RU2787171C1 - Способ определения антител к SARS-COV-2 в смешанной слюне - Google Patents
Способ определения антител к SARS-COV-2 в смешанной слюне Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787171C1 RU2787171C1 RU2022121801A RU2022121801A RU2787171C1 RU 2787171 C1 RU2787171 C1 RU 2787171C1 RU 2022121801 A RU2022121801 A RU 2022121801A RU 2022121801 A RU2022121801 A RU 2022121801A RU 2787171 C1 RU2787171 C1 RU 2787171C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- saliva
- wells
- cov
- sars
- plate
- Prior art date
Links
- 210000003296 Saliva Anatomy 0.000 title claims abstract description 53
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 6
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 230000003287 optical Effects 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 2
- 229940072417 Peroxidase Drugs 0.000 claims description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000437 Peroxidases Proteins 0.000 claims description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000001235 sensitizing Effects 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 3
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 claims 1
- 231100000202 sensitizing Toxicity 0.000 claims 1
- -1 tetramethylbenzidine dihydrochloride monohydrate Chemical compound 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 11
- 206010053983 Corona virus infection Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 108091005599 SARS-CoV-2 Spike protein Proteins 0.000 abstract description 2
- 229940043517 Specific immunoglobulins Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 9
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 200000000015 coronavirus disease 2019 Diseases 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 102000004851 Immunoglobulin G Human genes 0.000 description 6
- 210000000214 Mouth Anatomy 0.000 description 6
- 102100019404 CDSN Human genes 0.000 description 5
- 101700062689 CDSN Proteins 0.000 description 5
- 101710005864 HI_0216 Proteins 0.000 description 5
- 101710005865 MPN_201 Proteins 0.000 description 5
- 101710005862 MPN_285 Proteins 0.000 description 5
- 101710005861 MPN_289 Proteins 0.000 description 5
- 101710005860 MPN_290 Proteins 0.000 description 5
- 101710029070 MPN_343 Proteins 0.000 description 5
- 101710005841 MPN_365 Proteins 0.000 description 5
- 101710005863 MPN_615 Proteins 0.000 description 5
- 101710005859 MPN_638 Proteins 0.000 description 5
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 5
- 101700083974 prrB Proteins 0.000 description 5
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 4
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 4
- 101710004211 VTN Proteins 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 229940112822 Chewing Gum Drugs 0.000 description 2
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010039424 Salivary hypersecretion Diseases 0.000 description 2
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 235000015218 chewing gum Nutrition 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 description 2
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 2
- KVCWTKDFVVSVSJ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-amino-3,5-dimethylphenyl)-2,6-dimethylaniline;hydrate;dihydrochloride Chemical compound O.Cl.Cl.CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 KVCWTKDFVVSVSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000981 Epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000628997 Flos Species 0.000 description 1
- 210000003128 Head Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 description 1
- 210000000088 Lip Anatomy 0.000 description 1
- 229940051866 Mouthwash Drugs 0.000 description 1
- 210000003097 Mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001331 Nose Anatomy 0.000 description 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 1
- 108091005601 SARS-CoV-2 Spike Subunit S1 Proteins 0.000 description 1
- 210000003079 Salivary Glands Anatomy 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 230000003497 anti-pneumococcal Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000001488 breeding Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulators Drugs 0.000 description 1
- 238000009114 investigational therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000002324 mouth wash Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 230000000391 smoking Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000031068 symbiosis, encompassing mutualism through parasitism Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Разработан способ количественной оценки содержания локальных антител в слюне с использованием в качестве антигена рекомбинантного S-белка SARS-CoV-2. Способ показал высокую результативность и позволяет повысить эффективность диагностики коронавирусной инфекции за счет определения вирус-специфических иммуноглобулинов в слюне. 4 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области вирусологии и иммунологии и может быть использовано в медицине при изучении коллективного иммунитета к SARS-CoV-2 и при оценке иммуногенности мукозальных вакцин против вируса SARS-CoV-2.
