RU2752862C1

RU2752862C1 - Штамм hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 коронавируса SARS-CoV-2, иммуносорбент, содержащий цельновирионный очищенный антиген, полученный на основе указанного штамма и тест-система ИФА для выявления антител классов M, G и A к коронавирусу SARS-CoV-2 с использованием указанного иммуносорбента

Info

Publication number: RU2752862C1
Application number: RU2021110009A
Authority: RU
Inventors: Александр Петрович Агафонов; Марина Поликарповна Богрянцева; Сергей Александрович Боднев; Елена Васильевна Гаврилова; Анастасия Андреевна Зимонина; Ильназ Рамисович Иматдинов; Ринат Амирович Максютов; Елена Юрьевна Прудникова; Олег Викторович Пьянков; Степан Александрович ПЬЯНКОВ; Александр Борисович Рыжиков; Владимир Александрович Терновой; Елена Владимировна Чуб; Ирина Сергеевна Шульгина
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2021-08-11

Abstract

Изобретение относится к штамму hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 вируса SARS-CoV-2, иммуносорбенту, содержащему цельновирионный антиген, полученный с использованием указанного штамма, и тест-системе ИФА для выявления антител классов М, G и А к коронавирусу SARS-CoV-2 и может быть использовано в медицинской вирусологии. Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение чувствительности набора реагентов для двухстадийного твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием цельновирионного антигена, полученного на основе заявляемого штамма hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 вируса SARS-CoV-2. Указанный технический результат достигается получением штамма hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 вируса SARS-CoV-2, депонированного в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Указанный технический результат достигается также получением иммуносорбента, содержащего цельновирионный антиген вируса SARS-CoV-2, используемого в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов М, G и А к вирусу SARS-CoV-2. Указанный технический результат достигается также изготовлением иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов М, G и А к вирусу SARS-CoV-2, содержащему вышеуказанный иммуносорбент. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 11 табл., 7 пр.

Description

Изобретение относится к разработке средства иммуноферментной диагностики COVID-19 и может быть использовано в медицинской практике, а именно для выявления и ретроспективного расследования случаев заражения вирусом SARS-CoV-2, а также для оценки эффективности терапевтических (на основе антител к возбудителю) и профилактических (вакцина) препаратов. Кроме этого, средство диагностики может выявлять концентрацию специфических антител и даст возможность сравнивать специфическую активность медицинских препаратов измерением величины гуморального ответа на препарат в крови человека и различных животных. Главное отличие средства диагностики от ранее известных заключается в способе приготовления иммуносорбента - основного компонента тест-системы для выявления специфических антител методом иммуноферментного анализа (ИФА). Иммуносорбент представляет собой планшет, предназначенный для проведения ИФА, в лунках которого сорбирован антиген. Антиген получен из штамма hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 вируса SARS-CoV-2 (депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекционных болезней, риккетсиозов Роспотребнадзора, функционирующей на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, №V-1034) методом очистки на ультрацентрифуге в градиенте плотности сахарозы.

Известен способ получения антигена на основе рекомбинантного белка нуклеокапсида (N) вируса SARS-CoV-2, полученного в прокариотической системе экспрессии (Lin D, Liu L, Zhang Μ, et al. Evaluations of the serological test in the diagnosis of 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2) infections during the COVID-19 outbreak. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2020;39(12):2271-2277. doi:10.1007/sl0096-020-03978-6).

Недостатки способа заключаются в том, что рекомбинантный антиген по своим антигенным свойствам не в полной мере соответствует нативному N-белку из вириона, при этом по специфичности может соответствовать и антигенам других коронавирусов. Антитела у больных и реконвалесцентов имеют широкий спектр антигенной специфичности ко всем белкам SARS-CoV-2 (Ma Η, Zeng W, He H, et al. Serum IgA, IgM, and IgG responses in COVID-19. Cell Mol Immunol. 2020;17:773-775.). По этим двум причинам не все антитела, синтезом которых организм будет отвечать на инфицирование вирусом SARS-CoV-2, будут связываться с рекомбинантным N-белком или связываться с высокой авидностью для образования иммунного комплекса, что приводит к потере чувствительности и специфичности метода. Кроме того, выявление специфических к N-белку вируса SARS-CoV-2 антител не может быть использовано для оценки эффективности вакцин против SARS-CoV-2, главным компонентом которых будут являются домены поверхностного S-белка (Spike).

Известен способ получения антигена на основе рекомбинантного белка аналогичного рецептор-связывающему домену (receptor-binding domain - RBD) S-белка оболочки вируса (Spike), полученного в эукариотической системе экспрессии (Chen Y, Tong X, Li Υ, et al. A comprehensive, longitudinal analysis of humoral responses specific to four recombinant antigens of SARS-CoV-2 in severe and non-severe COVID-19 patients. PLoS Pathog. 2020;16(9):el008796. Published 2020 Sep 10. doi:10.1371/journal.ppat.1008796).

Это высоко специфичный антиген, позволяющий не только дифференцировать COVID-19 от сезонных коронавирусных инфекций, но и составить представление о концентрации антител с нейтрализующими SARS-CoV-2 свойствами. Его основной недостаток, что в подавляющем большинстве случаев клинические образцы сыворотки крови могут быть выявлены в анализе на его основе только на 2-4 месяц после инфекции (Haddad NS, Nguyen DC, et al. Elevated SARS-CoV-2 Antibodies Distinguish Severe Disease in Early COVID-19 Infection. bioRxiv [Preprint]. 2020 Dec 6:2020.12.04.410589. doi:10.1101/2020.12.04.410589. PMID: 33299998; PMCID: PMC7724666.). Это объясняется его малым вкладом в репертуар гуморального иммунитета пациентов с COVID-19.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является (патент РФ №2730897, МПК G01N 33/535, опубл. 26.08.2020 г.):

- генетическая конструкция для получения рекомбинантного белка-антигена вируса SARS-CoV-2, в сыворотке или плазме крови больных COVID-19 или инфицированных этим вирусом, представляющая собой pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD или pLVI-N, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно;

