RU2801178C1

RU2801178C1 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА IGA2m1-ИЗОТИПА В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Info

Publication number: RU2801178C1
Application number: RU2022135380A
Authority: RU
Inventors: Виктория Александровна Топорова; Мария Викторовна Ларина; Теймур Кантамирович Алиев; Виктория Витальевна Аргентова; Дмитрий Александрович Долгих; Михаил Петрович Кирпичников
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-08-03

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана рекомбинантная плазмидная ДНК pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht, кодирующая нейтрализующее моноклональное антитело P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 изотипа IgA2m1, содержащая интронированный ген тяжелой цепи антитела с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2, кодируюшей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, находящийся под контролем промотора hEF1-HTLV с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:6 и сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста BGH polyA с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:7, ген легкой цепи антитела с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:4, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, находящийся под контролем промотора CMV с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:5, сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса цепей антитела, а также селективный маркер, обеспечивающий отбор трансфецированных эукариотических клеток, при этом промоторы hEF1-HTLV и CMV размещены в последовательности, обеспечивающей однонаправленную транскрипцию. Также описан способ получения линии эукариотических клеток CHO DG44/pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht продуцента нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 изотипа IgA2m1 путем трансфекции клеток яичника китайского хомячка СНО описанными рекомбинантными плазмидными ДНК. Представлена линия эукариотических клеток CHO DG44/pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht - продуцент нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 изотипа IgA2m1. Также представлен способ получения нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 изотипа IgA2m1, включающий: культивирование в питательной среде указанных линий клеток, выделение полученного целевого антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 изотипа IgA2m1 из культуральной жидкости. В результате трансфекции клеток СНО DG44 сконструированной рекомбинантной плазмидой pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht, последующего культивирования на ростовой среде и отбора колоний, устойчивых к метотрексату, получены культуры клеток, стабильно продуцирующие в культуральную жидкость нейтрализующие моноклональные антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 изотипа IgA2m1 с выходом 16.6 мкг в мл кондиционированной среды. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 4 пр.

Description

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности предложена рекомбинантная плазмидная ДНК, позволяющая осуществлять транскрипцию и трансляцию кодирующей последовательности генов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина А для последующего получения линий клеток, экспрессирующих антитела изотипа A2m1, которые могут быть использованы при производстве терапевтических средств (препаратов и вакцин), в том числе против вируса SARS-CoV-2 (2019-nCoV).

Уровень техники

В литературе описано несколько способов получения рекомбинантных иммуноглобулинов А в животных клетках и создания культур - продуцентов антител на основе клеток грызунов и приматов, например, на основе линии клеток СНО (клетки яичника китайского хомячка).

Известна плазмида, созданная на основе pEE14.4, содержащая промотор и энхансер гена hCMV-MIE, включая 5'-нетранслируемую последовательность и первый интрон, лидерный пептид HAVT20, вариабельный домен легкой цепи антитела 225 против рецептора эпидермального фактора роста человека EGF-R, константный домен легкой каппа-цепи человека, сайт полиаденилирования и, в качестве селективного маркера на безглутаминовой среде, ген глутамин-синтетазы под контролем слабого позднего промотора вируса SV40. Известна плазмида, созданная на основе pEE14.4, содержащая промотор и энхансер гена hCMV-MIE, включая 5'-нетранслируемую последовательность и первый интрон, лидерный пептид HAVT20, вариабельный домен тяжелой цепи антитела 225 против EGF-R, ген констанных доменов тяжелой α1-цепи человека (или α2-цепи в варианте для IgA2(m1)), сайт полиаденилирования и ген глутамин-синтетазы под контролем слабого позднего промотора вируса SV40 в качестве селективного маркера на безглутаминовой среде. Полученные с помощью ко-трансфекции в клетках CHO-K1 стабильные клеточные линии обеспечивали продукцию мономерных IgA1 и IgA2 в суспензионной культуре в бессывороточной среде с выходом 2,2 пикограмм/клетку/день [Beyer T, Lohse S, Berger S, Peipp M, Valerius T, Dechant M. Serum-free production and purification of chimeric IgA antibodies. J Immunol Methods. 2009 Jul 31;346(1-2):26-37. doi: 10.1016/j.jim.2009.05.002. Epub 2009 May 7. PMID: 19427867.].

Известна плазмида, полученная на основе вектора pIR-ESpuro3 (Clontech, Mountain View, CA), содержащая ранний промотор и энхансер цитомегаловируса человека Р_{CMV IE}, ген J-цепи человека с гексагистидиновой последовательностью на N-конце (кодирующая последовательность 6 гистидинов взята из вектора pcDNA6His (Invitrogen)), синтетический интрон IVS, внутренный сайт посадки рибосом вируса энцефаломиокардита IRES, ген пуромицин-N-ацетил-трансферазы Puro^r и ранний сигнал полиаденилирования вируса SV40. Котрансфекция этой плазмидой клонов, хорошо продуцирующих антитела 225-IgA против EGF-R, обеспечивает продукцию димеров 225-IgA, связанных с J-цепью, в суспензионной культуре в бессывороточной среде в клетках (CHO)-K1 с выходом 200.8 (673.3) и 295.2 (6139.5) мг/мл для мономерной и димерной форм 225-IgA1 [Lohse S, Derer S, Beyer T, Klausz K, Peipp M, Leusen JH, van de Winkel JG, Dechant M, Valerius T. Recombinant dimeric IgA antibodies against the epidermal growth factor receptor mediate effective tumor cell killing. J Immunol. 2011 Mar 15;186(6):3770-8. doi: 10.4049/jimmunol.1003082. Epub 2011 Feb 11. PMID: 21317397.].

Известна плазмида pEF-dhfr2a-NEO-IGA-chi-H, содержащая кодирующую последовательность вариабельного домена тяжелой цепи мышиного антитела HA-9 против вируса птичьего гриппа H5N1, кодирующую последовательность константных доменов IgA2 антител человека из pGEM-T-Easy-IGHA с интронами, ген устойчивости к неомицину Neo^R и ген дигидрофолатредуктазы dhfr, промоторы CMV и фактора элонгации 1 человека (EF1)-α, искусственный интрон перед и поздний сайт полиаденилирования SV40 poly (A) после гена цепи антитела. Известна плазмида pEF-dhfr2a-NEO-IGA-Kappa, содержащая кодирующую последовательность вариабельного домена легкой цепи мышиного антитела HA-9 против вируса птичьего гриппа H5N1, кодирующую последовательность константного домена каппа легкой цепи антител человека из pGEM-T-Easy-CK, устойчивости к неомицину Neo^R и ген дигидрофолатредуктазы dhfr, промоторы CMV и фактора элонгации 1 человека (EF1)-α, искусственный интрон перед и поздний сайт полиаденилирования SV40 poly (A) после гена цепи антитела. Обе плазмиды обеспечивают продукцию химерного антитела IgA2 HA-9 против вируса птичьего гриппа H5N1 при котрансфекции в клетки CHO/dhfr- в суспензионной культуре в бессывороточной среде. Известна плазмида pcDNA4/His A-IgJ, содержащая ген J-цепи антител IgJ. Известна плазмида pcDNA4/HisA-SC, содержащая ген секреторного компонента (состоит из первых 585 аминокислот полимерного рецептора иммуноглобулинов pIgR человека). Обе плазмиды обеспечивают продукцию секреторного варианта химерного антитела IgA2 HA-9 против вируса птичьего гриппа H5N1 при котрансфекции в клетки CHO/dhfr-, продуцироющие мономерный вариант в суспензионной культуре в бессывороточной среде с выходом 25 мг/л супернатанта [Li C, An X, Butt AM, Zhang B, Zhang Z, Wang X, Huang Y, Zhang W, Zhang B, Mi Z, Tong Y. Construction of a chimeric secretory IgA and its neutralization activity against avian influenza virus H5N1. J Immunol Res. 2014;2014:394127. doi: 10.1155/2014/394127. Epub 2014 Feb 13. PMID: 24741594; PMCID: PMC3987799.].

Известна плазмида, полученная на основе pFUSE2ss-CLIg-hK (InvivoGen), содержащая гибридный промотор hEF1-HTLV, сигнальную последовательность интерлейкина-2 человека, кодирующую последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела 9F4 против вирусов гриппа H5N1, ген константного каппа-домена легкой цепи антитела человека, сигнал полиаденилирования SV40 pAn, ген устойчивости к бластицидину под контролем гибридного промотора CMV enh / hFerL и сайта полиаденилирования бета-глобина человека βGlo pAn в качестве селективного маркера [Tze-Minn Mak, Brendon J. Hanson, Yee-Joo Tan. Chimerization and characterization of a monoclonal antibody with potent neutralizing activity across multiple influenza A H5N1 clades. // Antiviral Res. 2014 Jul;107:76-83. doi: 10.1016/j.antiviral.2014.04.011].

