JP2021525548A - 転写調節エレメント及びそれの外来タンパク質発現の増強における応用 - Google Patents

Abstract

本開示は、タンパク質発現システムでのタンパク質の発現レベルを高めるためのＷＸＲＥ転写調節エレメントとして使用することができるポリヌクレオチド、ならびに前述のＷＸＲＥ転写調節エレメントを含むタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムおよびそれらの使用に関する。本開示による転写調節エレメントＷＸＲＥを使用することで、外来タンパク質の発現レベルを大きく向上るとともに、それ自体の生化学的な活性を維持することができる。【選択図】図１

Description

本開示は、分子生物学および生物工学分野に関する。特に、本開示は、哺乳動物細胞を使用して外来タンパク質を発現することにおける新規な転写調節エレメントに関する。具体的には、本開示は、真核細胞株にて外来タンパク質を製造、その発現レベルを増強するために用いられる転写調節エレメントであるＷＸＲＥ（ＷｕＸｉ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）、及びＷＸＲＥを含有する外来タンパク質発現システム、ならびに外来タンパク質の生産における前述発現システムの応用に関する。

生物学的研究では、タンパク質の研究がますます注目を集めており、タンパク質研究で最も重要なことは、タンパク質発現システムの選択である。タンパク質発現システムとは、細菌、酵母、植物細胞或いは動物細胞などのモデル生物を用いて外来タンパク質を発現する分子生物学的技術である。タンパク質発現システムは、原核生物の発現システムと真核発現システムに大まかに分けられている。

ここで、原核生物の発現システムは、原核生物を介して外来タンパク質を取得するシステムであり、主に、大腸菌発現システム、枯草菌発現システム、ストレプトミセス発現システムなどが含まれる。その中で、大腸菌システムが最も広く使用されている。原核生物の発現システムは、宿主細菌の急速な増殖、簡単な培養、便利な操作、安価な価格、明確な遺伝的背景、安全な遺伝子、高いタンパク質の発現レベルという特徴がある。しかしながら、原核生物の発現システムは、発現時間及び発現レベルを制御することができない。また、原核生物の発現システムでは、発現産物が封入体として存在する可能性があるため生物的活性が低く、翻訳後プロセシングおよび修飾システムが不完全である（例えば、グリコシル化修飾ができない）。

一方、真核発現システムには、主に哺乳動物細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞の発現システムが含まれる。これは、近年一般的な外来タンパク質を発現する手段の一つであり、原核生物の発現システムに欠けているいくつかの機能を補完する。具体的に、例えば真核発現システムで発現した場合に安定したジスルフィド結合を形成でき、タンパク質の翻訳済、タンパク質を正しく修飾することで発現したタンパク質が分解されたり封入体を形成したりすることなく、より天然な活性を持つことができる。ただし、哺乳動物発現システムは、高効率発現の誘導、発現のタンパク質の正しく折り畳み、複雑なグリコシル化修飾を正確に行え、天然タンパク質に近いタンパク質活性を持ち、且つエンドトキシンを除去する必要がない等の特徴がある。そして、哺乳動物発現システムは、複雑タンパク質を発現できる唯一のシステムであり、抗体、例えばヒト化モノクローナル抗体の生産では、大量生産可能でヒト化特性が良好などの特徴がある。哺乳動物発現システムに一般的に使用される宿主細胞として、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ等の細胞が含まれる。

アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、商品名：ＨＵＭＩＲＡ）は、関節リウマチと強直性脊椎炎の治療における応用がＮＭＰＡ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に承認された、抗ヒト腫瘍坏死因子（ＴＮＦ）のヒト化モノクローナル抗体である。そして、良好な治療効果を持つ。

顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ-ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、ＧＭ-ＣＳＦ）は、多機能性的な造血細胞成長因子であり、顆粒球類及びマクロファージの発達と成熟において調節的役割を果たす。ＧＭ-ＣＳＦは、滑膜組織の単球の炎症性樹状細胞への分化においても重要な役割を果たし、急性関節炎の発生と発症の誘発及び維持に関与している。そして、関節リウマチ患者の血清及び滑膜の検査では、ＧＭ-ＣＳＦ因子のレベルが著しく増加し、疾患活発と密接に関連していることが分かった。これは、主に骨侵食の発展、滑膜内層細胞及びその下層細胞に多数のマクロファージの浸潤に反映される。

ＰＤ-１は、活性化されたＴ細胞とＢ細胞によって発現される重要な免疫チェックポイント受容体であり、免疫阻害を仲介することができる。ＰＤ-１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ-４、ＩＣＯＳ、ＰＤ-１、及びＢＴＬＡを含むＣＤ２８受容体ファミリーのメンバーである。ＰＤ-１について、細胞表面糖タンパク質リガンドであるプログラム細胞死リガンド-１（ＰＤ-Ｌ１）とプログラム細胞死リガンド-２（ＰＤ-Ｌ２）がすでに同定されている。これらは、抗原提示細胞と多くのヒトがんで発現され、ＰＤ-１に結合するとＴ細胞の活性化と細胞因子の分泌をダウンレギュレートすることが示されている。

ＰＤ-Ｌ１は、ＣＤ２７４或いはＢ７-Ｈ１とも呼ばれる。それは、さまざまな腫瘍細胞で発現がアップレギュレートされ、Ｔ細胞上のＰＤ-１と結合すると、Ｔ細胞の増殖と活性化を阻害し、Ｔ細胞を不活化状態にし、最終に免疫逃避を誘導する。ＰＤ-Ｌ１阻害剤は、ＰＤ-１とＰＤ-Ｌ１との結合をプロックでき、Ｔ細胞の成長と増殖をアップレギュレートし、腫瘍細胞に対するＴ細胞の認識を高め、Ｔ細胞の攻撃と殺傷機能を活性化し、ヒト自身の免疫機能を動員することによって抗腫瘍効果を果たす。

アダリムマブなどのモノクローナル抗体、ＰＤ-１に対するモノクローナル抗体とＰＤ-Ｌ１に対するモノクローナル抗体は、すべて哺乳動物発現システムによって生産されることができる一方、哺乳動物発現システムには外来タンパク質の発現レベルが低いという問題がある。したがって、先行技術として知らされている哺乳動物発現システムを改善し、著しく高いレベルの外来タンパク質発現を達成できるシステムを提供することが切迫されている。そして、ヒト化モノクローナル抗体を作製するには、上記システムが必要である。

本開示は、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞に由来する、外来タンパク質発現の増強に使用できるＤＮＡ配列であり、哺乳動物発現システムでの外来タンパク質の発現レベルを増強できるＤＮＡ配列を提供する。

本開示に係る技術構成は以下の通りである。

（１）（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドであって：
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３-９のいずれかで示される配列を含むヌクレオチド配列；
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３-９のいずれかで示される配列の逆相補配列を含むヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｉ）または（ｉｉ）で示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な配列の逆相補配列；
（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）で示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、さらに少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列；
である、ポリヌクレオチド。

（２） （ｖ）〜（ｖｉｉｉ）から選択されるいずれか１つをさらに含む：
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示される配列を含むヌクレオチド配列；
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示される配列の逆相補配列を含むヌクレオチド配列；
（ｖｉｉ）高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｖ）または（ｖｉ）で示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な配列の逆相補配列；
（ｖｉｉｉ）（ｖ）または（ｖｉ）で示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、さらに少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列；
である、（１）に記載のポリヌクレオチド。

（３）タンパク質発現システムでのタンパク質の発現レベルを高めることができる（１）〜（２）のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。任意に、タンパク質発現システムが真核細胞タンパク質発現システムから選択される。好ましくは、前記真核細胞タンパク質発現システムがＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞のタンパク質発現システムである。

（４） 前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される配列を含む配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される配列の逆相補配列を含む配列から選択される、（１）〜（２）のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。任意に、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示される配列とを含むヌクレオチド配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される配列の逆相補配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示される配列の逆相補配列とを含むヌクレオチド配列から選択される。

（５）タンパク質発現システムが、抗体、融合タンパク質または組換えタンパク質を発現するものである、（３）に記載のポリヌクレオチド。任意に、前記抗体はモノクローナル抗体から選択され、前記融合タンパク質がプログラム細胞死受容体-１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ-１、ＰＤ-１）に対する抗体またはプログラム細胞死受容体リガンド-１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ- Ｌｉｇａｎｄ １、ＰＤ-Ｌ１）に対する抗体である。好ましくは、前記モノクローナル抗体はアダリムマブから選択され、前記ＰＤ-１に対する抗体がペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）である。

（６）（１）〜（５）のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する、タンパク質発現システムでのタンパク質の発現レベルを増強するためのＷＸＲＥ転写調節エレメント。

（７）（１）〜（５）のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは（６）に記載のＷＸＲＥ転写調節エレメントを含有するタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム。任意に、前記タンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムは少なくとも１つのプロモーターと少なくとも１つの制限酵素サイトをさらに含む。好ましくは、前記タンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムは哺乳動物細胞タンパク質発現ベクターまたは哺乳動物細胞タンパク質発現システムから選択される。より好ましくは、前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である。