- рекомбинантный белок-антиген для определения антител IgM- или IgG-или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания, в сыворотке или плазме крови больных COVID-19 или инфицированных этим вирусом, RBD-SD1 или NTD, содержащий антигенные детерминанты спайк-белка вируса SARS-CoV-2, или рекомбинантный белок-антиген N, содержащий антигенные детерминанты нуклеопротеина вируса SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQIDNO:7, SEQIDNO:8 или SEQIDNO:9 соответственно, полученный путем извлечения белков из разрушенных клеток электрокомпетентного штамма BL21(DE3) E.coli, трансформированных через электропорацию плазмидной генетической конструкции pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD или pLVI-N соответственно, с последующей селекцией бактерий, устойчивых к ампициллину;

- иммуносорбент для определения IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентов COVID-19, содержащий одновременно три рекомбинантных белка-антигена NTD, RBD-SD1 и N;

- иммуносорбент представляет собой планшет 96-луночный, разборный, выполненный из полистирола;

- тест-система для иммуноферментного определения содержания IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентов COVID-19, содержащая иммуносорбент, набор реагентов, концентрат конъюгата раздельного определения содержания IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания; в качестве каждого из наборов реагентов для определения суммарного и раздельного содержания IgM-, IgG-, IgA-антител SARS-CoV-2 включает положительный контроль (К+), отрицательный контроль (К-), раствор для разведения образцов (РРО), раствор для разведения конъюгата, ТМБ-хромоген, концентрат промывочного раствора, стоп-реагент.

Однако применяемые в диагностических целях отдельные рекомбинантные антигены - аналоги белков вируса SARS-CoV-2 имеют свои недостатки, ограничивающие их применение. В том числе такое как взаимное подавление диагностической эффективности при одновременном использовании различных антигенов. Это возможно по причине различных требований к подготовке антигенов до рабочего диагностического состояния и хранения, к оптимальным режимам анализа и к составу реагентов. Суммирование свойств отдельных антигенов SARS-CoV-2 для выявления специфических антител происходит только при условии целостности нативной структуры вируса с сохранением конформации белков и их удельной концентрации. В этом случае при использовании для диагностики заболевания диагностического набора с нативным антигеном будут детектироваться все высоко авидные специфические только для SARS-CoV-2 антитела. Поскольку на разных стадиях иммунного ответа вероятность выявления специфических антител классов А, Μ и G сильно варьирует, для достижения максимальной ширины диагностического окна необходимо выявлять все эти классы иммуноглобулинов. При использовании техники выявления суммарных антител (сэндвич-метод) невозможно составить представление о стадии заболевания. Данные о профиле специфических IgA, IgM и IgG в отдельном образце будут более информативны для точного определения фазы заболевания.

Задачей изобретения является расширение спектра тест-систем для выявления антител классов М, G и А к вирусу SARS-CoV-2.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение чувствительности тест-системы (набора реагентов) для двухстадийного твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) за счет использования цельновирионного антигена вируса SARS-CoV-2.

Указанный технический результат достигается получением штамма hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 вируса SARS-CoV-2 для получения цельновирионного антигена - компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов М, G и А к вирусу SARS-CoV-2, депонированного в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-1034.

Указанный технический результат достигается также получением иммуносорбента для определения антител классов М, G и А к вирусу SARS-CoV-2 в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентов COVID-19, согласно изобретения, представляет собой планшет 96-луночный, разборный, выполненный из полистирола, в лунках которого сорбирован цельновирионный антиген вируса SARS-CoV-2, используемый в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов М, G и А к вирусу SARS-CoV-2, полученный из культуральной жидкости, содержащей штамм hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 вируса SARS-CoV-2 по п. 1 с титром не менее 5×10⁷ ЦПД₅₀/мл путем осаждения вируса центрифугированием, очистки антигена от примесей ультрацентрифугированием и его инактивации химическим реагентом с получением очищенного антигена в количестве не менее 2 мкг/мл, чистотой не менее 90% и диагностической чувствительностью не менее 96,9%.

Указанный технический результат достигается также созданием тест-системы для иммуноферментного определения содержания антител классов М, G и А к вирусу SARS-CoV-2 в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентов COVID-19, согласно изобретения, содержащей иммуносорбент по п. 2, набор реагентов, концентрат конъюгата моноклональных мышиных антител к IgG или IgM, или IgA человека, конъюгированных с пероксидазой хрена для определения содержания антител классов М, G и А к вирусу SARS-CoV-2. Набор реагентов содержит положительный контроль (К+), отрицательный контроль (К-), раствор для разведения образцов (РРО), раствор для разведения конъюгата, ТМБ-хромоген, концентрат промывочного раствора, стоп-реагент.

Характеристика заявляемого штамма вируса SARS-CoV-2 Штамм hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 вируса SARS-CoV-2 депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-1034 (справка о депонировании штамма прилагается).

Название вируса в соответствии с правилами номенклатуры и положение в современной системе классификации:

Царство Riboviria; Тип Orthornavirae; Класс Pisuviricota; Подкласс Pisoniviricetes;

Порядок Nidovirales; Подотряд Cornidovirineae; Семейство Coronaviridae;

Подсемейство Orthocoronavirinae; Род Betacoronavirus; Подрод Sarbecovirus

Вид Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus

Без ранга SARS-CoV-2

Штамм hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020.

Область использования: диагностический штамм для получения цельновирионного антигена вируса SARS-CoV-2.

Способ получения штамма. Штамм выделен из биопробы (мазок носоглотки) в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора 17.07.2020 г.

Транспортная среда с носоглоточным мазком была растворена в 10 раз в питательной среде (среда ДМЕМ с глутамином и добавлением антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл)) и 1 мл полученного раствора был внесен в культуральный флакон Т-25 с монослоем культуры клеток Vero Е6. Адсорбция 1 ч при комнатной температуре. Добавление 5 мл питательной среды с 2% эмбриональной сыворотки. Экспозиция при +37°С в течение 2-5 сут до развития 80-100% ЦПД.

Способ идентификации штамма. Штамм идентифицирован 17.07.2020 г. методом ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени с использованием набора реагентов для выявления РНК коронавирусов SARS/COVID-19 методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Вектор-OneStepПЦР-CoV-RG».

Новый вирусный штамм выделен путем 3 последовательных пассажей на культуре клеток Vero Ε. После проведения пассажей гомология нуклеотидных последовательностей генома с исходным штаммов составила 99,9%.

Культурально-морфологические особенности штамма. Размножается на культуре клеток Vero Е6 (+37°С), ЦПД развивается на 2-7 сутки в зависимости от дозы заражения.