Известна плазмида, полученная на основе pFUSEss-CHIg-hA1 (InvivoGen), содержащая гибридный промотор hEF1-HTLV, сигнальную последовательность интерлейкина-2 человека, кодирующую последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела 9F4 против вирусов гриппа H5N1, кодирующую последовательность константных доменов тяжелой цепи антитела человека IgA1, сигнал полиаденилирования SV40 pAn, ген устойчивости к зеоцину под контролем гибридного промотора CMV enh / hFerL и сайта полиаденилирования бета-глобина человека βGlo pAn в качестве селективного маркера. При транзиентной котрансфекции клеток 293FT обе плазмиды обеспечивали продукцию химерного антитела против вирусов гриппа H5N1 xi-IgA1-9F4 [Tze-Minn Mak, Brendon J. Hanson, Yee-Joo Tan. Chimerization and characterization of a monoclonal antibody with potent neutralizing activity across multiple influenza A H5N1 clades. // Antiviral Res. 2014 Jul;107:76-83. doi: 10.1016/j.antiviral.2014.04.011].

Известна плазмида pYR-GCEVH, содержащая тяжелую цепь антитела HCAb к раку кишечника человека, и плазмида pYR-GCEVL, содержащая легкую цепь антитела к раку кишечника человека [Xiong H, Ran Y, Xing J, Yang X, Li Y, Chen Z. Expression vectors for human-mouse chimeric antibodies. J Biochem Mol Biol. 2005 Jul 31;38(4):414-9. doi: 10.5483/bmbrep.2005.38.4.414. PMID: 16053708.]. Плазмида pYR-GCEVL включает в себя ген устойчивости к неомицину/генетицину под управлением раннего промотора вируса SV40 с удаленным энхансером. Транскрипция гена легкой цепи находится под контролем CMV на 5' конце и терминатора бычьего гормона роста (BGHT), на 3' конце находится сайт полиаденилирования. Плазмида pYR-GCEVH включает в себя ген dhfr под управлением раннего промотора вируса SV40. Транскрипция гена легкой цепи находится под контролем CMV на 5' конце и терминатора бычьего гормона роста (BGHT), на 3' конце находится сайт полиаденилирования. Культура клеток dhfr (−) CHO (ATCC, США), дефицитных по дигидрофолатредуктазе (ДГФР), была ко-трансфецирована с использованием равных количеств плазмид pYR-GCEVH, pYR-GCEVL. После проведения нескольких раундов селекции была получена культура, клоны которой имели продукцию химерных антител против рака кишечника человека от 30 до 100 и более мкг/мл кондиционированной среды [Xiong и др., 2005].

Известны плазмиды pOptiVEC-L и pcDNA3.3-L, содержащие в своем составе ген легкой цепи антитела против ФНО-альфа человека [Radko BV, Boitchenko VE, Nedospasov SA, Korobko VG. Characterization of the genes encoding variable light and heavy chains of the high-affinity monoclonal antibody against human tumor necrosis factor. Russ J Immunol. 2002 Dec;7(4):371-4. PMID: 12687250.] под контролем промотора CMV, а также OptiVEC-H, pcDNA3.3-H, содержащие в своем составе ген легкой цепи антитела против ФНО-альфа человека под контролем промотора CMV. Плазмиды pcDNA3.3-L и pcDNA3.3-H содержат в своем составе также ген устойчивости к селективному антибиотику G418, а плазмиды pOptiVEC-L и pOptiVEC-H содержат в своем составе также миниген ДГФР мыши. После трансфекции экспрессирующими векторами pOptiVEC-L и pcDNA3.3-H клеток линии CHO DG44 и селекции в среде без нуклеотидов получен клон клеток, секретирующий химерные антитела против ФНО-альфа человека в среду культивирования с выходом 2 мкг на мл кондиционированной среды. Путем проведения нескольких раундов амплификации в присутствии возрастающих концентраций метотрексата и селективного антибиотика G418 была получена линия-продуцент, стабильно секретирующая химерные антитела против ФНО-альфа человека с выходом до 24,5 мкг/мл. [Балабашин Д.С., Зайцева-Зотова Д.С., Топорова В.А., Панина А.А., Марквичева Е.А., Свирщевская Е.В., Алиев Т.К. Способы увеличения продукции рекомбинантных антител в клеточных линиях CHO DG44 // Современные проблемы науки и образования. - 2011. - № 5.].

Недостатком данного продуцента, в котором используются 2 различные плазмиды, имеющие в своем составе гены тяжелой и легкой цепей антитела является то, что интегрированные в них гены цепей антител против ФНО-альфа человека находятся в клетке под контролем одинаковых промоторов и терминаторов. Также различные генетические маркеры, позволяющие за счет селективного давления увеличивать продукцию cis-ориентированных генов в клетках-продуцентах, имеют различную активность, что может влиять на количество экспрессируемого белкового продукта каждой из плазмид. Данное обстоятельство может изменять соотношение легкой и тяжелой цепей, и приводить к токсичности белкового продукта для клеток-продуцентов. При использовании метода селекции клеточной линии-продуцента с помощью метотрексата увеличение уровня экспрессии будет происходить только для той цепи антитела, которая находится в непосредственной близости от селективного маркера, гена ДГФР.

Известно нейтрализующее моноклональное антитело P4A1, специфичное к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV), идентифицированое у выздоравливающих пациентов с COVID-19, взаимодействующее непосредственно с рецептор-связывающим мотивом рецептор-связывающего домена (RBD) шиповидного белка Spike и покрывает его большую часть, что показано анализом сложной структуры с высоким разрешением. P4A1 демонстрирует связывающую и нейтрализующую активность против дикого типа и мутантных белков Spike или псевдовирусов. P4A1 связывается с субъединицей S1 с наномолярной IC₅₀, но не связывается с субъединицей S2, блокируя при этом связывание субъединицы S1 с клетками, экспрессирующими ACE2, со значениями IC₅₀ в наномолярном диапазоне концентраций. P4A1 нейтрализовал живую инфекцию SARS-CoV-2 клеток Vero E6 со значением 50% нейтрализующей дозы (ND₅₀) 5,212 нМ. Сконструированное для снижения потенциального риска антителозависимого усиления инфекции и увеличения периода его полужизни антитело P4A1 изотипа IgG4 (названное как P4A1-2A) обладает оптимизированным профилем фармакокинетики и безопасности и приводит к полной элиминации вируса в модели COVID-19 на макаках-резусах после однократной инъекции, что свидетельствует о его потенциале против заболеваний, связанных с SARS-CoV-2 [Guo, Y., Huang, L., Zhang, G. et al. A SARS-CoV-2 neutralizing antibody with extensive Spike binding coverage and modified for optimal therapeutic outcomes. Nat Commun 12, 2623 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-22926-2]. кДНК вариабельных доменов этого антитела были клонированы в экспрессионные векторы IgG4 и Igk и экспрессированы путем транзиентной трансфекции суспензионной культуры клеток CHO.K1 (ATCC, No. CCL 61). Эти антитела и их фрагменты потенциально могут быть использованы для диагностики и терапии коронавирусной инфекции [Патент WO/2021/257695 A61K 38/00 2006.1, опубл. 23.12.2021г.]. Последовательности вариабельных доменов данного антитела использованы в качестве примера.

Известна плазмида pBiPr-ABTNF [Патент RU 2555533 С2, C12N 15/13 (2006.01), опубл. 27.11.2014, прототип по конструированию], кодирующая химерное антитело против фактора некроза опухолей-альфа человека (ФНО-альфа) изотипа IgG1, созданная на основе плазмиды pOptiVEC™-TOPO®. Трансфецированная этой плазмидой линия эукариотических клеток осуществляет продукцию антитела против ФНО-альфа на уровне 90 мг/л. Наличие в плазмиде pBiPr-ABTNF активного гена ДГФР, находящегося под контролем IRES, позволяет проводить селекцию и амплификацию чужеродных последовательностей, интегрированных в геном клетки СНО DG44 (dhfr-/- вариант линии клеток СНО-K1), в среде, содержащей метотрексат. Сочетание процессов трансфекции, селекции и амплификации позволяет получить линию клеток продуцентов CHO-S11, содержащую в своем геноме интегрированные копии генов химерного антитела против ФНО-альфа человека и стабильно секретирующую рекомбинантные антитела в культуральную жидкость. Наличие генов тяжелой и легкой цепей антитела в составе одной плазмиды позволяет осуществлять одновременную амплификацию генов легкой и тяжелой цепей рекомбинантного антитела, встроенных в геном клеток СНО, при воздействии метотрексатом. Недостатком плазмиды является то, что эта плазмида позволяет получать антитела только изотипа G1 и только против фактора некроза опухолей-альфа человека.

Известна плазмида pBiPr-ABIgA1FI6-ht [Патент RU2656142C1, C12N 15/13 (2006.01), опубл. 31.05.2018, прототип по конструированию], кодирующая человеческое антитело к гемагглютинину вируса гриппа А человека изотипа IgA1, созданная на основе плазмиды pOptiVEC™-TOPO®. Трансфецированная этой плазмидой линия эукариотических клеток осуществляет продукцию человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А человека на уровне 3,6 мг/л. Наличие в плазмиде активного гена ДГФР, находящегося под контролем IRES, позволяет проводить селекцию и амплификацию чужеродных последовательностей, интегрированных в геном клетки СНО DG44 (dhfr-/- вариант линии клеток СНО-K1), в среде, содержащей метотрексат. Сочетание процессов трансфекции, селекции и амплификации позволяет получить линию клеток продуцентов CHO, содержащую в своем геноме интегрированные копии генов человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А человека изотипа IgA1 и стабильно секретирующую рекомбинантные антитела в культуральную жидкость. Наличие генов тяжелой и легкой цепей антитела в составе одной плазмиды позволяет осуществлять одновременную амплификацию генов легкой и тяжелой цепей рекомбинантного антитела, встроенных в геном клеток СНО, при воздействии метотрексатом. Недостатком плазмиды является то, что эта плазмида позволяет получать антитела только изотипа IgA1 и только против гемагглютинина вируса гриппа А.

