RU2770444C1 - Рекомбинантные белки-антигены и способ определения эпитопной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой, тест-система на их основе - Google Patents

Рекомбинантные белки-антигены и способ определения эпитопной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой, тест-система на их основе Download PDF

Info

Publication number
RU2770444C1
RU2770444C1 RU2020144116A RU2020144116A RU2770444C1 RU 2770444 C1 RU2770444 C1 RU 2770444C1 RU 2020144116 A RU2020144116 A RU 2020144116A RU 2020144116 A RU2020144116 A RU 2020144116A RU 2770444 C1 RU2770444 C1 RU 2770444C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
seq
insdseq
insdqualifier
extracellular domain
insdfeature
Prior art date
Application number
RU2020144116A
Other languages
English (en)
Inventor
Алексей Алексеевич Кубанов
Дмитрий Геннадьевич Дерябин
Александр Александрович Никоноров
Марина Валентиновна Шпилевая
Арфеня Эдуардовна Карамова
Екатерина Николаевна ЛАРИНА
Теймур Кантамирович Алиев
Иван Витальевич Смирнов
Александр Габибович Габибов
Михаил Петрович Кирпичников
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority to RU2020144116A priority Critical patent/RU2770444C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2770444C1 publication Critical patent/RU2770444C1/ru

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6881Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from skin

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантным антигенам десмоглеина человека, и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике пузырчатки обыкновенной. Изобретение обеспечивает возможность определения антигенной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой за счет применения рекомбинатного белка-антигена, содержащего белки-антигены экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека и его фрагментов, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, соответственно. 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно - к дерматовенерологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностике и предназначено для выявления аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа (Dsg3) человека у больных пузырчаткой обыкновенной (L10.0 по МКБ-10). Изобретение может быть использовано для обнаружения аутореактивных антител к Dsg3 человека в сыворотке крови при проведении первичной диагностики пузырчатки, исследовании развития аутоимунного ответа на Dsg3 в динамике заболевания с построением соответствующего прогноза, выборе средств и методов для удаления аутореактивных антител из крови пациентов, а также для оценки эффективности проводимых терапевтических мероприятий.
Из уровня техники (Ishii K, Amagai М, Hall RP. et al.: Characterization of autoantibodies in pemphigus using antigen-specific ELISAs with baculovirus expressed recombinant desmogleins. J Immunol 1997; 159:2010-2017) известна чувствительная и специфичная экспериментальная тест-система иммуноферментного анализа (ELISA) для выявления суммарных аутоантител против Dsg3, положенная в основу коммерчески доступной тест-системы «MESACUP-2 TEST Desmoglein 3», выпускаемой фирмой MBL (Medical and Biological Laboratories Co. Ltd. Нагоя, Япония). В данной тест-системе используется полноразмерный рекомбинантный внеклеточный домен Dsg3 человека, продуцируемый клетками СНО (Chinese hamster ovary). Уровень антител в сыворотке крови оценивается индексом U/ml (Unit value/ml). Тест-система включает калибраторы 0, 20 и 100 U/ml, с использованием которых рассчитывается данный индекс. Значение индекса ≥20 свидетельствует о наличии антител к Dsg3. Существенным недостатком данной тест системы является отсутствие возможности построения калибровочного графика для количественной оценки уровня аутоантител против экстрацеллюлярного домена Dsg3, а также невозможность определения профиля аутоантител против отдельных фрагментов ЕС1-ЕС5 внеклеточного домена Dsg3 (Amagai М. Klaus-Kovtun V., Stanley J.R. Autoantibodies against a novel epithelial cadherin in pemphigus vulgaris, a disease of cell adhesion. Cell 1991; 67:869-877).
В другой известной системе ELISA (Schmidt E,
Figure 00000001
C, Rosemann A. et al. Novel ELISA systems for antibodies to desmoglein 1 and 3: correlation of disease activity with serum autoantibody levels in individual pemphigus patients. Exp Dermatol. 2010; 19: 458-463) в качестве целевых антигенов применены экстрацеллюлярные домены Dsg1 и Dsg3, экспрессированные в клеточной линии человека HEK293. Уровень активности антител в исследуемом образце оценивается в сравнительных единицах - relative units в мл (RU/ml). Для количественной характеристики активности антител в состав тест-системы входят калибраторы 2, 20 и 200 RU/ml, на основе значений оптической плотности которых строится калибровочный график. Как и в тест-системе фирмы MBL, значение активности ≥20 RU/ml свидетельствует о наличии антител к Dsg3. Разработанная Schmidt Е. et al. тест-система в настоящее время коммерциализована и выпускается фирмой Euroimmun - «Anti-Dsg3 ELISA (IgG)» (Medizinische Labordiagnostika AG,
Figure 00000002
Germany). Недостатком данной тест системы также является отсутствие возможности охарактеризовать специфичность аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека у больных вульгарной пузырчаткой.
Указанный недостаток рассматриваемых тест-систем имеет принципиальное значение, поскольку имеются сообщения о возможности преобладания в разные фазы заболевания аутоантител класса IgG, специфичных к разным (проксимальным С-концевым или дистальным N-концевым) фрагментам экстрацеллюлярного домена Dsg3. При этом аутоантитела к дистальному фрагменту ЕС1, имея более низкую активность в ELISA, обладают большей патогенностью, в то время как более реакционно-активные антитела к проксимальным доменам ЕС4 и ЕС5 менее патогенны (Amagai М, Karpati S, Prussick R, Klaus-Kovtun V, Stanley J R. Autoantibodies against the amino-terminal cadherin-like binding domain of pemphigus vulgaris antigen are pathogenic. J Clin Invest 1992; 90: 919-926).