（８）（７）に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムを含有する細胞株。

（９）（７）に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または（８）に記載の細胞株を含有するキット。

（１０）（７）に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または（８）に記載の細胞株の、異常なタンパク質発現による動物の疾患を検出するための試薬またはキットの製造における使用。

（１１）前記動物の疾患が前記動物体において標的タンパク質の異常な発現を引き起こし、かつ前記タンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムまたは細胞株が、前記標的タンパク質に対する抗体を分泌することができる、（１０）に記載の使用。任意に、前記動物は哺乳動物から選択される。好ましくは、前記哺乳動物がヒトである。

本発明の一局面において、関節リウマチでは、ＧＭ-ＣＳＦ因子の発現レベルが顕著に増強し、疾患活発と密切に関連していることが先行技術で知られることができる。これは、主に骨侵食の発展、滑膜内層細胞及びその下層に多数のマクロファージの浸潤に反映される。したがって、本開示に係るタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムによって抗ＧＭ-ＣＳＦ抗体を製造することができる。ただし、ＧＭ-ＣＳＦ抗体の配列は先行技術で知られているもの通りである。例示的に、抗ＧＭ-ＣＳＦ抗体の配列は、ＷＯ ２０１８０５０１１１ Ａ１で示される配列から選択することができる。抗ＧＭ-ＣＳＦ抗体が得られた後、ＧＭ-ＣＳＦの発現レベルを検出することにより、関節リウマチの診断に用いることができる。

（１２）（７）に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または（８）に記載の細胞株から発現したタンパク質の、動物の疾患を治療または予防するための医薬品の製造への使用。任意に、前記動物の疾患は腫瘍或いは自己免疫疾患から選択される。

（１３）前記腫瘍はがんから選択され、および/または前記自己免疫疾患は関節リウマチまたは強直性脊椎炎から選択される、（１２）に記載の使用。

（１４）（７）に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または（８）に記載の細胞株を選択して前記タンパク質を分泌する、タンパク質を製造する方法。任意に、前記タンパク質は抗体、融合タンパク質または組換えタンパク質から選択される。好ましくは、前記抗体はモノクローナル抗体から選択される。前記融合タンパク質がプログラム細胞死受容体-１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ-１、ＰＤ-１）に対する抗体またはプログラム細胞死受容体リガンド-１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ- Ｌｉｇａｎｄ １、ＰＤ-Ｌ１）に対する抗体である；より好ましくは、前記モノクローナル抗体がアダリムマブであり、前記ＰＤ-１に対する抗体がペムブロリズマブである。

（１５）標的タンパク質を高発現する安定な細胞株のスクリーニング方法であって、（７）に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムを利用して、前記標的タンパク質をコードする標的遺伝子を前記細胞にトランスフェクトし、標的タンパク質を高発現する安定な細胞株をスクリーニングして取得する、方法。任意に、前記タンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システムは哺乳動物細胞のタンパク質発現ベクターまたは哺乳動物細胞のタンパク質発現システムから選択される。より好ましくは、前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である。

（１６）（１５）に記載のスクリーニング方法であって、前記スクリーニング方法は、選択マーカーである抗生物質によるスクリーニング、または増幅されたマーカー遺伝子に対して、試薬ストレスによるスクリーニングすることが含まれる、方法。

（１７）（１５）〜（１６）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法を用いて得られた細胞株。

（１８）（７）に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または（８）に記載の細胞株から分泌されたタンパク質を用いて前記動物が病気にかかっているかどうかを検出するための方法であって、前記動物の疾患は、前記動物体において標的タンパク質の異常な発現を引き起こすことができる、動物の疾患を検出する方法。
（ｉ）前記分泌されたタンパク質が前記検出標的タンパク質と相互作用できた場合、前記動物患が疾患を持っていることを示す；
（ｉｉ）前記分泌されたタンパク質が前記検出標的タンパク質と相互作用できない場合、前記動物が疾患を持っていないことを示す。

（１９）前記タンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または細胞株が前記検出目的とするタンパク質に対する抗体を分泌することができる（１８）に記載の方法。任意に、前記動物は哺乳動物から選択される。好ましくは、前記哺乳動物がヒトである。

（２０）（７）に記載のタンパク質発現ベクターまたはタンパク質発現システム、または（８）に記載の細胞株から分泌されたタンパク質を前記動物に投与する、動物の疾患を治療または予防する方法。任意に、前記動物の疾患は腫瘍或いは自己免疫疾患から選択される。

（２１）前記腫瘍はがんから選択される、および/または前記自己免疫疾患はる関節リウマチまたは強直性脊椎炎から選択される（２０）に記載の方法。

（２２）標的抗体を製造する方法であって、以下のステップを含む：
（ｉ）（１４）に記載のタンパク質を製造する方法に従って、前記タンパク質を製造して得られる；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた前記タンパク質を動物に免疫させて、対応する前記標的抗体を得る、
方法。

（２３）（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドの少なくともいずれか１つを含むベクター。

（２４）ＣＭＶプロモーターはをさらに含む（２３）に記載のベクター。任意に、前記ＣＭＶプロモーターがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示される配列を含む、または前記ＣＭＶプロモーターが前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６で示される配列と少なくとも９０％、さらに少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。

（２５）一種類または多種類の標的タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含む、（２３）または（２４）に記載のベクター。

（２６）前記標的タンパク質は、抗体、融合タンパク質、酵素、可溶性タンパク質、膜タンパク質、構造タンパク質、リボソームタンパク質、チモーゲン、細胞表面受容体タンパク質、転写調節タンパク質、翻訳調節タンパク質、クロマチンタンパク質、ホルモン、細胞周期調節タンパク質、Ｇタンパク質、神経活性化ペプチド（ｎｅｕｒｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）、免疫調節タンパク質、血液成分タンパク質、イオンチャネルタンパク質、熱ショックタンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、抗生物質耐性タンパク質、いずれかの前記タンパク質の機能的フラグメント、いずれかの前記タンパク質のエピトープフラグメント、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする（２５）に記載のベクター。

（２７）（２３）〜（２６）のいずれか一項に記載のベクターを含むことを特徴とする単離された宿主細胞。

（２８）（２３）〜（２６）のいずれか一項に記載のベクターを用いて当初の宿主細胞を形質転換するステップが含まれることを特徴とする標的タンパク質を安定的に発現する宿主細胞を製造する方法。

（２９）前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、（２７）に記載の宿主細胞または（２８）に記載の方法。

（３０）（２７）に記載の宿主細胞を用いるまたは（２８）または（２９）に記載の方法を利用することで、前記標的タンパク質を製造することが含まれる、標的タンパク質を製造する方法。
任意に、本発明は以下の実施形態を提供する。

（３１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３-９からなる群から選択される制御配列と少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列と、プロモーターと、ポリペプチドをコードする外来配列とを含むポリヌクレオチドであって、前記制御配列と、前記プロモーターと、前記ポリペプチドをコードする外来配列とが作動可能に連結されている、ポリヌクレオチド。

（３２）ＥＦ１αＩ遺伝子におけるイントロンをさらに含む請求項（３１）に記載のポリヌクレオチド。

（３３）前記ＥＦ１αＩ遺伝子におけるイントロンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む請求項（３２）に記載のポリヌクレオチド。

（３４）前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ３-９からなる群から選択される制御配列はフォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）方向である請求項（３３）に記載のポリヌクレオチド。

（３５）前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ３-９からなる群から選択される制御配列はリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）方向である請求項（３４）に記載のポリヌクレオチド。
（３６）以下の配列を含む、抗体の発現を増強するための宿主細胞であって、

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３-９のいずれかの配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３-９のいずれかの配列の逆相補配列に作動可能に連結されている、抗体重鎖またはその断片をコードする第１のポリヌクレオチド；及び
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３-９のいずれかの配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３-９のいずれかの配列の逆相補配列に作動可能に連結されている、抗体軽鎖またはその断片をコードする第２のポリヌクレオチド；
である、宿主細胞。

（３７）前記第１のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ４と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第２のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ４と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、請求項（３６）に記載の宿主細胞。

（３８）前記第１のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ４と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第２のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ９と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、請求項（３６）に記載の宿主細胞。

（３９）前記第１のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ９と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第２のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ９と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、請求項（３６）に記載の宿主細胞。

（４０）前記第１のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ４と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第２のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １７と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、請求項（３６）に記載の宿主細胞。

（４１）前記第１のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ９と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第２のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １７と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、請求項（３６）に記載の宿主細胞。

（４２）発現カセットを含む発現ベクターであって、前記発現カセットは、ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３-９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有する制御配列が含まれ、前記制御配列は前記プロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクター。

（４３）センス鎖とアンチセンス鎖を有し、かつ前記センス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３-９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む（５’から３’へ）、請求項（４２）に記載の発現ベクター。

（４４）センス鎖とアンチセンス鎖を有し、かつ前記アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３-９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列（５’から３’へ）、請求項（４２）に記載の発現ベクター。

本発明の一局面において、本開示による転写調節エレメントＷＸＲＥを使用することで、外来タンパク質の発現レベルを大きく向上させ、哺乳動物タンパク質の生産に大きく貢献する。

