RU2730897C1 - СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19 - Google Patents
СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2730897C1 RU2730897C1 RU2020121770A RU2020121770A RU2730897C1 RU 2730897 C1 RU2730897 C1 RU 2730897C1 RU 2020121770 A RU2020121770 A RU 2020121770A RU 2020121770 A RU2020121770 A RU 2020121770A RU 2730897 C1 RU2730897 C1 RU 2730897C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cov
- sars
- virus
- covid
- igg
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 111
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 title claims abstract description 57
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 35
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 26
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 title abstract description 18
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 73
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 16
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims abstract description 6
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 14
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 claims description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 13
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 5
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 4
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- -1 TMB-chromogen Substances 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 239000013579 wash concentrate Substances 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 abstract description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract description 7
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 19
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 17
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 description 2
- 102000016622 Dipeptidyl Peptidase 4 Human genes 0.000 description 2
- 108010067722 Dipeptidyl Peptidase 4 Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 108700010904 coronavirus proteins Proteins 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 1
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003757 Atypical pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101710114810 Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000282375 Herpestidae Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 101001024637 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 101710167605 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 1
- 229940127002 anti-2019-nCov Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002134 immunopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000004043 pneumocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940080237 sodium caseinate Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 244000059546 zoonotic virus Species 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии. Сущность изобретения заключается в том, что для определения антител, принадлежащих к разным классам иммуноглобулинов, в сыворотке или плазме крови больных COVID-19 или инфицированных этим вирусом используется комплекс антигенных рекомбинантных белков (RBD-SD1 и NTD фрагментов спайк-белка вируса SARS-CoV-2, а также нуклеопротеина вируса SARS-CoV-2, полученных на основе искусственно синтезированных генетических конструкций в составе плазмиды DHFRControlTemplate, инкорпорированной в штамм BL21(DE3) E.coli. Целевые рекомбинантные белки сорбированы в лунках разборного полистиролового планшета, на основе которого сформирована тест-система, включающая четыре набора реагентов как для суммарного, так и раздельного определения IgM-, IgG-, IgA-антител к SARS-CoV-2 в процессе лабораторной диагностики и клинико-эпидемиологического мониторинга COVID-19. Изобретение может быть использовано для получения тест-систем для серологической диагностики COVID-19 c целью оценки гуморального иммунного ответа у инфицированных лиц и эпидемиологической характеристики инфекционного процесса у населения, а в перспективе – для определения эффективности вакцинации и иммунотерапии при получении и внедрении соответствующих лечебно-профилактических препаратов против SARS-CoV-2. Изобретение позволяет полно и всесторонне оценить иммунный ответ на SARS-CoV-2. 5 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 3 прил.
Description
Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии, в частности, к использованию генноинженерных биотехнологий в совершенствовании тест-систем для серологической диагностики COVID-19 c целью оценки гуморального иммунного ответа у инфицированных лиц и эпидемиологической характеристики инфекционного процесса у населения, а в перспективе - для определения эффективности вакцинации и иммунотерапии при получении и внедрении соответствующих лечебно-профилактических препаратов против SARS-CoV-2.
Распространение среди людей вируса SARS-CoV-2 (тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2), послужившего причиной инфекционного заболевания под названием СOVID-19, началось в Китае в конце 2019 года, привело к крупной глобальной вспышке, носящей характер пандемии, и в настоящее время является серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире.
Человечество сталкивается с коронавирусами зоонозной природы уже в третий раз. В 2002 году в китайской провинции Гуандун впервые была зарегистрирована атипичная пневмония, вызванная вирусом SARS-CoV, что привело в 2003 году к глобальной пандемии с 10%-ной летальностью [1]. Это заболевание с 2004 года у людей не регистрируется. В 2012 году в Саудовской Аравии был зарегистрирован другой короновирус MERS-CoV, он продолжает заражать людей с ограниченной передачей инфекции от человека к человеку и встречается примерно в 27 странах. Природным резервуаром обоих короновирусов являются летучие мыши, которые передают возбудителя промежуточным хозяевам (пальмовым циветтам для SARS-CoV и верблюдам-дромадерам для MERS-CoV), что, в свою очередь, приводит к заражению людей [1, 2].
В отличие от SARS-CoV и MERS-CoV, SARS-CoV-2, зарегистрированный в Ухане (Китай) в декабре 2019 года, характеризуется быстрым распространением и вирулентной передачей от человека к человеку [3], что привело к глобальной пандемии при летальности в среднем около 4% [4], не завершившейся до настоящего времени. SARS-CoV-2 также является зоонозным вирусом с летучими мышами в качестве его естественного резервуара [3], но промежуточные хозяева не идентифицированы [5].
Подобно SARS-CoV и MERS-CoV, SARS-CoV-2 представляет собой вирус, содержащий одноцепочечную +-цепь РНК и относящийся к семейству Coronaviridae и роду бетакороновирусов [3]. Геном этих патогенов кодирует четыре основных структурных белка: спайк-белок (S-белок), оболочечный белок (E), мембранный белок (M) и нуклеокапсид (N), а также приблизительно 16 неструктурных белков (nsp1-16) и от пяти до восьми вспомогательных белков. Среди них белок S играет важную роль в прикреплении вируса к клетке хозяина, слиянии с клеточной мембраной, проникновении в клетку. S-белок имеет тримерную структуру, он содержит субъединицу S1, ответственную за связывание вируса с рецептором, и субъединицу S2, ответственную за слияние вируса с клеточной мембраной [1, 2]. Субъединица S1 имеет V-образную структуру, в ее составе выделяют N-концевой домен (NTD) и C-концевой домен, каждый из которых может быть рецептор-связывающим доменом (RBD) в зависимости от разновидности короновируса и поражаемых им клеток того или иного хозяина [5]. Во время инфекционного процесса короновирус сначала взаимодействует через S1-RBD с рецептором клетки хозяина, вызывая конформационные изменения в субъединице S2, которые приводят к слиянию вируса и проникновению в клетку-мишень [1, 2].
Различные коронавирусы используют различные домены внутри субъединицы S1 для распознавания рецепторов клетки-мишени. SARS-CoV-2 и SARS-CoV связывают ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2), экспрессируемый пневмоцитами и энтероцитами, в то время как MERS-CoV связывает дипептидилпептидазу 4 (DPP4) клеток печени или легких [1, 2, 6].
В статье S.F.Ahmed et al. [7], датируемой мартом этого года, подчеркивается, что в настоящее время отсутствует информация об иммуногенных эпитопах, определяющих специфичность антител или реакции Т-клеток, у вируса SARS-CoV-2. Однако, предварительные исследования на основе полногеномного филогенетического анализа показывают, что SARS-CoV-2 очень похож на SARS-CoV - 79,6% идентичности геномных последовательностей [3, 8,9], имеет аналогичный механизм проникновения в клетки и те же чувствительные рецепторы на клетках человека [8, 10]. Из-за этого очевидного сходства между двумя вирусами, предыдущие исследования, которые обеспечили понимание защитных иммунных реакций против SARS-CoV, потенциально могут быть использованы для интепретации данных по SARS-CoV-2.
В то же время существуют и определенные отличительные особенности в молекулярной структуре SARS-CoV-2. A.C.Walls et al. [11] определили наличие участка расщепления фурином на границе S1/S2 SARS-CoV-2 S-белка как новую особенность, отличающую этот вирус от SARS-CoV. Элиминация этого участка умеренно влияет на S-опосредованное проникновение SARS-CoV-2 в клетки in vitro и может способствовать расширению тропизма этого вируса, как это происходило с другими высокопатогенными вирусами (возбудителями птичьего гриппа и болезни Ньюкасла) [12, 13].
Золотым стандартом лабораторной диагностики COVID-19 в настоящее время является полимеразная цепная реакция обратной транскрипции (ОT-ПЦР)[14]. Несмотря на доступность методов молекулярно-биологического анализа в клинической практике, в целом ряде случаев отмечаются как ложно-положительные, так и ложно-отрицательные результаты [15, 16]. Для верификации диагноза в ходе обследования пациентов широко использовался метод рентгендиагностики - компьютерная томография [14, 16]. Вместе с тем даже на ранних этапах наблюдения пациентов с COVID-19 как в стационаре, так и при амбулаторном обследовании крайне желательно было исследовать серологический статус пациента, а именно: наличие иммунного ответа на белки вируса. Было отмечено, что даже на относительно ранних этапах развития инфекции IgM-опосредованный ответ на белковые компоненты CОVID-19 может быть использован в качестве диагностического маркера для принятия положительного решения о наличии у пациента вируса [17].