Другим аргументом в пользу необходимости анализа индивидуальных профилей иммунореактивности на способность взаимодействия с тем или иным фрагментом экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека является т.н. «теория распространения эпитопов» (Lehmann, P.V., Forsthuber, Т., Miller, A. and Sercarz, Е.Е. Spreading of T-cell autoimmunity to cryptic determinants of an autoantigen. Nature 1992; 358: 155-157. The first description of epitope spreading in an autoimmune disease). Согласно данным представлениям, у пациентов с обыкновенной пузырчаткой клинический переход от слизистого фенотипа к слизисто-кожному происходит из-за смены мишеней для аутореактивных антител. По данным Salato V. et al. (Salato V.K., Hacker-Foegen M.K., Zelmira Lazarova Z., Fairley J.A., Lin M-S. Role of intramolecular epitope spreading in pemphigus vulgaris. Clinical Immunology 2005; 116: 54-66), у большинства пациентов со слизистой формой пузырчатки аутоантитела направлены к проксимальной (С-концевой) части экстрацеллюлярного домена Dsg3, в то время как для развития повреждений кожи характерно появление антител к дистальным (N-концевым) эпитопам. В связи с этим возникает задача персонализированного наблюдения уровня аутоантител к различным фрагментам экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека у пациентов с различным клиническим фенотипом вульгарной пузырчатки (
Figure 00000003
R., Svoboda V., Wenzel E et al. IgG against extracellular subdomains of desmoglein 3 relates to clinical phenotype of pemphigus vulgaris Exp Dermatol 2008; 17: 35-43).
Доступные технические решения, обеспечивающие возможность определения антигенной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена Dsg3 у больных обыкновенной пузырчаткой, из уровня техники не известны.
Техническая проблема, на решение которой направлен заявляемый способ, заключается в определении антигенной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена Dsg3 у больных обыкновенной пузырчаткой.
Техническим результатом заявляемого изобретения является возможность полуколичественной оценки аутоантител к полному экстрацеллюлярному домену десмоглеина 3-го типа и его наиболее иммуногенным отдельным фрагментам ЕС1, ЕС2, ЕС3, ЕС4, а также ЕС2-ЕС5 в сыворотке крови пациентов с вульгарной пузырчаткой.
Для решения заявленной технической проблемы и достижения технического результата предлагается применение рекомбинатного белка-антигена, содержащего рекомбинантный полноразмерный экстрацеллюлярный домен Dsg3full-His с последовательностью SEQ ID NO: 1 и его отдельные рекомбинантные фрагменты ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His, имеющие последовательности SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 соответственно, для определения наличия аутореактивных антител к десмоглеину 3-го типа человека в крови больных обыкновенной пузырчаткой.
Предлагается способ определения антигенной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой, включающий исследование взаимодействия сыворотки крови с данным белком с использованием твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигенов для ИФА применяют белки-антигены, при этом исследование осуществляют в два этапа, на первом из которых осуществляют конкурентное истощение аутоантител к Dsg3full-His, ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His, имеющие последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 соответственно, и контрольному материалу - БСА, сорбированным на твердой фазе, а на втором осуществляют определение остаточных (непрореагировавших) аутоантител по отношению к Dsg3full-His с последовательностью SEQ ID NO: 1 с последующим расчетом коэффициента конкуренции по отношению к отдельным рекомбинантным белкам по формуле:
Figure 00000004
где AR - активность сыворотки после преинкубации в контакте с иммобилизованным рекомбинантным белком - ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His;
APos - активность сыворотки после преинкубации с полноразмерным Dsg3full-His;
ANeg - активность сыворотки после преинкубации в контрольной лунке с иммобилизированным БСА.
Предлагается тест-система для определения эпитопной специфичности аутореактивных антител к фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой способом по п. 5, содержащая сорбент, набор реагентов, концентрат конъюгата для определения содержания IgG-антител к Dsg3, отличающаяся тем, что в качестве сорбента выбран иммуносорбент.
Набор реагентов указанной тест-системы содержит положительную (+k) сыворотку, представляющую собой индивидуальную сыворотку от пациента с обыкновенной пузырчаткой с предварительно охарактеризованной активностью в отношении Dsg3 и профилем антигенной специфичности в отношении фрагментов экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека, и отрицательную (-k) сыворотку, сформированную из пула сывороток здоровых доноров.
Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее: двухэтапный иммуноферментный анализ, включающий конкурентное «истощение» аутоантител к рекомбинантным белкам ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His, сорбированным на твердой фазе, с последующим определением остаточных (непрореагировавших) аутоантител по отношению к полноразмерному экстрацеллюлярному домену десмоглеина 3-го типа человека, Dsg3full-His, позволяет охарактеризовать профиль антигенной специфичности аутореактивных антител с их выражением полуколичественной величиной (%) от общего значения аутореактивности.
Актуальность изобретения определяется ключевой патогенетической ролью в развитии обыкновенной пузырчатки, установленной для аутоантител класса IgG, направленных против основного структурного белка десмосом кожи человека - десмоглеина 3-го типа. Его экстрацеллюлярный домен, в котором выделяют 5 фрагментов (ЕС1, ЕС2, ЕС3, ЕС4, ЕС5) (англ. - extracellular domain; ЕС), вовлечен в формирование гомофильного контакта между соседствующими эпителиальными клетками. Результатом взаимодействия аутоантител с экстрацеллюлярным доменом Dsg3 является разрушение десмосом и развитие так называемого «акантолиза» - дегенеративного изменения шиповатого слоя эпидермиса, проявляющееся разрушением межклеточных мостиков и приводящего к образованию интраэпидермальных пузырей.
