JP2021525548A6 - 転写調節エレメント及びそれの外来タンパク質発現の増強における応用 - Google Patents
転写調節エレメント及びそれの外来タンパク質発現の増強における応用 Download PDFInfo
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Abstract
本開示は、タンパク質発現システムでのタンパク質の発現レベルを高めるためのWXRE転写調節エレメントとして使用することができるポリヌクレオチド、ならびに前述のWXRE転写調節エレメントを含むタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムおよびそれらの使用に関する。本開示による転写調節エレメントWXREを使用することで、外来タンパク質の発現レベルを大きく向上るとともに、それ自体の生化学的な活性を維持することができる。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
本開示は、分子生物学および生物工学分野に関する。特に、本開示は、哺乳動物細胞を使用して外来タンパク質を発現することにおける新規な転写調節エレメントに関する。具体的には、本開示は、真核細胞株にて外来タンパク質を製造、その発現レベルを増強するために用いられる転写調節エレメントであるWXRE(WuXi Regulatory Element)、及びWXREを含有する外来タンパク質発現システム、ならびに外来タンパク質の生産における前述発現システムの応用に関する。
生物学的研究では、タンパク質の研究がますます注目を集めており、タンパク質研究で最も重要なことは、タンパク質発現システムの選択である。タンパク質発現システムとは、細菌、酵母、植物細胞或いは動物細胞などのモデル生物を用いて外来タンパク質を発現する分子生物学的技術である。タンパク質発現システムは、原核生物の発現システムと真核発現システムに大まかに分けられている。
ここで、原核生物の発現システムは、原核生物を介して外来タンパク質を取得するシステムであり、主に、大腸菌発現システム、枯草菌発現システム、ストレプトミセス発現システムなどが含まれる。その中で、大腸菌システムが最も広く使用されている。原核生物の発現システムは、宿主細菌の急速な増殖、簡単な培養、便利な操作、安価な価格、明確な遺伝的背景、安全な遺伝子、高いタンパク質の発現レベルという特徴がある。しかしながら、原核生物の発現システムは、発現時間及び発現レベルを制御することができない。また、原核生物の発現システムでは、発現産物が封入体として存在する可能性があるため生物的活性が低く、翻訳後プロセシングおよび修飾システムが不完全である(例えば、グリコシル化修飾ができない)。
一方、真核発現システムには、主に哺乳動物細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞の発現システムが含まれる。これは、近年一般的な外来タンパク質を発現する手段の一つであり、原核生物の発現システムに欠けているいくつかの機能を補完する。具体的に、例えば真核発現システムで発現した場合に安定したジスルフィド結合を形成でき、タンパク質の翻訳済、タンパク質を正しく修飾することで発現したタンパク質が分解されたり封入体を形成したりすることなく、より天然な活性を持つことができる。ただし、哺乳動物発現システムは、高効率発現の誘導、発現のタンパク質の正しく折り畳み、複雑なグリコシル化修飾を正確に行え、天然タンパク質に近いタンパク質活性を持ち、且つエンドトキシンを除去する必要がない等の特徴がある。そして、哺乳動物発現システムは、複雑タンパク質を発現できる唯一のシステムであり、抗体、例えばヒト化モノクローナル抗体の生産では、大量生産可能でヒト化特性が良好などの特徴がある。哺乳動物発現システムに一般的に使用される宿主細胞として、CHO、COS、BHK等の細胞が含まれる。
アダリムマブ(adalimumab、商品名:HUMIRA)は、関節リウマチと強直性脊椎炎の治療における応用がNMPA(National Medical Products Administration)に承認された、抗ヒト腫瘍坏死因子(TNF)のヒト化モノクローナル抗体である。そして、良好な治療効果を持つ。
顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor、GM-CSF)は、多機能性的な造血細胞成長因子であり、顆粒球類及びマクロファージの発達と成熟において調節的役割を果たす。GM-CSFは、滑膜組織の単球の炎症性樹状細胞への分化においても重要な役割を果たし、急性関節炎の発生と発症の誘発及び維持に関与している。そして、関節リウマチ患者の血清及び滑膜の検査では、GM-CSF因子のレベルが著しく増加し、疾患活発と密接に関連していることが分かった。これは、主に骨侵食の発展、滑膜内層細胞及びその下層細胞に多数のマクロファージの浸潤に反映される。
PD-1は、活性化されたT細胞とB細胞によって発現される重要な免疫チェックポイント受容体であり、免疫阻害を仲介することができる。PD-1は、CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、及びBTLAを含むCD28受容体ファミリーのメンバーである。PD-1について、細胞表面糖タンパク質リガンドであるプログラム細胞死リガンド-1(PD-L1)とプログラム細胞死リガンド-2(PD-L2)がすでに同定されている。これらは、抗原提示細胞と多くのヒトがんで発現され、PD-1に結合するとT細胞の活性化と細胞因子の分泌をダウンレギュレートすることが示されている。
PD-L1は、CD274或いはB7-H1とも呼ばれる。それは、さまざまな腫瘍細胞で発現がアップレギュレートされ、T細胞上のPD-1と結合すると、T細胞の増殖と活性化を阻害し、T細胞を不活化状態にし、最終に免疫逃避を誘導する。PD-L1阻害剤は、PD-1とPD-L1との結合をプロックでき、T細胞の成長と増殖をアップレギュレートし、腫瘍細胞に対するT細胞の認識を高め、T細胞の攻撃と殺傷機能を活性化し、ヒト自身の免疫機能を動員することによって抗腫瘍効果を果たす。
アダリムマブなどのモノクローナル抗体、PD-1に対するモノクローナル抗体とPD-L1に対するモノクローナル抗体は、すべて哺乳動物発現システムによって生産されることができる一方、哺乳動物発現システムには外来タンパク質の発現レベルが低いという問題がある。したがって、先行技術として知らされている哺乳動物発現システムを改善し、著しく高いレベルの外来タンパク質発現を達成できるシステムを提供することが切迫されている。そして、ヒト化モノクローナル抗体を作製するには、上記システムが必要である。
本開示は、CHO(Chinese Hamster Ovary)細胞に由来する、外来タンパク質発現の増強に使用できるDNA配列であり、哺乳動物発現システムでの外来タンパク質の発現レベルを増強できるDNA配列を提供する。
本開示に係る技術構成は以下の通りである。
(1)(i)〜(iv)から選択されるいずれか1つのポリヌクレオチドであって:
(i)SEQ ID NO:3-9のいずれかで示される配列を含むヌクレオチド配列;
(ii)SEQ ID NO:3-9のいずれかで示される配列の逆相補配列を含むヌクレオチド配列;
(iii)高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、(i)または(ii)で示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な配列の逆相補配列;
(iv)(i)または(ii)で示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも90%、さらに少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列;
である、ポリヌクレオチド。
(i)SEQ ID NO:3-9のいずれかで示される配列を含むヌクレオチド配列;
(ii)SEQ ID NO:3-9のいずれかで示される配列の逆相補配列を含むヌクレオチド配列;
(iii)高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、(i)または(ii)で示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な配列の逆相補配列;
(iv)(i)または(ii)で示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも90%、さらに少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列;
である、ポリヌクレオチド。
(2) (v)〜(viii)から選択されるいずれか1つをさらに含む:
(v)SEQ ID NO:13で示される配列を含むヌクレオチド配列;
(vi)SEQ ID NO:13で示される配列の逆相補配列を含むヌクレオチド配列;
(vii)高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、(v)または(vi)で示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な配列の逆相補配列;
(viii)(v)または(vi)で示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも90%、さらに少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列;
である、(1)に記載のポリヌクレオチド。
(v)SEQ ID NO:13で示される配列を含むヌクレオチド配列;
(vi)SEQ ID NO:13で示される配列の逆相補配列を含むヌクレオチド配列;
(vii)高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、(v)または(vi)で示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な配列の逆相補配列;
(viii)(v)または(vi)で示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも90%、さらに少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列;
である、(1)に記載のポリヌクレオチド。
(3)タンパク質発現システムでのタンパク質の発現レベルを高めることができる(1)〜(2)のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。任意に、タンパク質発現システムが真核細胞タンパク質発現システムから選択される。好ましくは、前記真核細胞タンパク質発現システムがCHO(Chinese Hamster Ovary)細胞のタンパク質発現システムである。
(4) 前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4で示される配列を含む配列、またはSEQ ID NO:4で示される配列の逆相補配列を含む配列から選択される、(1)〜(2)のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。任意に、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4で示される配列とSEQ ID NO:13で示される配列とを含むヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:4で示される配列の逆相補配列とSEQ ID NO:13で示される配列の逆相補配列とを含むヌクレオチド配列から選択される。
(5)タンパク質発現システムが、抗体、融合タンパク質または組換えタンパク質を発現するものである、(3)に記載のポリヌクレオチド。任意に、前記抗体はモノクローナル抗体から選択され、前記融合タンパク質がプログラム細胞死受容体-1(Programmed Death-1、PD-1)に対する抗体またはプログラム細胞死受容体リガンド-1(Programmed Death- Ligand 1、PD-L1)に対する抗体である。好ましくは、前記モノクローナル抗体はアダリムマブから選択され、前記PD-1に対する抗体がペムブロリズマブ(pembrolizumab)である。
