ES2900327T3

ES2900327T3 - Composiciones y métodos de células T con receptores de autoanticuerpos quiméricos

Info

Publication number: ES2900327T3
Application number: ES15786710T
Authority: ES
Inventors: Aimee S Payne; Christoph T Ellebrecht; Vijay Bhoj; Michael C Milone
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2014-05-02
Filing date: 2015-05-01
Publication date: 2022-03-16
Anticipated expiration: 2035-05-01
Also published as: WO2015168613A3; CA2984484C; EP3166968A4; US11407803B2; WO2015168613A2; EP4008725A1; CN107074929B; CN113604491A; US11578113B2; CN107074929A; US10301370B2; CA2984484A1; US20230303653A1; EP3166968B1; DK3166968T3; US20190315829A1; EP3166968A2; US20170051035A1; US11407802B2; US20190315830A1

Abstract

Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de autoanticuerpos quimérico (CAAR) que comprende: una secuencia de ácido nucleico de un dominio extracelular, una secuencia de ácido nucleico de un dominio transmembrana y una secuencia de ácido nucleico de un dominio de señalización intracelular, la secuencia de ácido nucleico del dominio extracelular que comprende una secuencia de ácido nucleico de un autoantígeno que comprende Dsg3 o un fragmento del mismo que es específico para un autoanticuerpo patógeno, y en donde la secuencia de ácido nucleico del dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un CD137 intracelular dominio y un dominio de señalización zeta de CD3.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos de células T con receptores de autoanticuerpos quiméricos

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la Solicitud Provisional de EE.UU. N.° 61/987.989, presentada el 2 de mayo de 2014.

DECLARACIÓN SOBRE LA INVESTIGACIÓN O EL DESARROLLO PATROCINADOS POR VÍA FEDERAL

La presente invención se hizo con apoyo gubernamental bajo AR057001, otorgada por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención

La autoinmunidad es la tercera categoría más común de enfermedad en los Estados Unidos, afectando al 8 % de la población. Hay dos categorías básicas de enfermedades autoinmunes: las causadas predominantemente por células T y las causados predominantemente por células B y los autoanticuerpos que producen. El pénfigo vulgar (PV) es una enfermedad modelo mediada por autoanticuerpos, en la que los autoanticuerpos contra la proteína de adhesión celular de la piel desmogleína 3 (Dsg3) provocan ampollas potencialmente mortales en la piel y las membranas mucosas.

Las terapias actuales se centran en la inmunosupresión general para reducir todos los anticuerpos, pero estas estrategias también se dirigen a los buenos anticuerpos que nos protegen de las infecciones. Dado que el pénfigo es una enfermedad crónica remitente-recidivante, tales tratamientos están asociados con múltiples efectos secundarios, incluido el riesgo de infección mortal y cánceres secundarios. Como ejemplo, rituximab, un reactivo de anticuerpo monoclonal anti-CD20, se ha documentado que tiene una excelente eficacia en el tratamiento del pénfigo vulgar, con el 95 % de los pacientes logrando la curación completa de las ampollas en 3 meses, y el 35 % de los pacientes logrando la remisión completa de todas las terapias sistémicas durante el seguimiento a largo plazo. Sin embargo, más del 80 % de los pacientes recaerán (presumiblemente debido a que la eficacia de la depleción de células B CD20+ por rituximab suele ser incompleta), y las infecciones graves no son infrecuentes, informó que ocurre en el 7 % de los pacientes con enfermedades autoinmunes tratados con rituximab, con infección letal en 1-2 %. Por lo tanto, los pacientes con enfermedades autoinmunes graves, como el pénfigo vulgar, pénfigo paraneoplásico o pénfigo foliáceo, ya no mueren de su enfermedad, pero en cambio están sufriendo complicaciones del tratamiento. El documento WO 02/16414 A2 desvela moléculas de toxina quimérica que contienen fragmentos de Dsg3 y una exotoxina de Pseudomonas modificada. PROBY C. M. et al.: "Desarrollo de moléculas quiméricas para el reconocimiento y el direccionamiento de células B específicas de antígeno en pénfigo vulgar" (12 de febrero de 2000) D7 describe receptores de antígenos quiméricos que comprenden un dominio extracelular con un sitio de unión de ligando (por ejemplo, un scFv) que se une a una diana ligando (por ejemplo, receptor de a-folato (FRa)). Sin embargo, actualmente, no existen estrategias terapéuticas para el tratamiento del PV que se dirijan únicamente a las células B autorreactivas. Corticosteroides sistémicos, azatioprina, micofenolato de mofetilo y la ciclofosfamida son eficaces en el tratamiento del PV, pero inhiben de forma no específica la proliferación de linfocitos. El rituximab se dirige al CD20 expresado en la mayoría de las células B, pero carece de especificidad solo para las células B autorreactivas.

Como resultado, las estrategias terapéuticas pueden presentar efectos secundarios graves relacionados con la inmunosupresión general, incluyendo infecciones y cánceres secundarios letales. Por lo tanto, existe la necesidad de una terapia que se dirija solo a las células B autorreactivas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona las siguientes realizaciones definidas en los puntos 1-14:

1. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de autoanticuerpos quimérico (CAAR) que comprende: una secuencia de ácido nucleico de un dominio extracelular, una secuencia de ácido nucleico de un dominio transmembrana y una secuencia de ácido nucleico de un dominio de señalización intracelular, la secuencia de ácido nucleico del dominio extracelular que comprende una secuencia de ácido nucleico de un autoantígeno que comprende Dsg3 o un fragmento del mismo que es específico para un autoanticuerpo patógeno, y en donde la secuencia de ácido nucleico del dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un CD137 intracelular dominio y un dominio de señalización zeta de CD3.

2. Un receptor de autoanticuerpos quimérico aislado (CAAR) que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, comprendiendo el dominio extracelular un autoantígeno que comprende Dsg3 o un fragmento del mismo que es específico para un autoanticuerpo patógeno, y en el que el dominio de señalización intracelular comprende un dominio intracelular de CD137 y un dominio de señalización zeta de CD3.

3. La secuencia de ácido nucleico aislada del elemento 1 o el CAAR aislado del elemento 2, en donde el autoantígeno comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

4. La secuencia de ácido nucleico aislada del elemento 1 o el CAAR aislado del elemento 2, en donde la secuencia de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un propéptido de Dsg3 o el CAAR aislado comprende además un propéptido de Dsg3, en donde el propéptido de Dsg3 preferentemente comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

5. La secuencia de ácido nucleico aislada del punto 1, que comprende además una secuencia de ácido nucleico de un péptido señal de la cadena alfa de CD8, o el CAAR aislado del punto 2, que comprende además un péptido señal de la cadena alfa de CD8, en donde el péptido señal de la cadena alfa de CD8 comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

6. La secuencia de ácido nucleico aislada del punto 1, en donde la secuencia de ácido nucleico del dominio transmembrana codifica una bisagra de cadena alfa de CD8 y un dominio transmembrana o el CAAR aislado del punto 2, en donde el dominio transmembrana comprende una bisagra de cadena alfa de CD8 y un dominio transmembrana, en donde la bisagra de la cadena alfa de CD8 y el dominio transmembrana preferentemente comprenden una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.

7. La secuencia de ácido nucleico aislada del punto 1 que comprende además una secuencia de ácido nucleico de un enlazador peptídico o el CAAR aislado del punto 2 que además comprende un enlazador peptídico, en donde el enlazador peptídico comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.

8. La secuencia de ácido nucleico aislada del punto 1, o el CAAR aislado del punto 2, en donde el dominio bisagra CD137 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

9. La secuencia de ácido nucleico aislada del punto 1, o el CAAR aislado del punto 2, en donde el dominio de señalización de zeta de CD3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16.

10. Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico aislada de cualquiera de los puntos 1 o 3-9, en donde el vector es preferentemente un vector lentivírico o un vector de ARN.

11. Una célula genéticamente modificada que comprende el CAAR aislado de cualquiera de los puntos 2-9. 12. La célula del punto 11, en donde la célula expresa el CAAR aislado y tiene al menos una característica seleccionada del grupo que consiste en:

(i) alta afinidad por los autoanticuerpos expresados en células B;

(ii) induce la muerte de las células B que expresan autoanticuerpos;

(iii) tiene baja afinidad por los anticuerpos unidos a un receptor Fc; y

(iv) tiene una toxicidad limitada para las células sanas,

y en donde la célula se selecciona preferentemente del grupo que consiste en una célula T colaboradora, una célula T citotóxica, una célula T de memoria, una célula T reguladora, una célula T gamma delta, un linfocito citolítico natural, un linfocito citolítico inducido por citocinas, una línea celular de la misma y otra célula efectora.

13. Una célula T genéticamente modificada para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un sujeto, la célula T genéticamente modificada que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de autoanticuerpo quimérico (CAAR) que comprende una secuencia de ácido nucleico de un dominio extracelular, una secuencia de ácido nucleico de un dominio transmembrana y una secuencia de ácido nucleico de un dominio de señalización intracelular; donde la secuencia de ácido nucleico del dominio extracelular comprende una secuencia de ácido nucleico de un autoantígeno que comprende Dsg3 o un fragmento del mismo que es específico para un autoanticuerpo patógeno, y donde la secuencia de ácido nucleico del dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio intracelular CD137 y un dominio de señalización zeta de CD3; en donde la enfermedad autoinmune se selecciona preferentemente del grupo que consiste en pénfigo vulgar, pénfigo paraneoplásico y pénfigo foliáceo; y en donde el sujeto es preferentemente un ser humano.

14. La célula T genéticamente modificada para su uso de acuerdo con el punto 13, en donde la célula T modificada se dirige a una célula B.

Como se describe a continuación, la presente divulgación incluye composiciones y métodos para su uso, de un receptor de autoanticuerpos quimérico (CAAR) específico para un autoanticuerpo.

Un aspecto de la divulgación incluye una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de autoanticuerpos quimérico (CAAR), en donde la secuencia de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de ácido nucleico de un autoantígeno o fragmento del mismo, una secuencia de ácido nucleico de un dominio transmembrana, una secuencia de ácido nucleico de un dominio intracelular de una molécula coestimuladora y una secuencia de ácido nucleico de un dominio de señalización.

En otro aspecto, la divulgación incluye un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico aislada descrita en el presente documento.

En otro aspecto adicional, la divulgación incluye un receptor de autoanticuerpos quimérico aislado (CAAR) que comprende un dominio extracelular que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular.

En otro aspecto más, la divulgación incluye una célula modificada genéticamente que comprende el CAAR descrito en el presente documento.

En varias realizaciones de los aspectos anteriores o cualquier otro aspecto de la divulgación delineada en el presente documento, el autoantígeno se selecciona del grupo que consiste en Dsg1, Dsg3 y un fragmento del mismo. En una realización, el autoantígeno comprende Dsg3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 36.

En otra realización, el autoantígeno comprende Dsg3 y la secuencia de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un propéptido de Dsg3. En algunas realizaciones que incluyen el propéptido Dsg3, comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2.

En otra realización, la secuencia de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia de ácido nucleico de un péptido señal de la cadena alfa de CD8. En algunas realizaciones que incluyen el péptido señal de la cadena alfa de ^cD8, comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1.

En otra realización más, la secuencia de ácido nucleico del dominio transmembrana codifica una bisagra de cadena alfa de CD8 y un dominio transmembrana. En algunas realizaciones que incluyen la bisagra de la cadena alfa de CD8 y el dominio transmembrana, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.

En aún otra realización, la secuencia de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia de ácido nucleico de un enlazador peptídico. En algunas realizaciones que incluyen el péptido enlazador, comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.

En otra realización, la secuencia de ácido nucleico del dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio intracelular de CD137. En algunas realizaciones que incluyen el dominio intracelular de CD137, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15.

En otra realización más, la secuencia de ácido nucleico del dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización zeta de CD3. En algunas realizaciones que incluyen el dominio de señalización zeta de CD3, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16.

En una realización, la célula que comprende el CAAR, lo expresa y tiene una alta afinidad por los autoanticuerpos expresados en las células B. En otra realización, la célula expresa el CAAR e induce la muerte de las células B que expresan autoanticuerpos. En aún otra realización, la célula expresa el CAAR y tiene baja afinidad por los anticuerpos unidos a un receptor Fc. En otra realización más, la célula expresa el CAAR y tiene una toxicidad limitada hacia las células sanas. En otra realización, la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula T colaboradora, una célula T citotóxica, una célula T de memoria, una célula T reguladora, una célula T gamma delta, un linfocito citolítico natural (NK), un linfocito citolítico inducido por citocinas, una línea celular de la misma y otra célula efectora.

En otro aspecto, la divulgación incluye una cantidad eficaz de una célula T genéticamente modificada que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de autoanticuerpos quimérico (CAAR) para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un sujeto, en donde la secuencia de ácido nucleico aislada comprende un dominio extracelular que comprende un autoantígeno o fragmento del mismo, una secuencia de ácido nucleico de un dominio transmembrana y una secuencia de ácido nucleico de un dominio de señalización intracelular, tratando así la enfermedad autoinmune en el sujeto. La enfermedad autoinmune incluye pénfigo vulgar, pénfigo paraneoplásico y pénfigo foliáceo.

En varias realizaciones de los aspectos anteriores o cualquier otro aspecto de la divulgación delineada en el presente documento, el sujeto es un ser humano. En otra realización, la célula T modificada se dirige a una célula B.

Breve descripción de los dibujos

La siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención se entenderá mejor cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. A fin de ilustrar la invención, se muestran en los dibujos realizaciones que se prefieren actualmente.

La Figura 2 es una ilustración que muestra que los receptores de células T quiméricos manipulados se dirigen a células B específicas de Dsg3.

La Figura 3 es una ilustración que muestra el direccionamiento de células B de memoria específicas de Dsg y la destrucción de células B secretoras de anticuerpos de vida corta.

La Figura 4 es un dibujo esquemático de los dominios de proteínas que comprenden un receptor de autoanticuerpo quimérico (CAAR) de desmogleína 3 (Dsg3).

La Figura 5 es una imagen que muestra la amplificación de los dominios individuales usados en el CAAR de Dsg3 a partir de ADNc de células mononucleares de sangre periférica.

La Figura 6 es una imagen que muestra la amplificación de CD137 usado en el CAAR de Dsg3 a partir de ADNc de células mononucleares de sangre periférica.

La Figura 7 es un conjunto de imágenes que muestran la amplificación de Dsg3 usada en el CAAR de Dsg3 del plásmido DN653.

La Figura 8 es una imagen que muestra un análisis por transferencia Western de CAAR de Dsg3 para determinar la expresión de proteínas 48 horas después de la transformación y lisis celular de células 293T en condiciones reductoras. El sobrenadante de baculovirus Dsg3 E-His es un control positivo, las células HEK293T no transfectadas son un control negativo. El tamaño esperado es de 96 kDa para la proteína no glucosilada, que típicamente migra a ~ 112 kD con glucosilación.

La Figura 9 es un dibujo esquemático que describe los experimentos para probar la especificidad del CAAR de Dsg3 hacia las dianas previstas y no deseadas.

La Figura 10 es un panel de gráficos de citometría de flujo que muestran las señales de CAAR de Dsg3 después de la exposición a la diana pretendida. Se estimularon células Jurkats NFAT-GFP que expresaban Dsg3-CAAR con perlas recubiertas de anticuerpo en una proporción de 3:1 (perlas:células). AK23, PV4B3 y PV2B7 son mAb específicos de Dsg3, que si están ligados al CAAR, debe desencadenar la señalización que da como resultado la expresión de GFP. El promotor EF1a funcionó mejor que el promotor PGK y dio como resultado una señalización específica. SS1 = CAR anti-mesotelina, control positivo, tuvo actividad basal positiva. No transducido, control negativo no se detectó señal GFP.

La Figura 11 es un panel de gráficos de citometría de flujo que muestran que el CAAR de Dsg3 induce una señalización de bajo nivel pero específica después de la exposición a IgG sérica de paciente con pénfigo vulgar (PV) policlonal (que refleja el bajo porcentaje global de IgG total que es específico de Dsg3).

La Figura 12 es un panel de gráficos de citometría de flujo que muestran que el CAAR de Dsg3 responde a un número bajo de células de superficie IgG+ (hibridoma AK23) de una manera dependiente de la dosis.

La Figura 13 es un panel de gráficos de citometría de flujo que muestran la seguridad de los CAAR de Dsg3 sin la inducción de señalización cuando se exponen a queratinocitos que expresan Dsg3, lo que indica que las interacciones de Dsg3 con cadherinas desmosómicas en los queratinocitos no deberían producir toxicidad cutánea o de las membranas mucosas.

La Figura 14 es un diagrama esquemático que muestra los diferentes escenarios para probar la citotoxicidad hacia células diana que expresan autoanticuerpos de superficie anti-Dsg3 y células difusas que expresan receptores Fc de superficie que podrían unirse a autoanticuerpos de PV en suero dando como resultado una lisis redireccionada no intencionada.

La Figura 15 es un panel de gráficos que muestran que el CAAR de Dsg3 no demuestra lisis redirigida contra una línea celular K562 que expresa receptores Fc de superficie que están precargados con mAb anti-Dsg3 PV (PV2B7).

La Figura 16A es una imagen de un gel electroforético que muestra la amplificación de los diferentes dominios extracelulares Dsg3, EC2-3, EC1-2, EC1-3, EC1-4 y EC1-5, que están construidos para optimizar la citotoxicidad de CAAR de Dsg3, ya que la eficacia de la citotoxicidad mediada por CAAR depende de la distancia entre el efector y la célula diana.

La Figura 16B es un dibujo esquemático de los dominios extracelulares Dsg3 amplificados en la Figura 16A.

La Figura 17 es un panel de gráficos de citometría de flujo que muestra que los CAAR de Dsg EC1-3, EC1-4, EC1-5 pueden expresarse en células T humanas primarias y son reconocidos por 3 mAb anti-Dsg3 PV diferentes, AK23, Px44 y F779. EC1-2 no se expresó de manera efectiva. 21D4 = CAR de control negativo.

La Figura 18 es un panel de gráficos que muestra la eficacia del CAAR de Dsg3 contra un hibridoma de ratón IgG anti-Dsg3 (destinado a modelar una célula B de memoria humana específica de PV o plasmablasto que muestra IgG anti-Dsg3 en la superficie celular). El CAAR de Dsg3, expresado en la superficie de las células T humanas primarias, muestra la destrucción específica in vitro de AK23 (un hibridoma anti-Dsg3) en un ensayo de liberación de cromo después de 4 horas.

La Figura 19 es un panel de gráficos que muestra la destrucción de CAAR de Dsg3 de los aumentos de hibridoma AK23 a lo largo del tiempo en un ensayo de liberación de cromo después de 24 horas. La eficacia destructora de los CAAR se correlaciona con el tamaño del CAAR (más corto es mejor, por lo que EC1-3> EC1-4> EC1-5). Simulacro = CAR anti-CD19 humano; el CD19 humano no se expresa en la célula de hibridoma diana. El hibridoma de control (BK2) que no expresa un autoanticuerpo Dsg3, muestra cierta destrucción por CAAR de Dsg3 durante 24 horas, quizás debido a la alorreactividad humano-ratón.

La Figura 20 es un gráfico que muestra la destrucción de células anti-Dsg3 dirigidas a diferentes epítopos Dsg3 por células T con CAAR de Dsg3 en un ensayo de liberación de cromo de 4 horas. Los valores son representativos de al menos 4 experimentos con células T de diferentes donantes normales (ND).

La Figura 21 es un gráfico que muestra la destrucción de células anti-Dsg3 dirigidas a epítopos Dsg3 humanos diferentes adicionales por células T con CAAR de Dsg3 en un ensayo de liberación de cromo de 4 horas.

La Figura 22 es un panel de imágenes que muestra que la densidad de IgG de superficie de los hibridomas anti-Dsg es comparable a la de las células B de memoria humana. Se tienen en cuenta diferentes tipos de células para calcular la densidad relativa de la diana.

La Figura 23 es un gráfico que muestra ELISA de afinidad relativa para diferentes anticuerpos diana del CAAR de Dsg3, lo que indica que las células T con CAAR de Dsg3 destruyen las células diana dentro de un rango de afinidades de anticuerpos.

La Figura 24 es un panel de gráficos que muestra que las células T con CAAR de Dsg3 mueren incluso en presencia de anticuerpo anti-Dsg3 bloqueante soluble. Proporción de efector a diana (E:D) para todas las condiciones: 30:1. 51 Cr, 8 horas.

La Figura 25 es un panel de gráficos que muestra que las células T con CAAR de Dsg3 no destruyen las células que expresan el receptor Fc que pueden unirse a anticuerpos anti-Dsg3 solubles en el suero de un paciente con P^vpor toxicidad celular dependiente de anticuerpos inversa (rADCC) in vitro.

