CN101505791A - 使用抗桥粒芯蛋白3抗体的癌症的诊断和治疗 - Google Patents
使用抗桥粒芯蛋白3抗体的癌症的诊断和治疗 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了癌症的诊断方法，其特征在于：检测DSG3蛋白质。肺癌中，发现DSG3以非常高的频率、在基因水平和蛋白质水平表达亢进。本发明的方法可使用识别DSG3蛋白质的抗体来进行。还公开了含有与DSG3结合的抗体作为有效成分的药物组合物、细胞增殖抑制剂和抗癌药。进一步公开了通过使DSG3表达细胞和与DSG3结合的抗体接触，对DSG3表达细胞引发细胞毒的方法、以及抑制DSG3表达细胞的增殖的方法。
Description
技术领域
本发明涉及癌症的诊断和治疗方法、以及细胞增殖抑制剂和抗癌药。
背景技术
桥粒芯蛋白3(Demoglein3)(以下在本说明书中称为DSG3)分子是由罹患了皮肤和粘膜的自身免疫水泡形成疾病—寻常性天疱疮(Pemphigus vulgaris，以下在本说明书中称为PV)的患者血清中得到的自身抗体，使用该自身抗体对角质形成细胞提取物进行免疫沉淀，首次鉴定了分子量130kDa的糖蛋白，命名为PV抗原(以下在本说明书中称为PVA)(非专利文献1和J.Clin.Invest.74，313～320，1984)。然后，通过亲和纯化，从PV患者血清中分离出与上述130kDa蛋白反应的抗体分子。接着，使用该分离抗体，对使用由人角质形成细胞分离的polyA RNA构建的表达载体文库进行筛选，分离出编码PVA的cDNA。基于对分离的cDNA的核苷酸序列的分析，表明PVA分子与属于编码胞间粘附因子的一群钙粘附蛋白超家族基因的分子群的序列具有高的同源性(非专利文献2)。
在广泛的组织中表达、在生物体内与细胞粘附相关的分子—钙粘附蛋白分子群内，在位于细胞膜的细胞之间的粘附部位—桥粒(细胞斑)表达的该分子群的集团被命名为桥粒Cd(desmosomal cadherins)或桥粒芯蛋白。桥粒芯蛋白家族之一的DSG3分子的分离和克隆中使用的角质形成细胞是占表皮的大部分的细胞。可以认为是通过桥粒与相邻的细胞紧密粘附，DSG3分子参与了所述粘附。PV患者血清中存在的抗DSG3自身抗体与DSG3分子结合，由此抑制经由DSG3分子的细胞间的粘附，引起PV病变。
如上所述，在PV患者血清中，通过存在于多克隆抗体中的抗DSG3自身抗体诱发PV病变，不过也分离了将杂交瘤移植到小鼠中时具有诱发PV样病变的能力的抗DSG3单克隆抗体(非专利文献3)。该单克隆抗体在试管内也显示出具有抑制角质形成细胞的细胞粘附的细胞解离活性(非专利文献4)。如上所述，通过抗DSG3抗体在试管内观察的细胞解离活性在生物体内显示为诱发PV病变的活性。
如上所述，已知DSG3蛋白质在角质形成细胞的粘附中具有重要的功能，抗DSG3抗体参与了PV病变的发生。而DSG3蛋白质对其它疾病的参与、或者抗DSG3抗体的细胞解离活性以外的功能尚未明确。特别是DSG3分子与哺乳动物、特别是人的癌症、尤其是肺癌的发生、肺癌细胞的增殖、浸润、转移、或转化的相关性目前尚未明确。
各种癌症中，肺癌在男性和女性中均是死亡率最高的癌症，日本的肺癌死亡率在1950年以后一直是增加的趋势，1998年肺癌死亡人数为50，871人，占全部恶性肿瘤死亡人数的约18％，1993年以后，在男性中间肺癌死亡率超过胃癌，成为恶性肿瘤中的第1位(日本厚生统计协会，国民卫生的动向、厚生指标，47，52～53，2000)。从整个世界来看，每年有300万人左右死于肺癌。肺癌的基本组织类型包含：腺癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌、大细胞癌、小细胞癌。前4种的预后或治疗方针没有大的差异，因此一并称为非小细胞肺癌。
非小细胞肺癌的病例数占全部肺癌的病例数的80～85％。非小细胞肺癌的特征有：与小细胞癌相比，进展缓慢，对化疗或放疗的反应不足。因此，当肿瘤未扩散时，外科切除成为第一选择肢，但治疗效果与在TNM分类中相当于相同病期的胃癌等其它癌肿相比相差很多，最近，盛行尝试通过协同治疗提高该效果，但尚未建立可完全缓解的有效治疗方法。非小细胞肺癌中，对于IIIa期以前的探讨了手术疗法，但对于之后的临床病期缺乏手术适应性，化疗、放疗成为治疗的主体。血清诊断标志物可选择SCC(鳞状细胞癌相关抗原)、Cyfra(细胞角蛋白19片段)、CEA(癌胚抗原)、SLX(唾液酸化Lewis x-i抗原)等，单独或组合使用，但对于分级初期的癌症的阳性率依然较低，人们希望开发确实可进行分级初期的非小细胞肺癌血清诊断的诊断用标志物(腫瘍マ—カ—の読み方の実際；肺癌，臨床と研究78，35～40，2001)。
小细胞肺癌在日本是占肺癌全体的约15～20％的肿瘤，与其它肺癌比较，肿瘤的增殖速度快，但对抗癌药、放射线治疗的感受性高，具有与腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等显著不同的临床上的特征。小细胞癌中，仅对分级Ia期(肿瘤直径20mm以下，且未见向淋巴结、周围器官的浸润和转移)探讨了手术疗法，但基本上是主要采用化疗、放疗的治疗方法。作为诊断标志物，NSE(神经元特异性烯醇化酶)和proGRP(前胃泌素释放肽)可用作对小细胞癌特异性较高的肿瘤标志物，有报道称其阳性率分别为约60％和70％。
尽管在临床实践中还没有应用于肺癌的例子，但是对于乳腺癌或淋巴瘤等，单克隆抗体对癌症特异性肿瘤抗原的靶向疗法可发挥与以往的化疗药物不同的作用机理，因此，治疗奏效率提高。使用上述抗体药物进行靶向疗法时，该抗体发挥功能、产生效果的活性有：经由效应细胞的抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性，经由补体的补体依赖性细胞毒(CDC)活性，或者通过构建与化疗药物、毒性肽或放射性化学物质的缀合分子来发挥的细胞毒活性等。该活性除上述之外，还有：抗体自身对抗原分子进行催化激动作用的激动活性、或者阻断对细胞活化或增殖等的信号的中和活性等。但依然是诊断的阳性率低和疾病的治愈率低，为了应用使用发挥上述活性的抗体的分子靶向疗法对仍有完全缓解余地的肺癌进行治疗，强烈希望对肺癌细胞中的肿瘤特异性表达分子进行鉴定，以该分子为靶，制备可发挥所需活性的抗体。
本发明的相关先行技术文献信息如下。
专利文献1：WO99/57149
专利文献2：WO02/86443
专利文献3：WO03/20769
非专利文献1：J.Clin.Invest.70，281～288，1982
非专利文献2：Cell.67，869～877，1991
非专利文献3：J.Immunology 170，2170～2178，2003
非专利文献4：J.Invest.Dermatol.，124，939～946，2005
发明内容
发明所要解决的抗体
本发明的课题在于：提供抗DSG3抗体及其用途。更具体地说，其目的在于提供使用抗DSG3抗体的诊断和治疗癌症的新型方法、含有抗DSG3抗体的新型的细胞增殖抑制剂和抗癌药、以及新型的抗DSG3抗体。
解决课题的方法
本发明人等发现：DSG3在肺癌等癌细胞中高度表达。并且，在测定抗DSG3抗体的补体依赖性细胞毒(CDC)活性、以及抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性时，发现抗DSG3抗体对于DSG3表达细胞具有CDC活性和ADCC活性。进一步根据上述认识，本发明人等发现：抗DSG3抗体对于以肺癌为代表的DSG3表达亢进的癌症的诊断、预防和治疗有效，从而完成了本发明。
本发明提供含有与DSG3蛋白质结合的抗体作为有效成分的药物组合物。本发明还提供含有与DSG3蛋白质结合的抗体作为有效成分的细胞增殖抑制剂。本发明又提供含有与DSG3蛋白质结合的抗体作为有效成分的抗癌药。优选与DSG3蛋白质结合的抗体是具有细胞毒活性的抗体。还优选癌症是肺癌。进一步优选癌症是非小细胞肺癌。
在另一方式中，本发明提供使DSG3表达细胞和与DSG3蛋白质结合的抗体接触，对表达DSG3蛋白质的细胞引发细胞毒的方法。本发明还提供使表达DSG3蛋白质的细胞和与DSG3蛋白质结合的抗体接触，抑制表达DSG3蛋白质的细胞的增殖的方法。优选与DSG3蛋白质结合的抗体是具有细胞毒活性的抗体。还优选表达DSG3蛋白质的细胞是癌细胞。
在又一方式中，本发明提供与DSG3蛋白质结合、且对于表达DSG3蛋白质的细胞具有细胞毒活性的抗体。优选该细胞毒活性是ADCC活性。优选该细胞毒活性是CDC活性。本发明还提供结合有低分子化疗药物或毒性肽的抗体、或者结合有低分子化疗药物或毒性肽并具有细胞毒活性的抗体。
本发明进一步提供与DSG3蛋白质结合、且对表达DSG3蛋白质的细胞具有细胞毒活性但不具有细胞解离活性的抗体。
在另一方式中，本发明提供作为癌症诊断标志物的DSG3蛋白质的应用。
另外，在又一方式中，本发明提供癌症的诊断方法，其特征在于：使用与DSG3蛋白质结合的抗体检测DSG3蛋白质。本发明的方法中，优选检测DSG3蛋白质的胞外区。还优选本发明的方法使用识别DSG3蛋白质的抗体进行。优选本发明的方法中，检测血液中、血清中或血浆中的DSG3蛋白质，或者由细胞中分离的DSG3蛋白质。
在另一方式中，本发明提供癌症的诊断方法，该方法包含以下步骤：
(a)由受试者采集试样的步骤；
(b)使用与DSG3蛋白质结合的抗体，检测采集的试样中所含的DSG3蛋白质的步骤。
本发明中，上述试样只要可由受试者采集即可，均可使用，在一个方式中，使用由受试者采集的血清，在另一方式中，也可以使用通过活组织检查，由受试者采集的试样。该诊断方法涉及的癌症只要是作为受治对象的癌细胞表达DSG3蛋白质的癌即可，可以是任何癌症，但优选为肺癌，进一步优选非小细胞肺癌。本发明中，由受试者采集试样的步骤也可描述为提供由受试者采集的试样的步骤。
在另一方式中，本发明提供癌症的诊断方法，其中，与DSG3蛋白质结合的抗体是由选自11C、13N、15O、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、124I的任一种核素所标记的抗体。
在另一方式中，本发明提供癌症的诊断方法，其特征在于：检测编码DSG3蛋白质的基因的表达。
在又一方式中，本发明提供在本发明的诊断方法中使用的诊断试剂或试剂盒。
即，本申请提供以下的[1]～[32]。
[1]药物组合物，该药物组合物含有与DSG3蛋白质结合的抗体作为有效成分。
[2]细胞增殖抑制剂，该细胞增殖抑制剂含有与DSG3蛋白质结合的抗体作为有效成分。
[3]抗癌药，该抗癌药含有与DSG3蛋白质结合的抗体作为有效成分。
[4][3]所述的抗癌药，其中，与DSG3蛋白质结合的抗体是具有细胞毒活性的抗体。
[5][3]或[4]所述的抗癌药，其中，与DSG3蛋白质结合的抗体是以下(1)～(47)中任一项所述的抗体：
(1)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.4的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.6的氨基酸序列。
(2)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.8的氨基酸序列。
(3)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列。
(4)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.14的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.16的氨基酸序列。
(5)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.18的氨基酸序列。
(6)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列。
(7)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(4)所述的L链。
(8)抗体，该抗体含有(2)所述的H链和(5)所述的L链。
(9)抗体，该抗体含有(3)所述的H链和(6)所述的L链。
(10)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.22的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.24的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.26的氨基酸序列。
(11)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列。
(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列。
(13)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.30的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.32的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.34的氨基酸序列。
(14)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列。
(15)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列。
(16)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(13)所述的L链。
(17)抗体，该抗体含有(11)所述的H链和(14)所述的L链。
(18)抗体，该抗体含有(12)所述的H链和(15)所述的L链。
(19)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(13)所述的L链。
(20)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(14)所述的L链。
(21)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(15)所述的L链。
(22)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(4)所述的L链。
(23)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(5)所述的L链。
(24)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(6)所述的L链。
(25)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.81的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.83的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.85的氨基酸序列。
(26)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列。
(27)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列。
(28)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.87的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.89的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.91的氨基酸序列。
(29)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列。
(30)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列。
(31)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(28)所述的L链。
(32)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(29)所述的L链。
(33)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(30)所述的L链。
(34)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(28)所述的L链。
(35)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(29)所述的L链。
(36)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(30)所述的L链。
(37)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(28)所述的L链。
(38)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(29)所述的L链。
(39)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(30)所述的L链。
(40)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(4)所述的L链。
(41)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(5)所述的L链。
(42)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(6)所述的L链。
(43)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(13)所述的L链。
(44)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(14)所述的L链。
(45)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(15)所述的L链。
(46)抗体，该抗体是在(1)～(45)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(45)中任一项所述的抗体具有同等活性。
(47)抗体，该抗体与表位结合，该表位与(1)～(45)中任一项所述的抗体所结合的DSG3蛋白质的表位相同。
[6][3]～[5]中任一项所述的抗癌药，其中，癌症是肺癌、大肠癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌或子宫癌。
[7][6]所述的抗癌药，其中，肺癌是非小细胞肺癌。
[8]使表达DSG3蛋白质的细胞和与DSG3蛋白质结合的抗体接触，由此对该DSG3表达细胞引发细胞毒的方法。
[9]使表达DSG3蛋白质的细胞和与DSG3蛋白质结合的抗体接触，由此抑制该DSG3表达细胞的增殖的方法。
[10][8]或[9]所述的方法，其中，与DSG3蛋白质结合的抗体是具有细胞毒活性的抗体。
[11][8]～[10]中任一项所述的方法，其中，与DSG3蛋白质结合的抗体是以下(1)～(47)中任一项所述的抗体：
(1)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.4的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.6的氨基酸序列。
(2)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.8的氨基酸序列。
(3)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列。
(4)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.14的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.16的氨基酸序列。
(5)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.18的氨基酸序列。
(6)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列。
(7)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(4)所述的L链。
(8)抗体，该抗体含有(2)所述的H链和(5)所述的L链。
(9)抗体，该抗体含有(3)所述的H链和(6)所述的L链。
(10)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.22的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.24的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.26的氨基酸序列。
(11)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列。
(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列。
(13)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.30的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.32的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.34的氨基酸序列。
(14)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列。
(15)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列。
(16)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(13)所述的L链。
(17)抗体，该抗体含有(11)所述的H链和(14)所述的L链。
(18)抗体，该抗体含有(12)所述的H链和(15)所述的L链。
(19)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(13)所述的L链。
(20)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(14)所述的L链。
(21)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(15)所述的L链。
(22)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(4)所述的L链。
(23)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(5)所述的L链。
(24)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(6)所述的L链。
(25)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.81的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.83的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.85的氨基酸序列。
(26)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列。
(27)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列。
(28)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.87的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.89的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.91的氨基酸序列。
(29)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列。
(30)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列。
(31)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(28)所述的L链。
(32)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(29)所述的L链。
(33)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(30)所述的L链。
(34)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(28)所述的L链。
(35)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(29)所述的L链。
(36)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(30)所述的L链。
(37)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(28)所述的L链。
(38)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(29)所述的L链。
(39)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(30)所述的L链。
(40)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(4)所述的L链。