Возникшая необходимость получения антител изотипа IgA2m1 приводит к созданию сходной бипромоторной рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей получение антител изотипа IgA2m1. В качестве вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей используются вариабельные домены атитела P4A1 [Патент WO/2021/257695 A61K 38/00 2006.1, опубл. 23.12.2021г.] как имеющие потенциальное терапевтическое значение. Кроме того, в ходе создания плазмиды получаются варианты как с однонаправленной, так и с разнонаправленной транскрипцией генов тяжелой и легкой цепей антитела. В литературе данные по влиянию взаимной ориентации транскрипции генов антител изотипа IgA2m1 не найдены, что приводит к необходимости как разработки способов дифференцирования клонов по взаимному направлению транскрипции генов, так и изучения влияния однонаправленной и разнонаправленной транскрипции генов на уровень продукции антител изотипа IgA2m1. Также не найдены в литературе данные по изучению влияния наличия или отсутствия интронов в гене константных доменов тяжелой цепи антитела изотипа IgA2m1 на уровень экспрессии целевого антитела, что приводит к созданию бипромоторной рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей получение антител изотипа IgA2m1 и содержащей интронированный вариант гена IgA2m1. В дальнейшем эти данные могут позволить оптимизировать работу по получению рекомбинантных плазмид и клеточных культур, экспрессирующих другие антитела изотипа IgA2m1.

Список иллюстраций

Фиг. 1 показана схематическая структура промежуточной плазмиды pOpti-LP4A1-MluI. CMV promoter - промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека, VL и CL - вариабельная и константная области гена легкой цепи нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV), соответственно, EMCV IRES - внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита, DHFR - ген дигидрофолатредуктазы, TK pA - сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса, MluI, NheI, XhoI - сайты узнавания соответствующих рестриктаз.

Фиг. 2 показана структура полученной промежуточной плазмиды pSK-EF1-P4A1HA2m1-Int-BGH. hEF1-HTLV promoter - гибридный промотор из плазмиды pMG, состоящий из промотора фактора элонгации EF-1a и 5'-нетранслируемой области вируса Т-клеточной лейкемии человека HTLV, BGH - сигнал полиаденилирования BGH из плазмиды pBudCE4.1, VH и CH - вариабельная и константная (интронированный вариант) области гена легкой цепи нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 изотипа IgA2m1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV), соответственно, MluI, NheI, XhoI - сайты узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции.

Фиг. 3 показана структура полученных плазмид pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Inthh и pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht. hEF1-HTLV promoter - гибридный промотор из плазмиды pMG, состоящий из промотора фактора элонгации EF-1a и 5'-нетранслируемой области вируса Т-клеточной лейкемии человека HTLV, VH и CH - вариабельная и константная (интронированный вариант) области гена легкой цепи нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 изотипа IgA2m1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV), соответственно, BGH - сайт полиаденилирования BGH из плазмиды pBudCE4.1, CMV promoter - промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека, VL и CL - вариабельная и константная области гена легкой цепи нейтрализующего моноклонального антитела P4A1, соответственно, EMCV IRES - внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита, DHFR - ген дигидрофолатредуктазы, TK pA - сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса, MluI, NheI, XhoI - сайты узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции.

Фиг. 4 показано влияние различной ориентации генов тяжелой и легкой цепей («голова-голова» и «голова-хвост») в экспрессионных плазмидах для продукции нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 изотипа IgA2m1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) в клеточной линии CHO DG44. IgA hh - pBiPr-ABIgA2m1P4A1-hh, IgA ht - pBiPr-ABIgA2m1P4A1-ht, IgA Ihh - pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Inthh, IgA Iht - pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения, является создание рекомбинантной плазмиды для получения нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 изотипа IgA2m1, специфичного к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV).

Сконструированная рекомбинантная плазмидная ДНК pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht содержит:

- фрагмент плазмиды pOptiVEC™-TOPO®, включающий промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV), ген ДГФР, сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса TK pA, сайт начала репликации в E. coli из плазмиды pUC, ген β-лактамазы, а также следующие модификации - единичный сайт узнавания рестриктазы MluI вместо сайта узнавания рестриктазы SalI в положении 23, единичные сайты узнавания рестриктаз NheI и XhoI после промотора CMV для клонирования ДНК легкой цепи антитела;

- фрагмент ДНК, включающий фланкированную сайтами рестрикции NheI и XhoI кДНК легкой цепи типа каппа нейтрализующего моноклонального антитела P4A1, специфичного к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) [Патент WO/2021/257695 A61K 38/00 2006.1, опубл. 23.12.2021г.] под контролем промотора/энхансера ранних генов цитомегаловируса человека (CMV);

- MluI/MluI - фрагмент ДНК, содержащий ДНК тяжелой цепи нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 изотипа IgA2m1, специфичного к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) [Патент WO/2021/257695 A61K 38/00 2006.1, опубл. 23.12.2021г.], в интронированном варианте под контролем гибридного промотора hEF1-HTLV и сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста BGH polyA. Фрагмент ориентирован так, что транскрипция с промоторов hEF1-HTLV и CMV идет однонаправлено.

Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht, характеризующуюся тем, что в ней содержится фрагмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 изотипа IgA2m1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 (сигнальный пептид составляет первые 19 аминокислотных остатков).

Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht, характеризующуюся тем, что фрагмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 изотипа IgA2m1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) в интронированном варианте, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2.

Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризующуюся тем, что в ней содержится фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 (сигнальный пептид составляет первые 20 аминокислотных остатков).

Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризующуюся тем, что фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV), имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:4.

Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризующуюся тем, что указанный промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека (CMV) имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5.

Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризующуюся тем, что указанный гибридный промотор hEF1-HTLV имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:6.

Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризующуюся тем, что указанный сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста BGH polyA имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7.

Поставленная задача также решается способом получения культуры клеток яичника китайского хомячка СНО - продуцента иммуноглобулина А изотипа IgA2m1 нейтрализующего моноклонального антитела P4A1, специфичного к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV), путем трансфекции клеток упомянутой выше рекомбинантной плазмидной ДНК pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht.

Также поставленная задача решается линией клеток яичника китайского хомячка СНО - продуцента нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 изотипа IgA2m1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV), полученной путем трансфекции линии клеток СНО DG44 упомянутой выше рекомбинантной плазмидной ДНК pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht.

Поставленная задача также решается способом получения нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 изотипа IgA2m1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV), включающим:

-культивирование в питательной среде упомянутых выше линий клеток,

-выделение полученного целевого белка из культуральной жидкости.

Технический результат заключается в стабильной коэкспрессии генов тяжелой и легкой цепей антитела под давлением одного селективного маркера и достигается за счет однонаправленной транскрипции генов тяжелой (в интронированном варианте) и легкой цепей антитела нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 изотипа IgA2m1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) клетками-продуцентами СНО при использовании полученной рекомбинантной плазмидной ДНК pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht с выходом до 16,6 мг/л культуральной среды.

Наличие в плазмиде pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht активного гена ДГФР, находящегося под контролем IRES, позволяет проводить селекцию и амплификацию чужеродных последовательностей, интегрированных в геном клетки CHO DG44 (dhfr-/- вариант линии клеток CHO-K1), в среде, содержащей метотрексат. Сочетание процессов трансфекции, селекции и амплификации позволяет получить линию клеток продуцентов CHO DG44/pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht, содержащую в своем геноме интегрированные копии генов нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) и стабильно секретирующие рекомбинантные антитела изотипа IgA2m1 в культуральную жидкость. Наличие генов тяжелой и легкой цепей антитела в составе одной плазмиды позволяет осуществлять одновременную амплификацию генов легкой и тяжелой цепей рекомбинантного антитела, встроенных в геном клеток СНО, при воздействии метотрексатом.

Преимущество предлагаемого изобретения заключается в том, что культуры, трансфецированные плазмидой pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht, значительно быстрее проходят процедуру селекции с использованием метотрексата в концентрации до 200 нМ в сравнении с культурой, трансфецированной двумя отдельными плазмидами, которой необходимы котрансфекция и дополнительный этап селекции с помощью добавления 500 мкг на мл питательной среды селективного антибиотика генетицина (G418). Линия-продуцент CHO DG44/pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht отличается от линии клеток CHO DG44 по признакам, передаваемым последовательностями ДНК, использованными для трансфекции, т.е. является устойчивой к высоким дозам метотрексата (200 нМ), и синтезирует рекомбинантные нейтрализующие антитела P4A1 изотипа IgA2m1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) с выходом до 16,6 мг/л культуральной среды. Наличие интронов позволяет достигнуть выхода 16.6 мг/л за трое суток культивирования вместо 14 в случае неинтронированного варианта гена тяжелой цепи.