いくつかの態様において、外来タンパク質の発現レベルは、約または少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％増加する。いくつかの態様において、外来タンパク質の発現レベルは８０％増加する。

別の態様において、本開示による転写調節エレメントＷＸＲＥを使用することで、外来タンパク質の発現レベルを大きく向上るとともに、それ自体の生化学的な活性を維持することが可能である。

別の態様において、本開示による転写調節エレメントＷＸＲＥは、他の転写調節エレメントと一緒に一体的に使用することができ、外来タンパク質の発現レベルを大きく向上るとともに、それ自体の生化学的な活性を維持することが可能である。

図１は、ＷＸＲＥが挿入されていないＧＦＰ発現ベクターの模式図を示す。 図２は、ＷＸＲＥ挿入済のＧＦＰ発現ベクターの模式図を示す。 図３は、転写調節エレメントＡ〜Ｇの添加による、融合タンパク質の発現レベルへの影響を示す。その中で、Ａ１とＡ２は、それぞれ転写調節エレメントＡのフォワード方向およびリバース方向を示す。以下同様である。 図４は、転写調節エレメントＡ〜Ｇの添加による、融合タンパク質の発現の比生産率への影響。その中で、Ａ１とＡ２は、それぞれ転写調節エレメントＡののフォワード方向およびリバース方向を示し、以下同様である。 図５は、ＷＸＲＥを挿入したアダリムマブ重鎖発現ベクターの模式図を示す。ただし、ＨＣは、重鎖を意味する。 図６は、ＷＸＲＥを挿入したアダリムマブ軽鎖発現ベクターの模式図を示す。ただし、ＬＣは、軽鎖を意味する。 図７は、転写調節エレメントの異なる組み合わせ条件下での１４日目のアダリムマブの発現レベルの比較を示す。ただし、サンプル１-サンプル６では、重鎖の上流にある転写調節エレメントの構成と軽鎖の上流にある転写調節エレメントの構成を表６に示す。 図８は、ＷＸＲＥとＥＦ１αＩイントロン（即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示される配列）が挿入された抗体重鎖発現ベクターの模式図を示す。ただし、ＨＣは、重鎖を意味する。 図９は、ＷＸＲＥとＥＦ１αＩイントロン（即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示される配列）が挿入された抗体軽鎖発現ベクターの模式図を示す。ただし、ＬＣは、軽鎖を意味する。 図１０は、抗体重鎖発現ベクターの模式図を示す。 図１１は、抗体軽鎖発現ベクターの模式図を示す。

定義
本開示の特許請求の範囲および/または明細書において、「一（ａ）」または「一（ａｎ）」または「一（ｔｈｅ）」という単語は「１つ」を指す場合があるが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つの」及び「１つまたは１つ超」 を指すことができる。

特許請求の範囲と明細書で使用される場合、「包含する」、「を有する」、「含む」または「含有する」という用語は、包括的またはオープン形式を意味し、記載されていない要素または方法・ステップを除外しない。そして、「包含する」、「を有する」、「含む」または「含有する」は、クローズド形式を意味する場合もあり、記載されていない要素または方法・ステップを除外する。

本出願の全体において、「約」という用語は、ある値がこの値を決定するために使用されるデバイスまたは方法の誤差を含む標準偏差を意味する。

公開された内容では、「または」という用語は、「および/または」と代替の両方だけに定義されているが、代替のみまたは代替同士が排他的であることが明確に示されていない限り、特許請求の範囲における「または」という用語は「および/または」を意味する。

本開示における「転写調節エレメント」（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）とは、遺伝子転写の制御に関与するいくつかのポリヌクレオチドを意味する。任意に、前述ポリヌクレオチドは、主にプロモーター、エンハンサー、インシュレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）等を含むＤＮＡから選択されることができる。本開示において、転写調節エレメントはＷＸＲＥ（ＷｕＸｉ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）とも呼ばれる。例示的に、本開示におけるＷＸＲＥは、転写調節エレメントＡ、転写調節エレメントＢ、転写調節エレメントＣ、転写調節エレメントＤ、転写調節エレメントＥ、転写調節エレメントＦ、転写調節エレメントＧを含む。

本開示における「逆相補配列」（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とは、元のポリヌクレオチドの配列の方向と反対で、かつ元のポリヌクレオチドの配列と相補的な配列と意味する。例示的に、元のポリヌクレオチド配列がＡＣＴＧＡＡＣである場合、その逆相補配列がＧＴＴＣＡＧＴである。

本開示における「内部リボソーム侵入部位」（ＩＲＥＳ）は、翻訳制御配列に属し、通常、キャップに依存せずＲＮＡを翻訳可能するように、注目する遺伝子の５‘末端に位置する。転写されたＩＲＥＳは、リボソームサブユニットに直接結合でき、その結果、ｍＲＮＡの開始コドンはリボソームに対して適切に配向されて翻訳を開始する。ＩＲＥＳ配列は、通常ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ（開始コドンの上流直前）にある。ＩＲＥＳは、機能的に、真核生物の翻訳メカニズムでの相互作用するさまざまなタンパク質因子のニーズを充足する。

本開示における「ベクター」は、ポリヌクレオチドの送達ビヒクルを指す。いくつかの実施形態において、遺伝子工学組換え技術では、ベクターは、作動可能に挿入された特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、このタンパク質の発現を可能にする。ベクターは、宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトするために用いられ、ベクターによって運ばれる遺伝物質要素が宿主細胞で発現されることが可能である。本開示における「ベクター」は、染色体、非染色体と合成核酸ベクター（適切な一連の発現制御エレメントを含む核酸配列）を含む任意の適切なベクターでありえる。例示的に、前記ベクターは、組換えプラスミドベクター、組換え真核生物ウイルスベクター、組換えバクテリオファージベクター、組換え酵母ミニ染色体ベクター、組換え細菌人工染色体ベクターまたは組換え酵母プラスミドベクターであってもよい。

例示的に、本開示におけるベクターは、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、バクテリオファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとバクテリオファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ならびにウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

具体的な一実施形態において、本開示に係るベクターは図１-２、５-６、８-９で示されるものである。上記ベクターの模式図において、ＣＭＶは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ: ２９８５２８０を参照）を意味する。ＴＫ ｐＡは、チミジンキナーゼポリアデニル化シグナル（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ、例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ: ３０１８５５１を参照）を意味する。ＳＶ４０は、ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ: ６２８６８３１を参照）を意味する。ＢＳＲは、ブラスチシジン耐性遺伝子選択マーカー（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ: ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ、例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ: ７９４８０２２を参照）を意味する。ＳＶ ｐＡは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ、例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ: ６１１３０５４を参照）を意味する。ｐＵＣ ｏｒｉは、ｐＵＣプラスミドの複製起点（例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ: ２９８５４７０を参照）を意味する。Ａｍｐは、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ、例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ: ２９８５４７０を参照）を意味する。ＥＭＣＶ ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム侵入部位（例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ: ８９５４１２１を参照）を意味する。Ｚｅｏｃｉｎは、ゼオシン耐性遺伝子選択マーカー（Ｚｅｏｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ: ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ、例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ: ２４５０７８３を参照）を意味する。ＥＦ１αＩは、ヒト伸長因子１α（ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ、例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ:２２１０３８２）遺伝子の１番目のイントロンを意味する。

いくつかの実施形態において、本開示におけるＣＭＶプロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６と少なくともまたは約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含んでよい。本明細書で使用される場合、プロモーターとは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからの転写開始を起こすＤＮＡ領域を意味する。プロモーターは、コード配列における転写開始部位の近く、かつＤＮＡの上流（コード配列のセンス鎖の５'領域に向かって）に位置する。いくつかの実施形態において、他のプロモーターを使用することができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ｍＣＭＶプロモーター、レチノスキシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、ＣＲＸプロモーター、または光受容体間レチノイド結合タンパク質（ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＩＲＢＰ）プロモーターである。コードされたタンパク質の組織特異的発現を可能にする任意のプロモーターも使用することができる。

本開示における「宿主細胞」は、外来ポリヌクレオチドおよび/またはベクターが導入された細胞。前記宿主細胞は、真核宿主細胞または原核宿主細胞である。その中で、前記真核宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真菌宿主細胞、真核藻類宿主細胞、センチュウ宿主細胞、原生動物宿主細胞と魚類宿主細胞であってもよい。例示的に、本開示における宿主細胞は真核宿主細胞であり、前記真核宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。その中で、前記哺乳動物宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＳＰ２/０細胞、ＮＳ/Ｏミエローマ細胞、ヒト胎児性腎細胞、未成熟ハムスター腎細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒトＢ細胞、ｃｖ-１/ＥＢＮＡ細胞、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＰｅｒＣ６細胞、２９３細胞とＭＤＣＫ細胞から選択される。例示的に、本開示における哺乳動物宿主細胞がＣＨＯ細胞である。