(41)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(5)所述的L链。
(42)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(6)所述的L链。
(43)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(13)所述的L链。
(44)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(14)所述的L链。
(45)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(15)所述的L链。
(46)抗体，该抗体是在(1)～(45)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(45)中任一项所述的抗体具有同等活性。
(47)抗体，该抗体与表位结合，该表位与(1)～(45)中任一项所述的抗体所结合的DSG3蛋白质的表位相同。
[12][8]～[11]中任一项所述的方法，其中，表达DSG3蛋白质的细胞是癌细胞。
[13]与DSG3蛋白质结合，且对于表达DSG3蛋白质的细胞具有细胞毒活性的抗体。
[14][13]所述的抗体，其中，细胞毒活性是ADCC活性。
[15][13]所述的抗体，其中，细胞毒活性是CDC活性。
[16][13]～[15]中任一项所述的抗体，其中该抗体是结合有低分子化疗药物或者毒性肽的抗体。
[17]与DSG3蛋白质结合的抗体，其中该抗体是结合有低分子化疗药物或者毒性肽的抗体。
[18][13]～[17]中任一项所述的抗体，其中该抗体是以下(1)～(47)中任一项所述的抗体：
(1)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.4的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.6的氨基酸序列。
(2)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.8的氨基酸序列。
(3)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列。
(4)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.14的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.16的氨基酸序列。
(5)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.18的氨基酸序列。
(6)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列。
(7)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(4)所述的L链。
(8)抗体，该抗体含有(2)所述的H链和(5)所述的L链。
(9)抗体，该抗体含有(3)所述的H链和(6)所述的L链。
(10)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.22的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.24的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.26的氨基酸序列。
(11)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列。
(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列。
(13)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.30的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.32的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.34的氨基酸序列。
(14)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列。
(15)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列。
(16)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(13)所述的L链。
(17)抗体，该抗体含有(11)所述的H链和(14)所述的L链。
(18)抗体，该抗体含有(12)所述的H链和(15)所述的L链。
(19)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(13)所述的L链。
(20)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(14)所述的L链。
(21)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(15)所述的L链。
(22)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(4)所述的L链。
(23)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(5)所述的L链。
(24)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(6)所述的L链。
(25)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.81的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.83的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.85的氨基酸序列。
(26)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列。
(27)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列。
(28)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.87的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.89的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.91的氨基酸序列。
(29)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列。
(30)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列。
(31)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(28)所述的L链。
(32)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(29)所述的L链。
(33)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(30)所述的L链。
(34)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(28)所述的L链。
(35)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(29)所述的L链。
(36)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(30)所述的L链。
(37)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(28)所述的L链。
(38)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(29)所述的L链。
(39)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(30)所述的L链。
(40)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(4)所述的L链。
(41)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(5)所述的L链。
(42)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(6)所述的L链。
(43)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(13)所述的L链。
(44)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(14)所述的L链。
(45)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(15)所述的L链。
(46)抗体，该抗体是在(1)～(45)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(45)中任一项所述的抗体具有同等活性。
(47)抗体，该抗体与表位结合，该表位与(1)～(45)中任一项所述的抗体所结合的DSG3蛋白质的表位相同。
[19]DSG3蛋白质作为癌症诊断标志物的应用。
[20]癌症的诊断方法，其特征在于：使用与DSG3蛋白质结合的抗体来检测DSG3蛋白质。
[21]癌症的诊断方法，该方法包含以下步骤：
(a)由受试者采集试样的步骤；
(b)使用与DSG3蛋白质结合的抗体来检测采集的试样中所含的DSG3蛋白质的步骤。
[22][20]或[21]所述的诊断方法，其中，与DSG3蛋白质结合的抗体是由发射正电子核素标记的抗体。
[23][22]所述的诊断方法，其中，发射正电子核素是选自11C、13N、15O、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、124I中任一种的核素。
[24]癌症的诊断方法，其特征在于：检测编码DSG3蛋白质的基因的表达。
[25][20]～[24]中任一项所述的诊断方法，其中，癌症是肺癌、大肠癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌或子宫癌。
[26][25]所述的诊断方法，其中，肺癌是非小细胞肺癌。
[27]诊断药物，该诊断药物用于[20]～[26]中任一项所述的诊断方法。
[28]试剂盒，该试剂盒用于[20]～[26]中任一项所述的诊断方法。
[29]与DSG3蛋白质结合的抗体在制备细胞增殖抑制剂中的应用。
[30]与DSG3蛋白质结合的抗体在制备抗癌药中的应用。
[31]抑制细胞增殖的方法，该方法包含将与DSG3蛋白质结合的抗体给予受治对象的步骤。
[32]预防或治疗癌症的方法，该方法包含将与DSG3蛋白质结合的抗体给予受治对象的步骤。
附图简述
图1是表示使用基因芯片U133对正常组织和癌组织中的DSG3基因的表达进行分析的结果图。
图2是表示使用基因芯片U133对癌细胞株中的DSG3基因的表达进行分析的结果图。
图3是表示通过免疫染色使DSG3蛋白质在肺鳞状细胞癌中的表达可视化的免疫组织染色的结果照片。全部5例临床检样中均显示DSG3蛋白质表达亢进。
图4是表示显示抗DSG3单克隆抗体DF120、DF122、DF148、DF151、DF153、DF168、DF331、DF364、DF366与恒定表达全长DSG3的CHO细胞株结合的流式细胞术分析的结果图。
图5是表示抗DSG3单克隆抗体DF120、DF122、DF148、DF151、DF153、DF168、DF331对恒定表达全长DSG3的CHO细胞株的CDC活性的图。
图6是表示抗DSG3单克隆抗体DF151对人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431、以及恒定表达DSG3的人肺鳞状细胞癌细胞株DSG3-A549细胞株的CDC活性的图。
图7是表示抗DSG3单克隆抗体DF151、DF364以及DF366对恒定表达DSG3的人肺鳞状细胞癌细胞株—DSG3-A549细胞株的ADCC活性的图。图7A表示使用来自小鼠骨髓的效应细胞的分析结果，图7B表示使用来自小鼠脾脏的效应细胞的分析结果，
图8是表示抗DSG3小鼠-人嵌合抗体DF151c、DF364c以及DF366c对恒定表达DSG3的Ba/F3细胞株—DSG3-Ba/F3细胞株的CDC活性的图。
图9是表示抗DSG3小鼠-人嵌合抗体DF364c以及DF366c、低岩藻糖型抗DSG3小鼠-人嵌合抗体YB-DF364c和YB-DF366c对恒定表达DSG3的Ba/F3细胞株DSG3-Ba/F3细胞株的ADCC活性的图。
图10是表示抗DSG3抗体DF366m(小鼠IgG2a嵌合抗体)、低岩藻糖DF366m(低岩藻糖型小鼠IgG2a嵌合抗体)、DF366c(小鼠-人嵌合抗体)、以及YB-DF366c(低岩藻糖型小鼠-人嵌合抗体)对恒定表达DSG3的Ba/F3细胞株—DSG3-Ba/F3细胞株的ADCC活性的图。效应细胞使用添加了白细胞介素-2的小鼠脾细胞。
图11是表示抗DSG3抗体DF366m(小鼠IgG2a嵌合抗体)、低岩藻糖DF366m(低岩藻糖型小鼠IgG2a嵌合抗体)、DF366c(小鼠-人嵌合抗体)、以及YB-DF366c(低岩藻糖型小鼠-人嵌合抗体)对恒定表达DSG3的Ba/F3细胞株—DSG3-Ba/F3细胞株的ADCC活性的图。效应细胞使用在白细胞介素-2存在下将小鼠脾细胞培养4天所得的细胞。
图12是表示抗DSG3抗体DF366m(小鼠IgG2a嵌合抗体)和低岩藻糖DF366m(低岩藻糖型小鼠IgG2a嵌合抗体)的抗肿瘤活性的图。
实施发明的最佳方式
DSG3(Desmoglein3，桥粒芯蛋白3)是轴突导向受体蛋白，公开的其氨基酸序列和编码该序列的基因序列分别为GemBank检索号NP_001935(SEQ ID NO.40)和NM_001944(SEQ ID NO.39)。本发明中，DSG3蛋白质是指包含全长蛋白质及其片段两者。片段是含有DSG3蛋白质的任意区域的多肽，可以不具有天然DSG3蛋白质的功能。对片段的例子没有限定，可以是包含DSG3蛋白质的胞外区的片段。DSG3蛋白质的胞外区在SEQ ID NO.40的氨基酸序列中相当于第1～616号。跨膜区在SEQ ID NO.40的氨基酸序列中相当于第617～641号。
本发明中，在肺癌组织中发现DSG3以非常高的频率在基因水平和蛋白质水平表达亢进。对其它癌症种类的临床检样或癌细胞株的分析显示：不仅是肺癌，在大肠癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌或子宫癌等中也表达亢进。还显示，使用DSG3蛋白质特异性单克隆抗体可以进行免疫组织诊断。即，DSG蛋白质可用作癌症诊断的标志物。
DSG3基因表达的检测
本发明的方法的特征在于：检测DSG3基因表达。本发明的方法之一的方式中，检测DSG3蛋白质的表达。
本发明中，检测包含定量或定性的检测，例如，定性的检测可以是单纯的对DSG3蛋白质是否存在的测定、DSG3蛋白质是否存在一定量以上的测定、将DSG3蛋白质的量与其它试样(例如对照试样等)进行比较的测定等。而定量检测可以是测定DSG3蛋白质的浓度、测定DSG3蛋白质的量等。
被检试样只要是可能含有DSG3蛋白质的试样即可，没有特别限定，优选从哺乳类等生物的体内采集的试样，进一步优选为由人采集的试样。被检试样的具体例子例如有：血液、间质液、血浆、血管外液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿等，优选为血液、血清或血浆。此外，本发明的被检试样也包含由下述被检试样得到的试样，即由生物体内采集的组织或细胞固定而得到的标本或者细胞的培养液等。
对要诊断的癌症没有特别限定，可以是任何癌症，具体有肺癌、大肠癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌或子宫癌等。优选的是肺癌，特别优选的是非小细胞肺癌。
本发明中，被检试样中检测出DSG3蛋白质时，与阴性对照或正常者比较，判断被检试样中检测出的DSG3蛋白质的量多时，可以判定受试者为癌症，或者将来罹患癌症的可能性高。
本发明的受试者只要是遗传性具有DSG3蛋白质的动物种类即可，所述动物种类已知有：猴、牛、绵羊、小鼠、狗、猫、仓鼠等人以外的多种哺乳类。特别适合使用的受试者是人，但并不限于此。
本发明的诊断方法的优选方式包含具以下特征的诊断方法：在固定有组织或细胞的切片上检测DSG3蛋白质，所述组织或细胞由罹患了上述癌症的患者获得。本发明的其它方式包含具以下特征的诊断方法：检测从细胞中游离出、存在于血液中的DSG3蛋白质。特别优选本发明是以下的诊断方法：检测存在于血液中的、含有DSG3蛋白质胞外区的片段。
对被检试样中所含的DSG3蛋白质的检测方法没有特别限定，优选通过使用抗DSG3抗体的免疫学方法进行检测。免疫学方法例如有：放射免疫测定(RIA)、酶联免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、发光免疫测定(LIA)、免疫沉降法(IP)、免疫比浊法(TIA)、蛋白质印迹法(WB)、免疫组织染色法(IHC)、免疫扩散法(SRID)等，优选酶联免疫测定，特别优选酶联免疫吸附定量法(enzyme-linked immunosorbentassay：ELISA)，其中的一个方式例如有夹层ELISA(sandwich ELISA)。ELISA等上述免疫学方法可按照本领域技术人员公知的方法进行。
使用抗DSG3抗体的常规检测方法例如有以下的方法。将抗DSG3抗体固定在支撑体上，然后为了防止蛋白质与支撑体的非特异性结合，例如用胎牛血清白蛋白(BSA)、明胶、白蛋白等封闭支撑体。接着，通过向支撑体中加入被检试样进行孵育，使已经与支撑体结合的抗DSG3抗体与DSG3蛋白质结合。然后用清洗液清洗与支撑体结合的抗DSG3抗体和DSG3蛋白质的复合物，除去与支撑体上的抗DSG3抗体结合的DSG3蛋白质以外、与该支撑体非特异性结合的DSG3蛋白质。通过定性或定量检测支撑体上的与抗DSG3抗体结合的DSG3蛋白质，进行被检试样中的DSG3蛋白质的检测，该方法可作为使用抗DSG3抗体的检测方法，以下进一步给出几个具体例子进行说明。
本发明中，用于固定抗DSG3抗体的支撑体例如有：琼脂糖、纤维素等不溶性多糖类，有机硅树脂、聚苯乙烯树脂、聚丙烯酰胺树脂、尼龙树脂、聚碳酸酯树脂等合成树脂或玻璃等不溶性的支撑体。这些支撑体可以以珠或板的形状使用。为珠状时，可使用填充了它们的柱等。为板状时，可使用多孔板(96孔多孔板等)、或生物传感芯片等。抗DSG3抗体与支撑体的结合中，可以通过化学键或物理吸附等通常使用的方法，使抗DSG3抗体与支撑体结合。这些支撑体均可优选使用市售的商品。
抗DSG3抗体与DSG3蛋白质的结合通常在缓冲液中进行。缓冲液例如可使用磷酸缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等。孵育的条件可以是常规使用的条件，例如优选在4℃～室温之间的温度下、以1小时～24小时的时间实施孵育。孵育后的清洗只要不妨碍DSG3蛋白质与抗DSG3抗体的结合即可，例如可优选使用含有吐温20等表面活性剂的缓冲液等。
本发明的DSG3蛋白质的检测方法中，除该用于检测DSG3蛋白质含量的被检试样之外，还可适当制备对照试样。对照试样例如有：不含有DSG3蛋白质的阴性对照试样、或含有DSG3蛋白质的阳性对照试样等。这种情况下，可以通过对由不含有DSG3蛋白质的阴性对照试样得到的结果、和由含有DSG3蛋白质的阳性对照试样得到的结果进行比较，确认被检试样中是否存在DSG3蛋白质。另外，制备使浓度阶段变化的一系列对照试样，以数值的形式得到对各对照试样的检测结果，然后基于与DSG3蛋白质的浓度值对应的测定值制成标准曲线，根据该标准曲线可以定量检测被检试样中所含的DSG3蛋白质。
经由抗DSG3抗体检测与支撑体结合的DSG3蛋白质的优选方式例如有：使用用标记物标记的抗DSG3抗体的方法。例如，通过使被检试样与固定在支撑体上的抗DSG3抗体接触，清洗，然后使用特异性识别与该抗DSG3抗体结合的DSG3蛋白质的标记抗体，可以检测该DSG3蛋白质。
抗DSG3抗体的标记可按照通常已知的方法进行。标记物可以使用荧光染料、酶、辅酶、化学发光物质、放射性物质等本领域技术人员所公知的标记物质，具体例子有：放射性同位素(32P、14C、125I、3H、131I等)、荧光素、罗丹明、丹磺酰氯、伞形酮、萤光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、微过氧化物酶、生物素等。使用生物素作为标记物时，优选添加生物素标记抗体，然后进一步添加使碱性磷酸酶等酶结合的抗生物素蛋白。为了使标记物与抗DSG3抗体结合，可以采用戊二醛法、马来酰亚胺法、二硫吡啶法、高碘酸法等公知的方法。
具体来说，通过将含有抗DSG3抗体的溶液加入到板等支撑体上，使抗DSG3抗体固定在支撑体上。板清洗后，为了防止蛋白质的非特异性结合，例如可用胎牛血清白蛋白(BSA)、明胶、白蛋白等封闭该板。板再次清洗后，将被检试样加入到板中，进行孵育。孵育后，清洗该板，加入标记抗DSG3抗体。适当孵育后，清洗该板，可以检测出残留在该板上的标记的抗DSG3抗体。检测可按照本领域技术人员所公知的方法进行，例如检测用放射性物质标记的抗DSG3抗体时，该标记抗DSG3抗体可通过液体闪烁计数法或RIA法检测。检测用酶标记的抗DSG3抗体时，向该标记抗DSG3抗体中加入底物，然后可通过分光光度计检测底物的酶促变化，例如显色。底物的具体例子有：2，2-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1，2-苯二胺(邻苯二胺)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)等。底物为荧光发光物时，底物的酶促变化可使用荧光分光光度计检测。
本发明的DSG3蛋白质的检测方法的特别优选的方式是使用用生物素标记的抗DSG3抗体以及抗生物素蛋白的方法。具体来说，通过将含有抗DSG3抗体的溶液加入到板等支撑体上，可以使抗DSG3抗体固定在该板上。该板清洗后，为了防止蛋白质的非特异性的结合，该板例如可以用BSA等封闭。再次清洗该板，然后将被检试样加入到该板中。孵育后，清洗该板，并将生物素标记的抗DSG3抗体加入到该板上。适当孵育，然后清洗该板，并将与碱性磷酸酶、过氧化物酶等酶结合的抗生物素蛋白加入到该板上。孵育后清洗该板，加入可以使与抗生物素蛋白结合的酶发挥作用的底物后，以底物的酶促变化等为指标，可以检测DSG3蛋白质。
本发明的检测DSG3蛋白质的方法的另一方式是使用一种以上特异性识别DSG3蛋白质的一次抗体、以及一种以上特异性识别该一次抗体的二次抗体的方法。
例如，在板等的支撑体上固定抗DSG3抗体后，为了防止蛋白质与支撑体的非特异性结合，例如可用胎牛血清白蛋白(BSA)、明胶、白蛋白等封闭该板。接着向该板中加入被检试样，然后进行孵育，使已经与该板结合的抗DSG3抗体与DSG3蛋白质结合。然后通过清洗液清洗该板，从该板中除去不与抗DSG3抗体特异性结合、而是非特异性地与该支撑体结合的DSG3蛋白质。使与同支撑体结合的抗体不同的另外一种抗DSG3抗体与抗DSG3蛋白质结合，然后使二次抗体与由该DSG3蛋白质和抗DSG3抗体形成的复合物进行反应，该二次抗体可以只与抗DSG3抗体结合，该抗DSG3抗体不与支撑体而与DSG3蛋白质结合。上述操作的结果，是通过对结合的二次抗体进行定向或定量检测，来检测被检试样中DSG3蛋白质的方法。此时，可通过标记物适当标记二次抗体。
本发明的DSG3蛋白质的检测方法的另一方式例如有：利用聚集反应的检测方法。该方法中，可以使用吸附有抗DSG3抗体的载体，检测DSG3蛋白质。吸附抗体的载体只要为不溶性、不发生非特异性反应、且稳定即可，可以使用任何抗体。例如有：胶乳颗粒、皂土、胶棉、高岭土、固定羊红细胞等，但优选使用胶乳颗粒。胶乳颗粒例如可使用聚苯乙烯胶乳颗粒、苯乙烯-丁二烯共聚物胶乳颗粒、聚乙烯基甲苯胶乳颗粒等，但优选使用聚苯乙烯胶乳颗粒。将致敏的颗粒与试样混合，搅拌一定时间。试样中以高浓度含有DSG3蛋白质等颗粒的聚集度大，因此可以通过肉眼估算该聚集度，由此可以检测DSG3蛋白质。另外，通过分光光度计等测定聚集导致的浊度的增加，也可检测出DSG3蛋白质。
本发明的DSG3蛋白质的检测方法的另一方式例如有：使用利用表面等离子体共振现象的生物传感器的方法。通过使用利用表面等离子体共振现象的生物传感器，蛋白质与蛋白质之间的相互作用作为表面等离子体共振信号，无需标记即可实时观察该蛋白质。例如，可以通过使用BIAcore(Biacore制造)等生物传感器来检测DSG3蛋白质与抗DSG3抗体的结合。具体来说，使被检试样与固定有抗DSG3抗体的传感芯片接触，可以以共振信号的变化的形式检测出与抗DSG3抗体结合的DSG3蛋白质。
除上述例举的标记之外，还可以使用18F、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr和124I等发射正电子的核素，可按照常规方法(ActaOncol.32，825～830，1993)标记抗DSG3抗体。用上述发射正电子核素标记的抗DSG3抗体给予人或动物后，通过使用非侵袭性获得药物动力相关的数据的装置PET(正电子断层摄影装置)，可以从体外计测由该放射性核素放射的放射线，通过计算机层析成像方法变换为定量图像。如上所述，通过使用PET，在不需要从患者采集试样的情况下，即可以检测在特定的癌症中高表达的抗原分子。抗DSG3抗体除上述核素之外，还可以使用11C、13N、15O、18F、45Ti等发射正电子的核素，通过短寿命RI进行放射标记。
