영역 및 C 말단 끝에 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은, 예를 들어 세포질 꼬리를 통해 신호 전달 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 결합한다. 일부 경우에, 구조는 TCR이 CD3 및 이의 하위 단위와 같은 다른 분자와 결합하게 한다. 예를 들어, 막관통 영역을 가진 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막에 단백질을 고정하고 CD3 신호 전달 장치 또는 복합체의 불변 하위 단위와 결합할 수 있다. CD3 신호 전달 하위 단위(예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 사슬)의 세포 내 꼬리는 일반적으로 TCR 복합체의 신호 전달 용량에 관여하고, 하나 이상의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 즉 ITAM을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR의 다양한 도메인 또는 영역이 결정될 수 있다. 일부 경우에, 도메인 또는 영역의 정확한 유전자 좌는 특정 도메인을 기재하는데 사용된 특정 구조 또는 상동성 모델링 또는 기타 특성에 따라 달라질 수 있다. 재조합 수용체, 예를 들어, TCR의 도메인 구성을 기재하는데 사용된 서열 번호로 제시된 특정 서열을 포함한 아미노산에 대한 언급은 예시 목적을 위한 것이며 제공된 구현예의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다는 것이 이해된다. 일부 경우에, 특정 도메인(예를 들어, 가변 또는 불변)은 몇 개의 아미노산(예컨대 1, 2, 3 또는 4)이 더 길거나 더 짧을 수 있다. 일부 측면에서, TCR의 잔기는 공지되거나 IMGT(International Immunogenetics Information System) 넘버링 시스템(예를 들어, www.imgt.org 참조; 또한 Lefranc et al. (2003) Developmental and Comparative Immunology, 2&;55-77; 및 The T Cell Factsbook 2nd Edition, Lefranc and LeFranc Academic Press 2001 참조)에 따라 확인될 수 있다. 상기 시스템을 사용하여, TCR Vα 사슬 및/또는 Vβ 사슬 내의 CDR1 서열은 잔기 번호 27-38(수치 포함) 사이에 존재하는 아미노산에 해당하며, TCR Vα 사슬 및/또는 Vβ 사슬 내의 CDR2 서열은 잔기 번호 56-65(수치 포함) 사이에 존재하는 아미노산에 해당하고, TCR Vα 사슬 및/또는 Vβ 사슬 내의 CDR3 서열은 잔기 번호 105-117(수치 포함) 사이에 존재하는 아미노산에 해당한다.
일부 구현예에서, TCR의 α 사슬 및 β 사슬은 각각 불변 도메인을 더 함유한다. 일부 구현예에서, α 사슬 불변 도메인(Cα) 및 β 사슬 불변 도메인(Cβ)은 개별적으로 인간 또는 뮤린 불변 도메인과 같은 포유류이다. 일부 구현예에서, 불변 도메인은 세포막에 인접해 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포 외 부분은 2개의 막 근위 불변 도메인과 2개의 막 원위 가변 도메인을 함유하고, 상기 가변 도메인 각각은 CDR을 함유한다.
일부 구현예에서, 각각의 TCRα 및 TCRβ 불변 도메인은 인간이다. 일부 구현예에서, Cα는 TRAC 유전자(IMGT 명명법)에 의해 암호화되거나 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cα는 서열 번호: 19에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 19에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 일부 구현예에서, Cα는 서열 번호: 19 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cα는 서열 번호: 1에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 예를 들어, 성숙 폴리펩티드 또는 서열 번호: 1에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 예를 들어, 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cβ는 TRBC1 또는 TRBC2 유전자(IMGT 명명법)에 의해 암호화되거나 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, Cβ는 서열 번호: 20 또는 21에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 20 또는 21에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cβ는 서열 번호: 20 또는 21에 제시된 아미노산 서열을 갖거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cβ는 서열 번호: 2 또는 3에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 예를 들어, 성숙 폴리펩티드 또는 서열 번호: 2 또는 3에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 예를 들어, 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 TCR의 일부는 TRAC 또는 TRBC 유전자의 오픈 리딩 프레임의 적어도 일부에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 세포로 전이 유전자, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 전달, 도입, 접촉, 형질 감염 및/또는 형질 도입은 재조합 TCR의 발현을 초래한다. 일부 구현예에서, 재조합 TCR의 일부는 전이 유전자, 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터에 의해 암호화되고, 나머지 부분은 세포에 대해 내인성 및/또는 본래의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 내인성 및/또는 본래의 핵산 서열은 TRAC 또는 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임이거나 이의 안에 있다. 일부 구현예에서, TRAC 또는 TRBC 유전자 좌는 인간이다. 특정 구현예에서, TCR의 나머지 부분은 불변 도메인, 예를 들어, TCRα 또는 TCRβ 불변 도메인이다. 특정 구현예에서, TCR의 나머지 부분은 불변 도메인의 일부, 예를 들어, TCRα 또는 TCRβ 불변 도메인의 일부이다.
일부 구현예에서, 제공된 TCR 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나는 인간/마우스 키메라 TCR일 수 있다. 일부 경우에, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 마우스 불변 영역을 포함하는 α 사슬 및/또는 β 사슬을 갖는다. 일부 측면에서, Cα 및/또는 Cβ 영역은 마우스 불변 영역이다. 일부 구현예에서, Cα는 서열 번호: 14, 15, 121 또는 122에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 14, 15, 121 또는 122에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 마우스 불변 영역이다. 일부 구현예에서, Cα는 서열 번호: 14, 15, 121 또는 122에 제시된 아미노산 서열이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cβ는 서열 번호: 16, 17 또는 123에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 16, 17 또는 123에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 마우스 불변 영역이다. 일부 구현예에서, Cβ는 서열 번호: 16, 17 또는 123에 제시된 아미노산 서열이거나 이를 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 α 사슬 및/또는 β 사슬에서 하나 이상의 변형을 함유하여, TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 세포에서 발현될 경우, TCR α 사슬 및 β 사슬과 내인성 TCR α 사슬 및 β 사슬 사이의 짝짓기 오류 빈도가 감소하고/거나 TCR α 사슬 및 β 사슬의 발현이 증가하고/거나 TCR α 사슬 및 β 사슬의 안정성이 증가한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 Cα 영역 및/또는 Cβ 영역에서 하나 이상의 아미노산의 교체, 결실 또는 삽입이다. 일부 측면에서, 하나 이상의 변형은 교체(들)를 함유하여 α 사슬과 β 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 넘버링으로 48번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 함유하는 Cα 영역 및/또는 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 넘버링으로 57번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 함유하는 Cβ 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 Cα 영역은 β 사슬과 비천연 이황화물 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 서열 번호: 19 또는 24 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 이에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하고/거나; 상기 Cβ 영역은 α 사슬과 비천연 이황화물 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 서열 번호: 20, 21 또는 25 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 이에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합 분자 또는 TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 단리 또는 정제 또는 재조합이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합 분자 또는 TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 인간이다.
일부 구현예에서, TCR은 예컨대 이황화물 결합 또는 이황화물 결합들에 의해 연결된 2개의 사슬 α 및 β의 이종 이량체일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화물 결합을 형성하는 짧은 연결 서열을 함유하고, 이로써 2개의 TCR 사슬을 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 α 및 β 사슬 각각에 추가 시스테인 잔기를 가질 수 있어서, TCR은 불변 도메인에 2 개의 이황화물 결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 불변 및 가변 도메인 각각은 시스테인 잔기에 의해 형성된 이황화물 결합을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR은 도입된 이황화물 결합 또는 결합들을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 천연 이황화물 결합은 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 천연 사슬 간 이황화물 결합을 형성하는 (예를 들어, α 사슬 및 β 사슬의 불변 도메인의) 천연 시스테인 중 하나 이상이 다른 잔기, 예컨대 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 구현예에서, 도입된 이황화물 결합은, 예컨대 α 사슬 및 β 사슬의 불변 도메인에서 알파 및 β 사슬의 비시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 TCR에 비천연 시스테인 잔기의 존재(예를 들어, 하나 이상의 비천연 이황화물 결합 초래)는 천연 TCR 사슬을 함유하는 잘못 짝지어진 TCR 쌍의 발현을 넘어 도입된 세포에서 바람직한 재조합 TCR의 생산에 유리할 수 있다.
TCR의 예시적인 비천연 이황화물 결합은 문헌[국제 PCT 공개 번호 WO2006/000830, WO2006037960 및 Kuball et al. (2007) Blood, 109:2331-2338]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 24에 제시된 Cα의 넘버링 또는 서열 번호: 20에 제시된 Cβ의 넘버링을 참조로, Cα 사슬의 Thr48 및 Cβ 사슬의 Ser57 잔기, Cα 사슬의 Thr45 및 Cβ 사슬의 Ser77 잔기, Cα 사슬의 Tyr10 및 Cβ 사슬의 Ser17 잔기, Cα 사슬의 Thr45 및 Cβ 사슬의 Asp59 잔기 및/또는 Cα 사슬의 Ser15 및 Cβ 사슬의 Glu15 잔기에 시스테인이 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 임의의 제공된 시스테인 돌연변이는 다른 서열, 예를 들어 여기에 기재된 마우스 Cα 및 Cβ 서열의 해당 위치에서 이루어질 수 있다. 아미노산 위치가 서열 목록에 제시된 것과 같은 개시된 서열의 아미노산 위치에 "해당(correspond to)"한다는 설명과 같이 단백질의 위치에 관하여 용어 "해당하는(corresponding)"은 GAP 알고리즘과 같은 표준 정렬 알고리즘을 사용하거나 구조적 서열 정렬에 기초하여 개시된 서열과 정렬 시 확인된 아미노산 위치를 지칭한다. 예를 들어, 해당하는 잔기는 여기 기재된 바와 같은 구조적 정렬 방법에 의해 서열 번호: 24 중 어느 하나에 제시된 Cα 서열 또는 서열 번호: 20에 제시된 Cβ 서열과 참조 서열의 정렬로 결정될 수 있다. 서열을 정렬함으로써, 예를 들어 보존되고 동일한 아미노산 잔기를 가이드로 사용하여 해당하는 잔기를 확인할 수 있다.
제공된 TCR의 예시적인 서열(예를 들어, CDR, Vα 및/또는 Vβ 및 불변 영역 서열)이 여기에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 재조합 TCR 또는 이의 항원 결합 부분(또는 TCR 유사 항체와 같은 다른 MHC 펩티드 결합 분자)는 MHC 분자, 즉 표적 폴리펩티드의 MHC 펩티드 복합체의 상황에서 세포에 의해 제시될 경우, 표적 폴리펩티드의 펩티드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식할 수 있거나, 인식할 가능성이 있거나 또는 인식하는 것으로 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 재조합 TCR(또는 다른 MHC 펩티드 결합 분자 또는 TCR 유사 항체)는, 예를 들어, MHC 펩티드 복합체로 제시될 경우, 표적 폴리펩티드의 T 세포 에피토프에 대해 특이적 결합을 나타낼 가능성이 있거나 나타내는 것으로 공지되어 있다. MHC 펩티드 결합 분자(예를 들어, TCR 또는 TCR 유사 항체)의 결합 또는 상호 작용을 평가하는 방법은 여기에 기재된 예시적인 방법 중 어느 하나를 포함하여 공지되어 있다.
일부 구현예에서, MHC 분자는 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자이다. 일부 구현예에서, MHC는 일부 경우에, 세포 기계에 의해 가공된 펩티드 에피토프를 포함하여 폴리펩티드의 펩티드 에피토프와 복합체를 형성할 수 있는 다형성 펩티드 결합 부위 또는 결합 그루브(groove)를 함유한다. 일부 경우에, MHC 분자는, T 세포 상의 TCR 또는 기타 MHC 펩티드 결합 분자에 의해 인식 가능한 형태로 항원 제시를 위해 펩티드와의 복합체로, 즉 MHC 펩티드 복합체를 포함하여 세포 표면 상에 제시되거나 발현될 수 있다. 일반적으로, MHC 클래스 I 분자는, 일부 경우에, 3 개의 α 도메인 및 비공유 결합된 β2 마이크로글로불린을 가지며, 막에 걸쳐있는 α 사슬을 갖는 이종 이량체이다. 일반적으로, MHC 클래스 II 분자는 두 개의 막관통 당단백질, α 및 β로 구성되며, 둘 다 전형적으로 막에 걸쳐 있다. MHC 분자는 펩티드에 결합하기 위한 항원 결합 부위 또는 부위들 및 TCR과 같은 적절한 결합 분자에 의한 인식에 필요한 서열을 함유하는 MHC의 유효 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 분자는 시토졸에서 유래한 펩티드를 세포 표면으로 전달하고, 여기서 펩티드: MHC 복합체는 일반적으로 CD8+ T 세포이나, 일부 경우에 CD4+ T 세포와 같은 T 세포에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템에서 유래한 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 이는 전형적으로 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 일반적으로, MHC 분자는 인간에서 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA) 및 마우스에서 H-2라고 통칭되는 연관된 유전자좌(loci) 그룹에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 인간 MHC는 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA)으로도 지칭될 수 있다.
일부 구현예에서, 펩티드 에피토프 또는 T 세포 에피토프는 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 더 긴 생물학적 분자의 단편으로부터 유래되거나 또는 이에 기초할 수 있고, MHC 분자와 복합체를 형성할 수 있거나 이와 결합할 수 있는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 펩티드는 약 8 내지 약 24 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드는 MHC 클래스 II 복합체에서 인식을 위해 (약) 9 내지 22개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩티드는 MHC 클래스 I 복합체에서 인식을 위해 (약) 8 내지 13개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, MHC 분자 및 펩티드 에피토프 또는 T 세포 에피토프는 MHC 분자의 결합 그루브(groove) 또는 틈에서 펩티드의 비공유 상호작용을 통해 결합하거나 이와 복합체를 형성한다.
일부 구현예에서, MHC 펩티드 복합체는 세포의 표면 상에 존재하거나 제시된다. 일부 구현예에서, MHC 펩티드 복합체는 TCR 또는 이의 항원 결합 부분 또는 기타 MHC 펩티드 결합 분자에 의해 특이적으로 인식될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 에피토프 또는 펩티드 에피토프는 MHC 분자에 대한 결합 특성에 의해 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 펩티드 복합체와 같은 T 세포 에피토프 인식시, TCR(또는 기타 MHC 펩티드 결합 분자)은 T 세포 반응, 예컨대 T 세포 증식, 사이토카인 생성, 세포 독성 T 세포 반응 또는 기타 반응을 유도하는 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성하거나 유발시킨다.
일부 구현예에서, TCR 또는 기타 MHC 펩티드 결합 분자는, MHC 클래스 I 분자의 상황에서 T 세포 에피토프를 인식하거나 잠재적으로 인식한다. MHC 클래스 I 단백질은 보다 고등한 척추동물의 모든 유핵 세포에서 발현된다. MHC 클래스 I 분자는 12 kDa 경쇄 β-2 마이크로글로불린과 비공유적으로 결합하는 46 kDa 중쇄로 구성된 이종 이량체이다. 인간의 경우, 예를 들어, HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 및 HLA-Cw8와 같은 여러 개의 MHC 대립 유전자가 존재한다. MHC 대립 유전자 서열은 공지되어 있고 예를 들어, www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla에서 이용 가능한 IMGT/HLA 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 대립 유전자는 HLA-A2 대립 유전자이며, 이는 일부 집단에서 집단의 약 50%에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, THLA-A2 대립 유전자는 HLA-A*0201, *0202, *0203, *0206 또는 *0207 유전자 생성물일 수 있다. 일부 경우에, 상이한 집단 간의 하위 유형 빈도에 차이가 있을 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, HLA-A2 양성 백인 인구의 95% 이상이 HLA-A*0201인 반면, 중국 인구에서는 빈도가 약 23% HLA-A*0201, 45% HLA-A*0207, 8% HLA-A*0206 및 23% HLA-A*0203으로 보고되었다.
일부 구현예에서, MHC 클래스 I 제한 펩티드는 8 내지 15개의 아미노산 길이, 예컨대 8 내지 10개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 분자는 질병 또는 감염된 세포 내에서 생성된 종양, 바이러스 또는 세균성 단백질과 같은 내인성 항원에서 유래된 펩티드에 결합하고, 이는 세포질 경로를 통해 세포의 세포질 내에서 프로세싱되었다. 일부 구현예에서, 세포의 표면 상에 제시되는 MHC 클래스 I 펩티드 복합체는 전형적으로 세포 독성 T 세포와 같은 CD8+ T 세포 상에 발현된 TCR에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 펩티드 복합체는, 예컨대 CD8 또는 부분적인 CD8 독립적인 결합을 나타내는 TCR에 의해 CD4+ T 세포 상에 발현된 TCR에 의해 인식될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 기타 MHC 펩티드 결합 분자는, MHC 클래스 II 분자의 상황에서 T 세포 에피토프를 인식하거나 잠재적으로 인식한다. MHC 클래스 II 단백질은 일반적으로 항원 제시 세포 (antigen presenting cell, APC)로 명명되고, 유핵 척추 동물 세포의 하위 세트에서 발현된다. 인간의 경우, 예를 들어 DR1, DR3, DR4, DR7, DR52, DQ1, DQ2, DQ4, DQ8 및 DP1와 같은 여러 개의 MHC 클래스 II 대립 유전자가 존재한다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II 대립 유전자는 HLA-DRB1*0101, HLA-DRB*0301, HLA-DRB*0701, HLA-DRB*0401, HLA-DQB1*0201이다. MHC 대립 유전자 서열은 공지되어 있고 예를 들어, www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla에서 이용 가능한 IMGT/HLA 데이터베이스에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, MHC 클래스 II 제한 펩티드는 일반적으로 약 9 내지 25 개의 잔기 길이, 예컨대 15 내지 25 개의 잔기 또는 13 내지 18 개의 잔기 길이이고, 일부 경우에 약 9 개의 아미노산 또는 약 12 개의 아미노산의 결합 코어 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II 분자는 외인성 항원에서 유래된 펩티드에 결합하며, 이는 식균작용 또는 세포 내 이입에 의해 내부화되고 엔도솜/리소좀 경로 내에서 프로세싱된다. 일부 구현예에서, 세포의 표면 상에 제시되는 MHC 클래스 II 펩티드 복합체는 전형적으로 헬퍼 T 세포와 같은 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 제시된 MHC 클래스 II 펩티드 복합체는 CD8+ T 세포 상에 발현된 TCR에 의해 인식될 수 있다.
전형적으로, 펩티드 에피토프 또는 T 세포 에피토프는 항원의 펩티드 부분이다. 일부 구현예에서, 항원은 공지되고, 일부 경우에 TCR 또는 이의 항원 결합 부분(또는 기타 MHC 펩티드 결합 분자)에 의해 인식된 펩티드 에피토프도, 제공된 방법을 수행하기 전 공지와 같이 공지될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원은 종양 관련 항원, 자가면역 또는 염증성 질환과 관련된 특정 세포 유형에서 발현된 항원 또는 바이러스성 병원체 또는 세균성 병원체로부터 유래된 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 질병에 관련된 항원이다. 일부 구현예에서, 질병은 암과 같은 세포의 악성 또는 변형에 의해 유발될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 종양 관련 항원과 같은 종양 또는 암 세포 유래 세포 내 단백질 항원일 수 있다. 일부 경우에, 암 항원의 대다수가 MHC 분자의 상황에서 세포 표면에서만 표적화될 수 있는 세포 내 단백질 유래이기 때문에, TCR은 상기 클래스의 항원을 인식하도록 진화해왔음으로 치료를 위한 이상적인 후보가 된다. 일부 구현예에서, 질병은 세균 또는 바이러스 감염과 같은 감염에 의해 유발될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스 관련 암 항원이다. 일부 경우에, 재조합 TCR 또는 이의 항원 결합 부분(및 기타 MHC 펩티드 결합 분자)은 감염된 세포에서 자연적으로 프로세싱되고 세포 표면에 MHC 분자에 의해 제시된 바이러스 단백질 유래 펩티드를 인식하거나 잠재적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 질병은 자가면역 질환일 수 있다. 기타 표적에는 문헌[The HLA Factsbook (Marsh et al. (2000))]에 열거된 것 및 기타 공지된 것이 포함된다.
일부 구현예에서, 항원은 종양 또는 암과 관련된 것이다. 일부 구현예에서, 종양 또는 암 항원은 악성 세포에서 발견될 수 있고, 악성 세포 내부에서 발견될 수 있거나 종양 세포 성장의 중재자인 항원이다. 일부 구현예에서, 종양 또는 암 항원은 종양 세포 또는 암 세포에 의해 우세하게 발현되거나 과발현되는 항원이다. MHC 제한, T 세포 정의 종양 항원을 포함한 다수의 종양 항원이 확인되었고 공지되어 있다(예를 들어, cancerimmunity.org/peptide/; Boon and Old (1997) Curr Opin Immunol, 9:681 -3; Cheever et al. (2009) Clin Cancer Res, 15:5323-37 참조). 일부 구현예에서, 종양 항원에는 돌연변이 펩티드, 분화 항원 및 과발현 항원이 포함되나 이에 제한되지 않으며, 이들 모두 치료의 표적으로 작용할 수 있다.
일부 구현예에서, 종양 또는 암 항원은 림프종 항원(예를 들어, 비호지킨 림프종 또는 호지킨 림프종), B 세포 림프종 암 항원, 백혈병 항원, 골수종(즉, 다발성 골수종 또는 혈장 세포 골수종) 항원, 급성 림프아구성 백혈병 항원, 만성 골수성 백혈병 항원 또는 급성 골수성 백혈병 항원이다. 일부 구현예에서, 암 항원은 다발성 골수종 및 일부 B 세포 림프종을 포함한, 췌장, 결장, 유방, 난소, 폐, 전립선, 두부 및 경부와 같은 선암인 암과 관련되거나 과발현되는 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 전립선암, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 피부암, 간암(예를 들어, 간세포 선암), 장암 또는 방광암과 같은 암과 관련된다.
일부 구현예에서, 항원은 신경 교종 관련 항원, β-인간 융모막 성선 자극 호르몬, 알파페토프로테인(alphafetoprotein, AFP), B 세포 성숙 항원(BCMA, BCM), B 세포 활성화 인자 수용체(BAFFR, BR3) 및/또는 막관통 활성제 및 CAML 상호작용자(TACI), Fc 수용체 유사 5(FCRL5, FcRH5), 렉틴 반응성 AFP, 티로글로불린(thyroglobulin), RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스터라제, mut hsp70-2, M-CSF, 멜라닌-A/MART-1, WT-1, S-100, MBP, CD63, MUC1(예를 들어, MUC1-8), p53, Ras, 사이클린 B1, HER-2/neu, 암배아 항원(CEA), gp100, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A11, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-C1, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5, 티로시나제(예를 들어, 티로시나제 관련 단백질 1(TRP-1), 티로시나제 관련 단백질 2(TRP-2)), β-카테닌, NY-ESO-1, LAGE-1a, PP1, MDM2, MDM4, EGVFvIII, Tax, SSX2, 텔로머라제, TARP, pp65, CDK4, 비멘틴, S100, eIF-4A1, IFN 유도성 p78 및 멜라노트랜스페린(p97), 우로플라킨 II, 전립선 특이적 항원(PSA), 인간 칼리크레인(huK2), 전립선 특이적 막 항원(PSM) 및 전립선산 포스파타아제(PAP), 호중구 엘라스타제, 에프린 B2, BA-46, 베타-카테닌, Bcr-abl, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 카스파제 8 또는 B-Raf 항원일 수 있는 종양 항원이다. 기타 종양 항원에는 FRa, CD24, CD44, CD133, CD 166, epCAM, CA-125, HE4, 오발(Oval), 에스트로겐 수용체, 프로게스트론 수용체, uPA, PAI-1, CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, GD-2, 인슐린 성장 인자(insulin growth factor, IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린으로부터 유래된 어느 하나가 포함될 수 있다. 특정 종양 관련 항원 또는 T 세포 에피토프가 공지되어 있다(예를 들어, van der Bruggen et al. (2013) Cancer Immun, www.cancerimmunity.org/peptide/에서 이용 가능; Cheever et al. (2009) Clin Cancer Res, 15, 5323-37 참조).
일부 구현예에서, 항원은 바이러스 항원이다. HIV, HTLV 및 기타 바이러스의 바이러스 게놈 유래 펩티드를 포함한, 많은 바이러스 항원 표적이 확인되었으며 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Addo et al. (2007) PLoS ONE, 2, e321 ; Tsomides et al. (1994) J Exp Med, 180, 1283-93; Utz et al. (1996) J Virol, 70, 843-51] 참조). 예시적인 바이러스 항원에는 A형 간염, B형 간염(예를 들어, HBV 코어 및 표면 항원(HBVc, HBVs)), C형 간염(HCV), 엡스타인-바 바이러스(예를 들어, EBVA), 인간 유두종 바이러스(HPV; 예를 들어 E6 및 E7), 인간 면역 결핍 유형-1 바이러스(HIV1), 카포시의 육종 헤르페스 바이러스(KSHV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 인플루엔자 바이러스, 라사 바이러스, HTLN-1, HIN-1, HIN-II, CMN, EBN 또는 HPN 유래 항원이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 세균성 항원 또는 기타 병원성 항원, 예컨대 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MT) 항원, 트리파노소마, 예를 들어, 표면 항원과 같은 Tiypansoma cruzi(T. cruzi), 항원(TSA) 또는 말라리아 항원이다. 특정 바이러스 항원 또는 에피토스 또는 기타 병원성 항원 또는 T 세포 에피토프가 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Addo et al. (2007) PLoS ONE, 2:e321 ; Anikeeva et al. (2009) Clin Immunol, 130:98-109] 참조).
일부 구현예에서, 항원은 종양 형성 바이러스와 같은 암과 관련된 바이러스 유래 항원이다. 예를 들어, 종양 발생 바이러스는 특정 바이러스 감염이 상이한 유형의 암의 발달로 이어지는 것으로 공지된 바이러스, 예를 들어 A형 간염, B형 간염(예를 들어, HBV 코어 및 표면 항원(HBVc, HBVs)), C형 간염(HCV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 간염 바이러스의 감염, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 인간 헤르페스 바이러스 8(HHV-8), 인간 T 세포 백혈병 바이러스-1(HTLV-1), 인간 T 세포 백혈병 바이러스-2(HTLV-2) 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 항원이다.
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HPV 항원이며, 일부 경우에 이는 자궁 경부암 발병의 보다 큰 위험으로 이어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 HPV-16 항원 및 HPV-18 항원 및 HPV-31 항원, HPV-33 항원 또는 HPV-35 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HPV-16 항원(예를 들어, HPV-16E1의 E1, E2, E6 및/또는 E7 단백질의 혈청 반응성 영역, 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,531,127호 참조) 또는 HPV-18 항원(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,840,306호에 기재된 바와 같은 HPV-18의 L1 및/또는 L2 단백질의 혈청 반응성 영역)이다. 일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HPV-16의 E6 및/또는 E7 단백질 유래의 HPV-16 항원이다. 일부 구현예에서, TCR은 HPV-16 E6 또는 HPV-16 E7에 대하여 유도된 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 예를 들어, 문헌[국제 출원 WO 2015/184228, WO 2015/009604 및 WO 2015/009606]에 기재된 TCR이다.
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HBV 또는 HCV 항원이며, 일부 경우에 이는 HBV 또는 HCV 음성 대상체보다 간암 발병의 보다 큰 위험으로 이어질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이종 항원은 B형 간염 코어 항원 또는 B형 간염 외피 항원과 같은 HBV 항원이다(US2012/0308580).
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 EBV 항원이고, 일부 경우에 이는 EBV 음성 대상체보다 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 비인두 암종 및 호지킨 질병의 발병에 대한 보다 큰 위험으로 이어질 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, EBV는 다양한 조직 기원의 수많은 인간 종양과 관련되어 발견되는 인간 헤르페스 바이러스이다. 주로 무증상 감염으로 발견되나, EBV 양성 종양은 EBNA-1, LMP-1 및 LMP-2A와 같은 바이러스 유전자 생성물의 활성 발현에 의해 특성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 항원은 엡스타인-바 핵 항원(EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA 리더 단백질(EBNA-LP), 잠재성 막 단백질(latent membrane protein), LMP-1, LMP-2A 및 LMP-2B, EBV-EA, EBV-MA 또는 EBV-VCA를 포함할 수 있는 EBV 항원이다.
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HTLV-1 또는 HTLV-2 항원이며, 일부 경우에 이는 HTLV-1 또는 HTLV-2 음성 대상체보다 T 세포 백혈병 발병의 보다 큰 위험으로 이어질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이종 항원은 TAX와 같은 HTLV 항원이다.
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HHV-8 항원이며, 일부 경우에 이는 HHV-8 음성 대상체보다 카포시 육종(Kaposi's sarcoma) 발병의 보다 큰 위험으로 이어질 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 항원은 pp65 또는 pp64와 같은 CMV 항원이다(미국 특허 번호 제8,361,473호 참조).
일부 구현예에서, 항원은 자가면역 질환 또는 장애와 관련된 폴리펩티드 항원과 같은 자가항원이다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환 또는 장애는 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 류마티스 천포창 관절염(RA), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 피부 경화증, 다발성 근육염(polymyositis), 피부근염(dermatomyositis), 전신 루푸스 홍반성, 청소년 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 중증 근무력증(myasthenia gravis, MG), 수포성류천포창(진피-표피 교차점에서 기저막에 대한 항체), 천포창(뮤코 다당류 단백질 복합체 또는 세포 내 시멘트 물질에 대한 항체), 사구체 신염(사구체 기저막에 대한 항체), Goodpasture 증후군, 자가 면역 용혈성 빈혈(적혈구에 대한 항체), 하시모토병(갑상선에 대한 항체), 악성 빈혈(내인성 인자에 대한 항체), 특발성 혈소판 감소성 자반병(혈소판에 대한 항체), 그레이브병 또는 애디슨병(티로글로불린에 대한 항체)일 수 있다. 일부 구현예에서, 여기에 기재된 자가면역 질환과 관련된 자가 항원과 같은 자가 항원은 II 형 콜라겐, 미코박테리아 열충격 단백질, 티로글로불린, 아세틸 콜린 수용체(acetyl choline receptor, AcHR), 미엘린 염기성 단백질(myelin basic protein, MBP) 또는 단백지질 단백질(proteolipid protein, PLP)과 같은 콜라겐일 수 있다. 특정 자가면역 관련 에피토프 또는 항원이 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Bulek et al. (2012) Nat Immunol, 13:283-9; Harkiolaki et al. (2009) Immunity, 30:348-57; Skowera et al. (2008) J Clin Invest, 1(18): 3390-402] 참조).
일부 구현예에서, 표적 항원의 펩티드 에피토프의 본질이 공지되어 있으며, 일부 경우에, 이는 제공된 방법과 관련해서뿐만 아니라, 관심 TCR의 생산 또는 생성 또는 기능적 활성 또는 특성의 평가에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 에피토프는 관심 표적 항원의 HLA 제한 모티프의 존재에 근거하여 결정되거나 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드는 공지된 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 확인된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 결합 부위를 예측하기 위해, 상기 모델은 ProPred1(Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237) 및 SYFPEITHI(Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007 참조)를 포함하되 이에 국한되지 않는다. 일부 구현예에서, MHC 제한 에피토프는 HLA-A0201이며, 이는 모든 백인의 약 39-46%에서 발현되고 따라서, TCR 또는 다른 MHC 펩티드 결합 분자를 제조하는데 사용하기 위한 MHC 항원의 적합한 선택을 나타낸다. 일부 측면에서, 컴퓨터 예측 모델을 사용한 프로테아좀 및 면역 프로테아좀에 대한 HLA-A*0201 결합 모티프 및 절단 부위가 공지되어 있다. MHC 클래스 I 결합 부위를 예측하기 위해, 상기 모델은 ProPred1(Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001에 보다 상세하게 기재됨) 및 SYFPEITHI(Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007 참조)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자의 상황에서, 항원 또는 에피토프를 인식하는 T 세포와 같은 스크리닝 방법에 이용되는 세포 및 스크리닝 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, MHC는 일부 경우에, 세포 기계에 의해 가공된 펩티드 에피토프를 포함하여 폴리펩티드의 펩티드 에피토프와 복합체를 형성할 수 있는 다형성 펩티드 결합 부위 또는 결합 그루브(groove)를 함유한다. 일부 경우에, MHC 분자는, T 세포 상의 TCR 또는 기타 MHC 펩티드 결합 분자에 의해 인식 가능한 형태로 항원 제시를 위해 펩티드와의 복합체로, 즉 MHC 펩티드 복합체를 포함하여 세포 표면 상에 제시되거나 발현될 수 있다. 일반적으로, MHC 클래스 I 분자는, 일부 경우에, 3 개의 α 도메인 및 비공유 결합된 β2 마이크로글로불린을 가지며, 막에 걸쳐있는 α 사슬을 갖는 이종 이량체이다. 일반적으로, MHC 클래스 II 분자는 두 개의 막관통 당단백질, α 및 β로 구성되며, 둘 다 전형적으로 막에 걸쳐 있다. MHC 분자는 펩티드에 결합하기 위한 에피토프 결합 부위 또는 부위들 및 TCR과 같은 적절한 결합 분자에 의한 인식에 필요한 서열을 함유하는 MHC의 유효 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 분자는 시토졸에서 유래한 펩티드를 세포 표면으로 전달하고, 여기서 펩티드: MHC 복합체는 일반적으로 CD8+ T 세포이나, 일부 경우에 CD4+ T 세포와 같은 T 세포에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템에서 유래한 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 이는 전형적으로 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 일반적으로, MHC 분자는 인간에서 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA) 및 마우스에서 H-2라고 통칭되는 연관된 유전자좌(loci) 그룹에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 인간 MHC는 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA)으로도 지칭될 수 있다.
일부 구현예에서, 펩티드 에피토프 또는 T 세포 에피토프는 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 더 긴 생물학적 분자의 단편으로부터 유래되거나 또는 이에 기초할 수 있고, MHC 분자와 복합체를 형성할 수 있거나 이와 결합할 수 있는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 펩티드는 약 8 내지 약 24 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드는 MHC 클래스 II 복합체에서 인식을 위해 (약) 9 내지 22개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩티드는 MHC 클래스 I 복합체에서 인식을 위해 (약) 8 내지 13개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, MHC 분자 및 펩티드 에피토프 또는 T 세포 에피토프는 MHC 분자의 결합 그루브(groove) 또는 틈에서 펩티드의 비공유 상호작용을 통해 결합하거나 이와 복합체를 형성한다.
일부 구현예에서, MHC 펩티드 복합체는 세포의 표면 상에 존재하거나 제시된다. 일부 구현예에서, MHC 펩티드 복합체는 TCR 또는 이의 항원 결합 부분 또는 기타 MHC 펩티드 결합 분자에 의해 특이적으로 인식될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 에피토프 또는 펩티드 에피토프는 MHC 분자에 대한 결합 특성에 의해 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 펩티드 복합체와 같은 T 세포 에피토프 인식시, TCR(또는 기타 MHC 펩티드 결합 분자)은 T 세포 반응, 예컨대 T 세포 증식, 사이토카인 생성, 세포 독성 T 세포 반응 또는 기타 반응을 유도하는 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성하거나 유발시킨다.
일부 구현예에서, MHC 펩티드 결합 분자는 TCR 또는 이의 에피토프 결합 단편이다. 일부 구현예에서, MHC 펩티드 결합 분자는 MHC 펩티드 복합체에 결합하도록 조작된 것과 같은 TCR 유사 항체와 같은 항체 또는 이의 에피토프 결합 단편을 함유하는 TCR 유사 CAR이다. 일부 구현예에서, 상기 결합 분자는 표적 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 항원을 함유하는 T 세포 에피토프와 같은 결합 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적 펩티드 또는 표적 폴리펩티드의 결합 서열은 공지되어 있다. 일부 구현예에서, MHC 펩티드 결합 분자는 천연 공급원 유래일 수 있거나, 부분적으로 또는 전체적으로 합성 또는 재조합으로 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, MHC 펩티드 결합 분자는, 예컨대 세포의 표면 상에 MHC 분자, 즉 MHC 펩티드 복합체의 상황에서 제시되거나 표시된 펩티드 에피토프에 결합, 예를 들어, 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 분자 또는 이의 부분이다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 MHC 펩티드 복합체에 결합, 예를 들어 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 자연 발생, 합성, 반-합성 또는 재조합으로 생산된 분자를 포함할 수 있다. 예시적인 MHC 펩티드 결합 분자에는 MHC 펩티드 복합체에 결합하는 특이적 능력을 나타내는 이의 단일 사슬 면역 글로불린 가변 영역(예를 들어, scTCR, scFv)을 포함한, T 세포 수용체 또는 이의 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 포함된다.
일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, TCR은 2량체성 TCR(dTCR)이다. 일부 구현예에서, TCR은 단일 사슬 TCR(sc-TCR)이다. TCR은 세포 결합 또는 가용성 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포의 표면 상에 발현된 세포 결합 형태이다.
일부 구현예에서, dTCR은 제1 폴리펩티드(여기서 제공된 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 서열은 TCR α 사슬 불변 영역 세포 외 서열에 해당하는 서열의 N 말단에 융합됨) 및 제2 폴리펩티드(여기서 제공된 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 서열은 TCR β 사슬 불변 영역 세포 외 서열에 해당하는 N 말단 서열에 융합됨)를 함유하고, 제1 및 제2 폴리펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 결합은 천연 이량체 αβ TCR에 존재하는 천연 사슬 간 이황화물 결합에 해당할 수 있다. 일부 구현예에서, 사슬 간 이황화물 결합은 천연 TCR에 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인이 dTCR 폴리펩티드 쌍의 불변 영역 세포 외 서열에 편입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화물 결합이 모두 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 막에 고정하는 막관통 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, dTCR은 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 불변 α 도메인의 C-말단에 부착된 제1 2량체화 모티프를 함유하는 제공된 TCR α 사슬 및 가변 β 도메인, 불변 β 도메인 및 불변 β 도메인의 C-말단에 부착된 제1 2량체화 모티프를 포함하는 제공된 TCR β 사슬을 함유하고, 여기에서 제1 및 제2 2량체화 모티프는 TCR α 사슬과 TCR β 사슬을 서로 연결하는 제1 2량체화 모티프에 있는 아미노산과 제2 2량체화 모티프에 있는 아미노산 간의 공유 결합을 형성하도록 쉽게 상호 작용한다.