La Figura 26 es un gráfico que muestra que las células T con CAAR de Dsg3 no destruyen los queratinocitos primarios.

La Figura 27 es un gráfico que muestra que las células T con CAAR de Dsg3 controlan eficazmente las células de hibridoma anti-Dsg3 secretoras de IgG bioluminiscente in vivo.

La Figura 28 es un panel de gráficos que muestra, mediante análisis de citometría de flujo, que en los 4 ratones de la Figura 27 que escapan al tratamiento de T con CAAR de Dsg3, los hibridomas de "escape" bioluminiscentes no expresan IgG de superficie, lo que explica por qué ya no son la diana de las células T con CAAR de Dsg3. Los números de los 3 paneles de la derecha indican ratones individuales. 9406 y 9407 muestran células GFP+ que son negativas para IgG de superficie, lo que indica que estas células no fueron la diana de las células T con CAAR de Dsg3.

La Figura 29 es un gráfico que muestra la presencia y el injerto de células T con CAAR de Dsg3 trasplantadas en ratones.

La Figura 30A es un gráfico que muestra la presencia de células T con CAAR de Dsg3 en sangre.

La Figura 30B es un gráfico que muestra la presencia de células T con CAAR de Dsg3 en la médula ósea.

La Figura 30C es un gráfico que muestra la presencia de células T con CAAR de Dsg3 en el bazo.

La Figura 31 es un gráfico que muestra que las células T con CAAR de Dsg no causaron rADCC contra neutrófilos y monocitos que expresan FcgammaR in vivo. Los valores de referencia se indican mediante líneas horizontales. Los ratones NSG no tienen linfocitos B, T/linfocitos citolíticos naturales.

La Figura 32A es un gráfico que muestra la bioluminiscencia de la carga tumoral de AK23 en ratones inyectados con T con CAAR de Dsg3 EC1-3.

La Figura 32B es un gráfico que muestra la supervivencia de ratones portadores de tumores AK23 inyectados con T con CAAR de control y Dsg3 EC1-3.

La Figura 33 es un panel de gráficos que muestra que las células T con CAAR de Dsg3 EC1-4 presentan eficacia contra una amplia gama de dianas in vivo (imágenes de bioluminiscencia días 0-3 después de la inyección). La Figura 34 es un panel de gráficos que muestra que las células T con CAAR de Dsg3 EC1-4 presentan eficacia contra una amplia gama de dianas in vivo (imágenes de bioluminiscencia días 7-13 después de la inyección). La Figura 35 es un panel de gráficos que muestra que las células T con CAAR de Dsg3 EC1-4 muestran eficacia contra una amplia gama de dianas in vivo, basado en curvas de supervivencia con un flujo total de 10E8 definido como muerte.

La Figura 36 es un dibujo esquemático de los dominios de proteínas que comprenden un receptor de autoanticuerpo quimérico (CAAR) de desmogleína 1 (Dsg1).

La Figura 37^aes un panel de gráficos que muestra la muerte de dos células anti-Dsg1 diferentes por células T con CAAR de Dsg1 dirigidas a los dominios EC1 y EC2.

La Figura 37B es un panel de gráficos que muestra que las células T con CAAR de Dsg1 no destruyen de forma no específica las células K562 de tipo silvestre o las células K562 que expresan el anticuerpo anti-Dsg3 PVB28. La Figura 38 es un dibujo esquemático de los dominios KIR en un receptor de autoanticuerpo quimérico de desmogleína 1 o 3 (CAAR).

La Figura 39A es un gráfico que muestra la muerte de células anti-Dsg3 (PVB28 anti-EC2) por células T con CAAR de Dsg3 EC1-3 y Dsg3 EC1-4 KIR en un ensayo de liberación de cromo de 16 horas.

La Figura 39B es un gráfico que muestra que no se produce la muerte de las células K562 de tipo silvestre por los CAAR Dsg3 KIR.

Descripción detallada

La divulgación incluye composiciones que comprenden al menos un receptor de autoanticuerpos quimérico (CAAR) específico para un autoanticuerpo, vectores que comprenden el mismo, composiciones que comprenden vectores CAAR empaquetados en partículas víricas y células T recombinantes que comprenden CAAR. La divulgación también incluye métodos para producir una célula T genéticamente modificada que exprese un CAAR (CAART) en donde el CAAR expresado comprende un dominio extracelular de desmogleína.

La presente divulgación también se refiere en general al uso de células T manipuladas para expresar un receptor de autoanticuerpos quimérico (CAAR) para tratar una enfermedad autoinmune asociada con la expresión de autoantígenos. En una realización, las células T que expresan el CAAR de la divulgación se unen específicamente a las células que expresan autoanticuerpos de desmogleína 1 o 3 y las destruyen, pero no células que expresan anticuerpos normales.

Definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica y/o para la prueba de la presente invención, se describen en el presente documento los materiales y métodos preferentes. Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología según se defina, donde se proporciona una definición.

También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es únicamente con el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante.

Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Se entiende que "aproximadamente", como se usa en el presente documento, cuando hace referencia a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, y similares, abarca variaciones de hasta ±20 % o ±10 %, en algunos casos ± 5 %, en algunos casos ± 1 %, y en algunos casos ± 0,1 % del valor especificado, ya que dichas variaciones son adecuadas para realizar los métodos desvelados.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une con un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas procedentes de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser partes inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos son normalmente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. El anticuerpo descrito en el presente documento puede existir en una variedad de formas en las que el anticuerpo se expresa como parte de una cadena polipeptídica contigua que incluye, p. ej., un fragmento de anticuerpo de dominio único (sdAb), un anticuerpo monocatenario (scFv) y un anticuerpo humanizado (Harlow et al., 1999, En: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, En: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242: 423-426).

La expresión "alta afinidad", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una alta especificidad en la unión o interacción o atracción de una molécula a una molécula diana.

El término "antígeno" o "Ag", como se usa en el presente documento, se define como una molécula que provoca una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. El experto en la materia comprenderá que cualquier macromolécula, incluyendo prácticamente todas las proteínas o péptidos, puede actuar como antígeno. Asimismo, los antígenos pueden proceder de ADN recombinante o genómico. Un experto en la materia comprenderá que cualquier ADN, que comprenda una secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos parcial que codifique una proteína que induzca una respuesta inmunitaria, por lo tanto, codifica un "antígeno" como se usa ese término en el presente documento. Asimismo, un experto en la técnica comprenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos de longitud completa de un gen. Resulta evidente que la presente divulgación incluye, pero sin limitación, el uso de secuencias de nucleótidos parciales de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos se disponen en diversas combinaciones para codificar polipéptidos que provocan la respuesta inmunitaria deseada. Por otra parte, un experto en la técnica comprenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado por un "gen" en absoluto. Resulta evidente que un antígeno se puede generar sintetizado o se puede obtener de una muestra biológica. Dicha muestra biológica puede incluir, pero sin limitación, una muestra tisular, una muestra tumoral, una célula o un líquido biológico.

Por "autoantígeno" se entiende un antígeno endógeno que estimula la producción de una respuesta autoinmune, como la producción de autoanticuerpos. El autoantígeno también incluye un autoantígeno o antígeno de un tejido normal que es la diana de una respuesta inmune mediada por células o mediada por anticuerpos que puede resultar en el desarrollo de una enfermedad autoinmune. Los ejemplos de autoantígenos incluyen, pero sin limitación, desmogleína 1, desmogleína 3 y fragmentos de la misma.

El término "toxicidad limitada" tal como se usa en el presente documento, se refiere a los péptidos, polinucleótidos, células y/o anticuerpos desvelados en el presente documento que manifiestan una falta de efectos biológicos sustancialmente negativos, efectos antitumorales, o síntomas fisiológicos sustancialmente negativos hacia una célula sana, célula no tumoral, célula no enferma, célula no diana o población de tales células, ya sea in vitro o in vivo.

"Autoanticuerpo" se refiere a un anticuerpo que es producido por una célula B específica para un autoantígeno. La expresión "enfermedad autoinmune" tal como se usa en el presente documento se define como un trastorno o afección que es resultado de una respuesta autoinmune mediada por anticuerpos contra autoantígenos. Una enfermedad autoinmune da como resultado la producción de autoanticuerpos que se producen de manera inapropiada y/o se producen en exceso para un antígeno propio o autoantígeno.

Como se usa en el presente documento, se entiende que el término "autólogo" se refiere a cualquier material procedente del mismo individuo al que luego se va a reintroducir en el individuo.

"Alogénico" se refiere a un injerto procedente de un animal diferente de la misma especie.

"Xenogénico" se refiere a un injerto procedente de un animal de una especie diferente.

"Receptor de autoanticuerpo quimérico" o "CAAR" se refiere a un receptor manipulado que se expresa en una célula T o cualquier otro tipo de célula efectora capaz de citotoxicidad mediada por células. El CAAR incluye un antígeno o fragmento del mismo que es específico para un autoanticuerpo patógeno. El CAAR también incluye un dominio transmembrana, un dominio intracelular y un dominio de señalización.

Como se usa en el presente documento, se entiende que la expresión "modificaciones conservadoras de secuencia" se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y supresiones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo desvelado en el presente documento mediante técnicas convencionales conocidas en la materia, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Son sustituciones conservadoras de aminoácidos aquellas en las que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, p. ej., uno o más restos de aminoácidos dentro de las regiones extracelulares del CAAR desvelado en el presente documento pueden reemplazarse con otros restos de aminoácidos que tienen una cadena lateral o carga similar y el CAAR alterado puede probarse para determinar su capacidad para unirse a autoanticuerpos usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

"Ligando coestimulante", como se usa la expresión en el presente documento, incluye una molécula en una célula presentadora de antígenos (p. ej., una aAPC, célula dendrítica, linfocito B y similares) que se une específicamente a una molécula coestimulante afín en un linfocito T, proporcionando de este modo una señal que, además de la señal primaria proporcionada mediante, p. ej., la unión de un complejo de TCR/CD3 con una molécula del MHC cargada con péptido, media en una respuesta de linfocitos T, incluyendo, pero sin limitación, proliferación, activación, diferenciación y similares.

Una "molécula coestimulante" se refiere al compañero de unión afín en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulante, mediando de este modo en una respuesta coestimulante mediante el linfocito T, tal como, pero sin limitación, proliferación. Las moléculas coestimulantes incluyen, pero sin limitación, una molécula del MHC de clase I, BTLA y un receptor de ligando Toll.

"Desmogleína 1" o "Dsg1" se refiere a una glucoproteína transmembrana de unión a calcio que es un componente de los desmosomas que se encuentran en las uniones célula-célula entre células epiteliales. Una secuencia de Dsg1 ilustrativa incluye Dsg1 humana encontrada en GenBank con N.° de registro N^m_001942 y NP_001932, o un fragmento de la misma, y la secuencia de Dsg1 de ratón encontrada en NM_010079 o NP_034209, o un fragmento de la misma.

"Desmogleína 3" o "Dsg3" se refiere a una glucoproteína transmembrana de unión a calcio que es un componente de los desmosomas que se encuentran en las uniones célula-célula entre células epiteliales. Una secuencia de Dsg3 ilustrativa incluye Dsg3 humana encontrada en GenBank con N.° de registro NM_0oi944 y NP_001935 (P32926), o un fragmento de la misma, y la secuencia de Dsg3 de ratón encontrada en NM_030596 o NP_085099, o un fragmento de la misma.

"Codificante" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, para actuar como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de los mismos. Por tanto, un gen codifica una proteína si la transcripción y la traducción del ARNm correspondiente a ese gen producen la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y, habitualmente, se proporciona en listados de secuencias, como la cadena no codificante, usada como molde para la transcripción de un gen o ADNc, se pueden denominar codificantes de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

A menos que se especifique otra cosa, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones redundantes entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y ARN pueden incluir intrones. "Cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una cantidad de un compuesto, formulación, material o composición, como se describe en el presente documento, eficaz para lograr un resultado biológico determinado. Dichos resultados pueden incluir, pero sin limitación, la inhibición de la infección por virus determinada por cualquier medio adecuado en la técnica.

Como se usa en el presente documento, "endógeno" se refiere a cualquier material de o producido dentro de un organismo, célula, tejido o sistema.

Como se usa en el presente documento, el término "exógeno" se refiere a cualquier material introducido desde o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema.

El término "expresión", como se usa en el presente documento, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos determinada dirigida por un promotor.

"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos que se va a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula hospedadora o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas), retrotransposones (por ejemplo, piggyback, bella durmiente) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

"Homólogo", como se usa en el presente documento, se refiere a la identidad de secuencia de subunidades entre dos moléculas poliméricas, p. ej., entre dos moléculas de ácido nucleico, tales como, dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas polipeptídicas. Cuando una posición de subunidad en ambas moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica; p. ej., si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; p. ej., si la mitad (p. ej., cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son 50 % homólogas; si el 90 % de las posiciones (p. ej., 9 de 10) son coincidentes u homólogas, las dos secuencias son 90 % homólogas.

"Identidad", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la identidad de secuencia de subunidades entre dos moléculas poliméricas, particularmente entre dos moléculas de aminoácidos, tal como, entre dos moléculas polipeptídicas. Cuando dos secuencias de aminoácidos tienen los mismos restos en las mismas posiciones; p. ej., si una posición en cada una de las dos moléculas polipeptídicas está ocupada por una arginina, entonces son idénticas en esa posición. La identidad o el grado en el que dos secuencias de aminoácidos tienen los mismos restos en las mismas posiciones en un alineamiento se expresa a menudo como porcentaje. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos es una función directa del número de posiciones coincidentes o idénticas; p. ej., si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son idénticas al 50 %; si el 90 % de las posiciones (p. ej., 9 de 10) son coincidentes o idénticas, las dos secuencias de aminoácidos son idénticas en un 90 %.

Como se usa en el presente documento, un "material de formación" incluye una publicación, un registro, un diagrama o cualquier otro medio de expresión que pueda usarse para comunicar la utilidad de las composiciones y métodos desvelados en el presente documento. El material instructivo del kit desvelado en el presente documento puede, p. ej., fijarse a un recipiente que contiene el ácido nucleico, péptido y/o composición desvelada en el presente documento o enviarse junto con un recipiente que contiene el ácido nucleico, péptido y/o composición. Como alternativa, el material de formación puede enviarse por separado del recipiente con la intención de que el material de formación y el compuesto sean utilizados conjuntamente por el receptor.

"Dominio intracelular" se refiere a una porción o región de una molécula que reside dentro de una célula.

"Aislado" significa alterado o eliminado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado". Un ácido nucleico o proteína aislados pueden existir en forma sustancialmente purificada o pueden existir en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, una célula hospedadora.

En el contexto de la presente divulgación, se usan las siguientes abreviaturas para las bases de ácido nucleico habituales. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina y "U" se refiere a uridina.

A menos que se especifique otra cosa, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones redundantes entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La expresión secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede contener, en alguna versión, uno o más intrones.

Un "lentivirus", como se usa en el presente documento, se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son particulares entre los retrovirus al ser capaces de infectar células que no se dividen; pueden administrar una cantidad significativa de información genética en el ADN de la célula hospedadora, por lo que son uno de los métodos más eficientes de un vector de administración de genes. El VIH, SIV y FIV son ejemplos de lentivirus. Los vectores procedentes de lentivirus ofrecen los medios para lograr niveles significativos de transferencia génica in vivo.

La expresión "unido operativamente" se refiere al enlace funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que da lugar a la expresión de esta última. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. En general, las secuencias de ADN unidas operativamente están contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, están en el mismo marco de lectura.

La administración "parenteral" de una composición inmunogénica incluye, p. ej., inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) o intraesternal, o técnicas de infusión.

El término "polinucleótido", como se usa en el presente documento, se define como una cadena de nucleótidos. Asimismo, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Por tanto, ácidos nucleicos y polinucleótidos, como se usan en el presente documento, son intercambiables. Un experto en la materia tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que se pueden hidrolizar en los "nucleótidos" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos se pueden hidrolizar en nucleósidos. Como se usan en el presente documento, los polinucleótidos incluyen, pero sin limitación, todas las secuencias de ácido nucleico que se obtienen mediante cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, sin limitación, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácido nucleico de una biblioteca recombinante o un genoma celular, usando de tecnología de clonación habitual y PCR™, y similares, y mediante medios sintéticos.

Como se usan en el presente documento, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a un compuesto comprendido por restos de aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos y no se limita el número máximo de aminoácidos que pueden comprender la secuencia de una proteína o un péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Como se usa en el presente documento, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan habitualmente en la técnica péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que se denominan en general en la técnica proteínas, de las que existen muchos tipos. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos.

El término "atocina proinflamatoria" se refiere a una citocina o factor que promueve la inflamación o respuestas inflamatorias. Ejemplos de citocinas proinflamatorias incluyen, pero sin limitación, quimiocinas (CCL, CXCL, CX3CL, XCL), interleucinas (tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL10 e IL-15), interferones (IFNy) y factores de necrosis tumoral (TNFa y TNFp).

El término "promotor", como se usa en el presente documento, se define como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de una secuencia polinucleotídica.

Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia promotora/reguladora" significa una secuencia de ácido nucleico que es necesaria para la expresión de un producto génico unido operativamente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y, en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que son necesarios para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede, por ejemplo, ser una que exprese el producto génico de una manera específica de tejido.

Un promotor "constitutivo" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está unida operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula en la mayoría o la totalidad de las condiciones fisiológicas de la célula.

Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está unida operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente solo cuando un inductor que corresponde al promotor está presente en la célula.

Un promotor "específico de tejido" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está unida operativamente con un polinucleótido codificado o especificado por un gen, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente solo si la célula es una célula del tipo tisular correspondiente al promotor.

Una "ruta de transducción de señal" se refiere a la relación bioquímica entre una diversidad de moléculas de transducción de señales que desempeñan una función en la transmisión de una señal de una parte de una célula a otra parte de una célula. La expresión "receptor de superficie celular" incluye moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y transmitirla a través de la membrana de una célula.

"Dominio de señalización" se refiere a la porción o región de una molécula que recluta e interactúa con proteínas específicas en respuesta a una señal de activación.

Se entiende que el término "sujeto" incluye organismos vivos en los que se puede inducir una respuesta inmunitaria (p. ej., mamíferos).

Como se usa en el presente documento, una célula "sustancialmente purificada" es una célula que está esencialmente exenta de otros tipos celulares. Una célula sustancialmente purificada también se refiere a una célula que se ha separado de otros tipos celulares con los que normalmente está asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, esta expresión se refiere simplemente a células que se han separado de las células con las que están naturalmente asociadas en su estado natural. En algunas realizaciones, las células se cultivan in vitro. En otras realizaciones, las células no se cultivan in vitro.

El término "terapéutico", como se usa en el presente documento, significa un tratamiento y/o profilaxis. Se obtiene un efecto terapéutico mediante supresión, remisión o erradicación de una patología.

El término "transfectado" o "transformado" o "transducido", como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso mediante el que se transfiere o introduce ácido nucleico exógeno en la célula hospedadora. Una célula "transfectada" o "transformada" o "transducida" es una que se ha transfectado, transformado o transducido con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula objeto principal y su descendencia.

"Dominio transmembrana" se refiere a una porción o región de una molécula que se extiende por una membrana de bicapa lipídica.

La expresión "bajo control transcripcional" o "unido operativamente", como se usa en el presente documento, significa que el promotor está en la ubicación y orientación correcta en relación con un polinucleótido para controlar el inicio de la transcripción por la ARN polimerasa y la expresión del polinucleótido.

Un "vector" es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que se puede usar para administrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. En la técnica se conocen numerosos vectores, que incluyen, pero sin limitación, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por tanto, el término "vector" incluye un plásmido o un virus que se replica de forma autónoma. También debe interpretarse que el término incluye compuestos no plasmídicos y no víricos que faciliten la transferencia de ácido nucleico a las células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas y similares. Los ejemplos de vectores víricos incluyen, pero sin limitación, vectores adenovíricos, vectores adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos y similares.

Por la expresión "se une específicamente", como se usa en el presente documento, se entiende un anticuerpo, o un ligando, que reconoce y se une con una proteína compañera de unión afín (p. ej., una molécula estimulante y/o coestimulante presente en un linfocito T) presente en una muestra, pero dicho anticuerpo o ligando no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas de la muestra.

Por el término "estimulación", se entiende una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimulante (p. ej., un complejo TCR/CD3) con su ligando afín mediando de este modo en un acontecimiento de transducción de señal, tal como, pero sin limitación, transducción de señal a través del complejo TCR/CD3. La estimulación puede mediar en la expresión alterada de determinadas moléculas, tal como la regulación negativa de TGF-p, y/o la reorganización de estructuras citoesqueléticas, y similares.