目前，使用由医疗用回旋加速器得到的上述核素的短寿命核素的生产、短寿命RI标记化合物制备技术等相关研究开发得到进展，可由该技术标记抗DSG3抗体。用上述发射正电子核素标记抗DSG3抗体后给予患者，由此识别生物体内存在的DSG3蛋白质的该标记抗DSG3抗体可以根据抗DSG3抗体与各部位的病理组织的特异性，聚集在原发灶和转移灶中，因此可以通过检测其放射活性来诊断该原发灶和转移灶的存在。在该诊断用途中使用时，可以适当使用25～4000keV的γ粒子或正电子放射量的活性值。选择适当的核素进一步大量给予，有望获得治疗效果，这种情况下可适当使用70～700keV的γ粒子或正电子放射量值。
本发明的方法的另一方式中，检测DSG3mRNA的表达。本发明中，检测包含定量或定性检测，例如定性检测例如有：单纯的DSG3mRNA是否存在的测定、DSG3 mRNA是否存在一定量以上的测定、DSG3 mRNA的量与其它试样(例如对照试样等)进行比较的测定等。而定量检测可以是测定DSG3 mRNA的浓度、测定DSG3 mRNA的量等。
被检试样只要是有含有DSG3 mRNA的可能性的试样即可，没有特别限定，优选为由哺乳类等生物的体内采集的试样，进一步优选由人采集的试样。被检试样的具体例子例如有：血液、间质液、血浆、血管外液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿等，但优选的是血液、血清或血浆。此外，在本发明的被检试样中也包含由下述被检试样获得的试样，即由生物体内采集的组织或细胞固定而得到的标本或者细胞的培养液等。
对所要诊断的癌症没有特别限定，可以是任何癌症，具体有肺癌、大肠癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌或子宫癌等，优选的是肺癌，特别优选的是小细胞肺癌。
本发明中的受试者只要是遗传性具有DSG3蛋白质的动物种类即可，所述动物种类已知有：猴、牛、绵羊、小鼠、狗、猫、仓鼠等人以外的很多种哺乳类。特别适合使用的受试者是人，但并不限于此。
以下给出检测方法的具体方式，但本发明的方法并不限于这些方法。首先由受试者制备试样。接着检测该试样中含有的DSG3 mRNA。本发明中，可以进行由mRNA合成的cDNA的检测。本发明中，在被检试样中检测出DSG3 mRNA或编码DSG3的cDNA时，与阴性对照或正常者比较，判断被检试样中检测出的DSG3 mRNA或编码DSG3的cDNA的量多时，则可以判定受试者为癌症，或者将来罹患癌症的可能性高。
这些方法可以是本领域技术人员所周知的方法，例如RNA印迹法、RT-PCR法、DNA阵列法等。
上述本发明的检测方法可以使用各种自动检测装置实现自动化，也可以是对于大量的试样进行一次性检测。
本发明的目的还在于提供诊断试剂或试剂盒，该诊断试剂或试剂盒用来检测用于癌症诊断的被检试样中的DSG3蛋白质，该诊断试剂或试剂盒至少含有抗DSG3抗体。根据作为ELISA法等的EIA法进行时，该诊断试剂或试剂盒可以含有固定有抗体的载体，抗体可以预先与载体结合。基于使用胶乳等载体的聚集法时，该诊断药或试剂盒可以含有吸附有抗体的载体。
本发明的目的又在于提供诊断试剂或试剂盒，该诊断试剂或试剂盒用来检测用于癌症诊断的被检试样中的DSG3mRNA、或编码DSG3的cDNA，该诊断试剂或试剂盒至少含有编码DSG3的DNA(含有SEQID NO.39所述核苷酸序列的DNA)、或含有至少15个核苷酸与该互补链互补的寡核苷酸。
这里，“互补链”是指由A:T(为RNA时则为U)、G:C碱基对构成的双链核酸中相对于一条链的另一条链。另外“互补”并不仅限于在至少15个连续的核苷酸区完全互补的序列，还可以在核苷酸序列上具有至少70％、优选至少80％、更优选90％、进一步优选95％以上的同源性。用于确定同源性的算法可以采用本说明书所述的方法。
本发明的寡核苷酸可以作为编码DSG3的DNA的检测或扩增中使用的探针或引物、用于检测该DNA表达的探针或引物使用。本发明的寡核苷酸还可以以DNA阵列的基板形式使用。
使用该寡核苷酸作为引物时，其长度通常为15bp～100bp，优选为17bp～30bp。引物只要是可扩增编码DSG3的DNA、或其互补链的至少一部分即可，没有特别限定。作为引物使用时，其3’末端区可制成具互补性，可以对其5′末端附加限制酶识别序列或tag等。
使用上述寡核苷酸作为探针时，该探针只要于编码DSG3的DNA、或其互补链的至少一部分特异性杂交即可，没有特别限定。该探针可以是合成寡核苷酸，通常至少具有15bp以上的链长。
使用本发明的寡核苷酸作为探针时，优选适当标记后使用。标记方法例如有：使用T4多核苷酸激酶，用32P将寡核苷酸5′末端磷酸化而进行标记的方法；以及使用克列诺酶等的DNA聚合酶，以随机六聚寡核苷酸等作为引物，摄入用32P等放射性同位素、荧光染料或生物素等标记的底物核苷酸的方法(随机引物法等)。
本发明的寡核苷酸例如可通过市售的寡核苷酸合成仪来制备，探针可以制成通过限制酶处理等获得的双链DNA片段的形式。
上述诊断试剂或试剂盒中，除作为有效成分的寡核苷酸或抗体之外，例如可以根据需要混合无菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂类、溶解助剂、缓冲剂、蛋白质稳定剂(BSA或明胶等)、保存剂、封闭溶液、反应溶液、反应中止液、用于处理试样的试剂等。
本发明的诊断方法可以在体外或体内进行，优选在体外进行。
本发明的癌症诊断方法的优选方式可以例举包含以下步骤的方法：
(a)提供由受试者采集的试样的步骤；
(b)检测(a)的试样中所含的DSG3蛋白质的步骤。
本发明的癌症诊断的进一步优选方式可以例举包含以下步骤的方法：
(a)提供由受试者采集的试样的步骤；
(b)检测(a)的试样中所含的DSG3基因的步骤。
抗DSG3抗体的制备
本发明中使用的抗DSG3抗体只要可与DSG3蛋白质特异性结合即可，不限定其来源、种类(单克隆、多克隆)和形状。具体来说，可以使用动物抗体(例如小鼠抗体、大鼠抗体、骆驼抗体)、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体等公知的抗体。抗体可以是多克隆抗体，但优选为单克隆抗体。
本发明中使用的抗DSG3抗体可以使用公知的方法、以单克隆或多克隆抗体的形式获得。本发明中所使用的抗DSG3抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体包含：通过杂交瘤产生的单克隆抗体；以及通过基因工程的方法、由用含有抗体基因的表达载体转化的宿主产生的单克隆抗体等。
产生单克隆抗体的杂交瘤基本上可采用公知技术，如下制备。即，使用DSG3蛋白质作为致敏抗原，将其按照常规免疫方法进行免疫，通过常规的细胞融合法将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合，通过通常的筛选法筛选单克隆的抗体产生细胞，由此可选择产生抗DSG3抗体的杂交瘤。
具体来说，单克隆抗体的制备例如可如下进行。首先，使在GenBank检索号NM-001944(SEQ ID NO.39)中公开了其核苷酸序列的DSG3基因表达，由此可获得作为取得抗体的致敏抗原使用的DSG3蛋白质。即，将编码DSG3的基因序列插入到公知的表达载体中，转化适当的宿主细胞，然后按照公知的方法，从该宿主细胞中或培养上清中纯化目标人DSG3蛋白质。另外，纯化的天然DSG3蛋白质也可同样使用。
对哺乳动物进行免疫的致敏抗原可使用该纯化DSG3蛋白质。DSG3的部分肽也可以用作致敏抗原。此时，该部分肽可通过化学合成，由人DSG3的氨基酸序列获得，也可以将DSG3基因的一部分整合到表达载体中，使其表达来获得，还可以进一步通过蛋白分解酶分解DSG3蛋白质来获得，对用作部分肽的DSG3的区域和大小没有限定。
对用该致敏抗原免疫的哺乳动物没有特别限定，优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的适合性而进行选择，通常可使用啮齿类的动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠或兔、猴等。
可按照公知的方法，通过致敏抗原免疫上述动物。例如，常规方法是可将致敏抗原通过腹腔内或皮下注射给予哺乳动物来实施免疫。具体来说，将用PBS(磷酸缓冲盐)或生理盐水等、以适当的稀释倍率稀释的致敏抗原按照需要与常规的佐剂例如弗氏完全佐剂混合、乳化，然后每隔4～21天分多次将该致敏抗原给予哺乳动物。用致敏抗原进行免疫时可使用适当的载体。特别是使用分子量小的部分肽作为致敏抗原时，优选将该致敏抗原肽与白蛋白、钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)等载体蛋白结合后用于免疫。
如上所述，哺乳动物被免疫，确认血清中所需抗体量升高后，从哺乳动物中采集免疫细胞用于细胞融合。特别优选的免疫细胞是脾细胞。
与上述免疫细胞融合的细胞可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。该骨髓瘤细胞优选使用公知的各种细胞株，例如P3(P3x63Ag8.653)(J.Immnol.(1979)123，1548～1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics inMicrobiology and Immunology(1978)81，1～7)、NS-1(Kohler.G.和Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511～519)、MPC-11(Margulies.D.H.等人.，Cell(1976)8，405～415)、SP2/0(Shulman，M.等人.，Nature(1978)276，269～270)、FO(de St.Groth，S.F.等人.，J.Immunol.Methods(1980)35，1～21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313～323)、R210(Galfre，G.等人.，Nature(1979)277，131～133)等。
基本上可按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3～46)进行上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。
更具体地说，例如在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中可实施上述细胞融合。融合促进剂例如可使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，为了进一步提高融合效率，可以根据需要添加二甲基亚砜等辅助剂。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可任意设定。例如优选相对于骨髓瘤细胞使免疫细胞为1～10倍。上述细胞融合中使用的培养液例如可使用适合上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、或在该种细胞培养中使用的常规培养液，并且，可适当添加胎牛血清(FCS)等血清补液，结合使用。
细胞融合可如下形成，即将上述规定量的免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，通常以30～60％(w/v)的浓度添加预先加温至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量为1000～6000左右)，通过混合形成目标融合细胞(杂交瘤)。接着，依次添加上述例举的适当培养液，通过离心除去上清，并将该操作反复进行，可以除去对杂交瘤生长不利的细胞融合剂等。
上述得到的杂交瘤通常可通过在常规选择培养液例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养液)中培养来进行选择。为了使目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡可以使用上述HAT培养液持续培养足够的时间(通常，所述足够的时间是数天至数周)。接着，通过实施常规的极限稀释法，可以实施产生目标抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。
另外，识别DSG3的抗体的制备可以采用国际公开WO03/104453中所述的方法进行制备。
目标抗体的筛选和单一克隆可优选按照基于公知的抗原抗体反应的筛选方法进行实施。例如，可以使抗原与用聚苯乙烯等制成的珠或市售的96孔微量滴定板等载体结合，与杂交瘤的培养上清反应，清洗载体，然后与用酶标记的二次抗体等反应，由此可以确定培养上清中是否含有与致敏抗原反应的目的抗体。产生与抗原具有结合能力的所需抗体的杂交瘤可以通过极限稀释法等进行克隆。此时，抗原不仅可以使用用于免疫的抗原，还可以适当使用实质为相同性质的DSG3蛋白质。
通过将抗原对人以外的动物进行免疫、获得上述杂交瘤，除上述方法之外，通过将人淋巴细胞在体外用DSG3蛋白质致敏，将致敏的淋巴细胞与来自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞融合，也可以获得与DSG3蛋白质具有结合活性的所需的人抗体(参照日本特公平1-59878号公报)。并且，对具有完全人抗体基因的所有组成成分的转基因动物给予作为抗原的DSG3蛋白质，使由此所得的抗DSG3抗体产生细胞无限增殖，然后从该无限增殖细胞中分离DSG3蛋白质的人抗体，也可以获得所需人抗体(参照国际公开WO94/25585、WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602)。
产生上述制备的单克隆抗体的杂交瘤可在常规的培养液中继代培养，还可同样实施该杂交瘤在液氮中的长期保存。
由该杂交瘤获得单克隆抗体时，可优选实施以下的方法：按照常规方法培养该杂交瘤，以其培养上清的形式获得单克隆抗体的方法；或者将杂交瘤给予与其具有适合性的哺乳动物，使其增殖，以其腹水的形式获得单克隆抗体的方法等。前者的方法适合获得高纯度的抗体，而后者的方法适合抗体的大量生产。
本发明中，由杂交瘤克隆抗体基因后，可以将该基因整合到适当的载体中，导入到宿主中，由采用上述基因重组技术制备的重组细胞产生的重组型抗体可用作单克隆抗体(例如参照Vandamme，A.M.等人.，Eur.J.Biochem.(1990)192，767～775)。具体来说，该基因可以通过从产生抗DSG3抗体的杂交瘤细胞中分离编码抗DSG3抗体的可变区(V区)的mRNA来获得。即，可以通过公知的方法例如胍超离心法(Chirgwin，J.M.等人.，Biochemistry(1979)18，5294～5299)、APGC法(Chomczynski，P.等人.，Anal.Biochem.(1987)162，156～159)等，由该杂交瘤细胞制备总RNA，然后使用mRNA纯化试剂盒(GE HealthcareBio-Sciences制备)等可以制备目标mRNA。还可以通过使用QuickPrepmRNA纯化试剂盒(GE Healthcare Bio-Sciences制备)由该杂交瘤直接制备mRNA。
使用反转录酶，可以从所得mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成可使用AMV反转录酶第一链cDNA合成试剂盒(AMV ReverseTranscriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit)(生化学工业制备)等进行实施。为了进行cDNA的合成和扩增，还可优选采用用5′-AmpliFINDER RACE试剂盒(Clontech制备)和PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.等人.，Proc.Natl.Acid.Sci.USA(1988)85，8998～9002、Belyavsky，A.等人.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919～2932)等，上述cDNA的合成过程中，可以向cDNA的两个末端导入后述的适当的限制酶切位点。
由所得的PCR产物纯化目标cDNA片段，接着，与载体DNA连接。如上制备重组载体，并将其导入到大肠杆菌等中，筛选菌落，然后从形成该菌落的大肠杆菌中制备所需的重组载体。该重组载体是否具有目标cDNA的核苷酸序列，这可以通过公知的方法例如双脱氧核苷酸链终止法等进行确认。在获得编码目标抗DSG3抗体的V区的cDNA后，通过识别插入到该cDNA两个末端的限制酶切位点的酶消化该cDNA。通过连接，上述被消化的编码抗DSG3抗体的V区的cDNA与用相同组合的酶消化得到的、编码所需抗体恒定区(C区)的DNA进行符合读框的融合，整合到含有该C区的表达载体中。
制备本发明中使用的抗DSG3抗体时，可优选采用将抗体基因整合到表达控制区、例如在增强子、启动子的控制下进行表达的表达载体中的方法。接着，使用该表达载体适当转化宿主细胞，由此可获得表达编码抗DSG3抗体的DNA的重组细胞。
抗体基因的表达可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别整合到表达载体中，同时转化宿主细胞，或者将编码H链和L链的DNA整合到单一的表达载体中，转化宿主细胞(参照国际公开WO94/11523)。
先分离抗体基因、再导入到适当的宿主细胞中制备抗体时，优选使用适当的宿主和表达载体的组合。使用真核细胞作为宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞、真菌细胞。动物细胞已知有：(1)哺乳类细胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾细胞)、Hela、Vero，(2)两栖类细胞，例如非洲爪蟾卵细胞，或(3)昆虫细胞，例如sf9、sf21、Tn5等。植物细胞已知有来自烟草属(Nicotiana)例如烟草(Nicotianatabacum)的细胞，可以进行愈伤组织培养。真菌细胞已知有：酵母例如糖酵母属(Saccharomyces)例如啤酒糖酵母(Saccharomycesserevisiae)、丝状菌例如曲霉属(Aspergillus)例如黑曲霉(Aspergillusniger)等。使用原核细胞时，优选采用使用细菌细胞的产生体系。细菌细胞已知有大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。通过转化向这些细胞中导入含有目标抗体基因的表达载体，将转化的细胞在体外进行培养，所需的抗体可由该转化细胞的培养物中获得。
重组型抗体的产生不仅可使用上述宿主细胞，也优选使用转基因动物。例如抗体基因可符合读框地插入到编码乳汁中特性产生的蛋白质(山羊β酪蛋白等)的基因的内部，以融合基因的形式构建。含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段可以注入到山羊胚胎中，该注入胚胎可以导入到雌性山羊体内。从接受了胚胎的山羊所产出的转基因山羊或其子代所产生的乳汁中可以获得所需抗体。另外，为了使由转基因山羊产生的含有所需抗体的乳汁量增加，激素可适当应用于转基因山羊(Ebert，K.M.等人.，Bio/Technology(1994)12，699～702)。
本发明的重组抗体的C区可以使用来自动物抗体的C区。例如小鼠抗体的H链C区可以使用Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε，L链的C区可使用Cκ、Cλ。另外，小鼠抗体以外的动物抗体可使用大鼠、兔、山羊、绵羊、骆驼、猴等的动物抗体。这些序列是公知的。为了改善抗体或其产生的稳定性，可以对C区进行修饰。
本发明中，为了降低对人的异种抗原性等，可以使用人工修饰的基因重组型抗体、例如嵌合抗体、人源化抗体等。这些修饰抗体可采用公知的方法进行制备。嵌合抗体是含有人以外的动物例如小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体。编码小鼠抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，将其整合到表达载体中，由此可以制备表达该DNA的重组载体。培养由该载体转化的重组细胞，使整合的DNA表达，由此可获得在培养中产生的该嵌合抗体。
嵌合抗体和人源化抗体的C区可以使用人抗体，例如H链可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Ca2、Cε，L链可使用Cκ、Cλ。这些序列是公知的。为了改善抗体或其产生的稳定性，可以对人抗体C区进行修饰。
嵌合抗体由来自人以外的动物的抗体的V区和来自人抗体的C区构成。而人源化抗体由来自人以外的动物的抗体的互补决定区(CDR)和来自人抗体的构架区(FR)、以及来自人抗体的C区构成。由于人源化抗体在人体内的抗原性降低，因此可用作本发明的治疗药的有效成分。
人源化抗体也称为重构人抗体，是通过移植将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR置换为人抗体的CDR而成的，且其常规的基因重组方法也是已知的。具体来说，设计成小鼠抗体的CDR与人抗体的FR符合读框的融合的DNA序列是通过使用设计为末端部具有重叠部分的多个寡核苷酸作为引物的PCR法进行合成。将上述得到的DNA与编码人抗体C区的DNA符合读框的融合，插入到表达载体中，由此制备重组载体。将该重组载体导入宿主中，建立重组细胞，然后培养该重组细胞，使编码该人源化抗体的DNA表达，由此，该人源化抗体可以在该培养细胞的培养物中产生(参照欧洲专利公开EP239400，国际公开WO96/02576)。
通过对上述制备的人源化抗体与抗原的结合活性进行定性或定量测定并评价，可以适当选择经由CDR连接时该CDR可形成良好的抗原结合部位的人抗体的FR。根据需要，FR的氨基酸也可以被置换，使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位。上述氨基酸置换可以适当采用在小鼠CDR与人FR融合时所使用的PCR法进行导入，通过上述方法测定并评价置换了氨基酸的突变型抗体与抗原的结合活性，由此可以选择具有所需性质的突变FR序列(Sato，K.等人.，CancerRes，1993，53，851～856)。
还已知人抗体的获得方法。例如，在体外将人淋巴细胞用所需抗原或表达所需抗原的细胞致敏，将致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞例如U266融合，由此可获得与抗原具有结合活性的所需人抗体(参照日本特公平1-59878)。还可以将具有完全人抗体基因的所有组成成分的转基因动物用所需抗原进行免疫，由此获得所需人抗体(参照国际公开WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096、WO96/33735)。进一步已知使用人抗体库，通过淘选获得人抗体的技术。例如，将人抗体的V区作为单链抗体(scFv)，通过噬菌体展示法在噬菌体的表面表达，可以选择与抗原结合的噬菌体。通过分析所选择的噬菌体基因，由此可以确定编码与抗原结合的人抗体的V区的DNA序列。确定了与抗原结合的scFv的DNA序列之后，将该V区序列与所需人抗体C区序列进行符合读框的融合，然后插入到适当的表达载体中，由此可以制备表达载体。将该表达载体导入到上述所例举的优选的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，可以获得该人抗体。这些方法也是公知的，可参考国际公开WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388。
本发明中所使用的抗体只要与DSG3蛋白质结合即可，不仅是以IgG为代表的二价抗体，也包含一价抗体、或以IgM为代表的多价抗体。本发明的多价抗体中包含具有完全相同的抗原结合部位的多价抗体、或具有一部分或者完全不同的抗原结合部位的多价抗体。
本发明中使用的抗体并不限于抗体的全长分子，只要与DSG3蛋白质结合即可，可以是低分子抗体或其修饰物。
低分子抗体也含有全抗体(whole antibody，例如全IgG等)的一部分缺损的抗体片段，只要具有与抗原的结合能力即可，没有特别限定。本发明的抗体片段只要是全抗体的一部分即可，没有特别限定，但优选含有重链可变区(VH)或/和轻链可变区(VL)。VH或VL的氨基酸序列可以具有置换、缺失、附加和/或插入。并且，只要具有与抗原的结合能力即可，可以使VH或/和VL的一部分缺损。另外，可变区可以进行嵌合或人源化。抗体片段的具体例子例如有：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv等。低分子抗体的具体例子例如有：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv(单链Fv)、双抗体、sc(Fv)2(单链(Fv)2)等。这些抗体的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、多聚体)也包含在本发明的低分子抗体中。
关于抗体的片段，可以将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理，生成抗体片段，或者构建编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载体中，然后在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S.等人.，J.Immunol.(1994)152，2968～2976；Better，M.和Horwitz，A.H.Methodsin Enzymology(1989)178，476～496；Plueckthun，A.和Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476～496；Lamoyi，E.，Methods inEnzymology(1989)121，652～663；Rousseaux，J.等人.，Methods inEnzymology(1989)121，663～669；Bird，R.E.等人.，TIBTECH(1991)9，132～137)。