Продукция антител может быть осуществлена в эукариотических клетках. Примером эукариотической клетки, пригодной для продукции полноразмерного антитела, согласно настоящему изобретению являются, но не ограничиваются ими, клетки яичников Cricetulus griseus (CHO). Фраза “клетки яичников Cricetulus griseus” означает, что указанные эукариотические клетки классифицируют как клетки яичников C. griseus (CHO) в соответствии с классификацией, известной специалисту в данной области биотехнологии. Примерами клеток яичников Cricetulus griseus (CHO), применимых в рамках настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, клетки яичников Cricetulus griseus (CHO) клетки CHO DG44 (Invitrogen).

Предложенная рекомбинантная плазмида pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht и способ получения линии культивируемых клеток CHO, основанный на использовании рекомбинантной плазмиды pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht, впервые получены авторами данного изобретения, в научной и патентной литературе не описаны. Кроме того, нуклеотидная последовательность вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела P4A1 получена отличным от прототипа способом. Также большая часть использованных праймеров впервые разработана для получения данной плазмиды и ранее не встречались в литературе. Наличие интронов в кодирующей последовательности гена тяжелой цепи антитела позволяет повысить уровень продукции антител и сократить время культивирования.

Осуществление изобретения

В частном варианте воплощения настоящего изобретения указанная плазмида pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht может представлять собой плазмиду, кодирующую полипептиды со свойствами тяжелой и легкой цепей нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) изотипа IgA2m1 с молекулярной массой 2,9 Md (8,092 т.п.о.), и, например, состоять из:

фрагмента плазмиды pOptiVEC™-TOPO® длиной 4,402 т.п.о., включающего промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), обеспечивающий высокий уровень экспрессии целевых белков в клетках млекопитающих, внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV) для кэп-независимой трансляции гена ДГФР, ген ДГФР для ауксотрофной селекции трансфецированных клеток СНО DG44 и геномной амплификации стабильных клеточных линий с использованием метатрексата, сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса TK pA для правильной терминации и процессинга рекомбинантных транскриптов, сайт начала репликации в E. coli из плазмиды pUC, ген β-лактамазы, а также следующие модификации - единичный сайт узнавания рестриктазы MluI вместо сайта узнавания рестриктазы SalI в положении 23, единичные сайты узнавания рестриктаз NheI и XhoI после промотора CMV для клонирования кДНК легкой цепи антитела;

NheI/XhoI - фрагмента ДНК длиной 0,708 т.п.о., включающего фланкированную сайтами рестрикции NheI и XhoI кДНК легкой каппа цепи нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

MluI/MluI - фрагмента ДНК длиной 2,670 т.п.о., включающего гибридный промотор hEF1-HTLV из плазмиды pMG, интронированный вариант гена тяжелой цепи нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) изотипа IgA2m1 в интронированном варианте и сигнал полиаденилирования гена фактора роста быка BGH polyA из плазмиды pBudCE4.1. Фрагмент ориентирован так, что транскрипция с промоторов hEF1-HTLV и CMV идет однонаправлено.

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения полноразмерного нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 изотипа IgA2m1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV), включающий выращивание транcформированных клеток эукариот в питательной среде и выделение полученных антител из культуральной жидкости. В настоящем изобретении выращивание, накопление и очистка антител из культуральной жидкости может быть осуществлена методом, сходным с традиционными методами ферментации, когда некий белок производится с использованием трансформированных клеток.

Выращивание клеток эукариот осуществляют в атмосфере 8% СО₂ в CO₂-инкубаторе при 37°C и 96% влажности в режиме культивирования с перемешиванием в синтетических средах, таких как среда OptiCHO или среда CD DG44 (Invitrogen, USA), в течение 3-6 суток.

После выращивания твердые компоненты, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрации с использованием мембраны, а затем антитела могут быть выделены и очищены методом осаждения с солями, с использованием сульфата натрия или сульфата аммония, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и т.п.

Предложенная рекомбинантная плазмида pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht и способ получения линии культивируемых клеток CHO, основанный на использовании рекомбинантной плазмиды pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht, впервые получены авторами данного изобретения, в научной и патентной литературе не описаны. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела P4A1, получена отличным от прототипа способом и отличается от опубликованной в прототипе по сайтам узнавания рестриктаз. Также большая часть использованных праймеров впервые разработана для получения данной плазмиды и ранее не встречались в литературе.

Ниже следуют примеры осуществления предлагаемого изобретения.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pBiPr-ABIgA2m1P4A1-ht.

Пример 1a. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pOpti-LP4A1-MluI.

Кодирующая последовательность легкой цепи антитела P4A1 [Guo, Y., Huang, L., Zhang, G. et al. A SARS-CoV-2 neutralizing antibody with extensive Spike binding coverage and modified for optimal therapeutic outcomes. Nat Commun 12, 2623 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-22926-2] была составлена, исходя из аминокислотной и нуклеотидной последовательности легкой цепи антитела P4A1 [Патент WO/2021/257695 A61K 38/00 2006.1, опубл. 23.12.2021г.] и сайтов узнавания рестриктаз. Для получения кодирующей последовательности используются олигонуклеотидные праймеры (структура праймеров приведена в Таблице 1). Данные олигонуклеотидные праймеры (кроме CMV forward и EMCV IRES reverse M) разработаны для получения составленной последовательности и ранее в литературе не встречались.

Таблица 1 Праймеры для получения кодирующей последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антитела P4A1. В скобках указана длина олигонуклеотидов, сайты узнавания рестриктаз подчеркнуты.

	LkapXhoIR1	5'-GGGCTCGAGCTATTAGCATTCTCCTCGGTTAAAGC-3'	(35b)
	P4A1-LNheIF	5'-CCCGCTAGCGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCC-3'	(37b)
	P4A1-HNheIF	5'-CCCGCTAGCGCCGCCACCATGGGATGGTCATGTATC-3'	(36b)
	P4A1-HSacIR	5'-GGAAGGGCCCTTGGTACTGGCGGAGCTCACAGTGACCAGGGT-3'	(42b)
	CMV forward	5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'	(21b)
	EMCV IRES reverse M	5'-GCCTTATTCCAAGCGGCTTCGG-3'	(22b)

Праймеры CMV forward и EMCV IRES reverse M (№№ 5 и 6) являются коммерческими, остальные синтезированы для этой работы и ранее в литературе не встречались.

Кодирующую последовательность легкой цепи получают методом ПЦР на матрице плазмиды с составленной последовательностью с полимеразой Pfu со специфическими олигонуклеотидными праймерами P4A1-LNheIF и LkapXhoIR1, при этом на 5'-конец гена вводят сайт узнавания рестриктазы NheI, а на 3'-конец - сайт XhoI. Реакцию проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 94°С, 30 сек; отжиг - 50°С, 40 сек; элонгация - 72°С, 2 мин; 30 циклов. Фрагменты очищают с помощью электpофоpеза в 1 % легкоплавкой агаpозе и выделения фрагментов из геля. После обработки ПЦР-фрагмента соответствующими рестриктазами кодирующую последовательность легкой цепи антитела клонируют в вектор pOpti-F10L-MluI [Патент RU 2555533 С2, C12N 15/13 (2006.01), опубл. 27.11.2014] по сайтам узнавания рестриктаз NheI и XhoI.

Отбирают плазмидные ДНК, содержащие нужный набор рестрикционных фрагментов. Определяют нуклеотидную последовательность отобранных клонов промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pOpti-LP4A1-MluI секвенированием по двум цепям по методу Сэнгера. Структура полученной промежуточной плазмиды pOpti-LP4A1-MluI приведена в Фиг. 1.

Пример 1б. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмиды pAL-2T-IgA2m1.

Наиболее эффективным способом получения константного домена тяжелой цепи изотипа IgA2m1 является амплификация экзонов соответствующего гена с использованием хромосомной ДНК в качестве матрицы. Ген находится в кластере генов иммуноглобулинов в области 14q32.33 хромосомы 14 человека и содержит три экзона. Анализ последовательностей на наличие сайтов узнавания рестриктаз показывает, что последовательность IgA2m1 не содержит сайт узнавания рестриктазы SacI, что можно использовать для подстыковки гена к кодирующей последовательности вариабельного домена тяжелой цепи антитела P4A1. Сайт SacI и последовательность CG для восстановления рамки считывания вносятся на 5'-конец кодирующей последовательности IgA2m1 с помощью ПЦР. Структура олигонуклеотидных праймеров, использованных для амплификации экзонов, приведена в Таблице 2. Все приведенные на рисунке праймеры разработаны для получения данной последовательности и ранее не встречались в литературе. Ожидаемые при амплификации размеры ДНК-фрагментов приведены в Таблице 3.

Фрагменты, содержащие экзоны гена IgA2m1, получают с помощью ПЦР c полимеразой Taq на матрице хромосомной ДНК человека из двух образцов. Реакцию проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 95°С, 30 сек; отжиг - 50°С, 40 сек; элонгация - 72°С, 2 мин; 30 циклов.