Изобретательский уровень заявляемого технического решения определяется применением двухэтапного иммуноферментного анализа на твердой фазе, позволяющим на первом этапе (за счет иммобилизованных в лунках полистироловых планшетов рекомбинантных белков - Dsg3full-His (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2), ЕС1-His (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4), EC2-His (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6), ЕС3-His (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8), EC4-His (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10), EC2-EC5-His (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12) осуществить специфическую сорбцию IgG, а на втором этапе определить количество остаточных (непрореагировавших) аутоантител к Dsg3-His с расчетом по оригинальной формуле полуколичественных показателей индивидуального профиля антигенной специфичности сыворотки крови больных вульгарной пузырчаткой.
Способ получения обозначенных выше рекомбинантных белков (ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His, Dsg3rull-His), не является предметом настоящего изобретения и является самостоятельным техническим решением.
Соответственно, при реализации заявляемого способа характеристика действий, порядок их выполнения и условия осуществления представляются следующим образом:
1) Исследуемая сыворотка крови разводится 1:100 в буфере (1% БСА в PBS), после чего аликвотами по 100 мкл вносится в лунки полистиролового планшета А, в одной из которых предварительно сорбирован рекомбинантный Dsg3full-His домен в количестве 1 мкг/лунку, в других - рекомбинантные EC1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His в количестве 1 мкг/лунку, а также БСА в той же концентрации для контроля неспецифической сорбции;
2) В аналогичные лунки планшета А вносятся положительная (+k) сыворотка, представляющая собой индивидуальную сыворотку от пациента с обыкновенной пузырчаткой с предварительно охарактеризованной активностью в отношении полноразмерного экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека и профилем антигенной специфичности в отношении отдельных фрагментов экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека, а также отрицательная (-k), сформированная из пула сывороток здоровых доноров;
3) Планшет А инкубируется в течение 18 часов при +24°С и встряхивании 200 rpm; сущностью этапа является конкурентное связывание (истощение) аутоантител определенной специфичности при взаимодействии с соответствующими рекомбинантными белками;
4) После завершения инкубации опытные и контрольные образцы исследуемых сывороток в полном объеме переносятся в лунки полистиролового планшета Б (табл. 1), сорбированного Dsg3full-His в количестве 1 мкг/лунку;
5) В дополнительные лунки планшета Б вносятся калибровочные образцы с активностями 20 и 200 RU/мл, сформированные на основе пула сывороток больных вульгарной пузырчаткой и предварительно количественно охарактеризованные по данной активности с использованием внешней (референсной) тест-системы;
6) Планшет Б заклеивается и инкубируется в том же режиме (18 час; +24°С; 200 rpm); сущностью этапа является связывание оставшихся после конкурентного «истощения» аутоантител с Dsg3full-His;
7) Планшет Б трехкратно промывается PBST;
8) В лунки планшета Б вносятся антитела к IgG человека, коньюгированные с пероксидазой хрена, после чего планшет инкубируется 60 мин при 22-24°С, затем 3-кратно промывается PBST;
9) В лунки планшета Б вносится субстратный раствор тетраметилбензидин (ТМБ) и инкубируется 30 мин;
10) Реакция останавливается внесением 4N раствора серной кислоты;
11) Оптическая плотность (ОП) результата ИФА регистрируется при 450 нм;
12) На основе ОП калибровочных образцов с активностями 20 и 200 RU/мл планшета Б строится калибровочная кривая, позволяющая определить активность каждой исследуемой сыворотки; активность выражается количественной величиной RU/мл;
13) На основе сравнения значений RU/мл каждой индивидуальной сыворотки, инкубированной в контрольной и опытных лунках планшета А и в дальнейшем анализируемой в планшете Б, рассчитывается степень ее специфического связывания (коэффициент конкуренции) по отношению к отдельным рекомбинантным белкам по формуле:
Figure 00000005
где AR - активность сыворотки после преинкубации в лунке планшета А, иммобилизованной рекомбинантным белком - ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His;
APos - активность сыворотки после преинкубации в лунке планшета А с Dsg3full-His;
ANeg - активность сыворотки после преинкубации в контрольной лунке планшета А с иммобилизированным БСА.
14) Качество проведенного исследования контролируется на основе значений ОП в лунках планшета Б, заполненных (-k) сывороткой (отсутствие детектируемых аутоантител) и (+k) сывороткой (наличие активности в отношении Dsg3full-His с отклонением ±10% от ранее охарактеризованного значения RU/мл; а также соответствие предварительно охарактеризованному профилю антигенной специфичности к ЕС1-His, ЕС2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His, %).
Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами и рисунками.
Фиг. 1 и Фиг. 2 Профиль антигенной специфичности образцов (коэффициенты конкуренции исследуемой сыворотки);
Фиг. 3. Схема экспрессионной кассеты;
Фиг. 4. Электрофореграмма (14% SDS-ПААГ для А, Б, Г, Д, Е и 10% SDS-ПААГ для В) элюированных фракций после металл-аффинной хроматографии на Ni2+-ИДА-сефарозе, нанесенных в присутствии β-меркаптоэтанола.
Пример 1.
Объектом исследования послужила сыворотка крови №0X11 из Коллекции сывороток крови от пациентов с клинически подтвержденным диагнозом «Пузырчатка обыкновенная» (L10.0 по МКБ-10), сформированной в ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России. Предварительно охарактеризованная (с использованием референсной тест-системы) суммарная активность данной сыворотки к полноразмерному внеклеточному домену Dsg3 человека характеризовалась величиной 200 RU/ml.