Серологические исследования имеют решающее значение для определения уровня протективного иммунитета среди населения, подтверждения контакта с вирусом в анамнезе и выявления высокореактивных доноров человека для получения реконвалесцентной сыворотки в качестве терапевтического средства. Чувствительная и специфичная идентификация титров антител к коронавирусу SARS-Cov-2 может способствовать скринингу широких групп населения для решения вопроса об о возможности их привлечения к работе в сложной эпидемиологической обстановке. В первую очередь это касается медицинских работников для выявления тех, кто уже обладает иммунитетом, и может быть задействован для работы с инфицированными больными, минимизируя риск распространения вируса среди коллег и других пациентов. К указанной группе населения относятся также работники социальной сферы, госсслужащие, работники торговли. Общее число гражданского населения, для которого потребуются серологические исследования в России может исчисляться десятками миллионов. Необходимость проведения широкомасштабного тестирования среди военных и работников правоохранительных органов также не вызывает сомнений и является серьезным вызовом. Помимо актуальности использования в социально-эпидемиологическом плане, серологические методы имеют и клиническое значение. Они позволяют детально характеризовать иммунный ответ на SARS-CoV-2 как качественным, так и количественным образом, прогнозировать тяжесть течения COVID-19, быть одним из критериев выздоровления [18].
В связи с этим одной из актуальных проблем, связанных с диагностикой COVID-19, остается разработка основных принципов и подходов, как и собственно создание тест-систем для обнаружения антител к SARS-CoV-2, c учетом особенностей молекулярной структуры вирусного возбудителя, определяющих его антигенные и иммуногенные свойства.
Показано, что спайк-белок (S) к SARS-CoV-2 обладает высокой иммуногенностью и является основной мишенью для нейтрализующих антител [5]. Современные тест-системы с использованием S-антигенов для серологического обнаружения антител к SARS-CoV-2 характеризуются, как правило, довольно высокой специфичностью. В то же время установлено, что большинство антител вырабатывается против N-белка нуклеокапсида SARS-CoV-2, а методы серодиагностики с использованием в качестве антигена N-белка обладают наиболее высоким уровнем чувствительности. В связи с этим в настоящее время созданы различные спайк(S)-содержащие или нуклеопротеин(N)-содержащие основанные на коммерческих или собственных разработках тест-системы для серодиагностики COVID-19 [19].
Выработка антител к указанным белкам или их фрагментам происходит с различной динамикой и характеризует различные стороны иммунного процесса в ответ на короновирус.
Профиль антител имеет жизненно важное значение для современных запросов на серологические анализы и интерпретации результатов теста на антитела, при этом серологическая диагностика приобретает особо важное значение в более поздние периоды COVID-19, когда вирусная нагрузка SARS-CoV-2 значительно падает и утрачивает клинико-диагностическую значимость. Поскольку большинство пациентов имеют повышенные титры антител примерно через 10 дней после появления симптомов, исследование образцов сыворотки на наличие антител разных классов позволяет не только контролировать период выхода больного из инфекционного процесса, но и (в случае серийных исследований) весьма полезно с эпидемиологической точки зрения [20].
Методом иммуноферментного анализа установлено, что количество IgG в сыворотке крови может повышаться одновременно или раньше, чем количество IgM против SARS-CoV-2, при этом большинство пациентов имеют также более раннюю сероконверсию IgG, чем IgM [21]. Впрочем, этот вывод может быть объяснен в том числе и низкой чувствительностью используемых тестов. Уровень IgG- и, особенно, IgM-антител в сыворотке крови не коррелировал с клинической тяжестью заболевания, тогда как повышение уровня IgA-антител четко соответствовало тяжелому течению COVID-19 [22]. У погибших пациентов развивался более быстрый рост анти-S антител по сравнению с пациентами, которые выздоравливали, с последующим ранним снижением В-клеточного иммунитета и нарушением нейтрализующей способности антител [23]. На экспериментальной модели острой респираторной короновирусной инфекции с использованием макак показано, что анти-S IgG стимулировали легочные провоспалительные реакции и вызывали острое повреждение легких вследствие, по мнению авторов публикации, стимулирующего воздействия этих антител через Fcγ-рецептор на макрофаги [24].
Более того, результаты, свидетельствующие о корреляции между уровнем антител, обнаруженных при иммуноферментном анализе, и титром нейтрализации вируса, были бы особенно важны для разработки вакцинных препаратов, а также для использования реконвалесцентной плазмы или терапевтических моноклональных антител, которые могут улучшить клинический исход или парадоксальным образом вызвать иммунопатологическое повреждение у реципиента [20].
Иными словами, показатели содержания антител разных классов в сыворотке крови несут достаточно много полезной информации о патогенезе и течении COVID-19, будут чрезвычайно полезны в будущем при оценке эффективности создаваемых вакцинных препаратов и средств иммунотерапии, что требует дальнейшего совершенствования подходов к способам осуществления иммунологического анализа этих показателей.
Учитывая сравнительно небольшой период времени, прошедший от начала пандемии COVID-19, патентная база, посвященная серодиагностике этого заболевания, пока невелика.
Для одновременного обнаружения N-белка SARS-CoV-2, а также IgM- и IgG-антител к этому короновирусу китайскими исследователями предложено иммунохроматографическое устройство с коллоидным золотом [25]. Предложен также набор коллоидного золота и способ его получения для совместного обнаружения антител IgM / IgG к коронавирусу [26].
Несмотря на оригинальность предложенного метода, большинство зарегистрированных полезных продуктов, связанных с проблемой серодиагностики короновирувирусной инфекции, касаются иммуноферментного анализа. Так, имеются наборы реагентов для иммуноферментного анализа, позволяющие количественно определять уровни IgG к нуклепротеину (N) или спайк-белку (S) вируса SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови, слюне, носовой жидкости человека [27, 28, 29], а также уровня IgM-антител к SARS-CoV-2[30], в том числе к S-белку [31].
Определенного внимания заслуживает способ диагностики атипичных пневмоний с использованием рекомбинантных белков, содержащих диагностически значимые антигенные детерминанты белков коронавируса, связанного с тяжелым острым респираторным синдромом (SARS-CoV) - патент Российской Федерации на изобретение 2253870 от 10.06.2005 г. «Рекомбинантные белки, содержащие диагностически значимые антигенные эпитопы белков короновируса (SARS-CoV), cвязанного с тяжелым острым респираторным синдромом, и последовательности синтетических генов, кодирующие диагностически значимые антигенные детерминанты белков короновируса (SARS-CoV), cвязанного с тяжелым острым респираторным синдромом» [32]. Способ предусматривает получение генетических конструкций и синтез на их основе рекомбинантных белков короновируса (SARS-CoV), близкого (но неравнозначного) по геному к SARS-CoV-2. В то же время данный способ диагностики не может быть аналогом настоящего изобретения, поскольку сориентирован, в основном, на полимеразно-цепную реакцию (ПЦР), но не на серодиагностику короновирусной инфекции, возможность реализации которой с использованием характеризуемых рекомбинантных вирусных белков указывается только в принципе.
Что касается тест систем для серодиагностики COVID-19 с использованием иммуноферментного анализа на основе антигенов SARS-CoV-2, то первым этапом их разработки является получение и использование таких иммуногенно значимых белков, которые позволяли бы с наибольшей эффективностью и на наиболее ранних этапах заболевания выявлять антитела разных классов к данному вирусному возбудителю.
Чувствительность и специфичность различных коммерческих тест-систем, используемых в настоящее время, отличаются друг от друга и зависят от сроков тестирования.
Так, сравнительное испытание двух сертифицированных версий Euroimmun SARS-CoV-2 IgG ELISA (Любек, Германия) и Vircell COVID-19 ELISA IgG (Гранада, Испания), а также версии Assure Tech Rapid Test (Франкфурт, Германия) при определении IgG-антител с S-белку, а в случае Vircell COVID-19 ELISA еще и к N-белку, в одноволновом варианте (450 нм) показали следующее. На ранней стадии инфекции (с 5-ого по 9-й день после появления положительного результата ПЦР) Vircell ELISA тест-система показала чувствительность 70,6%, Assure Tech Rapid Test - чувствительность 62,5% и Euroimmun ELISA - чувствительность 58,8%. За более поздний период (10-18 дней) Euroimmun ELISA и Assure Tech Rapid Test показали чувствительность 93,8%, Vircell ELISA - 100% [33]. Чувствительность тест-системы Euroimmun SARS-CoV-2 ELISA для обнаружения IgA-антител была значительно ниже [34].
Cравнение специфичности 4-х коммерческих тест-систем для обнаружения IgG на поздних сроках заболевания показало следующие величины: анти SARS-CoV-2 ELISA IgG (Euroimmun, Германия) - 96,2%, New Coronavirus COVID-19 IgG ELISA (Epitopediagnostics, США) - 88,7%, recomWell SARS-CoV-2 IgG ELISA (Microgen, Германия) - 100%, и SARS-CoV-2 Virachip IgG (Viramed, Германия) - 100% [35].