双抗体是指通过基因融合构建的二价抗体片段(Holliger P等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444～6448(1993)；EP404，097号；WO93/11161号等)。双抗体是由两条多肽链构成的二聚体，通常各多肽链在相同的链中，VL和VH通过短至无法互相结合的、例如5个残基左右的接头进行连接。在相同多肽链上所编码的VL和VH，其之间的接头短，因此无法形成单链可变区片段，而是形成二聚体，因此双抗体具有两个抗原结合部位。
scFv可通过将抗体的H链V区和L链V区连接而获得。在该scFv中，H链V区和L链V区经由接头、优选肽接头连接(Huston，J.S.等人.，Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.(1988)85，5879～5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以来自本说明书中作为抗体所述的任何抗体。对连接V区的肽接头没有特别限定，例如可使用含有3～25个残基左右的任意的单链肽，还可使用后述的肽接头等。V区的连接方法可利用上述的PCR法。上述编码抗体的H链或H链V区的DNA序列、以及编码L链或L链V区的DNA序列中，以编码全部或所需氨基酸序列的DNA部分为模板，以及使用具有与其两端的序列对应的序列的一对引物，通过PCR法扩增编码scFv的DNA。接着，将编码肽接头部分的DNA、以及具有设计为其两端分别与各H链、L链连接的序列的一对引物组合，进行PCR反应，由此可获得具有所需序列的DNA。还可以先制备编码scFv的DNA，可按照常规方法获得含有它们的表达载体、以及通过该表达载体转化的重组细胞，培养所得重组细胞，使编码该scFv的DNA表达，可获得该scFv。
sc(Fv)2是两个VH和两个VL通过接头等连接而形成的单链的低分子抗体(Hudson等人.，JImmunol.Methoda 1999；231：177～189)。sc(Fv)2例如可通过用接头连接scFv来制备。
优选具有以下特征的抗体：2个VH和2个VL以单链多肽的N末端一侧为基点，以VH、VL、VH、VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])的顺序排列。
2个VH和2个VL的顺序并不特别限定于上述排列，可以以任何顺序排列。例如包含以下的排列。
[VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL]
[VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH]
[VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL]
[VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH]
[VL]接头[VH]接头[VL]接头[VH]
连接抗体的可变区的接头可以使用可通过基因工程导入的任意的肽接头、或化学合成的接头(例如参照Protein Engineering，9(3)，299～305，1996)中所公开的接头等，但本发明中优选肽接头。对肽接头的长度没有特别限定，可以根据需要由本领域技术人员适当选择，但通常为1～100个氨基酸，优选为3～50个氨基酸，进一步优选为5～30个氨基酸，特别优选为12～18个氨基酸(例如15个氨基酸)。
肽接头的例子包括：
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：72)
Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：73)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：74)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：75)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：76)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：77)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：78)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：79)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：74))n
(SerGly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：75))n
[n为1以上的整数]等。但是，肽接头的长度或序列可根据目的，由本领域技术人员适当选择。
因此，本发明中特别优选的sc(Fv)2的方式例如有以下的sc(Fv)2。[VH]肽接头(15个氨基酸)[VL]肽接头(15个氨基酸)[VH]肽接头(15个氨基酸)[VL]
化学合成的接头(化学交联剂)是肽交联中通常使用的交联剂，例如为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3)、二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)、双(琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)、双(磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(磺基-EGS)、二琥珀酰亚氨基酒石酸盐(DST)、二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸盐(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等，这些交联剂均有销售。
连接4个抗体可变区时，通常需要3个接头，可以使用完全相同的接头，也可以使用不同的接头。本发明中，优选的低分子抗体是双抗体或sc(Fv)2。为了获得上述低分子抗体，可以将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等处理，生成抗体片段，或构建编码这些抗体片段的DNA，将其导入到表达载体中，然后在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S.等人.，J.Immunol.(1994)152，2968～2976；Better，M.和Horwitz，A.H.Methods Enzymol(1989)178，476～496；Plueckthun，A.和Skerra，A.Methods Enzymol(1989)178，497～515；Lamoyi，E.，Methods Enzymol(1986)121，652～663；Rousseaux，J.等人.，MethodsEnzymol(1986)121，663～669；Bird，R.E.和Walker，B.W.，TrendsBiotechnol.(1991)9，132～137)。
本发明的抗体可例举以下(1)～(62)所述的抗体，但并不限于这些抗体。以下(1)～(62)所述的抗体例如有全抗体、低分子抗体、动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等。
(1)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.2的氨基酸序列(DF151抗体的H链的CDR1序列)、作为CDR2的SEQ ID NO.4的氨基酸序列(DF151抗体的H链的CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO.6的氨基酸序列(DF151抗体的H链的CDR3序列)。
(2)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，该H链具有作为CH(H链恒定区)的SEQ ID NO.8的氨基酸序列(DF151抗体的CH序列)。
(3)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列(DF151小鼠-人嵌合抗体的CH序列)。
(4)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.12的氨基酸序列(DF151抗体的L链的CDR1序列)、作为CDR2的SEQ ID NO.14的氨基酸序列(DF151抗体的L链的CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO.16的氨基酸序列(DF151抗体的L链的CDR3序列)。
(5)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，该L链具有作为CL(L链恒定区)的SEQ ID NO.18的氨基酸序列(DF151抗体的CL序列)。
(6)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQID NO.20的氨基酸序列(DF151小鼠-人嵌合抗体的CL序列)。
(7)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(4)所述的L链。
(8)抗体，该抗体含有(2)所述的H链和(5)所述的L链。
(9)抗体，该抗体含有(3)所述的H链和(6)所述的L链。
(10)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.22的氨基酸序列(DF364抗体的H链的CDR1序列)、作为CDR2的SEQ ID NO.24的氨基酸序列(DF364抗体的H链的CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO.26的氨基酸序列(DF364抗体的H链的CDR3序列)。
(11)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列(DF364抗体的CH序列)。
(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列(DF364小鼠-人嵌合抗体的CH序列)。
(13)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.30的氨基酸序列(DF364抗体的L链的CDR1序列)、作为CDR2的SEQ ID NO.32的氨基酸序列(DF364抗体的L链的CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO.34的氨基酸序列(DF364抗体的L链的CDR3序列)。
(14)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列(DF364抗体的CL序列)。
(15)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列(DF364小鼠-人嵌合抗体的CL序列)。
(16)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(13)所述的L链。
(17)抗体，该抗体含有(11)所述的H链和(14)所述的L链。
(18)抗体，该抗体含有(12)所述的H链和(15)所述的L链。
(19)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(13)所述的L链。
(20)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(14)所述的L链。
(21)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(15)所述的L链。
(22)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(4)所述的L链。
(23)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(5)所述的L链。
(24)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(6)所述的L链。
(25)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.81的氨基酸序列(DF366抗体的H链的CDR1序列)、作为CDR2的SEQ ID NO.83的氨基酸序列(DF366抗体的H链的CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO.85的氨基酸序列(DF366抗体的H链的CDR3序列)。
(26)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列(DF366抗体的CH序列)。
(27)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列(DF366小鼠-人嵌合抗体的CH序列)。
(28)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.87的氨基酸序列(DF366抗体的L链的CDR1序列)、作为CDR2的SEQ ID NO.89的氨基酸序列(DF366抗体的L链的CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO.91的氨基酸序列(DF366抗体的L链的CDR3序列)。
(29)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列(DF366抗体的CL序列)。
(30)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列(DF366小鼠-人嵌合抗体的CL序列)。
(31)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(28)所述的L链。
(32)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(29)所述的L链。
(33)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(30)所述的L链。
(34)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(28)所述的L链。
(35)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(29)所述的L链。
(36)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(30)所述的L链。
(37)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(28)所述的L链。
(38)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(29)所述的L链。
(39)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(30)所述的L链。
(40)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(4)所述的L链。
(41)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(5)所述的L链。
(42)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(6)所述的L链。
(43)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(13)所述的L链。
(44)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(14)所述的L链。
(45)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(15)所述的L链。
(46)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO.108的氨基酸序列(小鼠IgG2a抗体的CH序列)。
(47)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO.112的氨基酸序列(小鼠IgG2a抗体的CL序列)。
(48)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO.108的氨基酸序列(小鼠IgG2a抗体的CH序列)。
(49)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO.112的氨基酸序列(小鼠IgG2a抗体的CL序列)。
(50)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO.108的氨基酸序列(小鼠IgG2a抗体的CH序列)。
(51)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO.112的氨基酸序列(小鼠IgG2a抗体的CL序列)。
(52)抗体，该抗体含有(46)所述的H链和(47)所述的L链。
(53)抗体，该抗体含有(48)所述的H链和(49)所述的L链。
(54)抗体，该抗体含有(50)所述的H链和(51)所述的L链。
(55)抗体，该抗体含有(46)所述的H链和(49)所述的L链。
(56)抗体，该抗体含有(48)所述的H链和(51)所述的L链。
(57)抗体，该抗体含有(50)所述的H链和(47)所述的L链。
(58)抗体，该抗体含有(46)所述的H链和(51)所述的L链。
(59)抗体，该抗体含有(48)所述的H链和(47)所述的L链。
(60)抗体，该抗体含有(50)所述的H链和(49)所述的L链。
(61)抗体，该抗体是在(1)～(60)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(61)中任一项所述的抗体具有同等活性。
(62)抗体，该抗体与表位结合，该表位与(1)～(60)中任一项所述的抗体所结合的DSG3蛋白质的表位相同。
上述(1)所述的“H链，该H链具有作为CDR1的SEQ ID NO.2的氨基酸序列(DF151抗体的H链的CDR1序列)、作为CDR2的SEQ IDNO.4的氨基酸序列(DF151抗体的H链的CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO.6的氨基酸序列(DF151抗体的H链的CDR3序列)”中的VH可例举具有SEQ ID NO.46所述氨基酸序列(DF151抗体的VH序列)的VH。
上述(4)所述的“L链，该L链具有作为CDR1的SEQ ID NO.12的氨基酸序列(DF151抗体的L链的CDR1序列)、作为CDR2的SEQ IDNO.14的氨基酸序列(DF151抗体的L链的CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO.16的氨基酸序列(DF151抗体的L链的CDR3序列)”中的VL可例举具有SEQ ID NO.48所述氨基酸序列(DF151抗体的VL序列)的VL。
上述(10)所述的“H链，该H链具有作为CDR1的SEQ ID NO.22的氨基酸序列(DF364抗体的H链的CDR1序列)、作为CDR2的SEQID NO.24的氨基酸序列(DF364抗体的H链的CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO.26的氨基酸序列(DF364抗体的H链的CDR3序列)”中的VH可例举具有SEQ ID NO.50所述氨基酸序列(DF364抗体的VH序列)的VH。
上述(13)所述的“L链，该L链具有作为CDR1的SEQ ID NO.30的氨基酸序列(DF364抗体的L链的CDR1序列)、作为CDR2的SEQID NO.32的氨基酸序列(DF364抗体的L链的CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO.34的氨基酸序列(DF364抗体的L链的CDR3序列)”中的VL可例举具有SEQ ID NO.52所述氨基酸序列(DF364抗体的VL序列)的VL。
上述(25)所述的“H链，该H链具有作为CDR1的SEQ ID NO.81的氨基酸序列(DF366抗体的H链的CDR1序列)、作为CDR2的SEQID NO.83的氨基酸序列(DF366抗体的H链的CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO.85的氨基酸序列(DF366抗体的H链的CDR3序列)”中的VH可例举具有SEQ ID NO.93所述氨基酸序列(DF366抗体的VH序列)的VH。
上述(28)所述的“L链，该L链具有作为CDR1的SEQ ID NO.87的氨基酸序列(DF366抗体的L链的CDR1序列)、作为CDR2的SEQID NO.89的氨基酸序列(DF366抗体的L链的CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO.91的氨基酸序列(DF366抗体的L链的CDR3序列)”中的VL可例举具有SEQ ID NO.95所述氨基酸序列(DF366抗体的VL序列)的VL。
上述(61)所述抗体的优选方式是CDR未被修饰的抗体。作为一个例子，在上述(61)所述的抗体中，“在(1)所述的抗体中有1或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的、与(1)所述的抗体具有同等活性的抗体”的优选方式是：“抗体，该抗体是与(1)所述的抗体具有同等活性、在(1)所述的抗体中有1或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的抗体，其含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO.2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.4的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.6的氨基酸序列”。上述(61)所述的抗体中，其它的抗体的优选方式也可同样描述。
本领域技术人员周知的制备与某种多肽功能同等的多肽的方法已知有向多肽导入突变的方法。例如，本领域技术人员可采用位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh，T.等人.(1995)Gene152，271～275；Zoller，MJ，和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468～500；Kramer，W.等人.(1984)Nucleic Acids Res.12，9441～9456；Kramer，W.和Fritz HJ(1987)Methods Enzymol.154，350～367；Kunkel，TA(1985)Proc Natl Acid Sci USA.82，488～492；Kunkel(1988)Methods.Enzymol.85，2763～2766)等，向本发明的抗体导入适当的突变，由此可以制备与该抗体同等功能的抗体。另外，氨基酸的突变在自然界也可发生。如上所述，在本发明的抗体的氨基酸序列中，具有1或多个氨基酸发生突变的氨基酸序列、且与该抗体的功能同等的抗体也包含在本发明中。上述突变中，突变的氨基酸数目通常为50个氨基酸以内、优选为30个氨基酸以内、进一步优选为10个氨基酸以内(例如为5个氨基酸以内)。
在突变的氨基酸残基中，优选突变为保守氨基酸支链的性质的其它的氨基酸。例如，氨基酸支链的性质有：疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂族支链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羟基支链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子支链的氨基酸(C、M)、具有羧酸和含酰胺的支链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱的支链的氨基酸(R、K、H)、具有含芳族的支链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号内均表示氨基酸的单一字母标记)。
已知具有对某一氨基酸序列，通过1或多个氨基酸残基的缺失、附加和/或其它氨基酸的置换进行修饰的氨基酸序列的多肽可保持其生物学活性(Mark，D.F.等人.，Proc Natl Acid Sci USA.(1984)81，5662～5666；Zoller，M.J.和Smith，M.，Nucleic，Acid Research(1982)10，6487～6500；Wang，A.等人.，Science 224，1431～1433；Dalbadie-McFarland，G.等人.，Proc Natl Acid Sci USA.(1982)79，6409～6413)。
本发明中还提供与表位结合的抗体，该表位与本发明所公开的抗DSG3抗体所结合的表位相同。上述抗体例如可通过以下的方法获得。
为了确定被检抗体是否可竞争性地与同本发明所公开的抗DSG3抗体所结合的表位相同的表位结合，可实施交叉阻断测定、例如竞争ELISA测定。例如，在竞争ELISA测定中，在候选竞争抗体的存在或非存在下，对包被在微量板的孔上的DSG3蛋白质进行孵育，然后添加生物素标记的本发明的抗DSG3抗体。与孔中的DSG3蛋白质结合的标记抗DSG3抗体的量可通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物和适当的底物来测定。抗体可用放射标记或荧光标记等的可检测或测定的其它标记物进行标记。与DSG3蛋白质结合的标记抗DSG3抗体的量与对相同表位竞争性结合的候选竞争抗体(被检抗体)的结合能力之间存在相关性。即，被检抗体对相同表位的亲和性越大，则标记抗DSG3抗体与包被有DSG3蛋白质的孔的结合活性降低。与在候选竞争抗体非存在下实施的对照实验中得到的结合活性比较，候选抗体如果可以阻断至少20％、优选至少20～50％、进一步优选至少50％的抗DSG3抗体的结合，则可以认为该候选竞争抗体与同本发明的抗DSG3抗体实质相同的表位结合，或者是对与相同表位结合进行竞争的抗体。