Una "molécula estimulante", como se usa la expresión en el presente documento, significa una molécula en un linfocito T que se une específicamente con un ligando estimulante afín presente en una célula presentadora de antígenos.

Un "ligando estimulante", como se usa en el presente documento, significa un ligando que, cuando está presente en una célula presentadora de antígenos (por ejemplo, una aAPC, una célula dendrítica, un linfocito B y similares), se puede unir específicamente con un compañero de unión afín (denominado en el presente documento "molécula estimulante") en un linfocito T, mediando de este modo en una respuesta primaria por el linfocito T, incluyendo, pero sin limitación, activación, iniciación de una respuesta inmunitaria, proliferación y similares. Los ligandos estimulantes son bien conocidos en la técnica y abarcan, entre otros, una molécula del MHC de clase I cargada con un péptido, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo superagonista anti-CD28 y un anticuerpo superagonista anti-CD2.

Intervalos: a lo largo de la presente divulgación, se pueden presentar diversos aspectos desvelados en el presente documento en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad. Por consiguiente, debería considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos así como valores numéricos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, debería considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 tiene subintervalos desvelados específicamente tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto es aplicable independientemente de la amplitud del intervalo.

Receptor de autoanticuerpos quimérico (CAAR)

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que los receptores de autoanticuerpos quiméricos pueden usarse para dirigirse a autoanticuerpos que causan enfermedades autoinmunes. En el presente documento se desvelan composiciones que comprenden al menos un receptor de autoanticuerpos quimérico (CAAR) específico para un autoanticuerpo, vectores que comprenden el mismo, composiciones que comprenden vectores CAAR empaquetados en partículas víricas y células T recombinantes u otras células efectoras que comprenden CAAR. La divulgación también incluye métodos para producir una célula T genéticamente modificada que exprese un CAAR (CAART) en donde el CAA^rexpresado comprende un dominio extracelular de desmogleína.

Se han descrito los antígenos de muchas enfermedades mediadas por autoanticuerpos. La presente divulgación incluye una tecnología para tratar enfermedades mediadas por autoanticuerpos. En particular, tecnologías que se dirigen a las células B que finalmente producen los autoanticuerpos y muestran los autoanticuerpos en sus superficies celulares, marcan estas células B como dianas específicas de la enfermedad para la intervención terapéutica. Por lo tanto, la divulgación incluye un método para atacar y destruir eficazmente las células B patógenas en enfermedades autoinmunes dirigiéndose a las células B que causan la enfermedad usando un receptor de autoanticuerpo quimérico específico de antígeno (por ejemplo, desmogleína 3) (o CAAR). En una realización de la presente divulgación, solo se destruyen las células B específicas que expresan autoanticuerpos anti-Dsg3, dejando así intactas las células B beneficiosas y los anticuerpos que protegen de la infección.

La presente divulgación abarca una construcción de ADN recombinante que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio extracelular que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, en un aspecto, un Dsg1, Dsg3 humano o un fragmento del mismo, en donde la secuencia del autoantígeno o fragmento del mismo está operativamente enlazada a una secuencia de ácido nucleico de un dominio de señalización intracelular. El dominio de señalización intracelular o de lo contrario el dominio citoplasmático comprende, una región de señalización coestimuladora. La región de señalización coestimuladora se refiere a una parte del CAAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular que se requieren para una activación eficaz de las células T.

En un aspecto, la divulgación incluye una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de autoanticuerpos quimérico (CAAR), en donde la secuencia de ácido nucleico aislada comprende un dominio extracelular que comprende un autoantígeno o fragmento del mismo, una secuencia de ácido nucleico de un dominio transmembrana y una secuencia de ácido nucleico de un dominio de señalización intracelular.

Resto de autoantígeno

En una realización ilustrativa, un receptor de autoanticuerpos quimérico manipulado genéticamente incluye el principal autoantígeno del pénfigo vulgar, desmogleína 3 (Dsg3) o fragmentos de la misma, en la superficie celular de las células T. En la presente realización, el CAAR comprende un propéptido, tal como un propéptido de desmogleína 3 humana (aminoácidos 24-49 de la desmogleína 3 humana): ELRiEt k GqYDEEEMTmQq AKRRQKR (SEQ ID NO:2). El propéptido Dsg3 humano previene la adhesión de la proteína Dsg3 a sí mismo dentro de la ruta sintética de la célula y es escindido por furina o peptidasas similares a furina en el Golgi tardío. En una realización, la secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el CAAR comprende una secuencia de ácido nucleico de un propéptido de Dsg3. En otra realización, el propéptido de Dsg3 codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2. En otra realización más, el CAAR comprende un propéptido de Dsg3. En aún otra realización, el CAAR comprende un propéptido de Dsg3 que comprende la SEQ ID NO:2, tal como:

a) dominios extracelulares de desmogleína 3 humana 1-5 (aminoácidos 50-615 de desmogleína 3 humana, uniprot P32926. Los dominios extracelulares de Dsg3 proporcionan la diana para las células B autoinmunes específicas de Dsg3.

EWVKFAKPCREGEDNSKRNPIAKITSDYQATQKITYRISGVGIDQPPFGIFWDKNTGDINITAIVD

REETPSFLITCRALNAQGLDVEKPLILTVKILDINDNPPVFSQQIFMGEIEENSASNSLVMILNATD

ADEPNHLNSKIAFKIVSQEPAGTPMFLLSRNTGEVRTLTNSLDREQASSYRLVVSGADKDGEGL

STQCECNIKVKDVNDNFPMFRDSQYSARIEENILSSELLRFQVTDLDEEYTDNWLAVYFFTSGN

EGNWFEIQTDPRTNEGILKVVKALDYEQLQSVKLSIAVKNKAEFHQSVISRYRVQSTPVTIQVINV

REGIAFRPASKTFTVQKGISSKKLVDYILGTYQAIDEDTNKAASNVKYVMGRNDGGYLMIDSKTA

EIKFVKNMNRDSTFIVNKTITAEVLAIDEYTGKTSTGTVYVRVPDFNDNCPTAVLEKDAVCSSSP

SVVVSARTLNNRYTGPYTFALEDQPVKLPAVWSITTLNATSALLRAQEQIPPGVYHISLVLTDSQ

NNRCEMPRSLTLEVCQCDNRGICGTSYPTTSPGTRYGRPHSGR (SEQ ID NO:3).

b) igual que a), pero con solo los dominios EC1-2 (aminoácidos 50-268 de la desmogleína 3 humana, P32926). (SEQ ID NO:4).

c) igual que a), pero con solo los dominios EC1-3 (aminoácidos 50-383 de la desmogleína 3 humana, P32926). (SEQ ID NO:5).

d) igual que a), pero con solo los dominios EC1-4 (aminoácidos 50-499 de la desmogleína 3 humana, P32926). (SEQ ID NO:6).

e) igual que a), pero con solo los dominios EC2-3 (aminoácidos 159-383 de la desmogleína 3 humana, P32926). (SEQ ID NO:7).

f) igual que a), pero con solo los dominios EC3-4 (aminoácidos 269-499 de la desmogleína 3 humana, P32926). (SEQ ID NO:8).

g) igual que a), pero con solo los dominios EC4-5 (aminoácidos 386-615 de la desmogleína 3 humana, P32926). (SEQ ID NO:9).

h) igual que a), pero con solo los dominios EC2-4 (aminoácidos 159-499 de la desmogleína 3 humana, P32926). (SEQ ID NO:10).

i) igual que a), pero con solo los dominios EC3-5 (aminoácidos 269-615 de la desmogleína 3 humana, P32926). (SEQ ID NO:11).

k) igual que a), pero con solo los dominios EC2-5 (aminoácidos 159-615 de la desmogleína 3 humana, P32926). (SEQ ID NO:12).

En una realización, la secuencia de ácido nucleico del dominio extracelular Dsg3 codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12. En otra realización, el CAAR comprende el dominio extracelular Dsg3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

En una realización, una secuencia de ácido nucleico tiene al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad u homología con cualquier secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento. En otra realización, una secuencia de aminoácidos tiene al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad u homología con cualquier secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento.

En otro aspecto, las construcciones descritas en el presente documento comprenden un dominio extracelular que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo. En una realización, el autoantígeno se selecciona del grupo que consiste en Dsg1, Dsg3 y un fragmento del mismo.

En una realización, el CAAR desvelado en el presente documento comprende un dominio de unión a autoanticuerpo denominado de otro modo un autoantígeno o un fragmento del mismo. La elección del autoantígeno para su uso en la presente invención depende del tipo de autoanticuerpo al que se dirige. Por ejemplo, el autoantígeno puede elegirse porque reconoce un autoanticuerpo en una célula diana, tal como una célula B, asociado con una patología particular, por ejemplo, una enfermedad autoinmune.

En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión de autoanticuerpos se obtenga de la misma especie en la que finalmente se utilizará el CAAR. Por ejemplo, para su uso en seres humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión de autoanticuerpos del CAAR comprenda un autoantígeno que se una a un autoanticuerpo o un fragmento del mismo. Por tanto, en una realización, la porción del dominio de unión al autoanticuerpo comprende un epítopo del autoantígeno que se une al autoanticuerpo. El epítopo es la parte del autoantígeno que es específicamente reconocida por el autoanticuerpo.

Dominio transmembrana

En una realización, el CAAR comprende un dominio transmembrana, tal como, pero sin limitación, una bisagra y/o dominio transmembrana de la cadena alfa de la glucoproteína CD8 de la superficie de la célula T humana (aminoácidos 136-203 de la cadena alfa de la glucoproteína CD8 de la superficie de la célula T humana).

KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO:13). La bisagra de la cadena CD8 humana y/o el dominio transmembrana proporciona la presentación en la superficie celular del receptor de autoanticuerpos quimérico.

Con respecto al dominio transmembrana, en diversas realizaciones, el CAAR comprende un dominio transmembrana que se fusiona con el dominio extracelular del CAAR. En una realización, el CAAR comprende un dominio transmembrana que, de manera natural, está asociado con uno de los dominios del CAAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se selecciona o modifica mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión a los dominios transmembrana de las mismas proteínas de la superficie de la membrana o de diferentes proteínas con el fin de minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.

El dominio transmembrana puede proceder de una fuente natural o sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio puede proceder de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. En una realización, el dominio transmembrana puede ser sintético, en cuyo caso comprenderá restos predominantemente hidrófobos tales como leucina y valina. En un aspecto, un triplete de fenilalanina, triptófano y valina se encontrará en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. Opcionalmente, un conector oligo o polipeptídico corto, entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplasmática del CAAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado.

En algunos casos, se pueden emplear diversas bisagras humanas, incluyendo también la bisagra de Ig humana (inmunoglobulina).

Los ejemplos del dominio bisagra y/o transmembrana incluyen, pero sin limitación, un dominio bisagra y/o transmembrana de una cadena alfa, beta o zeta de un receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIR, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D y/o NKG2C.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico del dominio transmembrana codifica una bisagra y/o un dominio transmembrana de la cadena alfa de CD8. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico de la bisagra de la cadena alfa de CD8 y/o el dominio transmembrana codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO:13.

En otra realización más, el dominio transmembrana comprende una bisagra de la cadena alfa de CD8 y/o un dominio transmembrana.

Dominio citoplasmático

El dominio citoplasmático o de otro modo el dominio de señalización intracelular del CAAR desvelado en el presente documento, es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se ha colocado el CAAR.

La expresión "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula.

La función efectora de un linfocito T, por ejemplo, puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar, incluyendo la secreción de citocinas. Por tanto, la expresión "dominio de señalización intracelular" se refiere a la parte de una proteína que transduce la señal de función efectora y dirige a la célula a realizar una función especializada. Si bien se puede emplear todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario usar el dominio entero. En la medida en que se use una parte truncada del dominio de señalización intracelular, dicha porción truncada se puede usar en lugar del dominio intacto siempre que transduzca la señal de la función efectora.

La expresión "dominio de señalización intracelular" pretende por lo tanto incluir cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora.

Ejemplos de dominios de señalización intracelular para su uso en el CAAR desvelado en el presente documento incluyen, pero sin limitación, la porción citoplásmica del receptor de células T (TCR) y los correceptores que actúan en conjunto para iniciar la transducción de señales después de la participación del receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estos elementos y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.

Es bien reconocido que las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para la activación total del linfocito T y que también se requiere una señal secundaria o coestimuladora. Por tanto, se puede decir que la activación de los linfocitos T está mediada por dos clases definidas de secuencia de señalización citoplasmática: las que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplasmáticas primarias) y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimulante (secuencias de señalización citoplasmáticas secundarias).

Las secuencias de señalización citoplasmáticas primarias regulan la activación primaria del complejo TCR, ya sea de forma estimulante o inhibidora. Las secuencias de señalización citoplasmáticas primarias que actúan de manera estimulante pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación de inmunorreceptores basados en tirosina o ITAM.

Los ejemplos del dominio de señalización intracelular incluyen un fragmento o dominio de una o más moléculas o receptores que incluyen, pero sin limitación, CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD86, FcR gamma común, FcR beta (Fc épsilon R1b), CD79a, CD79b, Fcgamma Rlla, DAP10, DAP12, receptor de células T (TCR), CD27, CD28, 4-1BB (c D137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83, CDS, ICAM-1, GⁱTR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, otras moléculas coestimuladoras descritas en el presente documento, cualquier derivado, variante, o fragmento de la misma, cualquier secuencia sintética de una molécula coestimuladora que tenga la misma capacidad funcional, y cualquier combinación de las mismas.

En una realización preferida, el dominio de señalización intracelular del CAAR comprende el dominio de señalización CD3-zeta por sí mismo o en combinación con cualquier otro dominio citoplasmático deseado útil en el contexto del CAAR desvelado en el presente documento. Por ejemplo, el dominio de señalización intracelular del CAAR puede comprender una parte de cadena CD3 zeta y una región de señalización coestimulante. La región de señalización coestimuladora se refiere a una parte del CAAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimulante es una molécula de superficie celular que no es un receptor de antígeno o sus ligandos que es necesaria para una respuesta eficaz de linfocitos hacia un antígeno.

En otra realización más, el dominio de señalización intracelular codifica un dominio intracelular CD137. En aún otra realización, el dominio intracelular CD137 comprende la SEQ ID NO:15, tal como un dominio intracelular de la isoforma 3 de la cadena zeta de la glucoproteína CD3 de la superficie de la célula T humana (CD247 humano, aminoácidos 52-163) RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNE LQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:16).

El dominio zeta de CD3 intracelular humano proporciona señalización intracelular estimulante al unirse al autoantígeno extracelular, tal como Dsg1, Dsg3 o un fragmento del mismo, sin restricción de HLA.

En otra realización, la secuencia de ácido nucleico del dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización zeta de CD3. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico del dominio de señalización zeta de CD3 codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO:16.

En otra realización más, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización zeta de CD3. En aún otra realización, el dominio de señalización zeta de CD3 comprende la SEQ ID NO:16.

Otros dominios

En otra realización, el CAAR y el ácido nucleico que codifica el CAAR comprenden un péptido señal de la cadena alfa de la glucoproteína CD8 de la superficie de la célula T humana (aminoácidos 1-21 de la cadena alfa de la glucoproteína CD8 de la superficie de la célula T): MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO:1). El péptido señal alfa CD8 humano es responsable de la translocación del receptor a la superficie de las células T. En una realización, la secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el CAAR comprende una secuencia de ácido nucleico de un péptido señal de la cadena alfa de CD8. En otra realización, el péptido señal de la cadena alfa de CD8 codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO:1. En otra realización más, el CAAR comprende un péptido señal de la cadena alfa de CD8.

En aún otra realización, el dominio transmembrana comprende una bisagra de la cadena alfa de CD8 y un dominio transmembrana que comprende la SEQ ID NO:13, como la región de bisagra mencionada en a) reemplazada con un enlazador peptídico que consiste en los aminoácidos: SGGGGSGGGGSSG (SEQ ID NO: 14) entre los dominios EC de desmogleína 3 y el dominio transmembrana CD8.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el CAAR comprende una secuencia de ácido nucleico de un péptido enlazador. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico del péptido enlazador codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO:14. En otra realización, las secuencias de señalización citoplasmáticas dentro del dominio de señalización intracelular del CAAR de la invención pueden estar unidas entre sí en un orden aleatorio o especificado. Opcionalmente, un conector oligo o polipeptídico corto, p. ej., entre 2 y 10 aminoácidos de longitud pueden formar el enlace. Un doblete de glicina-serina es un enlazador particularmente adecuado.

En otra realización más, el CAAR comprende un enlazador peptídico. En aún otra realización, el enlazador peptídico comprende la SEQ ID NO:14, tal como un miembro 9 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral humano (también conocido como receptor del ligando CD137 o 4-1BB) dominio intracelular (aminoácidos 214-255 del miembro 9 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral humano): KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:15). El dominio CD137 intracelular humano proporciona señalización intracelular coestimuladora al unirse al autoantígeno extracelular, tal como Dsg1, Dsg3 o un fragmento del mismo, sin la necesidad de su ligando original.

Cualquier dominio y/o fragmento del CAAR, vector, y el promotor puede amplificarse mediante PCR o cualquier otro medio conocido en la técnica.

Vector que comprende el CAAR

Todos los vectores descritos en el presente documento que comprenden diferentes partes de una porción extracelular de Desmogleína 3 humana deben considerarse igualmente compatibles con el uso de la porción extracelular de Desmogleína 1 humana. Como tal, el uso de los vectores descritos en el presente documento se ejemplifica mediante el uso de Desmogleína 3, pero debe interpretarse que se describe igualmente con respecto al uso de Desmogleína 1 humana.

Como prueba de concepto en cuanto a especificidad y funcionalidad, es útil un 3er plásmido de vector lentivírico autoactivante de generación, en donde la expresión está regulada por el promotor alfa del factor de elongación humano 1 (por ejemplo, pRRLSIN.cPPT.EF1a.Dsg3CAAR.WPRE). Esto da como resultado una expresión estable (permanente) en la célula T hospedadora. Como enfoque alternativo, el ARNm codificante puede electroporarse en la célula hospedadora, que lograría el mismo efecto terapéutico que las células T transducidas víricamente, pero no sería permanente, ya que el ARNm se diluiría con la división celular.

En un aspecto, la divulgación incluye un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de autoanticuerpos quimérico (CAAR), en donde la secuencia de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de ácido nucleico humano de un dominio extracelular que comprende un autoantígeno o fragmento del mismo, una secuencia de ácido nucleico de un dominio transmembrana y una secuencia de ácido nucleico de un dominio de señalización intracelular. En una realización, el vector comprende cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican el CAAR como se describe en el presente documento. En otra realización, el vector comprende un vector plásmido, vector vírico, retrotransposón (por ejemplo, piggyback, la bella durmiente), vector de inserción dirigido al sitio (por ejemplo, CRISPR, nucleasas de dedos de zn, T^{a l}Eⁿ), o vector de expresión suicida, u otro vector conocido en la técnica.

Todas las construcciones mencionadas anteriormente que comprenden diferentes autoantígenos y fragmentos de los mismos son capaces de usarse con plásmidos de vectores lentivíricos de 3a generación, otros vectores víricos o ARN aprobado para su uso en células humanas. En una realización, el vector es un vector vírico, tal como un vector lentivírico. En otra realización, el vector es un vector de ARN.

La producción del CAAR se puede verificar mediante secuenciación. La expresión de la proteína CAAR de longitud completa se puede verificar mediante inmunotransferencia, inmunohistoquímica, citometría de flujo u otra tecnología bien conocida y disponible en la técnica.

La presente divulgación también proporciona un vector en el que se inserta el ADN que codifica el CAAR de la presente divulgación. Los vectores, incluidos los obtenidos de retrovirus como el lentivirus, son herramientas adecuadas para lograr la transferencia de genes a largo plazo, ya que permiten a largo plazo, la integración estable de un transgén y su propagación en células hijas. Los vectores lentivíricos tienen la ventaja adicional sobre los vectores que provienen de onco-retrovirus, tales como los virus de la leucemia murina, en que pueden transducir células no proliferantes, tales como hepatocitos. También tienen la ventaja añadida de dar como resultado una baja inmunogenicidad en el sujeto en el que se introducen.

En resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican CAAR se logra normalmente uniendo operativamente un ácido nucleico que codifica el polipéptido CAR o partes del mismo a un promotor, e incorporando la construcción en un vector de expresión. El vector es generalmente capaz de replicarse en una célula de mamífero y/o también capaz de integrarse en el genoma celular del mamífero. Los vectores típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada.