В препринте статьи F.Amanat et al. [18], которая может рассматриваться как прототип данного изобретения, описаны результаты сравнительных исследований по созданию двух различных версий рекомбинантного спайк-белка SARS-CoV-2. Первая конструкция позволяла получить полноразмерную тримерную и стабилизированную версию S-белка, а вторая - только рецептор-связывающий домен (RBD). Полноразмерная нуклеотидная последовательность, синтезированная промышленным путем, была модифицирована путем удаления участка расщепления, распознаваемого фурином, и введения двух стабилизирующих мутаций, далее была клонирована в вектор pCAGGS для экспрессии в клетках млекопитающих и в модифицированный двойной вектор pFastBac для экспрессии в клетках насекомых. Рецептор-связывающий домен (RBD, аминокислоты от 319 до 541, RVQP....CVNF) вместе с сигнальным пептидом (аминокислоты 1-14, MFVF…TSGS) плюс гексагистидиновая метка был клонирован в аналогичные векторы, но его экспрессия в клетках млекопитающих оказалась гораздо более эффективной, чем в клетках насекомых. Полученные рекомбинантные белки были использованы в составе тест-систем для иммуноферментного анализа и испытаны в реакциях с сыворотками людей, больных COVID-19 и другими вирусными инфекциями с измерением оптической плотности в лунках при длине волны 490 нм. Все образцы плазмы/сыворотки больных COVID-19 показывали одинаково высокий положительный результат в отношении как RBD-домена, так и полноразмерного S-белка, в то время как с другими образцами сыворотки в обоих случаях была получена только фоновая реактивность. Авторы сделали вывод о взаимозаменяемости обоих типов использованных тест-систем, хотя эффективность полноразмерного белка была несколько выше, чем у RBD-домена. Было показано также, что в реакции с названными вариантами рекомбинантных белков принимали участие антитела классов IgM, IgG (преимущественно IgG3), IgA, зарегистрировать которые удавалось даже в инактивированных в течение 1 часа при 56°С сыворотках.
При всех положительных результатах процесса создания описанных тест-систем для серодиагностики COVID-19 методом иммуноферментного анализа к относительным недостаткам указанного прототипа следует отнести сложность работы с клетками млекопитающих и насекомых как носителями созданных генетических конструкций, использование довольно сложных по своей структуре и способам получения рекомбинантных белков в виде модифицированного полноразмерного S-белка, отсутствие в составе тест-системы N-белка с его позитивным влиянием на чувствительность серологического метода.
Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, является создание такой тест-системы для иммуноферментного анализа, которая позволила бы выявлять у человека, инфицированного SARS-CoV-2, или больного COVID-19 антитела к короновирусу, принадлежащие к разным классам иммуноглобулинов, с эффективностью, не уступающей таковой при использовании других тест-систем, но значительно упрощающей (и, соответственно, удешевляющей) процесс получения ее основных компонентов. Технический результат заключается в создании заявленной тест-системы, упрощение способа её создания при сохранении высокой её эффективности.
Для решения поставленной технической проблемы и достижения заявленного технического результата предлагаются следующие технические решения.
Генетические конструкции pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD и pLVI-N с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 соответственно, на основе плазмиды DHFR Control Template, содержащие искусственно синтезированные нуклеотидные последовательности ДНК фрагментов RBD-SD1, и NTD S-белка вируса SARS-CoV-2, а также нуклеопротеина вируса SARS-CoV-2, представленные как SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, соответственно, которые объединены в единой рамке считывания с последовательностями узнавания TEV-протеазы и шести гистидинами.
Рекомбинантные белки-антигены RBD-SD1и NTD, содержащие антигенные детерминанты S-белка вируса SARS-CoV-2, и N, содержащий антигенные детерминанты нуклеопротеина вируса SARS-CoV-2, с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, соответственно, кодируемые ДНК-последовательностями. Указанные рекомбинантные белки получены путем извлечения белков из разрушенных клеток электрокомпетентного штамма BL21(DE3) E.coli, трансформированных через электропорацию плазмидной ДНК с последующей селекцией бактерий, устойчивых к ампициллину.
Применение совместно трех рекомбинантных белков RBD-SD1, NTD и N, имеющих аминокислотные последовательности соответственно SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9, для определения антител IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания, в сыворотке или плазме крови больных COVID-19 или инфицированных этим вирусом.
Иммуносорбент, содержащий одновременно три рекомбинантных белка-антигена NTD, RBD-SD1 и N, имеющих аминокислотные последовательности, соответственно, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:9, для определения IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентов COVID-19. Иммуносорбент представляет собой планшет 96-луночный, разборный, выполненный из полистирола.
Тест- система для иммуноферментного определения содержания IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентов COVID-19, содержащая сорбент, набор реагентов, концентрат конъюгата раздельного определения содержания IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания. Отличительной особенностью тест-системы является то, что в качестве сорбента выбран иммуносорбент.
В качестве каждого из наборов реагентов для определения суммарного и раздельного содержания IgM-, IgG-, IgA-антител SARS-CoV-2 включает положительный контроль (К+), отрицательный контроль (К-), раствор для разведения образцов (РРО), раствор для разведения конъюгата, ТМБ-хромоген, концентрат промывочного раствора, стоп-реагент.
Предлагается способ определения антител IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме крови с использованием рекомбинантных белков, включающий следующие этапы: внесение в лунки контрольных образцов и анализируемых образцов, перемешивание, инкубирование иммуносорбента с последующей промывкой, добавлением реагентов, оценкой оптической плотности.
В качестве анализируемого образца используют сыворотку или плазму крови больных COVID-19 или инфицированных этим вирусом.
Для решения заявленной технической проблемы, а именно осуществления тестирования пациентов и скрининга населения и получения максимально адекватного технического результата, в состав разрабатываемой тест-системы для иммуноферментного анализа был введен не один белок короновируса, как в остальных описанных к настоящему времени полезных продуктах, а одновременно три рекомбинантных белка, соответствующих по структуре наиболее адекватным эпитопам белков вируса. В результате биоинформационного и экспериментального анализа в данном изобретении были идентифицированы фрагменты, соответствующие NTD-фрагменту S-белка, RBD-фрагменту S-белка и нуклеопротеину вируса SARS-CoV-2. Созданные генетические конструкции на основе вектора DHFR Control Template были предназначены для получения целевых рекомбинантных белков, путем электропорации в бактериальные клетки E.coli штамма BL21(DE3), что придавало им устойчивость к ампициллину как фактору селекции трансформированных бактерий.
В процессе поэтапного выполнения патентных исследований осуществлялись:
- создание генетических конструкций pLVI-RDB-SD1 (SEQ ID NO:1), pLVI-NTD (SEQ ID NO:2) и pLVI-N (SEQ ID NO:3) на основе искусственно синтезированных фрагментов ДНК, содержащих нуклеотидные последовательности фрагментов RBD-SD1 (SEQ ID NO:4), и NTD(SEQ ID NO:5), спайк-гликопротеина вируса SARS-CoV-2, а также нуклеопротеина (SEQ ID NO:6), вируса SARS-CoV-2 путем их клонирования в плазмиду DHFR Control Template;
- трансформация электрокомпетентных клеток E.coli штамма BL21(DE3) путем электропорации плазмидной ДНК, содержащей созданные генетические конструкции, с последующим получением целевых рекомбинантных белков-антигенов RBD-SD1 (SEQ ID NO:7),NTD (SEQ ID NO:8), и N (SEQ ID NO:9);
- сорбирование полученных трех рекомбинантных антигенных белков-антигенов RBD-SD1, NTD и N с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 в лунках разборного полистиролового планшета как основы тест-системы для иммуноферментного анализа;
- формирование 4-х видов тест-систем для иммуноферментного выявления антител к SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови человека: (1) «SARS-CoV-2-антитела IgM-IgG-IgA тест»; (2) «SARS-CoV-2-антитела IgG тест»; (3) «SARS-CoV-2-антителаIgM тест»; (4) «SARS-CoV-2-антитела IgA тест»;
- апробация созданной тест-системы в клинических условиях.
Создание генетических конструкций pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD и pLVI-N (с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, соответствено).
Искусственно синтезированные фрагменты ДНК, содержащие нуклеотидные последовательности фрагментов RBD-SD1 (receptor binding domain-subdomain 1) (SEQ ID NO:4), и NTD (N-terminal domain) (SEQ ID NO:5), спайк-белка (S-protein) и последовательность белка нуклеопротеина (N-protein) (SEQ ID NO:6) вируса Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) были клонированы в плазмиду DHFR Control Template (New England BioLabs) с использованием эндонуклеаз рестрикции NdeI и XhoI и получением экспрессионных генетических конструкций pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD и pLVI-N, имеющих нуклеотидные последовательностиSEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 соответственно (рисунок 1).
Полученные таким образом генетические конструкции содержат:
- точку начала репликации плазмид pUCori;
- последовательность гена β-лактамазыE.coli(AmpR), продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов E.coli к антибиотику ампициллину;
- промоторную последовательность Т7;
- одну из нуклеотидных последовательностей, кодирующих фрагменты RBD-SD1 (330-590 аминокислотных остатков), NTD S-белка (17-305 аминокслотных остатков) и нуклеотидную последовательность N-белка (1-419 аминокислотных остатков) вируса SARS-CoV-2, объединенные в единой рамке считывания с последовательностями узнавания TEV-протеазы и шести гистидинами;
- терминаторную последовательность Т7.