일부 구현예에서, TCR은 MHC 펩티드 복합체에 결합할 수 있는 α 사슬 및 β 사슬을 함유하는 단일 아미노산 가닥인 scTCR이다. 전형적으로, scTCR은 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[국제 PCT 공개 번호 WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/18129, WO 04/033685, WO2006/037960, WO2011/044186; 미국 특허 번호 제7,569,664호; 및 Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996)] 참조).
일부 구현예에서, scTCR은 제공된 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 제1 세그먼트, TCR β 사슬 불변 도메인 세포 외 서열에 해당하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 제공된 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 제2 세그먼트 및 제2 세그먼트의 N 말단에 제1 세그먼트의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 제공된 TCRβ 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 제1 세그먼트, TCR α 사슬 불변 도메인 세포 외 서열에 해당하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 제공된 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 제2 세그먼트 및 제2 세그먼트의 N 말단에 제1 세그먼트의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬 세포 외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 제공된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제1 세그먼트 및 β 사슬 세포 외 불변 서열의 N 말단에 융합된 제공된 β 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제2 세그먼트 및 막관통 서열 및 선택적으로 제2 세그먼트의 N 말단에 제1 세그먼트의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬 세포 외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 제공된 TCRβ 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제1 세그먼트 및 α 사슬 세포 외 불변 서열의 N 말단에 융합된 제공된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제2 세그먼트 및 막관통 서열 및 선택적으로 제2 세그먼트의 N 말단에 제1 세그먼트의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR이 MHC 펩티드 복합체에 결합하기 위해서는, α 및 β 사슬은 이의 가변 영역 서열이 상기 결합을 위해 배향되도록 쌍을 이루어야 한다. scTCR에서 α 및 β의 짝짓기를 촉진하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 단일 폴리펩티드 가닥을 형성하도록 α 및 β 사슬을 연결하는 링커 서열이 포함된다. 일부 구현예에서, 링커는 α 사슬의 C 말단과 β 사슬의 N 말단(또는 그 반대) 사이의 거리를 가로지르기에 충분한 길이인 반면, 링커 길이가 표적 펩티드-MHC 복합체에 대한 scTCR의 결합을 차단하거나 감소시킬 정도로 길지 않은 것을 또한 보장한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 세그먼트를 연결하는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩티드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 예를 들어, 화학식 -P-AA-P-를 가질 수 있고, 여기서 P는 프롤린이고 AA는 아미노산 서열을 나타내며 여기서 아미노산은 글리신과 세린이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 세그먼트는 이의 가변 영역 서열이 상기 결합을 위해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서, 일부 경우에, 링커는 제 1 세그먼트의 C 말단과 제 2 세그먼트의 N 말단 사이의 거리에 걸친 충분한 길이를 갖거나 그 반대의 경우도 있지만 표적 리간드에 대한 scTCR의 결합을 차단하거나 감소 시킬 정도로 너무 길지 않다. 일부 구현예에서, 링커는 (약) 10 내지 45 개의 아미노산, 예컨대 10 내지 30 개의 아미노산 또는 26 내지 41 개의 아미노산 잔기, 예를 들어 29, 30, 31 또는 32 개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 화학식 -PGGG-(SGGGG)n-P-를 갖고, 여기서 n은 5 또는 6이고, P는 프롤린이고, G는 글리신이며 S는 세린이다(서열 번호: 22). 일부 구현예에서, 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS(서열 번호: 23)을 갖는다.
일부 구현예에서, scTCR은 단일 아미노산 가닥의 잔기 사이에 이황화물 결합을 함유하고, 이는 일부 경우에 단일 사슬 분자의 α 및 β 영역 사이 짝짓기의 안정성을 촉진시킬 수 있다(예를 들어 미국 특허 번호 제7,569,664호 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 단일 사슬 분자의 β 사슬의 불변 도메인의 면역 글로불린 영역의 잔기에 α 사슬의 불변 도메인의 면역 글로불린 영역의 잔기를 연결하는 공유 이황화물 결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 이황화물 결합은 천연 dTCR에 존재하는 천연 이황화물 결합에 해당한다. 일부 구현예에서, 천연 TCR에 이황화물 결합은 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 이황화물 결합은, 예를 들어, 하나 이상의 시스테인이 scTCR 폴리펩티드의 제1 및 제2 사슬 영역의 불변 영역 세포 외 서열에 편입됨으로써 도입된 비천연 이황화물 결합이다. 예시적인 시스테인 돌연변이는 여기에 기재된 바와 같은 임의의 것을 포함한다. 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화물 결합 둘 다가 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, scTCR은 이의 C-말단에 융합된 이종 루신 지퍼(leucine zipper)가 사슬 결합을 촉진하는 비이황화물 연결 절단형 TCR이다(예를 들어, 국제 PCT 공개 번호 WO99/60120 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 펩티드 링커를 통해 TCRβ 가변 도메인에 공유적으로 연결된 TCRα 가변 도메인을 함유한다(예를 들어, 국제 PCT 공개 번호 WO99/18129 참조).
일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하는 제공된 임의의 TCR은 T 세포 표면 상에 활성 TCR을 생성하는 신호 전달 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포의 표면 상에 발현된다. 일부 구현예에서, TCR은 막관통 서열에 해당하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 양으로 하전된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 Cα 또는 Cβ 막관통 도메일 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 비-TCR 기원, 예를 들어 CD3z, CD28 또는 B7.1의 막관통 영역 유래일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포질 서열에 해당하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 CD3z 신호 전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 CD3과 TCR 복합체를 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 가용성 TCR이다. 일부 구현예에서, 가용성 TCR은 문헌[국제 출원 WO99/60120 또는 WO 03/020763]에 기재된 바와 같은 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, TCR은 예를 들어 그것이 발현되는 세포에 막 고정을 가능하게 하는 막관통 서열에 해당하는 서열을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, TCR은 세포질 서열에 해당하는 서열을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 공지된 재조합 수용체와 비교하여 변형되었거나 변형된다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 여기에 기재되거나 공지된 재조합 수용체, 예를 들어, TCR 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변이, 예를 들어 치환, 결실, 삽입 및/또는 돌연변이를 포함한다. 예시적인 변이체는 결합 분자의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하도록 설계된 것을 포함한다. 결합 분자의 아미노산 서열 변이체는 결합 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변경은, 예를 들어, 결합 분자의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특성, 예를 들어 항원 결합을 보유한다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 가해져 최종 작제물에 도달할 수 있다.
일부 구현예에서, MHC 분자의 상황에서 특정 펩티드에 대한 보다 높은 친화도을 갖는 것과 같은 변경된 특성을 가진 TCR을 생성하기 위해 유도 진화 방법이 사용된다. 일부 구현예에서, 유도 진화는 효모 디스플레이(Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이(Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54) 또는 T 세포 디스플레이(Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)를 포함하되 이에 국한되지 않는 디스플레이 방법에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 디스플레이 접근 방식은 공지된 모 또는 참조 TCR을 조작 또는 변형하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 여기 제공된 어느 하나와 같은 참조 TCR은 하나 이상의 CDR 잔기에서 돌연변이된 돌연변이를 일으킨 TCR을 생성하기 위한 주형으로 사용될 수 있고, 원하는 변경된 특성, 예컨대 MHC 분자의 상황에서 펩티드 에피토프에 대한 보다 높은 친화도를 갖는 돌연변이가 선택된다.
특정 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, 천연 레퍼토리, 예를 들어 인간 레퍼토리 서열과 비교하여 재조합 수용체, 예를 들어, TCR 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 치환 돌연변이 유발을 위한 관심 부위는 CDR, FR 및/또는 불변 영역을 포함한다. 원하는 활성, 예를 들어 보유/개선된 항원 친화도 또는 친화력, 감소된 면역원성 또는 개선된 반감기, CD8 독립적 결합 또는 활성, 표면 발현, TCR 사슬 짝짓기의 향상 및/또는 기타 개선된 특성 또는 기능에 대해 스크리닝되는 관심 결합 분자 및 생성물에 아미노산 치환이 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 TCR의 CDR 내의 하나 이상의 잔기가 치환된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 인간 대상체에 투여 시, 예를 들어 면역원성의 가능성을 감소시키기 위해, 생식 세포 계열(예를 들어, 인간 생식 세포 계열)에서 발견되는 결합 분자 서열과 같은 생식 세포 계열 서열로 서열 또는 서열에서의 위치를 복귀시키기 위한 치환이 이루어진다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 변경이 항원에 결합하는 재조합 수용체, 예를 들어 TCR 또는 이의 항원 결합 단편의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 CDR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 여기에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 CDR에서 이루어질 수 있다. 상기 변경은, 예를 들어 CDR의 항원 접촉 잔기 외부에 있을 수 있다. 여기에 제공된 가변 서열의 특정 구현예에서, 각각의 CDR은 변경되지 않거나 1 개, 2 개 또는 3 개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서 100 개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실- 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열 내 삽입을 포함한다.
일부 측면에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 α 사슬 및/또는 β 사슬에서 하나 이상의 변형을 함유할 수 있어서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 세포에서 발현될 경우, TCR α 사슬 및 β 사슬과 내인성 TCR α 사슬 및 β 사슬 사이의 짝짓기 오류 빈도가 감소하고/거나 TCR α 사슬 및 β 사슬의 발현이 증가하고/거나 TCR α 사슬 및 β 사슬의 안정성이 증가한다.
일부 구현예에서, TCR은 하나 이상의 비천연 시스테인 잔기를 함유하여 β 사슬의 불변 도메인의 면역 글로불린 영역의 잔기에 α 사슬의 불변 도메인의 면역 글로불린 영역의 잔기를 연결하는 공유 이황화물 결합을 도입한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인이 TCR 폴리펩티드의 제1 및 제2 세그먼트의 불변 영역 세포 외 서열로 통합될 수 있다. 비천연 시스테인 잔기를 도입하기 위한 TCR에서의 예시적인 비제한적 변경이 여기에 기재되어 있다(또한, 국제 출원 PCT 번호 WO2006/000830 및 WO2006037960 참조). 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화물 결합이 모두 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 항원 결합 단편은 천연 TCR에서 사슬 간 이황화 결합이 존재하지 않도록 변형된다.
일부 구현예에서, TCR의 불변 영역의 막관통 도메인은 보다 많은 수의 소수성 잔기를 함유하도록 변경될 수 있다(예를 들어 문헌[Haga-Friedman et al. (2012) Journal of Immunology, 188:5538-5546] 참조). 일부 구현예에서, TCR α 사슬의 막관통 영역은 서열 번호: 24에 제시된 Cα의 넘버링을 참조로, S116L, G119V 또는 F120L에 해당하는 하나 이상의 돌연변이를 함유한다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 코돈 최적화되었거나 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 예시적인 코돈 최적화 변이체는 여기 다른 곳에 기재된다.
Ⅴ. 조성물 및 제형
조작된 세포 집단, 상기 세포를 함유하고/거나 상기 세포로 농축된 조성물이 또한 제공된다. 조성물 중에는 예컨대 입양세포 요법에 대한 약학 조성물 및 투여용 제형이 있다. 또한 대상체, 예를 들어 환자에게 세포 및 조성물을 투여하기 위한 치료 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 제공된 세포 집단 및/또는 조작된 세포를 함유하는 조성물은, 전통적인 방법을 사용하여 생성된 조성물 및/또는 세포 집단의 발현 및/또는 항원 결합에 비해, 재조합 수용체에 의한 보다 개선된, 일정한, 균질한 및/또는 안정적인 발현 및/또는 항원 결합을 나타내는, 예를 들어 변이 계수의 감소를 나타내는 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단 및/또는 조성물은, 전통적인 방법, 예를 들어 전이 유전자의 무작위 통합을 사용하여 생성된 각각의 집단에 비해, 재조합 수용체에 의한 항원 결합 및/또는 전이 유전자 발현의 변이 계수가 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 이상 더 작다. 변이 계수는, 각각의 세포 집단 내 각각의 관심 핵산 발현의 평균으로 나누어진, 세포 집단, 예를 들어 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 내의 관심 핵산(예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 전이 유전자) 발현의 표준 편차로 정의된다. 일부 구현예에서, 세포 집단 및/또는 조성물은, 여기 제공된 방법을 사용하여 조작된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 집단 중에서 측정될 때 0.70, 0.65, 0.60, 0.55, 0.50, 0.45, 0.40, 0.35 또는 0.30 이하보다 작은 변이 계수를 나타낸다.
일부 구현예에서, 내인성 TCR 유전자의 유전자 좌 중 하나 이상으로 재조합 수용체 암호화 전이 유전자의 표적화된 녹인을 갖는 세포를 포함하는 세포 집단 및/또는 조성물이 제공되고, 이로써 내인성 TCR 유전자의 유전자 좌 중 하나 이상의 녹아웃, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2와 같은 통합을 위한 표적 유전자의 녹아웃을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체 암호화 전이 유전자의 통합을 갖는 세포 집단의 모든 또는 실질적으로 모든 세포는 또한 내인성 TCR 유전자의 유전자 좌 중 하나 이상의 녹아웃을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 세포 집단 및/또는 조성물의 세포 중 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이 내인성 TCR 유전자의 유전자 좌, 예를 들어 TRAC, TRBC1 및/또는 TRBC2 중 하나 이상의 녹아웃을 함유한다. 따라서, 제공된 세포 집단 및/또는 조성물에서, 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포의 전부 또는 실질적으로 전부가, 또한 내인성 TCR 유전자의 유전자 좌로 표적화된 전이 유전자의 녹인을 통해 내인성 TCR의 녹아웃을 함유한다.
일부 구현예에서, T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 내 하나 이상의 표적 부위의 유전자 파괴 및 전이 유전자에 의해 암호화된 재조합 수용체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 복수의 조작된 면역 세포를 포함하는 세포 집단 및/또는 조성물이 제공되고, 여기서 조성물 중 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 90% 이상 또는 초과의 세포가, T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 내 표적 위치에서 유전자 파괴를 포함하고; 재조합 TCR 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 표적 위치 또는 근처에서 표적화된다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체에 의한 발현 및/또는 항원 결합은 여기, 예를 들어 섹션 I.C.에 기재된 임의의 시약 및/또는 평가를 이용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현은 재조합 수용체 또는 이의 일부를 인식하고/거나 이에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 사용하여 측정된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 전이 유전자에 의해 암호화된 재조합 수용체의 발현은, 예를 들어, 유세포 분석에 의해 항-TCR Vβ 22 항체를 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, TCR인 재조합 수용체의 항원 결합은, 단리 또는 정제 또는 재조합인 항원, 특정 항원을 발현하는 세포를 사용하고/거나 TCR 리간드(MHC 펩티드 복합체)를 사용하여 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 내인성 TCR 암호화 유전자 중 하나 이상의 녹아웃을 함유하고/거나 재조합 수용체를 발현하는 세포와 같은 세포를 함유하는 제공된 조성물은 T 세포 또는 CD8+ 또는 CD4+ 세포와 같은 특정 유형의 세포 또는 조성물 중 전체 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 구성한다.
주어진 용량 또는 이의 분획으로 투여를 위한 세포의 수를 포함하는 단위 용량 형태 조성물과 같은 약학 조성물 및 제형을 포함한, 투여를 위한 세포를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 약학 조성물 및 제형은 일반적으로 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료제를 포함한다.
용어 "약학적 제형(pharmaceutical formulation)"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적일 수 있도록 하는 형태이고, 제형이 투여될 대상체에 허용 가능하지 않게 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 활성 성분이 아닌 약학 제형 안에 있는 성분을 지칭하고, 이는 대상체에 무독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 방부제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 담체의 선택은 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 존재한다. 예를 들어, 약학 조성물은 방부제를 함유할 수 있다. 적합한 방부제는 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산 나트륨 및 염화벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 2개 이상의 방부제가 혼합되어 사용된다. 방부제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물의 약 0.0001% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수용체에게 무독성이며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 방부제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3- 펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA 와 같은 킬레이팅제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 설탕; 나트륨과 같은 염 형성 카운터 이온; 금속 착물(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온 계면활성제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서 완충제는 조성물에 포함된다. 적합한 완충제는 예를 들어, 구연산, 구연산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 2 이상의 완충제 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물의 약 0.001% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법이 공지되어 있다. 예시적인 방법이, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
제형에는 수용액이 포함될 수 있다. 제형 또는 조성물은 또한 세포, 바람직하게는 세포에 상보적인 활성을 가진 것으로 치료될 특정 징후, 질병 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분을 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 활성이 서로 악영향을 미치지 않는다. 상기 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적절히 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은 화학 요법제, 예를 들어 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴 및/또는 빈크리스틴과 같은 다른 약학적 활성제 또는 약물을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서 약학 조성물은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량과 같이 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하기에 효과적인 양으로 세포를 함유한다. 일부 구현예에서 치료적 또는 예방적 효능은 치료 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 원하는 투여량은 세포의 단일 볼루스 투여, 세포의 다중 볼루스 투여 또는 세포의 지속적인 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
세포 및 조성물은 표준 투여 기술, 제형 및/또는 디바이스를 사용하여 투여될 수 있다. 세포의 투여는 자가 또는 이종일 수 있다. 예를 들어, 면역 반응성 세포 또는 전구체는 하나의 대상체로부터 수득될 수 있고, 동일한 대상체 또는 상이하고, 양립 가능한 대상체에 투여될 수 있다. 말초 혈액 유래 면역 반응성 세포 또는 이의 자손(예를 들어, 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내 유래)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 주사 또는 비경구 투여를 포함하는 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물(예를 들어, 유전자 변경 면역 반응성 세포를 함유하는 약학 조성물)을 투여할 때, 일반적으로 이는 주사 가능한 단위 투여량 형태(용액, 현탁액, 에멀젼)로 제형화될 것이다.
제형은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육, 비강, 볼, 설하 또는 좌약 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 비경구적으로 투여된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "비경구(parenteral)"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 이용하여 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서 조성물은 멸균 액체 제제로서, 예를 들어, 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액 또는 점성 조성물로 제공되며, 이는 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 제제는 일반적으로 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조가 보다 용이하다. 또한, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기가 다소 더 편리하다. 다른 한편으로, 점성 조성물은 특정 조직과의 보다 긴 접촉 기간을 제공하기 위해 적절한 점도 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 예를 들어, 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균 주사용 용액은 적합한 담체, 희석제 또는 멸균수, 생리식염수, 포도당, 덱스트로스 등과 같은 부형제와의 혼화물과 같은 용매에 세포를 통합함으로써 제조될 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 원하는 제조 경로에 따라 습윤제, 분산제 또는 유화제(예를 들어, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 방부제, 향미제 및/또는 색소와 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 적절한 제조를 위하여 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
항균 방부제, 항산화제, 킬레이팅제 및 완충액을 포함한 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제를 첨가할 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 및 소르브산에 의해 보장될 수 있다. 주사용 약학적 형태의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 초래될 수 있다.
생체 내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
Ⅵ. 입양 세포 요법에서의 투여 방법 및 용도
암을 포함한 질병, 병태 및 장애를 치료 또는 예방하기 위한 세포, 집단 및 조성물의 투여 방법 및 상기 세포, 집단 및 조성물의 용도가 제공된다. 일부 구현예에서, 세포, 집단 및 조성물은 치료될 특정 질병 또는 병태를 갖는 대상체 또는 환자에게 예를 들어, 입양 T 세포 요법과 같은 입양 세포 요법을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 제공된 방법에 의해 제조된 세포 및 조성물, 예컨대 조작된 조성물 및 인큐베이션 및/또는 기타 공정 단계 후의 최종 생산 조성물은 질병 또는 병태를 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체와 같은 대상체에 투여된다. 일부 측면에서, 이에 의한 방법은, 예컨대 조작된 T 세포에 의해 인식된 항원을 발현하는 암에서의 종양 부담을 감소시킴으로써 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상을 치료, 예를 들어, 개선한다.
여기에에 사용된 바와 같이, "대상체(subject)"는 인간 또는 다른 동물과 같은 포유동물이며, 전형적으로 인간이다. 일부 구현예에서, 세포, 세포 집단 또는 조성물이 투여되는 대상체, 예를 들어 환자는 인간과 같은 포유류, 전형적으로 영장류이다. 일부 구현예에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원(ape)이다. 상기 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있으며, 유아, 소아, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함한 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 설치류와 같은 비영장류 포유 동물이다.
여기에 사용된 바와 같은 "치료(treatment)"(및 "치료(treat)" 또는 "치료(treating)"와 같은 이의 문법적 변형)는 질병 또는 병태 또는 장애 또는 이와 관련된 증상, 불리한 효과 또는 결과 또는 표현형의 완전한 또는 부분적인 개선 또는 감소를 지칭한다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질병의 직접적 또는 간접적인 병리적 결과 중 어느 하나의 감소, 전이 방지, 질병 진행의 속도 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화 및 진정 또는 향상된 예후를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 용어는 질병의 완전한 치료 또는 모든 증상이나 결과에 있어 임의의 증상이나 결과(들)의 완전한 제거를 의미하지 않는다.
여기에 사용된 바와 같은 "질병의 발달 지연(delaying development of a disease)"은 질병(예컨대 암)의 발달을 미룸, 방해, 늦춤, 지연, 안정화, 억제 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 상기 지연은 치료될 개인 및/또는 병력에 따라 다양한 시간의 길이일 수 있다. 충분하거나 유의미한 지연은, 개인이 질병을 발달시키지 않는다는 점에서 사실상 예방을 포함할 수 있다. 예를 들면, 전이의 발달과 같은 말기 암이 지연될 수 있다.
여기에 사용된 바와 같은 "예방(preventing)"은 질병에 걸릴 성향을 가질 수 있으나 아직 질병으로 진단되지 않은 대상체에서 질병의 발생 또는 재발에 관하여 예방을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 세포 및 조성물은 질병의 발달을 지연시키거나 질병의 진행을 늦추는데 사용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 기능 또는 활성을 "억제(suppress)"하는 것은 다른 조건과 비교하여 또는 대안적으로 관심 조건 또는 파라미터를 제외하고 달리 동일한 조건과 비교할 때 기능 또는 활성을 감소시키는 것이다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 세포는 세포의 부재 하에서 종양의 성장 속도에 비해 종양의 성장 속도를 감소시킨다.
약학 제형, 세포 또는 조성물의 "유효량(effective amount)"은 투여의 상황에서, 치료적 또는 예방적 결과와 같은 원하는 결과를 달성하기 위해 투여량/양에서와 필요한 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
약학 제형 또는 세포의 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 예컨대 질병, 병태 또는 장애의 치료 및/또는 치료의 약동학적 또는 약력학적 효과를 위해 원하는 치료적 결과를 달성하기 위한 투여량에서와 필요한 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 대상체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중 및 투여된 세포 집단과 같은 인자에 따라 달라질 수있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포 및/또는 조성물을 유효량, 예를 들어 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
"예방적 유효량(prophylactically effective amount)"은 원하는 예방적 결과를 달성하기 위해 투여량에서와 필요한 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 반드시는 아니나 전형적으로, 예방 용량이 질병 이전 또는 초기 단계의 대상체에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다. 보다 낮은 종양 부담의 상황에서, 예방적 유효량은, 일부 측면에서, 치료적 유효량보다 더 높을 것이다.
입양 세포 요법을 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법 방법은, 예를 들어, 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 2003/0170238(Gruenberg et al); 미국 특허 번호 4,690,915(Rosenberg); Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338]을 참조한다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법은 자가 전달에 의해 수행되며, 상기 세포는 단리되고/거나 달리 세포 요법을 받은 대상체 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플로부터 제조된다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 대상체, 예를 들어 치료가 필요한 환자로부터 유래되고, 세포는 단리 및 가공 후에 동일한 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법은 동종 이계 전달에 의해 수행되며, 상기 세포는 단리되고/거나 달리 세포 요법을 받을 예정이거나 최종적으로 받은 대상체, 예를 들어 제1 대상체가 아닌 대상체로부터 제조된다. 상기 구현예에서, 이어서 세포는 상이한 대상체, 예를 들어, 같은 종의 제2 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 클래스 또는 수퍼타입(supertype)을 발현한다.
세포는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 복용량 및 투여는 투여가 짧거나 만성인지 여부에 부분적으로 의존할 수 있다. 다양한 복용량 스케쥴은 다양한 시점에 걸쳐 단일 또는 다수 투여, 볼러스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 대상체는, 예를 들어, 세포 또는 세포를 함유하는 조성물의 투여 전에 질병 또는 병태, 예를 들어, 종양을 표적화하는 치료제로 치료되었다. 일부 측면에서, 대상체는 다른 치료제에 대해 불응성이거나 반응적이지 않다. 일부 구현예에서, 대상체는, 예를 들어, 화학요법 또는 방사선 및/또는 조혈 줄기 세포 이식(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT), 예를 들어 동종이계 HSCT를 포함한 다른 치료적 개입으로 치료 후, 질병이 지속되거나 재발하였다. 일부 구현예에서, 상기 투여는 대상체가 다른 요법에 내성이 있음에도 불구하고 대상체를 효과적으로 치료한다.
일부 구현예에서, 대상체는 다른 치료제에 반응적이고, 상기 치료제로의 치료는 질병 부담을 감소시킨다. 일부 측면에서, 대상체는 처음에 상기 치료제에 반응적이나 시간이 지남에 따라 질병이나 병태의 재발을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상체는 재발하지 않았다. 상기 일부 구현예에서, 대상체는 재발의 위험이 높은 것과 같이 재발의 위험이 있는 것으로 결정되고, 따라서 세포는, 예를 들어 재발의 가능성을 낮추거나 재발을 예방하기 위해 예방적으로 투여된다.
일부 측면에서, 대상체는 다른 치료제로 사전 치료를 받지 않았다.
일부 측면에서, 치료되는 질병 또는 병태는, 항원의 발현이 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련, 이에 특이적 및/또는 이에서 발현되고/거나 질병, 병태 또는 장애의 병인에 수반, 예를 들어 상기 질병, 병태 또는 장애의 원인, 악화 또는 그렇지 않으면 이에 수반되는 임의의 것일 수 있다. 예시적인 질병 및 병태는 악성 종양 또는 세포의 형질 전환(예를 들어 암), 자가면역 또는 염증성 질환 또는 예를 들어 세균, 바이러스 또는 기타 병원체로 인한 감염성 질환과 관련된 질병 또는 병태를 포함할 수 있다. 치료될 수 있는 다양한 질병 및 병태와 관련된 항원을 포함하는 예시적인 항원들이 여기에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 면역 조절 폴리펩티드 및/또는 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체 또는 TCR은 질병 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병, 장애 또는 병태, 선택적으로 암, 종양, 자가면역 질환, 장애 또는 병태 또는 염증성 질환을 갖는다.
일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 다양한 암과 관련된 종양을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 대상체의 신체에 위치한 임의의 암, 예컨대 두부 및 경부, 유방, 간, 결장, 난소, 전립선, 췌장, 뇌, 자궁 경부, 뼈, 피부, 눈, 방광, 위, 식도, 복막 또는 폐에 위치한 암이나 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 항암제는 대장암, 자궁 경부암, 중추 신경계 암, 유방암, 방광암, 항문 암종, 두경부 암, 난소암, 자궁내막암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐 암종, 신경 내분비암, 연조직 암종, 음경암, 전립선암, 췌장암, 위암, 담낭암 또는 식도암 치료에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 암은 혈액 암일 수 있다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 종양, 예컨대 고형 종양, 림프종, 백혈병, 혈액 종양, 전이성 종양 또는 기타 암 또는 종양 유형이다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 결장, 폐, 간, 유방, 전립선, 난소, 피부, 흑색종, 뼈의 암, 뇌암, 난소암, 상피암, 신장 세포 암종, 췌장 선암, 자궁 경부 암종, 결장 직장암, 교모세포종, 신경모세포종, 유잉 육종(Ewing sarcoma), 수모세포종, 골육종, 활액 육종 및/또는 중피종 중에서 선택된다.
질병, 병태 및 장애 중에는 고형 종양, 혈액학적 악성 종양 및 흑색종을 포함한 종양이 있고, 국소화 및 전이성 종양, 감염성 질병, 예컨대 바이러스 또는 기타 병원체, 예를 들어 HIV, HCV, HBV, CMV, HPV로 인한 감염 및 기생충 질병 및 자가면역 질환 및 염증성 질환이 포함된다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 종양, 암, 악성 종양, 신생물 또는 기타 증식성 질병 또는 장애이다. 상기 질병은 백혈병, 림프종, 예를 들어, 급성 골수성(또는 골수형성) 백혈병(acute myeloid (or myelogenous) leukemia, AML), 만성 골수성(또는 골수형성) 백혈병(chronic myeloid (or myelogenous) leukemia, CML), 급성 림프구성(또는 림프아구성) 백혈병(acute lymphocytic (or lymphoblastic) leukemia, ALL), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 모발 세포 백혈병(hairy cell leukemia, HCL), 작은 림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma, SLL), 맨틀 세포 림프종(Mantle cell lymphoma, MCL), 변연부 림프종, 버키트 림프종, 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma, HL), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma, NHL), 역형성 거대 세포 림프종(Anaplastic large cell lymphoma, ALCL), 여포성 림프종, 불응성 여포성 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) 및 다발성 골수종(multiple myeloma, MM)을 포함하나 이에 제한되지 않고, B 세포 악성 종양은 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 성인 ALL, 만성 림프아구성 백혈병(CLL), 비호지킨 림프종(NHL) 및 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL) 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 감염성 질병 또는 병태이나, 예컨대 바이러스, 레트로바이러스, 박테리아 및 원생 동물 감염, 면역 결핍, 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 자가 면역 또는 염증성 질병 또는 병태, 예컨대 관절염, 예를 들어 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA), I 형 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 염증성 장 질환, 건선, 피부 경화증, 자가 면역 갑상선 질환, 그레이브병, 크론병, 다발성 경화증, 천식 및/또는 이식과 관련된 질병 또는 병태이다.
일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태와 관련된 항원은 ROR1, B 세포 성숙 항원(BCMA), 탄산 탈수 효소 9(CAIX), tEGFR, Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA 및 B 형 간염 표면 항원, 항 엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당 단백질 2(EPG-2), 상피 당 단백질 40(EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 2량체, EGFR vIII, 엽산 결합 단백질(folate binding protein, FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 키나제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 접착 분자(L1-cell adhesion molecule, L1-CAM), 흑색종 관련 항원(Melanoma-associated antigen, MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 흑색종 우선 발현 항원(Preferentially expressed antigen of melanoma, PRAME), 서바이빈(survivin), TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, Foetal AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암 고환 항원, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1(MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen, CEA), Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화 GD2(OGD2), CE7, 빌름스 종양(Wilms Tumor 1, WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, CD138, 병원체-특이적 항원 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애와 관련된 항원은 오펀(orphan) 티로신 키나제 수용체 ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA 및 B형 간염 표면 항원, 항 엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 접착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양 태아성 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아성 항원(CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2 및 MAGE A3 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 구현예에서, 세포는 원하는 투여량으로 투여되며, 이는 일부 측면에서 원하는 용량 또는 수의 세포 또는 세포 유형(들) 및/또는 원하는 비율의 세포 유형을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서 세포의 투여량은 세포의 총 수(또는 체중 kg 당 수) 및 원하는 비율의 개별 집단 또는 하위 유형, 예컨대 CD4+ 대 CD8+ 비율에 기초한다. 일부 구현예에서, 세포의 투여량은 개별 집단의 세포 또는 개별 세포 유형의 원하는 총 수(또는 체중 kg당 수)에 기초한다. 일부 구현예에서, 투여량은 상기 특성, 예컨대 개별 집단에서 총 세포의 원하는 수, 원하는 비율 및 세포의 원하는 총 수의 조합에 기초한다.
일부 구현예에서, 세포 집단 또는 하위 유형의 세포, 예컨대 CD8+ 및 CD4+ T 세포는 T 세포의 원하는 용량과 같은 총 세포의 원하는 용량의 허용된 차이로 또는 허용된 차이 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 원하는 세포 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위 당 원하는 세포 수, 예를 들어 세포/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 최소 세포 수 또는 최소 세포 수 이상 또는 체중 단위당 최소 세포 수이다. 일부 측면에서, 원하는 용량으로 투여되는 총 세포 중, 개별 집단 또는 하위 유형은 원하는 산출 비율(예컨대 CD4+ 대 CD8+ 비율) 또는 근처, 예를 들어 상기 비율의 특정 허용된 차이 또는 오류 내에 존재한다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 세포의 원하는 용량 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 용량과 같은 하나 이상의 개별 세포 집단 또는 하위 유형의 세포의 원하는 용량의 허용된 차이 또는 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 원하는 하위 유형 또는 집단의 세포 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위 당 원하는 상기 세포 수, 예를 들어 세포/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 집단 또는 하위 유형의 최소 세포 수 또는 그 이상 또는 체중 단위당 집단 또는 하위 유형의 최소 세포 수이다.
따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 총 세포의 원하는 고정 용량 및 원하는 비율에 기초하고/거나 하나 이상, 예를 들어 각각의 개별 하위 유형 또는 하위 집단의 원하는 고정 용량에 기초한다. 따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 T 세포의 원하는 고정 또는 최소 용량 및 CD4+ 대 CD8+ 세포의 원하는 비율에 기초하고/거나 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 고정 또는 최소 용량에 기초한다.
특정 구현예에서, 세포 또는 하위 유형의 개별 세포 집단은 약 1 백만 내지 약 1000억 개의 세포 범위, 예를 들어, 1 백만 내지 약 500억 세포 (예를 들어, 약 5 백만 세포, 약 25 백만 세포, 약 500 백만 세포, 약 10억 세포, 약 50억 세포, 약 200억 세포, 약 300억 세포, 약 400억 세포 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위), 예컨대 약 10 백만 내지 약 1000억 세포 (예를 들어, 약 20 백만 세포, 약 30 백만 세포, 약 40 백만 세포, 약 60 백만 세포, 약 70 백만 세포, 약 80 백만 세포, 약 90 백만 세포, 약 100억 세포, 약 250억 세포, 약 500억 세포, 약 750억 세포, 약 900억 세포 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위) 및 일부 경우에 약 100 백만 세포 내지 약 500억 세포 (예를 들어, 약 120 백만 세포, 약 250 백만 세포, 약 350 백만 세포, 약 450 백만 세포, 약 650 백만 세포, 약 800 백만 세포, 약 900 백만 세포, 약 30억 세포, 약 300억 세포, 약 450억 세포) 또는 상기 범위 사이 임의의 값과 같이 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 용량의 총 세포 및/또는 용량의 개별 하위 집단 세포는 체중 킬로그램(kg) 당 (약) 104 내지 (약) 109 개의 세포, 예컨대 105 내지 106 개의 세포/kg 체중, 예를 들어 (약) 1 x 105 세포/kg, 1.5 x 105 세포/kg, 2 x 105 세포/kg 또는 1 x 106 개의 세포/kg 체중의 범위 내에 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 (약) 104 내지 (약) 109 T 세포/킬로그램(kg) 체중, 예컨대 105 내지 106 T 세포/kg 체중, 예를 들어, (약) 1 x 105 T 세포/kg, 1.5 x 105 T 세포/kg, 2 x 105 T 세포/kg 또는 1 x 106 T 세포/kg 체중으로 또는 이의 특정 오차 범위 내에서 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 (약) 104 내지 (약) 109 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/킬로그램(kg) 체중, 예컨대 105 내지 106 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg 체중, 예를 들어, (약) 1 x 105 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg, 1.5 x 105 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg, 2 x 105 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg 또는 1 x 106 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포/kg 체중으로 또는 이의 특정 오차 범위 내에서 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 약 1 x 106, 약 2.5 x 106, 약 5 x 106, 약 7.5 x 106 또는 약 9 x 106 개 이상 및/또는 초과의 CD4+ 세포 및/또는 약 1 x 106, 약 2.5 x 106, 약 5 x 106, 약 7.5 x 106 또는 약 9 x 106 개 이상 및/또는 초과의 CD8+ 세포 및/또는 약 1 x 106, 약 2.5 x 106, 약 5 x 106, 약 7.5 x 106 또는 약 9 x 106 개 이상 및/또는 초과의 T 세포 또는 이의 특정 오차 범위 내에서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 약 108 내지 1012 또는 약 1010 내지 1011 개의 T 세포, 약 108 내지 1012 또는 약 1010 내지 1011 개의 CD4+ 세포 및/또는 약 108 내지 1012 또는 약 1010 내지 1011 개의 CD8+ 세포 또는 이의 특정 오차 범위 내에서 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 및 CD8+ 세포 또는 하위 유형과 같은 다중 세포 집단 또는 하위 유형의 원하는 산출 비율의 허용된 범위 또는 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 비율은 특정 비율일 수 있거나 비율의 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 원하는 비율(예를 들어, CD4+ 대 CD8+ 세포의 비율)은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1(또는 약 1:5 초과 내지 약 5:1 미만) 또는 (약) 1:3 내지 (약) 3:1(또는 약 1:3 초과 내지 약 3:1 미만), 예컨대 (약) 2:1 내지 (약) 1:5(또는 약 1:5 초과 내지 약 2:1 미만), 예컨대 (약) 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5 또는 1:5이다. 일부 측면에서, 허용된 차이는 원하는 비율의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50% (상기 범위 사이의 임의의 수치 포함) 이내이다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질병의 중증도 및 진행 과정, 세포가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료, 대상체의 임상 이력 및 세포에 대한 반응 및 주치의의 판단에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서 조성물 및 세포는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에 적합하게 투여된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, 용량은 약 5 x 108개보다 더 적은 총 재조합 수용체(예를 들어, 재조합 CAR) 발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵세포(PBMC), 예를 들어, 약 1 x 106 내지 1 x 108개의 상기 세포, 예컨대 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107 또는 1 x 108 개의 상기 총 세포의 범위 또는 상기 값 중 임의의 2개 사이 범위를 포함한다.
일부 측면에서, 단위 용량의 크기는 하나 이상의 기준, 예컨대 선행 요법, 예를 들어 화학요법에 대한 대상체의 반응, 대상체에서 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 부피, 크기 또는 전이의 등급, 정도 또는 유형, 단계 및/또는 대상체가 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성을 발달시킬 가능성 또는 발생률 및/또는 투여될 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기초하여 결정된다.