Конкурентное истощение аутоантител из данной сыворотки проводили на планшете А в отношении рекомбинантных белков Dsg3full-His, EC2-EC5-His, ЕС1-His, EC2-His, каждый из которых был сорбирован в дозе 1 мкг/лунку, а также БСА (контроль неспецифической сорбции) в такой же концентрации. Взаимодействие тестируемой сыворотки в объеме 100 мкл и рекомбинантных белков в планшете А проводилось при +24°С в течение 18 часов в условиях непрерывного перемешивания на шейкере при 200 rpm. После завершения инкубации образцы сыворотки в полном объеме были перенесены в лунки планшета Б, сорбированного белком Dsg3full-His в дозе 1 мкг/лунку. В дополнительные лунки планшета Б были внесены калибровочные образцы с активностями 20 и 200 RU/ml. Заполненный подобным образом планшет Б инкубировался при +24°С в течение 18 часов на шейкере при 200 rpm. Содержимое лунок было удалено и лунки трижды промыты PBS с 0,05% Tween 20 (PBST), после чего в лунки были внесены по 100 мкл антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена. После часовой инкубации при +24°С лунки были отмыты, как описано выше, после чего в них было внесено по 100 мкл раствора тетраметилбензидина (субстрата для пероксидазы хрена) и через 30 мин реакция была остановлена добавлением 100 мкл серной кислоты. Оптическую плотность результатов реакции регистрировали при 450 нм.
На основе ОП калибровочных образцов с активностями 20 и 200 RU/мл строили калибровочный график, по которому определяли остаточную (после преинкубации в планшете А) активность образцов исследуемой сыворотки в каждой лунке планшета Б; активность выражали количественной величиной RU/мл. На основании полученных значений активности, пользуясь формулой 1, рассчитывалась коэффициент конкуренции сыворотки с каждым представленным на планшете А рекомбинантным белком. Полученный профиль антигенной специфичности представлен на Фиг. 1.
Как следует из представленных данных, исследуемая сыворотка интенсивно взаимодействовала с Dsg3full-His (100%). При этом особенностью профиля ее антигенной специфичности являлось отсутствие детектируемого аутоиммунного ответа на наиболее «патогенный» дистальный N-концевой домен ЕС1, при выраженном реагировании с доменом ЕС2, а также проксимальными (С-концевыми) эпитопами, присутствующими в составе EC2-EC5-His конструкта.
Полученный результат позволяет оценить прогноз течения заболевания как достаточно благоприятный и ограничиться проведением традиционной консервативной терапии с использованием глюкокортикоидных гормонов.
Пример 2.
В качестве источника аутоантител к Dsg3 использована нативная сыворотка крови №0Z218, полученная от пациента с клинически подтвержденным диагнозом «Пузырчатка обыкновенная» (L10.0 по МКБ-10) в фазе обострения, находящегося на стационарном лечении в ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России. Предварительно охарактеризованная активность данной сыворотки в отношении полноразмерного внеклеточного домена Dsg3 человека характеризовалась величиной 150 RU/ml.
Конкурентное истощение аутоантител из данной сыворотки проводили на планшете А в отношении рекомбинантных белков Dsg3full-His, EC1-His, EC2-His, и EC4-His, использованных в дозе 1 мкг/лунку, а также БСА в такой же концентрации. Взаимодействие тестируемой сыворотки и рекомбинантных белков в планшете А проводилось в условиях, описанных в Примере 1. После завершения инкубации образцы сыворотки в полном объеме были перенесены в лунки планшета Б, сорбированного рекомбинантным белком Dsg3full-His. Последовательность внесения реагентов и условия проведения реакции на планшете Б соответствуют описанию в примере 1.
На основании полученных значений активности, пользуясь формулой 1, были рассчитаны коэффициенты конкуренции исследуемой сыворотки с каждым представленным на планшете А рекомбинантным белком. Полученные значения представлены на Фиг. 2.
Определенный подобным образом профиль антигенной специфичности характеризовался преимущественным аутоимунным ответом на дистальные экстрацеллюлярные фрагменты ЕС1 и ЕС2, что соответствует представлениям о них как о наиболее «патогенных» эпитопах, связанных с развитием тяжело протекающих случаев вульгарной пузырчатки.
Полученный результат свидетельствует о прогрессирующем течении заболевания, что определяет необходимость его терапии с использованием методов иммуносорбции, направленных на селективную элиминацию антител к ЕС1 и ЕС2 фрагментам.
Пример 3.
Нуклеотидные последовательности экстрацеллюлярного домена десмоглеина-3 человека (Dsg3full) и его фрагментов (ЕС1, ЕС2, ЕС3, ЕС4, ЕС2-ЕС5) были амплифицированы методом ПЦР с плазмиды pUC57, содержащей синтезированную нуклеотидную последовательность лидерного пептида (Р32926 из базы данных UniProt) - прелидерного пептида (Р32926 из базы данных UniProt) - полноразмерного экстрацеллюлярного домена (Р32926 из базы данных UniProt) - 6His с использованием специфических олигонуклеотидов (таблица 1). На первом этапе были наработаны нуклеотидные последовательности самих фрагментов экстрацеллюлярного домена Dsg3 (ЕС1, ЕС2, ЕС3, ЕС4, ЕС2-ЕС5), на втором - методом SOE-ПЦР они были объединены в одной рамке считывания с ДНК фрагментами лидерного и прелидерного пептидов на 5'-конце и 6His на 3'-конце. Нуклеотидная последовательность, кодирующая экспрессионную кассету Dsg3full-His, была наработана в один этап.
Figure 00000006
Figure 00000007
Экспрессионные кассеты были клонированы в вектор pcDNA3.4 (Invitrogen, США) по сайтам рестрикции NheI и XhoI (фиг. 3).
Правильность нуклеотидных последовательностей была подтверждена секвенированием по методу Сенгера. Полученые экспрессионные плазмиды (pcDNA 3.4_EC1-His, pcDNA 3.4_EC2-His, pcDNA 3.4_EC3-His, pcDNA 3.4_EC4-His, EC2-EC5-His и pcDNA 3.4_Dsg3 full-His) были использованы для наработки рекомбинантных белков в клетках СНО.