本開示における「タンパク質発現システム」は、宿主及び外来遺伝子を含むベクターを含み、かつ宿主における外来遺伝子の発現の目的を達成することができるシステムである。タンパク質発現システムは、一般的に、以下の要素を含む：（１）宿主、即ち、細菌、酵母、植物細胞と動物細胞等から選択され得るタンパク質を発現する生命体；（２）宿主と対応するベクター。異なるの宿主によると、ベクターは、原核（細菌）発現ベクター、酵母発現ベクター、植物発現ベクター、哺乳動物発現ベクター、と昆虫発現ベクター等に分けられる。ベクターは、外来遺伝子の断片が含まれる。外来遺伝子は、ベクターの媒介を介して宿主で発現させることができる。いくつかの実施形態において、発現されたタンパク質産物は分泌される。いくつかの実施形態において、ベクターは、宿主細胞のＤＮＡに組み込まれる。

タンパク質発現における重要なステップは、目的タンパク質をコードする外来遺伝子を含むベクターで成功的にトランスフェクトされた組換え宿主細胞をスクリーニングすることである。最も一般的には、選択マーカーがベクターに含まれている。選択マーカーは、マーカーを含む組換え宿主細胞とそれを含まない組換え宿主細胞との区別を可能にする遺伝子またはＤＮＡ配列であり得る。選択マーカーと選択培地の組み合わせにより、ベクターでトランスフェクトされた組換え宿主細胞の増殖が可能にすると共に、トランスフェクトに成功しなかった宿主細胞の増殖が阻害される。

抗生物質耐性遺伝子は、組換え宿主細胞のスクリーニングのために最も一般的に使用されるマーカーである。選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子と抗生物質を含有する選択培地を組み合わせて使用することによって、スクリーニングを達成することができる。例示的な抗生物質選択マーカーには、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ポリミキシンＢ耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ブラスチシジン耐性遺伝子、フラジオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、とハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。したがって、選択抗生物質は、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、テトラサイクリン、ポリミキシンＢ、エリスロマイシン、カルベニシリン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ブラスチシジン、フラジオマイシン、ピューロマイシン、ゼオシンとハイグロマイシンＢが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明で使用される選択マーカーは、ブラスチシジン耐性遺伝子である。いくつかの実施形態において、本発明で使用される選択マーカーは、ゼオシン耐性遺伝子である。

いくつかの局面において、本開示は、ヘテロ多量体（例えば、抗体）の発現を迅速に評価するために設計された方法を提供する。例えば、抗体を効率的に発現させるためには、抗体重鎖と抗体軽鎖を約１:１の割合で発現させる必要がある。選択用抗生物質の濃度が低すぎると、細胞内の機能的なベクターの量が少なすぎる可能性がある。選択用抗生物質の濃度が高すぎると、培養細胞に適さない状態になる可能性がある。また、２つのベクターの比率を適切に調整する必要がある。多くの異なる条件での試験に基づいて、本明細書で提供される方法は、高効率で抗体を発現することができ、かつ比較的短い時間でヘテロ多量体発現を確実に評価するために使用することができる。また、本明細書で提供される方法は、高い発現レベルで抗体を発現することができる。

いくつかの実施形態において、前記方法は、第１のポリペプチドをコードする外来遺伝子を保有する一方のベクターおよび第２のポリペプチドをコードする外来遺伝子を保有する他方のベクターという、ペアになる２つのベクターで細胞をトランスフェクトすることに関する。そして、２つの選択マーカーが使用される。１つの選択マーカーはブラスチシジン耐性遺伝子であり、もう１つの選択マーカーはゼオシン耐性遺伝子である。いくつかの実施形態において、ブラスチシジンが１-１５μｇ/ｍＬの量で選択培地中に存在し、ゼオシンが５０-１５００μｇ/ｍＬの量で存在する。好ましくは、ブラスチシジンが２-１２μｇ/ｍＬの量で存在し、ゼオシンが１００-１０００μｇ/ｍＬの量で存在する。より好ましくは、ブラスチシジンが３-１０μｇ/ｍＬの量で存在し、ゼオシンが１５０-８００μｇ/ｍＬの量で存在する。より好ましくは、ブラスチシジンが４-９μｇ/ｍＬの量で存在し、ゼオシンが２００-４００μｇ/ｍＬの量で存在する。最も好ましくは、ブラスチシジンが９μｇ/ｍＬの量で存在し、ゼオシンが４００μｇ/ｍＬの量で存在する。任意に、ブラスチシジンが４μｇ/ｍＬの量で存在し、ゼオシンが２００μｇ/ｍＬの量で存在する。いくつかの実施形態において、ゼオシンの濃度に対するブラスチシジンの濃度の比は１:５０〜１:４０（例えば、約９:４００）である。いくつかの実施形態において、培地中のブラスチシジンの最低濃度が５、６、７、８または９μｇ/ｍＬである。いくつかの実施形態において、培地中のブラスチシジンの最高濃度が１５または２０μｇ/ｍＬである。

いくつかの実施形態において、選択培地は、血清、多糖（例えばグルコースおよび/またはデキストロース）、ピルビン酸ナトリウム、グルタチオン、エタノールアミン、アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、グルタミン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、および/またはバリン）またはその塩、ビタミン（例えばアスコルビン酸リン酸塩（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、塩化コリン、Ｄ-パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、および/またはイソイノシトール（ｉ-ｉｎｏｓｉｔｏｌ））、無機塩（例えば塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および/またはリン酸水素二ナトリウム）、タンパク質（例えばヒトトランスフェリンおよび/または組換えインスリン）、および/または微量元素（例えばメタバナジン酸アンモニウム、硫酸銅、塩化マンガンおよび/または亜セレン酸ナトリウム）をさらに含む。

いくつかの実施形態において、細胞は、トランスフェクションから約１８〜３０時間（例えば、約２４時間）後、ブラスチシジン（例えば、９μｇ/ｍＬ）とゼオシン（例えば、４００μｇ/ｍＬ）を含有する適当な細胞培地中で培養される。その後、２〜４日ごとに細胞をブラスチシジンとゼオシンを含有する新しい培地に継代した。細胞生存率が９０％以上に回復した場合、ヘテロ多量体の発現レベルを流加培養で評価できる。いくつかの実施形態において、流加培養物（ｆｅｄ-ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）は、本明細書に記載されるような任意の培地であり得る。いくつかの実施形態において、流加培養物はブラスチシジンとゼオシンを含有する。

いくつかの実施形態において、本方法における「タンパク質発現システム」は、抗体重鎖をコードする外来遺伝子を保有する一方のベクターおよび抗体軽鎖をコードする外来遺伝子を保有する他方のベクターという、ペアになる２つのベクターに関する。２つのベクター中の選択マーカーが異なってもよい。一実施形態において、一方のベクター中の選択マーカーはブラスチシジンであり、他方のベクター中の選択マーカーはゼオシンである。ブラスチシジンとゼオシンの濃度は、本明細書に記載されるような任意の濃度であってもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、抗体重鎖をコードする外来遺伝子と抗体軽鎖をコードする外来遺伝子を含む１つのベクターに関与することもできる。

ＷＸＲＥ配列は２つのベクターに挿入できる。それらは同じでも異なっていてもよく、フォワード方向またはリバース方向を持つことができる。表１に２つのベクターにおけるＷＸＲＥの組み合わせの例を示す。

本開示における「配列同一性」と「同一性のパーセント」は、２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同じ（即ち同一）ヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指す。２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列同一性は、以下の方法によって測定することができる。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を整列させ、整列したポリヌクレオチドまたはポリペプチド中の同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含む位置の数をスコアリングし、それと整列したポリヌクレオチドまたはポリペプチド中の異なるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含む位置の数と比較する。ポリヌクレオチドは、例えば、異なるヌクレオチド（即ち置換または変異）を含むこと或いはヌクレオチドの欠失（即ち、ポリヌクレオチド中の、１つまたは２つのヌクレオチドの挿入または欠失）により、一箇所で異なり得る。ポリペプチドは、例えば、アミノ酸（即ち置換または変異）を含むことによって、あるいはアミノ酸の欠失（即ち１つまたは２つのポリペプチド中のアミノ酸の挿入またはアミノ酸の欠失）によって一箇所で異なり得る。配列同一性は、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含む位置の数を、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド中アミノ酸残基の総数で割ることによって算出することができる。例をあげると、パーセント同一性は、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含む位置の数を、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド中ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の総数で割ってから１００を掛けることによって算出することができる。

本開示における「動物体内の標的タンパク質の異常な発現」とは、正常な条件下での動物体内の標的タンパク質の発現レベルと比較して、検体動物体内の標的タンパク質の発現レベルが上昇または減少する；或いは正常な条件下で発現されるべきではないタンパク質が発現されている；或いは発現されるべきであるタンパク質が発現されていないことである。本発明の一局面において、前記動物は哺乳動物を指す。別の態様において、前記哺乳動物はヒトである。

本開示における「抗体」という用語は、免疫グロブリンまたはその断片またはそれらの誘導体を指し、インビトロまたはインビボのどちらで産生されるかに関われず、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含む。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体、非特異性抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、合成抗体、組換え抗体、ヘテロ接合抗体、変異抗体、グラフト抗体を含むが、これに限定されない。「抗体」という用語は、さらに例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂなどの抗体フラグメント、及び抗原結合機能を保有する他の抗体フラグメントを含む。通常、このようなフラグメントには抗原結合フラグメントが含まれる。