일부 측면에서, 용량의 크기는 대상체의 질병 또는 병태의 부담으로 결정된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 용량으로 투여되는 세포의 수는 세포 용량의 투여 개시 직전에 대상체에 존재하는 종양 부담에 기초하여 결정된다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 후속 용량의 크기는 질병 부담과 반대의 상관 관계가 있다. 일부 측면에서, 질병 부담이 큰 상황에서, 대상체에 적은 수의 세포가 투여된다. 다른 구현예에서, 질병 부담이 보다 작은 상황에서, 대상체에 보다 많은 수의 세포가 투여된다.
세포는, 임의의 적합한 수단, 예를 들어 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안구내(intraocular) 주사, 안구주위(periocular) 주사, 망막하(subretinal) 주사, 유리체내(intravitreal) 주사, 중격경유성(trans-septal) 주사, 공막하(subscleral) 주사, 맥락막내(intrachoroidal) 주사, 전방내(intracameral) 주사, 결막 하 주사(subconjectval injection, subconjuntival injection), 서브 테논(sub-Tenon) 주사, 안구뒤(retrobulbar) 주사, 안구주위(peribulbar) 주사 또는 후부 점막 주사(posterior juxtascleral) 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기는 비경구, 폐내 및 비강내 및 국소 치료가 바람직한 경우 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 단위 용량은 세포의 단일 볼루스 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 이는 예를 들어, 3일 이내의 기간에 걸쳐 세포의 다중 볼루스 투여에 의해, 또는 세포의 지속적인 주입 투여에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 다른 치료적 개입, 예컨대 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예컨대 세포 독성제 또는 치료제와 예컨대 동시에 또는 순차적으로, 어떠한 순서로든 조합 치료의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시이든 순차적이든 임의의 순서로 공투여된다. 일부 상황에서, 세포는 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료 제제의 효과를 강화하도록(또는 반대로) 시간에 있어 충분히 가깝게 다른 요법과 공투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제보다 앞서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어, 지속성을 향상시키기 위한 IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 화학요법제의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서 세포의 투여 후에, 조작된 세포 집단의 생물학적 활성이 예를 들어, 공지된 다수의 방법 중 하나에 의해 측정된다. 평가 파라미터는 생체 내에서, 예를 들어 영상화에 의해 또는 생체 외에서, 예를 들어 ELISA 또는 유세포 분석에 의해 항원에 대한 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포의 특이적 결합을 포함한다. 특정 구현예서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은, 예를 들어, 문헌[Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009) 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 기재된 세포 독성 평가와 같은 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 CD 107a, IFNγ, IL-2 및 TNF의 발현 및/또는 분비를 평가함으로써 측정된다. 일부 측면에서, 생물학적 활성은 종양 부담 또는 부하 감소와 같은 임상 결과를 평가함으로써 측정된다.
특정 구현예에서, 조작된 세포는 이들의 치료적 또는 예방적 효능이 증가하도록 임의의 다수의 방법으로 추가 변경된다. 예를 들어, 집단에 의해 발현된 조작된 CAR 또는 TCR은 표적화 모이어티에 링커를 통해 직접적으로든 간접적으로든 접합될 수 있다. 화합물, 예를 들어 TCR 또는 CAR을 표적화 모이어티에 접합시키는 실시는 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995) 및 미국 특허 5,087,616]을 참조한다.
Ⅶ. 키트 및 제조 물품
또한 제공된 구현예를 수행하는데 유용한 제조 물품, 시스템, 장치 및 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 제조 물품 또는 키트는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드(들), 예를 들어 재조합 수용체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 사슬을 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드 또는 하나 이상의 제2 주형 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 성분을 함유한다. 일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 재조합 수용체 및/또는 다른 폴리펩티드를 발현하도록 T 세포를 조작하고 제공된 방법에 따라 생산된 세포 및/또는 세포 집단을 평가하는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 여기에 제공된 제조 물품 또는 키트는 여기에 기재된 임의의 T 세포 및/또는 T 세포 조성물과 같은 T 세포 및/또는 T 세포 조성물을 함유한다.
일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 제공된 방법을 수행하는데 유용한 폴리펩티드, 핵산, 벡터 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드(들), 예를 들어 재조합 수용체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 사슬을 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드 또는 하나 이상의 제2 주형 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 성분을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자, 예를 들어, 플라스미드 또는 DNA 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 여기에 제공된 제조 물품 또는 키트는 대조군 벡터를 함유한다.
일부 구현예에서, 여기에 제공된 제조 물품 또는 키트는 하나 이상의 제제 - 여기서 하나 이상의 제제 각각은 독립적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 내 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있음 - ; 및 재조합 TCR 또는 이의 항원 결합 단편 또는 사슬을 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드 - 여기서 재조합 TCR 또는 이의 항원 결합 단편 또는 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 표적 부위 또는 근처에서 통합을 위해 표적화됨 - ;를 함유한다.
일부 구현예에서, 여기에 제공된 제조 물품 또는 키트는 여기에 기재된 임의의 T 세포 및/또는 T 세포 조성물과 같은 T 세포 및/또는 T 세포 조성물을 함유한다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 임의의 변형된 T 세포의 T 세포 조성물은 여기에 기재된 스크리닝 방법을 사용했다. 일부 구현예에서, 여기에 제공된 제조 물품 또는 키트는 대조군 T 세포 및/또는 T 세포 조성물을 함유한다.
일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포의 집단 및/또는 조성물의 특성을 평가하는데 사용되는 하나 이상의 성분을 포함한다. 예를 들어, 제조 물품 또는 키트는, 도입된 재조합 TCR의 특정 특성, 예를 들어, 재조합 TCR의 세포 표면 발현, MHC 분자의 상황에서 펩티드의 인식 및/또는 리포터, 예를 들어, T 세포 활성화 리포터에 의해 생성된 검출 가능한 신호를 평가하는데 사용되는 결합 시약, 예를 들어, 항체, MHC 펩티드 4량체 및/또는 프로브를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는, 표지된 성분, 예를 들어, 형광 표지된 성분 및/또는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 성분, 예를 들어, 형광 또는 발광을 생성할 수 있는 기질과 같은 특정 특성의 검출에 사용되는 성분을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 일반적으로 사용 지침, 예를 들어, 조작을 위해 세포로 성분을 도입하기 위한 지침 및/또는 조작된 세포 집단 및/또는 조성물을 평가하기 위한 지침을 포함하는, 하나 이상의 컨테이너, 전형적으로 다수의 컨테이너, 패키징 물질 및 컨테이너 또는 컨테이너들 및/또는 패키징 상에 또는 이와 관련된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 요법을 위한 조작된 세포 및/또는 세포 조성물의 투여를 위한 하나 이상의 지침을 포함한다.
여기에 제공된 제조 물품은 패키징 물질을 함유한다. 제공된 재료를 패키징하는데 사용하기 위한 패키징 물질은 공지되어 있다. 예를 들어, 이의 각각이 여기에 완전히 편입된 문헌[미국 특허 번호 5,323,907, 5,052,558 및 5,033,252]을 참조한다. 패키징 물질의 예에는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 컨테이너, 주사기, 일회용 실험실 용품, 예를 들어, 피펫 팁 및/또는 플라스틱 플레이트 또는 병이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 제조 물품 또는 키트는 재료의 분배를 용이하게 하거나 고처리량 또는 대규모 방식으로 사용을 용이하게 하기 위한, 예를 들어, 로봇 장비에서의 사용을 용이하게 하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 전형적으로, 패키징은 그 안에 함유된 조성물과 반응하지 않는다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드(들)는 별도로 포장된다. 일부 구현예에서, 각 컨테이너는 단일 구획을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트의 다른 성분은 개별적으로 포장되거나 또는 단일 구획에 함께 포장된다.
Ⅷ. 정의
달리 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 기술 및 과학 용어 또는 전문 용어는 청구된 주제가 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 여기에 정의되며, 여기에 상기 정의의 포함은 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되어서는 안된다.
용어 "폴리펩티드(polypeptide)" 및 "단백질(protein)"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용되며, 최소 길이로 제한되지 않는다. 제공된 항체 및 항체 사슬 및 다른 펩티드, 예를 들어 링커를 포함하는 폴리펩티드는 천연 및/또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 변형, 예를 들어 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리펩타이드는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한 천연 또는 천연 서열에 대한 변형을 함유할 수 있다. 상기 변형은 부위-지정 돌연변이 유발을 통한 것과 같이 고의적일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통한 것과 같이 우발적일 수 있다.
"단리된(isolated)" 핵산은 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외 또는 이의 천연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"TCR 또는 항체를 암호화하는 단리된 핵산(isolated nucleic acid encoding a TCR or an antibody)"은 단일 벡터 또는 별도의 벡터에 있는 상기 핵산 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 상기 핵산 분자(들)를 포함하여, TCR α 또는 β 사슬(또는 이의 단편) 또는 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭한다.
용어 "숙주 세포(host cell)", "숙주 세포주(host cell line)" 및 "숙주 세포 배양(host cell culture)"은 상호 교환적으로 사용되며, 상기 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질 전환체(transformants)" 및 "형질 전환된 세포(transformed cells)"를 포함하고, 이는 1 차 형질 전환 세포 및 계대 수에 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질 전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 여기에 포함된다.
일부 구현예에서, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 적절한 분자(예를 들어, 전사 활성제 단백질)가 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 허용하는 방식으로 DNA 서열과 같은 성분, 예를 들어 이종 핵산 및 조절 서열(들)의 결합을 포함할 수 있다. 따라서, 기재된 성분은 이들이 의도된 방식으로 작용하도록 허용하는 관계에 있음을 의미한다.
여기에 사용된 바와 같이, "아미노산 서열 동일성 백분율(percent (%) amino acid sequence identity)" 및 "동일성 백분율(percent identity)"이 아미노산 서열(기준 폴리펩티드 서열)에 대하여 사용될 경우, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고 최대 백분율의 서열 동일성을 달성하기 위해 서열 및 필요하다면 도입 갭을 정렬한 후 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열(예를 들어, 대상 항체 또는 단편)에서 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 기술 범위 내에서 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 비교될 서열의 전장에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터가 결정될 수 있다.
아미노산 치환은 폴리펩티드에서 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 교체하는 것을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은 관심 결합 분자, 예를 들어 항체에 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 보유/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
아미노산은 일반적으로 하기와 같은 공통적인 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르루신(Norleucine), Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
일부 구현예에서, 보존적 치환은 상기 클래스 중 하나의 멤머를 동일한 클래스의 다른 멤버로의 교환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비보존적 아미노산 치환은 상기 클래스 중 하나의 멤버를 다른 클래스로 교환하는 것을 포함할 수 있다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "벡터(vector)"는 이에 연결된 다른 핵산을 번식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 및 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 편입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 여기에서 "발현 벡터(expression vector)"로 지칭된다.
용어 "패키징 삽입물(package insert)"은 지시, 사용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 상기 치료 산물의 용도와 관련한 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유한 치료 산물의 상업적 패키지에 관례적으로 포함되는 지시 사항을 지칭하기 위해 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "a" 또는 "an"은 "적어도 하나(at least one)" 또는 "하나 이상(one or more)"을 의미한다. 여기에 기재된 측면 및 변형은 측면 및 변형을 "구성하는(consisting)" 및/또는 "본질적으로 구성하는(consisting essentially of)"을 포함하는 것으로 이해된다.
본 개시를 통해, 청구된 주제의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며 청구된 주제의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위 범위 및 상기 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 수치의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한 내지 하한 사이 각각의 사이에 오는 수치와 상기 언급된 범위에서 임의의 다른 언급되거나 사이에 오는 수치가 청구된 주제 내에 포함되는 것으로 이해된다. 상기 더 작은 범위의 상한 내지 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한도를 조건으로 청구된 주제 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 청구된 주제에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
여기에 사용된 바와 같은 용어 "약(about)"은 본 기술 분야의 당업자에게 용이하게 알려진 각각의 수치에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다. 여기에서 "약(about)" 수치 또는 파라미터에 대한 언급은 상기 수치 또는 파라미터 자체에 관한 구현예를 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X(about X)"를 지칭하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다. 일부 구현예에서, "약(about)"은 ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±1%를 지칭할 수 있다.
여기에 사용된 바와 같이, 조성물은 세포를 포함하여 둘 이상의 생성물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다.
여기에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성(positive)"이라는 진술은 특정 마커, 전형적으로 표면 마커가 세포 상에 또는 세포 내에 검출 가능하게 존재함을 지칭한다. 표면 마커를 언급할 때, 상기 용어는 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써, 유세포 분석에 의해 검출된 바와 같은 표면 발현의 존재를 지칭하며, 상기 염색은 달리 동일한 조건 하에서 아이소타이프-매칭된 대조군으로 같은 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 분석에 의해 검출 가능하다.
여기에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성(negative)"이라는 진술은 특정 마커, 전형적으로 표면 마커가 세포에 또는 세포 상에 실질적으로 검출 가능하게 존재하지 않음을 지칭한다. 표면 마커를 언급할 때, 상기 용어는 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써, 유세포 분석에 의해 검출된 바와 같은 표면 발현의 부재를 지칭하며, 여기에서 상기 염색은 달리 동일한 조건 하에서 아이소타이프-매칭된 대조군으로 같은 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 낮은 수준에서 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 것과 비교하여 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 분석에 의해 검출되지 않는다.
본 출원에서 언급된 특허 문헌, 과학 논문 및 데이터베이스를 포함한 모든 출판물은 각각의 개별 출판물이 개별적으로 참조로 통합된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 여기에 제시된 정의가 여기에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 출판물에 제시된 정의와 상반되거나 달리 부합하지 않는 경우, 여기에 제시된 정의가 여기에 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
여기에 사용된 섹션 제목은 단지 조직화를 위한 목적이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
Ⅸ. 예시적인 구현예
제공된 구현예 중에는 하기가 있다:
1. 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 T 세포로서, 상기 변형된 TRAC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬 및 (ii) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRβ 및 Vα 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 재조합 TCR의 Cα 도메인의 적어도 일부를 암호화하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
2. 구현예 1에서, 상기 전이 유전자 서열은 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 통합된 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에서, 상기 변형된 TRAC 유전자 좌는 (i) 전이 유전자 서열 및 (ii) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 인프레임 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
4. 구현예 1-3 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 3' 비번역 영역(3' UTR) 또는 인트론을 암호화하는 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
5. 구현예 1-4 중 어느 하나에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 3' UTR을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
6. 구현예 1-5 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, 상기 Cα의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 추가 부분은 전장 천연 Cα보다 짧은 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
7. 구현예 1-6 중 어느 하나에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
8. 구현예 1-7 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 인프레임인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
9. 구현예 1-8 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 최대 5' 뉴클레오티드의 하류 및 엑손 1의 최대 3' 뉴클레오티드의 상류에서 통합되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
10. 구현예 1-9 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 적어도 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 적어도 엑손 2-4에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
11. 구현예 1-10 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 적어도 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 적어도 엑손 1의 일부 및 엑손 2-4에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
12. 구현예 1-11 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 적어도 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 전장 미만에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
13. 구현예 1-12 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 TCRα 사슬은 TCRβ 사슬과 2량체화될 수 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
14. 구현예 1-13 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 Cα는 서열 번호: 14, 15, 19 또는 24 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 14, 15, 19 또는 24 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
15. 구현예 6-14 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
16. 구현예 6-15 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 400 개 미만, 300 개 미만, 250 개 미만, 200 개 미만 또는 150 개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
17. 구현예 14 또는 구현예 15에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 4 개 미만의 엑손, 3 개 미만의 엑손, 2 개 미만의 엑손, 1 개의 엑손 또는 1 개의 전체 엑손 미만의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
18. 구현예 6-17 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 전장 오픈 리딩 프레임보다 짧은 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
19. 구현예 6-18 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 엑손 1의 5' 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
20. 구현예 6-19 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 서열 번호: 142에 제시된 서열 또는 서열 번호: 142에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
21. 구현예 6-20 중 어느 하나에 있어서, (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
22. 구현예 1-21 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 T 세포는 TRBC 유전자 좌의 유전자 파괴를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
23. 구현예 1-22 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 T 세포는 TRBC1 유전자 좌 및/또는 TRBC2 유전자 좌의 유전자 파괴를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
24. 구현예 1-23 중 어느 하나에 있어서, (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
25. 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 T 세포로서, 상기 변형된 TRBC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬 및 (ii) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬을 포함하며, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRα 및 Vβ 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 재조합 TCR의 Cβ 도메인의 적어도 일부를 암호화하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
26. 구현예 25에서, 상기 전이 유전자 서열은 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 통합된 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
27. 구현예 25 또는 구현예 26에서, 상기 TRBC 유전자 좌는 TRBC1 유전자 좌 및/또는 TRBC2 유전자 좌인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
28. 구현예 25 또는 구현예 26에서, 상기 변형된 TRBC 유전자 좌는 (i) 전이 유전자 서열 및 (ii) 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 인프레임 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
29. 구현예 25-28 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 3' 비번역 영역(3' UTR) 또는 인트론을 암호화하는 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
30. 구현예 25-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 3' UTR을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
31. 구현예 25-30 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cβ의 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cβ의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cβ의 추가 부분은 천연 Cβ의 전장보다 짧은 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
32. 구현예 25-31 중 어느 하나에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
33. 구현예 25-32 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
34. 구현예 25-33 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 최대 5' 뉴클레오티드의 하류 및 엑손 1의 최대 3' 뉴클레오티드의 상류에서 통합되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
35. 구현예 25-34 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cβ의 적어도 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 적어도 엑손 2-4에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
36. 구현예 25-35 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cβ의 적어도 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 적어도 엑손 1의 일부 및 엑손 2-4에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
37. 구현예 25-36 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cβ의 적어도 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 전장 미만에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
38. 구현예 25-37 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 TCRβ 사슬은 TCRα 사슬과 2량체화될 수 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
39. 구현예 25-38 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 Cβ는 서열 번호: 16, 17, 21 또는 25 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 16, 17, 21 또는 25에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
40. 구현예 31-39 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 서열 번호: 2에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1445번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 2에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1445번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열; 또는 서열 번호: 3에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1486번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 3에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1486번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열;에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
41. 구현예 31-40 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 400 개 미만, 300 개 미만, 250 개 미만, 200 개 미만 또는 150 개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
42. 구현예 35 또는 구현예 36에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 4 개 미만의 엑손, 3 개 미만의 엑손, 2 개 미만의 엑손, 1 개의 엑손 또는 1 개의 전체 엑손 미만의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
43. 구현예 31-42 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 TRBC 유전자 좌의 엑손 1 오픈 리딩 프레임의 전장보다 더 짧은 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
44. 구현예 31-43 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 엑손 1의 5' 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
45. 구현예 25-44 중 어느 하나에 있어서, (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cβ의 추가 부분 및/또는 Cα 영역은 천연 Cβ 영역 및/또는 천연 Cα 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
46. 구현예 25-45 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 T 세포는 TRAC 유전자 좌의 유전자 파괴를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
47. 구현예 1-46 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 하나 이상의 다중 시스트론 요소(들)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
48. 구현예 47에서, 상기 다중 시스트론 요소(들)는 TCRα 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 TCRβ 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
49. 구현예 47 또는 구현예 48에 있어서, 상기 하나 이상의 다중 시스트론 요소(들)는 TCR 또는 TCR의 일부를 암호화하는 핵산 서열 또는 TCR을 암호화하는 핵산 분자의 상류에 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
50. 구현예 47-49 중 어느 하나에 있어서, 상기 다중 시스트론 요소는 리보솜 건너뛰기 서열, 선택적으로 T2A, P2A, E2A 또는 F2A이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
51. 구현예 1-50 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 이종 조절 또는 제어 요소(들)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
52. 구현예 1-51 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은, 유전자 조작된 T 세포가 도입된 세포에서 발현될 경우, TCR의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종 또는 조절 제어 요소(들)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
53. 구현예 51 또는 구현예 52에 있어서, 상기 하나 이상의 이종 조절 또는 제어 요소는 프로모터, 인핸서(enhancer), 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 컨센서스 서열(Kozak consensus sequence), 스플라이스 수용체 서열 및/또는 스플라이스 공여체 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
54. 구현예 51-53 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종 조절 또는 제어 요소는 이종 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
55. 구현예 54에 있어서, 상기 이종 프로모터는 구성적 프로모터, 유도 가능 프로모터, 억제 가능 프로모터 및/또는 조직 특이적 프로모터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
56. 구현예 54 또는 구현예 55에 있어서, 상기 이종 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 MND 프로모터 또는 이의 변이체이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
57. 구현예 1-56 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 TCR의 Cα 및/또는 Cβ는 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
58. 구현예 1-57 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 TCR은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 항원과 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
59. 구현예 1-58 중 어느 하나에 있어서, 상기 질병, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 종양 또는 암인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
60. 구현예 1-59 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원은 종양 항원 또는 병원체성 항원인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
61. 구현예 60에 있어서, 상기 병원성 항원은 세균성 항원 또는 바이러스성 항원인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
62. 구현예 61에 있어서, 상기 항원은 바이러스성 항원, 선택적으로 A형 간염, B형 간염, C형 간염 바이러스(HCV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 간염 바이러스 감염, 엡스타인 바 바이러스(EBV), 인간 헤르페스 바이러스 8(HHV-8), 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1(HTLV-1), 인간 T 세포 백혈병 바이러스 2(HTLV-2) 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 유래 바이러스성 항원인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
63. 구현예 61 또는 구현예 62에 있어서, 상기 바이러스성 항원은 HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 및 HPV-35 중에서 선택된 HPV 유래 항원인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
64. 구현예 61 또는 구현예 62에 있어서, 상기 바이러스성 항원은 HPV-16 E6 또는 HPV-16 E7 항원인 HPV-16 항원인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
65. 구현예 61 또는 구현예 62에 있어서, 상기 바이러스성 항원은 엡스타인-바 핵 항원(EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA 리더 단백질(EBNA-LP), 잠재성 막 단백질 LMP-1, LMP-2A 및 LMP-2B, EBV-EA, EBV-MA 및 EBV-VCA 중에서 선택된 EBV 항원인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
66. 구현예 61 또는 구현예 62에 있어서, 상기 바이러스성 항원은 TAX인 HTLV 항원인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
67. 구현예 61 또는 구현예 62에 있어서, 상기 바이러스성 항원은 B형 간염 코어 항원 또는 B형 간염 외피 항원인 HBV 항원인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
68. 구현예 61 또는 구현예 62에 있어서, 상기 항원은 종양 항원인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
69. 구현예 59 또는 구현예 60에 있어서, 상기 항원은 신경 교종 관련 항원, β-인간 융모막 성선 자극 호르몬, 알파페토프로테인(alphafetoprotein, AFP), 렉틴 반응성 AFP, 다이로글로블린(thyroglobulin), RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스터라제, mut hsp70-2, M-CSF, 멜라닌-A/MART-1, WT-1, S-100, MBP, CD63, MUC1(예를 들어, MUC1-8), p53, Ras, 사이클린 B1, HER-2/neu, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen, CEA), gp100, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A11, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-C1, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5, 티로시나제(예를 들어, 티로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase-related protein 1, TRP-1) 또는 티로시나제 관련 단백질 2(TRP-2)), β-카테닌, NY-ESO-1, LAGE-1a, PP1, MDM2, MDM4, EGVFvIII, Tax, SSX2, 텔로머라제, TARP, pp65, CDK4, 비멘틴, S100, eIF-4A1, IFN 유도성 p78, 멜라노트랜스페린(p97), 우로플라킨(Uroplakin) II, 전립선 특이적 항원(prostate specific antigen, PSA), 인간 칼리크레인(human kallikrein, huK2), 전립선 특이적 막 항원(prostate specific membrane antigen, PSM) 및 전립선산 포스파타아제(prostatic acid phosphatase, PAP), 호중구 엘라스타제, 에프린 B2, BA-46, Bcr-abl, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 카스파제 8, FRa, CD24, CD44, CD133, CD 166, epCAM, CA-125, HE4, 오발(Oval), 에스트로겐 수용체, 프로게스트론 수용체, uPA, PAI-1, CD19, CD20, CD22, ROR1, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, GD-2, 인슐린 성장 인자(insulin growth factor, IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
70. 구현예 1-69 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 대상체로부터 유래된 1차 T 세포이고, 선택적으로 상기 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
71. 구현예 1-70 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포 또는 이의 하위 유형인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
72. 구현예 1-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포 또는 이의 하위 유형인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
73. 구현예 1-72 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 다능성 또는 만능 세포로부터 유래되고, 이는 선택적으로 iPSC인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
74. 구현예 1-73 중 어느 하나의 복수의 유전자 조작된 T 세포를 포함하는 조성물.
75. 구현예 74에 있어서, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
76. 구현예 74 또는 구현예 75에 있어서, 상기 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:3 내지 3:1, 선택적으로 1:1인 것을 특징으로 하는, 조성물.
77. 구현예 74-76 중 어느 하나에 있어서, 조성물 중 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 조작된 세포가, 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자의 유전자 파괴 또는 상기 유전자에서 유전자 파괴를 포함하고/거나; 조성물 중 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 조작된 세포가, 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자의 유전자 생성물을 발현하지 않거나 검출 가능한 수준으로 발현하지 않는 것을 특징으로 하는, 조성물.
78. 구현예 74-77 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 중 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 90% 이상 또는 초과의 세포가 재조합 TCR을 발현하고/거나 항원 결합을 나타내는 것을 특징으로 하는, 조성물.
79. 폴리뉴클레오티드로서, (a) 재조합 T 세포 수용체(TCR)의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 핵산 서열은 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬; 및 (ii) T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부;를 암호화하고, 여기서 상기 TCRα 사슬의 일부는 천연 TCRα 사슬 전장보다 더 짧음 - ; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 여기서 상기 하나 이상의 상동성 암은 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함함 - ;을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
80. 구현예 79에 있어서, 상기 TCRα 사슬은 불변 알파 영역(Cα)을 포함하고, 여기서 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, 상기 Cα의 적어도 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
81. 구현예 79 또는 구현예 80에 있어서, (a)의 핵산 서열 및 하나 이상의 상동성 암 중 하나가 함께 천연 Cα의 전장보다 짧은 Cα를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기에서 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, 상기 Cα의 적어도 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
82. 구현예 79-81 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
83. 구현예 79-82 중 어느 하나에 있어서, 상기 TCRβ 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 TCRα 사슬의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 상류에 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
84. 구현예 79-83 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 인트론을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
85. 구현예 79-84 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 T 세포, 선택적으로 인간 T 세포의 내인성 게놈 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에 대해 이종성 또는 외인성 서열인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
86. 구현예 79-85 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 하나 이상의 상동성 암(들)에 포함된 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
87. 구현예 79-86 중 어느 하나에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열은 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1 내 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
88. 구현예 79-87 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, TCRα 사슬은 TCRβ 사슬과 2량체화될 수 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
89. 구현예 79-88 중 어느 하나에 있어서, 상기 TCRα 사슬의 일부는 가변 알파(Vα) 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
90. 구현예 79-89 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cα의 추가 부분은 (a)의 핵산 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 추가 부분은 전장 천연 Cα보다 짧은 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
91. 구현예 90에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하여 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하여 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
92. 구현예 91에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 400 개 미만, 300 개 미만, 250 개 미만, 200 개 미만 또는 150 개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
93. 구현예 91 또는 구현예 92에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 4 개 미만의 엑손, 3 개 미만의 엑손, 2 개 미만의 엑손, 1 개의 엑손 또는 1 개의 전체 엑손 미만의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
94. 구현예 91-93 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 전장 오픈 리딩 프레임보다 더 짧은 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
95. 구현예 90-94 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 엑손 1의 5' 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
96. 구현예 79-95 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 서열 번호: 142에 제시된 서열 또는 서열 번호: 142에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
97. 구현예 79-96 중 어느 하나에 있어서, (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
98. 구현예 79-97 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 상동성 암은 5' 상동성 암 및/또는 3' 상동성 암을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
99. 구현예 98에 있어서, 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 표적 부위 주변 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함하고, 여기에서 상기 표적 부위는 TRAC 유전자 좌 내에 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
100. 구현예 99에 있어서, 상기 표적 부위는 TRAC 유전자 좌의 엑손 1 내에 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
101. 구현예 98-100 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' 상동성 암은 a) 서열 번호: 124에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열의 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600 개 (이상)의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 서열; b) 서열 번호: 124에 제시된 서열의 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600 개 (이상)의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는 c) 서열 번호: 124에 제시된 서열;을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
102. 구현예 98-101 중 어느 하나에 있어서, 상기 3′상동성 암은 a) 서열 번호: 125에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열의 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600 개 (이상)의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 서열; b) 서열 번호: 125에 제시된 서열의 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600 개 (이상)의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는 c) 서열 번호: 125에 제시된 서열;을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
103. 폴리뉴클레오티드로서, (a) 재조합 T 세포 수용체(TCR)의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 핵산 서열은 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬; 및 (ii) T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬의 일부;를 암호화하고, 여기에서 상기 TCRβ 사슬의 일부는 천연 TCRβ 사슬 전장보다 더 짧음 - ; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 여기에서 상기 하나 이상의 상동성 암은 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함함 - ;을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
104. 구현예 103에 있어서, 상기 TCRβ 사슬은 불변 베타(Cβ)를 포함하고, 여기에서 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, 상기 Cβ의 적어도 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
105. 구현예 103 또는 구현예 104에 있어서, (a)의 핵산 서열 및 하나 이상의 상동성 암 중 하나가 함께 천연 Cβ의 전장보다 짧은 Cβ를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기에서 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, 상기 Cβ의 적어도 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
106. 구현예 103-105 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
107. 구현예 103-106 중 어느 하나에 있어서, 상기 TRBC 유전자 좌는 TRBC1 또는 TRBC2 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
108. 구현예 103-107 중 어느 하나에 있어서, 상기 TCRα 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 TCRβ 사슬의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 상류에 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
109. 구현예 103-108 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 인트론을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
110. 구현예 103-109 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 T 세포, 선택적으로 인간 T 세포의 내인성 게놈 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에 대해 이종성 또는 외인성 서열인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
111. 구현예 103-110 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 하나 이상의 상동성 암(들)에 포함된 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
112. 구현예 103-111 중 어느 하나에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열은 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1 내 서열이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
113. 구현예 103-112 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, TCRβ 사슬은 TCRα 사슬과 2량체화될 수 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
114. 구현예 103-113 중 어느 하나에 있어서, 상기 TCRβ 사슬의 일부는 가변 베타(Vβ) 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
115. 구현예 103-114 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cβ의 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cβ의 추가 부분은 (a)의 핵산 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cβ의 추가 부분은 천연 Cβ의 전장보다 짧은 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
116. 구현예 115에 있어서, 상기 Cβ의 추가 부분은 서열 번호: 2에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하여 1445번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 2에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하여 1445번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열; 또는 서열 번호: 3에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하여 1486 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 3에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하여 1486 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열;에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
117. 구현예 115 또는 구현예 116에 있어서, 상기 Cβ의 추가 부분은 400 개 미만, 300 개 미만, 250 개 미만, 200 개 미만 또는 150 개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
118. 구현예 115-117 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cβ의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 4 개 미만의 엑손, 3 개 미만의 엑손, 2 개 미만의 엑손, 1 개의 엑손 또는 1 개의 전체 엑손 미만의 오픈 리딩 프레임을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
119. 구현예 115-118 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cβ의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 TRBC 유전자 좌의 엑손 1의 전장 오픈 리딩 프레임보다 더 짧은 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
120. 구현예 115-119 중 어느 하나에 있어서, TCRα 불변 도메인의 상기 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 엑손 1의 5' 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
121. 구현예 115-120 중 어느 하나에 있어서, (a)의 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cβ의 추가 부분 및/또는 Cα 영역은 천연 Cβ 영역 및/또는 천연 Cα 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
122. 구현예 115-121 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 상동성 암은 5' 상동성 암 및/또는 3' 상동성 암을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
123. 구현예 122에 있어서, 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 표적 부위 주변 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함하고, 여기에서 상기 표적 부위는 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내에 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
124. 구현예 123에 있어서, 상기 표적 부위는 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1 내에 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
125. 구현예 98-100 및 122-124 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 이상의 뉴클레오티드 또는 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 개 미만의 뉴클레오티드인 것을 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
126. 구현예 125에 있어서, 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 100 내지 1000 개의 뉴클레오티드, 100 내지 750 개의 뉴클레오티드, 100 내지 600 개의 뉴클레오티드, 100 내지 400 개의 뉴클레오티드, 100 내지 300 개의 뉴클레오티드, 100 내지 200 개의 뉴클레오티드, 200 내지 1000 개의 뉴클레오티드, 200 내지 750 개의 뉴클레오티드, 200 내지 600 개의 뉴클레오티드, 200 내지 400 개의 뉴클레오티드, 200 내지 300 개의 뉴클레오티드, 300 내지 1000 개의 뉴클레오티드, 300 내지 750 개의 뉴클레오티드, 300 내지 600 개의 뉴클레오티드, 300 내지 400 개의 뉴클레오티드, 400 내지 1000 개의 뉴클레오티드, 400 내지 750 개의 뉴클레오티드, 400 내지 600 개의 뉴클레오티드, 600 내지 1000 개의 뉴클레오티드, 600 내지 750 개의 뉴클레오티드 또는 750 내지 1000 개의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
127. 구현예 125 또는 구현예 126에 있어서, 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 600 개 또는 약 600 개 미만의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
128. 구현예 79-127 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 하나 이상의 다중 시스트론 요소(들)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
129. 구현예 128에 있어서, 상기 다중 시스트론 요소(들)는 TCRα 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 TCRβ 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
130. 구현예 128 또는 구현예 129에 있어서, 상기 하나 이상의 다중 시스트론 요소(들)는 TCR 또는 TCR의 일부를 암호화하는 핵산 서열 또는 TCR을 암호화하는 핵산 분자의 상류에 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
131. 구현예 129 또는 구현예 130에 있어서, 상기 다중 시스트론 요소는 리보솜 건너뛰기 서열, 선택적으로 T2A, P2A, E2A 또는 F2A이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
132. 구현예 79-131 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 이종 조절 또는 제어 요소(들)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
133. 구현예 79-132 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, TCR의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종 또는 조절 제어 요소(들)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
134. 구현예 132 또는 구현예 133에 있어서, 상기 하나 이상의 이종 조절 또는 제어 요소는 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 컨센서스 서열, 스플라이스 수용체 서열 및/또는 스플라이스 공여체 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
135. 구현예 132-134 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종 조절 또는 제어 요소는 이종 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
136. 구현예 135에 있어서, 상기 이종 프로모터는 구성적 프로모터, 유도 가능 프로모터, 억제 가능 프로모터 및/또는 조직 특이적 프로모터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
137. 구현예 135 또는 구현예 136에 있어서, 상기 이종 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 MND 프로모터 또는 이의 변이체이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
138. 구현예 82-102 또는 106-137 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
139. 구현예 138에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
140. 구현예 139에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV6 벡터인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
141. 구현예 82-102 또는 106-137 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
142. 구현예 82-102 또는 106-137 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
143. 구현예 79-81, 84-105 또는 107-137 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 선형 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
144. 구현예 143에 있어서, 상기 선형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
145. 구현예 144에 있어서, 상기 선형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
146. 구현예 79-145 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 [5' 상동성 암]-[(a)의 핵산 서열]-[3' 상동성 암] 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
147.
구현예 128-146 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 [5' 상동성 암]-[다중 시스트론 요소]-[(a)의 핵산 서열]-[3' 상동성 암] 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
148.