Результатом всех проведенных ПЦР-амплификаций является получение ДНК-фрагментов требуемой длины. Фрагменты выделяют из геля и клонируют в вектор pAL2-T (Евроген, Россия). Вектоp лигиpуют с фpагментами с помощью ДНК-лигазы фага Т4 пpи 12°С в течение ночи. Лигазной смесью тpансфоpмиpуют компетентные клетки E.coli штамма XL-1 Blue. Для первичного анализа используют бело-голубую селекцию. Плазмидную ДНК клонов, отобранных по наличию в продуктах ПЦР фрагментов соответствующих длин, выделяют из ночных культур и дополнительно анализируют с помощью ПЦР с теми же парами праймеров. Отобранные по наличию фрагментов соответствующих длин клоны секвенируют по методу Сэнгера. Полученные нуклеотидные последовательности экзонов сравнивают с литературными данными с помощью выравнивания. Плазмидные ДНК клонов, чья нуклеотидная последовательность соответствует экзонам гена IgA2m1 и не содержит мутации, вызванные протеканием ПЦР, отбирают для последующей работы.

Объединение полученных экзонов проводят с помощью метода SOE-PCR. Проводят in vitro сплайсинг экзонов одновременно с удалением сайта XhoI во втором экзоне. Наличие данного сайта препятствует клонированию ДНК константных доменов в экспрессионный вектор.

Сплайсинг экзонов проводят в 2 этапа. На первом этапе проводят амплификацию экзонов по отдельности, используя в качестве матриц ДНК клонов, не содержащих артефактных нуклеотидных замен по отношению к последовательности константных доменов из баз данных. ПЦР с полимеразой Pfu проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 94°С, 30 сек; отжиг - 50°С, 40 сек; элонгация - 72°С, 2 мин; 30 циклов. ДНК-фрагменты требуемой длины выделяют из геля.

На втором этапе выделенные ПЦР-фрагменты, полученные на первом этапе, смешивают и амплифицируют с использованием концевых олигонуклеотидных праймеров IgAF1SacI и IgA-RXhoN, фланкирующих константный домен изотипа IgA2m1. Реакцию с помощью полимеразы Taq проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 95°С, 30 сек; отжиг - 50°С, 40 сек; элонгация - 72°С, 2 мин; 30 циклов. В итоге получают ДНК-фрагмент длиной 1,043 т.п.о., кодирующий полноразмерный константный домен IgA2m1.

Фрагмент выделяют из геля и клонируют в вектор pAL2-T. Вектоp лигиpуют с фpагментом с помощью ДНК-лигазы фага Т4 пpи 12 °С в течение ночи. Лигазной смесью тpансфоpмиpуют компетентные клетки E.coli штамма XL-1 Blue. Для первичного анализа используют бело-голубую селекцию. Колонии анализируют с помощью ПЦР с праймерами M13/pUC-46F и M13/pUC-46R, внешними к вставке. Структура олигонуклеотидных праймеров приведена в Таблице 4. Плазмидную ДНК отобранных по наличию фрагмента длиной 1,312 т.п.о. клонов выделяют из ночных культур и анализируют с помощью ПЦР с праймерами IgAF1SacI и IgA-RXhoN. Кроме того, плазмидную ДНК клонов дополнительно анализируют с помощью рестрикции с рестриктазами SacI и XhoI.

Отобранные положительные клоны секвенируют по Сэнгеру в области вставки по двум цепям. Проведенный гомологичный анализ нуклеотидных последовательностей с целью обнаружения в последовательностях отдельных клонов артефактных мутаций, вызванных протеканием ПЦР, позволяет идентифицировать плазмидные ДНК, в которых последовательность константного домена полностью соответствует завленной в базе данных Genbank.

Таким образом, из хромосомной ДНК человека получают и клонируют ДНК кодирующей последовательности константного домена иммуноглобулина изотипа IgA2m1.

Таблица 2. Праймеры для амплификации экзонов константных доменов тяжелой цепи изотипа IgA2m1 иммуноглобулина А. В скобках указана длина олигонуклеотидов

	IgAF1SacI	5'-CCGTGAGCTCCGCATCCCCGACCAGCCCCAAGGTC-3'	(34b)
	IgAR1	5'-GGGAACTGGGCAGGGCACAGTCACATCCTG-3'	(30b)
	IgA2F2	5'-GTGCCCTGCCCAGTTCCCCCACCTCCCC-3'	(28b)
	IgAXhoF	5'-GCACCGACCGGCCCTGGAGGACCTGCTCTTAGG-3'	(33b)
	IgAXhoR	5'-CCTAAGAGCAGGTCCTCCAGGGCCGGTCGGTGC-3'	(33b)
	IgAF3	5'-CAAAATCCGGAAACACATTCCGGCCCGAGGTCC-3'	(33b)
	IgA2R2	5'-GGAATGTGTTTCCGGATTTTGTGATGTTGGCGGTTAGTG-3'	(39b)
	IgA-RXhoN	5'-CCCTCGAGTCAGTAGCAGGTGCCGTCCACCTCCGCC-3'	(36b)

Все приведенные праймеры разработаны для получения данной последовательности и ранее не встречались в литературе.

Таблица 3. Размер ДНК-фрагментов при ПЦР амплификации экзонов тяжелой цепи изотипа IgA2m1 иммуноглобулина А.
Изотип цепи	Экзон 1, п.о.	Экзон 2, п.о.	Экзон 3, п.о.
A2m1	323	346	413

Таблица 4. Праймеры для секвенирования последовательностей в плазмидах, полученных на основе pAL-2T и pSK+. В скобках указана длина олигонуклеотидов.

1.	M13/pUC-46F	5'-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3'	(22)
2.	M13/pUC-46R	5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'	(24)

Пример 1в. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмиды pAL-2T-IgA2m1-Int.

Структура олигонуклеотидных праймеров, использованных для амплификации интронированного варианта гена, приведена в Таблице 2. Фрагменты, содержащие интронированный вариант гена IgA2m1, получают одновременно с удалением сайта XhoI во втором экзоне с помощью ПЦР c полимеразой Taq на матрице хромосомной ДНК человека из двух образцов с праймерами IgAF1SacI и IgAXhoR (первая половина гена) и IgAXhoF и IgA-RXhoN (вторая половина гена). Реакцию проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 95°С, 30 сек; отжиг - 50°С, 40 сек; элонгация - 72°С, 2 мин; 30 циклов.

Результатом всех проведенных ПЦР-амплификаций является получение ДНК-фрагментов требуемой длины. Фрагменты выделяют из геля и клонируют в вектор pAL2-T (Евроген, Россия). Вектоp лигиpуют с фpагментами с помощью ДНК-лигазы фага Т4 пpи 12⁰С в течение ночи. Лигазной смесью тpансфоpмиpуют компетентные клетки E.coli штамма XL-1 Blue. Для первичного анализа используют бело-голубую селекцию. Плазмидную ДНК клонов, отобранных по наличию в продуктах ПЦР фрагментов соответствующих длин, выделяют из ночных культур и дополнительно анализируют с помощью ПЦР с теми же парами праймеров. Отобранные по наличию фрагментов соответствующих длин клоны секвенируют по методу Сэнгера. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивают с литературными данными с помощью выравнивания. Плазмидные ДНК клонов, чья нуклеотидная последовательность соответствует гену IgA2m1 и не содержит мутации, вызванные протеканием ПЦР, отбирают для последующей работы.

Объединение полученных фрагментов проводят с помощью метода SOE-PCR одновременно с удалением сайта XhoI во втором экзоне. Наличие данного сайта препятствует клонированию ДНК константных доменов в экспрессионный вектор.

На первом этапе проводят амплификацию половин гена по отдельности, используя в качестве матриц ДНК клонов, не содержащих артефактных нуклеотидных замен по отношению к последовательности константных доменов из баз данных. ПЦР с полимеразой Pfu проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 94°С, 30 сек; отжиг - 50°С, 40 сек; элонгация - 72°С, 2 мин; 30 циклов. ДНК-фрагменты требуемой длины выделяют из геля.

На втором этапе выделенные ПЦР-фрагменты, полученные на первом этапе, смешивают и амплифицируют с использованием концевых олигонуклеотидных праймеров IgAF1SacI и IgA-RXhoN, фланкирующих интронированный вариант гена изотипа IgA2m1. Реакцию с помощью полимеразы Taq проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 95°С, 30 сек; отжиг - 50°С, 40 сек; элонгация - 72°С, 2 мин; 30 циклов. В итоге получают ДНК-фрагмент длиной 1,578 т.п.о., кодирующий полноразмерный константный домен IgA2m1.

Фрагмент выделяют из геля и клонируют в вектор pAL2-T. Вектоp лигиpуют с фpагментом с помощью ДНК-лигазы фага Т4 пpи 12 °С в течение ночи. Лигазной смесью тpансфоpмиpуют компетентные клетки E.coli штамма XL-1 Blue. Для первичного анализа используют бело-голубую селекцию. Колонии анализируют с помощью ПЦР с праймерами M13/pUC-46F и M13/pUC-46R, внешними к вставке. Структура олигонуклеотидных праймеров приведена в Таблице 3. Плазмидную ДНК отобранных по наличию фрагмента длиной 1,847 т.п.о. клонов выделяют из ночных культур и анализируют с помощью ПЦР с праймерами IgAF1Sac и IgA-RXhoN. Кроме того, плазмидную ДНК клонов дополнительно анализируют с помощью рестрикции с рестриктазами SacI и XhoI.

Таким образом, из хромосомной ДНК человека получают и клонируют содержащий интроны вариант гена константного домена иммуноглобулина изотипа IgA2m1.

Пример 1г. Конструирование промежуточных плазмид pSK-EF1-P4A1HA2m1-BGH и pSK-EF1-P4A1HA2m1-Int-BGH.

Кодирующая последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела P4A1 [Guo, Y., Huang, L., Zhang, G. et al. A SARS-CoV-2 neutralizing antibody with extensive Spike binding coverage and modified for optimal therapeutic outcomes. Nat Commun 12, 2623 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-22926-2] была составлена, исходя из аминокислотной и нуклеотидной последовательности тяжелой цепи антитела P4A1 [Патент WO/2021/257695 A61K 38/00 2006.1, опубл. 23.12.2021г.] и сайтов узнавания рестриктаз. Для получения кодирующей последовательности используются олигонуклеотидные праймеры (структура праймеров приведена в Таблице 1).

Кодирующую последовательность тяжелой цепи получают методом ПЦР на матрице плазмиды с составленной последовательностью с полимеразой Pfu со специфическими олигонуклеотидными праймерами P4A1-HNheIF и P4A1-HSacIR, при этом на 5'-конец гена вводят сайт узнавания рестриктазы NheI, а на 3'-конец - сайты SacI и Bsp120I. Реакцию проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 94°C, 30 сек; отжиг - 50°C, 40 сек; элонгация - 72°C, 1 мин; 30 циклов. Фрагмент очищают с помощью электpофоpеза в 1 % легкоплавкой агаpозе и выделения фрагмента из геля. После обработки ПЦР-фрагмента рестриктазами NheI и SacI фрагмент ДНК, содержащий кодирующую последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела снова очищают с помощью электpофоpеза в 1 % легкоплавкой агаpозе и выделения фрагмента из геля.

Также полученные промежуточные плазмиды pAL-2T-IgA2m1 и pAL-2T-IgA2m1-Int обрабатывают рестриктазами SacI и XhoI. Продукты реакции разделяют в 1% агарозном геле. Фрагменты IgA2m1-Int / SacI-Sfr274I длиной 1,402 т.п.о. IgA2m1 / SacI-Sfr274I длиной 1,031 т.п.о., содержащие интронированный и неинтронированный варианты кодирующей последовательности константной области изотипа IgA2m1, вырезают и выделяют из геля для последующих лигирований.

Для подстыковки кодирующих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи антитела P4A1 и константной области IgA2m1 ПЦР-фрагмент NheI-SacI и фрагменты SacI-XhoI из плазмид pAL-2T-IgA2m1 и pAL-2T-IgA2m1-Int клонируют в предобработанную рестриктазами NheI и XhoI плазмиду pSK+/hEF1-HTLV-BGH [Патент RU 2555533 С2, C12N 15/13 (2006.01), опубл. 27.11.2014]. Вектоp лигиpуют с фpагментами с помощью ДНК-лигазы фага Т4 пpи 12 °С в течение ночи. Лигазными смесями тpансфоpмиpуют компетентные клетки E.coli штамма XL-1 Blue. Колонии анализируют с помощью ПЦР с праймерами P4A1-HNheIF и P4A1-HSacIR. Плазмидную ДНК отобранных по наличию и длине фрагмента клонов выделяют из ночных культур и анализируют с помощью ПЦР с праймерами IgAF1SacI и IgA-RXhoIN. Кроме того, плазмидную ДНК клонов дополнительно анализируют с помощью рестрикции с рестриктазой SacI. Отбирают плазмидные ДНК, содержащие нужный набор рестрикционных фрагментов. Определяют нуклеотидную последовательность отобранных клонов промежуточных рекомбинантных плазмидных ДНК pSK-EF1-P4A1HA2m1-Int-BGH и pSK-EF1-P4A1HA2m1-BGH секвенированием по двум цепям по методу Сэнгера. Структура полученной промежуточной плазмиды pSK-EF1-FI6HA1-Int-BGH приведена в Фиг. 2. Структура промежуточной плазмиды pSK-EF1-P4A1HA2m1-BGH аналогична.

Пример 1д. Конструирование рекомбинантных плазмид pBiPr-ABIgA2m1P4A1-ht и pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht.

Рекомбинантную плазмидную ДНК pOpti-LP4A1-MluI обрабатывают рестриктазой MluI и дефосфорилируют с помощью фосфатазы CIAP, из полученного гидролизата выделяют линеаризованную плазмидную ДНК длиной 5,540 т.п.о. после электрофоретического разделения в 0,8%-ном агарозном геле.

Промежуточную рекомбинантную плазмидную ДНК pSK-EF1-P4A1HA2m1-Int-BGH обрабатывают рестриктазой MluI, из полученного гидролизата выделяют фрагмент ДНК длиной 2,670 т.п.о. после электрофоретического разделения в 1%-ном агарозном геле.

Промежуточную рекомбинантную плазмидную ДНК pSK-EF1-P4A1HA2m1-BGH также обрабатывают рестриктазой MluI, из полученного гидролизата выделяют фрагмент ДНК длиной 2,234 т.п.о. после электрофоретического разделения в 1%-ном агарозном геле.

Векторную часть плазмидной ДНК pOpti-LP4A1-MluI/MluI длиной 5,201 т.п.о. и MluI/MluI - фрагменты ДНК длиной 2,670 и 2,234 т.п.о., включающий в себя гибридный промотор hEF1-HTLV из плазмиды pMG, интронированный или неинтронированный вариант гена тяжелой цепи антитела P4A1 изотипа IgA2m1 и сигнал полиаденилирования гена фактора роста быка BGH из плазмиды pBudCE4.1, сшивают при помощи лигазной реакции и клонируют.

Вектоp лигиpуют с фpагментами с помощью ДНК-лигазы фага Т4 пpи 12 °C в течение ночи. Лигазной смесью тpансфоpмиpуют компетентные клетки E.coli штамма XL-1 Blue. Колонии анализируют с помощью ПЦР с полимеразой Taq с праймерами P4A1-HNheIF и P4A1-HSacIR. Реакцию проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 95°C, 30 сек; отжиг - 50°C, 40 сек; элонгация - 72°C, 1 мин; 30 циклов. Продукты реакции разделяют в 1% агарозном геле. Плазмидную ДНК отобранных по наличию и длине фрагмента клонов выделяют из ночных культур и анализируют с помощью рестрикции по наличию двух сайтов узнавания рестриктазы MluI (наличие в продуктах реакции фрагментов ДНК длиной 2,670 и 2,234 т.п.о.).

Кроме того, плазмидную ДНК клонов дополнительно анализируют с помощью рестрикции с рестриктазами NheI и XhoI (появление второго сайта узнавания рестриктаз свидетельствует о наличии вставки).

Пример 1е. Определение взаимной ориентации генов тяжелой и легкой цепей в полученных рекомбинантных плазмидах pBiPr-ABIgA2m1P4A1-ht и pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht.

Встраивание фрагментов MluI-MluI в плазмиду pOpti-LP4A1-MluI возможно в двух ориентациях: «голова-хвост» (ht), когда транскрипция генов тяжелой и легкой цепей антитела осуществляется в одном направлении, и «голова-голова» (hh), когда транскрипция разнонаправленная. Ориентацию встроенных MluI-MluI-фрагментов, включающих в себя гибридный промотор hEF1-HTLV из плазмиды pMG, интронированный или неинтронированный вариант гена тяжелой цепи антитела P4A1 изотипа IgA2m1 и сигнал полиаденилирования гена фактора роста быка BGH pA из плазмиды pBudCE4.1, определяют с помощью метода ПЦР с полимеразой Taq с олигонуклеотидными праймерами CMVrev1, BGHF и HTLV-R (праймеры в смесь добавляют в эквимолярном соотношении, состав праймеров приведен в Таблице 5). Реакцию проводят в следующем температурном режиме: денатурация - 95⁰С, 30 сек; отжиг - 50⁰С, 40 сек; элонгация - 72⁰С, 1 мин; 30 циклов. Продукты реакции разделяют в 1% агарозном геле. Кроме того, проводят аналогичный ПЦР с праймерами Opti4319, BGHF и HTLV-R. Условия реакции те же. Длины получаемых фрагментов приведены в Таблице 6.

Дополнительно плазмидную ДНК клонов анализируют с помощью обработки рестриктазами NheI и XhoI (появление второго сайта узнавания рестриктаз свидетельствует о наличии вставки). Продукты реакции разделяют в 1% агарозном геле.

Окончательно структуру рекомбинантных плазмидных ДНК pBiPr-ABIgA2m1P4A1-hh, pBiPr-ABIgA2m1P4A1-ht, pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Inthh и pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht подтверждают определением нуклеотидной последовательности секвенированием по методу Сэнгера с олигонуклеотидными праймерами pOpti-4319-4343 и CMVrev1 (состав праймеров приведен в Таблице 5). Структура полученных плазмид pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Inthh и pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht приведена в Фиг. 3. Структура плазмид pBiPr-ABIgA2m1P4A1-hh и pBiPr-ABIgA2m1P4A1-ht аналогична.