Способ, условия и состав сред для размножения. Заражение монослоя клеток Vero Е6 в поддерживающей среде Игла MEM (или аналоге) с глутамином и добавлением антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл) и 2% эмбриональной сыворотки плодов коров.

Серологические свойства. Нейтрализуется антителами переболевших COVID-19 людей.

Вирулентность (патогенность). II группа патогенности для человека по российской классификации.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма.

Температура хранения - (-70°С).

Свойство или иное назначение штамма, послужившее основанием для патентования: диагностический штамм для получения цельновирионного антигена вируса SARS-CoV-2.

Условия культивирования: Заражение монослоя клеток Vero Е6 в среде Игла ДМЕМ с добавлением сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота до конечной концентрации 2% и антибиотиков. Культивирование производится при температуре 37°С в течение 6-7 суток. Титр вируса: 5,0×10⁷ ЦПД₅₀/мл.

Геном вируса представлен молекулой односпиральной рибонуклеиновой кислоты (РНК) позитивной полярности протяженностью 29903 нуклеотидов, кодирующих 20 белков, из них 4 структурные.

Номер депонирования последовательности в базе GenBank: MW741552.1/

Номер депонирования в базе GISAID: EPI_ISL_1242008

Полная нуклеотидная последовательность штамма отличается от референсной (Wuhan-Hu-1) 8-ю аминокислотными заменами в следующих генах:

ORF1ab (L4111IF), (P4715L), (S5587P)

S gene (D614G)

ORF3a gene (T229I)

ORF7a gene (V93F)

N gene (delRG203-204KR)

ORF14 (G50N)

Состав вириона: 4 структурных белка кодируются геномом вируса SARS-CoV-2: нуклекапсидный (N), матричный (М), оболочечный (Е) и поверхностный белок (Spike).

Стратегия вирусного генома (способ репродукции): геномная РНК выполняет две матричные функции: транскрипции и репликации. Общая схема репликации: плюс-цепь РНК>минус-цепь родительской РНК>плюс-цепь РНК потомства>вирионы потомства.

Форма вириона: сферический нуклеокапсид окружен белковой мембраной и липосодержащей внешней оболочкой, от которой отходят булавовидные шиловидные отростки, напоминающие корону, за что семейство и получило свое название.

Молекулярная масса вириона составляет примерно 1000 МДа. Наружный диаметр частиц равен 80-100 нм. Снаружи вирион покрыт липопротеидной мембраной, на которой располагается до 100 тримеров белка S длиной 10 нм.

Патогенен для человека, Ro (индекс репродукции, коэффициент контагиозности) от 2,0 до 4,0, летальность - около 2% (для некоторых возрастных групп достигает 15%), относится ко II группе патогенности.

Антигенные свойства цельновирионного антигена. Выявляет все специфические антитела к вирусу SARS-CoV-2 в сыворотках больных и вакцинированных людей. Для исследования свойств антигена было проведено выявление специфических IgG в крови пациентов и доноров. Всего было протестировано 1000 образцов сыворотки и плазмы крови человека. Из них 51 образец содержит специфические антитела, 949 не содержат.

В таблице 1 приведена характеристика групп образцов сыворотки и плазмы крови человека, использованных для исследования диагностической информативности антигена.

Клинический статус пациентов установлен методами лабораторной диагностики по наличию (или отсутствию) аналитов возбудителей выявленных заболеваний. Статус доноров крови определен по отношению к социально значимым заболеваниям. Все отрицательные образцы собраны не позднее сентября 2019 года. Данные о составе панели представлены в Таблице 1.

Пример 1. Способ получения антигена вируса SARS-CoV-2

Все работы ведутся в боксе биологической безопасности III класса.

А) Наработка антигена вируса SARS-CoV-2.

В работе используют перевиваемую культуру клеток почки африканской зеленой мартышки Vero Е6. Культуру клеток хранят в жидком азоте и выращивают путем серийных пересевов общепринятым способом в ростовой среде ДМЕМ с добавлением сыворотки эмбрионов коров до 10% и антибиотиками: 100 ед./мл бензилпенициллина и 100 ед./мл стрептомицина, в течение 3-4 суток при посевной концентрации 5-10×10⁵ кл./мл. Концентрацию клеток подсчитывают в камере Горяева согласно инструкции фирмы-изготовителя.

Штамм hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 вируса SARS-CoV-2 получают из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекционных болезней, риккетсиозов Роспотребнадзора, функционирующей на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, все работы с вирусом проводят в соответствии с требованиями санитарных правил.

Антиген вируса SARS-CoV-2 нарабатывают на культуре клеток Vero, используя поддерживающую среду Игла MEM с добавлением сыворотки эмбрионов коров до 2% и антибиотиков: 100 ед/мл амфотерицина, 100 ед/мл бензилпенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. Для этого с монослоя культуры клеток Vero с концентрацией 1×10⁵ кл/мл, выращенный на 3 культуральных флаконах Т-75, рабочая площадь поверхности флакона 7500 мм², сливают ростовую среду и инфицируют клетки добавлением 30 мл вируссодержащей среды с множественностью заражения 4,5 lg БОЕ/5 мл при 20-25°С в течение 60 минут.

Культуральные флаконы инкубируют в течение 5-7 суток при (37+1)°С до разрушения не менее чем 70% монослоя, а затем замораживают при минус 20°С. После полного замораживания (не менее чем через 1 час) их оттаивают и снимают монослой, сливают КВЖ в один культуральный флакон и отстаивают для осаждения клеточного дебриса в течении 1-2 часов. Затем аккуратно отбирают КВЖ без клеточного дебриса и переносят в стерильный флакон. Концентрация вируса в КВЖ - не менее 10⁸ вирусных частиц/мл.

Б) Концентрирование антигена вируса SARS-CoV-2. К КВЖ добавляют полиэтиленгликоль ПЭГ-8000 до 8% и оставляют при температуре 20-25°С на 18-20 часов. Затем вирус осаждают на дно 2-миллилитровых полипропиленовых пробирок путем центрифугирования на центрифуге Minispin в течение 3 мин на скорости 10000 об/мин при температуре 20-25°С. Надосадочную жидкость сливают в емкость с дезинфицирующим раствором (3%-ный раствор хлорамина), а осадок растворяют в 9 мл раствора Хенкса.