구현예 134-147 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 [5' 상동성 암]-[프로모터]-[(a)의 핵산 서열]-[3' 상동성 암] 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
149. 구현예 79-148 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 TCR은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 항원과 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
150. 구현예 149에 있어서, 상기 질병, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 종양 또는 암인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
151. 구현예 149에 있어서, 상기 항원은 종양 항원 또는 병원성 항원인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
152. 구현예 151에 있어서, 상기 병원성 항원은 세균성 항원 또는 바이러스성 항원인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
153. 구현예 152에 있어서, 상기 항원은 바이러스성 항원, 선택적으로 A형 간염, B형 간염, C형 간염 바이러스(HCV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 간염 바이러스 감염, 엡스타인 바 바이러스(EBV), 인간 헤르페스 바이러스 8(HHV-8), 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1(HTLV-1), 인간 T 세포 백혈병 바이러스 2(HTLV-2) 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 유래 바이러스성 항원인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
154. 구현예 152 또는 구현예 153에 있어서, 상기 항원은 HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 및 HPV-35 중에서 선택된 HPV 유래 항원인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
155. 구현예 152 또는 구현예 153에 있어서, 상기 항원은 HPV-16 E6 또는 HPV-16 E7 항원인 HPV-16 항원인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
156. 구현예 152 또는 구현예 153에 있어서, 상기 바이러스성 항원은 엡스타인-바 핵 항원(EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA 리더 단백질(EBNA-LP), 잠재성 막 단백질 LMP-1, LMP-2A 및 LMP-2B, EBV-EA, EBV-MA 및 EBV-VCA 중에서 선택된 EBV 항원인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
157. 구현예 152 또는 구현예 153에 있어서, 상기 바이러스성 항원은 TAX인 HTLV 항원인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
158. 구현예 152 또는 구현예 153에 있어서, 상기 바이러스성 항원은 B형 간염 코어 항원 또는 B형 간염 외피 항원인 HBV 항원인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
159. 구현예 151에 있어서, 상기 항원은 종양 항원인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
160. 구현예 159에 있어서, 상기 항원은 신경 교종 관련 항원, β-인간 융모막 성선 자극 호르몬, 알파페토프로테인(alphafetoprotein, AFP), 렉틴 반응성 AFP, 다이로글로블린(thyroglobulin), RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스터라제, mut hsp70-2, M-CSF, 멜라닌-A/MART-1, WT-1, S-100, MBP, CD63, MUC1(예를 들어, MUC1-8), p53, Ras, 사이클린 B1, HER-2/neu, 암배아 항원(CEA), gp100, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A11, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-C1, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5, 티로시나제(예를 들어, 티로시나제 관련 단백질 1(TRP-1) 또는 티로시나제 관련 단백질 2(TRP-2)), β-카테닌, NY-ESO-1, LAGE-1a, PP1, MDM2, MDM4, EGVFvIII, Tax, SSX2, 텔로머라제, TARP, pp65, CDK4, 비멘틴, S100, eIF-4A1, IFN 유도성 p78, 멜라노트랜스페린(p97), 우로플라킨(Uroplakin) II, 전립선 특이적 항원(PSA), 인간 칼리크레인(huK2), 전립선 특이적 막 항원(PSM) 및 전립선산 포스파타아제(PAP), 호중구 엘라스타제, 에프린 B2, BA-46, Bcr-abl, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 카스파제 8, FRa, CD24, CD44, CD133, CD 166, epCAM, CA-125, HE4, 오발(Oval), 에스트로겐 수용체, 프로게스트론 수용체, uPA, PAI-1, CD19, CD20, CD22, ROR1, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, GD-2, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
161. 변형된 TRAC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서, 상기 방법은 구현예 79-102 또는 125-160 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 TRAC 유전자 좌의 유전자 파괴를 포함하는 T 세포로 도입시키는 것을 포함하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
162. 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서, 상기 방법은 (a) T 세포의 내인성 TRAC 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 T 세포로 도입시키는 단계; 및 (b) T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시키는 단계 - 여기에서 상기 일부는 천연 TCRα 사슬 전장보다 더 짧고, 여기에서 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 내인성 TRAC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고, 이로써 변형된 TRAC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포가 생산됨 - ;를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
163. 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서, 상기 방법은 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시키는 것을 포함하고, 상기 T 세포는 T 세포의 내인성 TRAC 유전자 좌 내에 유전자 파괴를 가지며, 여기에서 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 내인성 TRAC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고, 이로써 변형된 TRAC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포가 생산되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
164. 구현예 163에 있어서, 상기 유전자 파괴는 내인성 TRAC 유전자 좌 내 하나 이상의 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에 의해 유도되었음을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
165. 구현예 161-164 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 구현예 79-102 또는 125-160 중 어느 하나 유래인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
166. 구현예 161-165 중 어느 하나에 있어서, 상기 변형된 TRAC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 여기에서 상기 핵산 서열은, (i) 전이 유전자 서열 및 (ii) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 인프레임 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
167. 구현예 161-166 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 3' 비번역 영역(3' UTR) 또는 인트론을 암호화하는 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
168. 구현예 161-167 중 어느 하나에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 3' UTR을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
169. 구현예 161-168 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cα의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 추가 부분은 전장 천연 Cα보다 더 짧은 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
170. 구현예 161-169 중 어느 하나에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
171. 구현예 161-170 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
172. 구현예 161-171 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 최대 5' 뉴클레오티드의 하류 및 엑손 1의 최대 3' 뉴클레오티드의 상류에서 통합되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
173. 구현예 161-172 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 적어도 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 적어도 엑손 2-4에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
174. 구현예 161-173 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 Cα는 서열 번호: 14, 15, 19 또는 24 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 14, 15, 19 또는 24 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
175. 구현예 169-174 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cα의 추가 부분은 서열 번호: 142에 제시된 서열 또는 서열 번호: 142에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
176. 구현예 161-175 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 T 세포는 TRBC 유전자 좌에서 유전자 파괴의 유도를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
177. 구현예 161-174 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 T 세포는 TRBC1 유전자 좌 및/또는 TRBC2 유전자 좌의 유전자 파괴를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
178. 변형된 TRBC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서, 상기 방법은 구현예 103-160 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 TRBC 유전자 좌의 유전자 파괴를 포함하는 T 세포로 도입시키는 것을 포함하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
179. 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서, 상기 방법은 (a) T 세포의 내인성 TRBC 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 T 세포로 도입시키는 단계; 및 (b) T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬 및 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시키는 단계 - 여기에서 상기 일부는 천연 TCRβ 사슬 전장보다 더 짧고, 여기에서 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 내인성 TRBC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고, 이로써 변형된 TRBC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포가 생산됨 - ;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
180. 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서, 상기 방법은 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬 및 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시키는 것을 포함하고, 상기 T 세포는 T 세포의 내인성 TRBC 유전자 좌 내에 유전자 파괴를 가지며, 여기에서 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 내인성 TRBC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고, 이로써 변형된 TRBC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포가 생산되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
181. 구현예 180에 있어서, 상기 유전자 파괴는 내인성 TRBC 유전자 좌 내 하나 이상의 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에 의해 유도되었음을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
182. 구현예 178-181 중 어느 하나에 있어서, 상기 TRBC 유전자 좌는 TRBC1 유전자 좌 및/또는 TRBC2 유전자 좌인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
183. 구현예 178-182 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 구현예 95-149 중 어느 하나 유래인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
184. 구현예 178-183 중 어느 하나에 있어서, 상기 변형된 TRBC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 여기에서 상기 핵산 서열은, (i) 전이 유전자 서열 및 (ii) 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 인프레임 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
185. 구현예 178-184 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 3' 비번역 영역(3' UTR) 또는 인트론을 암호화하는 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
186. 구현예 178-185 중 어느 하나에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 3' UTR을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
187. 구현예 178-186 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cβ의 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, Cβ의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cβ의 추가 부분은 천연 Cβ의 전장보다 더 짧은 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
188. 구현예 178-187 중 어느 하나에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
189. 구현예 178-188 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
190. 구현예 178-189 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 최대 5' 뉴클레오티드의 하류 및 엑손 1의 최대 3' 뉴클레오티드의 상류에서 통합되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
191. 구현예 178-190 중 어느 하나에 있어서, 상기 Cβ의 적어도 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 적어도 엑손 2-4에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
192. 구현예 178-191 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 Cβ는 서열 번호: 16, 17, 21 또는 25 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 16, 17, 21 또는 25에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
193. 구현예 177-192 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 T 세포는 TRAC 유전자 좌에서 유전자 파괴의 유도를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
194. 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)는 표적 부위에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
195. 구현예 194에 있어서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 상기 하나 이상의 제제는 (a) DNA 표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질 또는 (b) RNA 가이드 뉴클레아제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
196. 구현예 195에 있어서, 상기 DNA 표적화 단백질 또는 RNA 가이드 뉴클레아제는 표적 부위에 특이적인 아연 핑거 단백질(zinc finger protein, ZFP), TAL 단백질 또는 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬 핵산(clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid, CRISPR)-결합 뉴클레아제(Cas)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
197. 구현예 194-196 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제제는 상기 표적 부위에 특이적으로 결합, 인식 또는 혼성화하는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL-이펙터 뉴클레아제(TAL-effector nuclease, TALEN) 및/또는 CRISPR-Cas9 조합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
198. 구현예 162, 164-177, 179 또는 181-197 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제제 각각은 하나 이상의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
199. 구현예 198에 있어서, 상기 하나 이상의 제제는 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보뉴클레오단백질(ribonucleoprotein, RNP) 복합체로서 도입되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
200. 구현예 199에 있어서, 상기 RNP는 전기 천공, 입자 총, 인산 칼슘 형질 감염, 세포 압축 또는 압착을 통해 도입되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
201. 구현예 199 또는 구현예 200에 있어서, 상기 RNP는 전기 천공을 통해 도입되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
202. 구현예 162, 164-177, 179 또는 181-197 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제제는 gRNA 및/또는 Cas9 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로서 도입되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
203. 구현예 198-202 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA는 UCUCUCAGCUGGUACACGGC (서열 번호:28), UGGAUUUAGAGUCUCUCAGC (서열 번호:29), ACACGGCAGGGUCAGGGUUC (서열 번호:30), GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (서열 번호:31), GCUGGUACACGGCAGGGUCA (서열 번호:32), CUCAGCUGGUACACGGC (서열 번호:33), UGGUACACGGCAGGGUC (서열 번호:34), GCUAGACAUGAGGUCUA (서열 번호:35), GUCAGAUUUGUUGCUCC (서열 번호:36), UCAGCUGGUACACGGCA (서열 번호:37), GCAGACAGACUUGUCAC (서열 번호:38), GGUACACGGCAGGGUCA (서열 번호:39), CUUCAAGAGCAACAGUGCUG (서열 번호:40), AGAGCAACAGUGCUGUGGCC (서열 번호:41), AAAGUCAGAUUUGUUGCUCC (서열 번호:42), ACAAAACUGUGCUAGACAUG (서열 번호:43), AAACUGUGCUAGACAUG (서열 번호:44), UGUGCUAGACAUGAGGUCUA (서열 번호:45), GGCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC (서열 번호:46), GCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC (서열 번호:47), GGGGAAGAAGGUGUCUUC (서열 번호:48), GUUUUGUCUGUGAUAUACACAU (서열 번호:49), GGCAGACAGACUUGUCACUGGAUU (서열 번호:50), GCAGACAGACUUGUCACUGGAUU (서열 번호:51), GACAGACUUGUCACUGGAUU (서열 번호:52), GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA (서열 번호:53), GAAUAGGCAGACAGACUUGUCA (서열 번호:54), GAGUCUCUCAGCUGGUACACGG (서열 번호:55), GUCUCUCAGCUGGUACACGG (서열 번호:56), GGUACACGGCAGGGUCAGGGUU (서열 번호:57) 및 GUACACGGCAGGGUCAGGGUU (서열 번호:58) 중에서 선택된 서열을 포함하고, TRAC 유전자 좌에 있는 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
204. 구현예 203에 있어서, 상기 gRNA는 GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (서열 번호:31)의 서열을 포함하는 표적화 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
205. 구현예 198-202 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA는 CACCCAGAUCGUCAGCGCCG (서열 번호:59), CAAACACAGCGACCUCGGGU (서열 번호:60), UGACGAGUGGACCCAGGAUA (서열 번호:61), GGCUCUCGGAGAAUGACGAG (서열 번호:62), GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (서열 번호:63), GAAAAACGUGUUCCCACCCG (서열 번호:64), AUGACGAGUGGACCCAGGAU (서열 번호:65), AGUCCAGUUCUACGGGCUCU (서열 번호:66), CGCUGUCAAGUCCAGUUCUA (서열 번호:67), AUCGUCAGCGCCGAGGCCUG (서열 번호:68), UCAAACACAGCGACCUCGGG (서열 번호:69), CGUAGAACUGGACUUGACAG (서열 번호:70), AGGCCUCGGCGCUGACGAUC (서열 번호:71), UGACAGCGGAAGUGGUUGCG (서열 번호:72), UUGACAGCGGAAGUGGUUGC (서열 번호:73), UCUCCGAGAGCCCGUAGAAC (서열 번호:74), CGGGUGGGAACACGUUUUUC (서열 번호:75), GACAGGUUUGGCCCUAUCCU (서열 번호:76), GAUCGUCAGCGCCGAGGCCU (서열 번호:77), GGCUCAAACACAGCGACCUC (서열 번호:78), UGAGGGUCUCGGCCACCUUC (서열 번호:79), AGGCUUCUACCCCGACCACG (서열 번호:80), CCGACCACGUGGAGCUGAGC (서열 번호:81), UGACAGGUUUGGCCCUAUCC (서열 번호:82), CUUGACAGCGGAAGUGGUUG (서열 번호:83), AGAUCGUCAGCGCCGAGGCC (서열 번호:84), GCGCUGACGAUCUGGGUGAC (서열 번호:85), UGAGGGCGGGCUGCUCCUUG (서열 번호:86), GUUGCGGGGGUUCUGCCAGA (서열 번호:87), AGCUCAGCUCCACGUGGUCG (서열 번호:88), GCGGCUGCUCAGGCAGUAUC (서열 번호:89), GCGGGGGUUCUGCCAGAAGG (서열 번호:90), UGGCUCAAACACAGCGACCU (서열 번호:91), ACUGGACUUGACAGCGGAAG (서열 번호:92), GACAGCGGAAGUGGUUGCGG (서열 번호:93), GCUGUCAAGUCCAGUUCUAC (서열 번호:94), GUAUCUGGAGUCAUUGAGGG (서열 번호:95), CUCGGCGCUGACGAUCU (서열 번호:96), CCUCGGCGCUGACGAUC (서열 번호:97), CCGAGAGCCCGUAGAAC (서열 번호:98), CCAGAUCGUCAGCGCCG (서열 번호:99), GAAUGACGAGUGGACCC (서열 번호:100), GGGUGACAGGUUUGGCCCUAUC (서열 번호:101), GGUGACAGGUUUGGCCCUAUC (서열 번호:102), GUGACAGGUUUGGCCCUAUC (서열 번호:103), GACAGGUUUGGCCCUAUC (서열 번호:104), GAUACUGCCUGAGCAGCCGCCU (서열 번호:105), GACCACGUGGAGCUGAGCUGGUGG (서열 번호:106), GUGGAGCUGAGCUGGUGG (서열 번호:107), GGGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:108), GGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:109), GCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:110), GGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:111), GGCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:112), GCUGCUCCUUGAGGGGCU (서열 번호:113), GGUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (서열 번호:114), GUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (서열 번호:115) 및 GAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (서열 번호:116) 중에서 선택된 서열을 포함하고, TRBC1 및 TRBC2 유전자 중 하나 또는 둘 다에 있는 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
206. 구현예 205에 있어서, 상기 gRNA는 GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (서열 번호:63)의 서열을 포함하는 표적화 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
207. 구현예 161-206 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포 또는 이의 하위 유형인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
208. 구현예 207에 있어서, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포 또는 이의 하위 유형인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
209. 구현예 161-206 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 다능성 또는 만능 세포로부터 유래하고, 이는 선택적으로 iPSC인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
210. 구현예 161-209 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포에는 대상체 자기 유래인 T 세포가 포함되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
211. 구현예 161-209 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포에는 대상체에 대해 동종이계인 T 세포가 포함되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
212. 구현예 161-211 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 gRNA 및/또는 Cas9 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 벡터(들)에 포함되고, 이는 선택적으로 바이러스 벡터(들)인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
213. 구현예 212에 있어서, 상기 벡터는 AAV 벡터인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
214. 구현예 213에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
215. 구현예 214에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV6 벡터인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
216. 구현예 212에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
217. 구현예 216에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
218. 구현예 161-211 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 선형 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
219. 구현예 218에 있어서, 상기 선형 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
220. 구현예 219에 있어서, 상기 선형 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
221. 구현예 161-220 중 어느 하나에 있어서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 및 주형 폴리뉴클레오티드의 도입은 동시에 또는 순차적으로, 어떠한 순서로든 수행되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
222. 구현예 161-221 중 어느 하나에 있어서, 상기 주형 폴리뉴클레오티드의 도입은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후에 수행되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
223. 구현예 222에 있어서, 상기 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후 약 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 6 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 60 분, 90 분, 2 시간, 3 시간 또는 4 시간 직후 또는 이내에 도입되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법.
224. 구현예 161-2 중 어느 하나의 방법을 사용하여 생성된 조작된 T 세포 또는 복수의 조작된 T 세포.
225. 구현예 224의 조작된 T 세포 또는 복수의 조작된 세포를 포함하는, 조성물.
226. 구현예 225에 있어서, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
227. 구현예 225 또는 구현예 226에 있어서, 상기 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:3 내지 3:1, 선택적으로 1:1인 것을 특징으로 하는, 조성물.
228. 구현예 225-227 중 어느 하나에 있어서, 조성물 중 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 조작된 세포가, 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자의 유전자 파괴 또는 상기 유전자에서 유전자 파괴를 포함하고/거나; 조성물 중 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 조작된 세포가, 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자의 유전자 생성물을 발현하지 않거나 검출 가능한 수준으로 발현하지 않는 것을 특징으로 하는, 조성물.
229. 구현예 225-228 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 중 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 90% 이상 또는 초과의 세포가 재조합 TCR을 발현하고/거나 항원 결합을 나타내는 것을 특징으로 하는, 조성물.
230. 대상체에 구현예 224-229 중 어느 하나의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한 치료 방법.
231. 질병 또는 장애를 치료하기 위한 구현예 224-229 중 어느 하나의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물의 용도.
232. 질병 또는 장애를 치료하기 위한 의약품 제조에 있어서 구현예 224-229 중 어느 하나의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물의 용도.
233. 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 구현예 224-229 중 어느 하나의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
234. 제조 물품으로서, 구현예 79-102 또는 116-149 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드; 및 TRAC 유전자 좌 내 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들);를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
235. 제조 물품으로서, (a) T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 여기에서 상기 일부는 천연 TCRα 사슬 전장보다 더 짧음 - ; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암(들) - 여기에서 상기 하나 이상의 상동성 암(들)은 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하고, 상기 오픈 리딩 프레임은 TCRα 사슬을 암호화함 - 을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 TRAC 유전자 좌 내 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들);를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
236. 구현예 201에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 구현예 79-102 또는 125-160 중 어느 하나 유래인 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
237. 제조 물품으로서, 구현예 79-160 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드; 및 TRBC 유전자 좌 내 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들);를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
238. 제조 물품으로서, (a) T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬 및 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 여기에서 상기 일부는 천연 TCRβ 사슬 전장보다 더 짧음 - ; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암(들) - 여기에서 상기 하나 이상의 상동성 암(들)은 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하고, 상기 오픈 리딩 프레임은 TCRβ 사슬을 암호화함 - 을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 TRAC 유전자 좌 내 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들);를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
239. 구현예 237 또는 구현예 238에 있어서, 상기 TRBC 유전자 좌는 TRBC1 및/또는 TRBC2인 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
240. 구현예 237 또는 구현예 238에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 구현예 103-160 중 어느 하나 유래인 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
241. 구현예 234-241 중 어느 하나에 있어서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)는 표적 부위에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
242. 구현예 241에 있어서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 상기 하나 이상의 제제는 (a) DNA 표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질 또는 (b) RNA 가이드 뉴클레아제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
243. 구현예 242에 있어서, 상기 DNA 표적화 단백질 또는 RNA 가이드 뉴클레아제는 표적 부위에 특이적인 아연 핑거 단백질(ZFP), TAL 단백질 또는 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬 핵산(CRISPR)-결합 뉴클레아제(Cas)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
244. 구현예 241-243 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제제는 상기 표적 부위에 특이적으로 결합, 인식 또는 혼성화하는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL-이펙터 뉴클레아제(TALEN) 및/또는 CRISPR-Cas9 조합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
245. 구현예 241-244 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제제 각각은 하나 이상의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
246. 구현예 241-245 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제제는 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로서 도입되는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
247. 구현예 246에 있어서, 상기 RNP는 전기 천공, 입자 총, 인산 칼슘 형질 감염, 세포 압축 또는 압착을 통해 도입되는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
248. 구현예 246 또는 구현예 247에 있어서, 상기 RNP는 전기 천공을 통해 도입되는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
249. 구현예 245-248 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제제는 상기 gRNA 및/또는 Cas9 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로서 도입되는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
250. 구현예 245-249 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA는 UCUCUCAGCUGGUACACGGC (서열 번호:28), UGGAUUUAGAGUCUCUCAGC (서열 번호:29), ACACGGCAGGGUCAGGGUUC (서열 번호:30), GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (서열 번호:31), GCUGGUACACGGCAGGGUCA (서열 번호:32), CUCAGCUGGUACACGGC (서열 번호:33), UGGUACACGGCAGGGUC (서열 번호:34), GCUAGACAUGAGGUCUA (서열 번호:35), GUCAGAUUUGUUGCUCC (서열 번호:36), UCAGCUGGUACACGGCA (서열 번호:37), GCAGACAGACUUGUCAC (서열 번호:38), GGUACACGGCAGGGUCA (서열 번호:39), CUUCAAGAGCAACAGUGCUG (서열 번호:40), AGAGCAACAGUGCUGUGGCC (서열 번호:41), AAAGUCAGAUUUGUUGCUCC (서열 번호:42), ACAAAACUGUGCUAGACAUG (서열 번호:43), AAACUGUGCUAGACAUG (서열 번호:44), UGUGCUAGACAUGAGGUCUA (서열 번호:45), GGCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC (서열 번호:46), GCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC (서열 번호:47), GGGGAAGAAGGUGUCUUC (서열 번호:48), GUUUUGUCUGUGAUAUACACAU (서열 번호:49), GGCAGACAGACUUGUCACUGGAUU (서열 번호:50), GCAGACAGACUUGUCACUGGAUU (서열 번호:51), GACAGACUUGUCACUGGAUU (서열 번호:52), GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA (서열 번호:53), GAAUAGGCAGACAGACUUGUCA (서열 번호:54), GAGUCUCUCAGCUGGUACACGG (서열 번호:55), GUCUCUCAGCUGGUACACGG (서열 번호:56), GGUACACGGCAGGGUCAGGGUU (서열 번호:57) 및 GUACACGGCAGGGUCAGGGUU (서열 번호:58) 중에서 선택된 서열을 포함하고, TRAC 유전자 좌에 있는 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
251. 구현예 250에 있어서, 상기 gRNA는 GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (서열 번호:31)의 서열을 포함하는 표적화 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
252. 구현예 245-251 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA는 CACCCAGAUCGUCAGCGCCG(서열 번호:59), CAAACACAGCGACCUCGGGU(서열 번호:60), UGACGAGUGGACCCAGGAUA(서열 번호:61), GGCUCUCGGAGAAUGACGAG(서열 번호:62), GGCCUCGGCGCUGACGAUCU(서열 번호:63), GAAAAACGUGUUCCCACCCG(서열 번호:64), AUGACGAGUGGACCCAGGAU(서열 번호:65), AGUCCAGUUCUACGGGCUCU(서열 번호:66), CGCUGUCAAGUCCAGUUCUA(서열 번호:67), AUCGUCAGCGCCGAGGCCUG(서열 번호:68), UCAAACACAGCGACCUCGGG(서열 번호:69), CGUAGAACUGGACUUGACAG(서열 번호:70), AGGCCUCGGCGCUGACGAUC(서열 번호:71), UGACAGCGGAAGUGGUUGCG(서열 번호:72), UUGACAGCGGAAGUGGUUGC(서열 번호:73), UCUCCGAGAGCCCGUAGAAC(서열 번호:74), CGGGUGGGAACACGUUUUUC(서열 번호:75), GACAGGUUUGGCCCUAUCCU(서열 번호:76), GAUCGUCAGCGCCGAGGCCU(서열 번호:77), GGCUCAAACACAGCGACCUC(서열 번호:78), UGAGGGUCUCGGCCACCUUC(서열 번호:79), AGGCUUCUACCCCGACCACG(서열 번호:80), CCGACCACGUGGAGCUGAGC(서열 번호:81), UGACAGGUUUGGCCCUAUCC(서열 번호:82), CUUGACAGCGGAAGUGGUUG(서열 번호:83), AGAUCGUCAGCGCCGAGGCC(서열 번호:84), GCGCUGACGAUCUGGGUGAC(서열 번호:85), UGAGGGCGGGCUGCUCCUUG(서열 번호:86), GUUGCGGGGGUUCUGCCAGA(서열 번호:87), AGCUCAGCUCCACGUGGUCG(서열 번호:88), GCGGCUGCUCAGGCAGUAUC(서열 번호:89), GCGGGGGUUCUGCCAGAAGG(서열 번호:90), UGGCUCAAACACAGCGACCU(서열 번호:91), ACUGGACUUGACAGCGGAAG(서열 번호:92), GACAGCGGAAGUGGUUGCGG(서열 번호:93), GCUGUCAAGUCCAGUUCUAC(서열 번호:94), GUAUCUGGAGUCAUUGAGGG(서열 번호:95), CUCGGCGCUGACGAUCU(서열 번호:96), CCUCGGCGCUGACGAUC(서열 번호:97), CCGAGAGCCCGUAGAAC(서열 번호:98), CCAGAUCGUCAGCGCCG(서열 번호:99), GAAUGACGAGUGGACCC(서열 번호:100), GGGUGACAGGUUUGGCCCUAUC(서열 번호:101), GGUGACAGGUUUGGCCCUAUC(서열 번호:102), GUGACAGGUUUGGCCCUAUC(서열 번호:103), GACAGGUUUGGCCCUAUC(서열 번호:104), GAUACUGCCUGAGCAGCCGCCU(서열 번호:105), GACCACGUGGAGCUGAGCUGGUGG(서열 번호:106), GUGGAGCUGAGCUGGUGG(서열 번호:107), GGGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열 번호:108), GGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열 번호:109), GCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열 번호:110), GGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열 번호:111), GGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열 번호:112), GCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열 번호:113), GGUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG(서열 번호:114), GUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG(서열 번호:115) 및 GAAUGGGAAGGAGGUGCACAG(서열 번호:116) 중에서 선택된 서열을 포함하고, TRBC1 및 TRBC2 유전자 중 하나 또는 둘 다에 있는 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
253. 구현예 252에 있어서, 상기 gRNA는 GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (서열 번호:63)의 서열을 포함하는 표적화 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는, 제조 물품.
254. 구현예 234-253 중 어느 하나의 제조 물품 및 사용 지침을 포함하는, 키트.
255. 구현예 254에 있어서, 상기 지침은 하나 이상의 제제(들) 및 폴리뉴클레오티드가 세포로 도입됨을 명시하는 것을 특징으로 하는, 키트.
256. 구현예 254 또는 구현예 255에 있어서, 상기 지침은 하나 이상의 제제(들) 및 폴리뉴클레오티드가 동시에 또는 순차적으로, 어떠한 순서로든 도입됨을 명시하는 것을 특징으로 하는, 키트.
257. 구현예 254-257 중 어느 하나에 있어서, 상기 지침은 폴리뉴클레오티드의 도입이 하나 이상의 제제(들)의 도입 후에 수행됨을 명시하는 것을 특징으로 하는, 키트.
258. 구현예 257에 있어서, 상기 지침은 상기 폴리뉴클레오티드가 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후 약 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 6 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 60 분, 90 분, 2 시간, 3 시간 또는 4 시간 직후 또는 이내에 도입됨을 명시하는 것을 특징으로 하는, 키트.
Ⅹ. 실시예
하기 실시예는 예시적인 목적으로만 포함되며 본 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다.
실시예 1:
재조합 TCR을 발현하는 조작된 T 세포의 생성
T 세포가 내인성 TCR α 불변(TRAC) 및 TCR β 불변(TRBC) 유전자 유전자 좌의 유전자 파괴를 함유하도록 조작되었고, 내인성 TRAC 유전자 좌에 재조합 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 표적화된 통합에 의해 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 조작되었다.
A. 재조합 TCR 전이 유전자 작제물
인간 유두종 바이러스(HPV) 16 종양 단백질 E7의 에피토프를 인식하는 예시적인 재조합 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 작제물이 생성되었고, 2A 리보솜 건너뛰기 서열에 의해 분리된 전체 TCRβ 사슬 서열 및 부분적인 TCRα 사슬 서열을 함유했다. 부분적인 재조합 TCRα 암호화 서열은 전체 TCRα 가변 영역 서열 및 TRAC 유전자의 엑손 1의 5' 부분에 해당하는 부분적인 재조합 TCRα 불변 영역 서열(서열 번호: 142에 제시)을 포함했다.
재조합 TCR을 암호화하는 서열은 또한 코돈 최적화 및/또는 돌연변이(들)에 의해 변경되어, TCR의 짝?기 및 안정성을 증가시키는 TCR 불변 도메인 사이 인터페이스에서 비천연 이황화물 결합의 형성을 촉진시킨다. 비천연 이황화물 결합은 TCRα 사슬 불변 영역(Cα)의 엑손 1의 48번 잔기에서 Thr이 Cys으로 및 TCRβ 사슬 불변 영역(Cβ)의 57번 잔기에서 Ser이 Cys으로 TCR 사슬이 변경됨으로써 촉진되었다(문헌[Kuball et al. (2007) Blood, 109:2331-2338] 참조). 내인성 TRAC 유전자 엑손 1 서열이 부분적인 재조합 TCRα 암호화 서열과 인프레임이 되도록 내인성 TRAC 유전자 엑손 1에, 변경된 Cys 잔기를 암호화하는 서열을 포함한 부분적인 재조합 TCRα 엑손 1 서열의 통합에 의해 전체 TCRβ 및 TCRα 사슬을 암호화하는 mRNA를 생성하기 위한 작제물이 설계되었다.
재조합 TCR을 암호화하는 서열은, 인간 TRAC 유전자에 인프레임으로 HDR 매개 표적화된 통합 시 내인성 TCRα 프로모터로부터 재조합 TCR의 발현을 구동하도록 재조합 TCR을 암호화하는 서열 다음에, 골수 증식 육종 바이러스 인핸서를 갖는 변경된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터인 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터(서열 번호: 127에 제시된 서열), MND 프로모터(서열 번호: 126에 제시된 서열) 또는 P2A 리보솜 건너뛰기 요소(서열 번호: 6에 제시된 서열)의 작동 가능한 제어 하에 배치되었다.
HDR에 의한 표적 통합을 위해, 인프레임 융합 mRNA를 생성하도록 전이 유전자의 통합을 위해 표적 통합 부위 주변 서열에 상동성인 5' 및 3' 말단에 600 bp 상동성 암(서열 번호: 124에 제시된 5' 상동성 암 서열; 서열 번호: 125에 제시된 3' 상동성 암 서열)이 측면 배치된 예시적인 재조합 TCR 전이 유전자를 함유하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 작제물이 생성되었다.
P2A 리보솜 건너뛰기 서열에 의해 분리된 예시적인 TCR 서열의 전체 TCRβ 및 TCRα 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 생성되었다. 상기 폴리뉴클레오티드는 전체 TCRα 사슬을 암호화하는 서열의 3'에 배치된 SV40 폴리 A 영역을 함유했고, TRAC 유전자에서 유전자 파괴 주변 서열에 상동성인 600 bp 상동성 암이 양쪽에 측면 배치되었다.
AAV 스톡(stock)은, 293T-17 세포주에 예시적인 재조합 TCR, 혈청형-6 헬퍼 플라스미드 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터의 삼중 형질 감염으로 생성되었다. 형질 감염된 세포가 수집 및 용해되었고, AAV 스톡이 세포의 형질 도입을 위해 수집되었다.
B. 조작된 T 세포의 생성
1차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 건강한 도너로부터 수득된 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)로부터 면역친화도 기반 선택에 의해 단리되었다. 생성된 세포를 인간 혈청, IL-2(100 U/mL), IL-7(10 ng/mL) 및 IL-15(5 ng/mL)를 함유하는 배지에서 세포:비드, 1:1의 비율로 항-CD3/항-CD28 시약과 37 ºC에서 72시간 동안 배양함으로써 자극하였다. 자극 후, CD3/CD28 비드를 자기적으로 제거하였고, 세포를 전기 천공 전에 PBS로 세척하였다.
내인성 TCR 유전자를 녹아웃시키기 위해, 세포를 TCR α 불변 영역 유전자의 엑손 1 내 표적 부위(서열 번호: 117에 제시된 TRAC를 위한 표적 부위 서열) 및 TCR β 불변 영역 1 및 2 둘 다의 엑손 1에 공통적인 컨센서스 표적 부위 서열(서열 번호: 118에 제시된 TRBC를 위한 표적 부위 서열)을 표적화하도록 설계된 가이드 RNA(gRNA) 및 Streptococcus pyogenes Cas9 단백질을 함유하는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로 전기 천공하였다. 이어서, 세포를 인간 혈청 및 IL-2(50 U/mL), IL-7(5 ng/mL) 및 IL-15(0.5 ng/mL)를 함유하는 배지에서 배양하였다.
TRAC 유전자 좌로 재조합 TCR의 표적화된 통합을 위해, 세포는 RNP 전기 천공 후 약 2시간에, 상기 기재된 적절한 AAV 제제로 형질 도입되었다. 이어서, 세포는 사이토카인을 함유하는 배양 배지에서 증폭되었다. 모의 형질 감염된 세포는 대조군으로 사용되었다.
실시예 2:
재조합 TCR 발현 및 기능의 평가
T 세포를, 실시예 1에 기재된 바와 같이 예시적인 재조합 항-HPV 16 E7 TCR을 발현하도록 조작하였다. 형질 도입 후 7 일째에, 세포를 재조합 TCR에 특이적인 CD8, 항-V베타22 항체를 포함하는 세포 표면 마커에 대한 항체 및 재조합 TCR에 의해 인식되는 항원, HPV 16 E7(11-19) 펩티드(서열 번호: 143에 제시된 서열)와 복합체를 이룬 펩티드 MHC 4량체로의 염색에 대해 유세포 분석법으로 평가하였다.
도 1a 및 1b에 도시된 바와 같이, 재조합 TCR의 HDR 매개 표적화된 녹인 및 내인성 TCRα 및 TCRβ의 녹아웃은 모의 형질 감염 대조군에 비해, HPV16 E7(11-19)-MHC 4량체에 대한 결합(도 1b) 및 V베타22를 발현(도 1a)하는 CD8+ 세포의 존재에 의해 나타낸 바와 같이 재조합 TCR의 발현을 초래했다. EF1α 또는 MND 프로모터의 제어 하에 전체 재조합 TCRβ 및 TCRα 사슬 서열을 암호화하는 AAV로 형질 도입(SV40 pA로 표시) 후에, 내인성 TRAC 프로모터(P2A로 표시) 또는 MND 프로모터의 제어 하에 전체 재조합 TCRβ 및 재조합과 내인성 TCRα 사슬 서열의 융합을 암호화하는 AAV로의 형질 도입(3' 암으로 표시)과 유사한 예시적인 재조합 TCR의 발현이 세포에서 관찰되었다.
세포 용해 활성을 5:1의 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 HPV-16 양성 편평상피 세포 암종 세포주, SCC-152와 재조합 TCR 발현 CD8+ 이펙터 세포를 인큐베이션함으로써 평가하였다. 표적 세포는 형광 현미경 검사법에 의한 추적이 가능하도록 NLR(NucLight Red)로 표지되었다. 대조군으로, 마우스 Cα 및 Cβ 영역을 함유하나 HPV 16 E7에 결합할 수 있는 참조 TCR을 발현하는 CD8+ 세포와 표적 세포의 공배양이 평가("E7 Ref 마우스")되거나 모의 형질 감염되었다. 도 2에 도시된 바와 같이, MND 프로모터 또는 내인성 TRAC 프로모터(P2A로 표시)의 제어 하에 완전한 재조합 TCRβ 및 TCRα 사슬 서열을 암호화하는 AAV로 형질 도입(SV40 pA로 표시)에 의해 생성; 내인성 TRAC 프로모터 또는 MND 프로모터의 제어 하에 완전한 재조합 TCRβ 및 재조합과 내인성 TCRα 사슬 서열의 융합을 암호화하는 AAV로의 형질 도입(3' 암으로 표시)에 의해 생성;된 예시적인 재조합 TCR을 발현하는 세포의 세포 용해 활성이 일반적으로 유사했고, 마우스 불변 영역을 함유하는 참조 TCR의 세포 용해 활성과 일반적으로 유사했다.
실시예 3:
전이 유전자 서열의 효과적인 HDR 매개 통합을 위한 상동성 암 길이의 평가
다양한 길이의 상동성 암이 측면 배치된 예시적인 전이 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 상동성 의존 수선(HDR)을 통해 전이 유전자의 표적화된 통합을 위해 T 세포로 도입시켰고, 통합의 효율성을 평가했다.
A. 재조합 전이 유전자 작제물 및 조작된 T 세포의 생성
인간 TCRα 불변 영역(TRAC) 유전자 좌로의 표적화된 통합을 위해 다양한 길이의 상동성 암이 측면 배치된 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)을 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유하는 예시적인 HDR 주형 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시켰다. 구체적으로, HDR에 의한 통합을 위해, GFP를 암호화하는 주형 뉴클레오티드 작제물을 함유하는 AAV 제제가, MND 프로모터의 작동 가능한 제어 하에 GFP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 인간 TCR α 불변 영역(TRAC) 유전자에서 표적 통합 부위 주변 서열과 상동성인 50, 100, 200, 300, 400, 500 또는 600 개의 염기쌍의 5' 및 3' 상동성 암(각각 서열 번호: 229-235 및 236-242)이 측면 배치된 SV40 폴리(A) 서열에 연결된 AAV 작제물이 생성된 점을 제외하고, 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성되었다. AAV 작제물의 전체 길이가 SV40 폴리(A) 서열 및 3' 상동성 암 사이에 필러(filler) DNA 서열을 사용함으로써 일정하게 만들어졌다.
HDR에 의한 표적화된 통합을 위해, 4 명의 인간 도너(도너 1-4)의 1 차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 일반적으로 실시예 1-3에 기재된 바와 같이, 1 : 1 비율로 결합하고 자극하고 TRAC 표적화 gRNA를 함유하는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로 전기 천공하였다. 전기 천공 후, 상기 기재된 다양한 상동성 암 길이를 함유하는 HDR 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 AAV 제제로 세포를 형질 도입시켰다. GFP 발현은 AAV로 형질 도입된 후 24, 48, 72, 96 시간 및 7 일에 유세포 분석으로 측정하여 하기 공식에 기초한 통합 비율(게놈에 통합된 세포 내부의 총 AAV 백분율을 나타냄)을 결정했다: 통합 비율 = 
. 높은 MFI % 및 낮은 MFI %는, 각각 통합된 GFP 전이 유전자 또는 통합되지 않은 AAV 작제물을 함유하는 세포를 나타내면서, 유세포 분석에 의해 역치 MFI보다 높거나 낮은 세포의 백분율을 나타낸다. 상동성 암 길이의 증가에 따른 통합 비율의 변화가 특정 암 길이의 통합 비율에서 다음으로 가장 짧은 암 길이의 통합 비율을 빼서 평가되었다.
B. 통합 비율의 평가
도 3a-3b에 도시된 바와 같이, 각각의 상동성 암 길이에 대해 평가된 다양한 시점에서 일정하거나 증가된 통합 비율이 관찰되었으며, 이는 시간이 지남에 따라 통합되지 않은 AAV 작제물 희석과 일치했다. 시간 경과에 따른 GFP 발현 패턴의 변화를 평가한 결과 통합된 GFP 전이 유전자가 있는 세포(높은 MFI)의 백분율은 일반적으로 72 시간 후에 일정하게 유지되었으나, 통합되지 않은 AAV만을 함유하는 세포(낮은 MFI)의 백분율은 계속 감소하는 것으로 나타났다.