Инфекция COVID-19 является глобальной медико-социальной проблемой вследствие высокой заболеваемости и смертности. К инфекции восприимчивы люди всех возрастных категорий, но пожилое население и пациенты с сопутствующими заболеваниями в анамнезе особо подвержены риску серьезных последствий для здоровья [Muralidar S. et al. The emergence of COVID-19 as a global pandemic: Understanding the epidemiology, immune response and potential therapeutic targets of SARS-CoV-2 // Biochimie. - 2020. - T. 179. - C. 85-100.]. Против нового вируса у человека изначально нет иммунитета, он приобретается после перенесенной болезни или после вакцинации.
Вирус SARS-CoV-2 распространяется воздушно-капельным путем вдыхания распыленных в воздухе частиц. Ротовая полость так же, как и нос, является местом первого контакта ранее несенсибилизированного организма с опасным антигеном [Varghese P.М. et al. Host-pathogen interaction in COVID-19: Pathogenesis, potential therapeutics and vaccination strategies // Immunobiology. - 2020. - T. 225. - №. 6. - C. 152008.].
Достижение успехов в профилактике и лечении новой коронавирусной инфекции прежде всего связано с познанием биологических свойств возбудителя и закономерностей формирования иммунитета. Главным фактором специфического иммунитета против SARS-CoV-2 являются сывороточные и секреторные антитела, первые из которых циркулируют в кровяном русле и являются основным звеном гуморального иммунитета, а вторые - локализуются непосредственно на слизистых ротовой полости и верхних дыхательных путей и отражают состояние местного иммунитета [Russell M.W. et al. Mucosal immunity in COVID-19: a neglected but critical aspect of SARS-CoV-2 infection // Frontiers in Immunology. - 2020. - C. 3221.].
Выявление специфических антител к SARS-CoV-2 наряду с обнаружением вирусного генетического материала методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) является основным методом идентификации COVID-19. При разработке вакцин против коронавирусной инфекции, включая мукозальные [Suvorov A. et al. Construction of the Enterococcal Strain Expressing Immunogenic Fragment of SARS-Cov-2 Virus //Frontiers in Pharmacology. - 2021. - T. 12. - C. 807256-807256.], требуется разработка критериев иммуногенности. Ряд исследований, связанных с COVID-19, предполагают защитную роль клеточного и гуморального иммунитета у человека [Li G. et al. Coronavirus infections and immune responses //Journal of medical virology. - 2020. - T. 92. - №. 4. - C. 424-432.], но оценка параметров клеточного иммунитета является намного более трудоемкой и затратной по сравнению с выявлением антител, включая локальные IgA.
Ротовая полость не только является входными воротами для ряда инфекций. Состояние слизистой оболочки отражает состояние иммунитета всего организма, а слюна является ценным диагностическим материалом для диагностики целого ряда инфекций [Heaney J. L. J. et al. The utility of saliva for the assessment of anti-pneumococcal antibodies: investigation of saliva as a marker of antibody status in serum // Biomarkers. - 2018. - T. 23. - №. 2. - C. 115-122; Beelaert G. et al. Evaluation of the intercept oral specimen collection device with HIV assays versus paired serum/plasma specimens // Journal of virological methods. - 2016. - T. 234. - C. 164-168.], включая SARS-CoV-2 [Pisanic N. et al. COVID-19 serology at population scale: SARS-CoV-2-specific antibody responses in saliva //Journal of clinical microbiology. - 2020. - T. 59. -№. 1. - C. e02204-20.],
Задачей данного изобретения является разработка способа оценки локальных антител к вирусу SARS-COV-2 в смешанной слюне методом иммуноферментного анализа (ИФА) с с использованием рекомбинантного S-белка вируса SARS-CoV-2 (заявка 576). Смешанная слюна - это общий суммарный секрет больших и малых слюнных желез, помимо этого включающий микрофлору полости рта и продукты ее жизнедеятельности, детрит и слущенный эпителий, десневую жидкость, клетки иммунной защиты (лейкоциты и др.), а также назальную слизь и бронхиальные секреты. Часто в литературе употребляется термин «слюна», но понимают под этим словом именно смешанную слюну [Брещенко Е.Е., Быков И.М. Биохимия полости рта, ротовой и десневой жидкостей: учебно-методическое пособие. - Краснодар, 2018. - 63 с.].