本開示における「融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質またはその断片を、それぞれのペプチドの主鎖を共有結合によって連結し含有した分子を指す。融合タンパク質は、それらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝発現によって生成されることがより好ましい。好ましい実施形態において、融合タンパク質は免疫グロブリンドメインを含む。好ましい実施形態において、融合タンパク質はＦｃ-融合タンパク質である。

例示的に、本開示で使用できる抗体には、アダリムマブ、ベズロトクスマブ、アベルマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、オクレリズマブ、ブロダルマブ、レスリズマブ、オララツマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、ネシツムマブ、インフリキシマブ、オビルトキサキシマブ、アテゾリズマブ、セクキヌマブ、メポリズマブ、ニボルマブ、アリロクマブ、エボロクマブ、ジヌツキシマブ、ベバシズマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、オビヌツズマブ、ブレンツキシマブ、ラキシバクマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、デノスマブ、オファツムマブ、ベシレソマブ、トシリズマブ、カナキヌマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、エクリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、イブリツモマブ、ファノレソマブ、トシツモマブ、ジェムツズマブ、パリビズマブ、ネシツムマブ、バシリキシマブ、リツキシマブ、カプロマブ、サツモマブ、およびムロモナブが含まれるが、これらに限定されない。

例示的に、本開示を使用できる融合タンパク質には、エタネルセプト、アレファセプト、アバタセプト、リロナセプト、ロミプロスティム、ベラタセプト、アフリベルセプトが含まれるが、これらに限定されない。

一実施形態において、本開示は、２つのポリヌクレオチドの相補性の程度を限定するために使用されるハイブリダイゼーション条件についてのストリンジェンシーに関する。任意に、前述ポリヌクレオチドはＤＮＡから選択されることができる。本開示で使用された「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション中の温度とイオン強度条件、及びある有機溶媒の存在か否かを指す。ストリンジェンシーが高いほど、標的ヌクレオチド配列と標識されたポリヌクレオチド配列との間の相補性の程度が高くなる。「ストリンジェントな条件」とは、単に相補頻度の高い塩基を有するヌクレオチド配列のみがハイブリダイゼーションできる、温度とイオン強度条件を指す。本明細書で使用される「高ストリンジェントまたはより高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーション及び洗浄に用いる条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆「Ｓｏｎｓ、Ｎ.Ｙ.（１９８９）、６.３.１-６.３.６」に参照することができる。本開示で言及される具体的なハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：１）高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件：約４５℃の６Ｘ 塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で、続いて６５℃下で０.２Ｘ ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで一回または二回以上洗浄する；２）より高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件：６５℃の０.５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、続いて６５℃下で０.２Ｘ ＳＳＣ、１％ＳＤＳで一回または二回以上洗浄する。

本開示の一実施形態において、前記ＷＸＲＥ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３-９のいずれかの配列と比べて、少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性（それらの数の間の全ての範囲とパーセンテージを含む）を有する。いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列相は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ３-９のいずれかの配列と比べて、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、９または１０個の保存的変異を有する。いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ３-９の配列と比べて、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドが異なる。ＷＸＲＥ配列には、フォワード方向またはリバース方向を持つことができる。本明細書で使用される場合、センス鎖（５’から３’へ）が対象の配列と同一の配列を有する場合は、対象の配列はフォワード方向である。センス鎖が対象の配列に逆相補的である配列を有する場合は、対象の配列はリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）方向である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ３-９と逆相補な配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １７-２３で示される。いくつかの実施形態において、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １７-２３から選択される配列の、少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（それらの数の間の全ての範囲とパーセンテージを含む）である配列を提供する。

いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列は、外来タンパク質の発現レベルを（例えば、ＷＸＲＥ配列のない制御配列と比較して）約または少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％増加させることができる。

本開示の一実施形態において、前記転写調節エレメントはまた、ＷＸＲＥ配列と他の真核細胞株のタンパク質の発現レベルを増加させ得る配列を含むヌクレオチド配列から選択される。例示的に、本開示における転写調節エレメントは、ＷＸＲＥ配列とＳＥＱ ＩＤ：１３（ヒトＥＦ１αＩの第１のイントロン）で示される配列と配列同一性を有する配列とを含むヌクレオチド配列である。

本開示の一実施形態において、前記ＳＥＱ ＩＤ：１３で示される配列と配列同一性を有する配列は、ＳＥＱ ＩＤ：１３（ヒトＥＦ１αＩの第１のイントロン）で示される配列に比べて、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性（それらの数の間の全ての範囲とパーセンテージを含む）を有する。いくつかの実施形態において、前記配列は、外来タンパク質の発現レベルを（例えば、そのような配列のない制御配列と比較して）約または少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を増加させ得る。

いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列、プロモーターとポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと１つ以上の追加の調節エレメントが作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の調節エレメントはＥＦ１αＩのイントロン（例えば、ヒトＥＦ１αＩの第１のイントロン）である。作動可能に連結されているＷＸＲＥ配列、プロモーターとポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、様々な順序を有することができる。例えば、ＷＸＲＥ配列は、プロモーターの前（例えば、コード配列のセンス鎖の５’から３’）またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの後（例えば、コード配列のセンス鎖の５’から３’）に位置することができる。いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列とプロモーターの間、またはＷＸＲＥ配列とポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの間に少なくともまたは約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１Ｋ、２Ｋ、３Ｋ、４Ｋまたは５Ｋ個のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、ＷＸＲＥ配列とプロモーターの間、またはＷＸＲＥ配列とポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの間に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１Ｋ、２Ｋ、３Ｋ、４Ｋまたは５Ｋ個以下のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の調節エレメントは、プロモーターとポリペプチドをコードする配列の間に位置する。

本開示はまた、組換えのタンパク質またはポリペプチドの発現を増強する方法を提供する。前記方法は、１つ以上の本明細書に記載されるようなベクターを細胞に（例えば、形質転換またはトランスフェクトによって）挿入し、培地で細胞を培養し、そのように発現された組換えタンパク質またはポリペプチドを回収することに関する。

本開示で使用された分子生物学的方法は、すべて「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｗｉｌｅｙ発行）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行）等の開示された出版物に記載された対応する方法を参照できる。
実施例

本開示の他の目的、特徴と利点は、以下の詳細な説明で明らかになる。しかしながら、詳細な説明と具体的な実施例は、（本開示の具体的な実施形態を表すが）当業者がその詳細を読んだ後に、本開示の精神および範囲内で行われた様々な変更および変化が明らかになるので、例示の目的でのみ提供されることを理解されるべきである。

実施例で使用された全ての試薬は、特に強調されていない限り、商業的供給源から購入および入手することができる。

実施例１：ベクターライブラリーの構築と緑色蛍光タンパク質を発現する安定した細胞集団の構築

１.１チャイニーズハムスター卵巣細胞ゲノム断片を含むベクターライブラリーの製造

１.１.１制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩを含む酵素消化キット（ＮＥＢ）中のＢａｍＨＩを用いて、ＧＦＰ発現ベクター（即ち図１に示されるベクター）１μｇを酵素消化して線形化し、３７℃で一晩保存した（酵素消化反応における試薬の組成と含有量を表２に示す）。ここで、ＢａｍＨＩは、任意にＧＦＰに対応するプロモーター上流に存在する特異的な酵素消化部位に対応する他のエンドヌクレアーゼで置き換えることができる。

ＧＦＰ発現ベクターの模式図は図１に示す通りである。

１.１.２ 約５００万個のＣＨＯ宿主細胞を取り、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ & Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＣＨＯ宿主細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、上記ゲノムＤＮＡが１００μＬの前述キットの溶出バッファーに溶解された。

１.１.３ １００Ｕの制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ（ＮＥＢ）またはＤｐｎＩＩ（ＮＥＢ）でゲノムＤＮＡ５μｇを酵素消化した（酵素消化反応における試薬の組成と含有量は表３の通りである）。ステップ１.１.１で線形化されたベクターのエンドヌクレアーゼ粘着末端と合致する限り、他の制限エンドヌクレアーゼも使用することができる。

１.１.４ １.１.１で線形化された後のベクターを、２Ｕの子ウシ腸アルカリフォスファターゼ（ＮＥＢ）で３７℃、３０分間程度処理した。他のタイプのアルカリフォスファターゼも使用することができる。

１.１.５ １.１.４で線形化されたＧＦＰ発現ベクターと１.１.３で酵素消化されたのＣＨＯゲノムＤＮＡは、それぞれアガロースゲル電気泳動による分離にかけられた。ゲルを切断してＧＦＰ発現ベクターフラグメントと酵素消化されたゲノム１-４ｋｂの断片を回収し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて電気泳動した後のアガロースゲルからＤＮＡを抽出した。

１.１.６ １.１.５で回収して得られたＧＦＰ発現ベクターフラグメントとゲノム断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ, Ｃａｔ# ６０２２）を用いて、１６℃の条件下で４５分間のライゲーション反応（ライゲーション反応における試薬の組成と含有量を表４に示す）を行ってライゲーションした。