도 4a-4b에 도시된 바와 같이, 통합 비율에서 가장 큰 실질적인 이득은 200 bp의 상동성 암에서 발생하는 것으로 나타났으며 300 bp에서는 약간의 이득이 발생했다. 300 bp 내지 500 bp 사이에서 상당한 이득이 관찰되지 않았고, 모든 도너에서 500 bp 내지 600 bp 사이에서 통합 비율의 증가가 관찰되었다. 본 결과는 높은 통합 효율성을 위해 최소 300 bp 상동성 암을 사용하고, 600 bp 상동성 암은 훨씬 더 높은 통합 효율성을 제공함을 지지한다.
본 발명은 예를 들어, 본 발명의 다양한 측면을 설명하기 위해 제공되는 특정 개시된 구현예로 범위를 제한하려는 것이 아니다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 여기의 기재 및 교시에서 명백해질 것이다. 상기 변형은 공개의 진정한 범위와 정신에서 벗어나지 않고 실천될 수 있으며, 본 개시의 범위에 속하도록 의도된다.
서열
SEQUENCE LISTING
<110> JUNO THERAPEUTICS, INC.
EDITAS MEDICINE, INC.
BURLEIGH, Stephen Michael
BORGES, Christopher
NYE, Christopher Heath
SATHER, Blythe D.
VONG, Queenie
WELSTEAD, G. Grant
<120> T CELLS EXPRESSING A RECOMBINANT
RECEPTOR, RELATED POLYNUCLEOTIDES AND METHODS
<130> 735042015540
<140> PCT/US2019/025681
<141> 2019-04-03
<150> 62/653,553
<151> 2018-04-05
<160> 261
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 4627
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TCR alpha constant (TRAC)
<300>
<308> NG_001332.3
<309> 2019-02-26
<400> 1
atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt 60
ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg 120
atgtgtatat cacagacaaa actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca 180
gtgctgtggc ctggagcaac aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca 240
ttattccaga agacaccttc ttccccagcc caggtaaggg cagctttggt gccttcgcag 300
gctgtttcct tgcttcagga atggccaggt tctgcccaga gctctggtca atgatgtcta 360
aaactcctct gattggtggt ctcggcctta tccattgcca ccaaaaccct ctttttacta 420
agaaacagtg agccttgttc tggcagtcca gagaatgaca cgggaaaaaa gcagatgaag 480
agaaggtggc aggagagggc acgtggccca gcctcagtct ctccaactga gttcctgcct 540
gcctgccttt gctcagactg tttgcccctt actgctcttc taggcctcat tctaagcccc 600
ttctccaagt tgcctctcct tatttctccc tgtctgccaa aaaatctttc ccagctcact 660
aagtcagtct cacgcagtca ctcattaacc caccaatcac tgattgtgcc ggcacatgaa 720
tgcaccaggt gttgaagtgg aggaattaaa aagtcagatg aggggtgtgc ccagaggaag 780
caccattcta gttgggggag cccatctgtc agctgggaaa agtccaaata acttcagatt 840
ggaatgtgtt ttaactcagg gttgagaaaa cagctacctt caggacaaaa gtcagggaag 900
ggctctctga agaaatgcta cttgaagata ccagccctac caagggcagg gagaggaccc 960
tatagaggcc tgggacagga gctcaatgag aaaggagaag agcagcaggc atgagttgaa 1020
tgaaggaggc agggccgggt cacagggcct tctaggccat gagagggtag acagtattct 1080
aaggacgcca gaaagctgtt gatcggcttc aagcagggga gggacaccta atttgctttt 1140
cttttttttt tttttttttt tttttttttt tgagatggag ttttgctctt gttgcccagg 1200
ctggagtgca atggtgcatc ttggctcact gcaacctccg cctcccaggt tcaagtgatt 1260
ctcctgcctc agcctcccga gtagctgaga ttacaggcac ccgccaccat gcctggctaa 1320
ttttttgtat ttttagtaga gacagggttt cactatgttg gccaggctgg tctcgaactc 1380
ctgacctcag gtgatccacc cgcttcagcc tcccaaagtg ctgggattac aggcgtgagc 1440
caccacaccc ggcctgcttt tcttaaagat caatctgagt gctgtacgga gagtgggttg 1500
taagccaaga gtagaagcag aaagggagca gttgcagcag agagatgatg gaggcctggg 1560
cagggtggtg gcagggaggt aaccaacacc attcaggttt caaaggtaga accatgcagg 1620
gatgagaaag caaagagggg atcaaggaag gcagctggat tttggcctga gcagctgagt 1680
caatgatagt gccgtttact aagaagaaac caaggaaaaa atttggggtg cagggatcaa 1740
aactttttgg aacatatgaa agtacgtgtt tatactcttt atggcccttg tcactatgta 1800
tgcctcgctg cctccattgg actctagaat gaagccaggc aagagcaggg tctatgtgtg 1860
atggcacatg tggccagggt catgcaacat gtactttgta caaacagtgt atattgagta 1920
aatagaaatg gtgtccagga gccgaggtat cggtcctgcc agggccaggg gctctcccta 1980
gcaggtgctc atatgctgta agttccctcc agatctctcc acaaggaggc atggaaaggc 2040
tgtagttgtt cacctgccca agaactagga ggtctggggt gggagagtca gcctgctctg 2100
gatgctgaaa gaatgtctgt ttttcctttt agaaagttcc tgtgatgtca agctggtcga 2160
gaaaagcttt gaaacaggta agacaggggt ctagcctggg tttgcacagg attgcggaag 2220
tgatgaaccc gcaataaccc tgcctggatg agggagtggg aagaaattag tagatgtggg 2280
aatgaatgat gaggaatgga aacagcggtt caagacctgc ccagagctgg gtggggtctc 2340
tcctgaatcc ctctcaccat ctctgacttt ccattctaag cactttgagg atgagtttct 2400
agcttcaata gaccaaggac tctctcctag gcctctgtat tcctttcaac agctccactg 2460
tcaagagagc cagagagagc ttctgggtgg cccagctgtg aaatttctga gtcccttagg 2520
gatagcccta aacgaaccag atcatcctga ggacagccaa gaggttttgc cttctttcaa 2580
gacaagcaac agtactcaca taggctgtgg gcaatggtcc tgtctctcaa gaatcccctg 2640
ccactcctca cacccaccct gggcccatat tcatttccat ttgagttgtt cttattgagt 2700
catccttcct gtggtagcgg aactcactaa ggggcccatc tggacccgag gtattgtgat 2760
gataaattct gagcacctac cccatcccca gaagggctca gaaataaaat aagagccaag 2820
tctagtcggt gtttcctgtc ttgaaacaca atactgttgg ccctggaaga atgcacagaa 2880
tctgtttgta aggggatatg cacagaagct gcaagggaca ggaggtgcag gagctgcagg 2940
cctcccccac ccagcctgct ctgccttggg gaaaaccgtg ggtgtgtcct gcaggccatg 3000
caggcctggg acatgcaagc ccataaccgc tgtggcctct tggttttaca gatacgaacc 3060
taaactttca aaacctgtca gtgattgggt tccgaatcct cctcctgaaa gtggccgggt 3120
ttaatctgct catgacgctg cggctgtggt ccagctgagg tgaggggcct tgaagctggg 3180
agtggggttt agggacgcgg gtctctgggt gcatcctaag ctctgagagc aaacctccct 3240
gcagggtctt gcttttaagt ccaaagcctg agcccaccaa actctcctac ttcttcctgt 3300
tacaaattcc tcttgtgcaa taataatggc ctgaaacgct gtaaaatatc ctcatttcag 3360
ccgcctcagt tgcacttctc ccctatgagg taggaagaac agttgtttag aaacgaagaa 3420
actgaggccc cacagctaat gagtggagga agagagacac ttgtgtacac cacatgcctt 3480
gtgttgtact tctctcaccg tgtaacctcc tcatgtcctc tctccccagt acggctctct 3540
tagctcagta gaaagaagac attacactca tattacaccc caatcctggc tagagtctcc 3600
gcaccctcct cccccagggt ccccagtcgt cttgctgaca actgcatcct gttccatcac 3660
catcaaaaaa aaactccagg ctgggtgcgg gggctcacac ctgtaatccc agcactttgg 3720
gaggcagagg caggaggagc acaggagctg gagaccagcc tgggcaacac agggagaccc 3780
cgcctctaca aaaagtgaaa aaattaacca ggtgtggtgc tgcacacctg tagtcccagc 3840
tacttaagag gctgagatgg gaggatcgct tgagccctgg aatgttgagg ctacaatgag 3900
ctgtgattgc gtcactgcac tccagcctgg aagacaaagc aagatcctgt ctcaaataat 3960
aaaaaaaata agaactccag ggtacatttg ctcctagaac tctaccacat agccccaaac 4020
agagccatca ccatcacatc cctaacagtc ctgggtcttc ctcagtgtcc agcctgactt 4080
ctgttcttcc tcattccaga tctgcaagat tgtaagacag cctgtgctcc ctcgctcctt 4140
cctctgcatt gcccctcttc tccctctcca aacagaggga actctcctac ccccaaggag 4200
gtgaaagctg ctaccacctc tgtgcccccc cggcaatgcc accaactgga tcctacccga 4260
atttatgatt aagattgctg aagagctgcc aaacactgct gccaccccct ctgttccctt 4320
attgctgctt gtcactgcct gacattcacg gcagaggcaa ggctgctgca gcctcccctg 4380
gctgtgcaca ttccctcctg ctccccagag actgcctccg ccatcccaca gatgatggat 4440
cttcagtggg ttctcttggg ctctaggtcc tgcagaatgt tgtgaggggt ttattttttt 4500
ttaatagtgt tcataaagaa atacatagta ttcttcttct caagacgtgg ggggaaatta 4560
tctcattatc gaggccctgc tatgctgtgt atctgggcgt gttgtatgtc ctgctgccga 4620
tgccttc 4627
<210> 2
<211> 1448
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TCR beta constant 1 (TRBC1)
<300>
<308> NG_001333.2
<309> 2018-09-23
<400> 2
aggacctgaa caaggtgttc ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga 60
tctcccacac ccaaaaggcc acactggtgt gcctggccac aggcttcttc cccgaccacg 120
tggagctgag ctggtgggtg aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc 180
agcccctcaa ggagcagccc gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga 240
gggtctcggc caccttctgg cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct 300
acgggctctc ggagaatgac gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg 360
tcagcgccga ggcctggggt agagcaggtg agtggggcct ggggagatgc ctggaggaga 420
ttaggtgaga ccagctacca gggaaaatgg aaagatccag gtagcagaca agactagatc 480
caaaaagaaa ggaaccagcg cacaccatga aggagaattg ggcacctgtg gttcattctt 540
ctcccagatt ctcagcccaa cagagccaag cagctgggtc ccctttctat gtggcctgtg 600
taactctcat ctgggtggtg ccccccatcc ccctcagtgc tgccacatgc catggattgc 660
aaggacaatg tggctgacat ctgcatggca gaagaaagga ggtgctgggc tgtcagagga 720
agctggtctg ggcctgggag tctgtgccaa ctgcaaatct gactttactt ttaattgcct 780
atgaaaataa ggtctctcat ttattttcct ctccctgctt tctttcagac tgtggcttta 840
cctcgggtaa gtaagccctt ccttttcctc tccctctctc atggttcttg acctagaacc 900
aaggcatgaa gaactcacag acactggagg gtggagggtg ggagagacca gagctacctg 960
tgcacaggta cccacctgtc cttcctccgt gccaacagtg tcctaccagc aaggggtcct 1020
gtctgccacc atcctctatg agatcctgct agggaaggcc accctgtatg ctgtgctggt 1080
cagcgccctt gtgttgatgg ccatggtaag caggagggca ggatggggcc agcaggctgg 1140
aggtgacaca ctgacaccaa gcacccagaa gtatagagtc cctgccagga ttggagctgg 1200
gcagtaggga gggaagagat ttcattcagg tgcctcagaa gataacttgc acctctgtag 1260
gatcacagtg gaagggtcat gctgggaagg agaagctgga gtcaccagaa aacccaatgg 1320
atgttgtgat gagccttact atttgtgtgg tcaatgggcc ctactacttt ctctcaatcc 1380
tcacaactcc tggctcttaa taacccccaa aactttctct tctgcaggtc aagagaaagg 1440
atttctga 1448
<210> 3
<211> 1489
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TCR beta constant 2 (TRBC2)
<300>
<308> NG_001333.2
<309> 2018-09-23
<400> 3
aggacctgaa aaacgtgttc ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga 60
tctcccacac ccaaaaggcc acactggtat gcctggccac aggcttctac cccgaccacg 120
tggagctgag ctggtgggtg aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc 180
agcccctcaa ggagcagccc gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga 240
gggtctcggc caccttctgg cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct 300
acgggctctc ggagaatgac gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg 360
tcagcgccga ggcctggggt agagcaggtg agtggggcct ggggagatgc ctggaggaga 420
ttaggtgaga ccagctacca gggaaaatgg aaagatccag gtagcggaca agactagatc 480
cagaagaaag ccagagtgga caaggtggga tgatcaaggt tcacagggtc agcaaagcac 540
ggtgtgcact tcccccacca agaagcatag aggctgaatg gagcacctca agctcattct 600
tccttcagat cctgacacct tagagctaag ctttcaagtc tccctgagga ccagccatac 660
agctcagcat ctgagtggtg tgcatcccat tctcttctgg ggtcctggtt tcctaagatc 720
atagtgacca cttcgctggc actggagcag catgagggag acagaaccag ggctatcaaa 780
ggaggctgac tttgtactat ctgatatgca tgtgtttgtg gcctgtgagt ctgtgatgta 840
aggctcaatg tccttacaaa gcagcattct ctcatccatt tttcttcccc tgttttcttt 900
cagactgtgg cttcacctcc ggtaagtgag tctctccttt ttctctctat ctttcgccgt 960
ctctgctctc gaaccagggc atggagaatc cacggacaca ggggcgtgag ggaggccaga 1020
gccacctgtg cacaggtgcc tacatgctct gttcttgtca acagagtctt accagcaagg 1080
ggtcctgtct gccaccatcc tctatgagat cttgctaggg aaggccacct tgtatgccgt 1140
gctggtcagt gccctcgtgc tgatggccat ggtaaggagg agggtgggat agggcagatg 1200
atgggggcag gggatggaac atcacacatg ggcataaagg aatctcagag ccagagcaca 1260
gcctaatata tcctatcacc tcaatgaaac cataatgaag ccagactggg gagaaaatgc 1320
agggaatatc acagaatgca tcatgggagg atggagacaa ccagcgagcc ctactcaaat 1380
taggcctcag agcccgcctc ccctgcccta ctcctgctgt gccatagccc ctgaaaccct 1440
gaaaatgttc tctcttccac aggtcaagag aaaggattcc agaggctag 1489
<210> 4
<211> 1189
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF1alpha promoter
<300>
<308> GenBank: J04617.1
<309> 1994-11-07
<400> 4
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360
agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420
gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480
ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540
tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600
tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660
ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720
ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780
tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840
aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900
gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960
cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020
tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080
ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140
cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaa 1189
<210> 5
<211> 1205
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF1alpha promoter
<400> 5
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcactagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360
ggtgggagag ttcgtggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgtgg 420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatcagca cactggtatt tcggtttttg 600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctgcccgg cctgctctgg 720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agcacaaaat 840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960
tcgattagtt ctccagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtgaaaacta cccctaaaag 1200
ccaaa 1205
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A
<400> 7
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 8
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 9
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 9
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2A
<400> 10
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 11
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F2A
<400> 11
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 12
<211> 357
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFRt
<400> 12
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 13
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFRt
<400> 13
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 14
<211> 137
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Mouse TCR alpha constant
<400> 14
Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg
1 5 10 15
Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile
20 25 30
Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr
65 70 75 80
Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr
85 90 95
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser
100 105 110
Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
115 120 125
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135
<210> 15
<211> 137
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Mouse TCR alpha constant
<400> 15
Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg
1 5 10 15
Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile
20 25 30
Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr
65 70 75 80
Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr
85 90 95
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser
100 105 110
Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
115 120 125
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135
<210> 16
<211> 173
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Mouse TCR beta constant
<300>
<308> Uniprot P01852
<309> 1986-07-21
<400> 16
Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys
50 55 60
Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
65 70 75 80
Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
85 90 95
His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro
100 105 110
Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly
115 120 125
Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu
130 135 140
Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser
145 150 155 160
Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
165 170
<210> 17
<211> 172
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Mouse TCR beta constant
<400> 17
Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu
50 55 60
Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His
85 90 95
Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val
100 105 110
Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile
115 120 125
Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr
130 135 140
Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Gly
145 150 155 160
Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
165 170
<210> 18
<211> 181
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MND promoter
<400> 18
gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120
tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180
a 181
<210> 19
<211> 142
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<300>
<308> Uniprot P01848
<309> 2018-07-18
<400> 19
Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
85 90 95
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
100 105 110
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
115 120 125
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 20
<211> 177
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TCR beta constant 1
<300>
<308> Uniprot P01850
<309> 2018-07-18
<400> 20
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Phe
<210> 21
<211> 178
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human TCR beta constant 2
<300>
<308> Uniprot A0A5B9
<309> 2018-07-18
<400> 21
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
115 120 125
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
130 135 140
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
145 150 155 160
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser
165 170 175
Arg Gly
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (0)...(0)
<223> SGGGG is repeated 5 or 6 times
<400> 22
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 23
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 24
<211> 141
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> human TCR alpha constant
<300>
<308> CAA26636.1
<309> 2016-07-25
<400> 24
Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 25
<211> 179
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> human TCR beta constant
<300>
<308> A0A0G2JNG9
<400> 25
Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Ser Arg Gly
<210> 26
<211> 149
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC gRNA transcription sequence
<400> 26
agcgctctcg tacagagttg gcattataat acgactcact ataggggaga atcaaaatcg 60
gtgaatgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 120
aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttt 149
<210> 27
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC gRNA sequence
<400> 27
gagaaucaaa aucggugaau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 28
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-10 gRNA targeting domain
<400> 28
ucucucagcu gguacacggc 20
<210> 29
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-110 gRNA targeting domain
<400> 29
uggauuuaga gucucucagc 20
<210> 30
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-116 gRNA targeting domain
<400> 30
acacggcagg gucaggguuc 20
<210> 31
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-16 gRNA targeting domain
<400> 31
gagaaucaaa aucggugaau 20
<210> 32
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-4 gRNA targeting domain
<400> 32
gcugguacac ggcaggguca 20
<210> 33
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-49 gRNA targeting domain
<400> 33
cucagcuggu acacggc 17
<210> 34
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-2 gRNA targeting domain
<400> 34
ugguacacgg caggguc 17
<210> 35
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-30 gRNA targeting domain
<400> 35
gcuagacaug aggucua 17
<210> 36
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-43 gRNA targeting domain
<400> 36
gucagauuug uugcucc 17
<210> 37
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-23 gRNA targeting domain
<400> 37
ucagcuggua cacggca 17
<210> 38
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-34 gRNA targeting domain
<400> 38
gcagacagac uugucac 17
<210> 39
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-25 gRNA targeting domain
<400> 39
gguacacggc aggguca 17
<210> 40
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-128 gRNA targeting domain
<400> 40
cuucaagagc aacagugcug 20
<210> 41
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-105 gRNA targeting domain
<400> 41
agagcaacag ugcuguggcc 20
<210> 42
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-106 gRNA targeting domain
<400> 42
aaagucagau uuguugcucc 20
<210> 43
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-123 gRNA targeting domain
<400> 43
acaaaacugu gcuagacaug 20
<210> 44
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-64 gRNA targeting domain
<400> 44
aaacugugcu agacaug 17
<210> 45
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-97 gRNA targeting domain
<400> 45
ugugcuagac augaggucua 20
<210> 46
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-148 gRNA targeting domain
<400> 46
ggcuggggaa gaaggugucu uc 22
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-147 gRNA targeting domain
<400> 47
gcuggggaag aaggugucuu c 21
<210> 48
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-234 gRNA targeting domain
<400> 48
ggggaagaag gugucuuc 18
<210> 49
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-167 gRNA targeting domain
<400> 49
guuuugucug ugauauacac au 22
<210> 50
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-177 gRNA targeting domain
<400> 50
ggcagacaga cuugucacug gauu 24
<210> 51
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-176 gRNA targeting domain
<400> 51
gcagacagac uugucacugg auu 23
<210> 52
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-257 gRNA targeting domain
<400> 52
gacagacuug ucacuggauu 20
<210> 53
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-233 gRNA targeting domain
<400> 53
gugaauaggc agacagacuu guca 24
<210> 54
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-231 gRNA targeting domain
<400> 54
gaauaggcag acagacuugu ca 22
<210> 55
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-163 gRNA targeting domain
<400> 55
gagucucuca gcugguacac gg 22
<210> 56
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-241 gRNA targeting domain
<400> 56
gucucucagc ugguacacgg 20
<210> 57
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-179 gRNA targeting domain
<400> 57
gguacacggc agggucaggg uu 22
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-178 gRNA targeting domain
<400> 58
guacacggca gggucagggu u 21
<210> 59
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-40 gRNA targeting domain
<400> 59
cacccagauc gucagcgccg 20
<210> 60
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-52 gRNA targeting domain
<400> 60
caaacacagc gaccucgggu 20
<210> 61
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-25 gRNA targeting domain
<400> 61
ugacgagugg acccaggaua 20
<210> 62
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-35 gRNA targeting domain
<400> 62
ggcucucgga gaaugacgag 20
<210> 63
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-50 gRNA targeting domain
<400> 63
ggccucggcg cugacgaucu 20
<210> 64
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-39 gRNA targeting domain
<400> 64
gaaaaacgug uucccacccg 20
<210> 65
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-49 gRNA targeting domain
<400> 65
augacgagug gacccaggau 20
<210> 66
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-51 gRNA targeting domain
<400> 66
aguccaguuc uacgggcucu 20
<210> 67
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-26 gRNA targeting domain
<400> 67
cgcugucaag uccaguucua 20
<210> 68
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-47 gRNA targeting domain
<400> 68
aucgucagcg ccgaggccug 20
<210> 69
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-45 gRNA targeting domain
<400> 69
ucaaacacag cgaccucggg 20
<210> 70
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-34 gRNA targeting domain
<400> 70
cguagaacug gacuugacag 20
<210> 71
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-227 gRNA targeting domain
<400> 71
aggccucggc gcugacgauc 20
<210> 72
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-41 gRNA targeting domain
<400> 72
ugacagcgga agugguugcg 20
<210> 73
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-30 gRNA targeting domain
<400> 73
uugacagcgg aagugguugc 20
<210> 74
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-206 gRNA targeting domain
<400> 74
ucuccgagag cccguagaac 20
<210> 75
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-32 gRNA targeting domain
<400> 75
cgggugggaa cacguuuuuc 20
<210> 76
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-276 gRNA targeting domain
<400> 76
gacagguuug gcccuauccu 20
<210> 77
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-274 gRNA targeting domain
<400> 77
gaucgucagc gccgaggccu 20
<210> 78
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-230 gRNA targeting domain
<400> 78
ggcucaaaca cagcgaccuc 20
<210> 79
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-235 gRNA targeting domain
<400> 79
ugagggucuc ggccaccuuc 20
<210> 80
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-38 gRNA targeting domain
<400> 80
aggcuucuac cccgaccacg 20
<210> 81
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-223 gRNA targeting domain
<400> 81
ccgaccacgu ggagcugagc 20
<210> 82
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-221 gRNA targeting domain
<400> 82
ugacagguuu ggcccuaucc 20
<210> 83
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-48 gRNA targeting domain
<400> 83
cuugacagcg gaagugguug 20
<210> 84
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-216 gRNA targeting domain
<400> 84
agaucgucag cgccgaggcc 20
<210> 85
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-210 gRNA targeting domain
<400> 85
gcgcugacga ucugggugac 20
<210> 86
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-268 gRNA targeting domain
<400> 86
ugagggcggg cugcuccuug 20
<210> 87
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-193 gRNA targeting domain
<400> 87
guugcggggg uucugccaga 20
<210> 88
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-246 gRNA targeting domain
<400> 88
agcucagcuc cacguggucg 20
<210> 89
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-228 gRNA targeting domain
<400> 89
gcggcugcuc aggcaguauc 20
<210> 90
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-43 gRNA targeting domain
<400> 90
gcggggguuc ugccagaagg 20
<210> 91
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-272 gRNA targeting domain
<400> 91
uggcucaaac acagcgaccu 20
<210> 92
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-33 gRNA targeting domain
<400> 92
acuggacuug acagcggaag 20
<210> 93
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-44 gRNA targeting domain
<400> 93
gacagcggaa gugguugcgg 20
<210> 94
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-211 gRNA targeting domain
<400> 94
gcugucaagu ccaguucuac 20
<210> 95
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-253 gRNA targeting domain
<400> 95
guaucuggag ucauugaggg 20
<210> 96
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-18 gRNA targeting domain
<400> 96
cucggcgcug acgaucu 17
<210> 97
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-6 gRNA targeting domain
<400> 97
ccucggcgcu gacgauc 17
<210> 98
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-85 gRNA targeting domain
<400> 98
ccgagagccc guagaac 17
<210> 99
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-129 gRNA targeting domain
<400> 99
ccagaucguc agcgccg 17
<210> 100
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-93 gRNA targeting domain
<400> 100
gaaugacgag uggaccc 17
<210> 101
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-415 gRNA targeting domain
<400> 101
gggugacagg uuuggcccua uc 22
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-414 gRNA targeting domain
<400> 102
ggugacaggu uuggcccuau c 21
<210> 103
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-310 gRNA targeting domain
<400> 103
gugacagguu uggcccuauc 20
<210> 104
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-308 gRNA targeting domain
<400> 104
gacagguuug gcccuauc 18
<210> 105
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-401 gRNA targeting domain
<400> 105
gauacugccu gagcagccgc cu 22
<210> 106
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-468 gRNA targeting domain
<400> 106
gaccacgugg agcugagcug gugg 24
<210> 107
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-462 gRNA targeting domain
<400> 107
guggagcuga gcuggugg 18
<210> 108
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-424 gRNA targeting domain
<400> 108
gggcgggcug cuccuugagg ggcu 24
<210> 109
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-423 gRNA targeting domain
<400> 109
ggcgggcugc uccuugaggg gcu 23
<210> 110
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-422 gRNA targeting domain
<400> 110
gcgggcugcu ccuugagggg cu 22
<210> 111
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-420 gRNA targeting domain
<400> 111
gggcugcucc uugaggggcu 20
<210> 112
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-419 gRNA targeting domain
<400> 112
ggcugcuccu ugaggggcu 19
<210> 113
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-418 gRNA targeting domain
<400> 113
gcugcuccuu gaggggcu 18
<210> 114
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-445 gRNA targeting domain
<400> 114
ggugaauggg aaggaggugc acag 24
<210> 115
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-444 gRNA targeting domain
<400> 115
gugaauggga aggaggugca cag 23
<210> 116
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC-442 gRNA targeting domain
<400> 116
gaaugggaag gaggugcaca g 21
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence
<400> 117
attcaccgat tttgattctc 20
<210> 118
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC target sequence
<400> 118
agatcgtcag cgccgaggcc 20
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBB splice site acceptor
<400> 119
ctgacctctt ctcttcctcc cacag 25
<210> 120
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG splice site acceptor
<400> 120
tttctctcca cag 13
<210> 121
<211> 138
<212> PRT
<213> mus musculus
<220>
<223> Mouse TCR alpha constant
<300>
<308> Uniprot P01849
<309> 1986-07-21
<400> 121
Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro
1 5 10 15
Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu
65 70 75 80
Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu
85 90 95
Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu
100 105 110
Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn
115 120 125
Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135
<210> 122
<211> 136
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified mouse TCR alpha constant
<400> 122
Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser
1 5 10 15
Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn
20 25 30
Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys Val
35 40 45
Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp
50 55 60
Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn
65 70 75 80
Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val
100 105 110
Ile Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu
115 120 125
Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135
<210> 123
<211> 173
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified mouse TCR beta constant
<400> 123
Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys
50 55 60
Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
65 70 75 80
Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
85 90 95
His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro
100 105 110
Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly
115 120 125
Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu
130 135 140
Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser
145 150 155 160
Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
165 170
<210> 124
<211> 611
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 5' homology arm
<400> 124
ctctatcaat gagagagcaa tctcctggta atgtgataga tttcccaact taatgccaac 60
ataccataaa cctcccattc tgctaatgcc cagcctaagt tggggagacc actccagatt 120
ccaagatgta cagtttgctt tgctgggcct ttttcccatg cctgccttta ctctgccaga 180
gttatattgc tggggttttg aagaagatcc tattaaataa aagaataagc agtattatta 240
agtagccctg catttcaggt ttccttgagt ggcaggccag gcctggccgt gaacgttcac 300
tgaaatcatg gcctcttggc caagattgat agcttgtgcc tgtccctgag tcccagtcca 360
tcacgagcag ctggtttcta agatgctatt tcccgtataa agcatgagac cgtgacttgc 420
cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc actggcatct ggactccagc ctgggttggg 480
gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac cctgatcctc ttgtcccaca gatatccaga 540
accctgaccc tgccgtgtac cagctgagag actctaaatc cagtgacaag tctgtctgcc 600
tattcaccga t 611
<210> 125
<211> 628
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 3' homology arm
<400> 125
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 60
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 120
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 180
ttccccagcc caggtaaggg cagctttggt gccttcgcag gctgtttcct tgcttcagga 240
atggccaggt tctgcccaga gctctggtca atgatgtcta aaactcctct gattggtggt 300
ctcggcctta tccattgcca ccaaaaccct ctttttacta agaaacagtg agccttgttc 360
tggcagtcca gagaatgaca cgggaaaaaa gcagatgaag agaaggtggc aggagagggc 420
acgtggccca gcctcagtct ctccaactga gttcctgcct gcctgccttt gctcagactg 480
tttgcccctt actgctcttc taggcctcat tctaagcccc ttctccaagt tgcctctcct 540
tatttctccc tgtctgccaa aaaatctttc ccagctcact aagtcagtct cacgcagtca 600
ctcattaacc caccaatcac tgattgtg 628
<210> 126
<211> 347
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MND promoter
<400> 126
gaacagagaa acaggagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 60
cggctcaggg ccaagaacag ttggaacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt 120
aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc ggtcccgccc 180
tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc tgaaatgacc 240
ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc gcgcttctgc 300
tccccgagct ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatc 347
<210> 127
<211> 544
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ef1alpha promoter with HTLV1 enhancer
<400> 127
ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60
agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120
actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180
atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240
agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300
gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360
cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420
cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480
tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540
ctac 544
<210> 128
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A nucleotide sequence
<400> 128
ggatctggag cgacgaattt tagtctactg aaacaagcgg gagacgtgga ggaaaaccct 60
ggacct 66
<210> 129
<211> 112
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 129
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 130
<211> 112
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 130
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 131
<211> 12
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> spacer (IgG4hinge)
<400> 131
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 132
<211> 36
<212> DNA
<213> homo sapiens
<220>
<223> spacer (IgG4hinge)
<400> 132
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 133
<211> 119
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> Hinge-CH3 spacer
<400> 133
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 134
<211> 229
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> Hinge-CH2-CH3 spacer
<400> 134
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 135
<211> 282
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> IgD-hinge-Fc
<400> 135
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 136
<211> 27
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> CD28
<300>
<308> No. P10747
<309> 1989-07-01
<400> 136
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 137
<211> 66
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> CD28
<300>
<308> No. P10747
<309> 1989-07-01
<400> 137
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 138
<211> 41
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> CD28
<300>
<308> P10747
<309> 1989-07-01
<400> 138
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 139
<211> 41
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> CD28 (LL to GG)
<400> 139
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 140
<211> 42
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> 4-1BB
<300>
<308> Q07011.1
<309> 1995-02-01
<400> 140
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 141
<211> 112
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 141
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 142
<211> 138
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial recombinant TCRalpha constant region exon
1 sequence
<400> 142
cagaacccag atcccgcggt atatcaactg cgcgactcaa aatcatccga taagagtgtc 60
tgtttgttta ctgacttcga cagtcaaact aatgtctctc agagcaaaga ttccgatgtc 120
tacatcactg acaagtgc 138
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV16 E7(11-19) peptide
<400> 143
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr
1 5
<210> 144
<211> 96
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC gRNA
<220>
<221> modified_base
<222> (1)...(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 144
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96
<210> 145
<211> 104
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> exemplary gRNA complementary domain
<220>
<221> modified_base
<222> (1)...(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 145
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcugaaa agcauagcaa guuaaaauaa 60
ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg gugc 104
<210> 146
<211> 106
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC gRNA
<220>
<221> modified_base
<222> (1)...(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 146
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuaaaau 60
aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 106
<210> 147
<211> 116
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC gRNA
<220>
<221> modified_base
<222> (1)...(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 147
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu uggaaacaaa acagcauagc 60
aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 116
<210> 148
<211> 96
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC gRNA
<220>
<221> modified_base
<222> (1)...(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 148
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guauuagagc uagaaauagc aaguuaauau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96
<210> 149
<211> 96
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC gRNA
<220>
<221> modified_base
<222> (1)...(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 149
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuaagagc uagaaauagc aaguuuaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96
<210> 150
<211> 116
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC gRNA
<220>
<221> modified_base
<222> (1)...(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 150
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guauuagagc uaugcuguau uggaaacaau acagcauagc 60
aaguuaauau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 116
<210> 151
<211> 47
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA Proximal and tail domain
<400> 151
aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcu 47
<210> 152
<211> 49
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA Proximal and tail domain
<400> 152
aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cgguggugc 49
<210> 153
<211> 51
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA Proximal and tail domain
<400> 153
aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcggau c 51
<210> 154
<211> 31
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA Proximal and tail domain
<400> 154
aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu g 31
<210> 155
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA Proximal and tail domain
<400> 155
aaggcuaguc cguuauca 18
<210> 156
<211> 12
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA Proximal and tail domain
<400> 156
aaggcuaguc cg 12
<210> 157
<211> 102
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary chimeric gRNA
<220>
<221> modified_base
<222> (1)...(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 157
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 158
<211> 102
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary chimeric gRNA
<220>
<221> modified_base
<222> (1)...(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 158
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca 60
aaaugccgug uuuaucucgu caacuuguug gcgagauuuu uu 102
<210> 159
<211> 1344
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptococcus mutans Cas9
<400> 159
Lys Lys Pro Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly
1 5 10 15
Trp Ala Val Val Thr Asp Asp Tyr Lys Val Pro Ala Lys Lys Met Lys
20 25 30
Val Leu Gly Asn Thr Asp Lys Ser His Ile Glu Lys Asn Leu Leu Gly
35 40 45
Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Asn Thr Ala Glu Asp Arg Arg Leu Lys
50 55 60
Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Arg Asn Arg Ile Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Glu Ile Phe Ser Glu Glu Met Gly Lys Val Asp Asp Ser Phe
85 90 95