与同抗DSG3抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体例如有上述(62)所述的抗体，但并不限于此。
上述(1)～(62)所述的抗体如上所述，不只是一价抗体，也包含二价以上的多价抗体。本发明的多价抗体包含具有完全相同的抗原结合部位的多价抗体、或者具有部分或者完全不同的抗原结合部位的多价抗体。
具有不同的抗原结合部位的多价抗体可例举以下抗体，但本发明的抗体并不限于这些抗体。
含有选自(7)、(16)、(19)、(22)、(31)、(34)、(37)、(40)和(43)所述的H链和L链对(以下称为HL对)的至少2个HL对的抗体。
含有选自(8)、(17)、(20)、(23)、(32)、(35)、(38)、(41)和(44)所述的HL对的至少2个HL对的抗体。
含有选自(9)、(18)、(21)、(24)、(33)、(36)、(39)、(42)和(45)所述的HL对的至少2个HL对的抗体。
含有选自(52)～(60)所述的HL对的至少2个HL对的抗体。
抗体的修饰物可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。抗体上可以结合化疗药物、毒性肽或放射性化学物质等。上述抗体修饰物(以下称为抗体缀合物)可通过对所得抗体实施化学修饰来获得。抗体的修饰方法在该领域中已经确立。如后所述，可以使用基因重组技术设计为不仅识别DSG3蛋白质，也识别化疗药物、毒性肽或放射性化学物质等的双特异性抗体等的分子型。本发明中的“抗体”也包含这些抗体。
与抗DSG3抗体结合、发挥细胞毒活性功能的化疗药物(包含在生物体内酶促性或非酶促性地变换为该化疗药物的前药)有：阿扎立平、阿那曲唑、5-氮杂胞苷、博来霉素、硼替佐米(Bortezomib)、苔藓抑素-1、白消安、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素D、道诺霉素葡萄糖醛酸苷、柔红霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、多柔比星葡萄糖醛酸苷、表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡萄糖醛酸苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基尿、伊达比星、异环磷酰胺、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、普卡霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、泼尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、紫杉烷类、泰素、丙酸睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、长春碱、长春瑞滨、长春新碱等低分子的化疗药物。也优选使用蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、核糖核酸酶、豹蛙酶(Onconase)、DNaseI、葡萄球菌素肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、L-天冬酰胺酶、PEG L-天冬酰胺酶等的毒性肽。在另外的方式中，可以将1或2种以上的低分子化疗药物和毒性肽分别优选组合使用。抗DSG3抗体与上述低分子化疗药物的结合优选选择共价键或非共价键，结合有该化疗药物的抗体的制备方法是公知的。
并且，与蛋白质性药物或毒素的结合可以通过基因重组法，使编码上述毒性肽的DNA与编码抗DSG3抗体的DNA进行符合读框的融合，插入到表达载体中，构建重组载体。将该载体导入到适当的宿主细胞中，得到转化细胞，培养所得转化细胞。通过使整合的DNA表达，可以制备该重组蛋白质。
并且，本发明中使用的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体可以是识别DSG3分子上的不同表位的具有抗原结合部位的双特异性抗体，其中一个抗原结合部位识别DSG3，另一抗原结合部位识别化疗药物、毒性肽或放射性化学物质等细胞毒性物质。这种情况下，可以使细胞毒性物质与表达DSG3的细胞直接作用，对肿瘤细胞产生特异性毒性，抑制肿瘤细胞的增殖。还可以制成另一个抗原结合部位识别以下抗原的双特异性抗体：与DSG3同样，在作为靶的癌细胞的细胞表面特异性表达，但与DSG3不同。双特异性抗体可以通过使两种抗体的HL对连接来制备，也可以使产生不同的单克隆抗体的杂交瘤融合，制备产生双特异性抗体的融合细胞。还可以通过基因工程的方法来制备双特异性抗体。
上述构建的抗体基因可通过公知的方法表达并获得。为哺乳类细胞时，抗体基因可以是在常用的有效启动子、要表达的抗体基因、其3′一侧下游功能性结合polyA信号来表达。例如启动子/增强子可以是人巨细胞病毒早期启动子/增强子。
除此之外，在本发明中使用的、用于抗体表达的启动子/增强子可以是反转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等的病毒启动子/增强子，或者人延伸因子1α(HEF1α)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子等。
使用SV40启动子/增强子时，可根据Mulligan等人的方法(Nature(1979)277，108)，以及使用HEF1α启动子/增强子时，可根据Mizushima等人的方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)，容易地进行基因表达。
为大肠杆菌时，可以使常用的有效启动子、用于抗体分泌的信号序列和要表达的抗体基因功能性连接，表达该基因。启动子例如有lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，可根据Warb等人的方法(Nature(1098)341，544～546；FASEBJ.(1992)6，2422～2427)、或者使用araB启动子时可根据Better等人的方法(Science(1988)240，1041～1043)表达该基因。
用于抗体分泌的信号序列在大肠杆菌的周质中产生时，可以使用pel B信号序列(Lei，S.P.等人.，J.Bacteriol.(1987)169，4379)。分离在周质中产生的抗体后，使用尿素的胍盐酸盐等的蛋白质改性剂，可重折叠抗体的结构，使其具有所需结合活性。
插入到表达载体中的复制起点可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点，并且，为了在宿主细胞体系中扩增基因的拷贝数，可以向表达载体中插入作为选择标志物的氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
为了制备本发明中使用的抗体，可以使用任意的表达体系，例如真核细胞或原核细胞的表达体系。真核细胞例如有：建立的哺乳类细胞系、昆虫细胞系、真丝状菌细胞和酵母细胞等动物细胞等，原核细胞例如有大肠杆菌细胞等细菌细胞。优选本发明中使用的抗体可使用哺乳类细胞例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero、Hela细胞进行表达。
接着，将转化的宿主细胞在体外或体内培养，产生目标抗体。宿主细胞的培养可按照公知的方法进行。例如培养液可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以结合使用胎牛血清(FCS)等血清补液。
如上所述地表达并产生的抗体可将常规蛋白质纯化中使用的公知的方法单独使用或适当组合来纯化。例如，可通过适当选择并组合蛋白A柱等亲和柱、色谱柱、滤器、超滤、盐析、透析等，来分离并纯化抗体(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
抗体与抗原的结合活性(Antibodies A Laboratory Manual.EdHarlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)的测定可采用公知的方法。例如可使用ELISA(酶联免疫吸附测定法)、EIA(酶联免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)或荧光免疫法等。
本发明中使用的抗体可以是糖链被修饰的抗体。已知通过修饰抗体的糖链，可以增强抗体的细胞毒活性。已知糖链被修饰的抗体例如有：进行糖基化修饰的抗体(WO99/54342等)、附加到糖链上的岩藻糖缺损的抗体(WO00/61739、WO02/31140等)、具有具等分GlcNAc的糖链的抗体(WO02/79255等)等。
本发明中使用的抗体优选为具有细胞毒活性的抗体。
在本发明中，细胞毒活性例如可以是抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒(CDC)活性等。本发明中，CDC活性是指补体系统产生的细胞毒活性，ADCC活性是指特异性抗体附着于靶细胞的细胞表面抗原时，保有Fcγ受体的细胞(免疫细胞等)经Fcγ受体介导与其Fc部位结合，使靶细胞产生变性的活性。
抗DSG3抗体是否具有ADCC活性、或者是否具有CDC活性，这可通过公知的方法进行测定(例如Current protocols in ImmunologyChapter 7.Immunologic studies in humans，Editor，John E，Coligan等人.，John Wiley & Sons，Inc.，(1993)等)。
具体来说，首先是实施效应细胞、补体溶液、靶细胞的制备。
(1)效应细胞的制备
从CBA/N小鼠等中摘除脾脏，在RPMI1640培养基(Invitrogen公司制备)中分离脾细胞。用含有10％胎牛血清(FBS、HyClone公司制备)的相同培养基清洗后，将细胞浓度制备为5×106/mL，由此可制备效应细胞。
(2)补体溶液的制备
将幼兔补体(BABY RABBIT COMPLEMENT)(CEDARLANE公司制备)用含有10％ FBS的培养基(Invitrogen公司制备)稀释10倍，可制备补体溶液。
(3)靶细胞的制备
将表达DSG3蛋白质的细胞(用编码DSG3蛋白质的基因转化的细胞、肺癌细胞、大肠癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、皮肤癌细胞或子宫癌细胞等)与0.2mCi的51Cr-铬酸钠(GEHealthcare Bio-Sciences公司制备)一起在含有10％ FBS的DMEM培养基中、在37℃下培养1小时，由此可以放射性标记该靶细胞。放射性标记后，将细胞用含有10％ FBS的RPMI 1640培养基清洗3次，将细胞浓度制备为2×105/mL，可制备该靶细胞。
ADCC活性或CDC活性可通过以下所述方法进行测定。在测定ADCC活性时，可以在96孔U底板(Becton Dickinson公司制造)中分别加入50μL靶细胞和抗DSG3抗体，在冰上反应15分钟。然后加入100μL效应细胞，在二氧化碳培养箱内培养4小时。使抗体的终浓度为0或10μg/mL。培养后回收100μL上清，用γ计数仪(COBRAIIAUTO-GAMMA，型号B5005，Packard Instrument Company公司制造)测定放射活性。细胞毒活性(％)可使用所得的值，根据(A-C)/(B-C)×100的计算式来计算。A表示各试样中的放射活性(cpm)，B表示加入了1％NP-40(nacalai tesque公司制备)的试样中的放射活性(cpm)，C表示只含有靶细胞的试样的放射活性(cpm)。
另一方面，在测定CDC活性时，是向96孔平底板(BectonDickinson公司制造)中分别加入50μL靶细胞和抗DSG3抗体，在冰上反应15分钟。然后加入100μL补体溶液，在二氧化碳培养箱内培养4小时。抗体的终浓度为0或3μg/mL。培养后回收100μL上清，用γ计数仪测定放射活性。细胞毒活性可与ADCC活性的测定同样地进行计算。
另一方面，测定抗体缀合而导致的细胞毒活性时，向96孔平底板(Becton Dickinson公司制造)中分别加入50μL靶细胞和抗DSG3抗体缀合物，在冰上反应15分钟。在二氧化碳培养箱内培养1～4小时。使抗体的终浓度为0或3μg/mL。培养后回收100μL上清，以γ计数仪测定放射活性。细胞毒活性可与ADCC活性的测定同样计算。
本发明的具有细胞毒活性的抗体进一步优选为不具有细胞解离活性的抗体。该抗体可以以在试管内测定抑制角质形成细胞粘附的细胞解离活性，适当选择并获得不具有该细胞解离活性的抗体。测定该细胞解离活性的方法例如可以按照J.Invest.Dermatol.，124，939～946，2005所述的方法在试管内进行测定。在生物体内观察该细胞活性的方法可以是以该细胞解离活性在生物体内的表现型PV病变的诱发活性来评价该活性。PV病变的诱发活性可按照J.Immunology 170，2170～2178，2003所述的方法评价。
通过抗DSG3抗体抑制其增殖的细胞只要是可表达DSG3蛋白质的细胞即可，没有特别限定，优选为癌细胞，更优选为肺癌细胞、大肠癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、皮肤癌细胞或子宫癌细胞。进一步优选非小细胞肺癌。因此，该DSG3抗体可以用于起因于细胞增殖的疾病例如肺癌、大肠癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌或子宫癌等的治疗或预防。更优选为非小细胞肺癌，进一步优选为肺鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌。
本发明还提供多核苷酸，该多核苷酸是编码本发明的抗体的多核苷酸，或与该多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码与本发明的抗体具有同等活性的抗体的多核苷酸。本发明还提供含有这些多核苷酸的载体、含有该载体的转化体(包含转化细胞)。本发明的多核苷酸只要编码本发明的抗体即可，没有特别限定，可以是含有多个脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等的碱基或碱基对的聚合物。也可以含有天然以外的碱基。本发明的多核苷酸可以在用基因工程方法表达抗体时使用。在筛选与本发明的抗体具有同等功能的抗体时可用作探针。即，使用编码本发明的抗体的多核苷酸或其一部分作为探针，通过杂交、基因扩增技术(例如PCR)等技术，可获得可与该多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码与本发明的抗体具有同等活性的抗体的DNA。上述DNA也包含在本发明的多核苷酸中。杂交技术(Sambrook，J等人.，Molecular Cloning 2nd ed.，9.47～9.58，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)是本领域技术人员周知的技术。杂交的条件例如有低严谨条件。低严谨条件是在杂交后的清洗中，例如为42℃、0.1×SSC、0.1％SDS的条件，优选50℃、0.1×SSC、0.1％SDS的条件。更优选的杂交条件例如有高严谨条件。高严谨条件例如为65℃、5×SSC和0.1％ SDS的条件。在这些条件中，如同在较高温度下一样，可有效地获得具有高同源性的多核苷酸。对杂交的严谨度有影响的因素是温度或盐浓度等多个因素，本领域技术人员可以通过适当选择这些因素来实现同样的严谨度。
通过这些杂交技术或基因扩增技术而得到的多核苷酸所编码的与本发明的抗体功能同等的抗体通常在这些抗体和氨基酸序列中具有高的同源性。本发明的抗体也包含与本发明的抗体功能相同、且与该抗体的氨基酸序列具有高同源性的抗体。高同源性是指在氨基酸水平通常至少具有50％以上的同一性、优选75％以上的同一性、进一步优选85％以上的同一性、更进一步优选95％以上的同一性。确定多肽的同源性时可按照文献(Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.Proc.Natl.Sci.USA(1983)80，726～730)所述的算法进行。
药物组合物
在另一个方面，本发明的特征在于：含有与DSG3蛋白质结合的抗体作为有效成分的药物组合物。此外，本发明的特征在于：含有与DSG3蛋白质结合的抗体作为有效成分的细胞增殖抑制剂，特别是抗癌药。优选本发明的细胞增殖抑制剂和抗癌药给予罹患或可能罹患癌症的受治对象。本发明的受治对象是遗传性具有DSG3蛋白质的动物种，只要是罹患癌症的动物种、或者具有罹患可能性的动物种即可，例如有人、猴、牛、绵羊、小鼠、狗、猫、仓鼠等哺乳类，但并不限于此。
本发明中，含有与DSG3蛋白质结合的抗体作为有效成分的细胞增殖抑制剂可描述为：抑制细胞增殖的方法，该方法包含将与DSG3蛋白质结合的抗体给予受治对象的步骤；或者与DSG3蛋白质结合的抗体在制备细胞增殖抑制剂中的应用。
本发明中，含有与DSG3蛋白质结合的抗体作为有效成分的抗癌药可描述为：癌症的预防或治疗方法，该方法包含将与DSG3蛋白质结合的抗体给予受治对象的步骤；或者与DSG3蛋白质结合的抗体在制备抗癌药中的应用。
本发明中，“含有与DSG3结合的抗体作为有效成分”是指含有抗DSG3抗体作为主要活性成分，并不限定抗DSG3抗体的含有率。
本发明的药物组合物(例如细胞增殖抑制剂、抗癌药。以下也相同)中含有的抗体只要可与DSG3蛋白质结合即可，没有限定，可例举本说明书中所述的抗体。
本发明的药物组合物的给药方法可通过口服、胃肠外给药的任何方法实施。特别优选经胃肠外给药的给药方法，所述给药方法具体有：注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。注射给药的例子例如可通过静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部给予本发明的药物组合物。还可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。给药量例如每次给药可以是在0.0001mg～1000mg/kg体重的范围内选择给药量。或者例如每位患者在0.001mg～100000mg/个体的范围内选择给药量。但是，本发明的药物组合物并不限于这些给药量。
本发明的药物组合物可以按照常规方法制成制剂(例如Remington’s Pharmaceutical Science，latest edition，Mark PublishingCompany，Easton，U.S.A)，可以同时含有制药学上可接受的载体或添加物。例如有：表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、保存剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等，但并不限于此，可以适当使用其它常用的载体。具体例子有：轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露糖醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。
本发明还提供通过使DSG3表达细胞和与DSG3蛋白质结合的抗体接触来对DSG3表达细胞引发毒性的方法，或抑制细胞增殖的方法。如上所述，与DSG3蛋白质结合的抗体是在本发明的细胞增殖抑制剂中所含的与DSG3蛋白质结合的抗体的形式。抗DSG3抗体所结合的细胞只要是表达DSG3的细胞即可，没有特别限定，优选为癌细胞，更优选肺癌细胞、大肠癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、皮肤癌细胞或子宫癌细胞，进一步优选为非小细胞肺癌。
本发明中的“接触”例如可通过向在试管内培养的DSG3表达细胞的培养液中添加抗体来进行。这种情况下，所添加的抗体的剂型可以适当使用溶液或通过冷冻干燥等而得到的固体等剂型。以水溶液的形式添加时，可以是纯粹地只含有抗体的水溶液，或者例如也可以是含有上述的表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、保存剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等的溶液。对添加浓度没有特别限定，但培养液中的终浓度可适当使用：优选为1pg/mL～1g/mL、更优选为1ng/mL～1mg/mL、进一步优选为1μg/mL～1mg/mL的范围。
此外，在另一方式中，本发明中的“接触”可通过对将DSG3表达细胞移植到体内的非人动物、或具有内源性表达DSG3的癌细胞的动物给予来进行。给药方法可按照口服或胃肠外给药的任何方式实施。特别优选经胃肠外给药的给药方法。所述给药方法具体有：注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。注射给药的例子例如有通过静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部给予本发明的药物组合物、细胞增殖抑制剂和抗癌药。还可根据受试动物的年龄、症状等选择适当的给药方法。以水溶液的方式给药时，可以是纯粹地只含有抗体的水溶液，或者例如可以是含有上述的表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、保存剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等的溶液。给药量例如每次给药可以是在0.0001mg～1000mg/kg体重的范围选择给药量。或者例如每位患者在0.001mg～100000mg/个体的范围内选择给药量。但是，本发明的给药量并不限于这些给药量。
通过抗DSG3抗体的接触来评价或测定在DSG3表达细胞中引发的细胞毒的方法优选采用以下的方法。在试管内评价或测定该细胞毒活性的方法有：上述抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒(CDC)活性等的测定方法。抗DSG3抗体是否具有ADCC活性、或是否具有CDC活性，这可根据公知的方法进行测定(例如Current protocols in Immunology Chapter 7.Immunologic studies inhumans，Editor，John E，Coligan等人.，John Wiley & Sons，Inc.，(1993)等)。测定活性时，作为对照抗体可以与抗DSG3抗体同样地使用与抗DSG3抗体具有相同的同工型、但不具有任何细胞毒活性的结合抗体，通过抗DSG3抗体显示比对照抗体强的细胞毒活性来判定活性。
抗体的同工型由该抗体的氨基酸序列的H链恒定区的序列来确定，由产生抗体的B细胞成熟时发生的染色体上的基因重组所产生的类型转换的结果来确定。同工型的不同反应在抗体的生理、病理性功能的不同，已知例如细胞毒活性的强度与抗原的表达量一起受抗体的同工型影响。因此，测定上述的细胞毒活性时，作为对照使用的抗体优选使用与被检抗体为相同的同工型。
在生物体内评价或测定细胞毒活性的方法例如可以是：将表达DSG3的癌细胞移植到非人被检动物的皮内或皮下，然后从当天或者第二天起每天或间隔数天静脉或腹腔内给予被检抗体。每天测定肿瘤的大小，由此来确定细胞毒活性。与试管内的评价同样，给予具有相同的同工型的对照抗体，可根据抗DSG3抗体给药组的肿瘤的大小比对照抗体给药组的肿瘤的大小显著小来判定细胞毒活性。使用小鼠作为非人被检动物时，优选使用使胸腺遗传性缺损、使其T淋巴细胞的功能缺陷的裸小鼠(nu/nu)。通过使用该小鼠，在评价、测定给予的抗体所产生的细胞毒活性时，可以排除被检动物中T淋巴细胞的参与。
评价或测定抗DSG3抗体的接触对DSG3表达细胞增殖的抑制效果的方法可优选采用以下方法。在试管内评价或测定该细胞增殖抑制活性的方法可以采用以添加到培养基中的[3H]标记的胸苷向活细胞中的摄入作为DNA复制能力的指标进行测定的方法。更简便的方法是在显微镜下计测将台盼蓝等色素排出到细胞外的能力的染色排除法或MTT法。后者是利用活细胞将四唑盐的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)转化为蓝色的甲
(Formazan)产物的能力。更具体地说，向被检细胞的培养液中添加被检抗体，经过一定时间后向培养液中添加MTT溶液，静置一定时间，使MTT摄入到细胞中。结果，黄色的化合物MTT通过活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶变换为蓝色的化合物。溶解该蓝色产物使其显色后，测定其吸光度，以此作为活细胞数的指标。除MTT之外，还可优选使用市场销售的MTS、XTT、WST-1、WST-8等试剂(nacalai tesque等)。进行活性测定时，可以与抗DSG3抗体同样地使用与抗DSG3抗体具有相同的同工型、但不具有该细胞增殖抑制活性的结合抗体作为对照抗体，通过抗DSG3抗体显示比对照抗体强的细胞增殖抑制活性，可判定活性。
在生物体内评价或测定细胞增殖抑制活性的方法可优选采用与上述的在生物体内评价或测定细胞毒活性相同的方法。
本说明书中引用的所有的先行技术文献均作为参照援引到本说明书中。
实施例
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。
[实施例1]各种癌症中的DSG 3mRNA表达分析
为了进行DSG3基因表达分析，使用了基因芯片。为了探讨癌细胞中表达亢进的基因，使用了通过ISOGEN(Nippon Gene公司制备)、按照常规方法从表1、2所示的各种RNA和各种摘除组织中制备的总RNA。更具体地说，使用各10μg总RNA供给基因芯片U-133A(Affymetrix公司制备)，按照表达分析技术手册(Affymetrix公司制订)实施基因的表达分析。肺腺癌和肝细胞癌的分析中，12例肺腺癌病例和3例肝细胞癌病例的总RNA共计10μg，实施分析(表1)。
[表1]
| 组织 | 来源 |
| 全脑 | Clontech 64020-1 |
| 肺 | 临床检样1例 |
| 气管 | Clontech 64091-1 |
| 心脏 | Ambion 7966 |
| 肾脏 | Ambion 7976 |
| 肝脏 | 临床样品(外科) |
| 胰脏 | Ambion 7954 |
| 胃 | 临床样品(外科) |
| 小肠 | Ambion 7984 |
| 大肠 | Ambion 7986 |
| 骨髓 | Clontech 64106-1 |
| 末梢血单核细胞 | 临床检样1例 |
| 睾丸 | Clontech 64027-1 |
| 前列腺 | Ambion 7988 |
| 卵巢 | Ambion 7974 |
| 皮肤 | Stratagene 735031 |
| 肺癌(腺癌) | 临床检样12例 |
| 肺癌(鳞状细胞癌) | 临床检样1例 |
| 肺癌(鳞状细胞癌) | 临床检样1例 |
| 肺癌(鳞状细胞癌) | 临床检样1例 |
| 肺癌(鳞状细胞癌) | 临床检样1例 |
| 肺癌(鳞状细胞癌) | 临床检样1例 |
| 肝癌(中分化) | 临床检样3例 |
| 肝癌(高分化) | 临床检样3例 |
| 大肠癌 | 临床检样1例 |
| 大肠癌 | 临床检样1例 |
| 大肠癌 | 临床检样1例 |
DSG3基因表达分析中使用的组织
[表2]
| 癌种类 | 细胞株 | 培养基 | 血清(％) |
| 脑肿瘤 | U251 | DMEM | 10 |
| 乳腺癌 | MCF7 | RPM11640 | 10 |
| 食道癌 | TE2 | RPMI1640 | 10 |
| 胃癌 | AGS | RPMI1640 | 10 |
| GT3 | DMEM | 10 | |
| KatoIII | RPMI1640：DMEM＝1∶1 | 10 | |
| MKN45 | RPMI1640 | 10 | |
| MKN74 | RPMI1640 | 10 | |
| 2M | DMEM | 10 | |
| 2MD3 | DMEM | 10 | |
| 大肠癌 | CACO2 | DMEM | 20 |
| DLD1 | RPMI1640 | 10 | |
| hCT116 | McCoy5A | 10 | |
| LOVO | HamF12：DMEM＝1∶1 | 10 | |
| SW480 | RPMI1640 | 10 | |
| 肝癌 | Alexander | DMEM | 10 |
| HepG2 | DMEM | 10 | |
| HLE | DMEM | 10 | |
| HuH6 | DMEM | 10 | |
| HuH7 | DMEM | 10 | |
| 胰腺癌 | Capan1 | DMEM | 20 |
| KLM1 | RPMI1640 | 10 | |
| Panc1 | RPMI1640 | 10 | |
| Paca2 | RPMI1640 | 10 | |
| PK-1 | RPMI1640 | 10 | |
| 肾癌 | Caki2 | RPMI1640 | 10 |
| 肺癌 | A549 | DMEM | 10 |
| Lu130 | RPMI1640 | 10 | |
| H1359 | RPMI1640 | 10 | |
| H157 | RPMI1640 | 10 | |
| H1648 | HamF12：DMEM＝1∶1 | 10 | |
| H2009 | HamF12：DMEM＝1∶1 | 10 | |
| H23 | RPMI1640 | 10 | |
| H2347 | RPMI1640 | 10 | |
| H522 | RPMI1640 | 10 | |
| 子宫颈癌 | HeIa | DMEM | 10 |
DSG3基因表达分析中使用的癌细胞株和培养条件
通过将全部基因的表达分值(scores)的平均值设定为100，对各基因的相对表达量进行比较，来探讨在癌组织或癌细胞中表达亢进的基因。结果，DSG3mRNA(探针ID：205595_at HG-U133A)的表达在正常组织中限于皮肤，而在癌组织中、在肺癌(肺鳞状细胞癌)或大肠癌，以及癌细胞株中、在TE2(食道癌)、2M(胃癌)和PK-1(胰腺癌)中亢进(图1、图2)。
以上表明，DSG3基因(探针ID：205595_at HG-U133A)在皮肤以外的正常组织中的表达非常低，而在肺癌、大肠癌、食道癌、胃癌和胰腺癌的广泛癌症种类中表达亢进。由以上的结果显示，通过以DSG3的表达作为指标，诊断上述癌症发生的可能性高。
[实施例2]肺鳞状细胞癌中的DSG3的免疫组织染色
DSG3基因的转录在癌细胞、特别是肺鳞状细胞癌细胞中亢进，由此，为了确认DSG3蛋白质的表达，实施免疫组织染色分析。
各检样制备成固定的石蜡包埋标本，切成4μm薄切片，该切片粘在载玻片上，然后在37℃下静置16小时左右，使其充分干燥。该切片在100％二甲苯中浸泡5分钟，重复3次进行脱石蜡，在100％乙醇中浸泡5分钟，重复3次，进一步在70％乙醇中浸泡5分钟，由此实施亲水处理。然后使用50mM TBS缓冲液清洗5分钟，重复3次，然后将该切片在柠檬酸缓冲液(10mM，pH7.0)中、在120℃下处理10分钟，激活切片中的抗原。抗原被激活处理后的该切片通过TBS缓冲液清洗5分钟，实施3次，然后在含有被稀释为终浓度为50μg/mL的抗DSG3抗体(5G11)(Zymed公司)的TBS缓冲液中、在室温下处理1小时。为了使内源性的过氧化物酶失活，将结合了抗DSG3抗体的切片用0.3％过氧化氢、在室温下处理15分钟。进一步用TBS缓冲液清洗3次，然后上述切片用作为二次抗体的ENVISON+试剂盒/HRP(DAKO公司)在室温下处理1小时。用TBS缓冲液清洗5分钟，实施3次，然后加入DAB(3，3′-二氨基苯甲酰胺四盐酸盐)作为显色底物，使切片染色。另外，在核的对比染色中使用苏木精作为染色剂。
结果，5例来自罹患肺鳞状细胞癌的癌症患者的组织切片中，均显示了被抗DSG3抗体(5G11)染色的阳性反应(图3)。通过获得肺癌特异性的染色图像，表明DSG3在肺癌中、在蛋白质水平也表达亢进。显示通过使用抗DSG3抗体可以检测肺癌的发生。
[实施例3]抗DSG3抗体的制备
3-1)克隆编码人DSG3的全长cDNA
编码人DSG3的全长cDNA可通过以Human Small IntestineMarathon-Ready cDNA(CLONTECH公司)作为模板的PCR扩增而获得。即，将50μL含有2μL cDNA、1μL有义引物(SEQ ID NO.37)、1μL反义引物(SEQ ID NO.38)、5μL 10×KOD-Plus缓冲液、5μL2mMdNTPs、2μL 25mM MgSO4、1μL KOD-Plus的反应液，实施下述条件下连续进行的PCR反应：将由94℃ 15秒、70℃ 2分钟的反应构成的反应循环进行5次，将由94℃ 15秒、68℃ 2分钟的反应构成的反应循环进行5次，将由94℃ 15秒、66℃ 2分钟的反应构成的反应循环进行28次。通过上述PCR反应而得到的扩增产物使用pGEM-T easy载体系统I(Promega公司)插入到pGEM-T easy中。通过使用ABI3730DNA测序仪进行的测序，确认编码人DSG3的cDNA序列的成功克隆。SEQ ID NO.39所示的序列表示人DSG3基因的核苷酸序列，SEQID NO.40所示的序列表示人DSG3蛋白质的氨基酸序列。
3-2)恒定表达全长人DSG3的细胞的建立
将全长人DSG3 cDNA克隆到哺乳细胞表达用载体(pMCN)中(pMCN/hDSG3)。pMCN可在小鼠CMV启动子(ACCESSION No.U68299)的控制下诱导表达，是整合了新霉素抗性基因的载体。通过电穿孔法将pMCN/hDSG3导入CHO细胞DG44株(Invitrogen公司)中，用500μg/mL遗传霉素(Geneticin)筛选，建立恒定表达全长人DSG3的CHO细胞株。同样，将pMCN/hDSG3导入到不表达DSG3的人肺鳞状细胞癌细胞株A549细胞中，用1000μg/mL遗传霉素筛选，建立恒定表达全长人DSG3的A549细胞株。
3-3)可溶型人DSG3/小鼠IgG2a Fc融合蛋白质的制备
制备可溶型人DSG3/小鼠IgG2a Fc融合蛋白质(以下称为shDSG3_mIgG2aFc)作为用于制备抗DSG3抗体的免疫抗原。将通过绞链部位的CpoI识别序列连接人DSG3胞外区(Met1-Leu616)和小鼠IgG2a恒定区而得到的shDSG3_mIgG2aFc，克隆到pMCDN载体中(pMCDN/shDSG3_mIgG2aFc)，所述pMCDN载体是将DHFR基因整合到表达载体pMCN中而得到的。SEQ ID NO.41所示的序列表示shDSG3_mIgG2aFc基因的核苷酸序列，SEQ ID NO.42所示的序列表示shDSG3_mIgG2aFc的氨基酸序列。将pMCDN/shDSG3_mIgG2aFc通过电穿孔法导入到DG44细胞中，用500μg/mL遗传霉素筛选，建立恒定表达shDSG3_mIgG2aFc的CHO细胞株。接着，由建立的该表达shDSG3_mIgG2aFc的CHO细胞株的培养上清实施shDSG3_mIgG2aFc的纯化。培养上清添加到Hi Trap ProteinG HP(GEHealthcare Bio-Sciences公司)柱中，用结合缓冲液(20mM磷酸钠(pH7.0))清洗后，用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7))洗脱。洗脱液洗脱到加入了中和缓冲液(1M Tris-HCl(pH9.0))的管中，立即中和。将该洗脱液供给利用Superdex 200 HR 10/30(GE HealthcareBio-Sciences公司)的凝胶过滤，使含有所需抗体的溶液的溶剂被置换为PBS缓冲液。纯化蛋白质是使用DC蛋白测定试剂盒(BIO-RAD公司)，换算成以该试剂盒所附的牛IgG作为标准试样的浓度，进行定量。
3-4)抗DSG3抗体的制备
使用Balb/c小鼠或MRL/MpJ UmmCrj-1pr/lpr小鼠(以下称为MRL/lpr小鼠，购自日本Charles River)作为免疫动物。从7周龄或8周龄开始免疫，初次免疫时，将用PBS缓冲液按照每只含100μgshDSG3_mIgG2aFc进行制备、用弗氏完全佐剂(Beckton Dickinson公司)制成乳液的抗原给予皮下。2周后用PBS缓冲液制备成每只含有50μg、用弗氏不完全佐剂(Beckton Dickinson公司)将其制成乳液的抗原给予皮下。以后以1周的间隔共追加免疫2～4次，最终免疫是用PBS稀释成每只含有50μg，然后经尾静脉进行给药。最终免疫4天后，摘除脾细胞，与小鼠骨髓瘤P3-X63Ag8U1(P3U1，购自ATCC)按照2:1混合，缓慢加入PEG1500(Roche Diagnostics公司)，实施细胞融合。接着慎重地加入RPMI1640培养基(Invitrogen公司)，稀释PEG1500，然后通过离心除去上清，由此除去PEG1500。用含有10％FBS的RPMI1640悬浮得到融合细胞群，使融合细胞群按100μL/孔接种于96孔培养板中。第二天，按100μL/孔添加含有10％FBS、1×HAT培养基添加剂(SIGMA公司)、0.5×BM-Condimed H1杂交瘤克隆添加剂(Roche Diagnostics公司)的RPMI1640(以下称为HAT培养基)。2、3天后培养基的一半置换为HAT培养基，使用7天后的培养上清，以与DSG3分子的结合活性为指标实施筛选。该筛选是通过可检测与恒定表达全长DSG3的CHO细胞的结合的流式细胞术分析来实施。由该分析得到的阳性克隆通过极限稀释法制成单克隆。即，建立了DF120、DF122、DF148、DF151、DF153、DF168、DF331、DF364、DF366作为与DSG3特异性结合的抗体。
用使用FBS(超低IgG)(Invitrogen公司)作为血清的HAT培养基培养杂交瘤，使用Hi Trap蛋白G HP柱，从该杂交瘤的培养上清中与shDSG3_mIgG2aFc同样地实施该单克隆抗体的纯化。洗脱组分是使用PD-10柱(GE Healthcare Bio-Sciences公司)，将该溶液的溶剂置换为PBS后在4℃下保管。纯化抗体是使用DC蛋白测定试剂盒(BIO-RAD公司)，换算为以该试剂盒所附的牛IgG为标准试样的浓度来定量。
3-5)通过流式细胞术进行结合活性的评价
使用获得的抗体，通过流式细胞术评价与恒定表达全长人DSG3的CHO细胞的结合。将细胞悬浮于FACS缓冲液(1％ FBS/PBS)中，使浓度为5×105个细胞/mL，并分注到Multiscreen-HV滤板(Millipore公司)上，通过离心，从分注到Multiscreen-HV滤板上的细胞悬浮液中除去上清。向除去了上清的细胞中添加用FACS缓冲液稀释为适当浓度(3μg/mL)的、含有抗DSG3单克隆抗体的FACS缓冲液，然后在冰上静置30分钟，使该细胞与该单克隆抗体反应。通过离心，从该反应液中除去上清，然后细胞用FACS缓冲液清洗1次。接着，用含有作为二次抗体的、FITC标记抗小鼠IgG抗体的FACS缓冲液使细胞悬浮，使细胞与该二次抗体在冰上反应30分钟。反应结束后通过离心除去上清，将所得细胞悬浮于100μL FACS缓冲液中，然后供给流式细胞术分析。流式细胞仪使用FACS Calibur(Becton Dickinson公司)。通过前散射光和侧散射光的直方图对活细胞集团设定阀值。如图4所示，3μg/mL的抗DSG3单克隆抗体(DF 120、DF 122、DF 148、DF 151、DF 153、DF 168、DF 331、DF 364、DF 366)与表达DSG3的CHO细胞强烈结合，但不与作为母株的CHO细胞结合，由此表明该抗DSG3单克隆抗体与呈递于细胞膜上的DSG3特异性结合。
[实施例4]抗DSG3抗体所具有的细胞毒活性的测定
4-1)抗DSG3抗体的补体依赖性细胞毒活性(CDC)活性的测定
使用恒定表达全长人DSG3的CHO(DSG3-CHO，记载在实施例3-2中)细胞株作为靶细胞。DSG3-CHO细胞株的培养是使用含有500μg/mL遗传霉素(Invitrogen公司)、HT添加剂(Invitrogen公司)、青霉素/链霉素(Invitrogen公司)的CHO-S-SFM II培养基(Invitrogen公司)(以下称为“培养基”)。将5×105个细胞的DSG3-CHO细胞株在4℃下离心5分钟(1000rpm)，并将由此得到的细胞团块悬浮于约200μL含有3.7MBq的铬-51(GE Healthcare Bio-Sciences公司)的培养基中，然后在5％二氧化碳培养箱中、在37℃下培养1小时。将该细胞用培养基清洗3次，然后用培养基制备成细胞密度为1×105个细胞/mL，然后分别以100μL分注到96孔平底板中。接着，向各孔中分别添加50μL用培养基稀释的抗DSG3抗体和对照小鼠IgG2a抗体(BD BiosciencesPharmingen公司)。将抗体制备成终浓度为10μg/mL。接着，向各孔中分别添加50μL用培养基稀释5倍的幼兔补体(Cederlane公司)，然后板在5％二氧化碳培养箱中、在37℃下静置1.5小时。静置后在4℃下离心5分钟(1000rpm)，由板的各孔中分别回收100μL的上清，用γ计数仪(1480 WIZARD 3”，Wallac公司)测定放射活性。基于下式确定特异性铬游离率。
特异性铬游离率(％)＝(A-C)×100/(B-C)
A表示各孔中的放射活性(cpm)，B表示添加100μL细胞和100μL2％ Nonidet P-40溶液(Nacalai Tesque公司)的孔中的放射活性(cpm)的平均值，C表示添加100μL细胞和100μL培养基的孔中的放射活性(cpm)的平均值。测定通过双份实验进行，计算特异性铬游离率的平均值和标准偏差。
确认实验中使用的全部的抗DSG3抗体均具有CDC活性(图5)。而对照小鼠IgG2a抗体在相同浓度下不显示CDC活性。
接着，使用人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431(购自ATCC)、人肺鳞状细胞癌细胞株A549(购自ATCC)、以及恒定表达全长人DSG3的A549细胞株(DSG3-A549，记载在实施例3-2中)作为靶细胞，研究该抗体是否有CDC活性。A431和DSG3-A549在细胞膜上表达DSG3。A431、A549的培养使用含有10％胎牛血清(Invitrogen公司)、青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(Invitrogen公司)(以下称为DMEM培养基)。DSG3-A549细胞株的培养是使用含有1mg/mL遗传霉素的DMEM培养基。A431、A549、DSG3-A549细胞是向96孔平底板的各孔中分别添加2×103个细胞(A549、DSG3-A549)或4×103个细胞(A431)，在5％二氧化碳培养箱中、在37℃下培养3天。培养后以终浓度1.85MBq/mL添加铬-51，进一步持续培养1小时。各孔用300μL的DMEM培养基洗涤，然后添加100μL的DMEM培养基。接着，抗DSG3抗体和幼兔补体按照与在使用DSG3-CHO细胞株的实验中所采用的条件同样地进行添加，由此确定特异性铬游离率。
抗DSG3抗体DF151对表达DSG3的A431和DSG3-A549细胞株浓度依赖性地诱导CDC，但对不表达DSG3的A549细胞株则不显示CDC活性(图6)。由以上结果显示，抗DSG3抗体发挥抗原特异性CDC活性。
4-2)抗DSG3抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性的测
定
ADCC活性的测定使用DSG3-A549细胞株和A431细胞株。与CDC活性测定同样，用96孔平底板培养上述细胞，与铬-51反应。然后各孔用含有10％胎牛血清、青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基(Invitrogen公司)(以下称为RPMI培养基)清洗，然后添加100μL的RPMI培养基。接着，向各孔中分别添加50μL用RPMI培养基稀释的抗DSG3抗体和对照小鼠IgG2a抗体。将抗体制备成终浓度为10μg/mL(来自骨髓的效应细胞)或1μg/mL(来自脾脏的效应细胞)。接着，向各孔中分别添加50μL后述的效应细胞溶液(1×107个细胞/mL)、然后将板放入5％二氧化碳培养箱中、在37℃下静置4小时，之后测定该板中各孔的放射活性，由此放射活性确定特异性铬游离率。效应细胞使用将Balb/c小鼠(日本Charles River公司)的脾细胞用含有50ng/mL重组人白细胞介素-2(Peprotech公司)的RPMI培养基培养5天所得的细胞，或者将相同的小鼠骨髓细胞用含有50ng/mL重组人白细胞介素-2和10ng/mL重组小鼠GM-CHF(Peprotech公司)的RPMI培养基培养6天所得的细胞。
抗DSG3抗体DF151、DF364和DF366对DSG3-A549细胞株和A431细胞株诱导ADCC(图7)。以上结果显示，抗DSG3抗体通过ADCC活性对表达DSG3蛋白质的细胞发挥细胞毒作用。
[实施例5]抗DSG3抗体可变区基因序列的确定
对于DSG3表达细胞，从产生显示ADCC活性、CDC活性的单克隆抗体DF151、DF364和DF366的杂交瘤中克隆抗体可变区基因，确定其序列。使用由产生抗DSG3抗体的杂交瘤提取的总RNA，通过RT-PCR法扩增编码单克隆抗体DF151、DF364和DF366的抗体基因。总RNA使用Rneasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN公司)，由1×107个细胞的杂交瘤提取。用1μg总RNA，使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(CLONTECH公司)、与小鼠IgG2b恒定区序列互补的合成寡核苷酸MHC-IgG2b(SEQ ID NO.43)、与小鼠IgG1恒定区序列互补的合成寡核苷酸MHC-IgG1(SEQ ID NO.100)或者与小鼠κ链恒定区核苷酸序列互补的合成寡核苷酸κ(SEQ ID NO.44)，扩增5′末端一侧基因片段。反转录反应是在42℃下进行1小时30分钟。在50μL含有5μL10×Advantage 2 PCR缓冲液、5μL 10×Universal Primer A Mix、0.2mMdNTPs(dNTP、dGTP、dCTP、dTTP)、1μL Advantage 2聚合酶Mix(以上为CLONTECH公司制备)、2.5μL反转录反应产物、10pmol合成寡核苷酸MHC-IgG2b、MHC-IgG1或κ的PCR反应液中实施PCR反应。反应条件是：在94℃的初始温度下反应30秒；然后将由94℃ 5秒、72℃ 3分钟的反应构成的反应循环重复5次，将由94℃ 5秒、70℃ 10秒、72℃ 3分钟的反应构成的反应循环重复5次，再将由94℃ 5秒、68℃ 10秒、72℃ 3分钟的反应构成的反应循环重复25次，实施PCR反应；最后，反应产物在72℃下加热7分钟。各PCR产物使用QIAquickGel纯化试剂盒(QIAGEN公司制备)，由琼脂糖凝胶进行纯化，然后克隆到pGEM-T Easy载体(Promega公司制备)中，确定该克隆的核苷酸序列。
DF151的H链的CDR1的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.1、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.2、CDR2的核苷酸序列表示为SEQ IDNO.3、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.4、CDR3的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.5、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.6。另外，DF151的L链的CDR1的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.11、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.12、CDR2的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.13、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.14、CDR3的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.15、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.16。
DF364的H链的CDR1的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.21、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.22、CDR2的核苷酸序列表示为SEQ IDNO.23、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.24、CDR3的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.25、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.26。另外，DF364的L链的CDR1的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.29、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.30、CDR2的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.31、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.32、CDR3的核苷酸序列表示为SEQ IDNO.33、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.34。
DF366的H链的CDR1的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.80、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.81、CDR2的核苷酸序列表示为SEQ IDNO.82、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.83、CDR3的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.84、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.85。另外，DF366的L链的CDR1的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.86、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.87、CDR2的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.88、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.89、CDR3的核苷酸序列表示为SEQ IDNO.90、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.91。