Получение рекомбинантных белков-антигенов RBD-SD1, NTD и N, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, соответственно.
Плазмидной ДНК экспрессионных генетических конструкций pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD и pLVI-N трансформируют электрокомпетентные клетки E.coli штамма BL21(DE3) методом электропорации. Селекцию трансформантов проводят на минимальной среде 2YT, содержащий антибиотик ампициллин 100мкг/мл.
Единичные выросшие клоны для каждой из генетических конструкций pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD и pLVI-N помещают в жидкую среду 2YT, содержащий антибиотик ампициллин 100мкг/мл и выращивают в течение 16 часов при 37°С в термостатируемой качалке при перемешивании 180 об/мин. Аликвоту выросшей клеточной суспензии (1/100) переносят в свежую жидкую среду 2YT, содержащий антибиотик ампициллин 100мкг/мл и выращивают в течение 16 часов при 37°С в термостатируемой качалке при перемешивании 180 об/мин до достижении 0,6 ОЕ/мл. Далее к клеточной суспензии добавляют индуктор IPTG до конечной концентрации 1мМ и выращивают в течение 7 часов при 30°С в термостатируемой качалке при перемешивании 180 об/мин.
По окончании для каждого из белков-антигенов RDB-SD1, NTD и N клетки осаждают центрифугированием при 7000g, супернатант отбрасывают, клеточный осадок суспендируют в лизирующем буфере (50мМ Трис-HCl, 100мМ натрия хлористого, 5% глицерин, 10мМ ЭДТА, 0,5мМ β-меркаптоэтанол рН 7,4), клетки разрушают ультразвуковой обработкой. Полученный раствор осветляют центрифугированием при 10000g 10 минут, супернатант отбрасывают, клеточный осадок суспендируют в буфере 50мМ Трис-HCl, 2М натрия хлористого, 10мМ ЭДТА, рН 8.0. Полученный раствор осветляют центрифугированием при 10000g 10 мин, супернатант отбрасывают, клеточный осадок суспендируют в буфере 50мМ Трис-HCl, 2% тритон Х-100, 10мМ ЭДТА, рН 8.0. Полученный раствор центрифугируют при 10000g 10 минут, супернатант отбрасывают, клеточный осадок суспендируют в буфере 50мМ Трис-HCl, 2% тритон Х-100 рН 8.0. Полученный раствор центрифугируют при 10000g 10 минут, супернатант отбрасывают, клеточный осадок суспендируют в буфере 50мМ Трис-HCl, 4М гуанидин рН 8.0. Таким образом, получают растворы, содержащие один из рекомбинантных белков-антигенов RDB-SD1, NTD и N.
Колонку, содержащую сорбент NiNTA уравновешивают буфером нанесения (50мМ Трис-HCl, 4М гуанидин рН 8.0), наносят раствор, содержащий один из рекомбинантных белков RDB-SD1, NTD и N. Колонку промывают 20 объемами буфера нанесения, связавшийся белок элюируют буфером для элюции (50мМ Трис-HCl, 4М гуанидин, 300мМ имидазол рН 8.0). Таким образом, получают раствор, содержащий один из очищенных рекомбинантных белков-антигенов RDB-SD1, NTD и N (приложение 2).
Полученные очищенные рекомбинантные белки-антигены RDB-SD1, NTD и N вносятся в раствор 68,6 мМ бикарбоната натрия, 31,4 мМ карбоната натрия, 4М мочевинырН 8.0, в количестве, соответствующием конечной концентрации 400 нг/мл RDB-SD1, 100 нг/мл NTD и 400/мл нг N. По 100 мкл полученного раствора смеси белков-антигенов вносят в лунки разборных стандартных плоскодонных 96-луночных планшетов («ООО Биомедикал», Россия) и инкубируют при 4°С 16 часов без перемешивания. По окончании инкубации удаляют раствор из лунок, вносят по 150 мкл дистиллированной воды, инткубируют 1 минуту, воду удаляют. В каждую лунку планшета вносят по 150 мкл блокирующего раствора (2,83 г/л натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-ти водного, 0,34 г/л натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-х водного, 0,48 г/л бензоат натрия, 63,73 г/л сахароза, 0,09 г/л казеината натрия 2 мг/л гентамицин сульфат, 001мл/л Проклин 300). Планшеты инкубируют 1 час при комнатной температуре без перемешивания. По окончании инкубации удаляют блокирующий раствор и высушивают досуха при комнатной температуре. Полученный планшет хранят при температуре 6±2°С до трех месяцев и используют согласно инструкции.
Формирование тест-системы дляиммуноферментного определения раздельного содержания IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентовCOVID-19.
Используя рекомбинантные антигены SARS-CoV-2, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 соответственно, сорбированные в лунках разборного полистиролового планшета, в составе тест-системы было сформировано 4 набора для иммуноферментного выявления антител к SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови человека. Сокращенные наименования тест-систем:
- «SARS-CoV-2-Антитела ИБХ РАН IgM-IgG-IgA тест»,
- «SARS-CoV-2-Антитела ИБХ РАН IgG тест»,
- «SARS-CoV-2-Антитела ИБХ РАН IgM тест»,
- «SARS-CoV-2-Антитела ИБХ РАН IgA тест».
Данные тест-системы рекомендуется использовать в клинической лабораторной практике для определения наличия антител против коронавируса SARS-CoV-2 при проведении скрининговых исследований крови, при мониторинге эпидемиологической ситуации среди населения и оценке степени распространения инфекции, при прогнозировании тяжести течения COVID-19.
В состав каждой тест-системы входят:
- иммуносорбент - 96-луночный планшет, в лунках которого сорбированы рекомбинантные антигены SARS-CoV-2, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 соответственно. Планшет выполнен из бесцветного полистирола, с плоским дном, разборный - 2 шт.;
- положительный контроль (К+) - 1 × 2,5 мл;
- отрицательный контроль (К-) - 1 × 2,5 мл;
- раствор для разведения образцов (РРО) - 1 × 2,5 мл;
- концентрат конъюгата для определения раздельного содержания IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме (Кг(х11)) - 1 × 2,5 мл;
- раствор для разведения конъюгата (РРК) - 1 × 2,5 мл;
- ТМБ-хромоген - 1 × 2,5 мл;
- концентрат промывочного раствора, 25-кратный (КПР(х26)) - 1 × 2,5 мл;
- стоп-реагент - 1 × 2,5 мл;
а также следующие принадлежности:
- клейкая лента для заклеивания иммуносорбента - 6 штук;
- одноразовые ванночки для реагентов - 6 штук;
- одноразовые сменные наконечники к дозаторам пипеточным (10-300 мкл) - 40 штук;
- инструкция по применению набора реагентов - 1 штука.
Тест-система рассчитана на проведение 192 определений, включая 6контрольных. Она предназначена для ручной постановки и для постановки на автоматических анализаторах для иммуноферментного анализа открытого типа с возможностью, как дробного использования планшета (набора), так и использования для постановки целого планшета (набора); предназначена для диагностики invitro; должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре от+2 до +8°С в течение всего срока годности (12 месяцев).
Принцип воспроизведения теста включает следующие этапы. Внесение контрольных образцов - по 100 мкл положительного контроля (К+) и по 100 мкл отрицательного контроля (К-).В остальные лунки вносится по 90 мкл раствора для разведения образцов (РРО) и по 10 мкл анализируемых образцов сыворотки крови с последующим перемешиванием. Иммуносорбент заклеивается клейкой пленкой и инкубируется в термостатирующем шейкере при температуре (37±2)°С и постоянном встряхивании (700-800 об\мин) в течение 30 минут. По окончании инкубации лунки планшета промываются 5 раз. Во все лунки вносится по 100 мкл рабочего разведения конъюгата с последующим инкубированием при тех же условиях и 5-кратным промыванием. В лунки добавляется по 100 мкл раствора ТМБ-хромогена. Иммуносорбент заклеивается новой клейкой пленкой и инкубируется в защищенном от света месте при температуре (20±5) °С в течение 15 минут. В лунки вносится по 100 мкл стоп-реагента для остановки цветной реакции. Не более чем через 15 минут после остановки цветной реакции на фотометреизмеряется оптическую плотность в лунках в двухволновом режиме (450/620-700 нм). Допускается измерение при одной длине волны с фильтром 450 нм.