Phe His Arg Leu Glu Asp Ser Phe Leu Val Thr Glu Asp Lys Arg Gly
100 105 110
Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Leu Glu Glu Glu Val Lys Tyr His
115 120 125
Glu Asn Phe Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Gln Tyr Leu Ala Asp Asn
130 135 140
Pro Glu Lys Val Asp Leu Arg Leu Val Tyr Leu Ala Leu Ala His Ile
145 150 155 160
Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Lys Phe Asp Thr Arg
165 170 175
Asn Asn Asp Val Gln Arg Leu Phe Gln Glu Phe Leu Ala Val Tyr Asp
180 185 190
Asn Thr Phe Glu Asn Ser Ser Leu Gln Glu Gln Asn Val Gln Val Glu
195 200 205
Glu Ile Leu Thr Asp Lys Ile Ser Lys Ser Ala Lys Lys Asp Arg Val
210 215 220
Leu Lys Leu Phe Pro Asn Glu Lys Ser Asn Gly Arg Phe Ala Glu Phe
225 230 235 240
Leu Lys Leu Ile Val Gly Asn Gln Ala Asp Phe Lys Lys His Phe Glu
245 250 255
Leu Glu Glu Lys Ala Pro Leu Gln Phe Ser Lys Asp Thr Tyr Glu Glu
260 265 270
Glu Leu Glu Val Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Asn Tyr Ala Glu Leu
275 280 285
Phe Leu Ser Ala Lys Lys Leu Tyr Asp Ser Ile Leu Leu Ser Gly Ile
290 295 300
Leu Thr Val Thr Asp Val Gly Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met
305 310 315 320
Ile Gln Arg Tyr Asn Glu His Gln Met Asp Leu Ala Gln Leu Lys Gln
325 330 335
Phe Ile Arg Gln Lys Leu Ser Asp Lys Tyr Asn Glu Val Phe Ser Asp
340 345 350
Val Ser Lys Asp Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Lys Thr Asn Gln
355 360 365
Glu Ala Phe Tyr Lys Tyr Leu Lys Gly Leu Leu Asn Lys Ile Glu Gly
370 375 380
Ser Gly Tyr Phe Leu Asp Lys Ile Glu Arg Glu Asp Phe Leu Arg Lys
385 390 395 400
Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gln
405 410 415
Glu Met Arg Ala Ile Ile Arg Arg Gln Ala Glu Phe Tyr Pro Phe Leu
420 425 430
Ala Asp Asn Gln Asp Arg Ile Glu Lys Leu Leu Thr Phe Arg Ile Pro
435 440 445
Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Lys Ser Asp Phe Ala Trp Leu
450 455 460
Ser Arg Lys Ser Ala Asp Lys Ile Thr Pro Trp Asn Phe Asp Glu Ile
465 470 475 480
Val Asp Lys Glu Ser Ser Ala Glu Ala Phe Ile Asn Arg Met Thr Asn
485 490 495
Tyr Asp Leu Tyr Leu Pro Asn Gln Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu
500 505 510
Leu Tyr Glu Lys Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr
515 520 525
Lys Thr Glu Gln Gly Lys Thr Ala Phe Phe Asp Ala Asn Met Lys Gln
530 535 540
Glu Ile Phe Asp Gly Val Phe Lys Val Tyr Arg Lys Val Thr Lys Asp
545 550 555 560
Lys Leu Met Asp Phe Leu Glu Lys Glu Phe Asp Glu Phe Arg Ile Val
565 570 575
Asp Leu Thr Gly Leu Asp Lys Glu Asn Lys Val Phe Asn Ala Ser Tyr
580 585 590
Gly Thr Tyr His Asp Leu Cys Lys Ile Leu Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Arg Lys Arg Leu Glu Asn Tyr Ser
625 630 635 640
Asp Leu Leu Thr Lys Glu Gln Val Lys Lys Leu Glu Arg Arg His Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Ala Glu Leu Ile His Gly Ile Arg Asn
660 665 670
Lys Glu Ser Arg Lys Thr Ile Leu Asp Tyr Leu Ile Asp Asp Gly Asn
675 680 685
Ser Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile Asn Asp Asp Ala Leu Ser Phe
690 695 700
Lys Glu Glu Ile Ala Lys Ala Gln Val Ile Gly Glu Thr Asp Asn Leu
705 710 715 720
Asn Gln Val Val Ser Asp Ile Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Ser Leu Lys Ile Val Asp Glu Leu Val Lys Ile Met Gly
740 745 750
His Gln Pro Glu Asn Ile Val Val Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Phe
755 760 765
Thr Asn Gln Gly Arg Arg Asn Ser Gln Gln Arg Leu Lys Gly Leu Thr
770 775 780
Asp Ser Ile Lys Glu Phe Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val
785 790 795 800
Glu Asn Ser Gln Leu Gln Asn Asp Arg Leu Phe Leu Tyr Tyr Leu Gln
805 810 815
Asn Gly Arg Asp Met Tyr Thr Gly Glu Glu Leu Asp Ile Asp Tyr Leu
820 825 830
Ser Gln Tyr Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Gln Ala Phe Ile Lys Asp
835 840 845
Asn Ser Ile Asp Asn Arg Val Leu Thr Ser Ser Lys Glu Asn Arg Gly
850 855 860
Lys Ser Asp Asp Val Pro Ser Lys Asp Val Val Arg Lys Met Lys Ser
865 870 875 880
Tyr Trp Ser Lys Leu Leu Ser Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe
885 890 895
Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Thr Asp Asp Asp Lys
900 905 910
Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys
915 920 925
His Val Ala Arg Ile Leu Asp Glu Arg Phe Asn Thr Glu Thr Asp Glu
930 935 940
Asn Asn Lys Lys Ile Arg Gln Val Lys Ile Val Thr Leu Lys Ser Asn
945 950 955 960
Leu Val Ser Asn Phe Arg Lys Glu Phe Glu Leu Tyr Lys Val Arg Glu
965 970 975
Ile Asn Asp Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Ile
980 985 990
Gly Lys Ala Leu Leu Gly Val Tyr Pro Gln Leu Glu Pro Glu Phe Val
995 1000 1005
Tyr Gly Asp Tyr Pro His Phe His Gly His Lys Glu Asn Lys Ala Thr
1010 1015 1020
Ala Lys Lys Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Lys Asp
1025 1030 1035 1040
Asp Val Arg Thr Asp Lys Asn Gly Glu Ile Ile Trp Lys Lys Asp Glu
1045 1050 1055
His Ile Ser Asn Ile Lys Lys Val Leu Ser Tyr Pro Gln Val Asn Ile
1060 1065 1070
Val Lys Lys Val Glu Glu Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile
1075 1080 1085
Leu Pro Lys Gly Asn Ser Asp Lys Leu Ile Pro Arg Lys Thr Lys Lys
1090 1095 1100
Phe Tyr Trp Asp Thr Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Ile Val
1105 1110 1115 1120
Ala Tyr Ser Ile Leu Val Ile Ala Asp Ile Glu Lys Gly Lys Ser Lys
1125 1130 1135
Lys Leu Lys Thr Val Lys Ala Leu Val Gly Val Thr Ile Met Glu Lys
1140 1145 1150
Met Thr Phe Glu Arg Asp Pro Val Ala Phe Leu Glu Arg Lys Gly Tyr
1155 1160 1165
Arg Asn Val Gln Glu Glu Asn Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1170 1175 1180
Phe Lys Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Leu Leu Ala Ser Ala Arg Glu
1185 1190 1195 1200
Leu Gln Lys Gly Asn Glu Ile Val Leu Pro Asn His Leu Gly Thr Leu
1205 1210 1215
Leu Tyr His Ala Lys Asn Ile His Lys Val Asp Glu Pro Lys His Leu
1220 1225 1230
Asp Tyr Val Asp Lys His Lys Asp Glu Phe Lys Glu Leu Leu Asp Val
1235 1240 1245
Val Ser Asn Phe Ser Lys Lys Tyr Thr Leu Ala Glu Gly Asn Leu Glu
1250 1255 1260
Lys Ile Lys Glu Leu Tyr Ala Gln Asn Asn Gly Glu Asp Leu Lys Glu
1265 1270 1275 1280
Leu Ala Ser Ser Phe Ile Asn Leu Leu Thr Phe Thr Ala Ile Gly Ala
1285 1290 1295
Pro Ala Thr Phe Lys Phe Phe Asp Lys Asn Ile Asp Arg Lys Arg Tyr
1300 1305 1310
Thr Ser Thr Thr Glu Ile Leu Asn Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile
1315 1320 1325
Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Asn Lys Leu Gly Gly Asp
1330 1335 1340
<210> 160
<211> 1367
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptococcus pyogenes Cas9
<400> 160
Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly
1 5 10 15
Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys
20 25 30
Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly
35 40 45
Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys
50 55 60
Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe
85 90 95
Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His
100 105 110
Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His
115 120 125
Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser
130 135 140
Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met
145 150 155 160
Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp
165 170 175
Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn
180 185 190
Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys
195 200 205
Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu
210 215 220
Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu
225 230 235 240
Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp
245 250 255
Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp
260 265 270
Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu
275 280 285
Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile
290 295 300
Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met
305 310 315 320
Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp
340 345 350
Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln
355 360 365
Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly
370 375 380
Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys
385 390 395 400
Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly
405 410 415
Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu
420 425 430
Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro
435 440 445
Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met
450 455 460
Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val
465 470 475 480
Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn
485 490 495
Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu
500 505 510
Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr
515 520 525
Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys
530 535 540
Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val
545 550 555 560
Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser
565 570 575
Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr
580 585 590
Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn
595 600 605
Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu
610 615 620
Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His
625 630 635 640
Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr
645 650 655
Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys
660 665 670
Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala
675 680 685
Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys
690 695 700
Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His
705 710 715 720
Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile
725 730 735
Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg
740 745 750
His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr
755 760 765
Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu
770 775 780
Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val
785 790 795 800
Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln
805 810 815
Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu
820 825 830
Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp
835 840 845
Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly
850 855 860
Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn
865 870 875 880
Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe
885 890 895
Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys
900 905 910
Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys
915 920 925
His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu
930 935 940
Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys
945 950 955 960
Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu
965 970 975
Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val
980 985 990
Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val
995 1000 1005
Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser
1010 1015 1020
Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn
1025 1030 1035 1040
Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile
1045 1050 1055
Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val
1060 1065 1070
Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met
1075 1080 1085
Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe
1090 1095 1100
Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala
1105 1110 1115 1120
Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro
1125 1130 1135
Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys
1140 1145 1150
Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met
1155 1160 1165
Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys
1170 1175 1180
Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr
1185 1190 1195 1200
Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala
1205 1210 1215
Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro
1235 1240 1245
Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr
1250 1255 1260
Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile
1265 1270 1275 1280
Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His
1285 1290 1295
Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe
1300 1305 1310
Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr
1315 1320 1325
Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala
1330 1335 1340
Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp
1345 1350 1355 1360
Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1365
<210> 161
<211> 1387
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptococcus thermophilus Cas9
<400> 161
Thr Lys Pro Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly
1 5 10 15
Trp Ala Val Thr Thr Asp Asn Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Met Lys
20 25 30
Val Leu Gly Asn Thr Ser Lys Lys Tyr Ile Lys Lys Asn Leu Leu Gly
35 40 45
Val Leu Leu Phe Asp Ser Gly Ile Thr Ala Glu Gly Arg Arg Leu Lys
50 55 60
Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Arg Asn Arg Ile Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Glu Ile Phe Ser Thr Glu Met Ala Thr Leu Asp Asp Ala Phe
85 90 95
Phe Gln Arg Leu Asp Asp Ser Phe Leu Val Pro Asp Asp Lys Arg Asp
100 105 110
Ser Lys Tyr Pro Ile Phe Gly Asn Leu Val Glu Glu Lys Ala Tyr His
115 120 125
Asp Glu Phe Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Tyr Leu Ala Asp Ser
130 135 140
Thr Lys Lys Ala Asp Leu Arg Leu Val Tyr Leu Ala Leu Ala His Met
145 150 155 160
Ile Lys Tyr Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Glu Phe Asn Ser Lys
165 170 175
Asn Asn Asp Ile Gln Lys Asn Phe Gln Asp Phe Leu Asp Thr Tyr Asn
180 185 190
Ala Ile Phe Glu Ser Asp Leu Ser Leu Glu Asn Ser Lys Gln Leu Glu
195 200 205
Glu Ile Val Lys Asp Lys Ile Ser Lys Leu Glu Lys Lys Asp Arg Ile
210 215 220
Leu Lys Leu Phe Pro Gly Glu Lys Asn Ser Gly Ile Phe Ser Glu Phe
225 230 235 240
Leu Lys Leu Ile Val Gly Asn Gln Ala Asp Phe Arg Lys Cys Phe Asn
245 250 255
Leu Asp Glu Lys Ala Ser Leu His Phe Ser Lys Glu Ser Tyr Asp Glu
260 265 270
Asp Leu Glu Thr Leu Leu Gly Tyr Ile Gly Asp Asp Tyr Ser Asp Val
275 280 285
Phe Leu Lys Ala Lys Lys Leu Tyr Asp Ala Ile Leu Leu Ser Gly Phe
290 295 300
Leu Thr Val Thr Asp Asn Glu Thr Glu Ala Pro Leu Ser Ser Ala Met
305 310 315 320
Ile Lys Arg Tyr Asn Glu His Lys Glu Asp Leu Ala Leu Leu Lys Glu
325 330 335
Tyr Ile Arg Asn Ile Ser Leu Lys Thr Tyr Asn Glu Val Phe Lys Asp
340 345 350
Asp Thr Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Lys Thr Asn Gln
355 360 365
Glu Asp Phe Tyr Val Tyr Leu Lys Lys Leu Leu Ala Glu Phe Glu Gly
370 375 380
Ala Asp Tyr Phe Leu Glu Lys Ile Asp Arg Glu Asp Phe Leu Arg Lys
385 390 395 400
Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro Tyr Gln Ile His Leu Gln
405 410 415
Glu Met Arg Ala Ile Leu Asp Lys Gln Ala Lys Phe Tyr Pro Phe Leu
420 425 430
Ala Lys Asn Lys Glu Arg Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro
435 440 445
Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Asp Phe Ala Trp Ser
450 455 460
Ile Arg Lys Arg Asn Glu Lys Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Asp Val
465 470 475 480
Ile Asp Lys Glu Ser Ser Ala Glu Ala Phe Ile Asn Arg Met Thr Ser
485 490 495
Phe Asp Leu Tyr Leu Pro Glu Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu
500 505 510
Leu Tyr Glu Thr Phe Asn Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Arg Phe
515 520 525
Ile Ala Glu Ser Met Arg Asp Tyr Gln Phe Leu Asp Ser Lys Gln Lys
530 535 540
Lys Asp Ile Val Arg Leu Tyr Phe Lys Asp Lys Arg Lys Val Thr Asp
545 550 555 560
Lys Asp Ile Ile Glu Tyr Leu His Ala Ile Tyr Gly Tyr Asp Gly Ile
565 570 575
Glu Leu Lys Gly Ile Glu Lys Gln Phe Asn Ser Ser Leu Ser Thr Tyr
580 585 590
His Asp Leu Leu Asn Ile Ile Asn Asp Lys Glu Phe Leu Asp Asp Ser
595 600 605
Ser Asn Glu Ala Ile Ile Glu Glu Ile Ile His Thr Leu Thr Ile Phe
610 615 620
Glu Asp Arg Glu Met Ile Lys Gln Arg Leu Ser Lys Phe Glu Asn Ile
625 630 635 640
Phe Asp Lys Ser Val Leu Lys Lys Leu Ser Arg Arg His Tyr Thr Gly
645 650 655
Trp Gly Lys Leu Ser Ala Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Glu Lys
660 665 670
Ser Gly Asn Thr Ile Leu Asp Tyr Leu Ile Asp Asp Gly Ile Ser Asn
675 680 685
Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ala Leu Ser Phe Lys Lys
690 695 700
Lys Ile Gln Lys Ala Gln Ile Ile Gly Asp Glu Asp Lys Gly Asn Ile
705 710 715 720
Lys Glu Val Val Lys Ser Leu Pro Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Ser Ile Lys Ile Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Gly Arg Lys Pro Glu Ser Ile Val Val Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Tyr Thr Asn Gln Gly Lys Ser Asn Ser Gln Gln Arg Leu Lys Arg Leu
770 775 780
Glu Lys Ser Leu Lys Glu Leu Gly Ser Lys Ile Leu Lys Glu Asn Ile
785 790 795 800
Pro Ala Lys Leu Ser Lys Ile Asp Asn Asn Ala Leu Gln Asn Asp Arg
805 810 815
Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Asp Met Tyr Thr Gly Asp
820 825 830
Asp Leu Asp Ile Asp Arg Leu Ser Asn Tyr Asp Ile Asp His Ile Ile
835 840 845
Pro Gln Ala Phe Leu Lys Asp Asn Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Val
850 855 860
Ser Ser Ala Ser Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asp Val Pro Ser Leu Glu
865 870 875 880
Val Val Lys Lys Arg Lys Thr Phe Trp Tyr Gln Leu Leu Lys Ser Lys
885 890 895
Leu Ile Ser Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly
900 905 910
Gly Leu Ser Pro Glu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Gln Arg Gln Leu Val
915 920 925
Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Arg Leu Leu Asp Glu Lys
930 935 940
Phe Asn Asn Lys Lys Asp Glu Asn Asn Arg Ala Val Arg Thr Val Lys
945 950 955 960
Ile Ile Thr Leu Lys Ser Thr Leu Val Ser Gln Phe Arg Lys Asp Phe
965 970 975
Glu Leu Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asp Phe His His Ala His Asp
980 985 990
Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Ala Ser Ala Leu Leu Lys Lys Tyr Pro
995 1000 1005
Lys Leu Glu Pro Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Pro Lys Tyr Asn Ser
1010 1015 1020
Phe Arg Glu Arg Lys Ser Ala Thr Glu Lys Val Tyr Phe Tyr Ser Asn
1025 1030 1035 1040
Ile Met Asn Ile Phe Lys Lys Ser Ile Ser Leu Ala Asp Gly Arg Val
1045 1050 1055
Ile Glu Arg Pro Leu Ile Glu Val Asn Glu Glu Thr Gly Glu Ser Val
1060 1065 1070
Trp Asn Lys Glu Ser Asp Leu Ala Thr Val Arg Arg Val Leu Ser Tyr
1075 1080 1085
Pro Gln Val Asn Val Val Lys Lys Val Glu Glu Gln Asn His Gly Leu
1090 1095 1100
Asp Arg Gly Lys Pro Lys Gly Leu Phe Asn Ala Asn Leu Ser Ser Lys
1105 1110 1115 1120
Pro Lys Pro Asn Ser Asn Glu Asn Leu Val Gly Ala Lys Glu Tyr Leu
1125 1130 1135
Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Tyr Ala Gly Ile Ser Asn Ser Phe Thr
1140 1145 1150
Val Leu Val Lys Gly Thr Ile Glu Lys Gly Ala Lys Lys Lys Ile Thr
1155 1160 1165
Asn Val Leu Glu Phe Gln Gly Ile Ser Ile Leu Asp Arg Ile Asn Tyr
1170 1175 1180
Arg Lys Asp Lys Leu Asn Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Lys Asp Ile
1185 1190 1195 1200
Glu Leu Ile Ile Glu Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Ser Asp
1205 1210 1215
Gly Ser Arg Arg Met Leu Ala Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Lys Arg
1220 1225 1230
Gly Glu Ile His Lys Gly Asn Gln Ile Phe Leu Ser Gln Lys Phe Val
1235 1240 1245
Lys Leu Leu Tyr His Ala Lys Arg Ile Ser Asn Thr Ile Asn Glu Asn
1250 1255 1260
His Arg Lys Tyr Val Glu Asn His Lys Lys Glu Phe Glu Glu Leu Phe
1265 1270 1275 1280
Tyr Tyr Ile Leu Glu Phe Asn Glu Asn Tyr Val Gly Ala Lys Lys Asn
1285 1290 1295
Gly Lys Leu Leu Asn Ser Ala Phe Gln Ser Trp Gln Asn His Ser Ile
1300 1305 1310
Asp Glu Leu Cys Ser Ser Phe Ile Gly Pro Thr Gly Ser Glu Arg Lys
1315 1320 1325
Gly Leu Phe Glu Leu Thr Ser Arg Gly Ser Ala Ala Asp Phe Glu Phe
1330 1335 1340
Leu Gly Val Lys Ile Pro Arg Tyr Arg Asp Tyr Thr Pro Ser Ser Leu
1345 1350 1355 1360
Leu Lys Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Val Thr Gly Leu Tyr Glu
1365 1370 1375
Thr Arg Ile Asp Leu Ala Lys Leu Gly Glu Gly
1380 1385
<210> 162
<211> 1333
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Listeria innocua Cas9
<400> 162
Lys Lys Pro Tyr Thr Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly
1 5 10 15
Trp Ala Val Leu Thr Asp Gln Tyr Asp Leu Val Lys Arg Lys Met Lys
20 25 30
Ile Ala Gly Asp Ser Glu Lys Lys Gln Ile Lys Lys Asn Phe Trp Gly
35 40 45
Val Arg Leu Phe Asp Glu Gly Gln Thr Ala Ala Asp Arg Arg Met Ala
50 55 60
Arg Thr Ala Arg Arg Arg Ile Glu Arg Arg Arg Asn Arg Ile Ser Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Gly Ile Phe Ala Glu Glu Met Ser Lys Thr Asp Ala Asn Phe
85 90 95
Phe Cys Arg Leu Ser Asp Ser Phe Tyr Val Asp Asn Glu Lys Arg Asn
100 105 110
Ser Arg His Pro Phe Phe Ala Thr Ile Glu Glu Glu Val Glu Tyr His
115 120 125
Lys Asn Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Glu Glu Leu Val Asn Ser
130 135 140
Ser Glu Lys Ala Asp Leu Arg Leu Val Tyr Leu Ala Leu Ala His Ile
145 150 155 160
Ile Lys Tyr Arg Gly Asn Phe Leu Ile Glu Gly Ala Leu Asp Thr Gln
165 170 175
Asn Thr Ser Val Asp Gly Ile Tyr Lys Gln Phe Ile Gln Thr Tyr Asn
180 185 190
Gln Val Phe Ala Ser Gly Ile Glu Asp Gly Ser Leu Lys Lys Leu Glu
195 200 205
Asp Asn Lys Asp Val Ala Lys Ile Leu Val Glu Lys Val Thr Arg Lys
210 215 220
Glu Lys Leu Glu Arg Ile Leu Lys Leu Tyr Pro Gly Glu Lys Ser Ala
225 230 235 240
Gly Met Phe Ala Gln Phe Ile Ser Leu Ile Val Gly Ser Lys Gly Asn
245 250 255
Phe Gln Lys Pro Phe Asp Leu Ile Glu Lys Ser Asp Ile Glu Cys Ala
260 265 270
Lys Asp Ser Tyr Glu Glu Asp Leu Glu Ser Leu Leu Ala Leu Ile Gly
275 280 285
Asp Glu Tyr Ala Glu Leu Phe Val Ala Ala Lys Asn Ala Tyr Ser Ala
290 295 300
Val Val Leu Ser Ser Ile Ile Thr Val Ala Glu Thr Glu Thr Asn Ala
305 310 315 320
Lys Leu Ser Ala Ser Met Ile Glu Arg Phe Asp Thr His Glu Glu Asp
325 330 335
Leu Gly Glu Leu Lys Ala Phe Ile Lys Leu His Leu Pro Lys His Tyr
340 345 350
Glu Glu Ile Phe Ser Asn Thr Glu Lys His Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile
355 360 365
Asp Gly Lys Thr Lys Gln Ala Asp Phe Tyr Lys Tyr Met Lys Met Thr
370 375 380
Leu Glu Asn Ile Glu Gly Ala Asp Tyr Phe Ile Ala Lys Ile Glu Lys
385 390 395 400
Glu Asn Phe Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ala Ile Pro
405 410 415
His Gln Leu His Leu Glu Glu Leu Glu Ala Ile Leu His Gln Gln Ala
420 425 430
Lys Tyr Tyr Pro Phe Leu Lys Glu Asn Tyr Asp Lys Ile Lys Ser Leu
435 440 445
Val Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Phe Val Gly Pro Leu Ala Asn Gly Gln
450 455 460
Ser Glu Phe Ala Trp Leu Thr Arg Lys Ala Asp Gly Glu Ile Arg Pro
465 470 475 480
Trp Asn Ile Glu Glu Lys Val Asp Phe Gly Lys Ser Ala Val Asp Phe
485 490 495
Ile Glu Lys Met Thr Asn Lys Asp Thr Tyr Leu Pro Lys Glu Asn Val
500 505 510
Leu Pro Lys His Ser Leu Cys Tyr Gln Lys Tyr Leu Val Tyr Asn Glu
515 520 525
Leu Thr Lys Val Arg Tyr Ile Asn Asp Gln Gly Lys Thr Ser Tyr Phe
530 535 540
Ser Gly Gln Glu Lys Glu Gln Ile Phe Asn Asp Leu Phe Lys Gln Lys
545 550 555 560
Arg Lys Val Lys Lys Lys Asp Leu Glu Leu Phe Leu Arg Asn Met Ser
565 570 575
His Val Glu Ser Pro Thr Ile Glu Gly Leu Glu Asp Ser Phe Asn Ser
580 585 590
Ser Tyr Ser Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Val Gly Ile Lys Gln Glu
595 600 605
Ile Leu Asp Asn Pro Val Asn Thr Glu Met Leu Glu Asn Ile Val Lys
610 615 620
Ile Leu Thr Val Phe Glu Asp Lys Arg Met Ile Lys Glu Gln Leu Gln
625 630 635 640
Gln Phe Ser Asp Val Leu Asp Gly Val Val Leu Lys Lys Leu Glu Arg
645 650 655
Arg His Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Ala Lys Leu Leu Met Gly
660 665 670
Ile Arg Asp Lys Gln Ser His Leu Thr Ile Leu Asp Tyr Leu Met Asn
675 680 685
Asp Asp Gly Leu Asn Arg Asn Leu Met Gln Leu Ile Asn Asp Ser Asn
690 695 700
Leu Ser Phe Lys Ser Ile Ile Glu Lys Glu Gln Val Thr Thr Ala Asp
705 710 715 720
Lys Asp Ile Gln Ser Ile Val Ala Asp Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile
725 730 735
Lys Lys Gly Ile Leu Gln Ser Leu Lys Ile Val Asp Glu Leu Val Ser
740 745 750
Val Met Gly Tyr Pro Pro Gln Thr Ile Val Val Glu Met Ala Arg Glu
755 760 765
Asn Gln Thr Thr Gly Lys Gly Lys Asn Asn Ser Arg Pro Arg Tyr Lys
770 775 780
Ser Leu Glu Lys Ala Ile Lys Glu Phe Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu
785 790 795 800
His Pro Thr Asp Asn Gln Glu Leu Arg Asn Asn Arg Leu Tyr Leu Tyr
805 810 815
Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Asp Met Tyr Thr Gly Gln Asp Leu Asp Ile
820 825 830
His Asn Leu Ser Asn Tyr Asp Ile Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe
835 840 845
Ile Thr Asp Asn Ser Ile Asp Asn Leu Val Leu Thr Ser Ser Ala Gly
850 855 860
Asn Arg Glu Lys Gly Asp Asp Val Pro Pro Leu Glu Ile Val Arg Lys
865 870 875 880
Arg Lys Val Phe Trp Glu Lys Leu Tyr Gln Gly Asn Leu Met Ser Lys
885 890 895
Arg Lys Phe Asp Tyr Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Thr Glu
900 905 910
Ala Asp Lys Ala Arg Phe Ile His Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln
915 920 925
Ile Thr Lys Asn Val Ala Asn Ile Leu His Gln Arg Phe Asn Tyr Glu
930 935 940
Lys Asp Asp His Gly Asn Thr Met Lys Gln Val Arg Ile Val Thr Leu
945 950 955 960
Lys Ser Ala Leu Val Ser Gln Phe Arg Lys Gln Phe Gln Leu Tyr Lys
965 970 975
Val Arg Asp Val Asn Asp Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn
980 985 990
Gly Val Val Ala Asn Thr Leu Leu Lys Val Tyr Pro Gln Leu Glu Pro
995 1000 1005
Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr His Gln Phe Asp Trp Phe Lys Ala Asn
1010 1015 1020
Lys Ala Thr Ala Lys Lys Gln Phe Tyr Thr Asn Ile Met Leu Phe Phe
1025 1030 1035 1040
Ala Gln Lys Asp Arg Ile Ile Asp Glu Asn Gly Glu Ile Leu Trp Asp
1045 1050 1055
Lys Lys Tyr Leu Asp Thr Val Lys Lys Val Met Ser Tyr Arg Gln Met
1060 1065 1070
Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Ile Gln Lys Gly Glu Phe Ser Lys Ala
1075 1080 1085
Thr Ile Lys Pro Lys Gly Asn Ser Ser Lys Leu Ile Pro Arg Lys Thr
1090 1095 1100
Asn Trp Asp Pro Met Lys Tyr Gly Gly Leu Asp Ser Pro Asn Met Ala
1105 1110 1115 1120
Tyr Ala Val Val Ile Glu Tyr Ala Lys Gly Lys Asn Lys Leu Val Phe
1125 1130 1135
Glu Lys Lys Ile Ile Arg Val Thr Ile Met Glu Arg Lys Ala Phe Glu
1140 1145 1150
Lys Asp Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Gln Gly Tyr Arg Gln Pro Lys
1155 1160 1165
Val Leu Ala Lys Leu Pro Lys Tyr Thr Leu Tyr Glu Cys Glu Glu Gly
1170 1175 1180
Arg Arg Arg Met Leu Ala Ser Ala Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Gln
1185 1190 1195 1200
Gln Val Leu Pro Asn His Leu Val Thr Leu Leu His His Ala Ala Asn
1205 1210 1215
Cys Glu Val Ser Asp Gly Lys Ser Leu Asp Tyr Ile Glu Ser Asn Arg
1220 1225 1230
Glu Met Phe Ala Glu Leu Leu Ala His Val Ser Glu Phe Ala Lys Arg
1235 1240 1245
Tyr Thr Leu Ala Glu Ala Asn Leu Asn Lys Ile Asn Gln Leu Phe Glu
1250 1255 1260
Gln Asn Lys Glu Gly Asp Ile Lys Ala Ile Ala Gln Ser Phe Val Asp
1265 1270 1275 1280
Leu Met Ala Phe Asn Ala Met Gly Ala Pro Ala Ser Phe Lys Phe Phe
1285 1290 1295
Glu Thr Thr Ile Glu Arg Lys Arg Tyr Asn Asn Leu Lys Glu Leu Leu
1300 1305 1310
Asn Ser Thr Ile Ile Tyr Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Ser Arg
1315 1320 1325
Lys Arg Leu Asp Asp
1330
<210> 163
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence 2
<400> 163
gagaatcaaa atcggtgaat 20
<210> 164
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC target sequence 2
<400> 164
ggcctcggcg ctgacgatct 20
<210> 165
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 3
<400> 165
gagaatcaaa atcggtgaat agg 23
<210> 166
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 4
<400> 166
ttcaaaacct gtcagtgatt ggg 23
<210> 167
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 5
<400> 167
tgtgctagac atgaggtcta tgg 23
<210> 168
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 6
<400> 168
cgtcatgagc agattaaacc cgg 23
<210> 169
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 7
<400> 169
tcagggttct ggatatctgt ggg 23
<210> 170
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 8
<400> 170
gtcagggttc tggatatctg tgg 23
<210> 171
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 9
<400> 171
ttcggaaccc aatcactgac agg 23
<210> 172
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 10
<400> 172
taaacccggc cactttcagg agg 23
<210> 173
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 11
<400> 173
aaagtcagat ttgttgctcc agg 23
<210> 174
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 12
<400> 174
aacaaatgtg tcacaaagta agg 23
<210> 175
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 13
<400> 175
tggatttaga gtctctcagc tgg 23
<210> 176
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 14
<400> 176
taggcagaca gacttgtcac tgg 23
<210> 177
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 15
<400> 177
agctggtaca cggcagggtc agg 23
<210> 178
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 16
<400> 178
gctggtacac ggcagggtca ggg 23
<210> 179
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 17
<400> 179
tctctcagct ggtacacggc agg 23
<210> 180
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 18
<400> 180
tttcaaaacc tgtcagtgat tgg 23
<210> 181
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 19
<400> 181
gattaaaccc ggccactttc agg 23
<210> 182
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 20
<400> 182
ctcgaccagc ttgacatcac agg 23
<210> 183
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 21
<400> 183
agagtctctc agctggtaca cgg 23
<210> 184
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 22
<400> 184
ctctcagctg gtacacggca ggg 23
<210> 185
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 23
<400> 185
aagttcctgt gatgtcaagc tgg 23
<210> 186
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 24
<400> 186
atcctcctcc tgaaagtggc cgg 23
<210> 187
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 25
<400> 187
tgctcatgac gctgcggctg tgg 23
<210> 188
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 26
<400> 188
acaaaactgt gctagacatg agg 23
<210> 189
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 27
<400> 189
atttgtttga gaatcaaaat cgg 23
<210> 190
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 28
<400> 190
catcacagga actttctaaa agg 23
<210> 191
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 29
<400> 191
gtcgagaaaa gctttgaaac agg 23
<210> 192
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 30
<400> 192
ccactttcag gaggaggatt cgg 23
<210> 193
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 31
<400> 193
ctgacaggtt ttgaaagttt agg 23
<210> 194
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 32
<400> 194
agctttgaaa caggtaagac agg 23
<210> 195
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 33
<400> 195
tggaataatg ctgttgttga agg 23
<210> 196
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 34
<400> 196
agagcaacag tgctgtggcc tgg 23
<210> 197
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 35
<400> 197
ctgtggtcca gctgaggtga ggg 23
<210> 198
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 36
<400> 198
ctgcggctgt ggtccagctg agg 23
<210> 199
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 37
<400> 199
tgtggtccag ctgaggtgag ggg 23
<210> 200
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 38
<400> 200
cttcttcccc agcccaggta agg 23
<210> 201
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 39
<400> 201
acacggcagg gtcagggttc tgg 23
<210> 202
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 40
<400> 202
cttcaagagc aacagtgctg tgg 23
<210> 203
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 41
<400> 203
ctggggaaga aggtgtcttc tgg 23
<210> 204
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 42
<400> 204
tcctcctcct gaaagtggcc ggg 23
<210> 205
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 43
<400> 205
ttaatctgct catgacgctg cgg 23
<210> 206
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 44
<400> 206
acccggccac tttcaggagg agg 23
<210> 207
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 45
<400> 207
ttcttcccca gcccaggtaa ggg 23
<210> 208
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 46
<400> 208
cttacctggg ctggggaaga agg 23
<210> 209
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 47
<400> 209
gacaccttct tccccagccc agg 23
<210> 210
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 48
<400> 210
gctgtggtcc agctgaggtg agg 23
<210> 211
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC target sequence with PAM 49
<400> 211
ccgaatcctc ctcctgaaag tgg 23
<210> 212
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC target sequence with PAM 3
<400> 212
gctgtcaagt ccagttctac ggg 23
<210> 213
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC ZFN target sequence 1
<400> 213
ctatggactt caagagcaac agtgctgt 28
<210> 214
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC ZFN target sequence 2
<400> 214
ctcatgtcta gcacagtttt gtctgtga 28
<210> 215
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC ZFN target sequence 3
<400> 215
gtgctgtggc ctggagcaac aaatctga 28
<210> 216
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC ZFN target sequence 4
<400> 216
ttgctcttga agtccataga cctcatgt 28
<210> 217
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC ZFN target sequence 5
<400> 217
ctgtggcctg gagcaacaaa tctgact 27
<210> 218
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC ZFN target sequence 6
<400> 218
ctgttgctct tgaagtccat agacctca 28
<210> 219
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC ZFN target sequence 7
<400> 219
ctgtggcctg gagcaacaaa tctgactt 28
<210> 220
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC ZFN target sequence 8
<400> 220
ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaa 28
<210> 221
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC ZFN target sequence 9
<400> 221
ttgttgctcc aggccacagc actgttgc 28
<210> 222
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC ZFN target sequence 10
<400> 222
tgaaagtggc cgggtttaat ctgctcat 28
<210> 223
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC ZFN target sequence 11
<400> 223
aggaggattc ggaacccaat cactgaca 28
<210> 224
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC ZFN target sequence 12
<400> 224
gaggaggatt cggaacccaa tcactgac 28
<210> 225
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC ZFN target sequence 1
<400> 225
ccgtagaact ggacttgaca gcggaagt 28
<210> 226
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC ZFN target sequence 2
<400> 226
tctcggagaa tgacgagtgg acccagga 28
<210> 227
<211> 1082
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Neisseria meningitidis Cas9
<400> 227
Met Ala Ala Phe Lys Pro Asn Ser Ile Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp
1 5 10 15
Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Met Val Glu Ile Asp Glu Glu
20 25 30
Glu Asn Pro Ile Arg Leu Ile Asp Leu Gly Val Arg Val Phe Glu Arg
35 40 45
Ala Glu Val Pro Lys Thr Gly Asp Ser Leu Ala Met Ala Arg Arg Leu
50 55 60
Ala Arg Ser Val Arg Arg Leu Thr Arg Arg Arg Ala His Arg Leu Leu
65 70 75 80
Arg Thr Arg Arg Leu Leu Lys Arg Glu Gly Val Leu Gln Ala Ala Asn
85 90 95
Phe Asp Glu Asn Gly Leu Ile Lys Ser Leu Pro Asn Thr Pro Trp Gln
100 105 110
Leu Arg Ala Ala Ala Leu Asp Arg Lys Leu Thr Pro Leu Glu Trp Ser
115 120 125
Ala Val Leu Leu His Leu Ile Lys His Arg Gly Tyr Leu Ser Gln Arg
130 135 140
Lys Asn Glu Gly Glu Thr Ala Asp Lys Glu Leu Gly Ala Leu Leu Lys
145 150 155 160
Gly Val Ala Gly Asn Ala His Ala Leu Gln Thr Gly Asp Phe Arg Thr
165 170 175
Pro Ala Glu Leu Ala Leu Asn Lys Phe Glu Lys Glu Ser Gly His Ile
180 185 190
Arg Asn Gln Arg Ser Asp Tyr Ser His Thr Phe Ser Arg Lys Asp Leu
195 200 205
Gln Ala Glu Leu Ile Leu Leu Phe Glu Lys Gln Lys Glu Phe Gly Asn
210 215 220
Pro His Val Ser Gly Gly Leu Lys Glu Gly Ile Glu Thr Leu Leu Met
225 230 235 240
Thr Gln Arg Pro Ala Leu Ser Gly Asp Ala Val Gln Lys Met Leu Gly
245 250 255
His Cys Thr Phe Glu Pro Ala Glu Pro Lys Ala Ala Lys Asn Thr Tyr
260 265 270
Thr Ala Glu Arg Phe Ile Trp Leu Thr Lys Leu Asn Asn Leu Arg Ile
275 280 285
Leu Glu Gln Gly Ser Glu Arg Pro Leu Thr Asp Thr Glu Arg Ala Thr
290 295 300
Leu Met Asp Glu Pro Tyr Arg Lys Ser Lys Leu Thr Tyr Ala Gln Ala
305 310 315 320
Arg Lys Leu Leu Gly Leu Glu Asp Thr Ala Phe Phe Lys Gly Leu Arg
325 330 335
Tyr Gly Lys Asp Asn Ala Glu Ala Ser Thr Leu Met Glu Met Lys Ala
340 345 350
Tyr His Ala Ile Ser Arg Ala Leu Glu Lys Glu Gly Leu Lys Asp Lys
355 360 365
Lys Ser Pro Leu Asn Leu Ser Pro Glu Leu Gln Asp Glu Ile Gly Thr
370 375 380
Ala Phe Ser Leu Phe Lys Thr Asp Glu Asp Ile Thr Gly Arg Leu Lys
385 390 395 400
Asp Arg Ile Gln Pro Glu Ile Leu Glu Ala Leu Leu Lys His Ile Ser
405 410 415
Phe Asp Lys Phe Val Gln Ile Ser Leu Lys Ala Leu Arg Arg Ile Val
420 425 430
Pro Leu Met Glu Gln Gly Lys Arg Tyr Asp Glu Ala Cys Ala Glu Ile
435 440 445
Tyr Gly Asp His Tyr Gly Lys Lys Asn Thr Glu Glu Lys Ile Tyr Leu
450 455 460
Pro Pro Ile Pro Ala Asp Glu Ile Arg Asn Pro Val Val Leu Arg Ala
465 470 475 480
Leu Ser Gln Ala Arg Lys Val Ile Asn Gly Val Val Arg Arg Tyr Gly
485 490 495
Ser Pro Ala Arg Ile His Ile Glu Thr Ala Arg Glu Val Gly Lys Ser
500 505 510
Phe Lys Asp Arg Lys Glu Ile Glu Lys Arg Gln Glu Glu Asn Arg Lys
515 520 525
Asp Arg Glu Lys Ala Ala Ala Lys Phe Arg Glu Tyr Phe Pro Asn Phe
530 535 540
Val Gly Glu Pro Lys Ser Lys Asp Ile Leu Lys Leu Arg Leu Tyr Glu
545 550 555 560
Gln Gln His Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Gly Lys Glu Ile Asn Leu Gly
565 570 575
Arg Leu Asn Glu Lys Gly Tyr Val Glu Ile Asp His Ala Leu Pro Phe
580 585 590
Ser Arg Thr Trp Asp Asp Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Leu Gly
595 600 605
Ser Glu Asn Gln Asn Lys Gly Asn Gln Thr Pro Tyr Glu Tyr Phe Asn
610 615 620
Gly Lys Asp Asn Ser Arg Glu Trp Gln Glu Phe Lys Ala Arg Val Glu
625 630 635 640
Thr Ser Arg Phe Pro Arg Ser Lys Lys Gln Arg Ile Leu Leu Gln Lys
645 650 655
Phe Asp Glu Asp Gly Phe Lys Glu Arg Asn Leu Asn Asp Thr Arg Tyr
660 665 670
Val Asn Arg Phe Leu Cys Gln Phe Val Ala Asp Arg Met Arg Leu Thr
675 680 685
Gly Lys Gly Lys Lys Arg Val Phe Ala Ser Asn Gly Gln Ile Thr Asn
690 695 700
Leu Leu Arg Gly Phe Trp Gly Leu Arg Lys Val Arg Ala Glu Asn Asp
705 710 715 720
Arg His His Ala Leu Asp Ala Val Val Val Ala Cys Ser Thr Val Ala
725 730 735
Met Gln Gln Lys Ile Thr Arg Phe Val Arg Tyr Lys Glu Met Asn Ala
740 745 750
Phe Asp Gly Lys Thr Ile Asp Lys Glu Thr Gly Glu Val Leu His Gln
755 760 765
Lys Thr His Phe Pro Gln Pro Trp Glu Phe Phe Ala Gln Glu Val Met
770 775 780
Ile Arg Val Phe Gly Lys Pro Asp Gly Lys Pro Glu Phe Glu Glu Ala
785 790 795 800
Asp Thr Leu Glu Lys Leu Arg Thr Leu Leu Ala Glu Lys Leu Ser Ser
805 810 815
Arg Pro Glu Ala Val His Glu Tyr Val Thr Pro Leu Phe Val Ser Arg
820 825 830
Ala Pro Asn Arg Lys Met Ser Gly Gln Gly His Met Glu Thr Val Lys
835 840 845
Ser Ala Lys Arg Leu Asp Glu Gly Val Ser Val Leu Arg Val Pro Leu
850 855 860
Thr Gln Leu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Lys Met Val Asn Arg Glu Arg
865 870 875 880
Glu Pro Lys Leu Tyr Glu Ala Leu Lys Ala Arg Leu Glu Ala His Lys
885 890 895
Asp Asp Pro Ala Lys Ala Phe Ala Glu Pro Phe Tyr Lys Tyr Asp Lys
900 905 910
Ala Gly Asn Arg Thr Gln Gln Val Lys Ala Val Arg Val Glu Gln Val
915 920 925
Gln Lys Thr Gly Val Trp Val Arg Asn His Asn Gly Ile Ala Asp Asn
930 935 940
Ala Thr Met Val Arg Val Asp Val Phe Glu Lys Gly Asp Lys Tyr Tyr
945 950 955 960
Leu Val Pro Ile Tyr Ser Trp Gln Val Ala Lys Gly Ile Leu Pro Asp
965 970 975
Arg Ala Val Val Gln Gly Lys Asp Glu Glu Asp Trp Gln Leu Ile Asp
980 985 990
Asp Ser Phe Asn Phe Lys Phe Ser Leu His Pro Asn Asp Leu Val Glu
995 1000 1005
Val Ile Thr Lys Lys Ala Arg Met Phe Gly Tyr Phe Ala Ser Cys His
1010 1015 1020
Arg Gly Thr Gly Asn Ile Asn Ile Arg Ile His Asp Leu Asp His Lys
1025 1030 1035 1040
Ile Gly Lys Asn Gly Ile Leu Glu Gly Ile Gly Val Lys Thr Ala Leu
1045 1050 1055
Ser Phe Gln Lys Tyr Gln Ile Asp Glu Leu Gly Lys Glu Ile Arg Pro
1060 1065 1070
Cys Arg Leu Lys Lys Arg Pro Pro Val Arg
1075 1080
<210> 228
<211> 1368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptococcus pyogenes Cas9
<400> 228
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys
1010 1015 1020
Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser
1025 1030 1035 1040
Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu
1045 1050 1055
Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile
1060 1065 1070
Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser
1075 1080 1085
Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly
1090 1095 1100
Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile
1105 1110 1115 1120
Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser
1125 1130 1135
Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly
1140 1145 1150
Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile
1155 1160 1165
Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala
1170 1175 1180
Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys
1185 1190 1195 1200
Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser
1205 1210 1215
Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr
1220 1225 1230
Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His
1250 1255 1260
Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val
1265 1270 1275 1280
Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys
1285 1290 1295
His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu
1300 1305 1310
Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp
1315 1320 1325
Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp
1330 1335 1340
Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile
1345 1350 1355 1360
Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1365
<210> 229
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 50 bp 5' Homology Arm
<400> 229
agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 50
<210> 230
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 100 bp 5' Homology Arm
<400> 230
ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 60
ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 100
<210> 231
<211> 200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 200 bp 5' Homology Arm
<400> 231
gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca ctggcatctg gactccagcc 60
tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc ctgatcctct tgtcccacag 120
atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt 180
ctgtctgcct attcaccgat 200
<210> 232
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 300 bp 5' Homology Arm
<400> 232
cctcttggcc aagattgata gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc 60
tggtttctaa gatgctattt cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag 120
agccccgccc ttgtccatca ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga 180
aatgagatca tgtcctaacc ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct 240
gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 300
<210> 233
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 400 bp 5' Homology Arm
<400> 233
attaaataaa agaataagca gtattattaa gtagccctgc atttcaggtt tccttgagtg 60
gcaggccagg cctggccgtg aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata 120
gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt 180
cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca 240
ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc 300
ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 360
ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 400
<210> 234
<211> 500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 500 bp 5' Homology Arm
<400> 234
ctccagattc caagatgtac agtttgcttt gctgggcctt tttcccatgc ctgcctttac 60
tctgccagag ttatattgct ggggttttga agaagatcct attaaataaa agaataagca 120
gtattattaa gtagccctgc atttcaggtt tccttgagtg gcaggccagg cctggccgtg 180
aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata gcttgtgcct gtccctgagt 240
cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt cccgtataaa gcatgagacc 300
gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca ctggcatctg gactccagcc 360
tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc ctgatcctct tgtcccacag 420
atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt 480
ctgtctgcct attcaccgat 500
<210> 235
<211> 600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 600 bp 5' Homology Arm
<400> 235
agagagcaat ctcctggtaa tgtgatagat ttcccaactt aatgccaaca taccataaac 60
ctcccattct gctaatgccc agcctaagtt ggggagacca ctccagattc caagatgtac 120
agtttgcttt gctgggcctt tttcccatgc ctgcctttac tctgccagag ttatattgct 180
ggggttttga agaagatcct attaaataaa agaataagca gtattattaa gtagccctgc 240
atttcaggtt tccttgagtg gcaggccagg cctggccgtg aacgttcact gaaatcatgg 300
cctcttggcc aagattgata gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc 360
tggtttctaa gatgctattt cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag 420
agccccgccc ttgtccatca ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg caaagaggga 480
aatgagatca tgtcctaacc ctgatcctct tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct 540
gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 600
<210> 236
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 50 bp 3' Homology Arm
<400> 236
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat 50
<210> 237
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 100 bp 3' Homology Arm
<400> 237
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 60
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca 100
<210> 238
<211> 200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 200 bp 3' Homology Arm
<400> 238
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 60
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 120
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 180
ttccccagcc caggtaaggg 200
<210> 239
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 300 bp 3' Homology Arm
<400> 239
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 60
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 120
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 180
ttccccagcc caggtaaggg cagctttggt gccttcgcag gctgtttcct tgcttcagga 240
atggccaggt tctgcccaga gctctggtca atgatgtcta aaactcctct gattggtggt 300
<210> 240
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 400 bp 3' Homology Arm
<400> 240
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 60
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 120
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 180
ttccccagcc caggtaaggg cagctttggt gccttcgcag gctgtttcct tgcttcagga 240
atggccaggt tctgcccaga gctctggtca atgatgtcta aaactcctct gattggtggt 300
ctcggcctta tccattgcca ccaaaaccct ctttttacta agaaacagtg agccttgttc 360
tggcagtcca gagaatgaca cgggaaaaaa gcagatgaag 400
<210> 241
<211> 500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 500 bp 3' Homology Arm
<400> 241
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 60
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 120
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 180
ttccccagcc caggtaaggg cagctttggt gccttcgcag gctgtttcct tgcttcagga 240
atggccaggt tctgcccaga gctctggtca atgatgtcta aaactcctct gattggtggt 300
ctcggcctta tccattgcca ccaaaaccct ctttttacta agaaacagtg agccttgttc 360
tggcagtcca gagaatgaca cgggaaaaaa gcagatgaag agaaggtggc aggagagggc 420
acgtggccca gcctcagtct ctccaactga gttcctgcct gcctgccttt gctcagactg 480
tttgcccctt actgctcttc 500
<210> 242
<211> 600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC 600 bp 3' Homology Arm
<400> 242
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 60
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 120
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 180
ttccccagcc caggtaaggg cagctttggt gccttcgcag gctgtttcct tgcttcagga 240
atggccaggt tctgcccaga gctctggtca atgatgtcta aaactcctct gattggtggt 300
ctcggcctta tccattgcca ccaaaaccct ctttttacta agaaacagtg agccttgttc 360
tggcagtcca gagaatgaca cgggaaaaaa gcagatgaag agaaggtggc aggagagggc 420
acgtggccca gcctcagtct ctccaactga gttcctgcct gcctgccttt gctcagactg 480
tttgcccctt actgctcttc taggcctcat tctaagcccc ttctccaagt tgcctctcct 540
tatttctccc tgtctgccaa aaaatctttc ccagctcact aagtcagtct cacgcagtca 600
<210> 243
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<400> 243
Asn Ile Gln Lys Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Ala Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 244
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<400> 244
His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 245
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<400> 245
Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 246
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<400> 246
Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 247
<211> 142
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<400> 247
Pro Asn Ile Gln Lys Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Ala Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
85 90 95
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
100 105 110
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
115 120 125
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 248
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<400> 248
Asn Ile Gln Lys Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Ala Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 249
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<400> 249
His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 250
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<400> 250
Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 251
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<400> 251
Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 252
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR alpha constant
<400> 252
Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 253
<211> 177
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR beta constant
<400> 253
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Phe
<210> 254
<211> 180
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR beta constant
<400> 254
Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu
130 135 140
Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr
145 150 155 160
Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys
165 170 175
Asp Ser Arg Gly
180
<210> 255
<211> 180
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR beta constant
<400> 255
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu
130 135 140
Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr
145 150 155 160
Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys
165 170 175
Asp Ser Arg Gly
180
<210> 256
<211> 179
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR beta constant
<400> 256
Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Ser Arg Gly
<210> 257
<211> 180
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR beta constant
<400> 257
Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu
130 135 140
Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr
145 150 155 160
Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys
165 170 175
Asp Ser Arg Gly
180
<210> 258
<211> 180
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human TCR beta constant
<400> 258
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu
130 135 140
Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr
145 150 155 160
Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys
165 170 175
Asp Ser Arg Gly
180
<210> 259
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial TCR alpha constant region
<400> 259
Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser
1 5 10 15
Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val
20 25 30
Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys
35 40 45
<210> 260
<211> 131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial endogenous TCR alpha constant region
<400> 260
gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 60
tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 120
cccagcccag g 131
<210> 261
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial TCR alpha constant region
<400> 261
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
1 5 10 15
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
20 25 30
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
35 40
Claims (210)
- 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포로서,
상기 변형된 TRAC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고,
상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬 및 (ii) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고,
여기에서 상기 핵산 서열은 (a) 상기 TCRβ 및 Vα 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 상기 재조합 TCR의 Cα 도메인의 적어도 일부를 암호화하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포로서,
상기 변형된 TRAC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고,
상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬 및 (ii) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRβ 및 Vα 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 상기 재조합 TCR의 Cα 도메인의 적어도 일부를 암호화하며, 여기에서:
상기 Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, 상기 Cα의 추가 부분은 상기 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 상기 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 더 짧고;
(a)의 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역에 비해 하나 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 상기 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키고/거나 여기에서 상기 재조합 TCR의 Cα 및/또는 Cβ는 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 T 세포로서,
상기 변형된 TRAC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬 및 (ii) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRβ 및 Vα 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 상기 재조합 TCR의 Cα 도메인의 적어도 일부를 암호화하며, 여기에서 상기 전이 유전자 서열은, 유전자 조작된 T 세포가 도입된 세포에서 발현될 경우, 상기 TCR의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 이종(heterologous) 프로모터를 포함하는 하나 이상의 이종 또는 조절 제어 요소(들)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전이 유전자 서열은 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 통합된 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변형된 TRAC 유전자 좌는 (i) 전이 유전자 서열 및 (ii) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 인프레임 융합을 포함하고, 선택적으로 여기에서 상기 전이 유전자 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전이 유전자 서열은 3' 비번역 영역(3' untranslated region, 3' UTR) 또는 인트론을 암호화하는 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, 상기 Cα의 추가 부분은 상기 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 상기 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 더 짧은 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 내인성 TRAC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 2 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cα의 추가 부분은 TRAC 유전자 좌의 4 개 미만의 엑손, 3 개 미만의 엑손, 2 개 미만의 엑손, 1 개의 엑손 또는 1 개의 전체 엑손 미만의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 2 항 및 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cα의 추가 부분은 400 개 미만, 300 개 미만, 250 개 미만, 200 개 미만 또는 150 개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 2 항 및 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cα의 추가 부분은 상기 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 상기TRAC 유전자 좌의 엑손 1 오픈 리딩 프레임 전장보다 더 짧은 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전이 유전자 서열은 상기 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 최대 5' 뉴클레오티드의 하류 및 엑손 1의 최대 3' 뉴클레오티드의 상류에서 통합된 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cα의 적어도 일부는 상기 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 적어도 일부 및 엑손 2-4에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암호화된 TCRα 사슬은 TCRβ 사슬과 2량체화될 수 있는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암호화된 Cα는 서열 번호: 14, 15, 19 및 24 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 14, 15, 19 및 24 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암호화된 Cα는 서열 번호: 19, 24 및 243-252 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 19, 24 및 243-252 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 2 항 및 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cα의 적어도 일부는 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 2 항 및 제 7 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cα의 추가 부분은 서열 번호: 142에 제시된 서열 또는 서열 번호: 142에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 7 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a)의 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 상기 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키고/거나 상기 재조합 TCR의 Cα 및/또는 Cβ는 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 2 항 또는 제 19 항에 있어서,
상기 하나 이상의 시스테인 잔기의 도입은 비시스테인 잔기의 시스테인 잔기로의 교체를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 2 항, 제 19 항 및 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암호화된 Cα 영역은 서열 번호: 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 넘버링으로 48번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함하고/거나;
상기 암호화된 Cβ 영역은 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 넘버링으로 57번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 2 항 및 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암호화된 Cα는 서열 번호: 248-252 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 T 세포는 TRBC 유전자 좌에서 유전자 파괴를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포로서,
상기 변형된 TRBC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬 및 (ii) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬을 포함하며, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) TCRα 및 Vβ 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 상기 재조합 TCR의 Cβ 도메인의 적어도 일부를 암호화하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포로서,
상기 변형된 TRBC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬 및 (ii) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬을 포함하며, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) 상기 TCRα 및 Vβ 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 상기 재조합 TCR의 Cβ 도메인의 적어도 일부를 암호화하며, 여기에서:
상기 Cβ의 일부는 상기 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, 상기 Cβ의 추가 부분은 상기 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cβ의 상기 추가 부분은 천연 Cβ의 전장보다 더 짧고;
(a)의 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cβ의 추가 부분 및/또는 Cα 영역은 천연 Cβ 영역 및/또는 천연 Cα 영역에 비해 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 상기 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,
상기 전이 유전자 서열은 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 통합된 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TRBC 유전자 좌는 TRBC1 유전자 좌 및/또는 TRBC2 유전자 좌인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변형된 TRBC 유전자 좌는 (i) 전이 유전자 서열 및 (ii) 상기 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 인프레임 융합을 포함하고, 선택적으로 여기에서 상기 전이 유전자 서열은 상기 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 24 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전이 유전자 서열은 3' 비번역 영역(3' UTR) 또는 인트론을 암호화하는 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 24 항 및 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cβ의 일부는 상기 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, 상기 Cβ의 추가 부분은 상기 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cβ의 상기 추가 부분은 천연 Cβ의 전장보다 더 짧은 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 24 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 상기 내인성 TRBC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 25 항, 제 30 항 및 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cβ의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 4 개 미만의 엑손, 3 개 미만의 엑손, 2 개 미만의 엑손, 1 개의 엑손 또는 1 개의 전체 엑손 미만의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 25 항 및 제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cβ의 추가 부분은 400 개 미만, 300 개 미만, 250 개 미만, 200 개 미만 또는 150 개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 25 항 및 제 30 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cβ의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 상기 TRBC 유전자 좌의 엑손 1 오픈 리딩 프레임 전장보다 더 짧은 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 24 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전이 유전자 서열은 상기 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1의 최대 5' 뉴클레오티드의 하류 및 엑손 1의 최대 3' 뉴클레오티드의 상류에서 통합된 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 24 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cβ의 적어도 일부는 상기 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 적어도 엑손 1의 일부 및 엑손 2-4에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 24 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암호화된 TCRβ 사슬은 TCRα 사슬과 2량체화될 수 있는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 24 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암호화된 Cβ는 서열 번호: 16, 17, 21 및 25 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 16, 17, 21 및 25 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 24 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암호화된 Cβ는 서열 번호: 20, 21, 25 및 253-258 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 20, 21, 25 및 253-258 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 25 항 및 제 30 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cβ의 적어도 일부는
서열 번호: 2에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1445번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 2에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1445번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열; 또는
서열 번호: 3에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1486번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 3에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1486번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열;
에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 25 항 및 제 30 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a)의 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cβ의 추가 부분 및/또는 Cα 영역은 천연 Cβ 영역 및/또는 천연 Cα 영역과 비교하여, 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 상기 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 25 항 및 제 41 항에 있어서,
상기 하나 이상의 시스테인 잔기의 도입은 비시스테인 잔기의 시스테인 잔기로의 교체를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 25 항, 제 41 항 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암호화된 Cα 영역은 서열 번호: 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 넘버링으로 48번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함하고/거나;
상기 암호화된 Cβ 영역은 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 넘버링으로 57번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 25 항 및 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암호화된 Cβ는 서열 번호: 253 및 256-258 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 24 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 T 세포는 TRAC 유전자 좌의 유전자 파괴를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전이 유전자 서열은 하나 이상의 다중 시스트론 요소(들)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 46 항에 있어서,
상기 다중 시스트론 요소(들)는 상기 TCRα 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 상기 TCRβ 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열 사이 및/또는 상기 TCR 또는 상기 TCR의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 상류에 위치하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서,
상기 다중 시스트론 요소는 리보솜 건너뛰기 서열, 선택적으로 T2A, P2A, E2A 또는 F2A이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전이 유전자 서열은, 상기 유전자 조작된 T 세포가 도입된 세포에서 발현될 경우 상기 TCR의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된, 하나 이상의 이종 또는 조절 제어 요소(들)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 49 항에 있어서,
상기 이종 조절 또는 제어 요소는 이종 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 50 항에 있어서,
상기 이종 프로모터는 구성적 프로모터, 유도 가능 프로모터, 억제 가능 프로모터 및/또는 조직 특이적 프로모터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 50 항 또는 제 51 항에 있어서,
상기 이종 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(human elongation factor 1 alpha, EF1α) 프로모터 또는 MND 프로모터 또는 이의 변이체이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 TCR은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 항원과 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 53 항에 있어서,
상기 질병, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 종양 또는 암인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 대상체에서 유래된 1차 T 세포이고, 선택적으로 상기 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 CD8+ T 세포 또는 이의 하위 유형인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 CD4+ T 세포 또는 이의 하위 유형인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 다능성(multipotent) 또는 만능(pluripotent) 세포에서 유래되고, 이는 선택적으로 iPSC인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포. - 제 1 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항의 복수의 유전자 조작된 T 세포를 포함하는 조성물.
- 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는 복수의 유전자 조작된 T 세포를 포함하는, 조성물로서,
상기 변형된 TRAC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬 및 (ii) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬을 포함하며, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) 상기 TCRβ 및 Vα 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 상기 재조합 TCR의 Cα 도메인의 적어도 일부를 암호화하고, 상기 재조합 TCR은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 항원과 결합할 수 있으며; 여기에서:
상기 조성물 중 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상기 조작된 세포가 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자의 유전자 파괴 또는 상기 유전자 내에서 유전자 파괴를 포함하고/거나;
상기 조성물 중 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상기 조작된 세포가 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자의 유전자 생성물을 발현하지 않거나 검출 가능한 수준으로 발현하지 않고/거나;
상기 조성물 중 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 90% 이상 또는 초과의 세포가 상기 재조합 TCR을 발현하고/거나 상기 항원에 대한 결합을 나타내는 것을 특징으로 하는,
조성물. - 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는 복수의 유전자 조작된 T 세포를 포함하는, 조성물로서,
상기 변형된 TRAC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬 및 (ii) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬을 포함하고, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) 상기TCRβ 및 Vα 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 상기 재조합 TCR의 Cα 도메인의 적어도 일부를 암호화하며;
상기 Cα의 일부는 상기 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, 상기 Cα의 추가 부분은 상기 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 상기 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 더 짧고;
(a)의 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역에 비해 하나 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 상기 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키는 것을 특징으로 하는,
조성물. - 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 포함하는 복수의 유전자 조작된 T 세포를 포함하는, 조성물로서,
상기 변형된 TRBC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬 및 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬을 포함하며, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) 상기 TCRα 및 Vβ 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 상기 재조합 TCR의 Cβ 도메인의 적어도 일부를 암호화하고, 상기 재조합 TCR은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 항원과 결합할 수 있으며, 여기에서:
상기 조성물 중 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상기 조작된 세포가 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자의 유전자 파괴 또는 상기 유전자 내에서 유전자 파괴를 포함하고/거나;
상기 조성물 중 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상기 조작된 세포가 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자의 유전자 생성물을 발현하지 않거나 검출 가능한 수준으로 발현하지 않고/거나;
상기 조성물 중 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 90% 이상 또는 초과의 세포가 상기 재조합 TCR을 발현하고/거나 상기 항원에 대한 결합을 나타내는 것을 특징으로 하는,
조성물. - 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 포함하는 복수의 유전자 조작된 T 세포를 포함하는, 조성물로서,
상기 변형된 TRBC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 재조합 TCR 또는 이의 일부는 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 TCR 베타(TCRβ) 사슬 및 (ii) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 TCR 알파(TCRα) 사슬을 포함하며, 여기에서 상기 핵산 서열은 (a) 상기 TCRα 및 Vβ 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 (b) 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 여기에서 상기 오픈 리딩 프레임은 상기 재조합 TCR의 Cβ 도메인의 적어도 일부를 암호화하며; 여기에서:
상기 Cβ의 일부는 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, 상기 Cβ의 추가 부분은 상기 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cβ의 상기 추가 부분은 천연 Cβ의 전장보다 더 짧고;
(a)의 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cβ의 추가 부분 및/또는 Cα 영역은 천연 Cβ 영역 및/또는 천연 Cα 영역에 비해 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 상기 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키는 것을 특징으로 하는,
조성물. - 제 61 항 또는 제 63 항에 있어서,
상기 재조합 TCR은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 항원에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는,
조성물. - 제 59 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는,
조성물. - 제 59 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:3 내지 3:1, 선택적으로 1:1인 것을 특징으로 하는,
조성물. - 제 59 항, 제 61 항 및 제 63 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물 중 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상기 조작된 세포가, 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자의 유전자 파괴 또는 상기 유전자 내에서 유전자 파괴를 포함하고/거나;
상기 조성물 중 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상기 조작된 세포가, 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자의 유전자 생성물을 발현하지 않거나 검출 가능한 수준으로 발현하지 않는 것을 특징으로 하는,
조성물. - 제 59 항, 제 61 항 및 제 63 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물 중 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 90% 이상 또는 초과의 세포가 상기 재조합 TCR을 발현하고/거나 상기 항원에 대한 결합을 나타내는 것을 특징으로 하는,
조성물. - 폴리뉴클레오티드로서,
(a) 재조합 T 세포 수용체(TCR)의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 핵산 서열은 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬; 및 (ii) T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부;를 암호화하고, 여기에서 상기 TCRα 사슬의 일부는 천연 TCRα 사슬 전장보다 더 짧음 - ; 및
(b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 여기에서 상기 하나 이상의 상동성 암은 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함함 - ;
을 포함하고,
여기에서 상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 폴리뉴클레오티드로서,
(a) 재조합 T 세포 수용체(TCR)의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 핵산 서열은 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬; 및 (ii) T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부;를 암호화하고, 여기에서 상기 TCRα 사슬의 일부는 천연 TCRα 사슬의 전장보다 더 짧음 - ; 및
(b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 여기에서 상기 하나 이상의 상동성 암은 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함함 - ;
을 포함하고,
여기에서, 상기 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우:
상기 Cα의 일부는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, 상기 Cα의 추가 부분은 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 상기 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 더 짧고;
(a)의 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 상기 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키고/거나 여기에서 상기 재조합 TCR의 Cα 및/또는 Cβ는 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 폴리뉴클레오티드로서,
(a) 재조합 T 세포 수용체(TCR)의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 핵산 서열은 (i) 가변 베타(Vβ) 도메인 및 불변 베타(Cβ) 도메인을 포함하는 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬; 및 (ii) T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부;를 암호화하고, 여기에서 상기 TCRα 사슬의 일부는 천연 TCRα 사슬의 전장보다 더 짧음 - ; 및
(b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 여기에서 상기 하나 이상의 상동성 암은 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함함 - ;
을 포함하고,
여기에서, 전이 유전자 서열은, 유전자 조작된 T 세포가 도입된 세포에서 발현될 경우, 상기 TCR의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함한 하나 이상의 이종 또는 조절 제어 요소(들)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TCRα 사슬은 불변 알파 영역(Cα)을 포함하고, 여기에서 상기 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, 상기 Cα의 적어도 일부는 상기 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고/거나
(a)의 상기 핵산 서열 및 상기 하나 이상의 상동성 암 중 하나가 함께 천연 Cα의 전장보다 더 짧은 Cα를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기에서 상기 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, 상기 Cα의 적어도 일부는 상기 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TCRβ 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 상기 TCRα 사슬의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 상류에 있는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a)의 상기 핵산 서열은 3' 비번역 영역(3' UTR) 또는 인트론을 암호화하는 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a)의 상기 핵산 서열은 상기 하나 이상의 상동성 암(들)에 포함된 상기 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임인 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 및 제 71 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cα의 일부는 상기 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, 상기 Cα의 추가 부분은 (a)의 상기 핵산 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 상기 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 더 짧은 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 상기 내인성 TRAC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 70 항, 제 76 항 및 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cα의 추가 부분은 상기 TRAC 유전자 좌의 4 개 미만의 엑손, 3 개 미만의 엑손, 2 개 미만의 엑손, 1 개의 엑손 또는 1 개의 전체 엑손 미만의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 70 항 및 제 76 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cα의 추가 부분은 400 개 미만, 300 개 미만, 250 개 미만, 200 개 미만 또는 150 개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 70 항 및 제 76 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cα의 추가 부분은 상기 TRAC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 상기 TRAC 유전자 좌의 엑손 1 오픈 리딩 프레임의 전장보다 더 짧은 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, 상기 TCRα 사슬은 TCRβ 사슬과 2량체화될 수 있는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, 상기 암호화된 Cα는 서열 번호: 19, 24 및 243-252 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 19, 24 및 243-252 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 70 항 및 제 76 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cα의 적어도 일부는 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 1에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 3155번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 70 항 및 제 76 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cα의 추가 부분은 서열 번호: 142에 제시된 서열 또는 서열 번호: 142에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 76 항 내지 제 84 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a)의 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 상기 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 70 항 및 제 85 항에 있어서,
상기 하나 이상의 시스테인 잔기의 도입은 비시스테인 잔기의 시스테인 잔기로의 교체를 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 70 항, 제 85 항 및 제 86 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, 상기 암호화된 Cα 영역은 서열 번호: 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 넘버링으로 48번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함하고/거나;
상기 암호화된 Cβ 영역은 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 넘버링으로 57번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 70 항 및 제 85 항 내지 제 87 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, 상기 암호화된 Cα는 서열 번호: 248-252 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TCRα 사슬의 일부는 가변 알파(Vα) 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 89 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 상동성 암은 5' 상동성 암 및/또는 3' 상동성 암을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 90 항에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 표적 부위 주변 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함하고, 여기에서 상기 표적 부위는 TRAC 유전자 좌 내에 있는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 91 항에 있어서,
상기 표적 부위는 상기 TRAC 유전자 좌의 엑손 1 내에 있는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 90 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5' 상동성 암은
a) 서열 번호: 124에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열에 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600 개 또는 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 서열;
b) 서열 번호: 124에 제시된 서열의 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600 개 또는 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는
c) 서열 번호: 124에 제시된 서열;
을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 90 항 내지 제 93 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 3′상동성 암은
a) 서열 번호: 125에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열에 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600 개 또는 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 서열;
b) 서열 번호: 125에 제시된 서열의 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600 개 또는 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 서열; 또는
c) 서열 번호: 125에 제시된 서열;
을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 폴리뉴클레오티드로서,
(a) 재조합 T 세포 수용체(TCR)의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 핵산 서열은 (i) 가변 알파(Vα) 도메인 및 불변 알파(Cα) 도메인을 포함하는 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬; 및 (ii) T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬의 일부;를 암호화하고, 여기에서 상기 TCRβ 사슬의 일부는 천연 TCRβ 사슬 전장보다 더 짧음 - ; 및
(b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 여기에서 상기 하나 이상의 상동성 암은 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함함 - ;
을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 95 항에 있어서,
상기 TCRβ 사슬은 불변 베타(Cβ)를 포함하고, 여기에서 상기 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, 상기 Cβ의 적어도 일부는 상기 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고/거나
(a)의 상기 핵산 서열 및 상기 하나 이상의 상동성 암 중 하나가 함께 천연 Cβ의 전장보다 더 짧은 Cβ를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기에서 상기 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, 상기 Cβ의 적어도 일부는 상기 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 95 항 또는 제 96 항에 있어서,
상기 TRBC 유전자 좌는 TRBC1 또는 TRBC2 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 95 항 내지 제 97 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TCRα 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 상기 TCRβ 사슬의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 상류에 있는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 95 항 내지 제 98 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a)의 상기 핵산 서열은 3' 비번역 영역(3' UTR) 또는 인트론을 암호화하는 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 95 항 내지 제 99 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a)의 상기 핵산 서열은 상기 하나 이상의 상동성 암(들)에 포함된 상기 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임인 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 95 항 내지 제 100 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cβ의 일부는 상기 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, 상기 Cβ의 추가 부분은 (a)의 상기 핵산 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cβ의 상기 추가 부분은 천연 Cβ의 전장보다 더 짧은 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 95 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열은 상기 내인성 TRBC 유전자 좌의 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 101 항 또는 제 102 항에 있어서,
상기 Cβ의 추가 부분은 상기 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 4 개 미만의 엑손, 3 개 미만의 엑손, 2 개 미만의 엑손, 1 개의 엑손 또는 1 개의 전체 엑손 미만을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 101 항 내지 제 103 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cβ의 추가 부분은 400 개 미만, 300 개 미만, 250 개 미만, 200 개 미만 또는 150 개 미만의 염기쌍 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 101 항 내지 제 104 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cβ의 추가 부분은 TRBC 유전자 좌의 엑손 1의 일부에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 엑손 1의 일부는 상기 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1 전장보다 더 짧은 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 95 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, 상기 TCRβ 사슬은 TCRα 사슬과 2량체화될 수 있는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 106 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 생산될 경우, 상기 암호화된 Cβ는 서열 번호: 20, 21, 25 및 253-258 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 서열 번호: 20, 21, 25 및 253-258 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 101 항 내지 제 107 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Cβ의 적어도 일부는:
서열 번호: 2에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1445번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 2에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1445번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열; 또는
서열 번호: 3에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1486번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손 또는 서열 번호: 3에 제시된 서열의 3번 잔기에서 시작하고 1486번 잔기까지의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하나 이상의 엑손에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열;
에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 101 항 내지 제 108 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a)의 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cβ의 추가 부분 및/또는 Cα 영역은 천연 Cβ 영역 및/또는 천연 Cα 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 변형, 선택적으로 교체, 결실 또는 삽입을 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 변형은 상기 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 109 항에 있어서,
상기 하나 이상의 시스테인 잔기의 도입은 비시스테인 잔기의 시스테인 잔기로의 교체를 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 109 항 또는 제 110 항에 있어서,
상기 암호화된 Cα 영역은 서열 번호: 24 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 넘버링으로 48번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함하고/거나;
상기 암호화된 Cβ 영역은 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 넘버링으로 57번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 109 항 내지 제 111 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암호화된 Cβ는 서열 번호: 253 및 256-258 중 어느 하나에서 선택된 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 95 항 내지 제 112 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TCRβ 사슬의 일부는 가변 베타(Vβ) 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 95 항 내지 제 113 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 상동성 암은 5' 상동성 암 및/또는 3' 상동성 암을 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 114 항에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 표적 부위 주변 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함하고, 여기에서 상기 표적 부위는 상기 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내에 있는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 115 항에 있어서,