DF151的H链可变区的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.45、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.46、L链可变区的核苷酸序列表示为SEQ IDNO.47、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.48。DF364的H链可变区的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.49、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.50、L链可变区的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.51、氨基酸序列表示为SEQID NO.52。DF366的H链可变区的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.92、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.93、L链可变区的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.94、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.95。
[实施例6]抗DSG3抗体全长基因序列的确定
在确定DF151、DF364和DF366的可变区基因序列时，与可变区相邻的恒定区的基因序列也得到确定。用国家生物技术信息中心(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的基本局部比对搜索工具(BLAST)检索与该序列具有相同序列的基因，可获得恒定区整个区域的核苷酸序列。通过将可变区核苷酸序列与所得恒定区的核苷酸序列结合，可以确定全长核苷酸序列。这样，从DF151的H链恒定区的核苷酸序列(SEQ ID NO.53)、DF151、DF364和DF366的L链恒定区的核苷酸序列(SEQ ID NO.54)、DF364和DF366的H链恒定区的核苷酸序列(SEQID NO.55)可分别获得小鼠IgG2b核苷酸序列(DDBJ Accession#：BC025447)、小鼠κ轻链核苷酸序列(DDBJ Accession#：AY704179)、小鼠IgG1核苷酸序列(DDBJ Accession#：BC057688)。
DF151(小鼠IgG2bκ)、DF364(小鼠IgG1κ)和DF366(小鼠IgG1K)的同工型使用IsoStrip小鼠单克隆抗体同工型分型试剂盒(ROCHE公司)预先确定。预想的DF151的H链全长核苷酸序列表示为SEQ IDNO.56、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.57、L链全长核苷酸序列表示为SEQ ID NO.58、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.59。另外，预想的DF364的H链全长核苷酸序列表示为SEQ ID NO.60、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.61、L链全长核苷酸序列表示为SEQ ID NO.62、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.63。另外，预想的DF366的H链全长核苷酸序列表示为SEQ ID NO.101、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.102、L链全长核苷酸序列表示为SEQ ID NO.103、氨基酸序列表示为SEQID NO.104。此外，DF151的H链恒定区的核苷酸序列表示为SEQ IDNO.7、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.8、L链恒定区的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.17、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.18。DF364和DF366的H链恒定区的碱基区的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.27、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.28、L链恒定区的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.35、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.36、
[实施例7]抗DSG3小鼠-人嵌合抗体的制备
各抗体的H链和L链可变区序列与人H链和人L链恒定区序列进行符合读框的连接。使用在编码H链可变区的核苷酸序列的5’末端具有Kozak序列的互补序列和EcoRI位点的合成寡核苷酸，以及与3末端核苷酸序列互补、在其序列中插入NheI位点所得的合成寡核苷酸实施PCR。使用在编码L链可变区的核苷酸序列的5’末端具有Kozak序列的互补序列和BamHI位点的合成寡核苷酸，以及与3’末端一侧核苷酸序列互补、在其序列中具有BsiWI位点的合成寡核苷酸实施PCR。所得PCR产物被克隆到抗体表达质粒pMCDN_G1k中。pMCDN-G1k具有将人IgG1恒定区(核苷酸序列表示为SEQ ID NO.9，氨基酸序列表示为SEQ ID NO.10)克隆到pMCDN载体中、且具有通过NheI位点连接小鼠H链可变区和人H链(γ1链)恒定区的结构。还具有另外一个含有小鼠CMV启动子的表达单元、以及插入有人κ恒定区(核苷酸序列表示为SEQ ID NO.19，氨基酸序列表示为SEQ IDNO.20)、且具有通过BsiWI位点连接小鼠L链可变区和人L链(κ链)恒定区的结构。该质粒在动物细胞内表达新霉素抗性基因、DHFR基因、抗DSG3小鼠-人嵌合抗体基因。
上述制备的pMCDN_G1k_DF151、pMCDN_G1k_DF364和pMCDN_G1k_DF366通过电穿孔法导入到DG44细胞中。用500μg/mL遗传霉素进行筛选，建立恒定表达DF151小鼠-人嵌合抗体(以下称为DF151c)、DF364小鼠-人嵌合抗体(以下称为DF364c)和DF366小鼠-人嵌合抗体(以下称为DF366c)的CHO细胞。接着，使用Hi Trap r蛋白A柱(GE Healthcare Bio-Sciences公司)，从该CHO细胞的培养上清中纯化抗DSG3小鼠-人嵌合抗体。纯化抗体是用PD-10柱(GEHealthcare Bio-Sciences公司)进行缓冲液更换，更换为PBS缓冲液，通过DC蛋白测定进行定量，然后在4℃下保存。纯化的抗DSG3小鼠-人嵌合抗体通过流式细胞术分析确认与小鼠抗体同样，与DSG3特异性结合。另外，DF151c的H链全长的核苷酸序列表示为SEQ IDNO.64、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.65、L链全长的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.66、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.67。DF364c的H链全长的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.68、氨基酸序列表示为SEQID NO.69、L链全长的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.70、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.71。DF366c的H链全长的核苷酸序列表示为SEQID NO.96、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.97、L链全长的核苷酸序列表示为SEQ ID NO.98、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.99。
[实施例8]低岩藻糖型抗DSG3小鼠-人嵌合抗体的制备
作为增强抗体的ADCC活性的方法，已知有将抗体的糖链进行修饰的方法。例如WO99/54342中记载：通过抗体的葡糖基化修饰，可以改良ADCC活性。WO00/61739中记载：根据抗体糖链中岩藻糖的存在与否，可调节ADCC活性。WO02/31140号中记载，通过在YB2/0细胞株中产生抗体，可以制备具有不含α-1，6核芯岩藻糖的糖链的抗体。探讨了抗DSG3抗体通过上述例举的ADCC改良技术是否可增强其活性。首先，作为宿主细胞，YB2/0细胞株(购自ATCC)在含有10％ FBS的RPMI1640培养基中培养。实施例7中制备的抗DSG3小鼠-人嵌合抗体表达载体通过电穿孔法、在1.4kV、25μF的条件下导入到YB2/0细胞株中。用500μg/mL遗传霉素进行筛选，由此建立了恒定表达低岩藻糖型DF151小鼠-人嵌合抗体(以下称为YB-DF151c)、低岩藻糖型DF364小鼠-人嵌合抗体(以下称为YB-DF364c)和低岩藻糖型DF366小鼠-人嵌合抗体(以下称为YB-DF366c)的YB2/0细胞株。接着，使用Hi Trap r蛋白A柱，从培养上清中纯化低岩藻糖型抗DSG3小鼠-人嵌合抗体。纯化抗体是通过PD-10柱进行缓冲液更换，更换为PBS缓冲液，通过DC蛋白测定进行定量，然后在4℃下保存。纯化的低岩藻糖型抗DSG3小鼠-人嵌合抗体通过流式细胞术分析确认：与抗DSG3小鼠-人嵌合抗体同样，与DSG3特异性结合。
[实施例9]抗DSG3小鼠-人嵌合抗体和低岩藻糖型抗DSG3小鼠-人嵌合抗体的CDC活性和ADCC活性的测定
9-1)恒定表达全长人DSG3的细胞株的建立
全长人DSG3的cDNA克隆到哺乳细胞表达用载体(pMCDN)中(pMCDN/hDSG3)。pMCDN可在小鼠CMV启动子(ACCESSIONNo.U68299)下诱导表达，是整合有新霉素抗性基因、DHFR基因的载体。pMCDN/hDSG3通过电穿孔法导入到Ba/F3细胞(购自理化学研究所BioResource Center)中，用500μg/mL遗传霉素(Invitrogen公司)筛选，建立恒定表达全长人DSG3的Ba/F3细胞株(DSG3-Ba/F3)。该DSG3-Ba/F3细胞的培养是使用含有500μg/mL遗传霉素、青霉素/链霉素(Invitrogen公司)、重组小鼠白细胞介素-3(R&D系统公司)、10％胎牛血清(Invitrogen公司)的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)。
9-2)全长人CD16恒定表达细胞的建立
全长人CD16(RefSeq ID，NM_000569)克隆到pMCDN中，然后通过电穿孔法导入到NK-92细胞(购自ATCC)中，用500μg/mL遗传霉素进行筛选，建立恒定表达全长人CD16的NK-92细胞株(CD16-NK92)。CD16-NK92细胞株的培养是使用含有500μg/mL遗传霉素、青霉素/链霉素、0.2mM肌醇(Sigma公司)、0.1mM 2-巯基乙醇(Invitrogen公司)、0.02mM叶酸(Sigma公司)、100U/mL重组人白细胞介素-2(Peprotech公司)、12.5％马血清(Invitrogen公司)、12.5％胎牛血清的不含核糖核苷和脱氧核糖核苷、含L-谷氨酰胺的α极限必需培养基(Invitrogen公司)。
9-3)抗DSG3小鼠-人嵌合抗体的CDC活性的测定
对5×105个细胞的DSG3-Ba/F3细胞悬浮液进行离心(1000rpm，5分钟，4℃)，细胞团块悬浮于约200μL含有10％胎牛血清、青霉素/链霉素和3.7MBq的铬-51(GE Healthcare Bio-Sciences公司)的RPMI1640培养基(以下称为培养基)中，将其在5％二氧化碳培养箱中、在37℃下培养1小时。该细胞用培养基清洗3次，然后制备成2×105个细胞/mL，然后向96孔圆底板的各孔中分别添加50μL。接着，每孔分别添加50μL DF151c、DF364c和DF366c以及对照人IgG抗体(Zymed公司)。抗体制备成终浓度为10μg/mL。接着，幼兔补体(Cederlane公司)是用培养基稀释为5倍，然后分别添加100μL。将该板在5％二氧化碳培养箱中、在37℃下静置4小时。培养后离心(1000rpm，5分钟，4℃)该板，通过γ计数仪(1480WIZARD 3″，Wallac公司)测定100μL上清的放射活性。基于下式确定特异性铬游离率。
特异性铬游离率(％)＝(A-C)×100/(B-C)
A表示各孔的放射活性(cpm)，B表示添加50μL细胞和150μL 2％Nonidet P-40溶液(Nacalai Tesque公司)的孔中的放射活性(cpm)的平均值，C表示添加50μL细胞和150μL培养基的孔中的放射活性(cpm)的平均值。测定通过双份实验进行，计算特异性铬游离率的平均值和标准偏差。显示DF151c、DF364c和DF366c具有CDC活性(图8)。
9-4)抗DSG3小鼠-人嵌合抗体和低岩藻糖型抗DSG3小鼠-人嵌合抗
体的ADCC活性的测定
DSG3-Ba/F3细胞用铬-51标记后，96孔圆底板的各孔中分别添加50μL。接着，DF364c、DF366c、YB-DF364c、YB-DF366c和对照人IgG抗体是各孔中分别添加50μL。抗体的终浓度通过由1μg/mL以比例10、分4个阶段连续稀释来制备。接着向各孔中分别添加100μL2×105个细胞/mL的CD16-NK92细胞。该板在5％二氧化碳培养箱中、在37℃下静置4小时，然后通过与8-3)同样的方法确定特异性铬游离率。
各抗体均显示抗体浓度依赖性的ADCC活性(图9)。特别是低岩藻糖型抗体YB-DF364c和YB-DF366c显示强的ADCC活性。
[实施例10]肺癌、皮肤癌、子宫癌中的DSG3的免疫组织染色
DSG3在肺鳞状细胞癌中以蛋白质水平表达亢进(参照实施例2)。这里，对于皮肤癌、子宫癌和肺癌中罹患数较多的肺腺癌，为了确认DSG3蛋白质的表达而重新实施免疫组织染色分析。首先，由各检样制备4％多聚甲醛(PFA)或过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛(PLP)固定的AmeX包埋石蜡块和10％中性缓冲甲醛(NBF)固定的石蜡包埋块，薄切成3μm的切片。脱石蜡后对这些切片用Ventana HX Discovery系统(Ventana Medical Systems，Inc.，亚利桑那，美国)，如下所述进行免疫组织化学染色。各标本在脱石蜡后进行水洗，为了除去内源性过氧化物酶，在室温下、在3.0％过氧化氢溶液(D抑制剂)下反应4分钟。清洗后为了除去非特异性反应而加入蛋白质封闭，在室温下反应30分钟。接着进行清洗，加入小鼠抗人桥粒芯蛋白抗体(Clone 5G11，ZYMEDLaboratories Inc.，加利福尼亚，美国)作为一次抗体，在室温下反应1小时。清洗后加入二次抗体(Ventana Universal二次抗体，VentanaMedical Systems)，在室温下反应30分钟。清洗后为了用Blocker D除去非特异性反应，在室温下反应2分钟。接着加入链霉亲和素辣根过氧化物酶(SA-HRP，Ventana Medical Systems)，在37℃下反应16分钟。清洗后将二氨基联苯胺(DAB图谱溶液，Ventana Medical Systems)和过氧化氢溶液(DAB图谱溶液，Ventana Medical Systems)混合、并加入，为了使底物显色，在37℃下反应8分钟。接着通过硫酸铜溶液(Ventana Medical Systems)进行显色的增敏。清洗后用苏木精进行核染，进行脱水、透明、密封。
结果，3例肺鳞状细胞癌中有2例、9例肺腺癌中有1例、2例皮肤鳞状细胞癌中有2例、1例皮肤基底细胞癌中有1例、1例子宫鳞状细胞癌中有1例确认了DSG3的表达(表3)。
[表3]
缩写：BBC：基底细胞癌；M：乳腺癌；SCC：鳞状细胞癌
a)癌症的组织部位
b)组织类型
c)癌症的分级(1：分化良好；2：中度分化；3：低分化)
d)病例编号
e)1：微弱；2：弱；3：中度；4：强
f)1：稀少(低于10％)；2：偶尔(低于50％，但为10％以上)；3：频繁(低于90％，但为50％以上)；4：衡量(为90％以上)
[实施例11]抗DSG3抗体的抗肿瘤活性的评价
11-1)小鼠IgG2a嵌合DF366抗体(DF366m)的制备
将DF366抗体的H链可变区基因的核苷酸序列与小鼠IgG2a的H链恒定区基因的核苷酸序列进行符合读框的连接。首先，使用具有H链可变区基因的5′末端核苷酸序列和Kozak序列以及限制酶EcoRI序列的引物(SEQ ID NO.105)，和在3′末端核苷酸序列的互补序列中附加有c残基的反义引物(SEQ ID NO.106)实施PCR。将所得扩增产物用限制酶EcoRI处理，然后整合到小鼠IgG2a嵌合H链表达质粒(pMCD/G2a)的EcoRI-NruI位点中，构建小鼠IgG2a嵌合DF366抗体H链表达载体(pMCD/G2a-DF366)。pMCD/G2a是将小鼠IgG2a的H链恒定区基因(核苷酸序列：SEQ ID NO.107，氨基酸序列：SEQ IDNO.108)克隆到哺乳细胞表达用质粒pMCD中，使H链恒定区的限制酶NruI序列与H链可变区连接。pMCD载体是可在小鼠CMV启动子(ACCESSION No.U68299)的控制下诱导表达、且整合有DHFR基因的载体。
将DF366抗体的L链可变区基因的核苷酸序列与小鼠IgG2a的L链(κ链)恒定区基因的核苷酸序列进行符合读框的连接。首先，使用具有L链可变区基因的5′末端核苷酸序列和Kozak序列以及限制酶EcoRI序列的引物(SEQ ID NO.109)，和在3′末端核苷酸序列的互补序列中附加有gcccg残基的反义引物(SEQ ID NO.110)实施PCR。将所得扩增产物用限制酶EcoRI处理，然后整合到小鼠IgG2a嵌合L链(κ链)表达质粒(pMCN/k)的EcoRI-NruI位点中，构建小鼠IgG2a嵌合DF366抗体L链表达载体(pMCN/κ-DF366)。pMCN/k是将小鼠IgG2a的L链(κ链)恒定区基因(核苷酸序列：SEQ ID NO.111，氨基酸序列：SEQ IDNO.112)克隆到质粒pMCN中，使L链(κ链)恒定区的限制酶NruI序列与L链可变区连接。
将质粒pMCD/G2a-DF366和质粒pMCN/k-DF366通过电穿孔法导入到DG44细胞中。用500μg/mL遗传霉素和不含核酸(HT添加剂)的培养基进行筛选，建立恒定表达小鼠IgG2a嵌合DF366抗体(DF366m)的CHO细胞(DF366m-DG44)。接着，使用Hi Trap蛋白G HP柱，由该DF366m-DG44的培养上清中纯化DF366m抗体。使用PD-10柱将溶剂置换为PBS。纯化的DF366m抗体的浓度使用DC蛋白测定试剂盒进行定量。DF366m抗体通过流式细胞术分析，确认与DF366抗体(记载在实施例3-5中)同样，与DSG3特异性结合。DF366m抗体的H链基因全长核苷酸序列表示为SEQ ID NO.113、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.114、L链基因全长核苷酸序列表示为SEQ ID NO.115、氨基酸序列表示为SEQ ID NO.116。
11-2)低岩藻糖小鼠IgG2a嵌合DF366抗体(低岩藻糖DF366m)的制备
通过电穿孔法将质粒pMCD/G2a-DF366和质粒pMCD/k-DF366导入到敲除岩藻糖转运蛋白的CHO细胞(FTPKO-DXB11细胞，国际公开公报WO2006/067913、国际公开公报WO2006/067847)中。用500μg/mL遗传霉素和不含核酸(HT添加剂)的培养基进行筛选，建立恒定表达低岩藻糖的小鼠IgG2a嵌合DF366抗体(低岩藻糖DF366m)的CHO细胞(DF366m-DXB11)。接着，使用Hi Trap蛋白G HP柱，从该DF366m-DXB11的培养上清中纯化低岩藻糖DF366m抗体。使用PD-10柱将溶剂置换为PBS，通过DC蛋白测定试剂盒定量抗体浓度。
11-3)ADCC活性的的测定
实验是使用含有青霉素/链霉素、10％胎牛血清的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)(以下称为RPMI培养基)。将1×106个DSG3-Ba/F3细胞悬浮于约200μL含有3.7MBq铬-51(GE Healthcare Bio-Sciences公司)的RPMI培养基中，然后在5％二氧化碳的培养箱中、在37℃下培养1小时。清洗后将细胞密度制备为为2×105个细胞/mL，以每孔50μL分别分注到96孔U底板中。接着向各孔中分别添加50μL抗体溶液。在室温下静置15分钟，然后分别添加100μL效应细胞(后述)。板在5％二氧化碳培养箱中、在37℃下静置6小时。然后从各孔中分别回收100μL上清，用γ计数仪(1480 WIZARD 3″，Wallac公司)测定放射活性。基于下式计算特异性铬游离率。
特异性铬游离率(％)＝(A-C)×100/(B-C)
A表示各孔的放射活性(cpm)，B表示添加50μL细胞和150μL 2％Nonidet P-40溶液(Nacalai Tesque公司)的孔中的放射活性(cpm)的平均值，C表示添加50μL细胞和150μL RPMI培养基的孔中的放射活性(cpm)的平均值。测定通过双份实验进行，计算特异性铬游离率的平均值和标准偏差。
效应细胞是向由C3H小鼠(日本Charles River公司)制备的脾细胞中添加50ng/mL重组人白细胞介素-2(Peprotech公司)所得的细胞(以下称为SPL)，或者在50ng/mL重组白细胞介素-2的存在下将脾细胞培养4天所得的细胞(以下称为SPL-LAK)。每孔的效应细胞数是5×105个(SPL)或2×105个(SPL-LAK)。阴性对照使用小鼠IgG2a(Cat.No.553453，Becton Dickinson公司)和人IgG1(Cat.No.PHP010，Serotec公司)。
在DF366m和低岩藻糖DF366m中测定到了ADCC活性，而DF366c、YB-DF366c中均未测到ADCC活性(图10、11)。因此可以认为，在小鼠中，DF366m、低岩藻糖DF366m比DF366c、YB-DF366c显示强的药效。
11-4)全长人DSG3恒定表达细胞株的建立
将pMCDN/hDSG3用限制酶PvuI消化，然后通过使用FuGENE(Roche公司)而进行的转染导入到SK-HEP-1细胞(购自ATCC)中，用1mg/mL遗传霉素进行筛选，建立恒定表达全长人DSG3的SK-HEP-1细胞株(以下称为DSG3-SK)。DSG3-SK细胞的培养使用含有1mg/mL遗传霉素、10％胎牛血清的D-MEM培养基(Sigma公司)。
11-5)评价DF366m和低岩藻糖DF366m的抗肿瘤活性
将DSG3-SK细胞用以1:1含有D-MEM培养基和MATRIGEL(Cat.No.354234，BD Bioscience)的溶液制备成1×108个细胞/mL，将100μL移植到在前一天腹腔内给予100μL抗去唾液酸GM1抗体(和光纯药制备，将1个安瓿瓶用1mL的注射用蒸馏水溶解，然后添加4mL生理盐水)的SCID小鼠(雌性，9周龄，日本CLEA)的腹部皮下。自移植后的第19天起，每周一次通过尾静脉给予DF366m和低岩藻糖DF366m，共给药4周。抗体是用PBS制备成1mg/mL(10mg/kg给药组)或0.2mg/mL(2mg/kg给药组)，以10mL/kg进行给药。同样地给予PBS(溶媒)作为阴性对照。每组5只进行实验。抗肿瘤活性以肿瘤体积进行评价。肿瘤体积基于下式测定，计算平均值和标准偏差。
肿瘤体积＝长径×短径×短径/2
显著性检验是使用非参数Dunnett型多重比较，以P值低于0.05为显著。
实验的结果表明，对于DF366m和低岩藻糖DF366m，在10mg/kg的给药组中相对于溶媒给药组显著抑制了肿瘤的增殖(图12)。并且，虽然不显著、但是低岩藻糖DF366m在以2mg/kg给药时也显示了抑制的倾向。以上确认了抗DSG3抗体显示抗肿瘤活性。
产业实用性
使用本发明的DSG3蛋白质特异性抗体，不仅可用作肺癌、也可用作大肠癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌或子宫癌的诊断试剂。并且，通过将该抗DSG3抗体用化学物质或放射性同位素等标记后使用，在生物体内可以检测出肺癌、大肠癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌或子宫癌的存在。
而且，本发明的具有细胞毒活性的抗DSG3抗体可用作表达DSG3蛋白质的肺癌、大肠癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌或子宫癌等各种癌细胞的细胞毒性剂或细胞增殖抑制剂。
并且，本发明的具有细胞毒活性的抗DSG3抗体可用作肺癌、大肠癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌或子宫癌等各种癌症的治疗药物。此外，使用本发明的抗DSG3抗体，不会诱发天疱疮病态，可用作上述癌症的治疗药物。
并且，编码本发明抗体的基因和由该基因转化的重组细胞可应用于发挥上述效果、以及更优选效果的重组抗体的制备。
序列表
<110>株式会社未来创药研究所
国立大学法人东京大学
<120>使用抗桥粒芯蛋白3抗体的癌症的诊断和治疗
<130>C1-A0613Y1P
<150>JP 2006-221230
<151>2006-08-14
<150>JP 2007-019108
<151>2007-01-30
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<170>PatentIn version 3.4
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<223>人工合成的肽序列
<400>116
Claims (32)
1.药物组合物，该药物组合物含有与DSG3蛋白质结合的抗体作为有效成分。
2.细胞增殖抑制剂，该细胞增殖抑制剂含有与DSG3蛋白质结合的抗体作为有效成分。
3.抗癌药，该抗癌药含有与DSG3蛋白质结合的抗体作为有效成分。
4.权利要求3所述的抗癌药，其中，与DSG3蛋白质结合的抗体是具有细胞毒活性的抗体。
5.权利要求3或4所述的抗癌药，其中，与DSG3蛋白质结合的抗体是以下(1)～(47)中任一项所述的抗体：
(1)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.4的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.6的氨基酸序列；