Таблица 5. Структура олигонуклеотидных праймеров, использованных для определения взаимной ориентации генов тяжелой и легкой цепей и секвенирования в плазмидах pBiPr-ABIgA2m1P4A1-hh, pBiPr-ABIgA2m1P4A1-ht, pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Inthh и pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht.
	Название	Структура олигонуклеотида	Длина, нуклеотидов
	CMVrev1	5'-CGCGGAACTCCATATATGGGCTAT-3'	24
	pOpti-4319-4343	5'-CAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGAT-3'	23
	EF-1F	5'-ccaGGTACCACGCGTCGCTCCGGTGCCCGTCAG-3'	33
	HTLV-R	5'-ccaGCTAGCTGATCTCAGGTAGGCGCCGGTCACAGC-3'	36
	BGHF	5'-CCCGCTAGCCTCGAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAG-3'	35
	BGHR	5'-CCCCTGCAGACGCGTCCATAGAGCCCACCGCATC-3'	34

Таблица 6. Длины фрагментов (п.о.), получаемых при определении взаимной ориентации генов тяжелой и легкой цепей в плазмидах pBiPr-ABIgA2m1P4A1-hh, pBiPr-ABIgA2m1P4A1-ht, pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Inthh и pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht.
вариант	длина	CMVRev1 BGHF HTLV-R	Opti4319 BGHF HTLV-R	MluI
pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht	7871	347	662	2670
pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Inthh	7871	658	351	2670
pBiPr-ABIgA2m1P4A1-ht	7435	347	662	2234
pBiPr-ABIgA2m1P4A1-hh	7435	658	351	2234

Пример 2. Получение линий CHO - продуцентов мономеров IgA2m1 нейтрализующего антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) с применением плазмид pBiPr-ABIgA2m1P4A1-hh, pBiPr-ABIgA2m1P4A1-ht, pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Inthh и pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht.

Для получения стабильного продуцента рекомбинантных антител человека проводят трансфекцию клеток яичника китайского хомячка CHO DG44 dhfr - плазмидами pBiPr-ABIgA2m1P4A1-hh, pBiPr-ABIgA2m1P4A1-ht, pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Inthh и pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht с разными направлениями транскрипции генов тяжелой (интронированный и неинтронированный вариант) и легкой цепей (hh или ht) нейтрализующего антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) изотипа IgA2m1. Клетки культивируют в CO2-инкубаторе при 37°C, 96% влажности и 8% CO2 в стандартной бессывороточной среде CD DG44 (Invitrogen) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и содержащей 0,18% (v/v) Pluronic F-68 (Invitrogen). Во флаконы Эрленмейера объемом 125 мл засевают 30 мл клеточной суспензии (4,5 млн клеток) при постоянном пемешивании на орбитальном шейкере с частотой 130 об/мин и через 20-24 ч проводят трансфекцию с использованием реагента трансфецирующего реагента Lipofectamine-3000Transfection Kit (Invitrogen) согласно стандартному протоколу производителя [Lipofectamine-3000 Reagent Protocol, https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/lipofectamine3000_protocol.pdf]. Плазмидную ДНК добавляют к клеткам в виде ДНК-липосомного преципитата. Преципитат готовят следующим образом: при комнатной температуре во флакон A вносят 18 мкг ДНК плазмиды в 1200 мкл среды OptiMEM (Invitrogen), перемешивают, добавляют 15 мкл реагента Freestyle MAX (Invitrogen), инкубируют от 10 до 20 минут при комнатной температуре. После инкубации перемешивают пипетированием и по каплям вносят в культуральный флакон. Культуральный флакон инкубируют при температуре 37^oC, 98% влажности, в атмосфере 8% CO₂ и непрерывном перемешивании 130 об/мин.

Через 48 ч после трансфекции клетки отмывают и помещают в ростовую среду CD OptiCHO (Invitrogen) (без тимидина и гипоксантина) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и содержащей 0,18% (v/v) Pluronic F-68 (или среду CD OptiCHO (Invitrogen, USA) с добавлением 8мМ L-глютамина (Gibco,USA),0.1% Pluronic F68 (Gibco, USA) с добавлением гентамицина (G418 “Gibco”) в зависимости от селективного маркера) на 48 ч. Клетки инкубируют в селективной среде в течение двух недель, смену среды и поддержание концентрации клеток в среде проводят каждые трое суток.

Измерение концентрации клеток и их жизнеспособности проводят с использованием 0.04% раствора трипанового синего в камере Горяева.

Отбор трансфектантов с наилучшей экпрессией антител проводят с помощью клональной селекции на полутвердой среде (Semi-Solid media ”Invitrogen”) по предложенной методике с использованием приборов ClonePix и CloneSelect Imager фирмы “Genetix”. Далее, для увеличения копийности плазмиды и повышения продукции антител применяют поэтапное увеличение концентрации метатрексата (МТХ).

Кроме того, определение продуктивности измеряют с помощью иммуноферментного анализа. После трансфекции клетки инкубируют в течение 48-72 часов. В эти временные интервалы берут пробы для иммуноферментного анализа (ELISA) для определения оптимального результата трансфекции. По результатам ELISA оптимальные варианты подвергают селекции по соответствующим маркерам.

Через 14 дней после помещения в селективные условия в культуре остаются клетки, способные существовать без добавления в среду тимидина и гипоксантина. При достижении культурой времени удвоения популяции 24 часа производят полную замену среды на среду CD DG44, содержащей 8 мМ L-Глутамина, 0,18% Pluronic F-68, 50 нМ метотрексата.

Через 14 дней после помещения в среду, содержащую метотрексат, остаются только клетки, способные существовать в присутствии 50 нМ метотрексата. При достижении культурой времени удвоения популяции 24 часа производят полную замену среды на среду CD DG44, содержащую 8 мМ L-Глутамина, 0,18% (v/v) Pluronic F-68, 100 нМ метотрексата.

Данную процедуру увеличения концентрации метотрексата проводят до тех пор, пока не будет достигнута устойчивость клеток к концентрации метотрексата равной 200 нМ.

Продуктивность измеряют с помощью иммуноферментного анализа по стандартной методике. В Фиг. 4 представлено влияние наличия и отсутствия интронов в гене тяжелой цепи, а также различного направления транскрипции генов тяжелой и легкой цепей (hh или ht) нейтрализующего антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) изотипа IgA2m1. Результаты анализа показывают, что продукция антител изотипа IgА2m1 в случае интронированного варианта гена тяжелой цепи (pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht) более чем в 6 раз выше при использовании экспрессионной плазмиды с однонаправленной транскрипцей генов тяжелой и легкой цепей к нейтрализующего антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) («голова-хвост»), чем неинтронированного (pBiPr-ABIgA2m1P4A1-ht), а в случае однонаправленной транскрипции (pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht) почти в 3 раза выше, чем разнонаправленной (pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Inthh).

Интронированный вариант достигает уровня 16.6 мг/мл за 3 суток, в то время как неинтронированному по другим экспериментам необходимо 14 суток культивирования, чтобы достичь такого же уровня продукции.

Пример 3. Получение, выделение и очистка белкового продукта с помощью линий клеток CHO, продуцирующих антитела P4A1 изотипа IgA2m1.

Получение белкового продукта производят в колбах Эрленмейера различного объема без рассекателей в ростовой среде CD OptiCHO (без тимидина и гипоксантина) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и 0,18% (v/v) Pluronic F-68 без добавления дополнительных количеств питательных веществ при постоянном перемешивании с частотой 135 об/мин при температуре 37^oC, 96% влажности в атмосфере 8% CO₂. Культивирование для получения белкового продукта производят не менее 14 дней.

После окончания культивирования для получения продукта антител P4A1 изотипа IgA2m1 полученную кондиционированную среду от культур трансфецированных клеток центрифугируют при 4000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант смешивают в соотношении 4:1 с Буфером для нанесения (50 мМ Трис-HCl, pH=7.0) и наносят на подготовленную Белок А - агарозную колонку (Gibco BRL, США). При элюции используют Буфер для элюции (100 мМ глицина, pH 3,0) и Нейтрализующий буфер (1 M Трис-HCl, pH 8,0). Колонку с 2 мл Белок А-агарозы промывают 3 раза по 4 мл Буфером для нанесения. Далее наносят смесь супернатанта кондиционированной среды и Буфера для нанесения. Образец наносят при комнатной температуре с помощью перистальтического насоса. После нанесения образца колонку промывают 3 раза по 20 мл Буфером для нанесения. Смывание антител с колонки производят с помощью 6 фракций по 2 мл Буфера для элюции. К образцу добавляют Нейтрализующий буфер в соотношении 1 часть буфера на 9 частей прошедшего через колонку Буфера для элюции.

Полученные образцы выделенных антител диализуют против ФСБ (фосфатно-солевой буфер, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 1,76 мМ KH₂PO₄, pH 7,4) и хранят при температуре +4 ºC.

Оценку гомогенности и степени очистки препарата проводят с использованием электрофоретического метода. Электрофорез проводят в 10%-ном полиакриламидном геле. В качестве контроля используют неокрашенный белковый маркер молекулярных весов (Fermentas, Великобритания). Перед внесением к 15 мкл образца антител добавляют 5 мкл Буфера для нанесения с 2-меркаптоэтанолом (2-МЭ) (200 мМ Трис-HCl, pH 6,8, 400 мМ 2-МЭ, 4% натрия додецилсульфат, 0,01 % бромофеноловый синий, 40 %-ный глицерин). Образцы для внесения на гель инкубируют при температуре 95 ºC в течение 5 мин. Антитела наносят в Буфере для нанесения, как содержащем 2-МЭ, так и в отсутствии него.