(6)(1)〜(5)のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する、タンパク質発現システムでのタンパク質の発現レベルを増強するためのWXRE転写調節エレメント。
(7)(1)〜(5)のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは(6)に記載のWXRE転写調節エレメントを含有するタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム。任意に、前記タンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムは少なくとも1つのプロモーターと少なくとも1つの制限酵素サイトをさらに含む。好ましくは、前記タンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムは哺乳動物細胞タンパク質発現ベクターまたは哺乳動物細胞タンパク質発現システムから選択される。より好ましくは、前記哺乳動物細胞がCHO細胞である。
(8)(7)に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムを含有する細胞株。
(9)(7)に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または(8)に記載の細胞株を含有するキット。
(10)(7)に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または(8)に記載の細胞株の、異常なタンパク質発現による動物の疾患を検出するための試薬またはキットの製造における使用。
(11)前記動物の疾患が前記動物体において標的タンパク質の異常な発現を引き起こし、かつ前記タンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムまたは細胞株が、前記標的タンパク質に対する抗体を分泌することができる、(10)に記載の使用。任意に、前記動物は哺乳動物から選択される。好ましくは、前記哺乳動物がヒトである。
本発明の一局面において、関節リウマチでは、GM-CSF因子の発現レベルが顕著に増強し、疾患活発と密切に関連していることが先行技術で知られることができる。これは、主に骨侵食の発展、滑膜内層細胞及びその下層に多数のマクロファージの浸潤に反映される。したがって、本開示に係るタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムによって抗GM-CSF抗体を製造することができる。ただし、GM-CSF抗体の配列は先行技術で知られているもの通りである。例示的に、抗GM-CSF抗体の配列は、WO 2018050111 A1で示される配列から選択することができる。抗GM-CSF抗体が得られた後、GM-CSFの発現レベルを検出することにより、関節リウマチの診断に用いることができる。
(12)(7)に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または(8)に記載の細胞株から発現したタンパク質の、動物の疾患を治療または予防するための医薬品の製造への使用。任意に、前記動物の疾患は腫瘍或いは自己免疫疾患から選択される。
(13)前記腫瘍はがんから選択され、および/または前記自己免疫疾患は関節リウマチまたは強直性脊椎炎から選択される、(12)に記載の使用。
(14)(7)に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または(8)に記載の細胞株を選択して前記タンパク質を分泌する、タンパク質を製造する方法。任意に、前記タンパク質は抗体、融合タンパク質または組換えタンパク質から選択される。好ましくは、前記抗体はモノクローナル抗体から選択される。前記融合タンパク質がプログラム細胞死受容体-1(Programmed Death-1、PD-1)に対する抗体またはプログラム細胞死受容体リガンド-1(Programmed Death- Ligand 1、PD-L1)に対する抗体である;より好ましくは、前記モノクローナル抗体がアダリムマブであり、前記PD-1に対する抗体がペムブロリズマブである。
(15)標的タンパク質を高発現する安定な細胞株のスクリーニング方法であって、(7)に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムを利用して、前記標的タンパク質をコードする標的遺伝子を前記細胞にトランスフェクトし、標的タンパク質を高発現する安定な細胞株をスクリーニングして取得する、方法。任意に、前記タンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムは哺乳動物細胞のタンパク質発現ベクターまたは哺乳動物細胞のタンパク質発現システムから選択される。より好ましくは、前記哺乳動物細胞がCHO細胞である。
(16)(15)に記載のスクリーニング方法であって、前記スクリーニング方法は、選択マーカーである抗生物質によるスクリーニング、または増幅されたマーカー遺伝子に対して、試薬ストレスによるスクリーニングすることが含まれる、方法。
(17)(15)〜(16)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法を用いて得られた細胞株。
(18)(7)に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または(8)に記載の細胞株から分泌されたタンパク質を用いて前記動物が病気にかかっているかどうかを検出するための方法であって、前記動物の疾患は、前記動物体において標的タンパク質の異常な発現を引き起こすことができる、動物の疾患を検出する方法。
(i)前記分泌されたタンパク質が前記検出標的タンパク質と相互作用できた場合、前記動物患が疾患を持っていることを示す;
(ii)前記分泌されたタンパク質が前記検出標的タンパク質と相互作用できない場合、前記動物が疾患を持っていないことを示す。
(i)前記分泌されたタンパク質が前記検出標的タンパク質と相互作用できた場合、前記動物患が疾患を持っていることを示す;
(ii)前記分泌されたタンパク質が前記検出標的タンパク質と相互作用できない場合、前記動物が疾患を持っていないことを示す。
(19)前記タンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または細胞株が前記検出目的とするタンパク質に対する抗体を分泌することができる(18)に記載の方法。任意に、前記動物は哺乳動物から選択される。好ましくは、前記哺乳動物がヒトである。
(20)(7)に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または(8)に記載の細胞株から分泌されたタンパク質を前記動物に投与する、動物の疾患を治療または予防する方法。任意に、前記動物の疾患は腫瘍或いは自己免疫疾患から選択される。
(21)前記腫瘍はがんから選択される、および/または前記自己免疫疾患はる関節リウマチまたは強直性脊椎炎から選択される(20)に記載の方法。
(22)標的抗体を製造する方法であって、以下のステップを含む:
(i)(14)に記載のタンパク質を製造する方法に従って、前記タンパク質を製造して得られる;
(ii)ステップ(i)で得られた前記タンパク質を動物に免疫させて、対応する前記標的抗体を得る、
方法。
(i)(14)に記載のタンパク質を製造する方法に従って、前記タンパク質を製造して得られる;
(ii)ステップ(i)で得られた前記タンパク質を動物に免疫させて、対応する前記標的抗体を得る、
方法。
(23)(1)または(2)に記載のポリヌクレオチドの少なくともいずれか1つを含むベクター。
(24)CMVプロモーターはをさらに含む(23)に記載のベクター。任意に、前記CMVプロモーターがSEQ ID NO:16で示される配列を含む、または前記CMVプロモーターが前記SEQ ID NO:16で示される配列と少なくとも90%、さらに少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む。
(25)一種類または多種類の標的タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子を含む、(23)または(24)に記載のベクター。
(26)前記標的タンパク質は、抗体、融合タンパク質、酵素、可溶性タンパク質、膜タンパク質、構造タンパク質、リボソームタンパク質、チモーゲン、細胞表面受容体タンパク質、転写調節タンパク質、翻訳調節タンパク質、クロマチンタンパク質、ホルモン、細胞周期調節タンパク質、Gタンパク質、神経活性化ペプチド(neuroactive peptide)、免疫調節タンパク質、血液成分タンパク質、イオンチャネルタンパク質、熱ショックタンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、抗生物質耐性タンパク質、いずれかの前記タンパク質の機能的フラグメント、いずれかの前記タンパク質のエピトープフラグメント、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする(25)に記載のベクター。
(27)(23)〜(26)のいずれか一項に記載のベクターを含むことを特徴とする単離された宿主細胞。
(28)(23)〜(26)のいずれか一項に記載のベクターを用いて当初の宿主細胞を形質転換するステップが含まれることを特徴とする標的タンパク質を安定的に発現する宿主細胞を製造する方法。
(29)前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、(27)に記載の宿主細胞または(28)に記載の方法。
(30)(27)に記載の宿主細胞を用いるまたは(28)または(29)に記載の方法を利用することで、前記標的タンパク質を製造することが含まれる、標的タンパク質を製造する方法。
任意に、本発明は以下の実施形態を提供する。
任意に、本発明は以下の実施形態を提供する。
(31)SEQ ID NO:3-9からなる群から選択される制御配列と少なくとも85%の同一性を有するヌクレオチド配列と、プロモーターと、ポリペプチドをコードする外来配列とを含むポリヌクレオチドであって、前記制御配列と、前記プロモーターと、前記ポリペプチドをコードする外来配列とが作動可能に連結されている、ポリヌクレオチド。
(32)EF1αI遺伝子におけるイントロンをさらに含む請求項(31)に記載のポリヌクレオチド。
(33)前記EF1αI遺伝子におけるイントロンは、SEQ ID NO: 13と少なくとも80%の同一性を有する配列を含む請求項(32)に記載のポリヌクレオチド。
(34)前記SEQ ID NO: 3-9からなる群から選択される制御配列はフォワード(forward)方向である請求項(33)に記載のポリヌクレオチド。
(35)前記SEQ ID NO: 3-9からなる群から選択される制御配列はリバース(reverse)方向である請求項(34)に記載のポリヌクレオチド。
(36)以下の配列を含む、抗体の発現を増強するための宿主細胞であって、
(36)以下の配列を含む、抗体の発現を増強するための宿主細胞であって、
SEQ ID NO:3-9のいずれかの配列と少なくとも85%の同一性を有する配列またはSEQ ID NO:3-9のいずれかの配列の逆相補配列に作動可能に連結されている、抗体重鎖またはその断片をコードする第1のポリヌクレオチド;及び
SEQ ID NO:3-9のいずれかの配列と少なくとも85%の同一性を有する配列またはSEQ ID NO:3-9のいずれかの配列の逆相補配列に作動可能に連結されている、抗体軽鎖またはその断片をコードする第2のポリヌクレオチド;
である、宿主細胞。
SEQ ID NO:3-9のいずれかの配列と少なくとも85%の同一性を有する配列またはSEQ ID NO:3-9のいずれかの配列の逆相補配列に作動可能に連結されている、抗体軽鎖またはその断片をコードする第2のポリヌクレオチド;
である、宿主細胞。
(37)前記第1のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 4と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第2のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 4と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、請求項(36)に記載の宿主細胞。