El ácido nucleico se puede clonar en varios tipos diferentes de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede clonar en un vector que incluye, pero sin limitación, un plásmido, un fagémido, un derivado de fago, un virus animal y un cósmido. Los vectores de especial interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación.

El vector de expresión se puede proporcionar a una célula en forma de un vector vírico. La tecnología de vectores víricos es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY) y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus, que son útiles como vectores, incluyen, pero sin limitación, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios convenientes de endonucleasas de restricción y uno o más marcadores seleccionables, (p. ej., documentos WO 01/96584; WO 01/29058; y patente de los Estados Unidos n.° 6.326.193).

Elementos promotores adicionales, p. ej., potenciadores, regulan la frecuencia de iniciación de la transcripción. Normalmente, estos se ubican en la región de 30-110 pb cadena arriba del sitio de inicio, aunque recientemente se ha mostrado que varios promotores contienen también elementos funcionales cadena abajo del sitio de inicio. La separación entre los elementos promotores con frecuencia es flexible, de modo que se conserva la función del promotor cuando los elementos se invierten o se mueven unos con respecto a los otros. En el promotor de timidina cinasa (tk), la separación entre los elementos promotores se puede aumentar a 50 pb de separación antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden actuar de manera cooperativa o independiente para activar la transcripción.

Un ejemplo de un promotor es la secuencia promotora de citomegalovirus (CMV) temprana inmediata. Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte capaz de impulsar altos niveles de expresión de cualquier secuencia polinucleotídica unida operativamente a la misma. Sin embargo, también se pueden usar otras secuencias promotoras constitutivas, incluyendo, pero sin limitación, promotor temprano del virus de los simios 40 (SV40), virus de tumor mamario de ratón (MMTV), promotor de repetición terminal larga (LTR) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), promotor de MoMuLv, un promotor del virus de la leucemia aviar, un promotor temprano inmediato del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor del factor de elongación-1a, así como promotores de genes humanos tales como, pero sin limitación, el promotor de actina, el promotor de miosina, el promotor de hemoglobina y el promotor de creatina cinasa. Adicionalmente, la divulgación no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. Los promotores inducibles también se contemplan como parte de la divulgación. El uso de un promotor inducible proporciona un interruptor molecular capaz de activar la expresión de la secuencia polinucleotídica que está unida operativamente cuando se desea dicha expresión o inactivar la expresión cuando no se desea la expresión. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero sin limitación, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina.

Para evaluar la expresión de un polipéptido CAAR o porciones del mismo, el vector de expresión que se introducirá en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen indicador o ambos para facilitar la identificación y selección de células con expresión de la población de células que se busca transfectar o infectar a través de vectores víricos. En otros aspectos, el marcador seleccionable puede transportarse en una pieza separada de ADN y puede usarse en un procedimiento de cotransfección. Tanto los marcadores seleccionables como los genes indicadores pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras adecuadas para permitir la expresión en las células hospedadoras. Los marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tales como neo y similares.

Se usan genes indicadores para identificar células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen indicador es un gen que no está presente en ni es expresado por el organismo o tejido receptor y que codifica un polipéptido cuya expresión se manifiesta por alguna propiedad fácilmente detectable, p. ej., actividad enzimática. La expresión del gen indicador se evalúa en un momento adecuado después de que el ADN se haya introducido en las células receptoras. Los genes indicadores adecuados pueden incluir genes que codifican la luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína verde fluorescente (p. ej., Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Los sistemas de expresión adecuados son bien conocidos y se pueden preparar usando técnicas conocidas o se pueden obtener comercialmente. En general, la construcción con la región mínima flanqueante 5' que muestra el nivel de expresión más alto del gen indicador se identifica como el promotor. Dichas regiones promotoras pueden estar vinculadas a un gen indicador y pueden usarse para evaluar la capacidad de los agentes de modular la transcripción impulsada por el promotor.

Los métodos para introducir y expresar genes en una célula son conocidos en la técnica. En el contexto de un vector de expresión, el vector se puede introducir fácilmente en una célula hospedadora, p. ej., una célula de mamífero, bacteriana, de levadura o de insecto por cualquier método en la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión se puede transferir a una célula hospedadora por medios físicos, químicos o biológicos.

Los métodos físicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sam brook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY).

Los métodos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula hospedadora incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores de ARN incluyen vectores que tienen un promotor de ARN y/otros dominios relevantes para la producción de un transcrito de ARN. Los vectores víricos, y especialmente los vectores retrovíricos, se han convertido en el método más utilizado para insertar genes en células de mamíferos, p. ej., humanas. Otros vectores víricos pueden provenir de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple, adenovirus y virus adenoasociados, y similares. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n.° 5.350.674 y 5.585.362. Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas a base de lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal ilustrativo para su uso como vehículo de suministro in vitro e in vivo es un liposoma (p. ej., una vesícula de membrana artificial). En el caso en el que se utilice un sistema de suministro no vírico, un vehículo de suministro ilustrativo es un liposoma. Se contempla el uso de formulaciones lipídicas para la introducción de los ácidos nucleicos en una célula hospedadora (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado con un lípido. El ácido nucleico asociado con un lípido puede estar encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, intercalado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, unido a un liposoma a través de una molécula de enlace que está asociada tanto con el liposoma como con el oligonucleótido, inmovilizado en un liposoma, en complejo con un liposoma, disperso en una solución que contiene un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o en complejo con una micela o asociado de otro modo con un lípido. Las composiciones asociadas a lípidos, lípidos/ADN o lípidos/vectores de expresión no están limitadas a ninguna estructura determinada en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de bicapa, como micelas, o con una estructura "colapsada". También pueden simplemente entremezclarse en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes en tamaño o forma. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos naturales o sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotas de grasa que se dan de manera natural en el citoplasma, así como la clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.

Se pueden obtener lípidos adecuados para su uso de fuentes comerciales. Por ejemplo, se puede obtener dimiristil fosfatidilcolina ("D^mP^c") de Sigma, San Luis, MO; se puede obtener fosfato de dicetilo ("DCP") de K & K Laboratories (Plainview, NY); se puede obtener colesterol ("Choi") de Calbiochem-Behring; el dimiristilfosfatidilglicerol ("DMPG") y otros lípidos se pueden obtener de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.). Las soluciones de reserva de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol se pueden almacenar a aproximadamente -20 °C. Se usa cloroformo como el único disolvente ya que se evapora más fácilmente que el metanol. "Liposoma" es un término genérico que abarca diversos vehículos lipídicos simples y multilamelares formados por la generación de bicapas o agregados lipídicos cerrados. Los liposomas se pueden caracterizar por tener estructuras vesiculares con una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por medio acuoso. Se forman de manera espontánea cuando se suspenden fosfolípidos en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se reorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Sin embargo, también se incluyen composiciones que tienen diferentes estructuras en solución que la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas lipídicas. También se contemplan complejos de lipofectamine-ácido nucleico. Células que comprenden el CAAR

En otro aspecto, la invención incluye una célula genéticamente modificada, tal como una célula T colaboradora, una célula T citotóxica, una célula T de memoria, una célula T reguladora, una célula T gamma delta, un linfocito citolítico natural, un linfocito citolítico inducido por citocinas, una línea celular del mismo, y otra célula efectora, comprende un receptor de autoanticuerpos quimérico (CAAR), en donde el CAAR comprende un dominio extracelular que comprende un autoantígeno o fragmento del mismo, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. En una realización, la célula genéticamente modificada comprende el CAAR descrito en el presente documento.

En otra realización, la célula expresa el CAAR. En la presente realización, la célula tiene una alta afinidad por los autoanticuerpos expresados en las células B. Como resultado, la célula puede inducir la muerte de las células B que expresan los autoanticuerpos. En otra realización más, la célula tiene baja afinidad por los anticuerpos unidos a un receptor Fc.

En otra realización, la célula modificada genéticamente es una célula T. En la presente realización, la célula T expresa un CAAR de Dsg3. En la presente realización, el autoantígeno comprende Dsg3 o un fragmento del mismo y la célula T tiene una alta afinidad por los autoanticuerpos de Dsg3 expresados en células B. Como resultado, la célula T puede inducir la muerte de células B que expresan autoanticuerpos Dsg3. En otra realización más, el autoantígeno comprende Dsg3 y la célula T tiene baja afinidad por los anticuerpos Dsg3 unidos a un receptor Fc. También es útil que la célula T tenga una toxicidad limitada hacia las células sanas y especificidad para las células que expresan autoanticuerpos. Tal especificidad previene o reduce la toxicidad inespecífica que prevalece en las terapias actuales que no son específicas para los autoanticuerpos. En una realización, la célula T tiene una toxicidad limitada hacia las células sanas.

La divulgación incluye células T, tales como las células primarias, células T expandidas obtenidas de células T primarias, células T obtenidas de células madre diferenciadas in vitro, líneas de células T como las células Jurkat, otras fuentes de células T, combinaciones de las mismas y otras células efectoras. Por ejemplo, se puede usar una línea celular Jurkat transducida con un elemento de respuesta NFAT seguido de GFP para detectar y aislar células B específicas de Dsg3 y para clonar el repertorio de anticuerpos específicos de Dsg3 de una manera integral e imparcial. Las células B y Jurkat que interactúan pueden detectarse como dobletes positivos para GFP y clasificarse mediante citometría de flujo. La clonación de expresión de los genes que codifican el receptor de células B proporcionará más información sobre cómo se desarrollan la autoinmunidad y los autoanticuerpos en el pénfigo, como el pénfigo vulgar, pénfigo paraneoplásico o pénfigo foliáceo y otras enfermedades autoinmunes.

La capacidad funcional de los CAAR para unirse a autoanticuerpos y sueros, p. ej., pero sin limitación, sueros de pénfigo vulgar, ha sido evaluado en una línea celular indicadora Jurkat, que depende de la activación del CAAR mediante la unión al autoanticuerpo (en respuesta a lo cual las células activadas emiten una fluorescencia verde debido a una construcción indicadora NFAT-GFP contenida en el mismo). Dichos métodos son medidas cualitativas útiles y fiables para la capacidad de unión funcional. El procesamiento adecuado del autoantígeno en la superficie celular también es importante y puede medirse usando anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, como se describen en el presente documento, una dilución en serie de células de hibridoma anti-Dsg3 (AK23) mostró una respuesta dependiente de la dosis de las células Jurkat transducidas al autoanticuerpo de Dsg3 que presenta hibridoma y ninguna activación por células B humanas primarias sanas o no específicas de Dsg3. Asimismo, las células T primarias transducidas con el CAAR demuestran la muerte específica de AK23. Asimismo, los truncamientos de Dsg3 basados en epítopos de enfermedades principales también son útiles y se incluyen en el presente documento. Las versiones truncadas que utilizan una región de bisagra más pequeña también son útiles. Con respecto a la seguridad, se prefiere prevenir o reducir las posibles interacciones hemofílicas y heterofílicas y la activación (por ejemplo, Dsg3-Dsg3) entre las células transducidas o hacia los queratinocitos.

Se puede realizar una evaluación adicional de la eficacia y seguridad del CAAR, p. ej., de la siguiente manera: Las construcciones se pueden transfectar transitoriamente en células humanas, como 293T/17. La expresión de superficie se puede detectar con anticuerpos monoclonales (ya sea IgG o ScFv) específicos para los dominios extracelulares mencionados anteriormente 1,2,3,4,5, el enlazador entre los dominios u otra estructura incluida en el CAAR. La unión puede verificarse con anticuerpos secundarios específicos y cuantificarse mediante citometría de flujo.

En el presente documento se describe la producción de construcciones expresadas en membrana de anticuerpos humanos anti-desmogleína 3 del isotipo IgM e IgG1, que se expresan en células K562 negativas para MHCI (ATCC CCL-243). Estas células pueden servir como células diana para probar los diferentes Dsg3-CAAR.

Las construcciones CAAR mencionadas anteriormente son compatibles con partículas lentivíricas derivadas de VIH-1 pseudotipadas de VSV-G y pueden expresarse permanentemente en células T humanas primarias de donantes sanos usando transducción lentivírica. La eficacia de destrucción se puede determinar en un ensayo de lisis celular basado en cromo o cualquier ensayo similar conocido en la técnica.

Se pueden producir líneas celulares diana adicionales según sea necesario mediante la expresión de anticuerpos monoclonales humanos en la superficie de las células K562.

Se podría aplicar un enfoque similar al anterior a la desmogleína 1, contra la cual se encuentran anticuerpos en las formas mucocutáneas de pénfigo vulgar o pénfigo foliáceo. También se puede aplicar un enfoque similar al dominio NC16A de BP180 (colágeno tipo XVII), que es la principal diana antigénica de los autoanticuerpos en el penfigoide ampolloso; los dominios NC1 y NC2 del colágeno tipo VII, que es direccionada por los autoanticuerpos en la epidermólisis ampollosa adquirida; o tranglutaminasa tisular/péptido de gliadina/transglutaminasa epidérmica, que es direccionada por los complejos de autoanticuerpos en la enfermedad celíaca y la dermatitis herpetiforme.

Enfermedades autoinmunes

La presente invención también proporciona métodos para prevenir, tratar y/o manejar un trastorno asociado con células que expresan autoanticuerpos (por ejemplo, una enfermedad autoinmune). Los métodos comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una célula T con CAAR desvelada en el presente documento que se une a la célula que expresa el autoanticuerpo. En un aspecto, el sujeto es un ser humano. Los ejemplos no limitantes de trastornos asociados con células que expresan autoanticuerpos incluyen trastornos autoinmunitarios (tales como pénfigo vulgar, pénfigo paraneoplásico o pénfigo foliáceo).

La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir, tratar y/o manejar una enfermedad autoinmune asociada con células que expresan autoanticuerpos. Los métodos comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una célula T con CAAR desvelada en el presente documento que se une a la célula que expresa el autoanticuerpo. En una realización, el sujeto se somete a plasmaféresis u otro tratamiento clínico para eliminar o disminuir los anticuerpos en el suero del sujeto. El método para eliminar o disminuir los anticuerpos séricos, tales como autoanticuerpos, puede incluir métodos químicos u otros conocidos en la técnica. El método de tratamiento puede ser específico del autoanticuerpo o generalizado para cualquier anticuerpo. En una realización, el sujeto es un ser humano. Los ejemplos no limitantes de enfermedades asociadas con células que expresan autoanticuerpos incluyen autoanticuerpos de desmogleína 3 y similares.

En los métodos de tratamiento, las células T aisladas de un sujeto se pueden modificar para expresar el CAAR apropiado, expandir ex vivo y luego reinfundir en el sujeto. Las células T modificadas reconocen las células diana, como las células B específicas de Dsg3, y se activan, dando como resultado la muerte de las células diana autoinmunes.

La recaída también puede ocurrir en pacientes con una enfermedad autoinmune, por ejemplo en pacientes con pénfigo. En pacientes tratados con rituximab, la recaída puede estar mediada por la persistencia de los mismos clones de células B autoanticuerpos, mientras que la remisión se asocia con la desaparición de estos clones. Al infundir células T con CAAR, las células autoinmunes se depletan para inducir una remisión a largo plazo, posiblemente debido a la longevidad de las células T con CAAR y/o los clones reactivos a autoantígenos no reaparecen (es decir, en pénfigo vulgar, pénfigo paraneoplásico o pénfigo foliáceo, la rotura de la tolerancia es un error de una sola vez).

Para monitorear las células que expresan CAAR in vitro, in situ, o in vivo, las células con CAAR pueden expresar además un marcador detectable. Cuando el CAAR une a la diana, el marcador detectable se activa y expresa, lo que puede detectarse mediante ensayos conocidos en la técnica, tales como la citometría de flujo. En una realización, el Dsg3-CAAR incluye un elemento de respuesta NFAT y un marcador detectable, tal como una proteína verde fluorescente (GFP), para detectar y cuantificar células que expresan CAAR de Dsg3.

Fuentes de células T

Antes de la expansión y modificación genética, Las células T se obtienen de un sujeto. Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. Se pueden obtener linfocitos T de varias fuentes, incluida la piel, células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En ciertas realizaciones, cualquier número de líneas de células T disponible en la técnica, puede ser usado. En ciertas realizaciones, se pueden obtener linfocitos T de una unidad de sangre recogida de un sujeto usando cualquiera de varias técnicas conocidas por el experto en la materia, tales como la separación con Ficoll™. En una realización preferida, se obtienen células de la sangre en circulación de un individuo por aféresis. El producto de aféresis normalmente contiene linfocitos, incluyendo linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En una realización, las células recogidas por aféresis se pueden lavar para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio adecuado para las etapas de procesamiento posteriores. En una realización, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En una realización alternativa, la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos, si no todos, los cationes divalentes. De nuevo, sorprendentemente, las etapas iniciales de activación en ausencia de calcio conducen a un aumento de la activación. Como apreciarán fácilmente los expertos en la materia, se puede realizar una etapa de lavado mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, tal como mediante el uso de una centrífuga semiautomática de "flujo continuo" (por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991, el Baxter CytoMate o el Haemonetics Cell Saver 5) según las instrucciones del fabricante. Tras el lavado, las células se pueden resuspender en diversos tampones biocompatibles, tales como, por ejemplo, PBS sin Ca, sin Mg, PlasmaLyte A u otra solución salina con o sin tampón. Como alternativa, los componentes indeseables de la muestra de aféresis se pueden eliminar y las células se pueden resuspender directamente en medios de cultivo.

En otra realización, los linfocitos T se aíslan de linfocitos de sangre periférica lisando los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente PERCOLL™ o mediante elutriación centrífuga a contraflujo. Una subpoblación específica de linfocitos T, tal como CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y células T CD45RO+, puede aislarse adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, en una realización, se aíslan células T mediante incubación con perlas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 (es decir, 3x28), tales como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un periodo de tiempo suficiente para la selección positiva de los linfocitos T deseados. En una realización, el periodo de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En una realización adicional, el periodo de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más y todos los valores enteros entre ellos. En una realización adicional, el periodo de tiempo es de al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En otra realización preferida más, el periodo de tiempo es de 10 a 24 horas. En una realización preferida, el periodo de tiempo de incubación es de 24 horas. Para el aislamiento de linfocitos T de pacientes con leucemia, el uso de tiempos de incubación más largos, tales como 24 horas, puede aumentar el rendimiento celular. Se pueden usar tiempos de incubación más largos para aislar linfocitos T en cualquier situación en la que haya pocos linfocitos T en comparación con otros tipos de células, tal como en el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de tejido tumoral o de individuos inmunodeprimidos. Adicionalmente, el uso de tiempos de incubación más largos puede aumentar la eficiencia de captura de linfocitos T CD8+. Por tanto, simplemente acortando o alargando el tiempo que se permite que los linfocitos T se unan a las perlas CD3/CD28 y/o aumentando o disminuyendo la relación de perlas con respecto a linfocitos T (como se describe más adelante en el presente documento), las subpoblaciones de linfocitos T pueden seleccionarse preferentemente positiva o negativamente al inicio del cultivo o en otros momentos durante el proceso. Adicionalmente, aumentando o disminuyendo la relación de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, las subpoblaciones de linfocitos T pueden seleccionarse preferentemente positiva o negativamente al inicio del cultivo o en otros momentos deseados. El experto en la materia reconocerá que también se pueden usar múltiples ciclos de selección en el contexto de la presente divulgación. En ciertas realizaciones, puede ser deseable realizar el procedimiento de selección y usar las células "no seleccionadas" en el proceso de activación y expansión. Las células "no seleccionadas" también pueden someterse a ciclos adicionales de selección.

El enriquecimiento de una población de linfocitos T por selección negativa se puede lograr con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie únicos para las células seleccionadas negativamente. Un método es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que usa una mezcla de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer las células CD4+ por selección negativa, una mezcla de anticuerpos monoclonales incluye normalmente anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En ciertas realizaciones, puede ser deseable enriquecer o seleccionar positivamente las células T reguladoras que normalmente expresan CD4+, CD25+, CD62Lalto, GITR+ y FoxP3+. Como alternativa, en ciertas realizaciones, los linfocitos T reguladores se agotan mediante perlas conjugadas anti-C25 u otro método similar de selección.

Para el aislamiento de una población deseada de células mediante selección positiva o negativa, la concentración de células y superficie (p. ej., partículas tales como perlas) puede variar. En ciertas realizaciones, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan las perlas y las células (es decir, aumentar la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de células y perlas. Por ejemplo, en una realización, se usa una concentración de 2 mil millones de células/ml. En una realización, se usa una concentración de 1 mil millones de células/ml. En una realización adicional, se usan más de 100 millones de células/ml. En una realización adicional, se usa una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En otra realización más, se usa una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En realizaciones adicionales, se pueden usar concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de altas concentraciones puede dar lugar a un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Adicionalmente, el uso de altas concentraciones celulares permite una captura más eficaz de células que pueden expresar débilmente los antígenos diana de interés, tales como células T CD28 negativas, o de muestras donde hay muchas células tumorales presentes (es decir, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Dichas poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de alta concentración de células permite una selección más eficiente de linfocitos T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

En una realización relacionada, puede ser deseable usar concentraciones más bajas de células. Al diluir significativamente la mezcla de linfocitos T y la superficie (p. ej., partículas tales como perlas), las interacciones entre las partículas y las células se minimizan. Esto selecciona las células que expresan altas cantidades de antígenos deseados para unirse a las partículas. Por ejemplo, las células T CD4+ expresan niveles más altos de CD28 y se capturan más eficazmente que las células T CD8+ en concentraciones diluidas. En una realización, la concentración de células usada es de 5x 106/ml. En otras realizaciones, la concentración usada puede ser de aproximadamente 1 X 105/ml a 1 X 106/ml y cualquier valor entero intermedio.

En otras realizaciones, las células se pueden incubar en un rotador durante periodos de tiempo variables a velocidades variables a 2-10 °C o a temperatura ambiente.

Los linfocitos T para la estimulación también se pueden congelar después de una etapa de lavado. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, la etapa de congelación y descongelación posterior proporciona un producto más uniforme al eliminar los granulocitos y, en cierta medida, los monocitos en la población celular. Después de la etapa de lavado que elimina el plasma y las plaquetas, las células se pueden suspender en una solución de congelación. Aunque muchas soluciones y parámetros de congelación se conocen en la técnica y serán útiles en este contexto, un método implica el uso de PBS que contiene 20 % de DMSO y 8 % de albúmina de suero humano, o medios de cultivo que contienen 10 % de dextrano 40 y 5 % de dextrosa, 20 % de seroalbúmina humana y 7,5 % de DMSO, o 31,25 % de Plasmalyte-A, 31,25 % de dextrosa 5 %, 0,45 % de NaCl, 10 % de dextrano 40 y 5 % de dextrosa, 20 % de seroalbúmina humana y 7,5 % de DMSO u otro medio de congelación celular adecuado que contenga, por ejemplo, Hespan y PlasmaLyte A, después, las células se congelan a -80 °C a una velocidad de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Se pueden usar otros métodos de congelación controlada, así como la congelación no controlada inmediatamente a -20 °C o en nitrógeno líquido.

En ciertas realizaciones, las células crioconservadas se descongelan y lavan como se describe en el presente documento y se dejan reposar durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación usando los métodos de la presente invención.

También se contempla en el contexto de la divulgación la recogida de muestras de sangre o producto de aféresis de un sujeto en un periodo de tiempo anterior a cuando las células expandidas como se describen en el presente documento podrían ser necesarias. Como tal, la fuente de las células que se van a expandir se puede recoger en cualquier momento necesario, y las células deseadas, tales como linfocitos T, se aíslan y congelan para su uso posterior en la terapia con linfocitos T para cualquiera de varias enfermedades o afecciones que se beneficiarían de la terapia con linfocitos T, tales como las descritas en el presente documento. En una realización, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano. En ciertas realizaciones, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto en general sano que está en riesgo de desarrollar una enfermedad, pero que aún no ha desarrollado una enfermedad, y las células de interés se aíslan y congelan para su uso posterior. En ciertas realizaciones, los linfocitos T pueden expandirse, congelarse y utilizarse en un momento posterior. En ciertas realizaciones, se recogen muestras de un paciente poco después del diagnóstico de una enfermedad determinada como se describe en el presente documento pero antes de cualquier tratamiento. En una realización adicional, las células se aíslan de una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto antes de cualquiera de varias modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, pero sin limitación, el tratamiento con agentes tales como natalizumab, efalizumab, agentes antivíricos, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3, cytoxan, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228 e irradiación. Estos fármacos inhiben la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66: 807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73: 316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5: 763-773, 1993). En una realización adicional, las células se aíslan para un paciente y se congelan para su uso posterior junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) trasplante de médula ósea o de células madre, terapia ablativa de linfocitos T usando agentes quimioterapéuticos tales como, fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En otra realización, las células se aíslan antes y se pueden congelar para su uso posterior para el tratamiento después de la terapia ablativa de células B, p. ej., Rituxan.

En una realización adicional, se obtienen linfocitos T de un paciente directamente después del tratamiento. A este respecto, se ha observado que después de determinados tratamientos contra el cáncer, en particular, tratamientos con fármacos que dañan el sistema inmunitario, poco después del tratamiento durante el periodo en el que los pacientes normalmente se estarían recuperando del tratamiento, la calidad de los linfocitos T obtenidos puede ser óptima o mejorada para su capacidad de expandirse ex vivo. De manera análoga, tras la manipulación ex vivo usando los métodos descritos en el presente documento, estas células pueden estar en un estado preferido para un injerto mejorado y expansión in vivo. Por tanto, se contempla dentro del contexto de la presente divulgación recolectar células sanguíneas, incluyendo linfocitos T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Adicionalmente, en ciertas realizaciones, se pueden usar movilización (por ejemplo, la movilización con GM-CSF) y regímenes de acondicionamiento para crear una condición en un sujeto en donde la repoblación, recirculación, regeneración y/o expansión de determinados tipos celulares se favorece, especialmente durante una ventana de tiempo definida después de la terapia. Los tipos de células ilustrativas incluyen linfocitos T, linfocitos B, células dendríticas y otras células del sistema inmunitario.

Activación y expansión de linfocitos T

Los linfocitos T se activan y expanden en general usando métodos como se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 20060121005.

En general, las células T desveladas en el presente documento se expanden por contacto con una superficie que se une a un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de los linfocitos T. En particular, las poblaciones de linfocitos T se pueden estimular como se describe en el presente documento, tal como por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de proteína cinasa C (p. ej., briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de los linfocitos T, se utiliza un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de linfocitos T se puede poner en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones adecuadas para estimular la proliferación de los linfocitos T. Para estimular la proliferación de células T CD4+ o células T CD8+, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Los ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besan ôn, Francia) se pueden utilizar al igual que otros métodos habitualmente conocidos en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30 (8): 3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227 (1-2): 53-63, 1999).

En ciertas realizaciones, la señal estimulante primaria y la señal coestimulante para los linfocitos T se pueden proporcionar por diferentes protocolos. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada señal pueden estar en solución o acoplados a una superficie. Cuando se acoplan a una superficie, los agentes se pueden acoplar a la misma superficie (es decir, en formación "cis") o a superficies separadas (es decir, en formación "trans"). Como alternativa, un agente puede estar acoplado a una superficie y el otro agente en solución. En una realización, el agente que proporciona la señal coestimulante está unido a una superficie celular y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en solución o acoplado a una superficie. En ciertas realizaciones, ambos agentes pueden estar en solución. En otra realización, los agentes pueden estar en forma soluble y después reticulados en una superficie, tal como una célula que expresa receptores de Fc o un anticuerpo u otro agente de unión que se unirá a los agentes. A este respecto, véase, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 20040101519 y 20060034810 para células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC) que se contemplan para su uso en la activación y expansión de linfocitos T.

En una realización, los dos agentes están inmovilizados en perlas, ya sea en la misma perla, es decir, en cis, o en perlas separadas, es decir, en trans. A modo de ejemplo, el agente que proporciona la señal de activación primaria es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente que proporciona la señal coestimulante es un anticuerpo anti-CD28 o fragmento de unión a antígeno del mismo; y ambos agentes se inmovilizan conjuntamente en la misma perla en cantidades moleculares equivalentes. En una realización, se usa una proporción de 1:1 de cada anticuerpo unido a las perlas para expansión de células T CD4+ y crecimiento de células T. En determinados aspectos de la presente divulgación, se usa una relación de anticuerpos anti-CD3:CD28 unidos a las perlas de manera que se observa un aumento en la expansión de linfocitos T en comparación con la expansión observada usando una relación de 1:1. En una realización particular, se observa un aumento de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces en comparación con la expansión observada usando una proporción de 1:1. En una realización, la proporción de anticuerpo CD3:CD28 unido a las perlas varía de 100:1 a 1:100 y todos los valores enteros entre ellos. En un aspecto, se une más anticuerpo anti-CD28 a las partículas que anticuerpo anti-CD3, es decir, la relación de CD3:CD28 es menor de uno. En ciertas realizaciones, la relación de anticuerpo anti-CD28 con respecto a anticuerpo anti-CD3 unido a las perlas es mayor de 2:1. En una realización particular, se usa una relación de CD3:CD28 1:100 de anticuerpo unido a perlas. En otra realización, se usa una relación de CD3:CD28 1:75 de anticuerpo unido a perlas. En una realización adicional, se usa una relación de CD3:CD28 1:50 de anticuerpo unido a perlas. En otra realización, se usa una relación de CD3:CD28 1:30 de anticuerpo unido a perlas. En una realización preferida, se usa una relación de CD3:CD281:10 de anticuerpo unido a perlas. En otra realización, se usa una relación de CD3:CD28 1:3 de anticuerpo unido a las perlas. En otra realización más, se usa una relación de CD3:CD283:1 de anticuerpo unido a las perlas.

Las relaciones de partículas con respecto a células de 1:500 a 500:1 y cualquier valor entero en el medio se puede usar para estimular linfocitos T u otras células diana. Como pueden apreciar fácilmente los expertos habituales en la materia, la relación de partículas con respecto a células puede depender del tamaño de partícula en relación con la célula diana. Por ejemplo, las perlas de pequeño tamaño solo podrían unirse a algunas células, mientras que perlas mayores podrían unirse a muchas. En ciertas realizaciones, la proporción de células frente a partículas varía de 1:100 a 100:1 y cualquier valor entero intermedio y en realizaciones adicionales, la proporción comprende 1:9 a 9:1 y cualquier valor entero intermedio, también se puede usar para estimular linfocitos T. La relación de partículas acopladas anti-CD3 y anti-CD28 frente a linfocitos T que dan lugar a la estimulación de linfocitos T puede variar como se ha indicado anteriormente, sin embargo, determinados valores preferidos incluyen 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 y 15:1 con una relación preferida de al menos 1:1 partículas por linfocito T. En una realización, se usa una relación de partículas frente a células de 1:1 o menos. En una realización particular, una partícula preferida: la proporción de células es 1:5. En realizaciones adicionales, la relación de partículas con respecto a células puede variar dependiendo del día de la estimulación. Por ejemplo, en una realización, la relación de partículas con respecto a células es de 1:1 a 10:1 el primer día y se añaden partículas adicionales a las células todos los días o cada dos días a partir de entonces durante un máximo de 10 días, a relaciones finales de 1:1 a 1:10 (basado en recuentos celulares el día de la adición). En una realización particular, la relación de partículas con respecto a células es de 1:1 el primer día de estimulación y ajustada a 1:5 el tercer y quinto día de estimulación. En otra realización, se añaden partículas diariamente o cada dos días en una relación final de 1:1 el primer día y 1:5 el tercer y quinto día de estimulación. En otra realización, la relación de partículas con respecto a células es de 2:1 el primer día de estimulación y ajustada a 1:10 el tercer y quinto día de estimulación. En otra realización, las partículas se añaden diariamente o cada dos días a una relación final de 1:1 el primer día y 1:10 el tercer y quinto día de estimulación. Un experto en la materia apreciará que una variedad de otras proporciones puede ser adecuada para su uso en la presente divulgación. En particular, las relaciones variarán dependiendo del tamaño de partícula y del tamaño y tipo de célula.

En realizaciones adicionales, las células, tales como linfocitos T, se combinan con perlas recubiertas de agente, las perlas y las células se separan posteriormente y después las células se cultivan. En una realización alternativa, antes del cultivo, las perlas y las células recubiertas con agente no se separan sino que se cultivan juntas. En una realización adicional, las perlas y las células se concentran primero mediante la aplicación de una fuerza, tal como una fuerza magnética, que da lugar a un aumento de la fijación de marcadores de la superficie celular, induciendo de este modo la estimulación celular.

A modo de ejemplo, las proteínas de la superficie celular pueden ligarse permitiendo que las perlas paramagnéticas a las que se unen los anti-CD3 y anti-CD28 (3x28 perlas) entren en contacto con los linfocitos T. En una realización, las células (por ejemplo, de 104 a 109 células T) y las perlas (por ejemplo, perlas paramagnéticas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T en una proporción de 1:1) se combinan en un tampón, por ejemplo PBS (sin cationes divalentes como calcio y magnesio). De nuevo, los expertos en la materia pueden apreciar fácilmente que se puede usar cualquier concentración celular. Por ejemplo, la célula diana puede ser muy infrecuente en la muestra y comprender solo el 0,01 % de la muestra o toda la muestra (es decir, el 100 %) puede comprender la célula diana de interés. Por consiguiente, cualquier número de células está dentro del contexto de la presente divulgación. En ciertas realizaciones, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan las partículas y las células (es decir, aumentar la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de células y partículas. Por ejemplo, en una realización, se usa una concentración de aproximadamente 2 mil millones de células/ml. En otra realización, se usan más de 100 millones de células/ml. En una realización adicional, se usa una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En otra realización más, se usa una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En realizaciones adicionales, se pueden usar concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de altas concentraciones puede dar lugar a un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Adicionalmente, el uso de altas concentraciones celulares permite una captura más eficaz de células que pueden expresar débilmente los antígenos diana de interés, tales como los linfocitos T CD28 negativos. Dichas poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas en ciertas realizaciones. Por ejemplo, el uso de alta concentración de células permite una selección más eficiente de linfocitos T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

En una realización, la mezcla se puede cultivar durante varias horas (aproximadamente 3 horas) a aproximadamente 14 días o cualquier valor entero de horas intermedio. En otra realización, la mezcla se puede cultivar durante 21 días. En una realización, las perlas y las células T se cultivan juntos durante aproximadamente ocho días. En otra realización, las perlas y los linfocitos T se cultivan juntos durante 2-3 días. También pueden desearse varios ciclos de estimulación de modo que el tiempo de cultivo de los linfocitos T pueda ser de 60 días o más. Las condiciones adecuadas para el cultivo de linfocitos T incluyen un medio adecuado (p. ej., medio mínimo esencial o medio RPMI 1640 o, X-vivo 15, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y la viabilidad, incluyendo suero (p. ej., suero bovino fetal o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-^y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFp y TNF-a o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocido por el experto en la materia. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero sin limitación, tensioactivo, plasmanato, y agentes reductores tales como N-acetil-cisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o complementados con una cantidad adecuada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina o citocinas suficiente para el crecimiento y la expansión de los linfocitos T. Los antibióticos, p. ej., penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se van a infundir en un sujeto. Las células diana se mantienen en condiciones necesarias para apoyar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (p. ej., 37 °C) y atmósfera (p. ej., aire más CO²al 5 %) adecuadas.

Los linfocitos T que se han expuesto a tiempos de estimulación variados pueden presentar características diferentes. Por ejemplo, los productos de células mononucleares de sangre periférica sometida a aféresis o típica tienen una población de linfocitos T auxiliares (T^h, CD4+) que es mayor que la población de células T citotóxicas o supresoras (Tc, CD8+). La expansión ex vivo de linfocitos T mediante la estimulación de los receptores CD3 y CD28 produce una población de linfocitos T que antes de aproximadamente los días 8-9 consiste predominantemente en linfocitos T^h, mientras que después de aproximadamente los días 8-9, la población de células T comprende una población cada vez mayor de células Tc. Por consiguiente, dependiendo del fin del tratamiento, puede ser ventajoso infundir a un sujeto con una población de linfocitos T que comprende predominantemente linfocitos T^h. De manera similar, si se ha aislado un subconjunto específico de antígeno de linfocitos T^c, puede ser beneficioso expandir este subconjunto en mayor grado.

Adicionalmente, además de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían significativamente, pero, en gran parte, de manera reproducible durante el trascurso del proceso de expansión celular. Por tanto, dicha reproducibilidad permite la capacidad de personalizar un producto de linfocitos T activados para fines específicos. Aplicación terapéutica

En un aspecto, la divulgación incluye un método para tratar una enfermedad autoinmune en un sujeto. El método comprende: administrar al sujeto una cantidad eficaz de una célula T modificada genéticamente que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de autoanticuerpo quimérico (CAAR), donde la secuencia de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de ácido nucleico de un dominio extracelular que comprende un autoantígeno o fragmento del mismo, una secuencia de ácido nucleico de un dominio transmembrana y una secuencia de ácido nucleico de un dominio de señalización intracelular, tratando así la enfermedad autoinmune en el sujeto.

En una realización, la enfermedad autoinmune se selecciona de pénfigo vulgar pénfigo paraneoplásico o pénfigo foliáceo. En otra realización, el sujeto es un ser humano.

Sin desear quedar ligados a teoría particular alguna, la respuesta inmune de anti-autoanticuerpos inducida por las células T modificadas con CAAR puede ser una respuesta inmunitaria activa o pasiva. En otra realización más, la célula T modificada se dirige a una célula B. Por ejemplo, las células B que expresan autoanticuerpos pueden ser susceptibles de destrucción indirecta por linfocitos T redirigidos por CAAR que han reaccionado previamente contra células adyacentes que expresan autoanticuerpos.

En una realización, las células T modificadas con CAAR completamente humanos pueden ser un tipo de vacuna para inmunización ex vivo y/o terapia in vivo en un mamífero. En una realización, el mamífero es un ser humano. Con respecto a la inmunización ex vivo, se produce in vivo al menos uno de los siguientes antes de administrar la célula a un mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico que codifica un CAAR a las células o iii) crioconservación de las células.

Los procedimientos ex vivo son bien conocidos en la técnica y se analizan más detalladamente a continuación. En resumen, las células se aíslan de un mamífero (por ejemplo, un ser humano) y se modifican genéticamente (es decir, se transducen o transfectan in vitro) con un vector que expresa un CAAR desvelado en el presente documento. La célula modificada con CAAR se puede administrar a un receptor de mamífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El receptor de mamífero puede ser humano y la célula modificada con CAAR puede ser autóloga con respecto al receptor. Como alternativa, las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas con respecto al receptor.

El procedimiento para la expansión ex vivo de las células madre y progenitoras hematopoyéticas se describe en la Pat. de EE.UU. N.° 5.199.942, se puede aplicar a las células de la presente divulgación. Otros métodos adecuados son conocidos en la técnica, por lo tanto, la presente divulgación no se limita a ningún método determinado de expansión ex vivo de las células. En resumen, el cultivo y la expansión ex vivo de los linfocitos T comprende: (1) recoger células madre hematopoyéticas CD34+ y células progenitoras de un mamífero de extracción de sangre periférica o explantes de médula ósea; y (2) expandir dichas células ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular descritos en la patente de los Estados Unidos n.° 5.199.942, otros factores tales como flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando c-kit, se pueden usar para el cultivo y la expansión de las células.

Además de usar una vacuna basada en células con respecto a inmunización ex vivo, la presente divulgación también incluye composiciones y métodos para inmunización in vivo para inducir una respuesta inmunitaria dirigida contra un antígeno en un paciente.

En general, las células activadas y expandidas como se describe en el presente documento se pueden utilizar en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en individuos que están inmunocomprometidos. En particular, las células T modificadas con CAAR desveladas en el presente documento se utilizan en el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con la expresión de autoanticuerpos. En ciertas realizaciones, las células desveladas en el presente documento se utilizan en el tratamiento de pacientes con riesgo de desarrollar enfermedades autoinmunes, trastornos y afecciones asociadas con la expresión de autoanticuerpos. Por tanto, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento o la prevención de enfermedades, trastornos y afecciones autoinmunes asociados con la expresión desregulada de aiutoanticuerpos que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de células T modificadas con CAAR.

Las células T modificadas con CAAR de la presente invención se pueden administrar solos o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares. En resumen, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender una población de células diana tal como se describe en el presente documento, en combinación con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender tampones tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; hidratos de carbono tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (p. ej., hidróxido de aluminio); y conservantes. En un aspecto, las composiciones de la presente invención están formuladas para administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de una manera adecuada para la enfermedad que se va a tratar (o prevenir). La cantidad y la frecuencia de la administración estarán determinadas por factores tales como la condición del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque las dosis adecuadas se pueden determinar mediante ensayos clínicos.