Для учета результатов расчитывается среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (ОПК-ср) и вычисляется ОПкрит по формуле: ОПкрит = ОПК-ср + А, где А - коэффициент, значение которого приведено в аналитическом паспорте (паспорте контроля качества)
Далее рассчитывается индекс позитивности для каждого исследуемого образца по формуле: ИПобр = ОПобр/ ОПкрит
При ИПобр ≥ 1,1 исследуемый образец сыворотки (плазмы) крови следует считать положительным (образец содержит антитела IgA и/или IgM и/или IgG к коронавирусу SARS-CoV-2), при ИПобр< 0,9 исследуемый образец сыворотки (плазмы) крови следует считать отрицательным, при значении 0,9 <ИПобр< 1,1 исследуемый образец сыворотки (плазмы) крови следует расценивать как сомнительный.
Клиническая апробация способа проводилась с использованием образцов крови 150 человек, из которых 33 условно здоровых человека контрольной группы и 117пациентов с верифицированным диагнозом COVID-19,находившихся на стационарном лечении. Степень поражения легких оценивалась по данным компьютерной томографии: у 9 больных с тяжелым течением COVD-19 наблюдалась наиболее высокая (третья-четвертая) степень поражениялегких, у остальных больных со среднетяжелым течением заболевания в 25% случаев наблюдалась низкая (первая) степень поражения легких, в 50% случаев - вторая степень, еще у 25% - третья степень. У 11 человек имелась сопутствующая системная патология, среди которых только 2 человека имели тяжелое течение заболевания. Всем включенным в исследование субъектам выполнялось исследованием методом ПЦР с целью обнаружения возбудителя SARS-Cov-2 и подтверждения диагноза COVID-19.
У больных COVID-19, включенных в исследование с 1-го по 7-й день болезни, во всех случаях наблюдался положительный результат ПЦР. Учитывая динамику выработки антител к SARS-CoV-2, отмеченную в литературе, эти больные были разделены на 2 группы - группа 1 с 1-го по 3-й день болезни (4 человека) и группа 2 с 4-го по 7-й день болезни (15 человек). В наблюдениях с 8-го по 19-й день болезни результат ПЦР мог быть как положительным, так и отрицательным, но в последнем случае в анамнезе всегда имелся положительный результат. Эти больные составили группу 3 исследования (70 человек). После 19-го дня болезни ПЦР, как правило, была отрицательной при наличии в анамнезе положительного результата - группа 4 (28 человек).
Определение диагностических критериев, диагностического значения и рекомендаций для выполнения совокупного определения уровней иммуноглобулинов классов IgM-IgG-IgAпроводилось на спектрофотометре "Лазурит" (Dynex, США)с использованием комплекса рекомбинантных белков и тест-системы для иммуноферментного анализа, входящих в предмет данного изобретения, в сопоставлении со стандартным методом с использованием набора реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов к SARS-CoV-2 с помощью полноразмерного S-белка, выпускаемого компанией «Генериум» (Владимирская область) и утвержденного 06.04.2020 г.
Статистическая обработка результатов проводилась на основе пакета статистических программ SPSS, версия 23.
Как показано в таблице 1, по результатам определения общего набора иммуноглобулинов всех трех классов (IgM, IgG, IgA) сравниваемые тест-системы равноценно выявляют высокую достоверность различий между показателями у больных и здоровых людей (р2< 0,05), начиная с 4-го дня болезни. В то же время по результатам автоматизированного ИФА на одном и том же приборе тесты разных производителей достоверно отличались друг от друга(р1< 0,001), но только при исследовании образцов сыворотки/плазмы крови в сроки, начиная с 8-го дня от начала заболевания.
Для определения критериальных значений теста и его диагностической значимости в сравнительном аспекте вычислялись 95%-ные доверительные интервалы индексов позитивности образцов (ИПобр) в каждой группе больных и в контроле, а путем построения ROC-кривых устанавливалось соотношение чувствительности и специфичности каждого теста в соответствии с закономерностями линейной регрессии. Количественным выражением диагностической значимости служила площадь под ROC-кривой (AUC) при ее максимальном значении, равном 1 [36].
Как следует из рисунка 2А, между 95%-ными доверительными интервалами показателей у здоровых и больных людей в обоих тестах были отмечены довольно существенные различия. С учетом стандартных отклонений можно утверждать, что показатели оптической плотности по тесту ИБХ при значениях ≥1,1с высокой диагностической значимостью (AUC = 0,743) свидетельствовали о наличии у больного COVID-19. Незначительно ниже была диагностическая значимость (AUC = 0,714) тест-системы компании «Генериум» при значениях≥ 1,1, как указывается в инструкции к набору реагентов (рисунок 2Б).
В то же время обращает на себя внимание тот факт, что в тест-системе ИБХ более чем у половины больных на 4-7 день от начала COVID-19 (группа 2) показатели ИФА позволяли определять диагностически значимый уровень антител. При использовании тест-системы компании "Генериум" на первой неделе заболевания обнаружить антитела на диагностически значимом уровне (ИПобр ≥1,1) практически невозможно. Чтобы подтвердить этот вывод, определялось соотношение чувствительности и специфичности обеих тест-систем в единицах AUC только на ранних этапах заболевания, то есть в группах 1 и 2 в сравнении с контролем (рисунок 2В). Для тест-системы ИБХ величина AUCв этой ситуации возрастала до 0,785, а для тест-системы компании "Генериум", наоборот, падала - до 0,699.
Таким образом, тест-система, служащая предметом данной заявки и предназначенная для обнаружения антител к SARS-CoV-2, проявляла большую чувствительность и может использоваться для серодиагностики COVID-19 уже на 4-7 день от начала заболевания.
Клинико-диагностические возможности теста ИБХ отчетливо проявлялись и при исследовании показателей выработки антител, принадлежащих к отдельным классам иммуноглобулинов.
На рисунке 3 показаны 95% доверительные интервалы показателей ИФА по определению IgMв сыворотке крови больных COVID-19 в разные сроки от начала заболевания, а также диагностическая значимость теста по результатам построения ROC-кривой при использовании заявляемой тест-системы производства ИБХ РАН (рисунок 3А) и тест-системы сравнения производства компании "Генериум" (рисунок 3Б). Заявляемая тест-система выявляла IgM-антитела на диагностически значимом уровне в период от 4-го до 19-го дня болезни при величине AUC = 0,685, в то время как тест-система сравнения, несмотря на рост уровня IgM, закономерностей такого повышения не выявляла, а ее результаты не были диагностически значимыми, поскольку AUC была ниже 0,5 и составляла 0,356.
На рисунке 4 показаны результаты анализа по аналогичному определению содержания IgG-антител в сыворотке больных COVID-19. Обе тест-системы показывали возрастание уровней антител до диагностически значимого уровня (сероконверсию) на 4-7 день от начала заболевания и сохранение этого уровня на протяжении всей болезни, включая период реконвалесценции. Оценка диагностического значения сравниваемых тест-систем по величинам AUC показала, что заявляемая тест-система проявляла умеренную диагностическую значимость (AUC = 0,688, рисунок 4А), но более высокую, чем тест-система сравнения (AUC = 0,577, рисунок 4Б).
На рисунке 5 представлены результаты анализа уровней IgA-антител к SARS-CoV-2. Обе тест-системы выявляли рост антител этого класса в период от 8-го до 19-го дня болезни с примерно одинаковой диагностической значимостью (величина AUC cоставляла, соответственно, 0,700 и 0,702).
Таким образом, апробация заявляемой тест-системы в клинических условия показала, что она способна выявлять антитела к SARS-CoV-2 у больных COVID-19 в сроки, примерно соответствующие данным, представленным в современной литературе. По диагностической значимости она обладает рядом преимуществ перед другой отечественной тест-системой, ранее сертифицированной в стране. Есть основание считать, что установленные преимущества связаны с расширением (до 3-х) спектра белков-носителей антигенных детерминант в составе заявляемой тест-системы. По сравнению с зарубежными аналогами, получение рекомбинантных белков, входящих в тест-систему, не связано с клетками млекопитающих или насекомых, а предполагает использование бактериальной культуры, что более выгодно с экономической точки зрения. Оценка соотношения чувствительности и специфичности заявляемой тест-системы с помощью единиц AUC, особенно при суммарном определении антител разных классов, демонстрирует ее конкурентоспособность.
Способ иллюстрируется следующими рисунками:
Рис. 1. Схемы экспрессионных генетических конструкций pLVI-RDB-SD1(А), pLVI-NTD(Б) и pLVI-N (В).
Рис. 2. 95%-ные доверительные интервалы показателей суммарного содержания IgM/IgG/IgA антител к SARS-CoV-2 (2А) и ROC-кривые их диагностической значимости у здоровых людей и больныхCOVID-19 в тест-системе, служащей предметом данного изобретения, и в тест-системе производства компании «Генериум», на протяжении всего заболевания (2Б) и в его начальном периоде (2В).
Рис. 3. 95%-ные доверительные интервалы содержания IgM-антител в сыворотке крови больных COVID-19 в разные периоды заболевания и ROC-кривые их диагностической значимости в заявляемой тест-системе производства ИБХ РАН (3A) и в тест-системе производства компании «Генериум» (3Б).