В) Очистка антигена вируса SARS-CoV-2. Окончательно АГ очищают от чужеродных белков ультрацентрифугированием в 10-60%-ном градиенте плотности сахарозы. Для приготовления градиента раствора сахарозы используют раствор воды очищенной и 6 стеклянных флаконов, отградуированных на объем 50 мл вместимостью 50 или 100 мл. В каждом приготавливаются навески для изготовления 50 мл 10%-, 20%-, 30%-, 40%-, 50%- и 60%-ного раствора сахарозы. После добавления в каждый флакон 40 мл воды и перемешивания до полного растворения сахарозы объем доводят до 50 мл. Растворы хранят при температуре минус 18°С.

За сутки до центрифугирования устанавливают прозрачные полипропиленовые пробирки вместимостью 2 мл. В них осторожно, чтобы не перемешать, наслаивают по 0,2 мл шести растворов сахарозы различной плотности начиная с максимальной 60%-ной. Раствор оставляют на сутки для сглаживания ступенек плотностей сахарозы. Перед ультрацентрифугированием на градиент сахарозы 10-60% осторожно наслаивают осадок вируса в растворе Хенкса по 0,5 мл в каждую пробирку. Закручивают винтовые крышки. Пробирки устанавливают в ротор центрифуги 5810R, Eppendorf, с охлаждением, закрывают и запускают центрифугу с включенной вытяжной вентиляцией. Режим центрифугирования - 14000 об/мин при 20-25°С в течение 4 час. По окончании центрифугирования пробирки переносят в штатив. Опалесцирующую полосу на уровне 20-40%-ной сахарозы осторожно отбирают из пробирок в 10-20 мл флакон с винтовой крышкой. Выход АГ: для приготовления 100 и более иммуносорбентов.

Г) Инактивация антигена вируса SARS-CoV-2. Стерильно непосредственно перед использованием готовят 4%-ный раствор бетта-пропиолактона (BPL) в охлажденной (4°С) дистиллированной воде. Для этого к 0,960 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 40 мкл 98%-ного BPL. Раствор держат на хладоэлементе до использования. Затем 1 часть 0,5 Μ раствор Na₂HPO₄ добавляют к 38 частям вируссодержащей жидкости, к полученной смеси по каплям добавляют 1 часть 4%-ного раствора BPL, продолжая перемешивать. Конечная концентрация BPL в растворе составляет 0,1%. Тщательно перемешав, чтобы обеспечить полный контакт вируса с BPL, раствор помещают в термостат при температуре 37°С на два часа, время от времени (примерно каждые 15 минут) помешивая. Одновременно по описанной методике в стерильных условиях готовят контрольный образец 0,1%-ного раствора BPL в культуральной среде Игла MEM, не содержащей вируса, который будет использован в качестве контрольного образца при оценке токсичность BPL. Хранят АГ при температуре от 2 до 6°С.

Проверка остаточной инфекционности антигена вируса SARS-CoV-2. Проверка остаточной инфекционности АГ и контроль токсичности BPL проводится путем 3-кратного слепого пассирования на культуре клеток Vero Е6. После 3-го пассажа проводят выявление РНК коронавируса SARS-CoV-2 в КВЖ методом ПЦР. При сохранении монослоя клеток Vero Е6 на 100% поверхности культуральных флаконов с внесенными аликвотами исследуемых препаратов, включая контроль токсичности BPL, и отрицательном результате ПЦР-анализа делают заключение об отсутствии в образцах остаточной инфекционности.

Пример 2. Приготовление иммуносорбента

Приготовление раствора для сорбции: расход сырья, используемого на операции, приведен в таблице 2.

Отмеряют с помощью цилиндра (700±10) мл очищенной воды и переливают ее в чистую стеклянную емкость вместимостью 1 л. Вносят навеску натрия углекислого. Перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения навески. Доводят объем раствора до метки 1 л. Водородный показатель раствора не корректируют.

Приготовление блокирующего раствора: расход сырья, используемого на операции, приведен в таблице 3.

Отмеряют с помощью мерного цилиндра (700±10) мл очищенной воды и переливают ее в чистую стеклянную емкость вместимостью 1 л. Вносят навеску сахарозы, добавив необходимый объем 5%-ного р-ра казеина. Перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения. Доводят объем раствора до 1 л.

Приготовление рабочего раствора для сорбции: расход сырья, используемого на операции, приведен в таблице 4.

Отмеряют с помощью мерного цилиндра (900±10) мл раствора для сорбции и переливают в чистую стеклянную емкость вместимостью 1 л. Добавляют с помощью полуавтоматического дозатора с одноразовым наконечником с фильтром очищенный цельновирионный антиген вируса SARS-CoV-2, полученный по примеру 1. Перемешивают на магнитной мешалке в течение 1 ч при температуре от 18°С до 24°С.

Нанесение и сорбция на планшеты. Для сорбции используют планшеты Nunc Maxisorp - «Nunc Α/S», Дания, или аналогичные им. Объем заполнения лунок - 100-105 мкл. Объем заполнения лунок контролируют пипеткой полуавтоматической одноканальной со сменным наконечником на 200 мкл в лунках A1, D6 и Η12 в одном планшете из каждых 100 сорбированных. Сорбцию проводят при температуре от 17°С до 27°С, время сорбции - 18-20 ч. После проведения сорбции содержимое лунок планшета удаляют в емкость для обеззараживания отходов. Остатки сорбционного раствора из лунок планшета удаляют, постукивая перевернутым планшетом по марлевой ткани.

Блокировка. Внесение блокирующего раствора в лунки планшетов проводят на автоматическом устройстве активации иммунологических планшетов. Объем заполнения лунок - 200-205 мкл. Объем заполнения лунок контролируют пипеткой полуавтоматической одноканальной со сменным наконечником на 250 мкл в лунках A1, D6 и H12 в одном планшете из каждых 100 заблокированных. Блокировку проводят при температуре от 17°С до 27°С, время - 2 ч. После проведения блокировки содержимое лунок планшета удаляют в емкость для отходов для обеззараживания. Остатки блокирующего раствора из лунок планшета удаляют, постукивая перевернутым планшетом по марлевой ткани.

Сушка планшетов. Планшеты устанавливают в кассеты и помещают в бокс для сушки планшетов. Сушку планшетов ведут 18-20 ч при температуре от 25°С до 27°С.

Иммуносорбент и мешочек с силикагелем помещают в этикетированный пакет. Пакет запаивают. Шов должен быть прочным, обеспечивающим герметичность упаковки.