Cuando se indica "una cantidad inmunológicamente eficaz", "una cantidad eficaz de anti-autoanticuerpos", "una cantidad eficaz inhibidora de enfermedades autoinmunes" o "cantidad terapéutica", la cantidad precisa de las composiciones desveladas en el presente documento que se va a administrar puede ser determinada por un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales de la edad, el peso, el tamaño del tumor, el grado de infección o metástasis, y la condición del paciente (sujeto). En general, se puede afirmar que una composición farmacéutica que comprende los linfocitos T descritos en el presente documento se puede administrar a una dosis de 104 a 109 células/kg de peso corporal, en algunos casos 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones de linfocitos T también se pueden administrar múltiples veces a estas dosis. Las células se pueden administrar mediante el uso de técnicas de infusión que se conocen habitualmente en inmunoterapia (véase, p. ej., Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). Un experto en la materia de la medicina puede determinar fácilmente la dosis óptima y el régimen de tratamiento para un paciente en particular haciendo un seguimiento del paciente en busca de signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.

En ciertas realizaciones, se administran células T activadas a un sujeto. Posterior a la administración, se vuelve a extraer sangre o se realiza una aféresis, y las células T se activan y expanden a partir de la misma utilizando los métodos descritos en el presente documento, y luego se vuelven a infundir de nuevo al paciente. Este proceso se puede llevar a cabo varias veces cada pocas semanas. En ciertas realizaciones, Los linfocitos T se pueden activar a partir de extracciones de sangre de 10 cm3 a 400 cm3. En ciertas realizaciones, los linfocitos T se activan a partir de extracciones de sangre de 20 cm3, 30 cm3, 40 cm3, 50 cm3, 60 cm3, 70 cm3, 80 cm3, 90 cm3 o 100 cm3. Sin desear quedar ligado a la teoría, usando este protocolo de extracción de sangre múltiple/reinfusión múltiple, se pueden seleccionar determinadas poblaciones de linfocitos T.

La administración de las células desveladas en el presente documento se puede llevar a cabo utilizando cualquier medio conveniente, incluyendo mediante inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar a un paciente por vía transarterial, subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodular, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa (i.v.), o por vía intraperitoneal. En una realización, las composiciones de células T de la presente invención se administran a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En otra realización, las composiciones de linfocitos T de la presente invención se administran por inyección i.v. Las composiciones de linfocitos T se pueden inyectar directamente en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.

En determinadas realizaciones de la presente invención, células activadas y expandidas usando los métodos descritos en el presente documento, u otros métodos conocidos en la técnica donde los linfocitos T se expanden a niveles terapéuticos, se administran a un paciente junto con (p. ej., antes, simultáneamente o después de) cualquiera de varias modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, pero sin limitación, el tratamiento con agentes tales como la terapia antivírica, cidofovir e interleucina-2, el tratamiento con citarabina (también conocido como ARA-C) o natalizumab para pacientes con EM o el tratamiento con efalizumab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con LMP. En realizaciones adicionales, las células T desveladas en el presente documento pueden usarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAM PATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66: 807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73: 316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5: 763-773, 1993). En una realización adicional, las composiciones celulares de la presente invención se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, de manera simultánea o después de) trasplante de médula ósea, terapia ablativa de linfocitos T usando agentes quimioterapéuticos tales como, fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En otra realización, las composiciones celulares de la presente invención se administran después de una terapia ablativa de células B, tal como agentes que reaccionan con CD20, p. ej., Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los sujetos se pueden someter a un tratamiento convencional con altas dosis de quimioterapia seguida de trasplante de células madre de sangre periférica. En ciertas realizaciones, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente invención. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

La dosificación de los tratamientos anteriores que se va a administrar a un paciente variará según la naturaleza precisa de la afección que se está tratando y el receptor del tratamiento. Se puede variar la escala de las dosis para la administración en seres humanos según las prácticas aceptadas en la técnica. La dosis para CAMPATH, por ejemplo, estará, en general, en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, administrado de forma habitual diariamente durante un periodo de entre 1 y 30 días. La dosis diaria preferida es de 1 a 10 mg al día, aunque en algunos casos se pueden usar dosis mayores de hasta 40 mg al día (descrita en la patente de los Estados Unidos n.° 6.120.766).

EJEMPLOS EXPERIMENTALES

La invención se describe adicionalmente en detalle por referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan solo con fines ilustrativos y no están destinados a ser limitantes a menos que se especifique lo contrario. Por tanto, la invención no debe interpretarse de ninguna manera como limitada a los siguientes ejemplos, sino que, debe interpretarse que abarca todas y cada una de las variaciones que se hacen evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en el presente documento.

Sin descripción adicional, se cree que un experto en la materia puede, usando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, preparar y utilizar los compuestos de la presente invención y poner en práctica los métodos reivindicados. Los siguientes ejemplos de trabajo, por lo tanto, señalan específicamente las realizaciones preferidas de la presente invención, y no deben interpretarse como limitantes de ninguna manera el resto de la divulgación. Los materiales y métodos usados en la realización de los experimentos desvelados en el presente documento se describen ahora.

Construcciones CAAR

El CAAR de desmogleína 3 (Dsg3) el CAAR se clonó mediante amplificación por PCR a partir de ADNc humano con cebadores específicos

a) para el péptido señal de CD8 alfa humano (fragmento A) (directo: 5'CTAGCAGGATCCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCG (SEQ ID NO: 17) (añadiendo una secuencia Kozak y un sitio de restricción BamHI), inverso: 5'TCTATTCGCAATTCCGGCCTGGCGGCG (SEQ ID NO:18), superpuesto al propéptido de Dsg3 humano),

b) el péptido señal de la bisagra CD8 humana y la región transmembrana (fragmento C) (directo: 5'CTCAGGGAGGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGC (SEQ ID NO: 19) (solapante en 5' de EC5 de Dsg3 humana), reverso: 5'CCCCGTTTGGTGATAACCAGTGACAGGAGAAGG (SEQ ID NO:20) (solapante en 5' en el dominio de transducción de señal de CD137)),

c) el dominio de transducción de señales de CD137 humano (fragmento D) (directo: 5'CTGGTTATCACCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCC (SEQ ID NO:21), inverso: 5'TTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTCTTCTGG (SEQ ID NO: 22) (superposición en el dominio de transducción de señal CD247 humano (también conocido como CD3 zeta)),

d) y el dominio de transducción de señales zeta de CD3 humano (fragmento E) (directo: 5'GATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGC (SEQ ID NO:23), inverso: 5'GGTTGATTGTCGACGCGGATCTTAGCGAGGGGGC (SEQ ID NO: 24) (añadiendo un sitio Sall después del codón de parada TAA)),

e) para la expresión en un plásmido de vector no lentivírico, el sitio BamHI se reemplazó con un sitio Xhol y el sitio SalI se reemplazó con un sitio BamHI.

La secuencia que codifica el exón de Dsg3 humano (fragmento B) se amplificó a partir del plásmido DN653 (un obsequio del Prof. Amagai, Universidad de Keio, Tokio, Japón) con los cebadores directo 5'CCAGGCCGGAATTGCGAATAGAGACTAAAGG (SEQ ID NO: 25) e inverso 5'CGTGGTGGGCTTCCTCCCTGAGTGCGGCC (SEQ ID NO: 26), de modo que se hizo posible una superposición con la secuencia ubicada en 5' del péptido señal de CD8 y la bisagra CD8 localizada en 3'.

Después de verificar el tamaño correcto de los productos de PCR, los fragmentos se purificaron (Promega wizard SV) y se sometieron a PCR de superposición de extensión, uniendo el fragmento A con B así como el C con D. El fragmento unido CD se extendió con otra PCR de superposición-extensión con el fragmento E y finalmente los fragmentos AB y CDE se conjugaron por PCR. Todas las reacciones de PCR se realizaron con polimerasa de inicio en caliente Q5 (New England Biolabs) de acuerdo con la recomendación del fabricante. El producto final de PCR de 2,5 kB de longitud se sometió a una purificación en gel y se digirió con BamHI-Sall (clonación en un plásmido de vector lentivírico) o Xhol-BamHI (clonación en un plásmido de expresión no lentivírico, a saber, pCEP4, life technologies).

Para facilitar la expresión constitutiva bajo un fuerte promotor humano que no es propenso al silenciamiento en las células linfoides, el CAAR de Dsg3 se clonó en un plásmido de vector lentivírico basado en VIH1 de 3a generación, a saber, pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE (addgene 12252). Dado que estudios anteriores habían mostrado una expresión favorable bajo EFIalpha en comparación con el promotor PGK, los presentes inventores amplificaron por PCR el promotor EFIalpha de ADN genómico humano usando los cebadores directo 5'GGATCCTGCTAGACTCACGACACCTGAAATGGAAG (SEQ ID NO:27) e inverso 5' GAGGAGGTCGACATTCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTC (SEQ ID NO:28). El promotor PGK se reemplazó con el promotor EFIalpha digiriendo el producto de PCR con Sall y BamHI y el plásmido con Xhol y BamHI. Los extremos compatibles de Sall y Xhol dan como resultado una deleción de los sitios Xhol y Sall, de modo que el plásmido conserva los sitios únicos BamHI y Sall que flanquean la GFP que fue reemplazada con el CAAR de Dsg3 por digestión y ligación.

Se clonaron versiones abreviadas de CAAR de Dsg3 en la misma estructura principal del plásmido usando BamHI y Sall. Para facilitar la expresión de alta superficie, las versiones abreviadas se optimizaron mediante codones utilizando un algoritmo basado en índices de adaptación de codones (geneart, life technologies) y se sintetizaron como fragmentos de ADN de doble hebra (geneart, life technologies). En estas construcciones, la región de bisagra CD8 se reemplazó con un enlazador GS flexible de 13 aminoácidos de longitud, proporcionando un sitio Nhel único que podría usarse para insertar diferentes fragmentos que codifican Dsg3 entre la secuencia Kozak (con BamHI) y el enlazador GS (con Nhel). El Dsg3 extracelular completo se clonó en este sitio de clonación y, a partir del plásmido derivado, se produjeron varias versiones de Dsg3 con los siguientes cebadores:

BamHI-CD8 péptido señal - Dsg3EC1-5-Nhel:

BamHI.CD8.directo:GAGGAGGAGGGATCCGCCACC (SEQ ID NO:29) EC5.Nhel.inverso:CCTCCGCCGCCGCTAGCTCTGCC (SEQ ID NO:30)

BamHI-CD8 péptido señal - Dsg3EC1-4-Nhel

BamHI.CD8.directo:GAGGAGGAGGGATCCGCCACC (SEQ ID NO:29) EC4.Nhel.inverso:CCTCCGCCGCCGCTAGCCTTTTCCAGCACGGCGG (SEQ ID NO:31)

BamHI-CD8 péptido señal - Dsg3EC1-3-Nhel:

BamHI.CD8.directo:GAGGAGGAGGGATCCGCCACC (SEQ ID NO:29) EC3.Nhel.inverso:TCTCCTCGCTAGCGAAGGCAATGCCC (SEQ ID NO:32)

BamHI-CD8 péptido señal - Dsg3EC1-2-Nhel:

BamHI.CD8.directo:GAGGAGGAGGGATCCGCCACC (SEQ ID NO:29) EC2.Nhel.inverso:TCCGCCGCCGCTAGCCCGGAACATAGGGAAGTTGTCG (SEQ ID NO:33)

Para clonar un CAAR que presente el EC2-3 de Dsg3, el cebador EC3.Nhel. inverso se usó en combinación con un cebador para la secuencia 5' del EC2 (5'AAGCGGCGGCAGAAACGCATCCTGGACATCAACGACAACC) (SEQ ID NO: 34); la secuencia EC2-3 resultante se conjugó por PCR con el péptido señal CD8 (previamente amplificado con el cebador inverso superpuesto 5' GATGCGTTTCTGCCGCCGCTTGGCCTGCTGCATTGTC (SEQ ID NO:35) y el cebador directo BamHI.CD8 (véase arriba)). La secuencia de la construcción EC1-5 CAAR completa es la siguiente: ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCATGTGCCAGAC CTGGCTCCGAGCTGCGGATCGAGACAAAGGGCCAGTACGACGAGGAAGAGATGACAATGC AGCAGGCCAAGCGGCGGCAGAAACGCGAGTGGGTCAAGTTCGCCAAGCCCTGCAGAGAG GGCGAGGACAACAGCAAGCGGAACCCTATCGCCAAGATCACCAGCGACTACCAGGCCACC CAGAAGATCACCTACCGGATCAGCGGCGTGGGCATCGACCAGCCCCCTTTCGGCATCTTC GTGGTGGACAAGAACACCGGCGACATCAACATCACCGCCATCGTGGACAGAGAGGAAACC CCCAGCTTCCTGATCACCTGTCGGGCCCTGAATGCCCAGGGCCTGGACGTGGAAAAGCCC CTGATCCTGACCGTGAAGATCCTGGACATCAACGACAACCCCCCCGTGTTCAGCCAGCAG ATCTTCATGGGCGAGATCGAGGAAAACAGCGCCAGCAACAGCCTCGTGATGATCCTGAAC GCCACCGACGCCGACGAGCCCAACCACCTGAATAGCAAGATCGCCTTCAAGATCGTGTCC CAGGAACCCGCCGGAACCCCCATGTTCCTGCTGAGCAGAAATACCGGCGAAGTGCGGACC CTG ACCAACAGCCT GGAT AGAGAGCAGGCCAGCAGCT ACCGGCT GGT GGT GT CT GGCGCT GACAAGG AT GGCGAGGGCCTGAGCACACAGT GCGAGT GCAACAT CAAAGT GAAGGACGT G AACGACAACTT CCCTAT GTTCCGGGACAGCCAGT ACAGCGCCCGG ATCGAAG AGAACAT C CTGAGCAGCGAGCTGCTGCGGTTCCAAGTGACCGACCTGGACGAAGAGTACACCGACAAC TGGCTAGCCGTGTACTTCTTCACCAGCGGCAACGAGGGCAATTGGTTCGAGATCCAGACC GACCCCCGGACCAATGAGGGCATCCTGAAGGTCGTGAAGGCCCTGGACTACGAGCAGCT GCAGAGCGTGAAGCTGTCTATCGCCGTGAAGAACAAGGCCGAGTTCCACCAGTCCGTGAT CAGCCGGT ACAGAGT GCAG AGCACCCCCGT GACCAT CCAAGT GATCAACGT GCGCGAGG GCATTGCCTTCAGACCCGCCAGCAAGACCTTCACCGTGCAGAAGGGCATCAGCAGCAAGA AACTGGTGGACTACATCCTGGGCACCTATCAGGCCATCGACGAGGACACCAACAAAGCCG CCTCCAACGTGAAATACGTGATGGGCCGGAACGACGGCGGCTACCTGATGATCGATTCCA AG ACCGCCG AG AT CAAGTT CGT G AAG AAT AT G AACCGGG ACTCCACCTT CAT CGT GAACAA GACCATCACAGCCGAGGTGCTGGCCATCGATGAGTATACCGGCAAGACCAGCACCGGCAC CGT GT ACGT GCGGGT GCCCGACTTCAACGAT AACT GCCCT ACCGCCGTGCT GG AAAAGGA CGCCGTGTGTAGCAGCAGCCCCAGCGTGGTGGTGTCCGCCAGAACCCTGAACAACCGGTA CACCGGCCCCT ACACCTT CGCCCT GGAAGAT CAGCCT GT G AAGCT GCC CGCCGTGTGGTCCATCACCACACTGAATGCCACCAGCGCCCTGCTGAGAGCCCAGGAACA GATT CCCCCT GGCGT GT ACCACATCAGCCTGGT GCTGACCGACAGCCAGAACAACAGAT G CGAGATGCCCCGGTCCCTGACCCTGGAAGTGTGCCAGTGCGACAACAGAGGCATCTGCG GCACCAGCTACCCTACCACCTCTCCCGGCACCAGATACGGCAGACCTCACAGCGGCAGAG CTAGCGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGATCTAGCGGCATCTACATCTGGGCCCCT CTGGCCGG AACAT GCGG AGTGCTGCT GCT GAGCCTCGT G ATCACCCT GT ACT GCAAGAGA GGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACC CAGGAAGAGGACGGCTGCAGCTGTCGGTTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACT GAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCT GT ACAACG AGCT GAACCTGGGCAG ACGGGAAGAGT ACGACGT GCTGGACAAGCGG AGAG GCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTAT AACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAG CGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACCAAGGA CACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATAA (SEQ ID NO:36).

El CAAR de desmogleína 1 (Dsg1) se clonó mediante amplificación por PCR a partir de ADNc humano utilizando cebadores específicos.La secuencia de la construcción CAAR completa es la siguiente:

Secuencia de nucleótidos de CAAR de Dsg1 EC1-3 (porción extracelular hasta enlazador GS, dominios transmembrana y citoplasmático igual que para CAAR de Dsg3) ATGGCACTTCCAGTGACCGCTCTGCTCCTGCCACTGGCCCTGCTGCTCCACGCTGCCCGC CCGGGCAGCGAGTTCAGGATCCAAGTCAGGGATTATAATACTAAAAACGGTACCATCAAGT GGCATT CCAT ACGCAGGCAGAAAAGGG AGT GGATT AAGTTTGCT GCCGCGT GCCGGGAGG GT GAAG ACAAT AGCAAACGGAATCCCATT GCAAAGAT ACAT AGCGATT GCGCTGCCAAT CA GCAGGTTACATATCGAATCTCCGGCGTGGGGATTGACCAGCCTCCTTATGGCATTTTCGTC ATTAACCAAAAG ACT GGCG AG AT AAAT AT CACAT CAATT GT GG ACCGG GAAGT G ACG CCGT TTTTT AT CATCT ACT GT AGAGCTCT GAACT CCATGGGCCAGGAT CT GGAAAGG CCACT GGA GCTGAGGGTCAGGGTCCTTGACATCAATGACAATCCCCCCGTCTTTTCCATGGCCACGTTC GCCGGACAGATT GAGG AAAAT AGCAATGCCAAT ACACT GGT GATGAT CCT GAACGCT ACCG ACGCT GACGAGCCGAAT AATCT GAACAGT AAAATT GCTTTT AAGAT CATT CGGCAGGAGCC ATCAGACAGCCCAATGTTTATCATTAACAGAAACACCGGAGAGATCCGCACAATGAACAATT T CCTGGAT AGGGAACAGT AT GGAC AGT AT GCACT CGCT GTTCGGGGCTCCGACCGGGACG GT GG AGCTGAT GG CATG AGT GCCG AGT G CGAGT GCAAT AT CAAGATACT CG ACGTAAAT G A T AAT ATTCC ATACATGGAAC AGAGCTCTT ACACT AT CG AGATCC AGG AGAAT ACT CT C AACT CTAATCTT CTT GAAATT AG AGT GATT G AT CT CG ACGAG GAATTTT CT GCCAATT GG AT GGCT GT CAT CTT CTTT ATT AGT GGT AACG AGGGT A ACTGGTT CG AG AT AG AAAT G AAT G AAAGG AC AAAT GT GG G AAT CTT GAAGGT GGTT AAACCACT GG ACT ACG AAGCAATGCAAT CACT CC AG CTGT CAAT AG GCGT CAGA AAT AAGGCGG AGTT CCAT C ACTCCATT AT GT CCCAGT AT AAATT GAAAGCCAGTGCCATAAGCGTAACCGTGTTGAACGTGATAGAAGGGCCTGTTTTTGCATCC GGA (SEQ ID NO:37)

Secuencia de aminoácidos de CAAR de Dsg1 EC1-3 (porción extracelular hasta enlazador GS, dominios transmembrana y citoplasmático igual que para CAAR de Dsg3) MALPVTALLLPLALLLHAARPGSEFRIQVRDYNTKNGTIKWHSIRRQKREWIKFAAACREGEDNS KRNPIAKIHSDCAANQQVTYRISGVGIDQPPYGIFVINQKTGEINITSIVDREVTPFFIIYCRALNSM GQDLERPLELRVRVLDINDNPPVFSMATFAGQIEENSNANTLVMILNATDADEPNNLNSKIAFKII RQEPSDSPMFIINRNTGEIRTMNNFLDREQYGQYALAVRGSDRDGGADGMSAECECNIKILDV NDNIPYMEQSSYTIEIQENTLNSNLLEIRVIDLDEEFSANWMAVIFFISGNEGNWFEIEMNERTNV

GlLKVVKPLDYEAMQSLQLSIGVRNKAEFHHSIMSQYKLKASAISVTVLNVIEGPVFASG (SEQ ID NO:38)