(38)前記第1のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 4と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第2のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 9と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、請求項(36)に記載の宿主細胞。
(39)前記第1のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 9と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第2のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 9と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、請求項(36)に記載の宿主細胞。
(40)前記第1のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 4と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第2のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 17と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、請求項(36)に記載の宿主細胞。
(41)前記第1のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 9と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第2のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 17と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、請求項(36)に記載の宿主細胞。
(42)発現カセットを含む発現ベクターであって、前記発現カセットは、ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター、及びSEQ ID NO:3-9からなる群から選択される配列と少なくとも85%の同一性を有する制御配列が含まれ、前記制御配列は前記プロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクター。
(43)センス鎖とアンチセンス鎖を有し、かつ前記センス鎖は、SEQ ID NO:3-9からなる群から選択される配列と少なくとも85%の同一性を有する配列を含む(5’から3’へ)、請求項(42)に記載の発現ベクター。
(44)センス鎖とアンチセンス鎖を有し、かつ前記アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:3-9からなる群から選択される配列と少なくとも85%の同一性を有する配列(5’から3’へ)、請求項(42)に記載の発現ベクター。
本発明の一局面において、本開示による転写調節エレメントWXREを使用することで、外来タンパク質の発現レベルを大きく向上させ、哺乳動物タンパク質の生産に大きく貢献する。
いくつかの態様において、外来タンパク質の発現レベルは、約または少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%または80%増加する。いくつかの態様において、外来タンパク質の発現レベルは80%増加する。
別の態様において、本開示による転写調節エレメントWXREを使用することで、外来タンパク質の発現レベルを大きく向上るとともに、それ自体の生化学的な活性を維持することが可能である。
別の態様において、本開示による転写調節エレメントWXREは、他の転写調節エレメントと一緒に一体的に使用することができ、外来タンパク質の発現レベルを大きく向上るとともに、それ自体の生化学的な活性を維持することが可能である。
定義
本開示の特許請求の範囲および/または明細書において、「一(a)」または「一(an)」または「一(the)」という単語は「1つ」を指す場合があるが、「1つまたは複数」、「少なくとも1つの」及び「1つまたは1つ超」 を指すことができる。
本開示の特許請求の範囲および/または明細書において、「一(a)」または「一(an)」または「一(the)」という単語は「1つ」を指す場合があるが、「1つまたは複数」、「少なくとも1つの」及び「1つまたは1つ超」 を指すことができる。
特許請求の範囲と明細書で使用される場合、「包含する」、「を有する」、「含む」または「含有する」という用語は、包括的またはオープン形式を意味し、記載されていない要素または方法・ステップを除外しない。そして、「包含する」、「を有する」、「含む」または「含有する」は、クローズド形式を意味する場合もあり、記載されていない要素または方法・ステップを除外する。
本出願の全体において、「約」という用語は、ある値がこの値を決定するために使用されるデバイスまたは方法の誤差を含む標準偏差を意味する。
公開された内容では、「または」という用語は、「および/または」と代替の両方だけに定義されているが、代替のみまたは代替同士が排他的であることが明確に示されていない限り、特許請求の範囲における「または」という用語は「および/または」を意味する。
本開示における「転写調節エレメント」(Transcriptional Regulatory Element)とは、遺伝子転写の制御に関与するいくつかのポリヌクレオチドを意味する。任意に、前述ポリヌクレオチドは、主にプロモーター、エンハンサー、インシュレーター(insulator)等を含むDNAから選択されることができる。本開示において、転写調節エレメントはWXRE(WuXi Regulatory Element)とも呼ばれる。例示的に、本開示におけるWXREは、転写調節エレメントA、転写調節エレメントB、転写調節エレメントC、転写調節エレメントD、転写調節エレメントE、転写調節エレメントF、転写調節エレメントGを含む。
本開示における「逆相補配列」(Reverse Complementary Sequence)とは、元のポリヌクレオチドの配列の方向と反対で、かつ元のポリヌクレオチドの配列と相補的な配列と意味する。例示的に、元のポリヌクレオチド配列がACTGAACである場合、その逆相補配列がGTTCAGTである。
本開示における「内部リボソーム侵入部位」(IRES)は、翻訳制御配列に属し、通常、キャップに依存せずRNAを翻訳可能するように、注目する遺伝子の5‘末端に位置する。転写されたIRESは、リボソームサブユニットに直接結合でき、その結果、mRNAの開始コドンはリボソームに対して適切に配向されて翻訳を開始する。IRES配列は、通常mRNAの5’UTR(開始コドンの上流直前)にある。IRESは、機能的に、真核生物の翻訳メカニズムでの相互作用するさまざまなタンパク質因子のニーズを充足する。
本開示における「ベクター」は、ポリヌクレオチドの送達ビヒクルを指す。いくつかの実施形態において、遺伝子工学組換え技術では、ベクターは、作動可能に挿入された特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、このタンパク質の発現を可能にする。ベクターは、宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトするために用いられ、ベクターによって運ばれる遺伝物質要素が宿主細胞で発現されることが可能である。本開示における「ベクター」は、染色体、非染色体と合成核酸ベクター(適切な一連の発現制御エレメントを含む核酸配列)を含む任意の適切なベクターでありえる。例示的に、前記ベクターは、組換えプラスミドベクター、組換え真核生物ウイルスベクター、組換えバクテリオファージベクター、組換え酵母ミニ染色体ベクター、組換え細菌人工染色体ベクターまたは組換え酵母プラスミドベクターであってもよい。
例示的に、本開示におけるベクターは、SV40の誘導体、細菌プラスミド、バクテリオファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとバクテリオファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ならびにウイルス核酸(RNAまたはDNA)ベクターを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。
具体的な一実施形態において、本開示に係るベクターは図1-2、5-6、8-9で示されるものである。上記ベクターの模式図において、CMVは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター(Human cytomegalovirus promoter、例えば、PubMed PMID: 2985280を参照)を意味する。TK pAは、チミジンキナーゼポリアデニル化シグナル(Thymidine kinase polyadenylation signal、例えば、PubMed PMID: 3018551を参照)を意味する。SV40は、SV40初期プロモーター(SV40 early promoter、例えば、PubMed PMID: 6286831を参照)を意味する。BSRは、ブラスチシジン耐性遺伝子選択マーカー(Blasticidin resistance gene: selection marker、例えば、PubMed PMID: 7948022を参照)を意味する。SV pAは、SV40ポリアデニル化シグナル(SV40 polyadenylation signal、例えば、PubMed PMID: 6113054を参照)を意味する。pUC oriは、pUCプラスミドの複製起点(例えば、PubMed PMID: 2985470を参照)を意味する。Ampは、アンピシリン耐性遺伝子(Ampicillin resistance gene、例えば、PubMed PMID: 2985470を参照)を意味する。EMCV IRESは、脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム侵入部位(例えば、PubMed PMID: 8954121を参照)を意味する。Zeocinは、ゼオシン耐性遺伝子選択マーカー(Zeocin resistance gene: selection marker、例えば、PubMed PMID: 2450783を参照)を意味する。EF1αIは、ヒト伸長因子1α(human elongation factor 1 alpha、例えば、PubMed PMID:2210382)遺伝子の1番目のイントロンを意味する。
いくつかの実施形態において、本開示におけるCMVプロモーターは、SEQ ID NO:16と少なくともまたは約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有する配列を含んでよい。本明細書で使用される場合、プロモーターとは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからの転写開始を起こすDNA領域を意味する。プロモーターは、コード配列における転写開始部位の近く、かつDNAの上流(コード配列のセンス鎖の5'領域に向かって)に位置する。いくつかの実施形態において、他のプロモーターを使用することができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、SV40プロモーター、hCMVプロモーター、mCMVプロモーター、レチノスキシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、CRXプロモーター、または光受容体間レチノイド結合タンパク質(interphotoreceptor retinoid binding protein、IRBP)プロモーターである。コードされたタンパク質の組織特異的発現を可能にする任意のプロモーターも使用することができる。
本開示における「宿主細胞」は、外来ポリヌクレオチドおよび/またはベクターが導入された細胞。前記宿主細胞は、真核宿主細胞または原核宿主細胞である。その中で、前記真核宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真菌宿主細胞、真核藻類宿主細胞、センチュウ宿主細胞、原生動物宿主細胞と魚類宿主細胞であってもよい。例示的に、本開示における宿主細胞は真核宿主細胞であり、前記真核宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。その中で、前記哺乳動物宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、COS細胞、Vero細胞、SP2/0細胞、NS/Oミエローマ細胞、ヒト胎児性腎細胞、未成熟ハムスター腎細胞、HeLa細胞、ヒトB細胞、cv-1/EBNA細胞、L細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞、293細胞とMDCK細胞から選択される。例示的に、本開示における哺乳動物宿主細胞がCHO細胞である。
本開示における「タンパク質発現システム」は、宿主及び外来遺伝子を含むベクターを含み、かつ宿主における外来遺伝子の発現の目的を達成することができるシステムである。タンパク質発現システムは、一般的に、以下の要素を含む:(1)宿主、即ち、細菌、酵母、植物細胞と動物細胞等から選択され得るタンパク質を発現する生命体;(2)宿主と対応するベクター。異なるの宿主によると、ベクターは、原核(細菌)発現ベクター、酵母発現ベクター、植物発現ベクター、哺乳動物発現ベクター、と昆虫発現ベクター等に分けられる。ベクターは、外来遺伝子の断片が含まれる。外来遺伝子は、ベクターの媒介を介して宿主で発現させることができる。いくつかの実施形態において、発現されたタンパク質産物は分泌される。いくつかの実施形態において、ベクターは、宿主細胞のDNAに組み込まれる。
タンパク質発現における重要なステップは、目的タンパク質をコードする外来遺伝子を含むベクターで成功的にトランスフェクトされた組換え宿主細胞をスクリーニングすることである。最も一般的には、選択マーカーがベクターに含まれている。選択マーカーは、マーカーを含む組換え宿主細胞とそれを含まない組換え宿主細胞との区別を可能にする遺伝子またはDNA配列であり得る。選択マーカーと選択培地の組み合わせにより、ベクターでトランスフェクトされた組換え宿主細胞の増殖が可能にすると共に、トランスフェクトに成功しなかった宿主細胞の増殖が阻害される。
抗生物質耐性遺伝子は、組換え宿主細胞のスクリーニングのために最も一般的に使用されるマーカーである。選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子と抗生物質を含有する選択培地を組み合わせて使用することによって、スクリーニングを達成することができる。例示的な抗生物質選択マーカーには、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ポリミキシンB耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ブラスチシジン耐性遺伝子、フラジオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、とハイグロマイシンB耐性遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。したがって、選択抗生物質は、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、テトラサイクリン、ポリミキシンB、エリスロマイシン、カルベニシリン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ブラスチシジン、フラジオマイシン、ピューロマイシン、ゼオシンとハイグロマイシンBが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明で使用される選択マーカーは、ブラスチシジン耐性遺伝子である。いくつかの実施形態において、本発明で使用される選択マーカーは、ゼオシン耐性遺伝子である。
いくつかの局面において、本開示は、ヘテロ多量体(例えば、抗体)の発現を迅速に評価するために設計された方法を提供する。例えば、抗体を効率的に発現させるためには、抗体重鎖と抗体軽鎖を約1:1の割合で発現させる必要がある。選択用抗生物質の濃度が低すぎると、細胞内の機能的なベクターの量が少なすぎる可能性がある。選択用抗生物質の濃度が高すぎると、培養細胞に適さない状態になる可能性がある。また、2つのベクターの比率を適切に調整する必要がある。多くの異なる条件での試験に基づいて、本明細書で提供される方法は、高効率で抗体を発現することができ、かつ比較的短い時間でヘテロ多量体発現を確実に評価するために使用することができる。また、本明細書で提供される方法は、高い発現レベルで抗体を発現することができる。
いくつかの実施形態において、前記方法は、第1のポリペプチドをコードする外来遺伝子を保有する一方のベクターおよび第2のポリペプチドをコードする外来遺伝子を保有する他方のベクターという、ペアになる2つのベクターで細胞をトランスフェクトすることに関する。そして、2つの選択マーカーが使用される。1つの選択マーカーはブラスチシジン耐性遺伝子であり、もう1つの選択マーカーはゼオシン耐性遺伝子である。いくつかの実施形態において、ブラスチシジンが1-15μg/mLの量で選択培地中に存在し、ゼオシンが50-1500μg/mLの量で存在する。好ましくは、ブラスチシジンが2-12μg/mLの量で存在し、ゼオシンが100-1000μg/mLの量で存在する。より好ましくは、ブラスチシジンが3-10μg/mLの量で存在し、ゼオシンが150-800μg/mLの量で存在する。より好ましくは、ブラスチシジンが4-9μg/mLの量で存在し、ゼオシンが200-400μg/mLの量で存在する。最も好ましくは、ブラスチシジンが9μg/mLの量で存在し、ゼオシンが400μg/mLの量で存在する。任意に、ブラスチシジンが4μg/mLの量で存在し、ゼオシンが200μg/mLの量で存在する。いくつかの実施形態において、ゼオシンの濃度に対するブラスチシジンの濃度の比は1:50〜1:40(例えば、約9:400)である。いくつかの実施形態において、培地中のブラスチシジンの最低濃度が5、6、7、8または9μg/mLである。いくつかの実施形態において、培地中のブラスチシジンの最高濃度が15または20μg/mLである。
いくつかの実施形態において、選択培地は、血清、多糖(例えばグルコースおよび/またはデキストロース)、ピルビン酸ナトリウム、グルタチオン、エタノールアミン、アミノ酸(例えばグリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、グルタミン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、および/またはバリン)またはその塩、ビタミン(例えばアスコルビン酸リン酸塩(ascorbic acid phosphate)、塩化コリン、D-パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、および/またはイソイノシトール(i-inositol))、無機塩(例えば塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および/またはリン酸水素二ナトリウム)、タンパク質(例えばヒトトランスフェリンおよび/または組換えインスリン)、および/または微量元素(例えばメタバナジン酸アンモニウム、硫酸銅、塩化マンガンおよび/または亜セレン酸ナトリウム)をさらに含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、トランスフェクションから約18〜30時間(例えば、約24時間)後、ブラスチシジン(例えば、9μg/mL)とゼオシン(例えば、400μg/mL)を含有する適当な細胞培地中で培養される。その後、2〜4日ごとに細胞をブラスチシジンとゼオシンを含有する新しい培地に継代した。細胞生存率が90%以上に回復した場合、ヘテロ多量体の発現レベルを流加培養で評価できる。いくつかの実施形態において、流加培養物(fed-batch cultures)は、本明細書に記載されるような任意の培地であり得る。いくつかの実施形態において、流加培養物はブラスチシジンとゼオシンを含有する。
いくつかの実施形態において、本方法における「タンパク質発現システム」は、抗体重鎖をコードする外来遺伝子を保有する一方のベクターおよび抗体軽鎖をコードする外来遺伝子を保有する他方のベクターという、ペアになる2つのベクターに関する。2つのベクター中の選択マーカーが異なってもよい。一実施形態において、一方のベクター中の選択マーカーはブラスチシジンであり、他方のベクター中の選択マーカーはゼオシンである。ブラスチシジンとゼオシンの濃度は、本明細書に記載されるような任意の濃度であってもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、抗体重鎖をコードする外来遺伝子と抗体軽鎖をコードする外来遺伝子を含む1つのベクターに関与することもできる。
WXRE配列は2つのベクターに挿入できる。それらは同じでも異なっていてもよく、フォワード方向またはリバース方向を持つことができる。表1に2つのベクターにおけるWXREの組み合わせの例を示す。
本開示における「配列同一性」と「同一性のパーセント」は、2つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同じ(即ち同一)ヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指す。2つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列同一性は、以下の方法によって測定することができる。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を整列させ、整列したポリヌクレオチドまたはポリペプチド中の同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含む位置の数をスコアリングし、それと整列したポリヌクレオチドまたはポリペプチド中の異なるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含む位置の数と比較する。ポリヌクレオチドは、例えば、異なるヌクレオチド(即ち置換または変異)を含むこと或いはヌクレオチドの欠失(即ち、ポリヌクレオチド中の、1つまたは2つのヌクレオチドの挿入または欠失)により、一箇所で異なり得る。ポリペプチドは、例えば、アミノ酸(即ち置換または変異)を含むことによって、あるいはアミノ酸の欠失(即ち1つまたは2つのポリペプチド中のアミノ酸の挿入またはアミノ酸の欠失)によって一箇所で異なり得る。配列同一性は、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含む位置の数を、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド中アミノ酸残基の総数で割ることによって算出することができる。例をあげると、パーセント同一性は、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含む位置の数を、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド中ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の総数で割ってから100を掛けることによって算出することができる。
本開示における「動物体内の標的タンパク質の異常な発現」とは、正常な条件下での動物体内の標的タンパク質の発現レベルと比較して、検体動物体内の標的タンパク質の発現レベルが上昇または減少する;或いは正常な条件下で発現されるべきではないタンパク質が発現されている;或いは発現されるべきであるタンパク質が発現されていないことである。本発明の一局面において、前記動物は哺乳動物を指す。別の態様において、前記哺乳動物はヒトである。
本開示における「抗体」という用語は、免疫グロブリンまたはその断片またはそれらの誘導体を指し、インビトロまたはインビボのどちらで産生されるかに関われず、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含む。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体、非特異性抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、合成抗体、組換え抗体、ヘテロ接合抗体、変異抗体、グラフト抗体を含むが、これに限定されない。「抗体」という用語は、さらに例えばFab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、dAbなどの抗体フラグメント、及び抗原結合機能を保有する他の抗体フラグメントを含む。通常、このようなフラグメントには抗原結合フラグメントが含まれる。
本開示における「融合タンパク質」は、2つ以上のタンパク質またはその断片を、それぞれのペプチドの主鎖を共有結合によって連結し含有した分子を指す。融合タンパク質は、それらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝発現によって生成されることがより好ましい。好ましい実施形態において、融合タンパク質は免疫グロブリンドメインを含む。好ましい実施形態において、融合タンパク質はFc-融合タンパク質である。
例示的に、本開示で使用できる抗体には、アダリムマブ、ベズロトクスマブ、アベルマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、オクレリズマブ、ブロダルマブ、レスリズマブ、オララツマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、ネシツムマブ、インフリキシマブ、オビルトキサキシマブ、アテゾリズマブ、セクキヌマブ、メポリズマブ、ニボルマブ、アリロクマブ、エボロクマブ、ジヌツキシマブ、ベバシズマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、オビヌツズマブ、ブレンツキシマブ、ラキシバクマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、デノスマブ、オファツムマブ、ベシレソマブ、トシリズマブ、カナキヌマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、エクリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、イブリツモマブ、ファノレソマブ、トシツモマブ、ジェムツズマブ、パリビズマブ、ネシツムマブ、バシリキシマブ、リツキシマブ、カプロマブ、サツモマブ、およびムロモナブが含まれるが、これらに限定されない。
例示的に、本開示を使用できる融合タンパク質には、エタネルセプト、アレファセプト、アバタセプト、リロナセプト、ロミプロスティム、ベラタセプト、アフリベルセプトが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本開示は、2つのポリヌクレオチドの相補性の程度を限定するために使用されるハイブリダイゼーション条件についてのストリンジェンシーに関する。任意に、前述ポリヌクレオチドはDNAから選択されることができる。本開示で使用された「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション中の温度とイオン強度条件、及びある有機溶媒の存在か否かを指す。ストリンジェンシーが高いほど、標的ヌクレオチド配列と標識されたポリヌクレオチド配列との間の相補性の程度が高くなる。「ストリンジェントな条件」とは、単に相補頻度の高い塩基を有するヌクレオチド配列のみがハイブリダイゼーションできる、温度とイオン強度条件を指す。本明細書で使用される「高ストリンジェントまたはより高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーション及び洗浄に用いる条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、「Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley&「Sons、N.Y.(1989)、6.3.1-6.3.6」に参照することができる。本開示で言及される具体的なハイブリダイゼーション条件は以下の通りである:1)高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件:約45℃の6X 塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)で、続いて65℃下で0.2X SSC、0.1%SDSで一回または二回以上洗浄する;2)より高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件:65℃の0.5Mリン酸ナトリウム、7%SDS、続いて65℃下で0.2X SSC、1%SDSで一回または二回以上洗浄する。
本開示の一実施形態において、前記WXRE配列は、SEQ ID NO:3-9のいずれかの配列と比べて、少なくともまたは約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の配列同一性(それらの数の間の全ての範囲とパーセンテージを含む)を有する。いくつかの実施形態において、WXRE配列相は、SEQ ID NO: 3-9のいずれかの配列と比べて、少なくともまたは約1、2、3、4、5、6、7、9または10個の保存的変異を有する。いくつかの実施形態において、WXRE配列は、SEQ ID NO: 3-9の配列と比べて、少なくともまたは約1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のヌクレオチドが異なる。WXRE配列には、フォワード方向またはリバース方向を持つことができる。本明細書で使用される場合、センス鎖(5’から3’へ)が対象の配列と同一の配列を有する場合は、対象の配列はフォワード方向である。センス鎖が対象の配列に逆相補的である配列を有する場合は、対象の配列はリバース(reverse)方向である。SEQ ID NO: 3-9と逆相補な配列は、それぞれSEQ ID NO: 17-23で示される。いくつかの実施形態において、本開示は、SEQ ID NO: 17-23から選択される配列の、少なくともまたは約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%(それらの数の間の全ての範囲とパーセンテージを含む)である配列を提供する。
いくつかの実施形態において、WXRE配列は、外来タンパク質の発現レベルを(例えば、WXRE配列のない制御配列と比較して)約または少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%または80%増加させることができる。
本開示の一実施形態において、前記転写調節エレメントはまた、WXRE配列と他の真核細胞株のタンパク質の発現レベルを増加させ得る配列を含むヌクレオチド配列から選択される。例示的に、本開示における転写調節エレメントは、WXRE配列とSEQ ID:13(ヒトEF1αIの第1のイントロン)で示される配列と配列同一性を有する配列とを含むヌクレオチド配列である。
本開示の一実施形態において、前記SEQ ID:13で示される配列と配列同一性を有する配列は、SEQ ID:13(ヒトEF1αIの第1のイントロン)で示される配列に比べて、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の配列同一性(それらの数の間の全ての範囲とパーセンテージを含む)を有する。いくつかの実施形態において、前記配列は、外来タンパク質の発現レベルを(例えば、そのような配列のない制御配列と比較して)約または少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%または80%を増加させ得る。
いくつかの実施形態において、WXRE配列、プロモーターとポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、WXRE配列、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと1つ以上の追加の調節エレメントが作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、1つ以上の追加の調節エレメントはEF1αIのイントロン(例えば、ヒトEF1αIの第1のイントロン)である。作動可能に連結されているWXRE配列、プロモーターとポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、様々な順序を有することができる。例えば、WXRE配列は、プロモーターの前(例えば、コード配列のセンス鎖の5’から3’)またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの後(例えば、コード配列のセンス鎖の5’から3’)に位置することができる。いくつかの実施形態において、WXRE配列とプロモーターの間、またはWXRE配列とポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの間に少なくともまたは約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1K、2K、3K、4Kまたは5K個のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、WXRE配列とプロモーターの間、またはWXRE配列とポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの間に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1K、2K、3K、4Kまたは5K個以下のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、1つ以上の追加の調節エレメントは、プロモーターとポリペプチドをコードする配列の間に位置する。
本開示はまた、組換えのタンパク質またはポリペプチドの発現を増強する方法を提供する。前記方法は、1つ以上の本明細書に記載されるようなベクターを細胞に(例えば、形質転換またはトランスフェクトによって)挿入し、培地で細胞を培養し、そのように発現された組換えタンパク質またはポリペプチドを回収することに関する。
本開示で使用された分子生物学的方法は、すべて「Current Protocols in Molecular Biology」(Wiley発行)、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」(Cold Spring Harbor Laboratory発行)等の開示された出版物に記載された対応する方法を参照できる。
実施例
実施例
本開示の他の目的、特徴と利点は、以下の詳細な説明で明らかになる。しかしながら、詳細な説明と具体的な実施例は、(本開示の具体的な実施形態を表すが)当業者がその詳細を読んだ後に、本開示の精神および範囲内で行われた様々な変更および変化が明らかになるので、例示の目的でのみ提供されることを理解されるべきである。
実施例で使用された全ての試薬は、特に強調されていない限り、商業的供給源から購入および入手することができる。
実施例1:ベクターライブラリーの構築と緑色蛍光タンパク質を発現する安定した細胞集団の構築
1.1チャイニーズハムスター卵巣細胞ゲノム断片を含むベクターライブラリーの製造
1.1.1制限エンドヌクレアーゼBamHIを含む酵素消化キット(NEB)中のBamHIを用いて、GFP発現ベクター(即ち図1に示されるベクター)1μgを酵素消化して線形化し、37℃で一晩保存した(酵素消化反応における試薬の組成と含有量を表2に示す)。ここで、BamHIは、任意にGFPに対応するプロモーター上流に存在する特異的な酵素消化部位に対応する他のエンドヌクレアーゼで置き換えることができる。
GFP発現ベクターの模式図は図1に示す通りである。
1.1.2 約500万個のCHO宿主細胞を取り、DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN)を使用してCHO宿主細胞のゲノムDNAを抽出し、上記ゲノムDNAが100μLの前述キットの溶出バッファーに溶解された。
1.1.3 100Uの制限エンドヌクレアーゼBglII(NEB)またはDpnII(NEB)でゲノムDNA5μgを酵素消化した(酵素消化反応における試薬の組成と含有量は表3の通りである)。ステップ1.1.1で線形化されたベクターのエンドヌクレアーゼ粘着末端と合致する限り、他の制限エンドヌクレアーゼも使用することができる。
1.1.4 1.1.1で線形化された後のベクターを、2Uの子ウシ腸アルカリフォスファターゼ(NEB)で37℃、30分間程度処理した。他のタイプのアルカリフォスファターゼも使用することができる。
1.1.5 1.1.4で線形化されたGFP発現ベクターと1.1.3で酵素消化されたのCHOゲノムDNAは、それぞれアガロースゲル電気泳動による分離にかけられた。ゲルを切断してGFP発現ベクターフラグメントと酵素消化されたゲノム1-4kbの断片を回収し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いて電気泳動した後のアガロースゲルからDNAを抽出した。
1.1.6 1.1.5で回収して得られたGFP発現ベクターフラグメントとゲノム断片を、DNA Ligation Kit(Takara, Cat# 6022)を用いて、16℃の条件下で45分間のライゲーション反応(ライゲーション反応における試薬の組成と含有量を表4に示す)を行ってライゲーションした。
1.1.7 1.1.6で得られたライゲーション産物10μLを取り、100μLコンピテント細胞に加え、氷浴に30分間入れ、42℃で1分間熱ショックした後、氷上で1分間置き、抗生物質を含まない新鮮なLB培地500μLを各チューブの細胞へ加え、37℃の温度下で45分間回復させた。プレーティングのステップをスキップし、アンピシリンを100mg/L含有する培地500mLを直接添加し、Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)を用いてベクターの抽出を行った。抽出したDNAをベクターライブラリーとした。
1.1.8 1.1.7で得られたベクターライブラリーは、例えばPvuI(NEB)などの酵素消化部位がベクターバックボーンの原核領域(prokaryotic region)のみにある制限エンドヌクレアーゼで線形化され、1.1.1と同じの反応条件で、37℃条件下で一晩保存した。翌日にフェノール‐クロロホルム法によりDNAを回収してトランスフェクトに用いた。
1.2緑色蛍光タンパク質を発現する安定した細胞集団の構築
1.2.1 約500万個のCHO宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。そして、Amaxa SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit L(Lonza、Cat# VCA-1005)に含まれる90μL SF Cell Line Solutionおよび20μL Supplement Iと0.3〜0.6μgステップ1.1.8で得られた線形化されたベクターライブラリーとを均一に混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーションキュ用ベットに移した。4D-Nucleofector(登録商標) システムエレクトロポレーション装置で、それぞれの宿主細胞に対応するプログラムを用いて細胞をトランスフェクションした。エレクトロポレーション後の細胞を抗生物質を含まない培地5mLに懸濁し、37℃のシェーカーに入れて培養した。
1.2.2 トランスフェクションから24時間後、ベクターの耐性遺伝子に対応の抗生物質を含む選択培地を等量で細胞培地に添加した(この実験では、抗生物質は800μg/mLのゼオシンであった)。
1.2.3 細胞は2〜4日ごとにカウントされた。細胞の増殖状況に応じて継代を行い、ベクター中の耐性遺伝子に対応の抗生物質を含む選択培地を用いてスクリーニングを行った(この実験では、抗生物質は400μg/mLのゼオシンであった)。細胞生存率が90%以上に回復したときにクローンスクリーニングを準備した。
実施例2:緑色蛍光タンパク質を高度に発現するクローンのスクリーニング
2.1 単細胞ソーティングと増幅
2.1.1 実施例1のステップ1.2.3で回復した後の細胞集団にGFP発現レベルの比較的高い(発現レベルの上位0.5%)細胞を、FACS AriaIIフローサイトメトリーソーティングによって96ウェルプレートに入れて培養した。
2.1.2 回収した細胞が肉眼で見えるようになるまで、プレート内の培地の75%を2〜4日ごとに交換した。
2.2 GFPを高度に発現するクローンのスクリーニング
2.1.2で回復された細胞は、それぞれ新しい96ウェルプレートに逐次に移され、合計で約300クローンになった(各ウェルのすべての細胞は1つの細胞に由来し、本明細書ではクローンと呼ばれる)。FACS AriaIIフローサイトメトリーによりGFP発現レベルを測定し、検出強度が上位10%のクローナルを24ウェルプレートに移して増殖させた。
実施例3:転写調節エレメントのスクリーニング、同定および検証
3.1 転写調節エレメント候補配列の同定
3.1.1 2.2で24ウェルプレートに増殖した細胞がプレートの底を実質的に覆った時、DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN)を使用して各クローナルのゲノムを抽出した。
3.1.2 フォワード方向プライマーとリバース方向プライマーを、それぞれベクターのBamHIの酵素消化部位から上流と下流約200bp程度離れたところに設計し、3.1.1で抽出したゲノムをPCR増幅にかけた。ただし、PCR反応のフォワード方向プライマーの配列は:GCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGG(SEQ ID NO:1)であり、PCR反応のリバース方向プライマーの配列は:CATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTA(SEQ ID NO:2)であった。
上記のPCR反応の反応系は表5の通りである:
上記PCR反応の反応ステップは表6の通りである:
3.1.3 PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルを切断して1kb以上の特定のバンドを回収し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いてDNAを抽出した。
3.1.4 回収されたバンドはシーケンシングに供して、転写調節エレメントの候補配列A〜Gが同定された。
3.1.5 シーケンシングによる同定から明らかにして、得られた転写調節エレメントの配列A〜Gは以下の通りである。ただし、
転写調節エレメントAの配列は、SEQ ID NO:3で示される配列(SEQ ID NO: 3の逆相補配列はSEQ ID NO: 17)であった;
転写調節エレメントBの配列は、SEQ ID NO:4で示される配列(SEQ ID NO: 4の逆相補配列はSEQ ID NO: 18)であった;
転写調節エレメントCの配列は、SEQ ID NO:5で示される配列(SEQ ID NO: 5の逆相補配列はSEQ ID NO: 19)であった;
転写調節エレメントDの配列は、SEQ ID NO:6で示される配列(SEQ ID NO: 6の逆相補配列はSEQ ID NO: 20)であった;
転写調節エレメントEの配列は、SEQ ID NO:7で示される配列(SEQ ID NO: 7の逆相補配列はSEQ ID NO: 21)であった;
転写調節エレメントFの配列は、SEQ ID NO:8で示される配列(SEQ ID NO: 8の逆相補配列はSEQ ID NO: 22)であった;
転写調節エレメントGの配列は、SEQ ID NO:9で示される配列(SEQ ID NO: 9の逆相補配列はSEQ ID NO: 23)であった。
転写調節エレメントBの配列は、SEQ ID NO:4で示される配列(SEQ ID NO: 4の逆相補配列はSEQ ID NO: 18)であった;
転写調節エレメントCの配列は、SEQ ID NO:5で示される配列(SEQ ID NO: 5の逆相補配列はSEQ ID NO: 19)であった;
転写調節エレメントDの配列は、SEQ ID NO:6で示される配列(SEQ ID NO: 6の逆相補配列はSEQ ID NO: 20)であった;
転写調節エレメントEの配列は、SEQ ID NO:7で示される配列(SEQ ID NO: 7の逆相補配列はSEQ ID NO: 21)であった;
転写調節エレメントFの配列は、SEQ ID NO:8で示される配列(SEQ ID NO: 8の逆相補配列はSEQ ID NO: 22)であった;
転写調節エレメントGの配列は、SEQ ID NO:9で示される配列(SEQ ID NO: 9の逆相補配列はSEQ ID NO: 23)であった。
3.2 転写調節エレメントの検証
3.2.1 In-Fusion Cloning Kit(Takara)を用いて、3.1.5でシーケンシングによる同定から得られた転写調節エレメントA〜GをそれぞれGFP遺伝子を含有するベクターの対応するプロモーターの上流のBamHI酵素消化部位に挿入した。図2に示すように、転写調節エレメントが挿入されたベクター(ここで、WXREは転写調節エレメントA〜Gの1つを示す)が得られた。前述ベクターは、例えばPvuI(NEB)などの酵素消化部位がベクターバックボーンの原核領域のみにある制限エンドヌクレアーゼを使用して線形化され、37℃で一晩保存した。翌日にフェノール‐クロロホルム法によりDNAを回収してトランスフェクトに用いた。
3.2.2 約500万個のCHO宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。そして、Amaxa SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit L(Lonza, Cat# VCA-1005)に含まれる90μL SF Cell Line Solutionおよび20μL Supplement Iと、発現すべきタンパク質の情報を含む線形化されたベクター(3.2.1で得られた)30μgを均一に混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーション用キュベットに移した。4D-Nucleofector(登録商標) システムエレクトロポレーション装置で、それぞれの宿主細胞に対応するプログラムを用いて細胞をトランスフェクションした。エレクトロポレーション後の細胞を抗生物質を含まない培地5mLに懸濁し、37℃のシェーカーに入れて培養した。各サンプルは、1種類の転写調節エレメントを含むか、または対照として転写調節エレメントを含まないサンプルである。
3.2.3 トランスフェクションから24時間後、ベクターの耐性遺伝子に対応の抗生物質を含む選択培地を等量で細胞培地に添加した。抗生物質を含む培地を用いて、2〜4日ごとに細胞を継代した。
3.2.4 細胞生存率が90%以上に回復した後、タンパク質の発現レベルに対する転写調節エレメントA〜Gの影響を流加培養によって評価した。
実施例4:外来タンパク質を発現するタンパク質発現システムの発現レベルに対する転写調節エレメントの影響
4.1.1 転写調節エレメントA〜Gは、フォワード方向およびリバース方向で融合タンパク質(前述融合タンパク質がPD-L1のA鎖であり、その配列がSEQ ID NO:10で示される配列である)のプロモーターの上流BamHI位置に構築された。図2に示すように、転写調節エレメントが挿入されたベクター(ここで、WXREは転写調節エレメントA〜Gの1つである)が得られた。その中で、エレメントの名前(A〜G)の後の数字は、WXRE調節エレメントの方向を示す。転写調節エレメントの名前の後の数字1はフォワード方向を示し、数字2はリバース方向を示す。例えば、転写調節エレメントA1は、コード配列のセンス鎖においてSEQ ID NO:3で示される配列のフォワード方向(即ち5’から3’)配列を示す。転写調節エレメントA2は、タンパク質コード配列のセンス鎖においてSEQ ID NO:17で示される配列の逆相補配列を示す。
前述ベクターは、例えばPvuI(NEB)などの酵素消化部位がベクターバックボーンの原核領域のみにある制限エンドヌクレアーゼを使用して線形化され、37℃条件下で一晩保存した。翌日にフェノール‐クロロホルム法によりDNAを回収してトランスフェクトに用いた。
4.1.2 約500万個のCHO宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。そして、Amaxa SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit L(Lonza, Cat# VCA-1005)に含まれる90μL SF Cell Line Solutionおよび20μL Supplement Iと、発現すべき融合タンパク質の情報を含む線形化されたベクター(4.1.1で得られた)30μgを均一に混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーション用キュベットに移した。4D-Nucleofector(登録商標) システムエレクトロポレーション装置で、それぞれの宿主細胞に対応するプログラムを用いて細胞をトランスフェクションした。エレクトロポレーション後の細胞を抗生物質を含まない培地5mLに懸濁し、37℃のシェーカーに入れて培養した。各グループのサンプルは、特定の方向(すなわち、フォワード方向またはリバース方向)である転写調節エレメントの1つだけを含む。転写調節エレメントを含まないサンプルを対照として採用した。
4.1.3 トランスフェクションから24時間後、800μg/mLのゼオシンを含む培地を等量でトランスフェクトされた細胞に添加した。
4.1.4 2〜4日ごとに400μg/mLのゼオシンを含む培地を使用して細胞を継代した。
4.1.5 細胞生存率が90%以上に回復した後、融合タンパク質PD-L1の発現レベルを流加培養によって評価した。
4.1.6 発現により得られたPD-L1の配列が配列番号10に示す配列と同一であるかどうかを検証した。
4.2 実験結果
図3に示すように、転写調節エレメントを持たない対照群と比較して、融合タンパク質のプロモーターの上流に転写調節エレメントを挿入すると、標的タンパク質の発現量が約10〜25%程度増加した(図3のA2、B1、B2、D2、E2、F2、G1を参照)。タンパク質発現に対する一方向の上記配列の促進効果は、他の方向の促進効果よりも優れており、これはプロモーターの方向性に関連している可能性がある。
図4に示すように、発現量に対応して、上記の転写調節エレメントのフォワード方向またはリバース方向は、比生産率を約10%増加できる(図4のA2、B1、B2、D2、E2、F2を参照)。
一方、検証により、発現で得られたPD-L1の配列は、SEQ ID NO:10で示される配列と同じであった。
実施例5:アダリムマブの発現に使用されるタンパク質発現システムの発現レベルに対する転写調節エレメントの影響
5.1.1 転写調節エレメントAのリバース方向配列(A2)、転写調節エレメントBのフォワード方向配列(B1)と転写調節エレメントGのフォワード方向配列(G1)は、それぞれTakaraのIn-Fusion Cloningキットによりアダリムマブを発現するプロモーターの上流(具体的な条件を表7に示す)に構築された。図5と図6に示すように転写調節エレメントが挿入されたベクター(ここで、WXREは、転写調節エレメントA〜Gの1つである)がそれぞれ得られた。ただし、「重鎖の上流にある転写調節エレメント」が図5に示すようなベクターにクローンされ、「軽鎖の上流にある転写調節エレメント」が図6に示すようなベクターにクローンされた。ただし、図5のアダリムマブの重鎖(HC)のアミノ酸配列はSEQ ID NO:11に示す通りであり、図6中アダリムマブの軽鎖(LC)のアミノ酸配列はSEQ ID NO:12に示す通りであった。
前述ベクターは、例えばPvuI(NEB)などの酵素消化部位がベクターバックボーンの原核領域のみにある制限エンドヌクレアーゼを使用して線形化され、37℃で一晩保存した。翌日にフェノール‐クロロホルム法によりDNAを回収してトランスフェクトに用いた。
前述ベクターは、例えばPvuI(NEB)などの酵素消化部位がベクターバックボーンの原核領域のみにある制限エンドヌクレアーゼを使用して線形化され、37℃で一晩保存した。翌日にフェノール‐クロロホルム法によりDNAを回収してトランスフェクトに用いた。
5.1.2 約500万個のCHO宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。そして、Amaxa SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit L(Lonza, Cat# VCA-1005)に含まれる90μL SF Cell Line Solutionおよび20μL Supplement Iと、アダリムマブ配列の情報を含む線形化されたベクター(5.1.1で得られた)30μgを均一に混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーション用キュベットに移した。4D-Nucleofector(登録商標) システムエレクトロポレーション装置で、それぞれの宿主細胞に対応するプログラムを用いて細胞をトランスフェクションした。エレクトロポレーション後の細胞を抗生物質を含まない培地5mLに懸濁し、37℃のシェーカーに入れて培養した。各グループのサンプルは、特定の方向(すなわち、フォワード方向またはリバース方向)である転写調節エレメントの1つだけを含み、転写調節エレメントを含まないサンプルを対照として採用した。
5.1.3 抗体発現を迅速に評価するために設計された方法が使用された。この方法により、抗体の重鎖と軽鎖がほぼ1:1の比率で発現することが保証され、比較的短い時間で抗体の発現を確実に評価できる。トランスフェクションから24時間後、18μg/mLのブラストサイジンと800μg/mLのゼオシンを含む培地を等量でトランスフェクトした細胞に添加した。
5.1.4 2〜4日ごとに9μg/mLのブラストサイジンと400μg/mLのゼオシンを含む培地を使用して細胞を継代した。
5.1.5 細胞生存率が90%以上に回復した後、アダリムマブの発現レベルを流加培養により評価した。アダリムマブの重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターの両方を同じ宿主細胞にトランスフェクトすることができたので、アダリムマブの重鎖と軽鎖を同時に発現させることができた。上記の重鎖および軽鎖は宿主細胞内で自己組織化することができたので、完全なアダリムマブが得られた。
5.1.6 得られたアダリムマブの生物的活性を測定した。
5.2 実験結果
対照群と比較して、転写調節エレメントBを含むフォワード配列の一部(サンプル1、2、および4を参照)では、アダリムマブの発現レベルは10%から20%増加した(図7に示す)。
外来タンパク質発現ベクターによって発現されるアダリムマブの生物学的活性を測定することにより、その生物学的活性が、既知の市販のアダリムマブの生物学的活性と同一であることが分かった。
実施例6:アダリムマブの発現に使用されるタンパク質発現システムの発現レベルに対する転写調節エレメントの組み合わせの影響
6.1.1 図8および図9に示すように、それぞれ2つのベクターを構築した。ここで、WXREは転写調節エレメントBのフォワード方向配列(B1)であり、EF1αIはSEQ ID NO: 13で示されるヒトEF1αI遺伝子の第1のイントロンの配列であり、HCは、アダリムマブの重鎖をコードする核酸配列であり、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO: 11に示され、LCはアダリムマブの軽鎖(LC)をコードする核酸アミノ酸配列(nucleic amino acid sequence)であり、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO: 12で示される。上記ベクター構築が完了した後、MNキットを用いてプラスミド抽出を行い、得られたプラスミドを細胞トランスフェクトに用いた。
6.1.2 約500万個のCHO宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。そして、Amaxa SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit L(Lonza, Cat# VCA-1005)に含まれる90μL SF Cell Line Solutionおよび20μL Supplement Iと、アダリムマブ配列を含むベクター(6.1.1で得られた)30μgを均一に混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーション用キュベットに移した。4D-Nucleofector(登録商標) システムエレクトロポレーション装置で、それぞれの宿主細胞に対応するプログラムを用いて細胞をトランスフェクションした。エレクトロポレーション後の細胞を抗生物質を含まない培地5mLに懸濁し、37℃のシェーカーに入れて培養した。一方のサンプルは1つの転写調節エレメント、すなわちEF1αIイントロンを含み、他方のサンプルは2つのエレメント、すなわちB1およびEF1αIイントロンを含み、転写調節エレメントを含まないサンプルを対照として採用した。
6.1.3 トランスフェクションから24時間後、8μg/mLのブラストサイジンと400μg/mLのゼオシンを含む培地を等量でトランスフェクトした細胞に添加した。
6.1.4 2〜4日ごとに4μg/mLのブラストサイジンと200μg/mLのゼオシンを含む培地を使用して細胞を継代した。
6.1.5 細胞生存率が90%以上に回復した後、アダリムマブの発現レベルを流加培養により評価した。アダリムマブの重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターの両方を同じ宿主細胞にトランスフェクトすることができたので、アダリムマブの重鎖と軽鎖を同時に発現させることができた。上記の重鎖および軽鎖は宿主細胞内で自己組織化することができたので、完全なアダリムマブが得られた。
6.1.6 得られたアダリムマブの生物的活性を測定した。
6.2 実験結果
実施例6の実験結果は表8の通りである。
表8からわかるように、WXREとEF1αIイントロンを含む組み合わせは、アダリムマブの発現レベルを有意に増加させた。
外来タンパク質発現ベクターによって発現されるアダリムマブの生物学的活性を測定することにより、その生物学的活性が、既知の市販のアダリムマブの生物学的活性と同一であることが分かった。したがって、このベクターによって発現されたタンパク質は正しく折り畳まれた。
実施例7:ペムブロリズマブを発現するために使用されるタンパク質発現システムの発現レベルに対する転写調節エレメントの組み合わせの影響
7.1.1 図8および図9に示すように、それぞれ2つのベクターを構築した。ここで、WXREは転写調節エレメントBのフォワード方向配列(B1)であり、EF1αIはSEQ ID NO: 13で示されるヒトEF1αI遺伝子の第1のイントロンの配列であり、HCはペムブロリズマブの重鎖をコードする核酸配列であり、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO: 14に示され、LCはペムブロリズマブの軽鎖(LC)をコードする核酸アミノ酸配列であり、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO: 15で示される。
上記ベクター構築が完了した後、MNキットを用いてプラスミド抽出を行い、得られたプラスミドを細胞トランスフェクトに用いた。
7.1.2 以下の実験ステップは、本開示の実施例6.1.2から6.1.6に記載された実験ステップと同じであった。
7.2 実験結果
実施例7の実験結果は表9の通りである。
表9から分かるように、WXREおよびEF1αIイントロンを含む組み合わせは、ペムブロリズマブの発現レベルを有意に増加させた。
外来タンパク質発現ベクターによって発現されるペムブロリズマブの生物学的活性を測定することにより、その生物学的活性が、既知の市販のペムブロリズマブの生物学的活性と同一であることが分かった。
実施例8:タンパク質発現システムの発現レベルに対する異なる抗生物質濃度の影響