(2)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.8的氨基酸序列；
(3)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列；
(4)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.14的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.16的氨基酸序列；
(5)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.18的氨基酸序列；
(6)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列；
(7)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(4)所述的L链；
(8)抗体，该抗体含有(2)所述的H链和(5)所述的L链；
(9)抗体，该抗体含有(3)所述的H链和(6)所述的L链；
(10)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.22的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.24的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.26的氨基酸序列；
(11)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列；
(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列；
(13)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.30的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.32的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.34的氨基酸序列；
(14)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列；
(15)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列；
(16)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(13)所述的L链；
(17)抗体，该抗体含有(11)所述的H链和(14)所述的L链；
(18)抗体，该抗体含有(12)所述的H链和(15)所述的L链；
(19)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(13)所述的L链；
(20)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(14)所述的L链；
(21)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(15)所述的L链；
(22)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(4)所述的L链；
(23)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(5)所述的L链；
(24)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(6)所述的L链；
(25)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.81的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.83的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.85的氨基酸序列；
(26)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列；
(27)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列；
(28)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.87的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.89的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.91的氨基酸序列；
(29)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列；
(30)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列；
(31)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(28)所述的L链；
(32)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(29)所述的L链；
(33)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(30)所述的L链；
(34)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(28)所述的L链；
(35)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(29)所述的L链；
(36)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(30)所述的L链；
(37)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(28)所述的L链；
(38)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(29)所述的L链；
(39)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(30)所述的L链；
(40)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(4)所述的L链；
(41)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(5)所述的L链；
(42)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(6)所述的L链；
(43)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(13)所述的L链；
(44)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(14)所述的L链；
(45)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(15)所述的L链；
(46)抗体，该抗体是在(1)～(45)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(45)中任一项所述的抗体具有同等活性；
(47)抗体，该抗体与表位结合，该表位与(1)～(45)中任一项所述的抗体所结合的DSG3蛋白质的表位相同。
6.权利要求3～5中任一项所述的抗癌药，其中，癌症是肺癌、大肠癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌或子宫癌。
7.权利要求6所述的抗癌药，其中，肺癌是非小细胞肺癌。
8.使表达DSG3蛋白质的细胞和与DSG3蛋白质结合的抗体接触，由此对该DSG3表达细胞引发细胞毒的方法。
9.使表达DSG3蛋白质的细胞和与DSG3蛋白质结合的抗体接触，由此抑制该DSG3表达细胞的增殖的方法。
10.权利要求8或9所述的方法，其中，与DSG3蛋白质结合的抗体是具有细胞毒活性的抗体。
11.权利要求8～10中任一项所述的方法，其中，与DSG3蛋白质结合的抗体是以下(1)～(47)中任一项所述的抗体：
(1)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.4的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.6的氨基酸序列；
(2)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.8的氨基酸序列；
(3)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列；
(4)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.14的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.16的氨基酸序列；
(5)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.18的氨基酸序列；
(6)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列；
(7)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(4)所述的L链；
(8)抗体，该抗体含有(2)所述的H链和(5)所述的L链；
(9)抗体，该抗体含有(3)所述的H链和(6)所述的L链；
(10)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.22的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.24的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.26的氨基酸序列；
(11)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列；
(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列；
(13)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.30的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.32的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.34的氨基酸序列；
(14)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列；
(15)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列；
(16)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(13)所述的L链；
(17)抗体，该抗体含有(11)所述的H链和(14)所述的L链；
(18)抗体，该抗体含有(12)所述的H链和(15)所述的L链；
(19)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(13)所述的L链；
(20)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(14)所述的L链；
(21)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(15)所述的L链；
(22)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(4)所述的L链；
(23)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(5)所述的L链；
(24)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(6)所述的L链；
(25)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.81的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.83的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.85的氨基酸序列；
(26)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列；
(27)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列；
(28)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.87的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.89的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.91的氨基酸序列；
(29)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列；
(30)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列；
(31)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(28)所述的L链；
(32)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(29)所述的L链；
(33)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(30)所述的L链；
(34)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(28)所述的L链；
(35)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(29)所述的L链；
(36)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(30)所述的L链；
(37)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(28)所述的L链；
(38)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(29)所述的L链；
(39)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(30)所述的L链；
(40)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(4)所述的L链；
(41)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(5)所述的L链；
(42)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(6)所述的L链；
(43)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(13)所述的L链；
(44)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(14)所述的L链；
(45)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(15)所述的L链；
(46)抗体，该抗体是在(1)～(45)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(45)中任一项所述的抗体具有同等活性；
(47)抗体，该抗体与表位结合，该表位与(1)～(45)中任一项所述的抗体所结合的DSG3蛋白质的表位相同。
12.权利要求8～11中任一项所述的方法，其中，表达DSG3蛋白质的细胞是癌细胞。
13.与DSG3蛋白质结合且对表达DSG3蛋白质的细胞具有细胞毒活性的抗体。
14.权利要求13所述的抗体，其中，细胞毒活性是ADCC活性。
15.权利要求13所述的抗体，其中，细胞毒活性是CDC活性。
16.权利要求13～15中任一项所述的抗体，其中该抗体是结合有低分子化疗药物或者毒性肽的抗体。
17.与DSG3蛋白质结合的抗体，其中该抗体是结合有低分子化疗药物或者毒性肽的抗体。
18.权利要求13～17中任一项所述的抗体，其中该抗体是以下(1)～(47)中任一项所述的抗体：
(1)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.4的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.6的氨基酸序列；
(2)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.8的氨基酸序列；
(3)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列；
(4)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.14的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.16的氨基酸序列；
(5)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.18的氨基酸序列；
(6)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列；
(7)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(4)所述的L链；
(8)抗体，该抗体含有(2)所述的H链和(5)所述的L链；
(9)抗体，该抗体含有(3)所述的H链和(6)所述的L链；
(10)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.22的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.24的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.26的氨基酸序列；
(11)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列；
(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列；
(13)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.30的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.32的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.34的氨基酸序列；
(14)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列；
(15)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列；
(16)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(13)所述的L链；
(17)抗体，该抗体含有(11)所述的H链和(14)所述的L链；
(18)抗体，该抗体含有(12)所述的H链和(15)所述的L链；
(19)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(13)所述的L链；
(20)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(14)所述的L链；
(21)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(15)所述的L链；
(22)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(4)所述的L链；
(23)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(5)所述的L链；
(24)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(6)所述的L链；
(25)抗体，该抗体含有H链，该H链具有作为CDR1的SEQ IDNO.81的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.83的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.85的氨基酸序列；
(26)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.28的氨基酸序列；
(27)抗体，该抗体含有(25)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO.10的氨基酸序列；
(28)抗体，该抗体含有L链，该L链具有作为CDR1的SEQ IDNO.87的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO.89的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO.91的氨基酸序列；
(29)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.36的氨基酸序列；
(30)抗体，该抗体含有(28)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO.20的氨基酸序列；
(31)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(28)所述的L链；
(32)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(29)所述的L链；
(33)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(30)所述的L链；
(34)抗体，该抗体具有(1)所述的H链和(28)所述的L链；
(35)抗体，该抗体具有(2)所述的H链和(29)所述的L链；
(36)抗体，该抗体具有(3)所述的H链和(30)所述的L链；
(37)抗体，该抗体具有(10)所述的H链和(28)所述的L链；
(38)抗体，该抗体具有(11)所述的H链和(29)所述的L链；
(39)抗体，该抗体具有(12)所述的H链和(30)所述的L链；
(40)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(4)所述的L链；
(41)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(5)所述的L链；
(42)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(6)所述的L链；
(43)抗体，该抗体含有(25)所述的H链和(13)所述的L链；
(44)抗体，该抗体含有(26)所述的H链和(14)所述的L链；
(45)抗体，该抗体含有(27)所述的H链和(15)所述的L链；
(46)抗体，该抗体是在(1)～(45)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(45)中任一项所述的抗体具有同等活性；
(47)抗体，该抗体与表位结合，该表位与(1)～(45)中任一项所述的抗体所结合的DSG3蛋白质的表位相同。
19.DSG3蛋白质作为癌症诊断标志物的应用。
20.癌症的诊断方法，其特征在于：使用与DSG3蛋白质结合的抗体来检测DSG3蛋白质。
21.癌症的诊断方法，该方法包含以下步骤：
(a)由受试者采集试样的步骤；
(b)使用与DSG3蛋白质结合的抗体来检测采集的试样中所含的DSG3蛋白质的步骤。
22.权利要求20或21所述的诊断方法，其中，与DSG3蛋白质结合的抗体是由发射正电子核素标记的抗体。
23.权利要求22所述的诊断方法，其中，发射正电子核素是选自11C、13N、15O、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、124I中的任一种核素。
24.癌症的诊断方法，其特征在于：检测编码DSG3蛋白质的基因的表达。
25.权利要求20～24中任一项所述的诊断方法，其中，癌症是肺癌、大肠癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌或子宫癌。
26.权利要求25所述的诊断方法，其中，肺癌是非小细胞肺癌。
27.诊断药物，该诊断药物用于权利要求20～26中任一项所述的诊断方法。
28.试剂盒，该试剂盒用于权利要求20～26中任一项所述的诊断方法。
29.与DSG3蛋白质结合的抗体在制备细胞增殖抑制剂中的应用。
30.与DSG3蛋白质结合的抗体在制备抗癌药中的应用。
31.抑制细胞增殖的方法，该方法包含将与DSG3蛋白质结合的抗体给予受治对象的步骤。
32.预防或治疗癌症的方法，该方法包含将与DSG3蛋白质结合的抗体给予受治对象的步骤。
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