Трансфекцию проводили с использованием реагента Липофектамин (Invitrogen, США). Клетки СНО в количестве 4×106 клеток/мл были пересеяны в колбу Эрленмейера, содержащую 30 мл культуральной среды CD OptiCHO (Invitrogen, США). Через сутки к клеткам добавляли 18-20 мкг плазмидной ДНК, смешанной с трансфекционным агентом в пропорциях, указанных производителем. Культивирование продолжали до снижения количества живых клеток в культуре до уровня 0.3×106 клеток/мл, что составляло 10-14 суток при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 8% CO2, при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере со скоростью 130 об/мин.
После завершения культивирования Dsg3 full-His и отдельные его фрагменты ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His были выделены из культуральной жидкости с помощью металл-аффинной хроматографии на Ni2+-ИДА-сефарозе. Клетки осаждали центрифугированием при скорости вращения 1200 об/мин в течение 10 мин, затем супернатанты, содержащие целевые белки, центрифугировали в течение 15 мин при скорости вращения 4000 об/мин. До выделения супернатанты хранили при температуре 4°С.
Культуральную среду, полученную после удаления клеток, диализовали 0,02 М натрий-фосфатным буфером, рН 7.5, содержащем 0.25 М NaCl. Для подготовки носителя 1 мл ИДА-сефарозы помещали в колонку, промывали 12-15 мл mQ и наносили 200 мкл 0.2 M NiSO4. Далее промывали колонку от слабо связавшихся ионов раствором 0.02 М CH3COONa, содержащем 0.5 М NaCl, 10-12 мл mQ и уравновешивали буфером для нанесения (0.02 М натрий-фосфатным буфером, 0.25 M NaCl, рН 7.5). После чего смешивали с соответствующим диализованным супернатантом и инкубировали в течение 1 ч при 4°С и перемешивании. Полученную смесь пропускали через колонку, промывали 10 мл буфера для нанесения. Элюцию белка проводили 0.3 М имидазолом в натрий-фосфатном буфере (промывка осуществлялась последовательно 0.01 М имидазолом и 0.03 М имидазолом).
Молекулярную массу и чистоту выделенных целевых белков: EC-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His и Dsg3 full-His, проверяли методом электрофоретического анализа в 14% или 10% SDS-ПААГ по Лэммли (фиг. 4).
--->
Перечень последовательностей
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.2//EN"
"ST26SequenceListing_V1_2.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_2" fileName="Тест система Dsg3"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="1.0.0-beta1" productionDate="2021-
12-10">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2020144116/10(082584)</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2021-05-27</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН), RU</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Shemyakin-Ovchinnikov Institute of bioorganic
chemistry</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">РЕКОМБИНАТНЫЕ БЕЛКИ - АНТИГЕНЫ И СПОСОБ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭПИТОПНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ АУТОРЕАКТИВНЫХ АНТИТЕЛ К ОТДЕЛЬНЫМ ФРАГМЕНТАМ
ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНОГО ДОМЕНА ДЕСМОГЛЕИНА 3-ГО ТИПА ЧЕЛОВЕКА У БОЛЬНЫХ ОБЫКНОВЕННОЙ
ПУЗЫРЧАТКОЙ, ТЕСТ-СИСТЕМА НА ИХ ОСНОВЕ</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>572</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>SOURCE</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..572</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>MOL_TYPE</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>ORGANISM</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EWVKFAKPCREGEDNSKRNPIAKITSDYQATQKITYRISGVGIDQPPFGIFVVDKNTGDI
NITAIVDREETPSFLITCRALNAQGLDVEKPLILTVKILDINDNPPVFSQQIFMGEIEENSASNSLVMILNATDADEPNHL
NSKIAFKIVSQEPAGTPMFLLSRNTGEVRTLTNSLDREQASSYRLVVSGADKDGEGLSTQCECNIKVKDVNDNFPM
FRDSQYSARIEENILSSELLRFQVTDLDEEYTDNWLAVYFFTSGNEGNWFEIQTDPRTNEGILKVVKALDYEQLQS
VKLSIAVKNKAEFHQSVISRYRVQSTPVTIQVINVREGIAFRPASKTFTVQKGISSKKLVDYILGTYQAIDEDTNKA
ASNVKYVMGRNDGGYLMIDSKTAEIKFVKNMNRDSTFIVNKTITAEVLAIDEYTGKTSTGTVYVRVPDFNDNCPT
AVLEKDAVCSSSPSVVVSARTLNNRYTGPYTFALEDQPVKLPAVWSITTLNATSALLRAQEQIPPGVYHISLVLTD
SQNNRCEMPRSLTLEVCQCDNRGICGTSYPTTSPGTRYGRPHSGRHHHHHH</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1716</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1716</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gaatgggtgaaatttgccaaaccctgcagagaaggagaagataactcaaaaagaaacccaat
tgccaagattacttcagattaccaagcaacccagaaaatcacctaccgaatctctggagtgggaatcgatcagccgccttttg
gaatctttgttgttgacaaaaacactggagatattaacataacagctatagtcgaccgggaggaaactccaagcttcctgatc
acatgtcgggctctaaatgcccaaggactagatgtagagaaaccacttatactaacggttaaaattttggatattaatgata
atcctccagtattttcacaacaaattttcatgggtgaaattgaagaaaatagtgcctcaaactcactggtgatgatactaaa
tgccacagatgcagatgaaccaaaccacttgaattctaaaattgccttcaaaattgtctctcaggaaccagcaggcacaccc
atgttcctcctaagcagaaacactggggaagtccgtactttgaccaattctcttgaccgagagcaagccagcagctatcgtc
tggttgtgagtggtgcagacaaagatggagaaggactatcaactcaatgtgaatgtaatattaaagtgaaagatgtcaacga
taacttcccaatgtttagagactctcagtattcagcacgtattgaagaaaatattttaagttctgaattacttcgatttcaa