상기 표적 부위는 상기 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 1 내에 있는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 116 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a)의 상기 핵산 서열은 T 세포, 선택적으로 인간 T 세포의 내인성 게놈 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임에 대해 이종성 또는 외인성 서열인 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 90 항 내지 제 94 항 및 제 114 항 내지 제 117 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 100 개의 뉴클레오티드 길이, (약) 100 내지 (약) 250 개의 뉴클레오티드 길이, (약) 250 내지 (약) 500 개의 뉴클레오티드 길이, (약) 500 내지 (약) 750 개의 뉴클레오티드 길이, (약) 750 내지 (약) 1000 개의 뉴클레오티드 길이 또는 (약) 1000 내지 (약) 2000 개의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 90 항 내지 제 94 항 및 제 114 항 내지 제 118 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 100 내지 (약) 1000 개의 뉴클레오티드, 100 내지 750 개의 뉴클레오티드, 100 내지 600 개의 뉴클레오티드, 100 내지 400 개의 뉴클레오티드, 100 내지 300 개의 뉴클레오티드, 100 내지 200 개의 뉴클레오티드, 200 내지 1000 개의 뉴클레오티드, 200 내지 750 개의 뉴클레오티드, 200 내지 600 개의 뉴클레오티드, 200 내지 400 개의 뉴클레오티드, 200 내지 300 개의 뉴클레오티드, 300 내지 1000 개의 뉴클레오티드, 300 내지 750 개의 뉴클레오티드, 300 내지 600 개의 뉴클레오티드, 300 내지 400 개의 뉴클레오티드, 400 내지 1000 개의 뉴클레오티드, 400 내지 750 개의 뉴클레오티드, 400 내지 600 개의 뉴클레오티드, 600 내지 1000 개의 뉴클레오티드, 600 내지 750 개의 뉴클레오티드 또는 750 내지 1000 개의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 90 항 내지 제 94 항 및 제 114 항 내지 제 119 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800 개의 뉴클레오티드 길이 또는 상기 중 임의의 사이의 임의의 수치인 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 90 항 내지 제 94 항 및 제 114 항 내지 제 120 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 300 개의 뉴클레오티드 길이를 초과하고, 선택적으로 여기에서 상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 400, 500 또는 600 개의 뉴클레오티드 길이이거나 또는 상기 중 임의의 사이의 임의의 수치인 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 90 항 내지 제 94 항 및 제 114 항 내지 제 121 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 600 개 또는 약 600 개 미만의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 90 항 내지 제 94 항 및 제 114 항 내지 제 122 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암은 독립적으로 (약) 300 개의 뉴클레오티드 길이를 초과하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 123 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a)의 상기 핵산 서열은 하나 이상의 다중 시스트론 요소(들)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 124 항에 있어서,
상기 다중 시스트론 요소(들)는 상기 TCRα 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 상기 TCRβ 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열 사이 및/또는 상기 TCR 또는 상기 TCR의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 상류에 위치하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 124 항 또는 제 125 항에 있어서,
상기 다중 시스트론 요소는 리보솜 건너뛰기 서열, 선택적으로 T2A, P2A, E2A 또는 F2A이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 126 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a)의 상기 핵산 서열은, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포에서 발현될 경우, 상기 TCR의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종 또는 조절 제어 요소(들)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 127 항에 있어서,
상기 이종 조절 또는 제어 요소는 이종 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 128 항에 있어서,
상기 이종 프로모터는 구성적 프로모터, 유도 가능 프로모터, 억제 가능 프로모터 및/또는 조직 특이적 프로모터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 128 항 또는 제 129 항에 있어서,
상기 이종 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 MND 프로모터 또는 이의 변이체이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 131 항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터이고, 선택적으로 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 132 항에 있어서,
상기 AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV6 벡터인 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 133 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 [5' 상동성 암]-[(a)의 핵산 서열]-[3' 상동성 암] 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 124 항 내지 제 134 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 [5' 상동성 암]-[다중 시스트론 요소]-[(a)의 핵산 서열]-[3' 상동성 암] 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 128 항 내지 제 134 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 [5' 상동성 암]-[이종 프로모터]-[(a)의 핵산 서열]-[3' 상동성 암] 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 136 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암호화된 재조합 TCR은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 항원과 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 137 항에 있어서,
상기 질병, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 종양 또는 암인 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 138 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 (약) 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 7500, 8000, 9000 또는 10000 개 이상의 뉴클레오티드 길이이거나 또는 상기 중 임의의 사이의 임의의 수치인 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 제 69 항 내지 제 139 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 (약) 2500 내지 (약) 5000 개의 뉴클레오티드, (약) 3500 내지 (약) 4500 개의 뉴클레오티드 또는 (약) 3750 개의 뉴클레오티드 내지 (약) 4250 개의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는,
폴리뉴클레오티드. - 변형된 TRAC 유전자 좌를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서,
상기 방법은 제 69 항 내지 제 94 항 또는 제 117 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 TRAC 유전자 좌의 유전자 파괴를 포함하는 T 세포로 도입시키는 것을 포함하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서,
상기 방법은
(a) T 세포의 내인성 TRAC 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 상기 T 세포로 도입시키는 단계; 및
(b) T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 상기 T 세포로 도입시키는 단계 - 여기에서 상기 일부는 천연 TCRα 사슬 전장보다 더 짧음 - ;
를 포함하고,
여기에서:
상기 주형 폴리뉴클레오티드의 도입은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 도입 후에 수행되고;
상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 상기 내인성 TRAC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고, 이로써 변형된 TRAC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포가 생산되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서,
상기 방법은 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시키는 것을 포함하고, 상기 T 세포는 상기 T 세포의 내인성 TRAC 유전자 좌 내에 유전자 파괴를 가지며, 여기에서 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 상기 내인성 TRAC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고, 이로써 변형된 TRAC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포가 생산되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서,
상기 방법은:
(a) T 세포의 내인성 TRAC 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 상기 T 세포로 도입시키는 단계; 및
(b) T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 상기 T 세포로 도입시키는 단계 - 여기에서 상기 일부는 천연 TCRα 사슬 전장보다 더 짧고; 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 내인성 TRAC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고; 이로써 변형된 TRAC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포가 생산됨 - ;
를 포함하고,
여기에서 상기 전이 유전자의 표적화된 통합 시:
상기 Cα의 일부는 상기 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, 상기 Cα의 추가 부분은 상기 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 상기 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 더 짧고;
(a)의 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역과 비교하여, 하나 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 상기 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키고/거나 여기에서 상기 재조합 TCR의 Cα 및/또는 Cβ는 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 변형된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자 좌를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서,
상기 방법은 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시키는 것을 포함하고, 상기 T 세포는 상기 T 세포의 내인성 TRAC 유전자 좌 내에 유전자 파괴를 가지고; 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 상기 내인성 TRAC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고; 이로써 변형된 TRAC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포가 생산되며,
여기에서 상기 전이 유전자의 표적화된 통합 시:
상기 Cα의 일부는 상기 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, 상기 Cα의 추가 부분은 상기 전이 유전자 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 상기 Cα의 상기 추가 부분은 천연 Cα의 전장보다 더 짧고;
(a)의 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 Cα의 추가 부분 및/또는 Cβ 영역은 천연 Cα 영역 및/또는 천연 Cβ 영역Cβ 영역하여 하나 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 상기 알파 사슬 및 베타 사슬 사이에 하나 이상의 비천연 이황화물 가교를 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키고/거나 여기에서 상기 재조합 TCR의 Cα 및/또는 Cβ는 하나 이상의 비천연 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항, 제 143 항 및 제 145 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유전자 파괴는 상기 내인성 TRAC 유전자 좌 내 하나 이상의 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에 의해 유도되었음을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항 내지 제 146 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 제 69 항 내지 제 94 항 또는 제 117 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항 내지 제 147 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변형된 TRAC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 여기에서 상기 핵산 서열은 (i) 전이 유전자 서열 및 (ii) 상기 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 인프레임 융합을 포함하고, 선택적으로 여기에서 상기 전이 유전자 서열은 상기 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항 내지 제 148 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 T 세포는 TRBC 유전자 좌에서 유전자 파괴의 유도를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 변형된 TRBC 유전자 좌를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서,
상기 방법은 제 95 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 TRBC 유전자 좌의 유전자 파괴를 포함하는 T 세포로 도입시키는 것을 포함하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서,
상기 방법은
(a) T 세포의 내인성 TRBC 유전자 좌 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 상기 T 세포로 도입시키는 단계; 및
(b) T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬 및 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 상기 T 세포로 도입시키는 단계 - 여기에서 상기 일부는 천연 TCRβ 사슬 전장보다 더 짧고, 여기에서 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 내인성 TRBC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고, 이로써 변형된 TRBC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포가 생산됨 - ;
를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 변형된 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 유전자 좌를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포 생산 방법으로서,
상기 방법은
T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬 및 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포로 도입시키는 것을 포함하고,
상기 T 세포는 상기 T 세포의 내인성 TRBC 유전자 좌 내에 유전자 파괴를 가지며, 여기에서 상기 전이 유전자는 상동성 지시 수선(HDR)을 통해 상기 내인성 TRBC 유전자 좌 내에서 통합을 위해 표적화되고, 이로써 변형된 TRBC 유전자 좌를 포함하는 유전자 조작된 세포가 생산되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 150 항 및 제 152 항에 있어서,
상기 유전자 파괴는 상기 내인성 TRBC 유전자 좌 내 하나 이상의 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에 의해 유도되었음을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 150 항 내지 제 153 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TRBC 유전자 좌는 TRBC1 유전자 좌 및/또는 TRBC2 유전자 좌인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 151 항 내지 제 154 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 제 95 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 151 항 내지 제 155 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변형된 TRBC 유전자 좌는 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 여기에서 상기 핵산 서열은 (i) 전이 유전자 서열 및 (ii) 상기 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 또는 이의 부분 서열의 인프레임 융합을 포함하고, 선택적으로 여기에서 상기 전이 유전자 서열은 상기 내인성 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 엑손 또는 이의 부분 서열과 인프레임인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 151 항 내지 제 156 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 T 세포는 TRAC 유전자 좌에서 유전자 파괴의 유도를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 142 항 및 제 144 항 내지 제 157 항 중 어느 한 항에 있어서,
유전자 파괴를 유도할 수 있는 상기 하나 이상의 제제(들)는 상기 표적 부위에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 142 항 및 제 144 항 내지 제 158 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 제제(들)는 상기 표적 부위에 특이적인 아연 핑거 단백질(zinc finger protein, ZFP), TAL 단백질 또는 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬 핵산(clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid, CRISPR)-결합 뉴클레아제(Cas)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 142 항 및 제 144 항 내지 제 159 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 제제는 CRISPR-Cas9 조합물 및 하나 이상의 상기 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 상기 CRISPR-Cas9 조합 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 160 항에 있어서,
상기 하나 이상의 제제는 상기 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보뉴클레오단백질(ribonucleoprotein, RNP) 복합체로서 도입되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 161 항에 있어서,
상기 RNP의 농도는 (약) 1 μM 내지 (약) 5 μM이고, 선택적으로 여기에서 상기 RNP의 농도는 (약) 2 μM인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 161 항 또는 제 162 항에 있어서,
상기 RNP는 전기 천공을 통해 도입되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 160 항 내지 제 163 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 gRNA는 UCUCUCAGCUGGUACACGGC(서열 번호:28), UGGAUUUAGAGUCUCUCAGC(서열 번호:29), ACACGGCAGGGUCAGGGUUC(서열 번호:30), GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU(서열 번호:31), GCUGGUACACGGCAGGGUCA(서열 번호:32), CUCAGCUGGUACACGGC(서열 번호:33), UGGUACACGGCAGGGUC(서열 번호:34), GCUAGACAUGAGGUCUA(서열 번호:35), GUCAGAUUUGUUGCUCC(서열 번호:36), UCAGCUGGUACACGGCA(서열 번호:37), GCAGACAGACUUGUCAC(서열 번호:38), GGUACACGGCAGGGUCA(서열 번호:39), CUUCAAGAGCAACAGUGCUG(서열 번호:40), AGAGCAACAGUGCUGUGGCC(서열 번호:41), AAAGUCAGAUUUGUUGCUCC(서열 번호:42), ACAAAACUGUGCUAGACAUG(서열 번호:43), AAACUGUGCUAGACAUG(서열 번호:44), UGUGCUAGACAUGAGGUCUA(서열 번호:45), GGCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC(서열 번호:46), GCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC(서열 번호:47), GGGGAAGAAGGUGUCUUC(서열 번호:48), GUUUUGUCUGUGAUAUACACAU(서열 번호:49), GGCAGACAGACUUGUCACUGGAUU(서열 번호:50), GCAGACAGACUUGUCACUGGAUU(서열 번호:51), GACAGACUUGUCACUGGAUU(서열 번호:52), GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(서열 번호:53), GAAUAGGCAGACAGACUUGUCA(서열 번호:54), GAGUCUCUCAGCUGGUACACGG(서열 번호:55), GUCUCUCAGCUGGUACACGG(서열 번호:56), GGUACACGGCAGGGUCAGGGUU(서열 번호:57) 및 GUACACGGCAGGGUCAGGGUU(서열 번호:58)로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하고, TRAC 유전자 좌에 있는 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 164 항에 있어서,
상기 gRNA는 GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU(서열 번호:31)의 서열을 포함하는 표적화 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 160 항 내지 제 163 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 gRNA는 CACCCAGAUCGUCAGCGCCG(서열 번호:59), CAAACACAGCGACCUCGGGU(서열 번호:60), UGACGAGUGGACCCAGGAUA(서열 번호:61), GGCUCUCGGAGAAUGACGAG(서열 번호:62), GGCCUCGGCGCUGACGAUCU(서열 번호:63), GAAAAACGUGUUCCCACCCG(서열 번호:64), AUGACGAGUGGACCCAGGAU(서열 번호:65), AGUCCAGUUCUACGGGCUCU(서열 번호:66), CGCUGUCAAGUCCAGUUCUA(서열 번호:67), AUCGUCAGCGCCGAGGCCUG(서열 번호:68), UCAAACACAGCGACCUCGGG(서열 번호:69), CGUAGAACUGGACUUGACAG(서열 번호:70), AGGCCUCGGCGCUGACGAUC(서열 번호:71), UGACAGCGGAAGUGGUUGCG(서열 번호:72), UUGACAGCGGAAGUGGUUGC(서열 번호:73), UCUCCGAGAGCCCGUAGAAC(서열 번호:74), CGGGUGGGAACACGUUUUUC(서열 번호:75), GACAGGUUUGGCCCUAUCCU(서열 번호:76), GAUCGUCAGCGCCGAGGCCU(서열 번호:77), GGCUCAAACACAGCGACCUC(서열 번호:78), UGAGGGUCUCGGCCACCUUC(서열 번호:79), AGGCUUCUACCCCGACCACG(서열 번호:80), CCGACCACGUGGAGCUGAGC(서열 번호:81), UGACAGGUUUGGCCCUAUCC(서열 번호:82), CUUGACAGCGGAAGUGGUUG(서열 번호:83), AGAUCGUCAGCGCCGAGGCC(서열 번호:84), GCGCUGACGAUCUGGGUGAC(서열 번호:85), UGAGGGCGGGCUGCUCCUUG(서열 번호:86), GUUGCGGGGGUUCUGCCAGA(서열 번호:87), AGCUCAGCUCCACGUGGUCG(서열 번호:88), GCGGCUGCUCAGGCAGUAUC(서열 번호:89), GCGGGGGUUCUGCCAGAAGG(서열 번호:90), UGGCUCAAACACAGCGACCU(서열 번호:91), ACUGGACUUGACAGCGGAAG(서열 번호:92), GACAGCGGAAGUGGUUGCGG(서열 번호:93), GCUGUCAAGUCCAGUUCUAC(서열 번호:94), GUAUCUGGAGUCAUUGAGGG(서열 번호:95), CUCGGCGCUGACGAUCU(서열 번호:96), CCUCGGCGCUGACGAUC(서열 번호:97), CCGAGAGCCCGUAGAAC(서열 번호:98), CCAGAUCGUCAGCGCCG(서열 번호:99), GAAUGACGAGUGGACCC(서열 번호:100), GGGUGACAGGUUUGGCCCUAUC(서열 번호:101), GGUGACAGGUUUGGCCCUAUC(서열 번호:102), GUGACAGGUUUGGCCCUAUC(서열 번호:103), GACAGGUUUGGCCCUAUC(서열 번호:104), GAUACUGCCUGAGCAGCCGCCU(서열 번호:105), GACCACGUGGAGCUGAGCUGGUGG(서열 번호:106), GUGGAGCUGAGCUGGUGG(서열 번호:107), GGGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열 번호:108), GGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열 번호:109), GCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열 번호:110), GGGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열 번호:111), GGCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열 번호:112), GCUGCUCCUUGAGGGGCU(서열 번호:113), GGUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG(서열 번호:114), GUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG(서열 번호:115) 및 GAAUGGGAAGGAGGUGCACAG(서열 번호:116)으로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하고, TRBC1 및 TRBC2 유전자 중 하나 또는 둘 다에 있는 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 166 항에 있어서,
상기 gRNA는 GGCCUCGGCGCUGACGAUCU(서열 번호:63)의 서열을 포함하는 표적화 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항 내지 제 167 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 대상체 유래 1차 T 세포인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 168 항에 있어서,
상기 대상체는 질병, 장애 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 짐작되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 168 항에 있어서,
상기 대상체는 건강하거나 건강한 것으로 짐작되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항 내지 제 170 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 CD8+ T 세포 또는 이의 하위 유형인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항 내지 제 170 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 CD4+ T 세포 또는 이의 하위 유형인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항 내지 제 167 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는, 선택적으로 iPSC인 다능성 또는 만능 세포에서 유래되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 168 항 내지 제 173 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 대상체 자기 유래인 T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 168 항 내지 제 173 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 대상체에 대해 동종 이계인 T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항 내지 제 175 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 176 항에 있어서,
상기 벡터는 AAV 벡터이고, 선택적으로 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 177 항에 있어서,
상기 AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV6 벡터인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항 내지 제 178 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 TCR은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 항원과 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 144 항 내지 제 179 항 중 어느 한 항에 있어서,
유전자 파괴를 유도할 수 있는 상기 하나 이상의 제제의 도입 및 상기 주형 폴리뉴클레오티드의 도입은 동시에 또는 순차적으로, 임의의 순서로 수행되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 144 항 내지 제 180 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 주형 폴리뉴클레오티드의 도입은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 상기 하나 이상의 제제의 도입 후에 수행되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 181 항에 있어서,
상기 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 상기 하나 이상의 제제의 도입 후 (약) 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 6 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 60 분, 90 분, 2 시간, 3 시간 또는 4 시간 직후 또는 이내에, 선택적으로 상기 하나 이상의 제제 도입 후 (약) 2 시간에 도입되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항 내지 제 182 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 복수의 T 세포에서 수행되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 183 항에 있어서,
상기 복수의 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 183 항 또는 제 184 항에 있어서,
상기 복수의 T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1, 선택적으로 (약) 1:2 내지 (약) 2:1, 선택적으로 (약) 1:1인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 142 항 및 제 144 항 내지 제 185 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 제제 도입 전에, 상기 방법은 상기 하나 이상의 T 세포를 자극 또는 활성화하기 위한 조건 하에서 자극제(들)와 상기 세포를 시험관 내에서 인큐베이션하는 것을 포함하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 186 항에 있어서,
상기 자극제(들)는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체, 선택적으로 항-CD3/항-CD28 비드를 포함하고, 선택적으로 여기에서 상기 비드 대 세포의 비율은 (약) 1:1인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 186 항 또는 제 187 항에 있어서,
상기 하나 이상의 제제를 도입하기 전에 상기 하나 이상의 면역 세포에서 상기 자극제(들)를 제거하는 것을 포함하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 142 항 및 제 144 항 내지 제 185 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 상기 하나 이상의 제제의 도입 및/또는 상기 주형 폴리뉴클레오티드의 도입 전, 중 또는 후에 상기 세포를 하나 이상의 재조합 사이토카인과 인큐베이션하는 것을 더 포함하고, 선택적으로 여기에서 상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-7 및 IL-15로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 189 항에 있어서,
상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 (약) 10 U/mL 내지 (약) 200 U/mL, 선택적으로 (약) 50 IU/mL 내지 (약) 100 U/mL의 농도에서 선택된 IL-2; 0.5 ng/mL 내지 50 ng/mL, 선택적으로 (약) 5 ng/mL 내지 (약) 10 ng/mL의 농도에서 선택된 IL-7; 및/또는 0.1 ng/mL 내지 20 ng/mL, 선택적으로 (약) 0.5 ng/mL 내지 (약) 5 ng/mL의 농도에서 선택된 IL-15;의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 189 항 또는 제 190 항에 있어서,
상기 인큐베이션은 상기 하나 이상의 제제의 도입 및 상기 주형 폴리뉴클레오티드의 도입 후에 최대 또는 약 24 시간, 36 시간, 48 시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 일, 선택적으로 최대 또는 약 7 일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항 내지 제 191 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 (약) 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 7500, 8000, 9000 또는 10000 개 이상의 뉴클레오티드 길이이거나 또는 상기 중 임의의 사이의 임의의 수치인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항 내지 제 192 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 (약) 2500 내지 (약) 5000 개의 뉴클레오티드, (약) 3500 내지 (약) 4500 개의 뉴클레오티드 또는 (약) 3750 개의 뉴클레오티드 내지 (약) 4250 개의 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는,
유전자 조작된 T 세포 생산 방법. - 제 141 항 내지 제 193 항 중 어느 하나의 방법을 사용하여 생성된 조작된 T 세포 또는 복수의 조작된 T 세포.
- 제 194 항의 조작된 T 세포 또는 복수의 조작된 세포를 포함하는, 조성물.
- 제 195 항에 있어서,
CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는,
조성물. - 제 195 항 또는 제 196 항에 있어서,
상기 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:3 내지 3:1, 선택적으로 1:1인 것을 특징으로 하는,
조성물. - 제 195 항 내지 제 197 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물 중 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상기 조작된 세포가, 내인성 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변 영역(TRBC) 유전자의 유전자 파괴 또는 상기 유전자 내에서 유전자 파괴를 포함하고/거나;
상기 조성물 중 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상기 조작된 세포가, 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자의 유전자 생성물을 발현하지 않거나 검출 가능한 수준으로 발현하지 않는 것을 특징으로 하는,
조성물. - 제 195 항 내지 제 198 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물 중 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 90% 이상 또는 초과의 세포가 상기 재조합 TCR을 발현하고/거나 상기 항원에 대한 결합을 나타내는 것을 특징으로 하는,
조성물. - 대상체에 제 194 항 내지 제 199 항 중 어느 한 항의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한, 치료 방법.
- 질병 또는 장애를 치료하기 위한 제 194 항 내지 제 199 항 중 어느 한 항의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물의 용도.
- 질병 또는 장애를 치료하기 위한 의약품 제조에 있어서 제 194 항 내지 제 199 항 중 어느 한 항의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물의 용도.
- 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 제 194 항 내지 제 199 항 중 어느 한 항의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
- 제조 물품으로서,
제 69 항 내지 제 94 항 또는 제 117 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드; 및
TRAC 유전자 좌 내 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들);
를 포함하는 것을 특징으로 하는,
제조 물품. - 제조 물품으로서,
(a) T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬 및 T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 여기에서 상기 일부는 천연 TCRα 사슬 전장보다 더 짧음 - ; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암(들) - 여기에서 상기 하나 이상의 상동성 암(들)은 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하고, 상기 오픈 리딩 프레임은 TCRα 사슬을 암호화함 - 을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
TRAC 유전자 좌 내 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들);
를 포함하는 것을 특징으로 하는,
제조 물품. - 제 205 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 제 69 항 내지 제 94 항 또는 제 117 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는,
제조 물품. - 제조 물품으로서,
제 95 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드; 및
TRBC 유전자 좌 내 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들);
를 포함하는 것을 특징으로 하는,
제조 물품. - 제조 물품으로서,
(a) T 세포 수용체 알파(TCRα) 사슬 및 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 사슬의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 여기에서 상기 일부는 천연 TCRβ 사슬 전장보다 더 짧음 - ; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암(들) - 여기에서 상기 하나 이상의 상동성 암(들)은 TRBC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 하나 이상의 영역(들)에 대해 상동성인 서열을 포함하고, 상기 오픈 리딩 프레임은 TCRβ 사슬을 암호화함 - 을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
TRAC 유전자 좌 내 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들);
를 포함하는 것을 특징으로 하는,
제조 물품. - 제 207 항 또는 제 208 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 제 95 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는,
제조 물품. - 제 204 항 내지 제 209 항 중 어느 한 항의 제조 물품 및 사용 지침을 포함하는, 키트.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862653553P | 2018-04-05 | 2018-04-05 | |
| US62/653,553 | 2018-04-05 | ||
| PCT/US2019/025681 WO2019195491A1 (en) | 2018-04-05 | 2019-04-03 | T cells expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210020873A true KR20210020873A (ko) | 2021-02-24 |
Family
ID=66290545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020207031922A KR20210020873A (ko) | 2018-04-05 | 2019-04-03 | 재조합 수용체를 발현하는 τ 세포, 관련 폴리뉴클레오티드 및 방법 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210015869A1 (ko) |
| EP (1) | EP3775237A1 (ko) |
| JP (1) | JP2021520211A (ko) |
| KR (1) | KR20210020873A (ko) |
| CN (1) | CN112585277A (ko) |
| AU (1) | AU2019247199A1 (ko) |
| BR (1) | BR112020020073A2 (ko) |
| CA (1) | CA3095084A1 (ko) |
| IL (1) | IL277704A (ko) |
| MA (1) | MA52207A (ko) |
| MX (1) | MX2020010461A (ko) |
| RU (1) | RU2020136054A (ko) |
| SG (1) | SG11202009446TA (ko) |
| WO (1) | WO2019195491A1 (ko) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019070541A1 (en) | 2017-10-03 | 2019-04-11 | Juno Therapeutics, Inc. | HPV-SPECIFIC BINDING MOLECULES |
| US11471489B2 (en) | 2018-04-05 | 2022-10-18 | Juno Therapeutics, Inc. | T cell receptors and engineered cells expressing same |
| GB202005184D0 (en) * | 2020-04-08 | 2020-05-20 | Autolus Ltd | Method |
| WO2022094348A1 (en) * | 2020-10-29 | 2022-05-05 | Arsenal Biosciences, Inc. | Compositions and methods of genomic modification of cells and uses thereof |
| EP4294458A1 (en) * | 2021-02-17 | 2023-12-27 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Probiotic-guided car-t cells for tumor targeting |
| KR20240004566A (ko) * | 2021-04-30 | 2024-01-11 | 로직바이오 테라퓨틱스, 인크. | 바이러스 벡터 조성물 및 이의 사용 방법 |
| WO2022234519A1 (en) * | 2021-05-05 | 2022-11-10 | Crispr Therapeutics Ag | Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences |
| WO2023070126A1 (en) * | 2021-10-22 | 2023-04-27 | Regents Of The University Of Minnesota | Genetically engineered t cell receptors |
| WO2023081900A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Juno Therapeutics, Inc. | Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods |
| WO2023193800A1 (zh) * | 2022-04-07 | 2023-10-12 | 恺兴生命科技(上海)有限公司 | 嵌合多肽及其应用 |
| WO2023238125A1 (en) * | 2022-06-08 | 2023-12-14 | Sheba Impact Ltd. | Virus-specific recombinant t cell receptors and t cells comprising them |
Family Cites Families (107)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4452773A (en) | 1982-04-05 | 1984-06-05 | Canadian Patents And Development Limited | Magnetic iron-dextran microspheres |
| US4690915A (en) | 1985-08-08 | 1987-09-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans |
| US4795698A (en) | 1985-10-04 | 1989-01-03 | Immunicon Corporation | Magnetic-polymer particles |
| IN165717B (ko) | 1986-08-07 | 1989-12-23 | Battelle Memorial Institute | |
| US5219740A (en) | 1987-02-13 | 1993-06-15 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy |
| US5033252A (en) | 1987-12-23 | 1991-07-23 | Entravision, Inc. | Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product |
| US5052558A (en) | 1987-12-23 | 1991-10-01 | Entravision, Inc. | Packaged pharmaceutical product |
| ES2067018T3 (es) | 1988-12-28 | 1995-03-16 | Stefan Miltenyi | Procedimiento y materiales para la separacion en alto gradiente magnetico de materiales biologicos. |
| US5200084A (en) | 1990-09-26 | 1993-04-06 | Immunicon Corporation | Apparatus and methods for magnetic separation |
| DE4123760C2 (de) | 1991-07-18 | 2000-01-20 | Dade Behring Marburg Gmbh | Seroreaktive Bereiche auf den HPV 16 Proteinen E1 und E2 |
| US5487994A (en) | 1992-04-03 | 1996-01-30 | The Johns Hopkins University | Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease |
| US5356802A (en) | 1992-04-03 | 1994-10-18 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease |
| US5436150A (en) | 1992-04-03 | 1995-07-25 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease |
| US5323907A (en) | 1992-06-23 | 1994-06-28 | Multi-Comp, Inc. | Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications |
| DE4228458A1 (de) | 1992-08-27 | 1994-06-01 | Beiersdorf Ag | Multicistronische Expressionseinheiten und deren Verwendung |
| CA2681922C (en) | 1994-01-18 | 2012-05-15 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
| US6140466A (en) | 1994-01-18 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
| GB9824544D0 (en) | 1998-11-09 | 1999-01-06 | Medical Res Council | Screening system |
| JP4118327B2 (ja) | 1994-08-20 | 2008-07-16 | ゲンダック・リミテッド | Ｄｎａ認識のための結合タンパク質におけるまたはそれに関連する改良 |
| US5827642A (en) | 1994-08-31 | 1998-10-27 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes |
| WO1996013593A2 (en) | 1994-10-26 | 1996-05-09 | Procept, Inc. | Soluble single chain t cell receptors |
| US5789538A (en) | 1995-02-03 | 1998-08-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities |
| US5840306A (en) | 1995-03-22 | 1998-11-24 | Merck & Co., Inc. | DNA encoding human papillomavirus type 18 |
| DE19608753C1 (de) | 1996-03-06 | 1997-06-26 | Medigene Gmbh | Transduktionssystem und seine Verwendung |
| US5925523A (en) | 1996-08-23 | 1999-07-20 | President & Fellows Of Harvard College | Intraction trap assay, reagents and uses thereof |
| GB9710807D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
| GB9710809D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
| JP2001519143A (ja) | 1997-10-02 | 2001-10-23 | スノル・モレキュラー・コーポレーション | 可溶性の一本鎖ｔ細胞レセプタータンパク質 |
| NZ507887A (en) | 1998-05-19 | 2002-12-20 | Avidex Ltd | Soluble T cell receptor |
| US6140081A (en) | 1998-10-16 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger binding domains for GNN |
| US6534261B1 (en) | 1999-01-12 | 2003-03-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
| US6453242B1 (en) | 1999-01-12 | 2002-09-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites |
| US6599692B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Sangamo Bioscience, Inc. | Functional genomics using zinc finger proteins |
| US6503717B2 (en) | 1999-12-06 | 2003-01-07 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function |
| US6689558B2 (en) | 2000-02-08 | 2004-02-10 | Sangamo Biosciences, Inc. | Cells for drug discovery |
| US20020061512A1 (en) | 2000-02-18 | 2002-05-23 | Kim Jin-Soo | Zinc finger domains and methods of identifying same |
| US20030044787A1 (en) | 2000-05-16 | 2003-03-06 | Joung J. Keith | Methods and compositions for interaction trap assays |
| JP2002060786A (ja) | 2000-08-23 | 2002-02-26 | Kao Corp | 硬質表面用殺菌防汚剤 |
| US7067317B2 (en) | 2000-12-07 | 2006-06-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
| GB0108491D0 (en) | 2001-04-04 | 2001-05-23 | Gendaq Ltd | Engineering zinc fingers |
| US20040224385A1 (en) | 2001-08-20 | 2004-11-11 | Barbas Carlos F | Zinc finger binding domains for cnn |
| ATE290020T1 (de) | 2001-08-31 | 2005-03-15 | Avidex Ltd | Löslicher t zell rezeptor |
| US7939059B2 (en) | 2001-12-10 | 2011-05-10 | California Institute Of Technology | Method for the generation of antigen-specific lymphocytes |
| US7262054B2 (en) | 2002-01-22 | 2007-08-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants |
| BRPI0307383B1 (pt) | 2002-01-23 | 2019-12-31 | The Univ Of Utah Research Foundation | método de recombinação genética direcionada em célula de planta hospedeira |
| US20030170238A1 (en) | 2002-03-07 | 2003-09-11 | Gruenberg Micheal L. | Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy |
| WO2003080809A2 (en) | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
| US7446190B2 (en) | 2002-05-28 | 2008-11-04 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors |
| WO2004037977A2 (en) | 2002-09-05 | 2004-05-06 | California Institute Of Thechnology | Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting |
| US7569664B2 (en) | 2002-10-09 | 2009-08-04 | Immunocore Limited | Single chain recombinant T cell receptors |
| US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
| US7972854B2 (en) | 2004-02-05 | 2011-07-05 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| DK1791865T3 (da) | 2004-06-29 | 2010-11-01 | Immunocore Ltd | Celler der udtrykker en modificeret T-cellerecptor |
| US20080131962A1 (en) | 2006-05-25 | 2008-06-05 | Sangamo Biosciences, Inc. | Engineered cleavage half-domains |
| WO2006033859A2 (en) | 2004-09-16 | 2006-03-30 | Sangamo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for protein production |
| MX2007003910A (es) | 2004-10-01 | 2007-06-07 | Avidex Ltd | Receptores de celulas t que contienen un enlace entre cadenas bisulfuro no nativo ligado a agentes terapeuticos. |
| AU2007267874B2 (en) | 2006-05-25 | 2012-03-15 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for gene inactivation |
| US8361473B2 (en) | 2007-03-29 | 2013-01-29 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Antibodies and their uses for diagnosis and treatment of cytomegalovirus infection and associated diseases |
| ATE489465T1 (de) | 2007-04-26 | 2010-12-15 | Sangamo Biosciences Inc | Gezielte integration in die ppp1r12c-position |
| NO2227271T3 (ko) | 2007-12-07 | 2018-06-23 | ||
| WO2009131632A1 (en) | 2008-04-14 | 2009-10-29 | Sangamo Biosciences, Inc. | Linear donor constructs for targeted integration |
| US20120164718A1 (en) | 2008-05-06 | 2012-06-28 | Innovative Micro Technology | Removable/disposable apparatus for MEMS particle sorting device |
| CN102159722B (zh) | 2008-08-22 | 2014-09-03 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 用于靶向单链切割和靶向整合的方法和组合物 |
| ES2627552T3 (es) | 2008-12-04 | 2017-07-28 | Sigma Aldrich Company | Edición de genoma en ratas usando nucleasas con dedos de cinc |
| US8586526B2 (en) | 2010-05-17 | 2013-11-19 | Sangamo Biosciences, Inc. | DNA-binding proteins and uses thereof |
| CA2779526C (en) | 2009-11-03 | 2022-12-06 | City Of Hope | Truncated epiderimal growth factor receptor (egfrt) for transduced t cell selection |
| US8956828B2 (en) | 2009-11-10 | 2015-02-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases |
| SG177025A1 (en) | 2010-06-21 | 2012-01-30 | Agency Science Tech & Res | Hepatitis b virus specific antibody and uses thereof |
| WO2011100058A1 (en) | 2010-02-09 | 2011-08-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules |
| CA2796600C (en) | 2010-04-26 | 2019-08-13 | Sangamo Biosciences, Inc. | Genome editing of a rosa locus using zinc-finger nucleases |
| EP2596011B1 (en) | 2010-07-21 | 2018-10-03 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for modification of a hla locus |
| KR101982360B1 (ko) | 2011-04-05 | 2019-05-24 | 셀렉티스 | 콤팩트 tale-뉴클레아제의 발생 방법 및 이의 용도 |
| CA2848417C (en) | 2011-09-21 | 2023-05-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for regulation of transgene expression |
| AU2012328682B2 (en) | 2011-10-27 | 2017-09-21 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for modification of the HPRT locus |
| WO2013074999A1 (en) | 2011-11-16 | 2013-05-23 | Sangamo Biosciences, Inc. | Modified dna-binding proteins and uses thereof |
| AU2013259647B2 (en) | 2012-05-07 | 2018-11-08 | Corteva Agriscience Llc | Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes |
| WO2013176916A1 (en) | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Roman Galetto | Use of pre t alpha or functional variant thereof for expanding tcr alpha deficient t cells |
| RS61345B1 (sr) | 2012-08-20 | 2021-02-26 | Hutchinson Fred Cancer Res | Postupak i kompozicije za ćelijsku imunoterapiju |
| ES2743738T3 (es) | 2012-10-02 | 2020-02-20 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Composiciones y métodos para inmunoterapia |
| EP3763810A3 (en) | 2012-10-10 | 2021-07-14 | Sangamo Therapeutics, Inc. | T cell modifying compounds and uses thereof |
| WO2014089212A1 (en) | 2012-12-05 | 2014-06-12 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for regulation of metabolic disorders |
| JP5372297B1 (ja) | 2012-12-20 | 2013-12-18 | 三菱電機株式会社 | 車載装置及びプログラム |
| US9937207B2 (en) | 2013-03-21 | 2018-04-10 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted disruption of T cell receptor genes using talens |
| CN116083487A (zh) | 2013-05-15 | 2023-05-09 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | 用于治疗遗传病状的方法和组合物 |
| WO2014191128A1 (en) | 2013-05-29 | 2014-12-04 | Cellectis | Methods for engineering t cells for immunotherapy by using rna-guided cas nuclease system |
| EP4137564A1 (en) | 2013-07-15 | 2023-02-22 | The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Methods of preparing anti-human papillomavirus antigen t cells |
| US9822162B2 (en) | 2013-07-15 | 2017-11-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-human papillomavirus 16 E6 T cell receptors |
| US9108442B2 (en) | 2013-08-20 | 2015-08-18 | Ricoh Company, Ltd. | Image forming apparatus |
| US20150098954A1 (en) | 2013-10-08 | 2015-04-09 | Elwha Llc | Compositions and Methods Related to CRISPR Targeting |
| DK3105317T3 (en) * | 2014-02-14 | 2019-01-14 | Cellectis | Immunotherapy cells that are genetically engineered to target antigen on both immune cells and pathological cells |
| KR102228828B1 (ko) | 2014-03-11 | 2021-03-16 | 셀렉티스 | 동종이형 이식에 양립성인 t-세포들을 만들어내는 방법 |
| US20170175128A1 (en) | 2014-04-18 | 2017-06-22 | Editas Medicine, Inc. | Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy |
| RU2691102C2 (ru) | 2014-05-08 | 2019-06-11 | Сангамо Байосайенсиз, Инк. | Способы и композиции для лечения болезни хантингтона |
| MX2016015383A (es) | 2014-05-29 | 2017-02-28 | Us Health | Receptores de celulas t anti - papilomavirus 16 e7 humano. |
| WO2016014794A1 (en) | 2014-07-25 | 2016-01-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells |
| CA2956307A1 (en) | 2014-07-29 | 2016-02-04 | Pfizer Inc. | Egfrviii specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy |
| US9616090B2 (en) | 2014-07-30 | 2017-04-11 | Sangamo Biosciences, Inc. | Gene correction of SCID-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells |
| AU2015339744B2 (en) | 2014-10-31 | 2021-03-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Altering gene expression in CART cells and uses thereof |
| BR112017020750A2 (pt) * | 2015-03-27 | 2018-06-26 | Harvard College | células t modificadas e métodos de produção e utilização das mesmas |
| US9790490B2 (en) | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
| CA2991301A1 (en) | 2015-07-13 | 2017-01-19 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
| WO2017070429A1 (en) | 2015-10-22 | 2017-04-27 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods involving editing polynucleotides that encode t cell receptor |
| MX2018006767A (es) | 2015-12-04 | 2019-03-14 | Novartis Ag | Composiciones y metodos para oncologia inmunologica. |
| JP7128741B2 (ja) | 2015-12-18 | 2022-08-31 | サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド | Ｔ細胞受容体の標的化破壊 |
| GB201604953D0 (en) * | 2016-03-23 | 2016-05-04 | Immunocore Ltd | T cell receptors |
| AU2017261380A1 (en) | 2016-05-06 | 2018-11-22 | Editas Medicine, Inc. | Genetically engineered cells and methods of making the same |
-
2019
- 2019-04-03 SG SG11202009446TA patent/SG11202009446TA/en unknown
- 2019-04-03 JP JP2020554302A patent/JP2021520211A/ja active Pending
- 2019-04-03 WO PCT/US2019/025681 patent/WO2019195491A1/en active Application Filing
- 2019-04-03 CN CN201980036930.3A patent/CN112585277A/zh active Pending
- 2019-04-03 AU AU2019247199A patent/AU2019247199A1/en active Pending
- 2019-04-03 CA CA3095084A patent/CA3095084A1/en active Pending
- 2019-04-03 RU RU2020136054A patent/RU2020136054A/ru unknown
- 2019-04-03 MA MA052207A patent/MA52207A/fr unknown
- 2019-04-03 EP EP19720006.6A patent/EP3775237A1/en active Pending
- 2019-04-03 KR KR1020207031922A patent/KR20210020873A/ko active Search and Examination
- 2019-04-03 US US17/044,279 patent/US20210015869A1/en active Pending
- 2019-04-03 BR BR112020020073-5A patent/BR112020020073A2/pt unknown
- 2019-04-03 MX MX2020010461A patent/MX2020010461A/es unknown
-
2020
- 2020-09-30 IL IL277704A patent/IL277704A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2021520211A (ja) | 2021-08-19 |
| EP3775237A1 (en) | 2021-02-17 |
| IL277704A (en) | 2020-11-30 |
| CA3095084A1 (en) | 2019-10-10 |
| CN112585277A (zh) | 2021-03-30 |
| BR112020020073A2 (pt) | 2021-01-05 |
| WO2019195491A1 (en) | 2019-10-10 |
| RU2020136054A (ru) | 2022-05-06 |
| US20210015869A1 (en) | 2021-01-21 |
| AU2019247199A1 (en) | 2020-10-15 |
| SG11202009446TA (en) | 2020-10-29 |
| MA52207A (fr) | 2021-02-17 |
| MX2020010461A (es) | 2021-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11952408B2 (en) | HPV-specific binding molecules | |
| US20210017249A1 (en) | Methods of producing cells expressing a recombinant receptor and related compositions | |
| KR20210020873A (ko) | 재조합 수용체를 발현하는 τ 세포, 관련 폴리뉴클레오티드 및 방법 | |
| US20220184131A1 (en) | Cells expressing a recombinant receptor from a modified tgfbr2 locus, related polynucleotides and methods | |
| US20240216508A1 (en) | Engineered t cells conditionally expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods | |
| US20230398148A1 (en) | Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods | |
| JP2022531577A (ja) | 改変されたｃｄ２４７遺伝子座からキメラ受容体を発現する細胞、関連ポリヌクレオチド、および方法 | |
| RU2804664C2 (ru) | Hpv-специфические связывающие молекулы | |
| WO2023081900A1 (en) | Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination |