CN116813776A - 一种靶向pd-1剪切亚型的特异性抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向PD‑1剪切亚型的特异性抗体，属于分子生物学技术领域。本发明提供了能够与PD‑1剪切亚型PD‑1^28特异性结合的抗体2E5和13D4，其中，2E5的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；2E5的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；13D4的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；13D4的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。本发明的2E5抗体和13D4抗体皆不结合PD‑1，而特异性结合PD‑1^28，且纯化得到的2E5抗体和13D4抗体对PD‑1^28具备较好亲和力。
Description
技术领域
本发明涉及一种靶向PD-1剪切亚型的特异性抗体，属于分子生物学技术领域。
背景技术
免疫检查点疗法(Immune checkpoint therapy，ICT)是通过共抑制或共刺激信号等一系列途径以调节T细胞活性来杀伤肿瘤细胞的治疗方法。近年来，免疫检查点疗法已被FDA批准用于部分癌症的一线治疗方法，给癌症治疗带来新的曙光(Chan等,ImmuneCheckpoint Inhibitors:Basics and Challenges[J].Current Medicinal Chemistry,2017)(Peck-Radosavljevic S M.Immunotherapy for advanced hepatocellularcarcinoma:a focus on special subgroups[J].Gut:Journal of the British Societyof Gastroenterology,2021,70(1).)。以CTLA-4、PD-1和PD-L1等为靶点的免疫检查点阻断剂广泛应用于临床。
程序化死亡分子1(PD-1)为I型跨膜糖蛋白，是免疫反应中重要的负性调控因子。在正常情况下，PD-1通过与其配体PD-L1、PD-L2结合抑制T淋巴细胞的功能，从而抑制自身免疫应答。肿瘤细胞同时表达PD-1和其配体PD-L1，T细胞表面的PD-1与肿瘤细胞上的PD-L1结合，可以阻止T细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤作用，从而导致免疫耐受，促进肿瘤细胞的免疫逃逸(L.Zitvogel等,Targeting PD-1/PD-L1 interactions for cancerimmunotherapy.OncoImmunology1,1223–1225,2012)(Freeman GJ.等,Engagement of thePD-1immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negativeregulationof lymphocyte activation.J Exp Med 1927:1027-1034,2000)。
PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂很直接的功能是清除T细胞与肿瘤细胞间的抑制信号，即PD-1与PD-L1的结合。免疫检查点阻断剂抗PD-1、抗PD-L1抗体已用于治疗多种人类肿瘤，如黑色素瘤、肾细胞癌、NSCLC、霍奇金淋巴瘤。研究表明，尽管已广泛使用PD-L1作为有利的生物标志物，病人对抗PD-1/PD-L1药物的反应率仍然只达到20％～40％左右，大部分患者对PD-1/PD-L1单克隆抗体治疗无反应、超进展或产生耐药性(Wang X.等,Tumor cell-intrinsic PD-1receptor is a tumor suppressor and mediates resistance to PD-1blockade therapy[J].Proceedings of the National Academy of Sciences117(12):201921445,2020)(Lei Q等,Resistance Mechanisms of Anti-PD1/PDL1Therapy inSolid Tumors[J].Frontiers in Cell and Developmental Biology,2020,8)(Sun J Y等,Resistance to PD-1/PD-L1 blockade cancer immunotherapy:mechanisms,predictive factors,and future perspectives[J].Biomarker Research,2020,8(1))。
不同的肿瘤类型存在癌种差别和肿瘤异质性。如黑色素瘤、肝癌、膀胱癌等肿瘤细胞表达PD-1促进肿瘤进展，而在非小细胞肺癌和结肠癌等肿瘤表达PD-1表现出抗肿瘤作用(J.Schachter等,Pembrolizumab versus ipilimumab for advanced melanoma:Finaloverall survival analysis of KEYNOTE-006.J.Clin.Oncol.34(suppl.15),9504,2016)(S.M.Ansell等,PD-1blockade with nivolumab in relapsed or refractory Hodgkin’slymphoma.N.Engl.J.Med.372,311–319,2015)(S.F.Kammerer-Jacquet等,Targeting thePD-1/PD-L1 pathway in renal cell carcinoma.Int.J.Mol.Sci.20,E1692(2019))(N.A.Rizvi等,Activity and safety of nivolumab,an anti-PD-1immune checkpointinhibitor,for patients with advanced,refractory squamous non-small-cell lungcancer(CheckMate 063):Aphase 2,single-arm trial.Lancet Oncol.16,257–265(2015))。PD-1分子异质性可能是由于选择性剪接导致转录本变异，产生不同的PD-1剪切亚型，从而发挥不同功能。已有研究表明PD-1剪切亚型有PD-1Dex2、PD-1Dex3、PD-1Dex2,3、PD-1Dex2,3,4和Δ42PD-1(Nielsen,C.等,Alternative splice variants of the humanPD-1gene.Cell Immunol 235:109–116(2005))(Zhou,J.等,Potentiating FunctionalAntigen-specific CD8+T Cell Immunity by a Novel PD1 Isoform-based Fusion DNAVaccine.Molecular Therapy 21.7:1445-1455(2013))。在类风湿关节炎中，PD-1和PD-1Dex3对滑膜T细胞活化起拮抗作用(Wan,B.等,Aberrant regulation of synovial Tcell activation by soluble costimulatory molecules in rheumatoidarthritis.Journal of Immunology 177:8844–8850(2006))。肝癌中存在PD-1的可变剪切亚型Δ42PD-1，与PD-1不同，Δ42PD-1并不通过与PD-L1/L2的相互作用发挥其生物学功能，靶向PD-1和Δ42PD-1的单克隆抗体并不能相互识别，所以PD-1抗体在治疗Δ42PD-1介导的癌症时疗效就非常有限(Tan Z.等,Isoformic PD-1-mediated immunosuppressionunderlies resistance to PD-1blockade in hepatocellular carcinomapatients.Gut.Nov 30:gutjnl-2022-327133(2022))。因此，若能深入针对PD-1剪切亚型相关的研究，可能对理解PD-1/PD-L1疗法的耐药机理十分有帮助。若能针对不同PD-1剪切亚型靶点提供特异性的PD-1抗体，有助于进一步提高PD-1抗体疗效。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种与PD-1剪切亚型特异性结合的抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述PD-1剪切亚型为PD-1^28，所述PD-1^28的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如SEQ ID NO：3所示的HCDR3，且所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、LCDR2和如SEQ ID NO：5所示的LCDR3，所述LCDR2的氨基酸序列为RMS；或，
所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：6所示的HCDR1、如SEQ ID NO：7所示的HCDR2和如SEQ ID NO：8所示的HCDR3，且所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQID NO：9所示的LCDR1、LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3，所述LCDR2的氨基酸序列为YTS。
在本发明的一种实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：11或与SEQ ID NO：11具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的氨基酸序列；或，
所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：13或与SEQ ID NO：13具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：12或与SEQ ID NO：12具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的氨基酸序列；或，
所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：14或与SEQ ID NO：14具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的氨基酸序列。
本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料为下述(a)至(g)中的任一种：
(a)编码上述抗体的重链可变区的核酸分子；
(b)编码上述抗体的轻链可变区的核酸分子；
(c)含有(a)～(b)所述核酸分子中一种或一种以上的组合的表达盒；
(d)含有(a)～(b)所述核酸分子中一种或一种以上的组合的重组载体，或含有(c)所述表达盒的重组载体；
(e)含有(a)～(b)所述核酸分子中一种或一种以上的组合的重组宿主细胞，或含有(c)所述表达盒的重组宿主细胞，或含有(d)所述重组载体的重组宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述编码上述抗体的重链可变区的核酸分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO：15或与SEQ ID NO：15具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列；或，
其核苷酸序列为SEQ ID NO：17或与SEQ ID NO：17具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述编码上述重链可变区的核酸分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO：19或与SEQ ID NO：19具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列；或，
其核苷酸序列为SEQ ID NO：21或与SEQ ID NO：21具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述编码上述轻链可变区的核酸分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO：16或与SEQ ID NO：16具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列；或，
其核苷酸序列为SEQ ID NO：18或与SEQ ID NO：18具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述编码上述轻链可变区的核酸分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO：20或与SEQ ID NO：20具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列；或，
其核苷酸序列为SEQ ID NO：22或与SEQ ID NO：22具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列。
本发明还提供了上述抗体和/或上述生物材料在(a)至(d)中的任一种应用：
(a)在检测含有PD-1^28的PD-1蛋白或制备用于检测含有PD-1^28的PD-1蛋白的产品中的应用；
(b)在制备用于结合含有PD-1^28的PD-1蛋白的产品中的应用；
(c)在介导药物特异性地识别表达含有PD-1^28的PD-1抗原的肿瘤或制备介导药物特异性地识别表达含有PD-1^28的PD-1抗原的肿瘤的产品中的应用；
(d)在含有PD-1^28的PD-1蛋白的体内显像或制备用于含有PD-1^28的PD-1蛋白的体内显像的产品中的应用。
本发明还提供了上述抗体的制备方法，所述方法包括：构建含有上述核酸分子的重组表达载体；将所述重组表达载体导入宿主细胞，获得表达所述抗体的重组细胞；培养所述重组细胞，经分离纯化获得所述抗体。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种与PD-1剪切亚型PD-1^28特异性结合的抗体2E5和13D4，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，2E5的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，包含如SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；2E5的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，包含如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、LCDR2(RMS)和如SEQ ID NO：5所示的LCDR3；13D4的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：13所示，包含如SEQ ID NO：6所示的HCDR1、如SEQ ID NO：7所示的HCDR2和如SEQ IDNO：8所示的HCDR3；13D4的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，包含如SEQ IDNO：9所示的LCDR1、LCDR2(YTS)和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3。通过Western印迹法验证表明2E5和13D4皆不结合PD-1，而特异性结合PD-1^28，通过酶联免疫吸附剂测定(ELISA)验证表明纯化得到的2E5嵌合抗体和13D4嵌合抗体对PD-1^28具备较好亲和力，且2E5抗体亲和力优于13D4抗体。
附图说明
图1：PD-1^28的表征结果。
图2：ΔPD-1^28HisTrap HP层析柱纯化图。
图3：ΔPD-1^28Surpdex200分子筛纯化图(1，2号泳道分别为ΔPD-1^28还原状态和非还原状态)。
图4：2E5鼠源抗体ProteinG层析柱纯化图。
图5：2E5嵌合抗体ProteinA层析柱纯化图。
图6：13D4鼠源抗体ProteinG层析柱纯化图。
图7：13D4嵌合抗体ProteinA层析柱纯化图。
图8：2E5鼠源抗体surpdex200分子筛纯化图(1，2号泳道分别为2E5鼠源抗体还原状态和非还原状态)。
图9：2E5嵌合抗体surpdex200分子筛纯化图(1，2号泳道分别为2E5嵌合抗体还原状态和非还原状态)。
图10：13D4鼠源抗体surpdex200分子筛纯化图(1，2号泳道分别为13D4鼠源抗体还原状态和非还原状态)。
图11：13D4嵌合抗体surpdex200分子筛纯化图(1，2号泳道分别为13D4嵌合抗体还原状态和非还原状态)。
图12：2E5和13D4抗体对ΔPD-1^28的特异性结合图。
图13：2E5和13D4抗体对ΔPD-1^28的亲和力检测图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实验例1：一种PD-1剪切亚型
本实施例提供了一种PD-1剪切亚型，所述PD-1剪切亚型通过如下步骤获得：
步骤一：在健康人的外周血单个核细胞(购自上海浚行生物科技有限公司)中扩增PDCD1。以107个/mL细胞的比例加入Trizol Reagent试剂(Takara-RNAiso Plus，9109)，上下颠倒10次充分混匀，于室温(25℃)放置15min后，得到细胞裂解液；在每1mL的细胞裂解液中加入200μL氯仿，上下颠倒10次充分混匀，于室温(25℃)放置5min后，冰上放置5min，于4℃下12000rpm离心15min，得到分层的细胞裂解液；取分层的细胞裂解液中的水相，加入等体积的异丙醇后，上下颠倒10次充分混匀，于室温(25℃)放置5min后，冰上放置5min，于4℃下12000rpm离心15min，吸弃上清，加入1mL DEPC水配制的75％乙醇混匀，于4℃下7500rpm离心5min，弃去上清，室温(25℃)晾干后加入50μL DEPC水溶解，使用Nanodrop 2000测量RNA浓度后置于冰上备用；使用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂(Takara，RR047A)对置于冰上备用的RNA进行基因组DNA去除与逆转录反应，得到cDNA样品，保存于-20℃；
步骤二：以cDNA为模板，使用如SEQ ID NO：24(AACTGGTACCGCATGAGCCC)所示的正向引物和如SEQ ID NO：25(TCCAGCTCCCCATAGTCCACAG)所示的反向引物扩增PDCD1基因(PDCD1基因信息获取自NCBI)。
从健康人的外周血单个核细胞中扩增PDCD1时，将如图1A所示的扩增产物连接于T载体后进行测序，发现其中一个克隆是在PDCD1的第二、第三个外显子中保留了第二内含子的前28个bp，将这个克隆命名为PD-1^28(氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示)，序列比对如图1B，测序峰图如图1C。根据测序结果得到了该剪切亚型的核酸序列模式图(图1D)与蛋白序列模式图(图1E)，由蛋白序列模式图(图1E)可知，PD-1^28羧基端(C端)有107个氨基酸与PD-1不同，即PD-1^28的特有氨基酸序列，将此特有氨基酸序列命名为ΔPD-1^28(SEQ ID NO：31)。
实施例1：编码与PD-1剪切亚型PD-1^28特异性结合的抗体的核酸分子的获取
本实施例提供了编码与PD-1剪切亚型PD-1^28特异性结合的抗体的核酸分子的获取，包括如下步骤：
步骤一：将PD-1^28特有氨基酸序列ΔPD-1^28所对应的核苷酸序列(SEQ ID NO：32)构建到pET-21a载体(ALMI Bio，LM-1197)，获得截短型PD-1^28(ΔPD-1^28)表达载体(为了增强ΔPD-1^28表达，ΔPD-1^28带有MBP标签)；
步骤二：将获得的ΔPD-1^28表达载体单克隆菌株在含有氨苄霉素(终浓度为0.1mg/L)的LB培养基中培养(37℃、180r/min震荡培养)，当OD值达到0.6时，加入诱导剂IPTG(终浓度为1mmol/L)，于37℃、180r/min震荡培养4h，得到培养液；将培养液离心(6500r，10min)，取细胞沉淀，用PBS溶解；经超声破碎、HisTrap HP层析柱(GE公司，17524801)和Superdex200分子筛(GE公司，28-9893-35)分离纯化，HisTrap HP层析柱纯化图如图2所示，Superdex200纯化图如图3所示；ΔPD-1^28由金斯瑞公司免疫Balb/c小鼠诱导产生特异性抗体，经细胞融合、筛选、鉴定，交付得到13D4和2E5杂交瘤细胞；
步骤三：根据实验例1步骤一的方法采用Trizol法从13D4和2E5杂交瘤细胞中抽提总RNA；
步骤四：将步骤三得到的RNA采用通用反转录试剂盒不含Taq酶M-MLV型(索莱宝，Cat.No.RP1105)以及如SEQ ID NO：26(ACAGGGATCCAGAGTTCC)所示的重链扩增所需合成引物或如SEQ ID NO：27(GCACCTCCAGATGTTAACTG)所示的轻链扩增所需合成引物合成cDNA第一条链，得到含有cDNA的反转录产物；使用表1所述反应体系，于37℃下15min，70℃下10min，获得含有dG-tailed cDNA的产物，置于冰上备用；
表1.PCR反应体系
步骤五：使用表2所述反应体系，于94℃反应5min后开始循环(94℃下1min，63℃下1min，72℃下1min)，经33个循环后，于72℃反应10min，4℃反应5min，得到PCR产物，其中，IgH-2引物序列如SEQ ID NO：28(CAGTGGATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC)所示的重链扩增所需合成引物，IgK-2引物序列如SEQ ID NO：29(GATGGTGGGAAGATGGATAC)所示的轻链扩增所需合成引物，引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO：30(CCCCCCCCCCCCCCC)所示的引物；
表2.PCR反应体系
| 试剂 | 使用量 |
| ddH2O | 28μL |
| 5×Trans Start@pfu Buffer | 10μL |
| pfu DNA Polymerase | 1μL |
| 引物2(IgK-2/IgH-2) | 1μL |
| 引物3 | 1μL |
| 含有dG-tailed cDNA的产物 | 5μL |
| 2.5m dNTPs | 4μL |
| 合计 | 50μL |
步骤六：将PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，将约500bp处的特异性条带割胶，采用琼脂糖DNA快速纯化试剂盒回收目的片段，连接于pClone007载体，转化大肠杆菌感受态Top10；连接反应体系如表3所述，于25℃连接5min；将经转化的大肠杆菌感受态Top10加600uL培养基，37℃摇床培养1h后，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，于37℃培养12h，挑取至少10个单菌落，特异引物进行PCR验证；
表3.连接反应体系
| 试剂 | 使用量 |
| pClone007 Blunt Simple Vector | 1μL |
| 凝胶回收目的片段 | 5μL(10～50ng) |
| 10×Top mix | 1μL |
| Water | 3μL |
步骤七：选取PCR验证双阳性的克隆，由擎科公司进行测序；
步骤八：将测序得到的序列与NCBI的GenBank中的己知序列进行比对，确定其前导肽编码序列及可变区的编码序列。
编码2E5的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，编码2E5的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；编码13D4的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，编码13D4的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
采用同源重组技术，根据人源抗体密码子偏好性对上述核酸分子的核苷酸序列进行优化，得到密码子优化的核酸分子；其中，密码子优化形式编码2E5的核酸分子的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，密码子优化形式编码2E5的核酸分子的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示；密码子优化形式编码13D4的核酸分子的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示，密码子优化形式编码13D4的核酸分子的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示。
实施例2：与PD-1剪切亚型PD-1^28特异性结合的抗体
本实施例提供了与PD-1剪切亚型PD-1^28特异性结合的抗体，实施例1所述核苷酸分子编码所述抗体，通过NCBI的IgBlast区分可变区的CDR区与FR区：
2E5的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，由如SEQ ID NO：1(GVNIKDTY)所示的HCDR1、如SEQ ID NO：2(IDPANGNT)所示的HCDR2和如SEQ ID NO：3(WITTSFAY)所示的HCDR3组成；2E5的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，由如SEQ ID NO：4(KSLLHSNGNTY)所示的LCDR1、LCDR2和如SEQ ID NO：5(MQHLEYPLT)所示的LCDR3组成，所述LCDR2的氨基酸序列为RMS；
13D4的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，由如SEQ ID NO：6(GYTFTEYT)所示的HCDR1、如SEQ ID NO：7(INPNNGDN)所示的HCDR2和如SEQ ID NO：8(ARDGHYDEDMAMDY)所示的HCDR3组成；13D4的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，由如SEQ ID NO：9(QDISNY)所示的LCDR1、LCDR2和如SEQ ID NO：10(QQFSKLPFT)所示的LCDR3组成，所述LCDR2的氨基酸序列为YTS。
实验例2：抗体表达纯化的方法
本实验例提供一种抗体表达纯化的方法，将实施例1中编码2E5或13D4的密码子优化的核酸分子的重链可变区的核苷酸序列通过EcoRⅠ和KpnI插入人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pCAGGS(爱迪基因，VT1076)中获得完整的嵌合重链序列表达载体；将实施例1中编码2E5或13D4的密码子优化的核酸分子的轻链可变区的核苷酸序列通过EcoRⅠ和KpnI插入人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pCAGGS中获得完整的嵌合轻链序列表达载体；
使用SMM 293-TII培养基(Sino Biological，M293TII)传代293F细胞(购自中国科学院细胞库)，取300mL细胞密度为1×106个/mL的293F细胞加入锥形摇瓶，于37℃，5％CO2下培养24h，用于转染；将900μg PEI(Yeasen，40816ES03)加入7.5mL浓度为150mM的NaCl中，漩涡震荡混匀，于室温(25℃)静置5min，得到PEI溶液；将300μg表达2E5或13D4嵌合抗体的质粒(嵌合抗体重链序列表达质粒和轻链序列表达质粒的质量比为1：1)分别加入7.5mL浓度为150mM的NaCl中，漩涡震荡混匀，得到质粒溶液；将PEI溶液以2s/滴的速率缓慢滴入质粒溶液中，上下颠倒10次充分混匀，于室温(25℃)静置15min后加入293F细胞培养液，于37℃，5％CO2下培养5天，收集与质粒共孵育的293F细胞培养液，进行纯化，其中，分别在培养24h和72h时加入SMS 293-SUPI Expression Medium Supplement(Sino Biological，SMS 293-SUPI)。培养13D4和2E5杂交瘤细胞，收集上清。将得到的嵌合抗体表达上清和杂交瘤上清作为纯化对象，使用HisTrap protein A/G HP柱与Superdex200分子筛纯化抗体，纯化过程如下：
将300mL的嵌合抗体表达上清或杂交瘤上清加入离心筒中，于4℃、6500r离心30min，取上清并用0.22μM的微孔滤膜过滤，以除去细胞杂质；使用预处理的HisTrapprotein A HP柱(GE公司，17040301)纯化嵌合抗体表达上清，使用预处理ProteinG柱(GE公司，17040401)纯化杂交瘤上清(预处理条件为：先用3个柱体积的ddH2O冲洗，再用5个柱体积的PBS缓冲液平衡)，将经离心、过滤的嵌合抗体表达上清或杂交瘤上清以2mL/min的流速过柱，使用PBS缓冲液洗杂，5mL的离心管收集(一般为杂蛋白)；待UV走平后，使用100mM pH2.7的甘氨酸(BioFroxx，1275GR500)洗脱目的蛋白，5mL离心管收集，所述离心管中预先加入400μL/管的100mM pH9的Tris(索莱宝，T8060)中和液，纯化结果如图4～7所示。
使用30KD超滤管(Millipore，ufc903096)浓缩得到的甘氨酸洗脱目的蛋白后，使用Superdex200分子筛(GE，28-9893-35)进一步纯化，收集目的蛋白，取20uL目的蛋白加入含DTT或不含DTT的5×蛋白Loading制样，SDS-PAGE检测目的蛋白分子量及蛋白纯度。纯化结果如图8～11所示。
实验例3：经纯化的2E5和13D4抗体对ΔPD-1^28的特异性结合情况
本实验例以实验例2中得到的经HisTrap protein A/G HP柱和Superdex200分子筛纯化的蛋白作为待测样本，使用Western印迹法检测经纯化的2E5和13D4抗体对ΔPD-1^28和PD-1的结合情况，包括如下步骤：
步骤一：将Con(实验室表达的pike protein-c His作为对照)、PD1(义翘神州，10377-H08H)和ΔPD-1^28相等蛋白上样量上样进行SDS-PAGE分离，转膜，整个过程在冰水混合物中进行；5％的脱脂奶粉室温(25℃)封闭2h，加入Anti-His-tag mAb-HRP-DirecT(MBL，D291-7)、2E5、13D4鼠源或嵌合抗体，4℃孵育12h，TBST漂洗3次，每次10min；加入HRPGoat Anti-Human IgG(H+L)(ABclonal，AS002)或HRP Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，室温(25℃)孵育1h，TBST漂洗3次，每次10min，最后放置于化学发光成像系统仪器中曝光。
由图12可知，2E5鼠源抗体(2E5 Mouse)、2E5嵌合抗体(2E5-Chimeric)、13D4鼠源抗体(13D4 Mouse)和13D4嵌合抗体(13D4-Chimeric)均不结合阴性对照和PD-1，而特异性结合ΔPD-1^28，说明扩增得到PD-1^28鼠单抗的可变区序列，并且2E5、13D4鼠源抗体和嵌合抗体具备特异性结合ΔPD-1^28的能力。
实验例4：2E5和13D4对ΔPD-1^28的亲和力检测
本实施例提供了2E5和13D4对ΔPD-1^28的亲和力检测，使用酶联免疫吸附剂测定，将ΔPD-1^28以100ng/孔加入96孔板中，于4℃包被16h，包被后，使用1％的PBST洗板(150μL/孔，2min/次，共3次)，以100μL/孔加入使用PBST配置的1％ BSA，于37℃封闭1h后，使用1％的PBST洗板(150μL/孔，2min/次，共3次)；使用PBS缓冲液稀释实验例2中得到的经HisTrap protein A/G HP柱和Superdex200分子筛纯化的蛋白，2E5嵌合抗体(2E5Chimeric)和2E5鼠源抗体(2E5 Mouse)，起始浓度为6.25μg/mL，2倍依次稀释，18个梯度，作为实验组，使用PBST配置的1％BSA作为空白对照；13D4嵌合抗体(13D4 Chimeric)和13D4鼠源抗体(13D4 Mouse)，起始浓度为400μg/mL，2倍依次稀释，18个梯度；将空白对照及实验组以100μL/孔加入96孔板中，于37℃孵育1h后，使用1％的PBST洗板(150μL/孔，2min/次，共5次)，得到经一抗孵育的包被ΔPD-1^28；将嵌合抗体作为一抗加入的位置处，将HRP GoatAnti-Human IgG(H+L)(ABclonal，AS002)作为二抗加入，将鼠源抗体作为一抗加入的位置处，将HRP Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(博奥易杰，BE0102)作为二抗加入，将二抗和TBST以1:8000混合，以100μL/孔加入96孔板中，空白对照的位置处加入100μL/孔的HRP GoatAnti-Human IgG(H+L)或HRP Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(各3个复孔)，于37℃孵育1h后，使用1％的PBST洗板(150μL/孔，2min/次，共5次)；以100μL/孔加入TMB显色液(碧云天，P0209-500ml)，显色5min后，以50μL/孔加入终止液(碧云天，C1058-500ml)，于酶标仪检测OD450值。亲和力检测结果见表4和图13。
由表4和图13可知，与13D4鼠源抗体相比，13D4嵌合抗体亲和力明显下降(13D4Mouse的EC50为5.316μg/mL，即35.44nM；13D4 Chimeric的EC50为423.45μg/mL，即2.82uM)，可能是因为FR区对亲和力造成影响，或是改造后影响亲和力的序列不在FR区而在恒定区，虽然抗体的恒定区不参与抗原互补结合，但其对抗体的空间结构也是极其重要的。2E5嵌合抗体亲和力相较于鼠源嵌合抗体EC50几乎没有变化，仍保持较高亲和力(2E5 Mouse的EC50为0.023μg/mL，即0.153nM；2E5 Chimeric的EC50为0.038μg/mL，即0.253nM)。综上，2E5抗体的亲和力优于13D4抗体。
表4.ELISA亲和力检测统计分析结果
| 2E5 Mouse | 2E5 Chimeric | 13D4 Mouse | 13D4 Chimeric | |
| EC50(μg/mL) | 0.023 | 0.038 | 5.316 | 423.45 |
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种与PD-1剪切亚型特异性结合的抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述PD-1剪切亚型为PD-1^28，所述PD-1^28的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如SEQ ID NO：3所示的HCDR3，且所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、LCDR2和如SEQ ID NO：5所示的LCDR3，所述LCDR2的氨基酸序列为RMS；或，
所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：6所示的HCDR1、如SEQ ID NO：7所示的HCDR2和如SEQ ID NO：8所示的HCDR3，且所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ IDNO：9所示的LCDR1、LCDR2和如SEQ ID NO：10所示的LCDR3，所述LCDR2的氨基酸序列为YTS。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：11或与SEQ ID NO：11具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的氨基酸序列；或，
所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：13或与SEQ ID NO：13具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO：12或与SEQ ID NO：12具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的氨基酸序列；或，
所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：14或与SEQ ID NO：14具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的氨基酸序列。
4.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述(a)至(g)中的任一种：
(a)编码权利要求1～3任一项所述抗体的重链可变区的核酸分子；
(b)编码权利要求1～3任一项所述抗体的轻链可变区的核酸分子；
(c)含有(a)～(b)所述核酸分子中一种或一种以上的组合的表达盒；
(d)含有(a)～(b)所述核酸分子中一种或一种以上的组合的重组载体，或含有(c)所述表达盒的重组载体；
(e)含有(a)～(b)所述核酸分子中一种或一种以上的组合的重组宿主细胞，或含有(c)所述表达盒的重组宿主细胞，或含有(d)所述重组载体的重组宿主细胞。
5.如权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述编码如权利要求1～3任一项所述抗体的重链可变区的核酸分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO：15或与SEQ ID NO：15具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列；或，
其核苷酸序列为SEQ ID NO：17或与SEQ ID NO：17具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述编码如权利要求1～3任一项所述重链可变区的核酸分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO：19或与SEQ ID NO：19具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列；或，
其核苷酸序列为SEQ ID NO：21或与SEQ ID NO：21具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列。
7.如权利要求4～6任一项所述的生物材料，其特征在于，所述编码如权利要求1～3任一项所述轻链可变区的核酸分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO：16或与SEQ ID NO：16具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列；或，
其核苷酸序列为SEQ ID NO：18或与SEQ ID NO：18具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列。
8.如权利要求4～6任一项所述的生物材料，其特征在于，所述编码如权利要求1～3任一项所述轻链可变区的核酸分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO：20或与SEQ ID NO：20具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列；或，
其核苷酸序列为SEQ ID NO：22或与SEQ ID NO：22具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性且具有相同的功能的核苷酸序列。
9.权利要求1～3任一项所述抗体和/或权利要求4～8任一项所述生物材料在(a)至(d)中的任一种应用：
(a)在检测含有PD-1^28的PD-1蛋白或制备用于检测含有PD-1^28的PD-1蛋白的产品中的应用；
(b)在制备用于结合含有PD-1^28的PD-1蛋白的产品中的应用；
(c)在介导药物特异性地识别表达含有PD-1^28的PD-1抗原的肿瘤或制备介导药物特异性地识别表达含有PD-1^28的PD-1抗原的肿瘤的产品中的应用；
(d)在含有PD-1^28的PD-1蛋白的体内显像或制备用于含有PD-1^28的PD-1蛋白的体内显像的产品中的应用。
10.权利要求1～3任一项所述抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：构建含有权利要求5～8任一项所述核酸分子的重组表达载体；将所述重组表达载体导入宿主细胞，获得表达所述抗体的重组细胞；培养所述重组细胞，经分离纯化获得所述抗体。
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