１.１.７ １.１.６で得られたライゲーション産物１０μＬを取り、１００μＬコンピテント細胞に加え、氷浴に３０分間入れ、４２℃で１分間熱ショックした後、氷上で１分間置き、抗生物質を含まない新鮮なＬＢ培地５００μＬを各チューブの細胞へ加え、３７℃の温度下で４５分間回復させた。プレーティングのステップをスキップし、アンピシリンを１００ｍｇ/Ｌ含有する培地５００ｍＬを直接添加し、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてベクターの抽出を行った。抽出したＤＮＡをベクターライブラリーとした。

１.１.８ １.１.７で得られたベクターライブラリーは、例えばＰｖｕＩ（ＮＥＢ）などの酵素消化部位がベクターバックボーンの原核領域（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）のみにある制限エンドヌクレアーゼで線形化され、１.１.１と同じの反応条件で、３７℃条件下で一晩保存した。翌日にフェノール‐クロロホルム法によりＤＮＡを回収してトランスフェクトに用いた。

１.２緑色蛍光タンパク質を発現する安定した細胞集団の構築

１.２.１ 約５００万個のＣＨＯ宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。そして、Ａｍａｘａ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｌ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ# ＶＣＡ-１００５）に含まれる９０μＬ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび２０μＬ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉと０.３〜０.６μｇステップ１.１.８で得られた線形化されたベクターライブラリーとを均一に混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーションキュ用ベットに移した。４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標） システムエレクトロポレーション装置で、それぞれの宿主細胞に対応するプログラムを用いて細胞をトランスフェクションした。エレクトロポレーション後の細胞を抗生物質を含まない培地５ｍＬに懸濁し、３７℃のシェーカーに入れて培養した。

１.２.２ トランスフェクションから２４時間後、ベクターの耐性遺伝子に対応の抗生物質を含む選択培地を等量で細胞培地に添加した（この実験では、抗生物質は８００μｇ/ｍＬのゼオシンであった）。

１.２.３ 細胞は２〜４日ごとにカウントされた。細胞の増殖状況に応じて継代を行い、ベクター中の耐性遺伝子に対応の抗生物質を含む選択培地を用いてスクリーニングを行った（この実験では、抗生物質は４００μｇ/ｍＬのゼオシンであった）。細胞生存率が９０％以上に回復したときにクローンスクリーニングを準備した。

実施例２：緑色蛍光タンパク質を高度に発現するクローンのスクリーニング

２.１ 単細胞ソーティングと増幅

２.１.１ 実施例１のステップ１.２.３で回復した後の細胞集団にＧＦＰ発現レベルの比較的高い（発現レベルの上位０.５％）細胞を、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩフローサイトメトリーソーティングによって９６ウェルプレートに入れて培養した。

２.１.２ 回収した細胞が肉眼で見えるようになるまで、プレート内の培地の７５％を２〜４日ごとに交換した。

２.２ ＧＦＰを高度に発現するクローンのスクリーニング

２.１.２で回復された細胞は、それぞれ新しい９６ウェルプレートに逐次に移され、合計で約３００クローンになった（各ウェルのすべての細胞は１つの細胞に由来し、本明細書ではクローンと呼ばれる）。ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩフローサイトメトリーによりＧＦＰ発現レベルを測定し、検出強度が上位１０％のクローナルを２４ウェルプレートに移して増殖させた。

実施例３：転写調節エレメントのスクリーニング、同定および検証

３.１ 転写調節エレメント候補配列の同定

３.１.１ ２.２で２４ウェルプレートに増殖した細胞がプレートの底を実質的に覆った時、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ & Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して各クローナルのゲノムを抽出した。

３.１.２ フォワード方向プライマーとリバース方向プライマーを、それぞれベクターのＢａｍＨＩの酵素消化部位から上流と下流約２００ｂｐ程度離れたところに設計し、３.１.１で抽出したゲノムをＰＣＲ増幅にかけた。ただし、ＰＣＲ反応のフォワード方向プライマーの配列は：ＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）であり、ＰＣＲ反応のリバース方向プライマーの配列は：ＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）であった。

上記のＰＣＲ反応の反応系は表５の通りである：

上記ＰＣＲ反応の反応ステップは表６の通りである：

３.１.３ ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルを切断して１ｋｂ以上の特定のバンドを回収し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡを抽出した。

３.１.４ 回収されたバンドはシーケンシングに供して、転写調節エレメントの候補配列Ａ〜Ｇが同定された。

３.１.５ シーケンシングによる同定から明らかにして、得られた転写調節エレメントの配列Ａ〜Ｇは以下の通りである。ただし、

転写調節エレメントＡの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ３の逆相補配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １７）であった；
転写調節エレメントＢの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ４の逆相補配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １８）であった；
転写調節エレメントＣの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ５の逆相補配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １９）であった；
転写調節エレメントＤの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ６の逆相補配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２０）であった；
転写調節エレメントＥの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ７の逆相補配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２１）であった；
転写調節エレメントＦの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ８の逆相補配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２２）であった；
転写調節エレメントＧの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ９の逆相補配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ２３）であった。

３.２ 転写調節エレメントの検証

３.２.１ Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、３.１.５でシーケンシングによる同定から得られた転写調節エレメントＡ〜ＧをそれぞれＧＦＰ遺伝子を含有するベクターの対応するプロモーターの上流のＢａｍＨＩ酵素消化部位に挿入した。図２に示すように、転写調節エレメントが挿入されたベクター（ここで、ＷＸＲＥは転写調節エレメントＡ〜Ｇの１つを示す）が得られた。前述ベクターは、例えばＰｖｕＩ（ＮＥＢ）などの酵素消化部位がベクターバックボーンの原核領域のみにある制限エンドヌクレアーゼを使用して線形化され、３７℃で一晩保存した。翌日にフェノール‐クロロホルム法によりＤＮＡを回収してトランスフェクトに用いた。

３.２.２ 約５００万個のＣＨＯ宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。そして、Ａｍａｘａ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｌ（Ｌｏｎｚａ, Ｃａｔ# ＶＣＡ-１００５）に含まれる９０μＬ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび２０μＬ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉと、発現すべきタンパク質の情報を含む線形化されたベクター（３.２.１で得られた）３０μｇを均一に混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーション用キュベットに移した。４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標） システムエレクトロポレーション装置で、それぞれの宿主細胞に対応するプログラムを用いて細胞をトランスフェクションした。エレクトロポレーション後の細胞を抗生物質を含まない培地５ｍＬに懸濁し、３７℃のシェーカーに入れて培養した。各サンプルは、１種類の転写調節エレメントを含むか、または対照として転写調節エレメントを含まないサンプルである。

３.２.３ トランスフェクションから２４時間後、ベクターの耐性遺伝子に対応の抗生物質を含む選択培地を等量で細胞培地に添加した。抗生物質を含む培地を用いて、２〜４日ごとに細胞を継代した。

３.２.４ 細胞生存率が９０％以上に回復した後、タンパク質の発現レベルに対する転写調節エレメントＡ〜Ｇの影響を流加培養によって評価した。

実施例４：外来タンパク質を発現するタンパク質発現システムの発現レベルに対する転写調節エレメントの影響

４.１.１ 転写調節エレメントＡ〜Ｇは、フォワード方向およびリバース方向で融合タンパク質（前述融合タンパク質がＰＤ-Ｌ１のＡ鎖であり、その配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０で示される配列である）のプロモーターの上流ＢａｍＨＩ位置に構築された。図２に示すように、転写調節エレメントが挿入されたベクター（ここで、ＷＸＲＥは転写調節エレメントＡ〜Ｇの１つである）が得られた。その中で、エレメントの名前（Ａ〜Ｇ）の後の数字は、ＷＸＲＥ調節エレメントの方向を示す。転写調節エレメントの名前の後の数字１はフォワード方向を示し、数字２はリバース方向を示す。例えば、転写調節エレメントＡ１は、コード配列のセンス鎖においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３で示される配列のフォワード方向（即ち５’から３’）配列を示す。転写調節エレメントＡ２は、タンパク質コード配列のセンス鎖においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７で示される配列の逆相補配列を示す。

前述ベクターは、例えばＰｖｕＩ（ＮＥＢ）などの酵素消化部位がベクターバックボーンの原核領域のみにある制限エンドヌクレアーゼを使用して線形化され、３７℃条件下で一晩保存した。翌日にフェノール‐クロロホルム法によりＤＮＡを回収してトランスフェクトに用いた。

４.１.２ 約５００万個のＣＨＯ宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。そして、Ａｍａｘａ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｌ（Ｌｏｎｚａ, Ｃａｔ# ＶＣＡ-１００５）に含まれる９０μＬ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび２０μＬ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉと、発現すべき融合タンパク質の情報を含む線形化されたベクター（４.１.１で得られた）３０μｇを均一に混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーション用キュベットに移した。４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標） システムエレクトロポレーション装置で、それぞれの宿主細胞に対応するプログラムを用いて細胞をトランスフェクションした。エレクトロポレーション後の細胞を抗生物質を含まない培地５ｍＬに懸濁し、３７℃のシェーカーに入れて培養した。各グループのサンプルは、特定の方向（すなわち、フォワード方向またはリバース方向）である転写調節エレメントの１つだけを含む。転写調節エレメントを含まないサンプルを対照として採用した。