Полученные образцы продукта антител P4A1 изотипа IgA2m1 характеризуются следующими показателями:

- гомогенность препарата не менее 98% (по данным гель-электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле с денситометрией);

- молекулярная масса - 148000 Да (по данным гель-электрофореза с белковыми маркерами молекулярных весов);

-молекулярная масса легкой цепи антитела 24000 Да, молекулярная масса тяжелой цепи антитела - 50000 Да (по данным гель-электрофореза с белковыми маркерами молекулярных весов).

Пример 4. Определение специфичности полученного антитела P4A1 изотипа IgA2m1.

Метод оценки количественных параметров, характеризующих специфическую активность моноклональных антител основан на измерении константы диссоциации комплекса антиген-антитело в растворе, т.к. именно этот параметр количественно определяет аффинность и специфичность взаимодействия моноклонального антитела с антигеном и не зависит от концентрации антител. Константу диссоциации полученного нейтрализующего антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) изотипа IgA2m1 определяют по стандартной методике ELISA [Guo, Y., Huang, L., Zhang, G. et al. A SARS-CoV-2 neutralizing antibody with extensive Spike binding coverage and modified for optimal therapeutic outcomes. Nat Commun 12, 2623 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-22926-2] и [Патент WO/2021/257695 A61K 38/00 2006.1, опубл. 23.12.2021г.], используя в качестве антигена гибридный белок RBD SARS-CoV-2 с человеческим FcG1.

Константа диссоциации полученного нейтрализующего антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 (2019-nCoV) изотипа IgA2m1 составила 1,42 nM в сравнении с 1,784 nM исходного антитела P4A1 изотипа IgG4 (P4A1-2A). Уменьшение константы диссоциации возможно связано со сменой изотипа антитела.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="2022135380_10(076753) перечень последовательностей.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"

productionDate="2023-05-08">

</ApplicationIdentification>

<ApplicationNumberText>RU2656142C1, C12N 15/13

(2006.01)</ApplicationNumberText>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

(ИБХ РАН), RU</ApplicantName>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ получения рекомбинантного

иммуноглобулина IgA2m1-изотипа в клетках

млекопитающих</InventionTitle>

<INSDSeq_length>477</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..477</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFIVS

SNYMSWVRQAPGKGLEWVSIIYSGGSTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCARDLQ

ELGSLDYWGQGTLVTVSSASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARN

FPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALE

DLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCT

AAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREK

YLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVM

AEVDGTCY</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>1870</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1870</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgggatggtcatgtatcatcctttttctggtagcaactgcaactggag

tacatagcgaggtgcagctggtcgagtccggcggaggtctgatacaaccggggggttccctccgcctctc

ctgtgccgcatcgggattcatcgtttcctccaactacatgtcttgggtcaggcaggcaccaggcaagggg

ctggaatgggtttcgataatttatagcggcggttcaacattttatgccgactcggtcaaaggcaggttta

ctatttcgcgggacaactcaaaaaatacgctctacctccaaatgaatagcctgcgggtcgaagacacagc

cgtgtactactgtgcacgagatttacaagaacttgggtctctggactattggggccaaggtaccctggtc

actgtgagctccgcatccccgaccagccccaaggtcttcccgctgagcctcgacagcaccccccaagatg

ggaacgtggtcgtcgcatgcctggtccagggcttcttcccccaggagccactcagtgtgacctggagcga

aagcggacagaacgtgaccgccagaaacttcccacctagccaggatgcctccggggacctgtacaccacg

agcagccagctgaccctgccggccacacagtgcccagacggcaagtccgtgacatgccacgtgaagcact

acacgaatcccagccaggatgtgactgtgccctgcccaggtcagagggcaggctggggagtggggcgggg

ccaccccgtcctgccctgacactgcgcctgcacccgtgttccccacagggagccgccccttcactcacac

cagagtggaccgcgggccgagccccaggaggtggtggtggacaggccaggaggggcgaggcgggggcacg

gggaagggcgttctgaccagctcaggccatctctccactccagttcccccacctcccccatgctgccacc

cccgactgtcgctgcaccgaccggccctggaggacctgctcttaggttcagaagcgaacctcacgtgcac

actgaccggcctgagagatgcctctggtgccaccttcacctggacgccctcaagtgggaagagcgctgtt

caaggaccacctgagcgtgacctctgtggctgctacagcgtgtccagtgtcctgcctggctgtgcccagc

catggaaccatggggagaccttcacctgcactgctgcccaccccgagttgaagaccccactaaccgccaa

catcacaaaatccggtgggtccagaccctgctcggggccctgctcagtgctctggtttgcaaagcatatt

cccggcctgcctcctccctcccaatcctgggctccagtgctcatgccaagtacagagggaaactgaggca

ggctgaggggccaggacacagcccagggtgcccaccagagcagaggggctctctcatcccctgcccagcc

ccctgacctggctctctaccctccaggaaacacattccggcccgaggtccacctgctgccgccgccgtcg

gaggagctggccctgaacgagctggtgacgctgacgtgcctggcacgtggcttcagccccaaggatgtgc

tggttcgctggctgcaggggtcacaggagctgccccgcgagaagtacctgacttgggcatcccggcagga

gcccagccagggcaccaccaccttcgctgtgaccagcatactgcgcgtggcagccgaggactggaagaag

ggggacaccttctcctgcatggtgggccacgaggccctgccgctggccttcacacagaagaccatcgacc

gcttggcgggtaaacccacccatgtcaatgtgtctgttgtcatggcggaggtggacggcacctgctactg

a</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>234</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..234</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGI

SSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQEANSFPYTFG

QGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>708</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..708</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccag

gctccaccggcgatatccagatgacacagtctcctagtagcgtgtccgcttctgttggggaccgggtcac

cattacatgtcgggctagtcagggtatctcttcttggctggcctggtatcagcaaaaacccggcaaggcg

ccgaagctgctgatctacgctgctagctccttacaatctggggtcccttctaggttcagcggcagcggca

gcggcaccgacttcacactcaccatttcttccctgcaacccgaggacttcgccacatactattgccaaga

agcgaattctttcccttacacatttggacaagggactaagctggaaatcaaacgcaccgtggccgctcca

agcgtattcatctttccacctagcgatgagcagctgaagtccggaacagcttctgtggtctgcctgctga

ataacttctaccctagggaggccaaggtccagtggaaggtggacaacgcccttcaatctggaaactcgca

agaatctgtaactgaacaagactctaaagacagtacctactccctgtctagcacactgaccctgtccaag

gccgactacgagaagcataaagtctacgcttgtgaagtgacgcatcaaggcctctctagccctgttacca

aaagctttaaccgaggagaatgctaatag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>680</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..680</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtc

attagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccg

cccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttcc

attgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgcc

aagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctta

tgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggc

agtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaa

tgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacg

caaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcg

cctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccggactct

a</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>532</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..532</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccga

gaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagt

gatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccg

tgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgaagcttcgaggggctcgcatctctcc

ttcacgcgcccgccgccctacctgaggccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcc

tgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtc

cggcgctcccttggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaact

ctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctac</INSDS

eq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>224</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..224</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgcc

ttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgt

ctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagaca

atagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht, кодирующая нейтрализующее моноклональное антитело P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 изотипа IgA2m1, содержащая интронированный ген тяжелой цепи антитела с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2, кодируюшей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, находящийся под контролем промотора hEF1-HTLV с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:6 и сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста BGH polyA с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:7, ген легкой цепи антитела с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:4, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, находящийся под контролем промотора CMV с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:5, сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса цепей антитела, а также селективный маркер, обеспечивающий отбор трансфецированных эукариотических клеток, при этом промоторы hEF1-HTLV и CMV размещены в последовательности, обеспечивающей однонаправленную транскрипцию.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК по п.1, характеризующаяся тем, что она выполнена на базе плазмиды pOptiVEC™-TOPO®, включающей также внутренний сайт связывания рибосом IRES вируса энцефаломиокардита EMCV, ген ДГФР, сайт начала репликации в E. coli из плазмиды pUC, ген β-лактамазы, а также следующие модификации - единичный сайт узнавания рестриктазы MluI вместо сайта узнавания рестриктазы SalI в положении 23, единичные сайты узнавания рестриктаз NheI и XhoI после промотора CMV для клонирования ДНК легкой цепи антитела.

3. Рекомбинантная плазмидная ДНК по п.1, характеризующаяся тем, что селективный маркер представляет собой ген ДГФР.

4. Способ получения линии эукариотических клеток CHO DG44/pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht продуцента нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 изотипа IgA2m1 путем трансфекции клеток яичника китайского хомячка СНО рекомбинантными плазмидными ДНК по п. 1.

5. Линия эукариотических клеток CHO DG44/pBiPr-ABIgA2m1P4A1-Intht - продуцент нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 изотипа IgA2m1, полученная способом по п.4.

6. Способ получения нейтрализующего моноклонального антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 изотипа IgA2m1, включающий:

- культивирование в питательной среде линий клеток по п. 5,

- выделение полученного целевого антитела P4A1 к вирусу SARS-CoV-2 изотипа IgA2m1 из культуральной жидкости.