Рис. 4. 95%-ные доверительные интервалы содержания IgG-антител в сыворотке крови больных COVID-19 в разные периоды заболевания и ROC-кривые их диагностической значимости в заявляемой тест-системе производства ИБХ РАН (4A) и в тест-системе производства компании «Генериум» (4Б).
Рис. 5. 95%-ные доверительные интервалы содержания IgA-антител в сыворотке крови больных COVID-19 в разные периоды заболевания и ROC-кривые их диагностической значимости в заявляемой тест-системе производства ИБХ РАН (5A) и в тест-системе производства компании «Генериум» (5Б).
Нуклеотидные последовательности каждой из трех экспрессионных генетических конструкций, а также аминокислотные последовательности целевых рекомбинантных белков представлены в разделе «Нуклеотидные последовательности».
В таблице 1 показаны результаты исследования с использованием тест-систем для ИФА с одновременным выявлением иммуноглобулинов классов IgM, IgG, IgA к SARS-CoV-2, являющихся предметом данного изобретения (производитель ИБХ РАН) и выпускаемых компанией «Генериум».
Таблица 1.
| Группа исследования |
Индексы позитивности образцов: медиана (минимум; максимум) |
р1 | |
| Тест на IgM-IgG-IgA (ИБХ РАН) |
Тест на IgM-IgG-IgA («Генериум) |
||
| Без учета сроков заболевания | |||
| Здоровые люди, n = 33 | 0,13 [0,09; 0,50] | 0,08 [0,04; 0,030] | <0,001* |
| Больные COVID-19, n= 117 | 2,05 [0,10; 3,25] | 1,48 [0,05; 2,56] | <0,001* |
| р2 | <0,001* | <0,001* | |
| Группа 1 больных COVID-19 (1-3 дни болезни) | |||
| Здоровые люди, n = 33 | 0,13 [0,09; 0,50] | 0,08 [0,04; 0,030] | <0,001* |
| Больные COVID-19, n = 4 | 0,33 [0,12; 0,54] | 0,67 [0,10; 1,25] | 0,897 |
| р2 | 0,272 | 0,164 | |
| Группа 2 больных COVID-19 (4-7 дни болезни) | |||
| Здоровые люди, n = 33 | 0,13 [0,09; 0,50] | 0,08 [0,04; 0,030] | <0,001* |
| Больные COVID-19, n = 15 | 0,32[0,10; 2,97] | 0,31[0,05; 2,01] | 0,312 |
| р2 | 0,001* | 0,001* | |
| Группа 3 больных COVID-19 (8-19 дни болезни) | |||
| Здоровые люди, n = 33 | 0,13 [0,09; 0,50] | 0,08 [0,04; 0,030] | <0,001* |
| Больные COVID-19, n = 70 | 2,07[0,10; 3,25] | 1,50[0,09; 2,56] | <0,001* |
| р2 | <0,001* | <0,001* | |
| Группа 4 больных COVID-19 (после 19-го дня болезни) | |||
| Здоровые люди, n = 33 | 0,13 [0,09; 0,50] | 0,08 [0,04; 0,030] | <0,001* |
| Больные COVID-19, n = 28 | 2,57[0,29; 3,05] | 1,70[0,28; 2,38] | 0,027* |
| р2 | <0,001* | <0,001* | |
р1 - вероятность различий по критерию Манна-Уитни между результатами разных тестов отдельно у здоровых и больных людей; р2 - вероятность различий по критерию Манна-Уитни между группами здоровых и больных людей в рамках одной тест-системы; р3 - вероятность различий по критерию Манна-Уитни между группами больных людей при сравнении с предыдущей группой рамках одной тест-системы; * - достоверность различий при р < 0,05
Литература
1. Du L. The spike protein of SARS-CoV - a target for vaccine and therapeuticdevelopment //Nat Rev Microbiol,2009. Vol. 7, N 3. - P. 226-236.
2. Du L. MERS-CoV spike protein: a key target for antivirals // Expert Opin TherTargets,2017. - Vol. 21, N 2. - P. 131-143.
3. Zhou P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin // Nature, 2020. - Vol. 579, N 7798. - P. 270-273.
4. Jiang S. An emerging coronavirus causing pneumonia outbreak in Wuhan, China: calling for developing therapeutic and prophylactic strategies //Emerg Microbes Infect, 2020. - Vol. 9, N 1. - P. 275-277.
5. Ou X., Liu Y., Lei X., Li P., Mi D., Ren L., Guo L., Guo R., Chen T., Hu J., Xiang Z., Mu Z., Chen X., Chen J., Hu K., Jin Q., Wang J., Qian Z. Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV //Nat Commun, 2020. - Vol. 11. - P. 1620.
6. Zhou Y., Yang Y., Huang J., Jiang S., Du L. Advances in MERS-CoV vaccines and therapeutics based on the receptor-binding domain // Viruses, 2019. - Vol. 11, N 1. - Pii:E60.
7. Ahmed S.F., Quadeer A.A., McKay M.R. Preliminary identification of potential vaccine targets for the COVID-19 coronavirus (SARS-CoV-2) based on SARS-CoV immunological studies // Viruses, 2020. - Vol. 12, N 3. - Pii: 254.
8. Zhou P., Yang X.-L., Wang X.-G., Hu B., Zhang L., Zhang W., Si H.-R., Zhu Y., Li B., Huang C.-L., et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin // Nature. 2020. - Vol. 579, N 7798. - P. 270-273.
9. Lu R., Zhao X., Li J., Niu P., Yang B., Wu H., Wang W., Song H., Huang B., Zhu N., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: Implications for virus origins and receptor binding // Lancet, 2020. - Vol. 395, N 10224. - P. 565-574.
10. Letko M., Marzi A., Munster V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B β-coronaviruses // Nat Microbiol, 2020. - Vol. 5. - P. 562-569.
11. Walls A.C., Park Y.J., Tortorici M.A., Wall A., McGuire A.T., Veesler D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein //Cell, 2020. doi: 10.1016/j.cell.2020.02.058 [Epub ahead of print].
11. Klenk H.D., Garten W. Host cell proteases controlling virus pathogenicity // Trends Microbiol, 1994. - Vol. 2, N 2. - P. 39-43.
12. Steinhauer D.A. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus // Virology, 1999. - Vol. 258, N 1. - P. 1-20.
13. Ai T., Yang Z., Hou H., Zhan C., Chen C., Lv W., Tao Q., Sun Z., Xia L. Correlation of Chest CT and RT-PCR Testing in Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) in China: A Report of 1014 Cases // Radiology, 2020: 200642.
14. Xiao A.T., Tong Y.X., Zhang S. False-negative of RT-PCR and prolonged nucleic acid conversion in COVID-19: Rather than recurrence // J Med Virol,2020. - 10.1002/jmv.25855.doi: 10.1002/jmv.25855. Online ahead of print.
15. Li Y., Yao L., Chen L., Song Y., Cai Z., Yang C. Stability issues of RT-PCR testing of SARS-CoV-2 for hospitalized patients clinically diagnosed with COVID-19 //J Med Virol, 2020. - Vol. 92, N 7. - P. 903-908.
16. Xiang F., Wang X., He X., Peng Z., Yang B., Zhang J., Zhou Q., Ye H., Ma Y., Li H., Wei X., Cai P., Ma W.L. Antibody detection and dynamic characteristics in patients with COVID-19 // Clin Infect Dis, 2020. ciaa461. doi: 10.1093/cid/ciaa461. Online ahead of print.
17. AmanatF., StadlbauerD., StrohmeierS., NguyenT.H.O., ChromikovaV., McMahonM., JiangK., ArunkumarG.A., JurczyszakD., PolancoJ., Bermudez-GonzalezM., KleinerG., AydilloT., MiorinL., FiererD., LugoL.A., KojicE.M., StoeverJ., LiuS.T.H., Cunningham-RundlesC., FelgnerP.L., MoranT., Garcia-SastreA., CaplivskiD., ChengA., KedzierskaK., VapalahtiO., HepojokiJ.M., SimonV., KrammerF. AserologicalassaytodetectSARS-CoV-2 seroconversioninhumans // https://doi.org/10.1101/2020.03.17.20037713.medRxiv preprint 2. - 2020.
18. Kohmer N., Westhaus S., Rühl C., Cieseka S., Rabenau H.F. Brief clinical evaluation of six high-throughput SARS-CoV-2 IgG antibody assays // J Clin Virol, 2020. - Vol. 129. - P. 104480.
19. To K.K.W, Tsang O.T.Y., Leung W.S., Tam A.R., Wu T.C., Lung D.C., et al. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study // Lancet Infect Dis, 2020. doi: 10.1016/S1473-3099(20)30196-1[Epub ahead of print].
20. Zhang W., Du R.H., Li B. Molecular and serological investigation of 2019-nCoV infected patients: implication of multiple shedding routes // Emerg Microbes Infect, 2020. - Vol. 9, N 1. - P. 386-389.
21. Yu H.Q., Sun B.Q., Fang Z.F., Zhao J.C., Liu X.Y., Li Y.M., et al. Distinct features of SARS-CoV-2-specific IgA response in COVID-19 patients // Eur Resp J, 2020. Doi: 10.1183/13993003.01526-2020.[Epub ahead of print].
21. Zhang L., Zhang F., Yu W. Antibody responses against SARS coronavirus are correlated with disease outcome of infected individuals // J Med Virol, 2006. - Vol. 78, N 1. - P. 1-8.
22. Liu L., Wei Q., Lin Q. Anti-spike IgG causes severe acute lung injury by skewing macrophage responses during acute SARS-CoV infection // JCI Insight, 2019. - Vol. 4, N 4. - e123158.
23. Заявка на патент CN111024954A от 17.04.2020 г. (на китайском языке). Иммунохроматографическое устройство с коллоидным золотом для совместного обнаружения антигена и антитела COVID-19 и способ его применения. Подана 09.03.2020 ShenzhenYiruiBiotechnologyCo., Ltd.
24. Заявка на патент CN111089962A от 01.05.2020 г. (на китайском языке).Набор коллоидного золота для совместного обнаружения нового антитела IgM / IgG к коронавирусу и способ его получения. Подана 25.03.2020 г. ChungshanBiologicalEngineeringCompany, Ltd.
25. Полезный продукт EH4395 /Humananti-2019-nCoV(N) IgGELISAKit, компанияFineTest, https://www.fn-test.com/product/eh4395/
26. Полезный продукт EH4397 /Humananti-SARS-CoV2(N) IgGELISAKit, компанияFineTest, https://www.fn-test.com/product/eh4397/
27. Полезный продукт EH4940 /Humananti-SARS-CoV2(N) IgMELISAKit, компанияFineTest, https://www.fn-test.com/product/eh4940/
28. Полезный продукт EH4941 /Humananti-2019 nCoV(S) IgGELISAKit, компанияFineTest, https://www.fn-test.com/product/eh4941/
29. Полезный продукт EH4942 /Human Anti-2019 nCoV(S) IgM ELISA Kit, компания Fine Test, https://www.fn-test.com/product/eh4942/
30. Патент РФ 2253870, опубл. 10.06.2005 г. (Бюллетень 16). Рекомбинантные белки, содержащие диагностически значимые антигенные эпитопы белков короновируса (SARS-CoV), cвязанного с тяжелым острым респираторным синдромом, и последовательности синтетических генов, кодирующие диагностически значимые антигенные детерминанты белков короновируса (SARS-CoV), cвязанного с тяжелым острым респираторным синдромом. Патентообладатель -ООО Научно производственное объединение "Диагностические системы".
31. Kohmer N., Westhaus S., Rühl C., Cieseka S., Rabenau H.F. Clinical performance of SARS-CoV-2 IgG antibody tests and potential protective immunity // bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.08.085506.
32. Beavis K.G., Matushek S.M., Abeleda A.P.F., Bethel C.,Hunt C., Gillen S., Moran A., Tesic V. Evaluation of the EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA Assay for detectionof IgA and IgG antibodies // J Clin Virol, 2020. - Vol. 129. - P. 104468.
33. Krüttgen A., Cornelissen C.G., Dreher M., Hornef M.,Imöhl M., Kleines M. Comparison of four new commercial serologic assays for determination ofSARS-CoV-2 IgG // J Clin Virol, 2020. - Vol. 128. P. 104394.
34. Zhou X., Obuchowski N., McClishD.Statistical Methods in Diagnostic Medicine // John Wiley & Sons, New York. - 2002.
Claims (10)
1. Генетическая конструкция для получения рекомбинантного белка-антигена вируса SARS-CoV-2, в сыворотке или плазме крови больных COVID-19 или инфицированных этим вирусом, представляющая собой pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD или pLVI-N, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно.
2. Рекомбинантный белок-антиген для определения антител IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания, в сыворотке или плазме крови больных COVID-19 или инфицированных этим вирусом, RBD-SD1 или NTD, содержащий антигенные детерминанты спайк-белка вируса SARS-CoV-2, или рекомбинантный белок-антиген N, содержащий антигенные детерминанты нуклеопротеина вируса SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQIDNO:7, SEQIDNO:8 или SEQIDNO:9 соответственно, полученный путем извлечения белков из разрушенных клеток электрокомпетентного штамма BL21(DE3) E.coli, трансформированных через электропорацию плазмидной генетической конструкции pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD или pLVI-N соответственно, с последующей селекцией бактерий, устойчивых к ампициллину.
3. Иммуносорбент для определения IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентов COVID-19, содержащий одновременно три рекомбинантных белка-антигена NTD, RBD-SD1 и N по п. 2.
4. Иммуносорбент по п. 3, отличающийся тем, что иммуносорбент представляет собой планшет 96-луночный, разборный, выполненный из полистирола.
5. Тест-система для иммуноферментного определения содержания IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентов COVID-19, содержащая сорбент, набор реагентов, концентрат конъюгата раздельного определения содержания IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания, отличающаяся тем, что в качестве сорбента выбран иммуносорбент по п. 3.
6. Тест-система по п. 5, отличающаяся тем, что в качестве каждого из наборов реагентов для определения суммарного и раздельного содержания IgM-, IgG-, IgA-антител SARS-CoV-2 включает положительный контроль (К+), отрицательный контроль (К-), раствор для разведения образцов (РРО), раствор для разведения конъюгата, ТМБ-хромоген, концентрат промывочного раствора, стоп-реагент.
7. Применение тест-системы по п. 5 для иммуноферментного определения содержания IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме крови больных или инфицированных этим вирусом и реконвалесцентов COVID-19.
8. Применение по п. 7, отличающееся тем, что иммуносорбент инкубируют в термостатирующем шейкере при температуре (37±2)°С и постоянном встряхивании (700-800 об/мин) в течение 30 минут.
9. Применение по п. 8, отличающееся тем, что иммуносорбент повторно инкубируют в защищенном от света месте при температуре (20±5) °С в течение 15 минут.
10. Применение по п. 7, отличающееся тем, что оптическую плотность в лунках измеряют в двухволновом режиме 450/620 нм и 700 нм.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020121770A RU2730897C1 (ru) | 2020-07-01 | 2020-07-01 | СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020121770A RU2730897C1 (ru) | 2020-07-01 | 2020-07-01 | СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2730897C1 true RU2730897C1 (ru) | 2020-08-26 |
Family
ID=72238008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020121770A RU2730897C1 (ru) | 2020-07-01 | 2020-07-01 | СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2730897C1 (ru) |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112048005A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-12-08 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 新型冠状病毒s蛋白片段多倍体及其制备方法、检测试剂盒、疫苗及药物 |
| CN112114141A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-12-22 | 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒 |
| CN112213497A (zh) * | 2020-09-24 | 2021-01-12 | 杭州医学院 | 检测新型冠状病毒s蛋白独特性抗体的多肽-elisa试剂盒 |
| CN112684169A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-20 | 西安医学院 | 一种基于免疫层析法的新型冠状病毒n蛋白的检测试纸条 |
| CN112964880A (zh) * | 2021-02-07 | 2021-06-15 | 安第斯抗体生物技术衡水有限公司 | 一种快速检测新冠病毒IgM抗体的方法和试剂盒 |
| RU2752862C1 (ru) * | 2021-04-09 | 2021-08-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 коронавируса SARS-CoV-2, иммуносорбент, содержащий цельновирионный очищенный антиген, полученный на основе указанного штамма и тест-система ИФА для выявления антител классов M, G и A к коронавирусу SARS-CoV-2 с использованием указанного иммуносорбента |
| WO2021211331A1 (en) * | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Abbott Point Of Care Inc. | METHODS, COMPLEXES AND KITS FOR DETECTING OR DETERMINING AN AMOUNT OF A ß-CORONAVIRUS ANTIBODY IN A SAMPLE |
| CN113583137A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-11-02 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 一种新型冠状病毒南非突变株的重组亚单位疫苗及其应用 |
| RU2759149C1 (ru) * | 2021-04-13 | 2021-11-09 | Акционерное общество "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО" | Способ проведения иммуноферментного анализа для выявления антител в биологическом образце человека, специфичных к коронавирусу человека SARS-COV2, тест-система |
| WO2021211332A3 (en) * | 2020-04-13 | 2021-12-30 | Abbott Laboratories | Methods and kits for detecting or determining an amount of an anti-β-coronavirus antibody in a sample |
| RU2770444C1 (ru) * | 2021-05-27 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Рекомбинантные белки-антигены и способ определения эпитопной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой, тест-система на их основе |
| WO2022083768A1 (zh) * | 2020-10-23 | 2022-04-28 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 免疫原性组合物及其应用 |