４.１.３ トランスフェクションから２４時間後、８００μｇ/ｍＬのゼオシンを含む培地を等量でトランスフェクトされた細胞に添加した。

４.１.４ ２〜４日ごとに４００μｇ/ｍＬのゼオシンを含む培地を使用して細胞を継代した。

４.１.５ 細胞生存率が９０％以上に回復した後、融合タンパク質ＰＤ-Ｌ１の発現レベルを流加培養によって評価した。

４.１.６ 発現により得られたＰＤ-Ｌ１の配列が配列番号１０に示す配列と同一であるかどうかを検証した。

４.２ 実験結果

図３に示すように、転写調節エレメントを持たない対照群と比較して、融合タンパク質のプロモーターの上流に転写調節エレメントを挿入すると、標的タンパク質の発現量が約１０〜２５％程度増加した（図３のＡ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ２、Ｅ２、Ｆ２、Ｇ１を参照）。タンパク質発現に対する一方向の上記配列の促進効果は、他の方向の促進効果よりも優れており、これはプロモーターの方向性に関連している可能性がある。

図４に示すように、発現量に対応して、上記の転写調節エレメントのフォワード方向またはリバース方向は、比生産率を約１０％増加できる（図４のＡ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ２、Ｅ２、Ｆ２を参照）。

一方、検証により、発現で得られたＰＤ-Ｌ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０で示される配列と同じであった。

実施例５：アダリムマブの発現に使用されるタンパク質発現システムの発現レベルに対する転写調節エレメントの影響

５.１.１ 転写調節エレメントＡのリバース方向配列（Ａ２）、転写調節エレメントＢのフォワード方向配列（Ｂ１）と転写調節エレメントＧのフォワード方向配列（Ｇ１）は、それぞれＴａｋａｒａのＩｎ-Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇキットによりアダリムマブを発現するプロモーターの上流（具体的な条件を表７に示す）に構築された。図５と図６に示すように転写調節エレメントが挿入されたベクター（ここで、ＷＸＲＥは、転写調節エレメントＡ〜Ｇの１つである）がそれぞれ得られた。ただし、「重鎖の上流にある転写調節エレメント」が図５に示すようなベクターにクローンされ、「軽鎖の上流にある転写調節エレメント」が図６に示すようなベクターにクローンされた。ただし、図５のアダリムマブの重鎖（ＨＣ）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示す通りであり、図６中アダリムマブの軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示す通りであった。
前述ベクターは、例えばＰｖｕＩ（ＮＥＢ）などの酵素消化部位がベクターバックボーンの原核領域のみにある制限エンドヌクレアーゼを使用して線形化され、３７℃で一晩保存した。翌日にフェノール‐クロロホルム法によりＤＮＡを回収してトランスフェクトに用いた。

５.１.２ 約５００万個のＣＨＯ宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。そして、Ａｍａｘａ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｌ（Ｌｏｎｚａ, Ｃａｔ# ＶＣＡ-１００５）に含まれる９０μＬ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび２０μＬ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉと、アダリムマブ配列の情報を含む線形化されたベクター（５.１.１で得られた）３０μｇを均一に混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーション用キュベットに移した。４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標） システムエレクトロポレーション装置で、それぞれの宿主細胞に対応するプログラムを用いて細胞をトランスフェクションした。エレクトロポレーション後の細胞を抗生物質を含まない培地５ｍＬに懸濁し、３７℃のシェーカーに入れて培養した。各グループのサンプルは、特定の方向（すなわち、フォワード方向またはリバース方向）である転写調節エレメントの１つだけを含み、転写調節エレメントを含まないサンプルを対照として採用した。

５.１.３ 抗体発現を迅速に評価するために設計された方法が使用された。この方法により、抗体の重鎖と軽鎖がほぼ１：１の比率で発現することが保証され、比較的短い時間で抗体の発現を確実に評価できる。トランスフェクションから２４時間後、１８μｇ/ｍＬのブラストサイジンと８００μｇ/ｍＬのゼオシンを含む培地を等量でトランスフェクトした細胞に添加した。

５.１.４ ２〜４日ごとに９μｇ/ｍＬのブラストサイジンと４００μｇ/ｍＬのゼオシンを含む培地を使用して細胞を継代した。

５.１.５ 細胞生存率が９０％以上に回復した後、アダリムマブの発現レベルを流加培養により評価した。アダリムマブの重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターの両方を同じ宿主細胞にトランスフェクトすることができたので、アダリムマブの重鎖と軽鎖を同時に発現させることができた。上記の重鎖および軽鎖は宿主細胞内で自己組織化することができたので、完全なアダリムマブが得られた。

５.１.６ 得られたアダリムマブの生物的活性を測定した。

５.２ 実験結果

対照群と比較して、転写調節エレメントＢを含むフォワード配列の一部（サンプル１、２、および４を参照）では、アダリムマブの発現レベルは１０％から２０％増加した（図７に示す）。

外来タンパク質発現ベクターによって発現されるアダリムマブの生物学的活性を測定することにより、その生物学的活性が、既知の市販のアダリムマブの生物学的活性と同一であることが分かった。

実施例６：アダリムマブの発現に使用されるタンパク質発現システムの発現レベルに対する転写調節エレメントの組み合わせの影響

６.１.１ 図８および図９に示すように、それぞれ２つのベクターを構築した。ここで、ＷＸＲＥは転写調節エレメントＢのフォワード方向配列（Ｂ１）であり、ＥＦ１αＩはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １３で示されるヒトＥＦ１αＩ遺伝子の第１のイントロンの配列であり、ＨＣは、アダリムマブの重鎖をコードする核酸配列であり、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １１に示され、ＬＣはアダリムマブの軽鎖（ＬＣ）をコードする核酸アミノ酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であり、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １２で示される。上記ベクター構築が完了した後、ＭＮキットを用いてプラスミド抽出を行い、得られたプラスミドを細胞トランスフェクトに用いた。

６.１.２ 約５００万個のＣＨＯ宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。そして、Ａｍａｘａ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｌ（Ｌｏｎｚａ, Ｃａｔ# ＶＣＡ-１００５）に含まれる９０μＬ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび２０μＬ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉと、アダリムマブ配列を含むベクター（６.１.１で得られた）３０μｇを均一に混合し、この混合溶液で細胞を再懸濁し、エレクトロポレーション用キュベットに移した。４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標） システムエレクトロポレーション装置で、それぞれの宿主細胞に対応するプログラムを用いて細胞をトランスフェクションした。エレクトロポレーション後の細胞を抗生物質を含まない培地５ｍＬに懸濁し、３７℃のシェーカーに入れて培養した。一方のサンプルは１つの転写調節エレメント、すなわちＥＦ１αＩイントロンを含み、他方のサンプルは２つのエレメント、すなわちＢ１およびＥＦ１αＩイントロンを含み、転写調節エレメントを含まないサンプルを対照として採用した。

６.１.３ トランスフェクションから２４時間後、８μｇ/ｍＬのブラストサイジンと４００μｇ/ｍＬのゼオシンを含む培地を等量でトランスフェクトした細胞に添加した。

６.１.４ ２〜４日ごとに４μｇ/ｍＬのブラストサイジンと２００μｇ/ｍＬのゼオシンを含む培地を使用して細胞を継代した。

６.１.５ 細胞生存率が９０％以上に回復した後、アダリムマブの発現レベルを流加培養により評価した。アダリムマブの重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターの両方を同じ宿主細胞にトランスフェクトすることができたので、アダリムマブの重鎖と軽鎖を同時に発現させることができた。上記の重鎖および軽鎖は宿主細胞内で自己組織化することができたので、完全なアダリムマブが得られた。

６.１.６ 得られたアダリムマブの生物的活性を測定した。

６.２ 実験結果

実施例６の実験結果は表８の通りである。

表８からわかるように、ＷＸＲＥとＥＦ１αＩイントロンを含む組み合わせは、アダリムマブの発現レベルを有意に増加させた。

外来タンパク質発現ベクターによって発現されるアダリムマブの生物学的活性を測定することにより、その生物学的活性が、既知の市販のアダリムマブの生物学的活性と同一であることが分かった。したがって、このベクターによって発現されたタンパク質は正しく折り畳まれた。

実施例７：ペムブロリズマブを発現するために使用されるタンパク質発現システムの発現レベルに対する転写調節エレメントの組み合わせの影響

７.１.１ 図８および図９に示すように、それぞれ２つのベクターを構築した。ここで、ＷＸＲＥは転写調節エレメントＢのフォワード方向配列（Ｂ１）であり、ＥＦ１αＩはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １３で示されるヒトＥＦ１αＩ遺伝子の第１のイントロンの配列であり、ＨＣはペムブロリズマブの重鎖をコードする核酸配列であり、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １４に示され、ＬＣはペムブロリズマブの軽鎖（ＬＣ）をコードする核酸アミノ酸配列であり、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １５で示される。