8.1.1 図10と図11に示すように、それぞれ2グループのベクターを構築した。1つのグループはアダリムマブに用いて、もう1つのグループはペムブロリズマブに用いた。ベクター構築完了した後、MNキットを用いてプラスミド抽出を行い、得られたプラスミドを細胞トランスフェクションに用いた。
8.1.2 約500万個のCHO宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。そして、Amaxa SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit L(Lonza、Cat# VCA-1005)に含まれる90μL SF Cell Line Solution及び20μLサプリメントIと、アダリムマブまたはペムブロリズマブの配列を含むベクター30μgを均一に混合し、細胞をこの混合溶液で再懸濁し、エレクトロポレーション用キュベットに移した。4D-Nucleofector(登録商標)システムエレクトロポレーション装置で、それぞれの宿主細胞に対応するプログラムを使用して、細胞をトランスフェクションした。エレクトロポレーション後の細胞を抗生物質を含まない培地5mLに再懸濁し、37℃のシェーカーに入れて培養した。
8.1.3 トランスフェクションから24時間後、2〜4日ごとに異なる濃度のブラストサイジンおよび/またはゼオシンを含む選択培地を使用して細胞を継代した。ブラスチシジンおよび/またはゼオシンの具体的な濃度を表10に示した。
8.1.4 細胞生存率が90%以上に回復した後、抗体発現レベルを流加培養により評価した。重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターの両方を同じ宿主細胞にトランスフェクトすることができたので、抗体の重鎖と軽鎖は同時に発現することができた。重鎖と軽鎖は宿主細胞内で自己組織化できるため、完全な抗体が得られた。
8.1.5 得られた抗体の生物学的活性を測定した。
8.2 実験結果
実施例8の実験結果は表10の通りである。
表10からわかるように、ブラストサイジンとゼオシンを含む組み合わせは、ブラストサイジンまたはゼオシンの単独使用と比較して、発現レベルが有意に増加した結果が得られた。
外来タンパク質発現ベクターによって発現されるアダリムマブまたはペムブロリズマブの生物学的活性を測定することにより、その生物学的活性が、既知の市販のアダリムマブまたはペムブロリズマブの生物学的活性と同一であることが分かった。したがって、このベクターによって発現されたタンパク質は正しく折り畳まれた。
本開示の上記の例は、本開示のみを明確に説明するために提供された例であり、本開示の実施形態を限定するものではない。当業者の場合、上記の仕様に基づいて、異なる形態の他の変更または変形を行うこともできる。本明細書のすべての実施形態を網羅する必要はなく、方法もありません。本開示の精神および原則の範囲内で行われた修正、同等の代替、改善などはすべて、本開示の請求項の保護範囲に含まれるべきである。
(32)EF1αI遺伝子におけるイントロンをさらに含む、(31)に記載のポリヌクレオチド。
(33)前記EF1αI遺伝子におけるイントロンは、SEQ ID NO: 13と少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、(32)に記載のポリヌクレオチド。
(34)前記SEQ ID NO: 3-9からなる群から選択される制御配列はフォワード(forward)方向である、(33)に記載のポリヌクレオチド。
(35)前記SEQ ID NO: 3-9からなる群から選択される制御配列はリバース(reverse)方向である、(34)に記載のポリヌクレオチド。
(37)前記第1のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 4と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第2のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 4と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、(36)に記載の宿主細胞。
(38)前記第1のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 4と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第2のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 9と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、(36)に記載の宿主細胞。
(39)前記第1のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 9と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第2のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 9と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、(36)に記載の宿主細胞。
(40)前記第1のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 4と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第2のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 17と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、(36)に記載の宿主細胞。
(41)前記第1のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 9と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第2のポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 17と少なくとも85%の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、(36)に記載の宿主細胞。
(43)センス鎖とアンチセンス鎖を有し、かつ前記センス鎖は、SEQ ID NO:3-9からなる群から選択される配列と少なくとも85%の同一性を有する配列を含む(5’から3’へ)、(42)に記載の発現ベクター。
(44)センス鎖とアンチセンス鎖を有し、かつ前記アンチセンス鎖は、SEQ ID NO:3-9からなる群から選択される配列と少なくとも85%の同一性を有する配列(5’から3’へ)、(42)に記載の発現ベクター。
Claims (20)
- (i)〜(iv)からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって:
(i)SEQ ID NO:3-9のいずれかの配列;
(ii)SEQ ID NO:3-9のいずれかの配列の逆相補配列;
(iii)高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、(i)または(ii)の配列とハイブリダイズ可能な配列の逆相補配列;及び
(iv)(i)または(ii)の配列に対して、少なくとも80%、または少なくとも90%、さらに少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列;
である、単離されたポリヌクレオチド分子。 - 請求項1に記載のポリヌクレオチド分子を含むベクター。
- 前記ベクターが組換え発現ベクターである請求項2に記載のベクター。
- (v)〜(viii)からなる群から選択されるヌクレオチド配列をさらに含む、
(v)SEQ ID NO:13の配列;
(vi)SEQ ID NO:13の配列の逆相補配列;
(vii)高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、(v)または(vi)の配列とハイブリダイズ可能な配列の逆相補配列;及び
(viii)(v)または(vi)の配列に対して、少なくとも80%、または少なくとも90%、さらに少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列;
である、請求項2または3に記載のベクター。 - CMVプロモーターをさらに含み、好ましくは、前記CMVプロモーターはSEQ ID NO:16のヌクレオチド配列を含むか、または前記CMVプロモーターは、前記SEQ ID NO:16の配列に対して少なくとも80%、または少なくとも90%、さらに少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、請求項2〜4のいずれか一項に記載のベクター。
- 以下の組み合わせを含む:
(1)SEQ ID NO:4の配列または該配列に対して90%の同一性を有する配列;
(2)SEQ ID NO:13の配列または該配列に対して90%の同一性を有する配列;及び
(3)SEQ ID NO:16の配列または該配列に対して90%の同一性を有する配列;
である、請求項5に記載のベクター。 - 一種類または多種類のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子をさらに含む請求項2〜6のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記タンパク質は、抗体、融合タンパク質、酵素、可溶性タンパク質、膜タンパク質、構造タンパク質、リボソームタンパク質、チモーゲン、細胞表面受容体タンパク質、転写調節タンパク質、翻訳調節タンパク質、クロマチンタンパク質、ホルモン、細胞周期調節タンパク質、Gタンパク質、神経活性化ペプチド、免疫調節タンパク質、血液成分タンパク質、イオンチャネルタンパク質、熱ショックタンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、抗生物質耐性タンパク質、いずれかの前記タンパク質の機能的フラグメント、いずれかの前記タンパク質のエピトープフラグメント、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項7に記載のベクター。
- 請求項2〜8のいずれか一項に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
- タンパク質を安定的に発現する組換え宿主細胞を製造する方法であって、請求項2〜8のいずれか一項に記載のベクターを宿主細胞に挿入するステップを含む方法。
- 前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である請求項9に記載の組換え宿主細胞または請求項10に記載の方法。
- タンパク質を製造する方法であって、タンパク質の産生を可能にする条件下で、請求項9または11に記載の組換え宿主細胞を培養するステップを含む方法。
- 請求項9または11に記載の組換え宿主細胞を含むキット。
- 異常なタンパク質発現による疾患を検出するための試薬またはキットの製造における、請求項9または11に記載の組換え宿主細胞の使用。
- 疾患を治療または予防するための医薬品の製造における、請求項9または11に記載の組換え宿主細胞の使用。
- タンパク質を安定的に発現する組換え宿主細胞をスクリーニングする方法であって、ブラスチシジンとゼオシンを含む選択培地を用いて宿主細胞をスクリーニングするステップを含む方法。
- ブラスチシジンが1-15μg/mLの量で存在し、ゼオシンが50-1500μg/mLの量で存在する請求項16に記載の方法。
- ブラスチシジンが4-9μg/mLの量で存在し、ゼオシンが200-400μg/mLの量で存在する請求項17に記載の方法。
- ブラスチシジンが9μg/mLの量で存在し、ゼオシンが400μg/mLの量で存在する請求項18に記載の方法。
- ブラスチシジンが4μg/mLの量で存在し、ゼオシンが200μg/mLの量で存在する請求項18に記載の方法。
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