gtaacagatttggatgaagagtacaccgataattggcttgcagtatatttctttacctctgggaatgaaggaaattggtttg
aaatacaaactgatcctagaactaatgaaggcatcctgaaagtggtgaaggctctagattatgaacaactacaaagcgtgaa
acttagtattgctgtcaaaaacaaagctgaatttcaccaatcagttatctctcgataccgagttcagtcaaccccagtcacg
attcaggtaataaatgtaagagaaggaattgcattccgtcctgcttccaagacatttactgtgcaaaaaggcataagtagca
aaaaattggtggattatatcctgggaacatatcaagccatcgatgaggacactaacaaagctgcctcaaatgtcaaatatgt
catgggacgtaacgatggtggatacctaatgattgattcaaaaactgctgaaatcaaatttgtcaaaaatatgaaccgagat
tctactttcatagttaacaaaacaatcacagctgaggttctggccatagatgaatacacgggtaaaacttctacaggcacgg
tatatgttagagtacccgatttcaatgacaattgtccaacagctgtcctcgaaaaagatgcagtttgcagttcttcaccttc
cgtggttgtctccgctagaacactgaataatagatacactggcccctatacatttgcactggaagatcaacctgtaaagttg
cctgccgtatggagtatcacaaccctcaatgctacctcggccctcctcagagcccaggaacagatacctcctggagtatacc
acatctccctggtacttacagacagtcagaacaatcggtgtgagatgccacgcagcttgacactggaagtctgtcagtgtga
caacaggggcatctgtggaacttcttacccaaccacaagccctgggaccaggtatggcaggccgcactcagggaggcatcac
catcaccatcac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>115</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>SOURCE</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>MOL_TYPE</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>ORGANISM</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EWVKFAKPCREGEDNSKRNPIAKITSDYQATQKITYRISGVGIDQPPFGIFVVDKNTGDI
NITAIVDREETPSFLITCRALNAQGLDVEKPLILTVKILDINDNPPVFSHHHHHH</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>345</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..345</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gaatgggtgaaatttgccaaaccctgcagagaaggagaagataactcaaaaagaaacccaa
ttgccaagattacttcagattaccaagcaacccagaaaatcacctaccgaatctctggagtgggaatcgatcagccgccttttg
gaatctttgttgttgacaaaaacactggagatattaacataacagctatagtcgaccgggaggaaactccaagcttcctgatc
acatgtcgggctctaaatgcccaaggactagatgtagagaaaccacttatactaacggttaaaattttggatattaatgata
atcctccagtattttcacatcaccatcaccatcac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>116</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>SOURCE</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..116</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>MOL_TYPE</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>ORGANISM</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QQIFMGEIEENSASNSLVMILNATDADEPNHLNSKIAFKIVSQEPAGTPMFLLSRNTGEV
RTLTNSLDREQASSYRLVVSGADKDGEGLSTQCECNIKVKDVNDNFPMFRHHHHHH</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>348</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..348</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caacaaattttcatgggtgaaattgaagaaaatagtgcctcaaactcactggtgatgatac
taaatgccacagatgcagatgaaccaaaccacttgaattctaaaattgccttcaaaattgtctctcaggaaccagcaggcaca
cccatgttcctcctaagcagaaacactggggaagtccgtactttgaccaattctcttgaccgagagcaagccagcagctatcg
tctggttgtgagtggtgcagacaaagatggagaaggactatcaactcaatgtgaatgtaatattaaagtgaaagatgtcaacg
ataacttcccaatgtttagacatcaccatcaccatcac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>121</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>SOURCE</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>MOL_TYPE</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>ORGANISM</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>DSQYSARIEENILSSELLRFQVTDLDEEYTDNWLAVYFFTSGNEGNWFEIQTDPRTNEGI
LKVVKALDYEQLQSVKLSIAVKNKAEFHQSVISRYRVQSTPVTIQVINVREGIAFHHHHHH</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>363</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..363</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gactctcagtattcagcacgtattgaagaaaatattttaagttctgaattacttcgattt
caagtaacagatttggatgaagagtacaccgataattggcttgcagtatatttctttacctctgggaatgaaggaaattgg
tttgaaatacaaactgatcctagaactaatgaaggcatcctgaaagtggtgaaggctctagattatgaacaactacaaagc
gtgaaacttagtattgctgtcaaaaacaaagctgaatttcaccaatcagttatctctcgataccgagttcagtcaacccca
gtcacgattcaggtaataaatgtaagagaaggaattgcattccatcaccatcaccatcac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>122</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>SOURCE</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..122</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>MOL_TYPE</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>ORGANISM</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>RPASKTFTVQKGISSKKLVDYILGTYQAIDEDTNKAASNVKYVMGRNDGGYLMIDSKTAE
IKFVKNMNRDSTFIVNKTITAEVLAIDEYTGKTSTGTVYVRVPDFNDNCPTAVLEKHHHHHH</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>366</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..366</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgtcctgcttccaagacatttactgtgcaaaaaggcataagtagcaaaaaattggtggatt
atatcctgggaacatatcaagccatcgatgaggacactaacaaagctgcctcaaatgtcaaatatgtcatgggacgtaacgat
ggtggatacctaatgattgattcaaaaactgctgaaatcaaatttgtcaaaaatatgaaccgagattctactttcatagttaa
caaaacaatcacagctgaggttctggccatagatgaatacacgggtaaaacttctacaggcacggtatatgttagagtacccg