Пример 3. Состав набора реагентов (тест-системы) «Вектор ИФА SARS-CoV-2-ΑΤ»

На основе иммуносорбента собран набор реагентов для иммуноферментного выявления специфических антител к SARS-CoV-2 в исследуемых сыворотках и плазме крови. Его короткое название «Вектор ИФА SARS-CoV-2-ΑΤ».

В ходе исследования образцов с применением разработанного набора реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к коронавирусу SARS-CoV-2 «SARS-CoV-2-ИФА-Вектор» были получены следующие результаты:

- доказана диагностическая эффективность медицинского изделия (МИ) «SARS-CoV-2-ИФА-Вектор»:

1) при исследовании 51 положительного образца положительный результат получен в 51 случае. Диагностическая чувствительность - 100% (88,7% - 100%) с доверительной вероятностью 95%.

2) при исследовании 949 отрицательных образцов отрицательный результат получен в 949 случаях. Диагностическая специфичность - 100% (98,8% - 100%) с доверительной вероятностью 95%.

3) неспецифических перекрестных реакций отмечено не было.

4) с достоверным результатом могут быть исследованы образцы, содержащие до 33 г/л эквивалента триглециридов (гиперлипидемия), гемоглобин до 1 г/л (гемолизированные образцы), билирубин до 100 мг/л (иктеричные образцы).

По полученным результатам на основе цельнорвирионного антигена создан иммуносорбент - основной компонент набора реагентов «Вектор ИФА SARS-CoV-2-AT скрин».

Набор реагентов (тест-система) включает в себя:

ИС Иммуносорбент - планшет разборный (12 восьмилуночных стрипов) с цельновирионным инактивированным антигеном SARS-CoV-2 1 шт.

К+ Положительный контрольный образец из сыворотки крови человека, содержащий антитела к антигенам SARS-CoV-2, инактивированный, прозрачная красного цвета жидкость объемом 1,5 мл 1 фл.

К- Отрицательный контрольный образец из сыворотки крови человека, не содержащий антител к SARS-CoV-2, антител и антигенов к ВИЧ, вирусу гепатита В, вирусу гепатита С, Treponema pallidum, инактивированный, прозрачная желтого цвета жидкость объемом 2,0 мл 1 фл.

Кг 20х концентрат моноклональных мышиных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена, для диагностики реконвалесценции и протективной защиты после вакцинации - прозрачная желтого цвета жидкость объемом 0,7 мл 1 фл.

РПР-С Раствор для предварительного разведения сывороток прозрачная красно-зеленого цвета жидкость объемом 10,0 мл 1 фл.

РБР-С Буферный раствор для разведения сывороток - прозрачная бесцветная жидкость объемом 10,0 мл 1 фл.

РБР-К Буферный раствор для разведения конъюгата - прозрачная зеленого цвета жидкость объемом 13,0 мл 1 фл.

ТМБ Хромоген тетраметилбензидин, прозрачная желтая жидкость объемом 0,7 мл 1 фл.

БРС Субстратный буферный раствор с перекисью водорода для разведения хромогена, прозрачная бесцветная жидкость объемом 13,0 мл 1 фл.

ФСБ-Т (концентрат х25) 25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином, прозрачная бесцветная жидкость объемом 26,0 мл 1 фл.

СТОП-реагент 1М раствор серной кислоты, прозрачная бесцветная жидкость объемом 6,0 мл. 1 фл.

Планшет для предварительного разведения 1 шт.

Одноразовая пленка для заклеивания лунок иммуносорбента 3 шт.

Одноразовые ванночки для растворов 4 шт.

Эксплуатационная документация: Инструкция по применению, паспорт.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

Нижний порог обнаружения. При разведении положительного образца №1 рабочей панели образцов «РП- IgG(+/-)SARS-CoV-2» (или аналогичного по содержанию антител) в 100 раз, результат анализа положительный.

Специфичность. Все отрицательные согласно паспорта образцы рабочей панели «РП- IgG(+/-)SARS-CoV-2» должны интерпретироваться как отрицательные. Все положительные согласно паспорта образцы рабочей панели «РП-IgG(+/-)SARS-CoV-2» должны интерпретироваться как положительные.

Воспроизводимость. Воспроизводимость установлена исследованием коэффициента вариации оптических плотностей повторов положительного образца №1 рабочей панели «РП-IgG(+/-)SARS-CoV-2». Коэффициент вариации не более 8%.

Интерферирующие вещества. С достоверным результатом могут быть исследованы образцы, содержащие до 33 г/л эквивалента триглециридов (гиперлипидемия), гемоглобин до 1 г/л (гемолизированные образцы), билирубин до 100 мг/л (иктеричные образцы). Диагностическая чувствительность 100% (94,2% - 100%) с доверительной вероятностью 95%. Диагностическая специфичность 100% (98,8% - 100%) с доверительной вероятностью 95%. Характеристики рабочей панели образцов предприятия «РП AT(+/-)SARS-CoV-2» в табл.5:

Пример 4. Проведение иммуноферментного анализа при скрининге

ИФА с использованием тест-системы «Вектор ИФА SARS-CoV-2-ΑΤ» предложено проводить в следующей последовательности:

Вносят во все предназначенные для исследуемых образцов лунки иммуносорбента по 90 мкл РБР-С.

Вносят по 100 мкл в лунку положительный К+и отрицательный К- контроли.

В лунки с 90 мкл РБР-С вносят по 10 мкл предварительно разведенных исследуемых образцов, тщательно перемешав пипетированием. Все лунки иммуносорбента заклеивают пленкой.

Иммуносорбент инкубируют 60 мин в термошейкере при 700 об/мин и температуре (37±1)°С.

По окончании инкубации содержимое лунок ИС собирают в сосуд с дезинфицирующим раствором, промывают лунки стрипов 5 раз промывочным раствором по 300-400 мкл на лунку и удаляют влагу. Время между заполнением и опорожнением лунок должно быть не менее 30 сек. По окончании промывки необходимо тщательно удалять влагу из лунок. Не допускать высыхания лунок ИС между отдельными операциями.

Готовят рабочий раствор конъюгата, разводя в стабилизаторе концентрат.

В лунки иммуносорбента вносят по 100 мкл рабочего раствора Кг.

Все лунки иммуносорбента заклеивают пленкой.