Secuencia de nucleótidos de CAAR de Dsg1 EC1-4 (porción extracelular hasta enlazador GS. Dominios transmembrana y citoplasmático igual que para CAAR de Dsg3) ATGGCACTTCCAGTGACCGCTCTGCTCCTGCCACTGGCCCTGCTGCTCCACGCTGCCCGC CCGGGCAGCGAGTTCAGGATCCAAGTCAGGGATTATAATACTAAAAACGGTACCATCAAGT GGCATTCCATACGCAGGCAGAAAAGGGAGTGGATTAAGTTTGCTGCCGCGTGCCGGGAGG GTGAAGACAATAGCAAACGGAATCCCATTGCAAAGATACATAGCGATTGCGCTGCCAATCA GCAGGTTACATATCGAATCTCCGGCGTGGGGATTGACCAGCCTCCTTATGGCATTTTCGTC ATTAACCAAAAGACT GGCGAGAT AAAT AT CACATCAATT GTGGACCGG GAAGT GACGCCGT TTTTT AT CAT CT ACT GT AGAGCTCT GAACT CCATGGGCCAGGATCT GGAAAGGCCACT GGA GCTGAGGGTCAGGGTCCTTGACATCAATGACAATCCCCCCGTCTTTTCCATGGCCACGTTC GCCGGACAGATT GAGG AAAAT AGCAATGCCAAT ACACT GGT GAT GAT CCT GAACGCT ACCG ACGCT GACGAGCCGAAT AAT CT GAACAGT AAAATT GCTTTT AAGAT CATT CGGCAGGAGCC ATCAGACAGCCCAATGTTTATCATTAACAGAAACACCGGAGAGATCCGCACAATGAACAATT TCCTGGATAGGGAACAGTATGGACAGTATGCACTCGCTGTTCGGGGCTCCGACCGGGACG GT GG AGCTGAT GG CATG AGT GCCG AGT G CGAGT GCAAT AT CAAGATACT CG ACGT AAAT G A T AAT ATTCCAT ACATGGAAC AG AGCTCTT ACACT AT CG AGATCC AGG AGAAT ACT CT C AACT CTAAT CTT CTT GAAATT AG AGT GATT G AT CT CG ACGAG GAATTTT CT GCCAATT GG AT GGCT GT CAT CTT CTTT ATT AGT GGT AACG AGGGT AACTGGTT CG AG AT AG AAAT G AAT G AAAGG AC AAAT GT GG G AAT CTT GAAGGT GGTT AAACCACT GG ACT ACG AAGCAATGCAAT CACT CCAG CTGT CAAT AG GCGT CAGAAAT AAGGCGG AGTT CCAT C ACTCCATT AT GT CCCAGT AT AAATT GAAAGCCAGTGCCATAAGCGTAACCGTGTTGAACGTGATAGAAGGGCCTGTTTTTCGCCCT GGGTCCAAAACCTACGTTGTGACAGGAAACATGGGATCCAACGACAAAGTCGGCGACTTC GT CGCAACAGACCT GG ACACCGGT CGCCCTTCCACAACT GT GCGGT ACGT GAT GGGAAAC AATCCAGCCGACTTGTTGGCAGTCGATAGCAGGACAGGGAAGCTGACCCTTAAAAACAAG GTTACAAAAGAACAATATAACATGCTGGGCGGCAAATATCAGGGAACCATTTTGTCAATCGA CGACAACCTGCAGCGCACGTGCACGGGGACGATCAACATCAACATCCAGAGCTTTGGGAA TGACGATAGAACCAACACAGAGCCCAACGCTAGCGGA (SEQ ID NO:39)

Secuencia de aminoácidos de Dsg1 CAAR EC1-4 (porción extracelular hasta enlazador GS. Dominios transmembrana y citoplasmático igual que para CAAR de Dsg3) MALPVTALLLPLALLLHAARPGSEFRIQVRDYNTKNGTIKWHSIRRQKREWIKFAAACREGEDNS KRNPIAKIHSDCAANQQVTYRISGVGIDQPPYGIFVINQKTGEINITSIVDREVTPFFIIYCRALNSM GQDLERPLELRVRVLDINDNPPVFSMATFAGQIEENSNANTLVMILNATDADEPNNLNSKIAFKII RQEPSDSPMFIINRNTGEIRTMNNFLDREQYGQYALAVRGSDRDGGADGMSAECECNIKILDV NDNIPYMEQSSYTIEIQENTLNSNLLEIRVIDLDEEFSANWMAVIFFISGNEGNWFEIEMNERTNV GILKVVKPLDYEAMQSLQLSIGVRNKAEFHHSIMSQYKLKASAISVTVLNVIEGPVFRPGSKTYVV TGNMGSNDKVGDFVATDLDTGRPSTTVRYVMGNNPADLLAVDSRTGKLTLKNKVTKEQYNML GGKYQGTILSIDDNLQRTCTGTININIQSFGNDDRTNTEPNASG (SEQ ID NO:40)

Secuencia de nucleótidos de CAAR de Dsg1 EC1-5 (porción extracelular hasta enlazador GS, dominios transmembrana y citoplasmático igual que para CAAR de Dsg3) GAAGAAGAAGGGTCAGCCACT ATGGCACTT CCAGT GACCGCTCTGCT CCTGCCACTGGCC CTGCTGCT CCACGCT GCCCGCCCGGGCAGCGAGTTCAGGAT CCAAGT CAGGG ATT AT AAT ACTAAAAACGGTACCATCAAGTGGCATTCCATACGCAGGCAGAAAAGGGAGTGGATTAAGT TTGCTGCCGCGTGCCGGGAGGGTGAAGACAATAGCAAACGGAATCCCATTGCAAAGATAC ATAGCGATTGCGCTGCCAATCAGCAGGTTACATATCGAATCTCCGGCGTGGGGATTGACCA GCCT CCTT ATGGCATTTT CGT CATT AACCAAAAGACT GGCGAG AT AAAT AT CACATCAATT G TGGACCGGGAAGTGACGCCGTTTTTTATCATCTACTGTAGAGCTCTGAACTCCATGGGCCA GGATCTGGAAAGGCCACTGGAGCTGAGGGTCAGGGTCCTTGACATCAATGACAATCCCCC CGTCTTTTCCATGGCCACGTTCGCCGGACAGATTGAGGAAAATAGCAATGCCAATACACTG GT GAT GATCCTGAACGCT ACCGACGCT GACGAGCCGAAT AATCT GAACAGT AAAATTGCTT TTAAGATCATTCGGCAGGAGCCATCAGACAGCCCAATGTTTATCATTAACAGAAACACCGG AG AGAT CC GC ACAAT G AACAATTTCCT GG AT AGGG AACAGT AT GG AC AGT AT G CACTCGCT GTTCGGGGCTCCGACCGGGACGGTGGAGCTGATGGCATGAGTGCCGAGTGCGAGTGCAA T AT CAAG AT ACTCG ACGTAAAT GAT AAT ATT CCAT AC AT GG AACAGAGCT CTT AC ACT AT CG AG ATCCAG GAG AAT ACT CT C AACT CT AAT CTT CTT G AAATT AG AGT GATT GAT CT CG ACG AG G AATTTT CTGCCAATTGG AT GGCT GT CAT CTT CTTT ATT AGT GGT AACG AGGGT AACT GGTT CGAGAT AGAAAT GAAT GAAAGG ACAAATGTGGGAAT CTTG AAGGTGGTT AAACCACT GGAC TACGAAGCAATGCAATCACTCCAGCTGTCAATAGGCGTCAGAAATAAGGCGGAGTTCCATC ACTCCATT AT GT CCCAGT AT AAATT GAAAGCCAGT GCCAT AAGCGT AACCGT GTTG AACGT G AT AGAAGGGCCT GTTTTTCGCCCTGGGT CCAAAACCT ACGTTGTGACAGGAAACAT GGGAT CCAACGACAAAGTCGGCGACTTCGTCGCAACAGACCTGGACACCGGTCGCCCTTCCACAA CTGTGCGGTACGTGATGGGAAACAATCCAGCCGACTTGTTGGCAGTCGATAGCAGGACAG GGAAGCTGACCCTTAAAAACAAGGTTACAAAAGAACAATATAACATGCTGGGCGGCAAATA TCAGGGAACCATTTTGTCAATCGACGACAACCTGCAGCGCACGTGCACGGGGACGATCAA CAT C AACATCCAG AGCTTT G GG AAT G ACGAT AGAACCAAC ACAGAGCCCAACAC AAAG AT C ACCACCAATACTGGCCGACAAGAATCCACCTCCAGCACAAACTATGATACGTCCACTACCA GTACAGACTCCAGTCAGGTTTACAGCAGTGAACCCGGTAATGGTGCCAAGGATCTCCTGAG T GAT AAT GTTCATTTT GG ACCCGCT AGCGG A (SEQ ID NO:41)

Secuencia de aminoácidos de CAAR de Dsg1 EC1-5 (porción extracelular hasta enlazador GS, dominios transmembrana y citoplasmático igual que para CAAR de Dsg3) MALPVTALLLPLALLLHAARPGSEFRIQVRDYNTKNGTIKWHSIRRQKREWIKFAAACREGEDNS KRNPIAKIHSDCAANQQVTYRISGVGIDQPPYGIFVINQKTGEINITSIVDREVTPFFIIYCRALNSM GQDLERPLELRVRVLDINDNPPVFSMATFAGQIEENSNANTLVMILNATDADEPNNLNSKIAFKII RQEPSDSPMFIINRNTGEIRTMNNFLDREQYGQYALAVRGSDRDGGADGMSAECECNIKILDV NDNIPYMEQSSYTIEIQENTLNSNLLEIRVIDLDEEFSANWMAVIFFISGNEGNWFEIEMNERTNV GILKVVKPLDYEAMQSLQLSIGVRNKAEFHHSIMSQYKLKASAISVTVLNVIEGPVFRPGSKTYVV TGNMGSNDKVGDFVATDLDTGRPSTTVRYVMGNNPADLLAVDSRTGKLTLKNKVTKEQYNML GGKYQGTILSIDDNLQRTCTGTININIQSFGNDDRTNTEPNTKITTNTGRQESTSSTNYDTSTTST DSSQVYSSEPGNGAKDLLSDNVHFGPASG (SEQ ID NO:42)

La presencia de la construcción que codifica las secuencias en los plásmidos se confirmó mediante digestión con SalI y BamHI. Todas las construcciones se verificaron mediante secuenciación de Sanger y los plásmidos se purificaron a mayor escala con eliminación de endotoxinas (qiagen endofree maxiprep).

Expresión transitoria

Para probar la expresión de las construcciones CAAR, las células 293T/17 se transfectaron transitoriamente usando polietilenimina (PEI, jetPEI, polyplus) en una proporción de ADN:PEI de 1:2. La expresión se validó mediante citometría de flujo con anti-Dsg3 EC1-IgG1 (clon: Px43) y anti-Fc-PE humano (clon HP6017) después de 36 horas en un citómetro de flujo LSRII (BD).

Producción de lentivirus autoactivantes basado en VIH-1

Para facilitar la expresión estable de las construcciones CAAR, se produjeron partículas lentivíricas pseudotipadas de VSV-G utilizando un sistema de empaquetado de 3a generación. En resumen, se transfectaron células 293T/17 (ATCC CRL-11268) a una confluencia del 90% con una mezcla de pRRLSIN.cPPT.EF1a-Dsg3CAAR. El plásmido WPRE, el plásmido de envoltura pMD2.G (addgene 12252), los plásmidos de empaquetamiento pRSVRev (addgene 12253) y pMDLgm/pRRE (addgene 12251) en un complejo con Lipofectamine2000 (life technologies). El sobrenadante que contenía lentivirus se recogió después de 24, 48 y 72 horas, se filtró a través de una membrana de 0,4 micrómetros, se concentró a 12000 g durante 12 horas a 4 °C y se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior.

Ensayo indicador con células T NFA T-GFP Jurkat

Las células Jurkat se cultivaron a 37 °C con 5 % de CO2 en un ambiente completamente humidificado usando RPMI1640, HEPES 10mM, Penicilina/Estreptomicina al 1 % y FBS al 10 %. El medio de hibridoma se complementó adicionalmente con un 1 % de aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio al 1 % y BME 0,5 mM. Para probar la transducción de señales mediante la interacción CAAR-diana, las construcciones CAAr se expresaron en una línea celular indicadora Jurkat que se ha seleccionado (G418) para la expresión estable de GFP controlada bajo un elemento de respuesta NFAT, facilitando la expresión de GFP después de la participación de CAAR y la liberación de calcio intracelular mediada por PLCgamma e IP3. La línea celular Jurkat fue proporcionada por Arthur Weiss (UCSF). Las células Jurkat se transdujeron con lentivirus CAAR a una multiplicidad de infección de 5-10 y la expresión de la construcción CAAR se validó después de > 72 horas con IgG1 de ratón anti-EC5-Dsg3 (clon: 5G11) y anti-IgG1-APC de ratón (clon: A85-1, BD Pharmingen) mediante citometría de flujo. Para crear estructuras diana, se cargaron dynabeads (life technologies) activadas con tosila con IgG1 monoclonal humana o de ratón específica para Dsg3 o con mesotelina (control negativo) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Adicionalmente, se cargaron en perlas suero de un paciente con PV y de un individuo sin PV. La línea celular de hibridoma AK23 (documento US 7550562 B2) sirvió como diana celular que secreta anticuerpos anti-Dsg3 y tiene una superficie positiva para estos anticuerpos. Como control negativo, los presentes inventores usaron otra línea celular de hibridoma que secreta anticuerpos contra la región marco VH3-15 humana (BK-2; US 5738847 A) Para la caracterización de la interacción CAAR-diana, las células Jurkat con CAAR se incubaron durante 4 horas con perlas a una proporción de perlas:células de 3:1 o con células diana a una concentración creciente a 37 °C. La expresión de GFP se validó mediante citometría de flujo. Además de las perlas y las células diana, las células B humanas de un individuo sin PV y los queratinocitos humanos primarios (proporcionados por el SDRC, núcleo B, University of Pennsylvania) se utilizaron para probar los efectos difusos.

Estimulación y expansión de células T humanas primarias

Se cultivaron células T humanas primarias en RPMI1640, FBS al 10% y HEPES 10 mM, suplementado con penicilina/estreptomicina al 1 %. Las células T se aislaron de donantes voluntarios sanos y fueron proporcionadas por el núcleo de inmunología humana (Universidad de Pensilvania). Las células T sin tratamiento (CD4+ y CD8+) se estimularon con perlas anti-CD3 y anti-CD28 (dynabeads, life technologies) en una proporción de perlas:células de 3:1. Cuando solo se usaron células CD8, el medio de cultivo se complementó con 150-300 Ul/ml de IL2. 24 horas después de la estimulación, se transdujeron 106 células T con las construcciones CAAR o un control simulado a una MDI de 5-10. Como control simulado, los presentes inventores usaron un receptor de antígeno quimérico basado en scFv contra CD19 humano o mesotelina humana. La expansión de las células T se controló durante 8-14 días con análisis de la densidad celular y el volumen celular cada 2 días durante los primeros 6 días, después de eso todos los días. El volumen celular y la densidad celular se analizaron con un CoulterCounter (Beckman Coulter). Los ensayos de destrucción se realizaron a un volumen celular de ~ 400 fl. La expresión de la superficie celular de las construcciones CAAR se validó mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-Dsg3 (clones: Px43 (IgG1), Px44 (IgG1), F779 (scFv), AK23 (IgG1 de ratón)) y anticuerpos de detección contra IgG-FC humana (clon: HP6017), IgG1 de ratón (clon: A85-1) o péptido HA (clon: 3F10). Se detectaron receptores de antígenos quiméricos basados en scFv con IgG antihumana policlonal de burro (cadena pesada y ligera) o IgG anti-ratón en cabra.

Ensayo de destrucción in vitro

La destrucción in vitro se probó con un ensayo de liberación de 51Cr. Se cargaron 5 x 105 células diana con 50 microCi de Na251CrO4 (Perkin Elmer) durante 90 minutos, se lavaron dos veces y se resuspendieron en medio sin fenol con FBS al 5 %. Las células T transducidas con CAAR o simuladas se coincubaron con células diana cargadas durante 4 y 24 horas en varias proporciones de efectores:diana y se midió la liberación de cromo en el sobrenadante con un contador de placa microbeta 2 (Perkin Elmer). Cuando solo se usaron células CD8, el ensayo se realizó en presencia de 75 Ul/ml de IL2. La liberación espontánea por las células diana solo se analizó en el mismo volumen y la liberación máxima se evaluó tratando las células diana con SDS a una concentración final del 2,5 %. Para probar la lisis redirigida, mediada por receptor Fc, las células K562 positivas para CD32 se incubaron con células T con CAAR en presencia de IgG1 anti-Dsg3 monoclonal humano (clon: PV2B7) a una concentración de 5 microgramos/ml o anti-CD3 humano (okt3) a la misma concentración.

La lisis específica se analizó como sigue:

Porcentaje de lisis específica: [(Liberación experimental - Liberación espontánea)/(Liberación máxima -Liberación espontánea)] * 100

Pruebas de eficacia in vivo de células T con CAAR

Las células T transducidas con CAAR o CAR de control se expandieron como se describe en el presente documento. Para los experimentos in vivo, las células T con CAAR o CAR de control se ajustaron a una concentración de 3x107 células/ml y mezclado con células de hibridoma AK18,19 o 23 transducidas con GFP-clickbeetle rojo o verde (a 106 células/ml), dando como resultado una proporción de células T a diana de 30. Las células se mantuvieron en hielo y se inyectaron 200 pl de la mezcla de células en la vena de la cola de ratones NSG, dando como resultado en 3x106 células T y 105 células diana por ratón. Después de la inyección intravenosa, se inyectaron ratones NSG con solución de sal monopotásica de D-luciferina a una dosis de 300 mg/kg de peso corporal.

La bioluminiscencia se cuantificó con una sistema preclínica de obtención de imágenes de espectro IVIS de PerkinElmer in vivo. Se realizó una evaluación adicional de la carga tumoral por bioluminiscencia los días 3, 7, 13, 17/18, 26 y 35 después de la inyección. El análisis se realizó con el programa informáctico Livinglmage 4.4. Para el análisis, se establecieron regiones de interés en forma de rectángulo con áreas idénticas desde la cabeza del ratón hasta el centro de la cola. Se calculó el flujo total en fotones/segundo después de la resta de la luminiscencia de fondo. Una bioluminiscencia de 108 fotones/segundo se utilizó para declarar muertos a los ratones, ya que esto representó una expansión de ~ 100 veces la carga tumoral inicial e indicó la pérdida del control tumoral.

Los ratones se sacrificaron de acuerdo con un protocolo IACUC aprobado. Las muestras de bazo y médula ósea se mantuvieron en medio RPMI suplementado con FBS al 10 % hasta su posterior procesamiento. Se obtuvieron muestras de sangre de ratones sacrificados mediante punción cardíaca y se anticoagularon con EDTA. Se obtuvieron suspensiones de células individuales de bazo y muestras de médula ósea lavadas pasando las células a través de un filtro de células de 100 um. Se tiñeron 106 células con anti-CD3 humano (clon Okt3), anti-CD45 humano (clones HI30 o 2D1) y anti-Dsg3 humano (clon Px44, sin pérdida de unión por desnaturalización con EDTA) durante 25 minutos a temperatura ambiente, se fijaron con BD Facs Lyse almacenado a 4 grados Celsius y se analizaron en un citómetro de flujo BD LSRII.

Los resultados de los experimentos se describen a continuación.

El pénfigo vulgar (PV) es una enfermedad autoinmune mediada por anticuerpos que causa ampollas potencialmente mortales en la piel y las membranas mucosas. Es potencialmente mortal debido a la desnutrición, infección y deshidratación. El PV es una enfermedad autoinmune mediada por anticuerpos, específica de tejido modelo porque el autoantígeno Dsg3 (desmogleína 3) está bien definido y los anticuerpos anti-desmogleína son necesarios y suficientes para causar ampollas suprabasales características en modelos de piel animal y humana.

Los autoanticuerpos son sintetizados y secretados por linfocitos B autorreactivos y se dirigen principalmente a los dominios EC1-3 extracelulares de Dsg3 donde se encuentran los restos adhesivos trans y cis. Las estrategias de tratamiento más eficaces en los linfocitos B diana de PV e incluyen corticosteroides sistémicos, azatrioprina, micofenolato de mofetilo y ciclofosfamida para inhibir la proliferación de linfocitos. El rituximab se usa como un mecanismo de depleción de células B anti-CD20 a través de una molécula de superficie específica de linfocitos B. Sin embargo, no existe un tratamiento que se dirija solo a las células autorreactivas en lugar de a todas las células B. Esto da como resultado que las estrategias de tratamiento actuales tengan efectos secundarios graves, incluyendo infecciones y cánceres secundarios letales.

Recientemente, las células T modificadas genéticamente que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) contra el marcador de superficie de células B CD19 (DL Porter et al, NEJM 2011; SA Grupp et al, NEJM 2013) se dirige específicamente a las células B CD19+ y las destruye y puede inducir una remisión duradera en pacientes con neoplasias malignas de células B refractarias.