atttcaatgacaattgtccaacagctgtcctcgaaaaacatcaccatcaccatcac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>463</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>SOURCE</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..463</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>MOL_TYPE</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>ORGANISM</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QQIFMGEIEENSASNSLVMILNATDADEPNHLNSKIAFKIVSQEPAGTPMFLLSRNTGEVRT
LTNSLDREQASSYRLVVSGADKDGEGLSTQCECNIKVKDVNDNFPMFRDSQYSARIEENILSSELLRFQVTDLDEEYTDNWLA
VYFFTSGNEGNWFEIQTDPRTNEGILKVVKALDYEQLQSVKLSIAVKNKAEFHQSVISRYRVQSTPVTIQVINVREGIAFRPA
SKTFTVQKGISSKKLVDYILGTYQAIDEDTNKAASNVKYVMGRNDGGYLMIDSKTAEIKFVKNMNRDSTFIVNKTITAEVLA
IDEYTGKTSTGTVYVRVPDFNDNCPTAVLEKDAVCSSSPSVVVSARTLNNRYTGPYTFALEDQPVKLPAVWSITTLNATSAL
LRAQEQIPPGVYHISLVLTDSQNNRCEMPRSLTLEVCQCDNRGICGTSYPTTSPGTRYGRPHSGRHHHHHH</INSDSeq_
sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1389</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1389</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caacaaattttcatgggtgaaattgaagaaaatagtgcctcaaactcactggtgatgatac
taaatgccacagatgcagatgaaccaaaccacttgaattctaaaattgccttcaaaattgtctctcaggaaccagcaggcaca
cccatgttcctcctaagcagaaacactggggaagtccgtactttgaccaattctcttgaccgagagcaagccagcagctatcg
tctggttgtgagtggtgcagacaaagatggagaaggactatcaactcaatgtgaatgtaatattaaagtgaaagatgtcaacg
ataacttcccaatgtttagagactctcagtattcagcacgtattgaagaaaatattttaagttctgaattacttcgatttca
agtaacagatttggatgaagagtacaccgataattggcttgcagtatatttctttacctctgggaatgaaggaaattggttt
gaaatacaaactgatcctagaactaatgaaggcatcctgaaagtggtgaaggctctagattatgaacaactacaaagcgtga
aacttagtattgctgtcaaaaacaaagctgaatttcaccaatcagttatctctcgataccgagttcagtcaaccccagtcac
gattcaggtaataaatgtaagagaaggaattgcattccgtcctgcttccaagacatttactgtgcaaaaaggcataagtagc
aaaaaattggtggattatatcctgggaacatatcaagccatcgatgaggacactaacaaagctgcctcaaatgtcaaatatg
tcatgggacgtaacgatggtggatacctaatgattgattcaaaaactgctgaaatcaaatttgtcaaaaatatgaaccgaga
ttctactttcatagttaacaaaacaatcacagctgaggttctggccatagatgaatacacgggtaaaacttctacaggcacg
gtatatgttagagtacccgatttcaatgacaattgtccaacagctgtcctcgaaaaagatgcagtttgcagttcttcacctt
ccgtggttgtctccgctagaacactgaataatagatacactggcccctatacatttgcactggaagatcaacctgtaaagtt
gcctgccgtatggagtatcacaaccctcaatgctacctcggccctcctcagagcccaggaacagatacctcctggagtatac
cacatctccctggtacttacagacagtcagaacaatcggtgtgagatgccacgcagcttgacactggaagtctgtcagtgtg
acaacaggggcatctgtggaacttcttacccaaccacaagccctgggaccaggtatggcaggccgcactcagggaggcatca
ccatcaccatcac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---

Claims (7)

1. Применение рекомбинатного белка-антигена, содержащего белки-антигены экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека и его фрагментов, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 соответственно, для определения антигенной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой.
2. Способ определения антигенной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой, включающий исследование взаимодействия сыворотки крови с данным белком с использованием твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигенов для ИФА применяют белки-антигены экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека и его фрагменты, при этом исследование осуществляют в два этапа, на первом из которых осуществляют конкурентное истощение аутоантител к белкам-антигенам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека и его фрагментам, имеющим последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 соответственно, и контрольному материалу - БСА, сорбированным на твердой фазе, а на втором осуществляют определение непрореагировавших аутоантител по отношению к Dsg3full-His с последовательностью SEQ ID NO 1 с последующим расчетом коэффициента конкуренции по отношению к отдельным рекомбинантным белкам по формуле:
Figure 00000008
где AR - активность сыворотки после преинкубации в контакте с иммобилизованными рекомбинантными белками - ЕС1-His, EC2-His, ЕС3-His, EC4-His, EC2-EC5-His, имеющими последовательности SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11;
APos - активность сыворотки после преинкубации с полноразмерным Dsg3full-His, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1;
ANeg - активность сыворотки после преинкубации в контрольной лунке с иммобилизированным БСА.
3. Тест-система для определения эпитопной специфичности аутореактивных антител к фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой способом по п. 2, содержащая иммуносорбент, включающий белки-антигены экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека и его фрагменты, имеющие последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 соответственно; набор реагентов, содержащий положительную (+k) сыворотку, представляющую собой индивидуальную сыворотку от пациента с обыкновенной пузырчаткой с предварительно охарактеризованной активностью в отношении Dsg3 и профилем антигенной специфичности в отношении фрагментов экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека, и отрицательную (-k) сыворотку, сформированную из пула сывороток здоровых доноров; и концентрат конъюгата антител к IgG человека с пероксидазой хрена для определения содержания IgG-антител к Dsg3.