| RU2776295C1 (ru) * | 2021-09-03 | 2022-07-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего образования "Новосибирский государственный аграрный университет" | Способ выявления заражения людей и животных SARS CoV2 и диагностический набор для осуществления способа |
| US12085340B2 (en) | 2016-11-08 | 2024-09-10 | Academia Sinica | Recombinant virus, composition comprising the same, and uses thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2004245896A1 (en) * | 2003-06-10 | 2004-12-16 | Agency For Science, Technology And Research | Method of diagnosing SARS corona virus infection |
| CN111187354A (zh) * | 2020-02-20 | 2020-05-22 | 北京新创生物工程有限公司 | 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)IgM/IgG抗体检测试剂盒 |
| RU2723008C1 (ru) * | 2020-05-19 | 2020-06-08 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение |
-
2020
- 2020-07-01 RU RU2020121770A patent/RU2730897C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2004245896A1 (en) * | 2003-06-10 | 2004-12-16 | Agency For Science, Technology And Research | Method of diagnosing SARS corona virus infection |
| CN111187354A (zh) * | 2020-02-20 | 2020-05-22 | 北京新创生物工程有限公司 | 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)IgM/IgG抗体检测试剂盒 |
| RU2723008C1 (ru) * | 2020-05-19 | 2020-06-08 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение |
Cited By (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US12085340B2 (en) | 2016-11-08 | 2024-09-10 | Academia Sinica | Recombinant virus, composition comprising the same, and uses thereof |
| WO2021211332A3 (en) * | 2020-04-13 | 2021-12-30 | Abbott Laboratories | Methods and kits for detecting or determining an amount of an anti-β-coronavirus antibody in a sample |
| WO2021211331A1 (en) * | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Abbott Point Of Care Inc. | METHODS, COMPLEXES AND KITS FOR DETECTING OR DETERMINING AN AMOUNT OF A ß-CORONAVIRUS ANTIBODY IN A SAMPLE |
| CN112048005A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-12-08 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 新型冠状病毒s蛋白片段多倍体及其制备方法、检测试剂盒、疫苗及药物 |
| CN112114141A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-12-22 | 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒 |
| CN112213497A (zh) * | 2020-09-24 | 2021-01-12 | 杭州医学院 | 检测新型冠状病毒s蛋白独特性抗体的多肽-elisa试剂盒 |
| CN112213497B (zh) * | 2020-09-24 | 2023-10-20 | 杭州医学院 | 检测新型冠状病毒s蛋白独特性抗体的多肽-elisa试剂盒 |
| WO2022083768A1 (zh) * | 2020-10-23 | 2022-04-28 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 免疫原性组合物及其应用 |
| CN112684169A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-20 | 西安医学院 | 一种基于免疫层析法的新型冠状病毒n蛋白的检测试纸条 |
| CN112964880A (zh) * | 2021-02-07 | 2021-06-15 | 安第斯抗体生物技术衡水有限公司 | 一种快速检测新冠病毒IgM抗体的方法和试剂盒 |
| RU2752862C1 (ru) * | 2021-04-09 | 2021-08-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 коронавируса SARS-CoV-2, иммуносорбент, содержащий цельновирионный очищенный антиген, полученный на основе указанного штамма и тест-система ИФА для выявления антител классов M, G и A к коронавирусу SARS-CoV-2 с использованием указанного иммуносорбента |
| RU2826172C2 (ru) * | 2021-04-12 | 2024-09-05 | Академиа Синика | Вакцины на основе информационной рнк против широкого спектра вариантов коронавируса |
| RU2759149C1 (ru) * | 2021-04-13 | 2021-11-09 | Акционерное общество "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО" | Способ проведения иммуноферментного анализа для выявления антител в биологическом образце человека, специфичных к коронавирусу человека SARS-COV2, тест-система |
| RU2770444C1 (ru) * | 2021-05-27 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Рекомбинантные белки-антигены и способ определения эпитопной специфичности аутореактивных антител к отдельным фрагментам экстрацеллюлярного домена десмоглеина 3-го типа человека у больных обыкновенной пузырчаткой, тест-система на их основе |
| CN113583137A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-11-02 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 一种新型冠状病毒南非突变株的重组亚单位疫苗及其应用 |
| RU2776295C1 (ru) * | 2021-09-03 | 2022-07-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего образования "Новосибирский государственный аграрный университет" | Способ выявления заражения людей и животных SARS CoV2 и диагностический набор для осуществления способа |
| RU2822761C2 (ru) * | 2021-10-25 | 2024-07-12 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Способ получения и очистки функционально активного рекомбинантного белка nsp1 sars-cov-2 и способ идентификации потенциальных лекарственных соединений против covid-19, направленных на ингибирование nsp1 |
| RU2784655C1 (ru) * | 2021-12-31 | 2022-11-29 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ К SARS-CoV-2 В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ ЛЮДЕЙ, ПЕРЕНЕСШИХ COVID-19 ИЛИ ПРИВИТЫХ ВАКЦИНАМИ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ НОВОЙ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ COVID-19, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА, СОДЕРЖАЩЕГО РЕКОМБИНАНТНЫЙ РЕЦЕПТОР-СВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН (RBD) ПОВЕРХНОСТНОГО ГЛИКОПРОТЕИНА S КОРОНАВИРУСА SARS-COV-2 И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ РЕЦЕПТОР АСЕ2 |
| RU2801597C1 (ru) * | 2022-07-25 | 2023-08-11 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" | Искусственная генетическая конструкция для гетерологической экспрессии рецептор-связывающего домена S-белка в слитной полипептидной цепи с нуклеокапсидным белком |
| RU2787171C1 (ru) * | 2022-08-09 | 2022-12-29 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Способ определения антител к SARS-COV-2 в смешанной слюне |
| RU2801178C1 (ru) * | 2022-12-30 | 2023-08-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА IGA2m1-ИЗОТИПА В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ |
| RU2822889C1 (ru) * | 2023-12-27 | 2024-07-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Способ получения димерной формы мутантного иммуноглобулина IgA2m1-изотипа в клетках млекопитающих |
| RU2822890C1 (ru) * | 2023-12-27 | 2024-07-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Способ получения димерной формы иммуноглобулина IgA1-изотипа в клетках млекопитающих |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2730897C1 (ru) | СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19 | |
| Burbelo et al. | Detection of nucleocapsid antibody to SARS-CoV-2 is more sensitive than antibody to spike protein in COVID-19 patients | |
| WO2021179371A1 (zh) | 新冠病毒n-s优势表位融合蛋白、制备方法、应用，及表达蛋白、微生物、应用，试剂盒 | |
| Zhang et al. | Evaluation of recombinant nucleocapsid and spike proteins for serological diagnosis of novel coronavirus disease 2019 (COVID-19) | |
| Shrivastava et al. | Evaluation of a commercial dengue NS1 enzyme-linked immunosorbent assay for early diagnosis of dengue infection | |
| Singh et al. | A sandwich-ELISA for the diagnosis of Peste des petits ruminants (PPR) infection in small ruminants using anti-nucleocapsid protein monoclonal antibody | |
| CN113215107B (zh) | 一种检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫试剂盒及其制备方法 | |
| Yu et al. | Evaluation of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 specific immunoglobulin M antibodies for diagnosis of hand-foot-and-mouth disease | |
| EP1745291A1 (en) | Detection of west nile virus | |
| CN101644709A (zh) | 快速检测病毒中和抗体的方法和试剂盒 | |
| Newton et al. | Clinical and laboratory diagnosis of influenza virus infections | |
| CN112300252A (zh) | 2019-nCoV冠状病毒核衣壳蛋白抗原表位多肽的预测及其在检测中的应用 | |
| CN104151399B (zh) | 博卡病毒(HBoV)共有的特异性表位、其应用及其抗体 | |
| Afzal et al. | Rapid antibody diagnostics for SARS-CoV-2 adaptive immune response | |
| Yu et al. | Recombinant truncated nucleocapsid protein as antigen in a novel immunoglobulin M capture enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of severe acute respiratory syndrome coronavirus infection | |
| CA2648481A1 (en) | Pestivirus species | |
| EP4124865A1 (en) | A surrogate cell-based corona virus spike protein blocking assay | |
| Forgacs et al. | Functional characterization of SARS-CoV-2 vaccine elicited antibodies in immunologically naïve and pre-immune humans | |
| CN113156118B (zh) | 一种诊断标志物及其在covid-19诊断及冠状病毒既往感染检测中的应用 | |
| JP2016503011A (ja) | レプトスピラ症の診断および処置のための方法およびタンパク質抗原の組成物 | |
| Dunbar et al. | Diagnostic tests and procedures during the COVID-19 pandemic | |
| Pattnaik et al. | Serology: A Precise Tool in Diagnosis and Epidemiology of COVID-19 | |
| Bhat et al. | Laboratory diagnosis of SARS-CoV-2: an Update for Clinicians | |
| US11353454B2 (en) | Methods for detection of flavivirus antibodies | |
| US20230296604A1 (en) | A Method of Detecting SARS-COV2 Antibodies and Related Products |