Сущностью предлагаемого изобретения является разработка полуколичественного способа для определения содержания антител к вирусу SARS-CoV-2 в смешанной слюне. Поставленная задача решалась путем оптимизации условий протекания реакции, определения способа нормализации и верификации полученных данных путем сравнения с результатами других тестов по выявлению антител к S-белку вируса SARS-CoV-2 в крови и слюни.
Организация исследования.
В исследовании приняли участие 43 человека в возрасте от 20 до 67 лет, разделенные на 3 группы. Исследование одобрено Локальным этическим комитетом ФГБНУ «ИЭМ» (протокол №3/21 от 27.10.2021). От каждого участника было полученное письменное информированное согласие. Для подтверждения иммунологического статуса пациентов в трех исследуемых группах на основании наличия IgG в крови был использован коммерческий набор реактивов «SARS-CoV-2-IgG-ИФА-БЕСТ», Вектор-Бест, г. Новосибирск, Россия согласно прилагаемой к набору инструкции.
Сведения об исследуемых группах пациентов представлены в таблице 1.
Сбор смешанной слюны, обработка и хранение.
За день до сбора материалов каждый пациент получил следующие рекомендации:
1) Не употреблять спиртные напитки за сутки;
2) Не есть, не пить (кроме негазированной воды) за 2 часа до сбора слюны;
3) Негазированную воду рекомендовалось не употреблять за 1 час до сбора слюны;
4) Не чистить зубы, не использовать зубную нить и ирригатор за 2 часа до сбора слюны;
5) Не использовать жевательную резинку для стимуляции выделения слюны. Воздержаться от приема жевательной резинки за 2 часа до сбора слюны;
6) Не курить за 2 часа до сбора слюны;
7) Не пользоваться ополаскивателями для полости рта за 2 часа до сбора слюны;
8) Если в течение нескольких дней до исследования пациент постоянно или периодически принимал любые лекарственные препараты, ему следовало предупредить об этом исследователя.
Условия, сформулированные в письменном виде, должны были быть полностью выполнены перед сбором биологических материалов; в противном случае, пациент не допускался до исследования. Рекомендации были даны пациентам для исключения разбавления слюны (стимуляция слюноотделения, употребление жидкости и др.), для исключения пересушивания слизистой оболочки (курение, употребление алкоголя) и для исключения влияния лекарственных препаратов на ход исследования (к примеру, иммуномодуляторов).
Для исследование требовался однократный сбор нестимулированной смешанной слюны (в состоянии покоя). Пациенту было предложено занять удобное сидячее положение и проглотить всю накопившуюся за длительное время слюну. Далее испытуемый опускал голову вниз, и с этого момента не глотал слюну, а также не двигал губами и языком во время всего периода сбора слюны. Исходя из наблюдения, в среднем слюна накапливалась в полости рта в течение 2 мин, а затем под силой тяжести стекала в приемный сосуд, который удерживался исследователем.
Образцы слюны были заморожены в соответствии с существующими стандартами хранения биологических жидкостей и хранились в морозильной камере при постоянной температуре -20°С.
Образцы слюны были исследованы методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка S1 SARS-CoV-2, разработанного в отделе молекулярной микробиологии «ИЭМ» [Suvorov A. et al. Construction of the Enterococcal Strain Expressing Immunogenic Fragment of SARS-Cov-2 Virus // Frontiers in Pharmacology. -2021. - T. 12. - C. 807256-807256.]. Рекомбинантный белок включает часть рецептор-связывающего домена (RBD) белка S1 вируса SARS-CoV-2, экспрессирован в E. coli и очищен, как указано в цитируемой публикации.
Осуществление заявляемого способа.
Иммуноферментный анализ проводили в 96-луночных планшетах для иммунологических реакций с плоским дном (Thermo Fisher Scientific, Дания). Для сенсибилизации в лунки каждого планшета вносили по 100 мкл антигена (рекомбинантный S-белок SARS-CoV-2) в концентрации 2 мкг/мл. Сорбцию проводили в 0,1 M бикарбонатном буфере (рН=9,5) в течение 18-20 часов при 4°С. После этого содержимое из планшета удаляли и добавляли в лунки по 100 мкл забуференного физиологического раствора, рН=7,4 (PBS), содержащего 0,05% Твин-20 (PBST). Инкубацию проводили при 37°С в течение 30 мин. Содержимое планшета удаляли и трижды промывали PBST. Затем в лунки планшета вносили пробы слюны (с начальным разведением 1:4) с последующим шагом разведения равным четырем. Все разведения осуществляли в PBST, и каждую пробу дублировали. Инкубацию проводили в течение 1 часа при 37°С. Далее содержимое планшета удаляли, и дважды промывали планшет PBST. После этого в лунки добавляли по 100 мкл кроличьих пероксидазно-меченных антител к IgA человека (Elabsciense, КНР). После часовой инкубации при 37°С содержимое планшета удаляли и четырежды отмывали планшет PBST. Далее для визуализации реакции в лунки планшета вносили по 100 мкл субстратной смеси ТМВ (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride Monohydrate, BD OptEIA™, США); реакцию останавливали внесением в лунки по 50 мкл 1Н H2SO4 (28 мл концентрированной серной кислоты на 1 литр воды). Реакцию регистрировали при длине волны 450 нм с помощью планшетного фотометра ELx800 (BIO-TEK INSTRUMENTS, INC., США). За титр антител принимали конечное разведение исследуемого материала, которое давало значение оптической плотности при длине волны 450 нм (ОП450) превышающее среднюю ОП450 негативных лунок на величину 3-х стандартных отклонений.
Результаты изучения вирус-специфических IgA в слюне, полученные в ИФА с использованием в качестве подложки рекомбинантного S-белка SARS-Cov-2, были нормализованы для того, чтобы уравновесить значения, так как при увеличенном количестве общих IgA в слюне может возрастать и количество вирус-специфических IgA вне зависимости от уровня иммунитета после контакта с вирусом.
Определение общего IgA в слюне.
Определение содержания общего IgA в слюне проводили с помощью коммерческого набора реагентов ООО «Полигност» (г.Санкт-Петербург, Россия) согласно инструкции производителя.
Определение общего белка в слюне.
Для того, чтобы исключить влияние колебаний концентрации общего белка в исследуемых образцах, этот показатель также учитывали. Определение концентрации общего белка в слюне проводили на спектрофотометре NanoDrop 2000, 190-850 нм, Thermo Scientific, США.
Авторами разработан метод для полуколичественной оценки локальных вирус-специфических IgA в слюне.
Пример 1.
На Фиг. 1 представлены уровни общих IgA и общего белка в одних и тех же пробах смешанной слюны обследованных пациентов.
Нормализованные титры локальных вирус-специфических IgA рассчитывали по формуле:
По оси абсцисс представлены группы пациентов, по оси ординат -концентрации в мг/мл.
На Фиг. 2 представлены усредненные и индивидуальные нормализованные и ненормализованные титры IgA специфичных к рекомбинантному S-белку SARS-Cov-2 антител в слюне исследуемых пациентов. По оси абсцисс представлены группы пациентов, по оси ординат - обратные титры антител. Стартовое разведение - 1:4, шаг - 1:4. * - Р<0,05 согласно критерию Манна-Уитни. Вершины столбцов соответствуют среднегеометрическим титрам антител (СГТ).
Показано, что СГТ локальных IgA после нормализации составили 15,5, 3,5 и 6,6 в группах реконвалесцентов, не переболевших и вакцинированных, соответственно. При сравнении нормализованных титров IgA в различных испытуемых группах были отмечены статистически значимые различия между реконвалесцентами и не переболевшими (Р=0,0159). Без нормализации СГТ антител в слюне были близкими по значению к нормализованным показателям (16,8, 5,0 и 6,6 соответственно), но различия между группами не были статистически значимыми (Фиг. 1).
Пример 2. Данные о корреляции титров IgG и IgA в слюне.
На фиг. 3. представлены результаты корреляционного анализа титров IgA и IgG антител в слюне. По оси абсцисс представлены обратные титры IgG антител, по оси ординат приведены обратные титры IgA антител.
Показана высокая степень корреляции между титрами IgA и IgG в слюне, о чем свидетельствует коэффициент корреляции r2=0,9, что согласно шкале Чеддока соответствует высокой силе связи между переменными.
Пример 3.
Авторы также продемонстрировали связь средней силы между уровнями IgA в крови и слюне у одних и тех же пациентов (r2=0,564), что может объясняться различным происхождением антител в сыворотке и слюне. Полученная корреляция значений титров IgA в крови и слюне отражена на фиг. 4. По оси абсцисс представлены обратные титры IgA антител в слюне, по оси ординат приведены обратные титры IgA антител в крови.
Показана связь высокой силы и прямая зависимость между содержанием локальных IgG и IgA в слюне. Помимо этого, между содержанием IgA в крови и слюне выявлена взаимосвязь средней силы. Это может быть обусловлено различным происхождением антител, выявляемых на поверхности слизистых оболочек, и антител, циркулирующих в крови.
Таким образом, разработан способ количественной оценки содержания локальных антител в слюне с использованием в качестве антигена рекомбинантного S-белка SARS-CoV-2. Методика показала высокую результативность и позволяет повысить эффективность диагностики коронавирусной инфекции за счет определения вирус-специфических иммуноглобулинов в слюне.
Claims (1)
- Способ определения антител к SARS-COV-2 в смешанной слюне, включающий проведение иммуноферментного анализа образцов жидкой слюны в луночных планшетах для иммунологических реакций с плоским дном, отличающийся тем, что предварительно в лунки каждого планшета вносят по 100 мкл сенсибилизирующего антигена, представляющего собой рекомбинантный S-белок SARS-CoV-2 в концентрации 2 мкг/мл, и проводят сорбцию в 0,1 M бикарбонатном буфере с рН=9,5 в течение 18-20 часов при 4°С, затем содержимое из планшета удаляют и добавляют в лунки по 100 мкл забуференного физиологического раствора PBST, имеющего рН=7,4 и содержащего 0,05% стандартного препарата Твин-20, затем проводят инкубацию при 37°С в течение 30 мин, после чего содержимое планшета удаляют и трижды промывают раствором PBST, затем в лунки планшета вносят пробы слюны с начальным разведением 1:4 и последующим шагом разведения равным четырем, проводят инкубацию в течение 1 часа при 37°С, далее содержимое планшета удаляют, дважды промывают планшет раствором PBST, после чего в лунки добавляют по 100 мкл кроличьих пероксидазно-меченых антител к IgA человека, инкубируют в течение часа при 37°С, содержимое планшета удаляют, четырежды отмывают планшет раствором PBST, далее вносят в лунки планшета по 100 мкл субстратной смеси тетраметилбензидина дигидрохлорид моногидрата и останавливают реакцию внесением в лунки по 50 мкл серной кислоты, разведенной из расчета 28 мл концентрированной серной кислоты на 1 литр воды, после чего регистрируют оптическую плотность материала с помощью планшетного фотометра при длине волны 450 нм, принимая за титр антител конечное разведение исследуемого материала, дающее значение оптической плотности, превышающее среднюю оптическую плотность негативных лунок на величину 3 стандартных отклонений.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2787171C1 true RU2787171C1 (ru) | 2022-12-29 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2730897C1 (ru) * | 2020-07-01 | 2020-08-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19 |
| RU2759149C1 (ru) * | 2021-04-13 | 2021-11-09 | Акционерное общество "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО" | Способ проведения иммуноферментного анализа для выявления антител в биологическом образце человека, специфичных к коронавирусу человека SARS-COV2, тест-система |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2730897C1 (ru) * | 2020-07-01 | 2020-08-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19 |
| RU2759149C1 (ru) * | 2021-04-13 | 2021-11-09 | Акционерное общество "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО" | Способ проведения иммуноферментного анализа для выявления антител в биологическом образце человека, специфичных к коронавирусу человека SARS-COV2, тест-система |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NORA PISANIC, PRANAY R RANDAD et al, COVID-19 Serology at Population Scale: SARS-CoV-2-Specific Antibody Responses in Saliva, J Clin Microbiol, 2020 Dec 17; 59(1), реферат. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Seror et al. | Association of anti–Porphyromonas gingivalis antibody titers with nonsmoking status in early rheumatoid arthritis: results from the prospective French cohort of patients with early rheumatoid arthritis | |
| Lucero et al. | Human Brucella canis outbreak linked to infection in dogs | |
| Nahm et al. | Identification of α-enolase as an autoantigen associated with severe asthma | |
| Rouhani et al. | Using specific synthetic peptide (p176) derived AgB 8/1-kDa accompanied by modified patient’s sera: a novel hypothesis to follow-up of Cystic echinococcosis after surgery | |
| Majster et al. | Salivary calprotectin is elevated in patients with active inflammatory bowel disease | |
| Chaiyarit et al. | Trefoil factors in saliva and gingival tissues of patients with chronic periodontitis | |
| Muniz et al. | SARS-CoV-2 and saliva as a diagnostic tool: a real possibility | |
| Grogan et al. | Anti-schistosome IgG4 and IgE at 2 years after chemotherapy: infected versus uninfected individuals | |
| Jiang et al. | Dynamic observation of SARS‐CoV‐2 IgM, IgG, and neutralizing antibodies in the development of population immunity through COVID‐19 vaccination | |
| RU2787171C1 (ru) | Способ определения антител к SARS-COV-2 в смешанной слюне | |
| RU2360254C1 (ru) | Способ дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза различной этиологии у детей | |
| Weber et al. | SARS-CoV-2 seroprevalence in healthcare workers and risk factors | |
| Badabaan et al. | The Relationship between salivary IgA level and dental caries in healthy school-aged children in makkah al-mukarramah | |
| Misbah et al. | Antipolysaccharide antibodies in 450 children with otitis media | |
| RU2414713C1 (ru) | Способ определения показания к проведению профилактической прививки против дифтерии | |
| Al-Kindi et al. | The first confirmed pediatric chronic osteomyelitis due to Coxiella burnetii in Oman | |
| Mihara et al. | Bordetella pertussis is a common pathogen in infants hospitalized for acute lower respiratory tract infection during the winter season | |
| Kim et al. | Performance evaluation of four rapid antibody tests for the detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 | |
| Yeung et al. | IgG subclass specific antibody response to periodontopathic organisms in HIV‐positive patients | |
| US11519919B2 (en) | Assay for the diagnosis of nematode infections | |
| RU2450276C1 (ru) | Способ дифференциальной диагностики увеитов при болезни бехтерева и ревматоидном артрите | |
| Hoffman et al. | Understanding COVID-19: the virus | |
| RU2752144C1 (ru) | Способ определения необходимости ревакцинации против кори у медицинских работников | |
| Ciaccio et al. | COVID-19 | |
| RU2415439C1 (ru) | Способ дифференциальной диагностики увеита при ревматоидном артрите и болезни бехтерева |