Иммуносорбент инкубируют 30 мин в термошейкере при 700 об/мин и температуре (37±1)°С.

По окончании инкубации содержимое лунок ИС собирают в сосуд с дезинфицирующим раствором, промывают лунки стрипов 5 раз промывочным раствором и удаляют влагу.

Во все лунки иммуносорбента вносят по 100 мкл рабочего раствора хромогена. Все лунки имуносорбента заклеивают пленкой.

Защищенный от света иммуносорбент инкубируют 15 мин при температуре (37±1)°С.

Результаты ИФА регистрируют с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность (ОП) с фильтром 450 нм и референс-фильтром 620-650 нм. Учет результатов после вычета ОП (620-650 нм) из ОП (450 нм). Результаты анализа учитывают только при соблюдении следующих условий: Значение ОП в лунке с К+ более 0,500 о.е.; Каждое значение ОП в лунках с К- (ОП К-) менее 0,200 о.е. Для интерпретации результатов рассчитывают ОП(К-)ср. по формуле:

где ОП(К-)ср. - среднее значение ОП в лунках с К-;

ОП(К-) - значение оптической плотности в лунке с К-.

Затем рассчитывают значение ОПкрит. по формуле:

где ОПкрит. - критическое значение оптической плотности.

Считают образец положительным если:

ОП образца равна или более ОПкрит (ОПобразца>ОПкрит.);

Считают образец отрицательным если:

ОП образца менее ОПкрит (ОПобразца<ОПкрит).

Для исследуемых образцов дополнительно рассчитывают КПобразца по формуле:

где КПобразца - коэффициент позитивности образца.

Пример 5. Использование набора реагентов «Вектор ИФА SARS-CoV-2-АТ» в клинических исследованиях

А. Набор использован в качестве референс-метода при проведении клинических испытаний медицинских изделий для иммуноферментного выявления антител класса G к коронавирусу SARS-CoV-2.

Материалом для исследований являлись образцы сыворотки и плазмы крови, содержащие и не содержащие IgG к коронавирусу SARS-CoV-2 (таблица 6). Образцы, содержащие антитела к коронавирусу SARS-CoV-2, получены от пациентов лечебных учреждений, которым 2-3 недели ранее был поставлен диагноз «коронавирусная инфекция по причине инфицирования SARS-CoV-2» на основе клинических признаков заболевания COVID-19 и лабораторной диагностики методом ПЦР - выявления РНК возбудителя. Не содержащие антитела к коронавирусу SARS-CoV-2 образцы получены в феврале-сентябре 2019 года от доноров и пациентов с гетерологичными инфекционными заболеваниями, а также от здоровых доноров и беременных.

* Образцы сывороток крови, взятые у пациентов, которые дали положительный результат методом ОТ-ПЦР на инфекцию COVID-19 и которые были помещены на карантин в больнице. Образцы взяты последовательно у одного пациента через 12-14 дней после выявления коронавируса SARS-CoV-2 методом ПЦР и спустя еще 7-10 дней. Исследование сывороток должно было продемонстрировать нарастание коэффициента позитивности (КП) в испытуемом наборе реагентов и нарастание оптической плотности (ОП) в наборе сравнения.

При клинических испытаниях МИ «Вектор ИФА SARS-CoV-2-ΑΤ» на 275 положительных образцах сыворотки и плазмы крови с антителами к коронавирусу SARS-CoV-2 от 125 пациентов был получен положительный результат в 100% случаев.

При клинических испытаниях на 309 отрицательных образцах сыворотки и плазмы крови, не содержащих антитела к коронавирусу SARS-CoV-2 от 259 пациентов был получен отрицательный результат в 100% случаев.

Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по порядку проведения экспертизы качества, эффективности и безопасности медицинских изделий», утв. ФГБУ «ЦМиКЭЭ» и ФГБУ «ВНИИИМТ» 24.08.2018 г.

Оценку статистической достоверности результатов клинических испытаний (диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность) в зависимости от числа независимых опытов (от числа пациентов, от которых получены положительные или отрицательные образцы, а не от количества образцов) проводили по Клопперу и Пирсону с доверительной вероятностью 0,95 (95%).

Таким образом, в ходе клинических испытаний с использованием положительных образцов от 125 пациентов, содержащих иммуноглобулины класса G к коронавирусу SARS-CoV-2 положительный результат получен в 125 случаях. Диагностическая чувствительность - 100% (интервал 98,5% - 100%, с доверительной вероятностью 95%). В ходе клинических испытаний с использованием образцов от 259 пациентов, не содержащих иммуноглобулины класса G к коронавирусу SARS-CoV-2, отрицательный результат получен в 259 случаях. Диагностическая специфичность на отрицательных образцах - 100% (интервал 98,5% - 100%, с доверительной вероятностью 95%).

Воспроизводимость: Коэффициент вариации оптических плотностей повторов положительных образцов составлял не более 8%.

Для оценки аналитической специфичности (перекрестной реактивности) использовали 209 образцов сыворотки крови от беременных женщин и пациентов с другими гетерологичными заболеваниями. Перекрестно реагирующих образцов обнаружено не было.

Б. Набор использован для иммуноферментного выявления антител класса Μ к коронавирусу SARS-CoV-2.

С этой целью использован концентрат Кг с содержанием моноклональных антител мыши к IgM человека, конъюгированных с пероксидазой хрена.

Материалом для исследований являлись образцы сыворотки и плазмы крови, содержащие и не содержащие IgM к коронавирусу SARS-CoV-2 (таблица 7). Образцы, содержащие IgM к коронавирусу SARS-CoV-2, получены от пациентов лечебных учреждений, которым 7-10 днями ранее был поставлен диагноз «коронавирусная инфекция по причине инфицирования SARS-CoV-2» на основе клинических признаков заболевания COVID-19 и лабораторной диагностики методом ПЦР - выявления РНК возбудителя. Не содержащие антитела к коронавирусу SARS-CoV-2 образцы получены в феврале-сентябре 2019 года от доноров и пациентов с гетерологичными инфекционными заболеваниями в острой стадии, а также от здоровых доноров и беременных.

* - Образцы сывороток крови, взятые у больных, которые дали положительный результат методом ОТ-ПЦР на инфекцию SARS-CoV-2 и которые были помещены на карантин в больнице. Образцы взяты последовательно у одного пациента через 7-10 дней после выявления коронавируса SARS-CoV-2 методом ПЦР и спустя еще 5-10 дней.