上記ベクター構築が完了した後、ＭＮキットを用いてプラスミド抽出を行い、得られたプラスミドを細胞トランスフェクトに用いた。

７.１.２ 以下の実験ステップは、本開示の実施例６.１.２から６.１.６に記載された実験ステップと同じであった。

７.２ 実験結果

実施例７の実験結果は表９の通りである。

表９から分かるように、ＷＸＲＥおよびＥＦ１αＩイントロンを含む組み合わせは、ペムブロリズマブの発現レベルを有意に増加させた。

外来タンパク質発現ベクターによって発現されるペムブロリズマブの生物学的活性を測定することにより、その生物学的活性が、既知の市販のペムブロリズマブの生物学的活性と同一であることが分かった。

実施例８：タンパク質発現システムの発現レベルに対する異なる抗生物質濃度の影響

８.１.１ 図１０と図１１に示すように、それぞれ２グループのベクターを構築した。１つのグループはアダリムマブに用いて、もう１つのグループはペムブロリズマブに用いた。ベクター構築完了した後、ＭＮキットを用いてプラスミド抽出を行い、得られたプラスミドを細胞トランスフェクションに用いた。

８.１.２ 約５００万個のＣＨＯ宿主細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。そして、Ａｍａｘａ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｌ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ# ＶＣＡ-１００５）に含まれる９０μＬ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ及び２０μＬサプリメントＩと、アダリムマブまたはペムブロリズマブの配列を含むベクター３０μｇを均一に混合し、細胞をこの混合溶液で再懸濁し、エレクトロポレーション用キュベットに移した。４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）システムエレクトロポレーション装置で、それぞれの宿主細胞に対応するプログラムを使用して、細胞をトランスフェクションした。エレクトロポレーション後の細胞を抗生物質を含まない培地５ｍＬに再懸濁し、３７℃のシェーカーに入れて培養した。

８.１.３ トランスフェクションから２４時間後、２〜４日ごとに異なる濃度のブラストサイジンおよび/またはゼオシンを含む選択培地を使用して細胞を継代した。ブラスチシジンおよび/またはゼオシンの具体的な濃度を表１０に示した。

８.１.４ 細胞生存率が９０％以上に回復した後、抗体発現レベルを流加培養により評価した。重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターの両方を同じ宿主細胞にトランスフェクトすることができたので、抗体の重鎖と軽鎖は同時に発現することができた。重鎖と軽鎖は宿主細胞内で自己組織化できるため、完全な抗体が得られた。

８.１.５ 得られた抗体の生物学的活性を測定した。

８.２ 実験結果

実施例８の実験結果は表１０の通りである。

表１０からわかるように、ブラストサイジンとゼオシンを含む組み合わせは、ブラストサイジンまたはゼオシンの単独使用と比較して、発現レベルが有意に増加した結果が得られた。

外来タンパク質発現ベクターによって発現されるアダリムマブまたはペムブロリズマブの生物学的活性を測定することにより、その生物学的活性が、既知の市販のアダリムマブまたはペムブロリズマブの生物学的活性と同一であることが分かった。したがって、このベクターによって発現されたタンパク質は正しく折り畳まれた。

本開示の上記の例は、本開示のみを明確に説明するために提供された例であり、本開示の実施形態を限定するものではない。当業者の場合、上記の仕様に基づいて、異なる形態の他の変更または変形を行うこともできる。本明細書のすべての実施形態を網羅する必要はなく、方法もありません。本開示の精神および原則の範囲内で行われた修正、同等の代替、改善などはすべて、本開示の請求項の保護範囲に含まれるべきである。

（３２）ＥＦ１αＩ遺伝子におけるイントロンをさらに含む、（３１）に記載のポリヌクレオチド。

（３３）前記ＥＦ１αＩ遺伝子におけるイントロンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、（３２）に記載のポリヌクレオチド。

（３４）前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ３-９からなる群から選択される制御配列はフォワード（forward）方向である、（３３）に記載のポリヌクレオチド。

（３５）前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ３-９からなる群から選択される制御配列はリバース（reverse）方向である、（３４）に記載のポリヌクレオチド。

（３７）前記第１のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ４と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第２のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ４と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、（３６）に記載の宿主細胞。

（３８）前記第１のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ４と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第２のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ９と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、（３６）に記載の宿主細胞。

（３９）前記第１のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ９と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第２のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ９と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、（３６）に記載の宿主細胞。

（４０）前記第１のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ４と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第２のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １７と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、（３６）に記載の宿主細胞。

（４１）前記第１のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: ９と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、かつ前記第２のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ: １７と少なくとも８５％の同一性を有する配列に作動可能に連結されている、（３６）に記載の宿主細胞。

（４３）センス鎖とアンチセンス鎖を有し、かつ前記センス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３-９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む（５’から３’へ）、（４２）に記載の発現ベクター。

（４４）センス鎖とアンチセンス鎖を有し、かつ前記アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３-９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列（５’から３’へ）、（４２）に記載の発現ベクター。

Claims (20)

1. （ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって：
   （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３-９のいずれかの配列；
   （ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３-９のいずれかの配列の逆相補配列；
   （ｉｉｉ）高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｉ）または（ｉｉ）の配列とハイブリダイズ可能な配列の逆相補配列；及び
   （ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）の配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、さらに少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列；
   である、単離されたポリヌクレオチド分子。
2. 請求項１に記載のポリヌクレオチド分子を含むベクター。
3. 前記ベクターが組換え発現ベクターである請求項２に記載のベクター。
4. （ｖ）〜（ｖｉｉｉ）からなる群から選択されるヌクレオチド配列をさらに含む、
   （ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の配列；
   （ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の配列の逆相補配列；
   （ｖｉｉ）高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｖ）または（ｖｉ）の配列とハイブリダイズ可能な配列の逆相補配列；及び
   （ｖｉｉｉ）（ｖ）または（ｖｉ）の配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、さらに少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列；
   である、請求項２または３に記載のベクター。
5. ＣＭＶプロモーターをさらに含み、好ましくは、前記ＣＭＶプロモーターはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のヌクレオチド配列を含むか、または前記ＣＭＶプロモーターは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６の配列に対して少なくとも８０％、または少なくとも９０％、さらに少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載のベクター。
6. 以下の組み合わせを含む：
   （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４の配列または該配列に対して９０％の同一性を有する配列；
   （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３の配列または該配列に対して９０％の同一性を有する配列；及び
   （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６の配列または該配列に対して９０％の同一性を有する配列；
   である、請求項５に記載のベクター。
7. 一種類または多種類のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子をさらに含む請求項２〜６のいずれか一項に記載のベクター。
8. 前記タンパク質は、抗体、融合タンパク質、酵素、可溶性タンパク質、膜タンパク質、構造タンパク質、リボソームタンパク質、チモーゲン、細胞表面受容体タンパク質、転写調節タンパク質、翻訳調節タンパク質、クロマチンタンパク質、ホルモン、細胞周期調節タンパク質、Ｇタンパク質、神経活性化ペプチド、免疫調節タンパク質、血液成分タンパク質、イオンチャネルタンパク質、熱ショックタンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、抗生物質耐性タンパク質、いずれかの前記タンパク質の機能的フラグメント、いずれかの前記タンパク質のエピトープフラグメント、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項７に記載のベクター。
9. 請求項２〜８のいずれか一項に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
10. タンパク質を安定的に発現する組換え宿主細胞を製造する方法であって、請求項２〜８のいずれか一項に記載のベクターを宿主細胞に挿入するステップを含む方法。
11. 前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である請求項９に記載の組換え宿主細胞または請求項１０に記載の方法。
12. タンパク質を製造する方法であって、タンパク質の産生を可能にする条件下で、請求項９または１１に記載の組換え宿主細胞を培養するステップを含む方法。
13. 請求項９または１１に記載の組換え宿主細胞を含むキット。
14. 異常なタンパク質発現による疾患を検出するための試薬またはキットの製造における、請求項９または１１に記載の組換え宿主細胞の使用。
15. 疾患を治療または予防するための医薬品の製造における、請求項９または１１に記載の組換え宿主細胞の使用。
16. タンパク質を安定的に発現する組換え宿主細胞をスクリーニングする方法であって、ブラスチシジンとゼオシンを含む選択培地を用いて宿主細胞をスクリーニングするステップを含む方法。
17. ブラスチシジンが１-１５μｇ/ｍＬの量で存在し、ゼオシンが５０-１５００μｇ/ｍＬの量で存在する請求項１６に記載の方法。
18. ブラスチシジンが４-９μｇ/ｍＬの量で存在し、ゼオシンが２００-４００μｇ/ｍＬの量で存在する請求項１７に記載の方法。
19. ブラスチシジンが９μｇ/ｍＬの量で存在し、ゼオシンが４００μｇ/ｍＬの量で存在する請求項１８に記載の方法。
20. ブラスチシジンが４μｇ/ｍＬの量で存在し、ゼオシンが２００μｇ/ｍＬの量で存在する請求項１８に記載の方法。

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