RU2020144116A 2021-05-27 2021-05-27 Рекомбинантные белки-антигены и способ определения эпитопной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой, тест-система на их основе RU2770444C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020144116A RU2770444C1 (ru) 2021-05-27 2021-05-27 Рекомбинантные белки-антигены и способ определения эпитопной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой, тест-система на их основе

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020144116A RU2770444C1 (ru) 2021-05-27 2021-05-27 Рекомбинантные белки-антигены и способ определения эпитопной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой, тест-система на их основе

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2770444C1 true RU2770444C1 (ru) 2022-04-18

Family

ID=81255612

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020144116A RU2770444C1 (ru) 2021-05-27 2021-05-27 Рекомбинантные белки-антигены и способ определения эпитопной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой, тест-система на их основе

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2770444C1 (ru)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7550562B2 (en) * 2001-09-04 2009-06-23 Keio University Pemphigus monoclonal antibody
WO2016016654A1 (en) * 2014-07-31 2016-02-04 Pemphimmune Solutions Limited Matrix for immunoadsorption of anti-pepmhigus antigen antibodies
RU2622005C2 (ru) * 2015-11-24 2017-06-08 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Минздрава России (ФГБУ ГНЦДК Минздрава России) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕЛЕКТИВНОГО ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ УДАЛЕНИЯ АНТИТЕЛ-IgG К ДЕСМОГЛЕИНУ 3 ТИПА ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ПУЗЫРЧАТКОЙ
RU2627652C1 (ru) * 2016-07-18 2017-08-09 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Минздрава России (ФГБУ ГНЦДК Минздрава России) Применение селективного иммуносорбента для удаления антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови у больных пузырчаткой
US10301370B2 (en) * 2014-05-02 2019-05-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of chimeric autoantibody receptor T cells
RU2730897C1 (ru) * 2020-07-01 2020-08-26 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7550562B2 (en) * 2001-09-04 2009-06-23 Keio University Pemphigus monoclonal antibody
US10301370B2 (en) * 2014-05-02 2019-05-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of chimeric autoantibody receptor T cells
WO2016016654A1 (en) * 2014-07-31 2016-02-04 Pemphimmune Solutions Limited Matrix for immunoadsorption of anti-pepmhigus antigen antibodies
RU2622005C2 (ru) * 2015-11-24 2017-06-08 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Минздрава России (ФГБУ ГНЦДК Минздрава России) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕЛЕКТИВНОГО ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ УДАЛЕНИЯ АНТИТЕЛ-IgG К ДЕСМОГЛЕИНУ 3 ТИПА ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ПУЗЫРЧАТКОЙ
RU2627652C1 (ru) * 2016-07-18 2017-08-09 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Минздрава России (ФГБУ ГНЦДК Минздрава России) Применение селективного иммуносорбента для удаления антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови у больных пузырчаткой
RU2730897C1 (ru) * 2020-07-01 2020-08-26 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARNAU J. et al. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins, Protein expression and purification, 2006, V. 48, N. 1, p.1-13. *
FRANKEL A.E. et al. Characterization of diphtheria fusion proteins targeted to the human interleukin-3 receptor, Protein Eng., 2000, v.13, n.8, p.575-581. *
FRANKEL A.E. et al. Characterization of diphtheria fusion proteins targeted to the human interleukin-3 receptor, Protein Eng., 2000, v.13, n.8, p.575-581. ARNAU J. et al. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins, Protein expression and purification, 2006, V. 48, N. 1, p.1-13. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sabroe et al. Classification of anti-FcϵRI and anti-IgE autoantibodies in chronic idiopathic urticaria and correlation with disease severity
Nijenhuis et al. Autoantibodies to citrullinated proteins in rheumatoid arthritis: clinical performance and biochemical aspects of an RA-specific marker
JP3026818B2 (ja) 抗グリコシルアルブミンモノクロナル抗体とそれらの抗体を産生するハイブリッド細胞株、およびその使用
JP5415946B2 (ja) 新規な動脈硬化性疾患マーカー
DK2383296T3 (en) Antibody of the thyrotropin receptor and its applications
US9261443B2 (en) Method for quantification of soluble LR 11
JP2022122924A (ja) 急性心不全に罹患している対象におけるうっ血を評価するためのアドレノメデュリン
CN107850589A (zh) 13+/17+bin1表达作为心脏病症的标记
JP7317379B2 (ja) 潰瘍性大腸炎及び原発性硬化性胆管炎の検査方法
Izaki et al. Differentiation between control subjects and patients with chronic spontaneous urticaria based on the ability of anti-IgE autoantibodies (AAbs) to induce FcεRI crosslinking, as compared to anti-FcεRIα AAbs
DK2446038T3 (en) SEQUENCES, ANTIBODIES, METHODS OF DETECTION AND IN VITRO DOSE OF periostin In DIAGNOSTIC OR IN THE FORECAST OF periostin-RELATED DISEASES OR BIOLOGICAL PHENOMENA
JPH04503006A (ja) 血液凝固XIIa因子βモノクローナル抗体およびイムノアッセイ
RU2770444C1 (ru) Рекомбинантные белки-антигены и способ определения эпитопной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой, тест-система на их основе
de Santana et al. Engineered biomarkers for leprosy diagnosis using labeled and label-free analysis
Rader et al. Differences in the fine specificity of anti–Ro (SS‐A) in relation to the presence of other precipitating autoantibodies
CN110672838B (zh) 检测阿司匹林代谢及血小板高反应性的试剂盒及检测方法
US20140186861A1 (en) Soluble treponema pallidum protein tp0453, tp0453-tp0326 fusion protein, and use in syphilis diagnosis
Johansson et al. Development of monoclonal antibodies for detection of antisecretory factor activity in human plasma
WO2007055340A1 (ja) Ptx3高感度測定法
Ramcke et al. Bullous pemphigoid (BP) patients with selective IgG autoreactivity against BP230: Review of a rare but valuable cohort with impact on the comprehension of the pathogenesis of BP
CN112194719A (zh) Crt抗原和mage-a1抗原的制备及其应用
Sasai et al. Characterization of two cases of bullous pemphigoid reactive only with BP230 on Japanese enzyme-linked immunosorbent assays
Batsalova et al. Comparative analysis of collagen type II-specific immune responses during development of collagen-induced arthritis in two B10 mouse strains
Kubanov et al. Analysis of the Specificity of Auto-Reactive Antibodies to Individual Fragments of the Extracellular Domain of Desmoglein 3 in Patients with Pemphigus Vulgaris
CN111735809B (zh) 阿司匹林代谢及血小板高反应性的化学发光检测方法及检测试剂盒