** Сыворотки крови больных с диагнозом COVID-19, взятые в динамике для демонстрации сероконверсии - через 0-2 дня после выявления коронавируса SARS-CoV-2 методом ПЦР и спустя еще 6-18 дней:

больной №1, образец в 0-й день (день взятия мазка) - №480;

больной №1, образец на 10-й день - №481;

больной №2, образец на 2-й день после взятия мазка - №482;

больной №2, образец на 10-й день после взятия мазка - №483;

больной №3, образец в 0-й день (день взятия мазка) - №484;

больной №3, образец на 6-й день после взятия мазка - №485;

больной №3, образец на 12-й день после взятия мазка - №486;

больной №4, образец в 0-й день (день взятия мазка) - №487;

больной №4, образец на 7-й день после взятия мазка - №488;

больной №5, образец в 0-й день (день взятия мазка) - №489;

больной №5, образец на 18-й день после взятия мазка - №490.

Изучение чувствительности на 175 положительных образцах сыворотки и плазмы крови с IgM коронавирусу SARS-CoV-2 от 75 пациентов показало положительный результат в 100% случаев (175 образцов из 175 положительных). Воспроизводимость для всех положительных образцов - 100%.

Изучение специфичности на 304 отрицательных образцах сыворотки и плазмы крови, не содержащих IgM коронавирусу SARS-CoV-2, от 254 пациентов показало отрицательный результат в 100% случаев (304 образца из 304 отрицательных). Воспроизводимость для всех отрицательных образцов - 100%.

При проведении исследований наблюдается 100%-ная внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость для всех положительных образцов.

Показана эквивалентность образцов сыворотки и плазмы крови, полученной с использованием в качестве антикоагулянта ЭДТА или цитрата натрия.

Для оценки аналитической специфичности (перекрестной реактивности) использовали образцы сыворотки крови от пациентов с ревматоидным фактором класса М, от беременных женщин и пациентов с другими гетерологичными заболеваниями, содержащими специфические IgM. Перекрестно реагирующих образцов обнаружено не было.

В. Набор использован для иммуноферментного выявления антител класса А к коронавирусу SARS-CoV-2.

С этой целью использован концентрат Кг с содержанием моноклональных антител мыши к IgA человека, конъюгированных с пероксидазой хрена.

Материалом для исследований являлись образцы сыворотки и плазмы крови, содержащие и не содержащие IgA к коронавирусу SARS-CoV-2 (таблица 8). Образцы, содержащие антитела к коронавирусу SARS-CoV-2, получены от пациентов лечебных учреждений, которым был поставлен диагноз «коронавирусная инфекция по причине инфицирования SARS-CoV-2» на основе клинических признаков заболевания COVID-19 и лабораторной диагностики методом ПЦР - выявления РНК возбудителя. Не содержащие антитела к коронавирусу SARS-CoV-2 образцы получены в феврале-сентябре 2019 года от доноров и пациентов с гетерологичными инфекционными заболеваниями в острой стадии, а также от здоровых доноров и беременных.

Результаты проведенных лабораторных исследований:

На 167 положительных образцах сыворотки и плазмы крови с IgA к коронавирусу SARS-CoV-2 от 117 пациентов был получен положительный результат в 100% случаев.

На 360 отрицательных образцах сыворотки и плазмы крови, не содержащих IgA к коронавирусу SARS-CoV-2, от 310 пациентов был получен отрицательный результат в 100% случаев.

Диагностическая чувствительность выявления IgA к SARS-CoV-2: на положительных образцах сыворотки и плазмы крови, полученных от 117 пациентов, показали 100%-ную чувствительность (интервал 96,9% - 100%, с доверительной вероятностью 95%);

Диагностическая специфичность выявления IgA к SARS-CoV-2: на отрицательных образцах сыворотки и плазмы крови, полученных от 310 пациентов, показали 100%-ную специфичность (интервал 98,8% - 100%, с доверительной вероятностью 95%).

Воспроизводимость: на 715 положительных и отрицательных образцах от 427 пациентов 100%-ная межсерийная воспроизводимость результатов.

Для оценки аналитической специфичности (перекрестной реактивности) использовали 285 образцов сыворотки крови от беременных женщин и пациентов с другими гетерологичными заболеваниями. Перекрестно реагирующих образцов обнаружено не было.

Таким образом, набор реагентов может быть использован для определения напряженности индивидуального иммунитета к COVID-19.

Диагностическая чувствительность разработанного набора реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов классов М, G и А к SARS-CoV-2 при исследовании образцов, содержащих иммуноглобулины классов М, G и А к коронавирусу SARS-CoV-2, составляет 100% (интервал 96,9% - 100%, с доверительной вероятностью 95%);

Диагностическая специфичность разработанного набора реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов классов М, G и А к SARS-CoV-2 при исследовании проб, не содержащих иммуноглобулины классов М, G и А к коронавирусу SARS-CoV-2, составляет 100% (интервал 98,8% - 100%, с доверительной вероятностью 95%).

При проведении исследований наблюдается 100% воспроизводимость для всех положительных и отрицательных образцов.

Пример 6. Использование набора реагентов «Вектор ИФА SARS-CoV-2-ΑΤ» в эпидемиологическом расследовании

Для установления в анамнезе пациента диагноза COVID-19 и фазы заболевания образцы сыворотки и плазмы крови пациентов исследовали на содержание специфических антител классов М, G и А к коронавирусу SARS-CoV-2. Для сравнения концентрации антител к SARS-CoV-2 в различных образцах (например, при исследовании парных сывороток) применяют титрование:

Каждый исследуемый образец в трех повторах разводят предварительно 1:10 в РПР-С с использованием планшета для предварительного разведения. Затем предварительно разведенный образец в объеме 20 мкл вносят в верхнюю лунку вертикального ряда планшета-иммуносорбента со 180 мкл РБР-С. Таким образом получаем разведение (титр) образца 1:100. Затем образец перемешивается пипетированием, отбирается 100 мкл и переносится в лунку ниже со 100 мкл РБР-С, затем после перемешивания - в лунку еще ниже со 100 мкл РБР-С и т.д. до восьмой нижней лунки вертикального ряда. Получаем тройную серию последовательных двукратных разведений: х100; х200; х400; х800; х1600; х3200; х6400; х12800 раз. Применив конъюгаты для выявления антител классов М, G и А к сериям разведений одноименного образца (примеры А. Б. и В.), получаем данные по наличию и концентрации специфических антител классов М, G и А для этого образца.