Como se describe en el presente documento, las células T se pueden manipular para destruir las células diana independientes del MHC y las señales coestimuladoras expresando un receptor de antígeno de células T quimérico recombinante con un dominio extracelular que reconoce específicamente el antígeno diana y un dominio intracelular que es suficiente para activar la señalización después de la unión del antígeno (receptores de antígenos quiméricos o CAR). Los receptores de antígenos quiméricos consisten en un receptor de superficie celular personalizado (generalmente un anticuerpo contra una molécula de superficie celular específica en la célula diana), dominio transmembrana y dominios intracelulares de receptores de señalización coestimuladores en la misma proteína. Las ventajas de usar CAR incluyen la capacidad de dirigirse contra prácticamente todos los antígenos conocidos, Los CAR actúan independientemente de la expresión de MHC de la célula diana, y la unión de CAR a su antígeno diana da como resultado la activación de la célula T independientemente de las señales coestimuladoras de la célula diana. La manipulación de células T para el tratamiento fotovoltaico se basa en la diana perfecta para una célula T manipulada que se comparte entre todas las células diana, así como único para la célula diana. Por ejemplo, las células B autorreactivas en PV expresan una Ig de superficie que se une a la desmogleína 3.

El diseño de las células T modificadas genéticamente para PV incluye de manera óptima un receptor de antígeno quimérico (CAR) típico con un resto de unión de anticuerpos de alta afinidad que se dirige a autoanticuerpos específicos. En enfermedades autoinmunes como el PV, las células patógenas (células B) ya expresan el autoanticuerpo de alta afinidad en su superficie celular. Por tanto, las células T manipuladas genéticamente para enfermedades mediadas por autoanticuerpos deben expresar el antígeno, no el anticuerpo, en su superficie celular = un receptor de autoanticuerpos quimérico (CAAR). En el caso del PV, este es Dsg3.

La Figura 1 es un dibujo esquemático que muestra cómo el receptor de autoanticuerpos quimérico propuesto (CAAR) es distinto de todas las tecnologías desarrolladas previamente. La mitad izquierda de la figura muestra un receptor de antígeno quimérico (CAR) en una célula efectora para (las propias células T del paciente), que se dirige a un antígeno (CD19) que se expresa específicamente en el linfoma de células B. Lo que hace que las células B autorreactivas de PV sean únicas de todas las demás células B es que expresan un autoanticuerpo en su superficie celular que es específico para el autoantígeno de la enfermedad, desmogleína 3 (Dsg3). Por lo tanto, el PV CAAR es el autoantígeno (Dsg3), que se dirige al autoanticuerpo Dsg3 expresado en la superficie de las células B de PV autorreactivas. La Figura 2 ilustra que la interacción entre los receptores de células T quiméricos modificados genéticamente y las células B específicas de Dsg3 diana es más específica para PV que las terapias dirigidas a CD19 o CD20. A diferencia de una terapia dirigida a CD19 o CD20, una inmunosupresión generalizada no debe ocurrir con una terapia dirigida con Dsg3. Las células T manipuladas son más sostenibles que la terapia basada en anticuerpos monoclonales porque las células T proliferan en respuesta al antígeno y forman células T de memoria. Por otra parte, los receptores de células T quiméricos manipulados que se dirigen a las células B específicas de Dsg eliminan tanto las células B de memoria como las secretoras de anticuerpos de corta duración (Figura 3).

Las desmogleínas son autoantígenos ideales para un receptor de autoanticuerpos quiméricos (CAAR) porque consisten en dominios extracelulares modulares que pueden truncarse. Además, la eficacia de CAAR está influenciada por la distancia intermembrana entre la célula T y su diana, véase la Figura 4.

Las Figuras 5-6 ilustran la capacidad de amplificar dominios individuales de Dsg3 (Figura 5) y CD137 (Figura 6) a partir de ADNc de células mononucleares de sangre periférica. La Figura 7 muestra además la amplificación de Dsg3 y CAAR de Dsg3 del plásmido DN653.

La proteína CAAR de Dsg3 se analizó mediante análisis por transferencia de Western 48 horas después de la transformación y lisis celular de las células 293T en condiciones reductoras (Figura 8). El sobrenadante de baculovirus Dsg3 E-His fue un control positivo, las células HEK293T no transfectadas fueron un control negativo. El tamaño esperado fue de 96 kDa para la proteína no glucosilada, que típicamente migra a ~ 112 kD con glucosilación.

Para evaluar la citotoxicidad de los CAAR de Dsg3, la capacidad de CAAR de Dsg3 expresada en células T humanas primarias para destruir células diana que expresan autoanticuerpos de superficie anti-Dsg3 (prueba de eficacia) y el potencial de CAAR de Dsg3 para destruir células fuera de la diana que pueden expresar un receptor Fc de superficie, que podría unirse a los autoanticuerpos de PV y dar lugar a una lisis redireccionada no intencionada (prueba de seguridad).

La especificidad de CAAR de Dsg3 hacia las dianas previstas y no deseadas se probó en ensayos de lisis. Se anticipó que las células T CAAR de Dsg3 destruirían las células B anti-Dsg3 como una diana prevista debido a una interacción de alta afinidad entre el CAAR de Dsg3 y el autoanticuerpo anti-Dsg3 (lado izquierdo de la Figura 9). Mientras que las interacciones hemofílicas débiles entre las células T con CAAR de Dsg3 y las células que expresan anti-Dsg3 con un receptor Fc (queratinocitos) no provocarían la muerte de las células T con CAAR de Dsg3 (lado derecho de Figura 9).

Como se esperaba, las células Jurkat con CAAR de Dsg3 no mostraron una fuerte lisis redireccionada. Se estimularon células Jurkats NFAT-GFP que expresaban Dsg3-CAAR con perlas recubiertas de anticuerpo en una proporción de 3:1 (perlas:células). Los gráficos de citometría de flujo que se muestran en Figura 10 indicaron que la señalización en las células Jurkat con CAAR de Dsg3 estaba presente después de la exposición a anticuerpos diana de PV. AK23, PV4B3 y PV2B7 son mAb específicos de Dsg3, que si están vinculados a las células Jurkat con CAAR, deben desencadenar la señalización que induce la expresión de GFP. El promotor EF1a funcionó mejor que el promotor PGK y dio como resultado una señalización específica. SS1 = CAR anti-mesotelina se usó como control positivo y tuvo actividad positiva inicial. Se usaron células no transducidas como control negativo y no se detectó señal de GFP.

La señalización de nivel bajo, pero específico se indujo en células Jurkat con CAAR de Dsg3 después de la exposición a IgG sérica del paciente con pénfigo vulgar (PV) policlonal (lo que refleja el bajo porcentaje general de IgG total que es específico de Dsg3) (Figura 11). Las células Jurkat con CAAR de Dsg3 también respondieron a números bajos de IgG de superficie en las células (hibridoma AK23) de una manera dependiente de la dosis. La señalización no se indujo cuando las células Jurkat con CAAR de Dsg3 se expusieron a queratinocitos que expresan Dsg3, lo que indica que las interacciones de Dsg3 con cadherinas desmosómicas en los queratinocitos no deberían producir toxicidad cutánea o de las membranas mucosas.

Para probar la seguridad de las células efectoras con CAAR de Dsg3, se propusieron diferentes escenarios para probar la citotoxicidad hacia células diana que expresan autoanticuerpos de superficie anti-Dsg3 y células fuera de diana que expresan receptores de Fc de superficie que podrían unirse a autoanticuerpos de PV en suero dando como resultado una lisis redireccionada no intencionada. Las células de la izquierda en la Figura 14 muestran la muerte esperada de las células B anti-Dsg3 como la diana prevista. Las células de la derecha en la Figura 14 muestran la muerte involuntaria de células que expresan receptores Fc, potencialmente a través de lisis redirigida. Se expusieron células efectoras con CAAR de Dsg3 a una línea celular K562 que expresaba receptores Fc de superficie precargados con mAb anti-Dsg3 de PV (PV2B7). No se observó lisis redirigida con mAb de PV unido al receptor Fc (gráfico de la izquierda en Figura 15), ya que se comportó de manera similar a los controles negativos y las células no transducidas (gráfico de la derecha en Figura 15).

La activación del TCR (y por tanto la muerte) depende de la distancia entre el efector y la célula diana (la distancia ideal es de 14 a 15 nm). Las distancias más cortas o más largas resultarán en la pérdida de la activación del TCR. La diana (IgG de superficie) para el CAAR de Dsg3 es ~ 8,4 nm. La desmogleína 3 tiene aproximadamente 12,5-18 nm de longitud. El hueco desmosómico es de ~ 40 nm. La desmogleína 3 consta de 5 dominios similares a Ig con un tamaño de aproximadamente 3,5 nm cada uno. Las interacciones trans y cis son de aproximadamente 24,5 nm cuando interactúan a través de la interacción cis EC2.

Para determinar si la expresión de solo una parte de Dsg3 puede resultar en una activación mejorada de CAAR, debido a la distancia intercelular óptima para la sinapsis inmunológica, se utilizaron diferentes construcciones de dominios EC de Dsg3 (los dominios de adhesión intermolecular están contenidos en EC1-2). También se pueden usar otras construcciones de dominio de EC y se detallan en la divulgación. La Figura 16A es una imagen de un gel electroforético que muestra la amplificación de los diferentes dominios extracelulares Dsg3, EC2-3, EC1-2, EC1-3, EC1-4 y EC1-5 (Figura 16B), que se construyeron para optimizar la citotoxicidad de CAAR de Dsg3, ya que la eficacia de la citotoxicidad mediada por CAAR depende de la distancia entre el efector y la célula diana.

Los CAAR de Dsg EC1-3, EC1-4 y EC1-5 se expresaron en células T humanas primarias y se reconocieron por 3 mAb anti-Dsg3 de PV diferentes, AK23, Px44 y F779 (Figura 17). EC1-2 no se expresó de manera efectiva.

La eficacia del CAAR de Dsg3 contra un hibridoma de ratón IgG anti-Dsg3 (destinado a modelar una célula B de memoria humana específica de PV o plasmablasto que muestra IgG anti-Dsg3 en la superficie celular) se muestra en la Figura 18. El CAAR de Dsg3 se expresó en la superficie de células T humanas primarias y se observó que la destrucción específica in vitro de AK23 (un hibridoma anti-Dsg3) en un ensayo de liberación de cromo después de 4 horas en comparación con el control negativo, BK2.

Se demostró además que la eficacia de las células T con CAAR de Dsg3 destruye específicamente el hibridoma de AK23 en un ensayo de liberación de cromo-51. La destrucción de CAAR de Dsg3 del hibridoma AK23 aumentó con el tiempo en un ensayo de liberación de cromo después de 24 horas. (Figura 19). Esencialmente, se observó aproximadamente un 100% de muerte con CAAR de Dsg3 EC1-3 y EC1-4 después de 16 horas. La eficacia destructora de los CAAR se correlacionó con el tamaño del CAAR (más corto era mejor EC1-3> EC1-4> EC1-5). El CD19 humano no se expresó en la célula de hibridoma diana ya que el CAR anti-CD19 humano era el control simulado. El hibridoma de control (BK2), que no expresa un autoanticuerpo Dsg3, demostró cierta destrucción por las células con CAAR de Dsg3 durante 24 horas, quizás debido a la alorreactividad humano-ratón.

Las células T con CAAR de Dsg3 destruyeron las células anti-Dsg3 dirigidas a una amplia gama de epítopos, F779 (anti-EC1) y PVB28 (anti-EC2). Dsg3 EC1-4 CAAR (EC1-4bbz) destruyó células B anti-EC1, anti-EC2 y anti-EC3, véase la Figura 20. El CAAR de Dsg3 EC1-4 tampoco destruyó las células K562 de tipo silvestre (ts) (Figura 21), así como las células T no transducidas no destruyeron las células F779/PVB28 K562. Las células K562 que expresan inmunoglobulinas de superficie F779 o PVB28 también expresaron CD19 y mesotelina. Se utilizaron células T no transducidas (NTD) como control negativo.

Para determinar si la densidad de anticuerpos es comparable entre hibridomas y células B de memoria, la cuantificación de IgG de superficie anti-Dsg se realizó en células de hibridoma, AK18, AK19 y AK23 y células B humanas. La densidad de IgG en los hibridomas se midió mediante la relación fluorescencia/proteína (F/P). Dadas las grandes diferencias de tamaño entre las células, la célula de hibridoma alrededor de 567,5 um2 y células B humanas alrededor de 160,3 um2, había aproximadamente 3,54 veces más área de superficie para el hibridoma que las células B de memoria humana. Por tanto, la relación fluorescencia/proteína (F/P) necesaria para tener en cuenta el área de la superficie. La densidad superficial normalizada de IgG se calculó en aproximadamente AK18: 1130, AK19: 5300, A^k23: 1765 y células B humanas: 3570, véase la Figura 22.

Las células T con CAAR de Dsg3 se probaron adicionalmente para determinar si las afinidades de los anticuerpos afectan a la eficacia. Las afinidades relativas de las inmunoglobulinas diana secretadas por los hibridomas usados en los ensayos de destrucción descritos en el presente documento, AK18, AK19 y AK23, se muestran en la Figura 23. Los tres anticuerpos tienen afinidades variables y las células T con CAAR de Dsg3 son eficaces contra los tres. Para probar más la eficacia de las células T con CAAR de Dsg3, se añadió anticuerpo anti-Dsg3 bloqueante soluble al ensayo de destrucción. Las células T con CAAR de Dsg3 demostraron una destrucción específica incluso en presencia de concentraciones crecientes de anticuerpo soluble (Figura 24). Los ensayos de destrucción se realizaron en presencia del hibridoma y el anticuerpo soluble del mismo clon. La Figura 24 demuestra que las células T con CAAR de Dsg3 se dirigen a las células incluso en presencia de anticuerpo anti-Dsg3 bloqueante soluble para todas las condiciones probadas.

Para probar la destrucción difusa de células T con CAAR de Dsg3, se examinaron posibles escenarios. Las células que expresan receptores Fc que se unen a IgG anti-Dsg en suero podrían ser destruidas por células T que expresan el CAAR de Dsg. Sin embargo, es probable que la distancia entre membranas sea demasiado grande para permitir una destrucción eficaz. La IgG anti-Dsg3 sérica también suele presentar solo una minoría (~ 1 %) de la IgG sérica total, sugiriendo que la toxicidad debería ser mínima. Los queratinocitos que expresan cadherinas desmosómicas (desmogleínas y desmocolinas) podrían interactuar teóricamente con el CAAR de Dsg y morir. Sin embargo, la distancia entre membranas es probablemente subóptima para destruir, y la afinidad de interacción es demasiado baja (intervalo de |^j M).

Las células T que llevan Dsg3 se probaron en un ensayo de toxicidad celular dependiente de anticuerpos inversa (rADCC) para determinar si las células T con CAAR de Dsg3 se dirigían a las células que expresan el receptor Fc (gráfico superior en Figura 25). Se coincubaron células K562 que expresaban FcgRI (CD64+ K562) durante 8 horas con células T con CAAR en suero PV. Las células diana fueron 100 % positivas para IgG de superficie, sin embargo, no fueron destruidas por las células T con CAAR de Dsg3. Las células K562 que expresan IgG4 PVB28 en medio normal se utilizaron como control positivo para mostrar que las mismas células T con CAAR eran, de hecho, funcionales (gráfico inferior en Figura 25), es decir, células diana específicamente destruidas.

Se incubaron células T con CAAR de Dsg3 con queratinocitos epidérmicos humanos primarios cultivados en medio que contenía calcio para inducir el ensamblaje del desmosoma. No se observó destrucción con las células T con CAAR de Dsg3 EC1-4 (Figura 26). Por el contrario, las células T con CAR que consisten en un mAb contra Dsg3 y Dsg1 destruyeron eficazmente los queratinocitos.

Las células T con CAAR de Dsg3 también controlaron eficazmente las células de hibridoma secretoras de IgG in vivo. La Figura 27 muestra que se co-injertaron células de hibridoma AK19 y células T con CAAR de Dsg3 EC1-4 o células T con CAR de control en ratones NSG. En los puntos de tiempo indicados, la carga tumoral se cuantificó mediante imágenes de bioluminiscencia. Se utilizó bioluminiscencia> 10e8 (flujo total [P/s]) para declarar a los ratones "muertos".

En ratones de escape (los 4 ratones tratados con CAAR que habían retrasado el crecimiento de AK19), las células AK19 recuperadas eran en su mayoría inmunoglobulinas de superficie negativas, lo que indica la eliminación efectiva de las células diana (IgG+ anti-Dsg3) (Figura 28). Los hibridomas AK19 se marcaron con GFP y luciferasa verde escarabajo clic antes de la inyección in vivo, lo que permitió determinar si las células AK19 permanecían slg+. Se tiñeron células de médula ósea 1e6 con cantidades saturadas de IgG1-APC anti-ratón. 41,6 49,6 = 91,2 % de las células de hibridoma AK19 cultivadas eran slg+ (panel izquierdo). 6/8 ratones coinyectados mostraron un patrón como el 9382, con pocas células GFP+ detectables. 9406 y 9407 (ratones de escape) mostraron células GFP+ que tenían expresión de IgG de superficie reducida o nula.

Las células T con CAAR de Dsg3 se injertaron más y mantuvieron la expresión de CAAR a largo plazo (Figura 29).

De hecho, se observó una expansión significativa de las células en comparación con las células T con CAR de control. El porcentaje de células T humanas en la médula ósea (MO) de ratón: CAR de control frente a CAAR de Dsg3

Las Figuras 30A-C muestran la presencia de células T con CAAR de Dsg3 que se injertaron en diferentes compartimentos inmunitarios, sangre (Figura 30A), médula ósea (Figura 30B), y bazo (Figura 30C).

Se muestra en la Figura 31 el hemograma completo de 7 ratones tratados con CAAR 35 días después de la inyección de CAAR. No se detectó depleción de las células portadoras del receptor Fc (NE = neutrófilos, MO=monocitos). Se demostró la eficacia in vivo de CAAR de Dsg3 EC1-4 y CAAR de Dsg3 EC1-3 frente a AK23 (anti-EC1).

El CAAR de Dsg3 EC1-3 redujo aún más la carga tumoral AK23 por bioluminiscencia (Figura 32A) y mayor supervivencia (Figura 32B). Potencialmente similar a AK19, los ratones que escapan del CAAR Dsg3 EC1-3 pueden seleccionarse para células AK23 de inmunoglobulina de superficie negativa. Las Figuras 33-35 muestran además que las células T con CAAR de Dsg3 EC1-4 muestran eficacia contra una amplia gama de dianas in vivo, incluido

Claims

REIVINDICACIONES

3. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, o el CAAR aislado de la reivindicación 2, en donde el autoantígeno comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

4. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, o el CAAR aislado de la reivindicación 2, en donde la secuencia de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un propéptido de Dsg3 o el CAAR aislado comprende además un propéptido de Dsg3, en donde el propéptido de Dsg3 preferentemente comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

5. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, que comprende además una secuencia de ácido nucleico de un péptido señal de la cadena alfa de CD8, o el CAAR aislado de la reivindicación 2, que comprende además un péptido señal de la cadena alfa de CD8, en donde el péptido señal de la cadena alfa de CD8 comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

6. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico del dominio transmembrana codifica una bisagra de cadena alfa de CD8 y un dominio transmembrana o el CAAR aislado de la reivindicación 2, en donde el dominio transmembrana comprende una bisagra de cadena alfa de CD8 y un dominio transmembrana, en donde la bisagra de la cadena alfa de CD8 y el dominio transmembrana preferentemente comprenden una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.

7. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 que comprende además una secuencia de ácido nucleico de un enlazador peptídico o el CAAR aislado de la reivindicación 2 que además comprende un enlazador peptídico, en donde el enlazador peptídico comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.

8. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, o el CAAR aislado de la reivindicación 2, en donde el dominio bisagra CD137 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

9. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, o el CAAR aislado de la reivindicación 2, en donde el dominio de señalización de zeta de CD3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16.

10. Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-9, en donde el vector es preferentemente un vector lentivírico o un vector de ARN.

11. Una célula genéticamente modificada que comprende el CAAR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 2-9.

12. La célula de la reivindicación 11, en donde la célula expresa el CAAR aislado y tiene al menos una característica seleccionada del grupo que consiste en:

(i) alta afinidad por los autoanticuerpos expresados en células B;

(ii) induce la muerte de las células B que expresan autoanticuerpos;

(iii) tiene baja afinidad por los anticuerpos unidos a un receptor Fc; y

(iv) tiene una toxicidad limitada para las células sanas,

14. La célula T genéticamente modificada para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la célula T modificada se dirige a una célula B.