Каждый планшет должен содержать по 1 комплекту лунок (одна со 100 мкл К+ и 2 по 100 мкл К-) для классов М, G и А. Анализ и интерпретация результатов проводятся согласно инструкции по применению «SARS-CoV-2-ИФА-Вектор».

Определение титра специфических антител. По результатам обсчета ОП (оптической плотности) рассчитывают среднее арифметическое значение ОП для данного разведения. Далее согласно Инструкции по применению набора рассчитывают критическую оптическую плотность (ОПкрит) для конъюгата классов М, G и А, которая является верхним пределом фоновых значений отрицательных контролей. Затем производят сравнение среднеарифметических значений ОП разведений с ОПкрит для планшета. Титром сыворотки классов М, G и А будет последнее разведение со значением ОП более ОПкрит.

А. Для проведения расследования были исследованы 35 образцов сыворотки крови сотрудников одного из производственных предприятий. Результаты исследования по титрованию сывороток приведены в таблице 9.

При анализе полученных результатов можно составить представление о давности заболевания конкретного донора образца. Требуется только знание о выраженности симптомов заболевания (или его бессимптомности). Также необходимо принять ранее установленный научный факт выработки специфических IgA через 2-3 суток с момента инфицирования, специфических IgM на 3-5 суток позднее, специфических IgG на 5-10 суток еще позднее; элиминация диагностически значимых количеств антител в той же последовательности за 6-12 месяцев. Например, пациенты под номерами 7, 8, 9, 10 и др. переболели и находятся в стадии реконвалесценции; больные №18, 21, 26 и др. находится в ранней острой фазе заболевания, и т.д.

Таким образом предполагается использование цельновирионного антигена вируса SARS-CoV-2 для определения фазы заболевания COVID-19.

Б. Для оценки развития иммунного ответа у 20 добровольцев после двукратной вакцинации «ЭпиВакКорона» (пр-во ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) проводили забор крови и получение из нее сыворотки. Образцы сыворотки исследовали на наличие специфических антител классов М, G и А титрованием в ИФА с помощью набора реагентов «Вектор ИФА SARS-CoV-2-АТ».

Результаты исследования специфического иммунитета тест-системой «Вектор ИФА SARS-CoV-2-ΑΤ» с набором из трех антивидовых пероксидазных конъюгатов (анти-IgM, анти-IgG и анти-IgA) свидетельствуют о появлении специфических антител хотя бы одного класса во всех образцах добровольцев, вакцинированных двукратно «ЭпиВакКорона».

Пример 7. Использование набора реагентов «Вектор ИФА SARS-CoV-2-ΑΤ» для сравнительного анализа рекомбинантных конструкций - кандидатных вариантов основы вакцины для профилактики COVID-19. Разработанная тест-система «Вектор ИФА SARS-CoV-2-ΑΤ» используется для изучения иммуногенных свойств аналогичных антигенам SARS-CoV-2 генетических конструкций, которые разрабатываются как прототипы вакцин. По результатам оперативного ИФА делается отбор наиболее перспективных белков с целью их применения в качестве иммуногена вакцин.

С целью оценки иммуногенности белков создана рабочая панель сывороток крови, содержащих и не содержащих IgG к коронавирусу SARS-CoV-2. Содержащие специфические антитела образцы получены от реконвалесцентов COVID-19 спустя 4-6 месяцев с начала заболевания. Срок и класс антител гарантируют их продукцию наиболее эффективными В-лимфоцитами - клетками памяти. Не содержащие специфические антитела образцы принадлежат донорам с гетерологичными заболеваниями.

Для сравнительного анализа были предоставлены три конструкции: аналогичная последовательностям домена S1 белка Spike, аналогичная последовательностям S2 белка Spike и аналогичная тримеру белка Spike без трансмембранного домена.

В ИФА с использованием пероксидазного коньюгата анти-IgG человека с набором «Вектор ИФА SARS-CoV-2-ΑΤ» были получены результаты (ОП, о.е.), приведенные в таблице 10. В таблице 11 приведены результаты ИФА, как отношение каждого положительного образца к усредненному фоновому значению для данного белка.

На основании проведенного анализа было сделано заключение об однозначно большей перспективности конструкции белка S2 для использования в качестве компонента вакцины.

Таким образом, выше приведенные примеры 4-7 использования заявляемой тест-системы подтверждают достижение заявляемого технического результата, заключающегося в повышении чувствительности созданной тест-системы (набора реагентов) для двухстадийного твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) за счет использования цельновирионного антигена.

Claims

1. Штамм hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 вируса SARS-CoV-2 для получения цельновирионного антигена - компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов М, G и А к вирусу SARS-CoV-2, депонированный в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-1034.

2. Иммуносорбент для определения антител классов М, G и А к вирусу SARS-CoV-2 в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентов COVID-19, характеризующийся тем, что представляет собой планшет 96-луночный, разборный, выполненный из полистирола, в лунках которого сорбирован цельновирионный антиген вируса SARS-CoV-2, используемый в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов М, G и А к вирусу SARS-CoV-2, полученный из культуральной жидкости, содержащей штамм hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 вируса SARS-CoV-2 по п. 1 с титром не менее 5×10⁷ ЦПД₅₀/мл путем осаждения вируса центрифугированием, очистки антигена от примесей ультрацентрифугированием и его инактивации химическим реагентом с получением очищенного антигена в количестве не менее 2 мкг/мл, чистотой не менее 90% и диагностической чувствительностью не менее 96,9%.

3. Тест-система для иммуноферментного определения содержания антител классов М, G и А к вирусу SARS-CoV-2 в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентов COVID-19, содержащая иммуносорбент по п. 2, набор реагентов, концентрат конъюгата моноклональных мышиных антител к IgG, или IgM, или IgA человека, конъюгированных с пероксидазой хрена для определения содержания антител классов М, G и А к вирусу SARS-CoV-2.

4. Тест-система по п. 3, отличающаяся тем, что набор реагентов содержит положительный контроль (К+), отрицательный контроль (К-), раствор для разведения образцов (РРО), раствор для разведения конъюгата, ТМБ-хромоген, концентрат промывочного раствора, стоп-реагент.