CN112684169A - 一种基于免疫层析法的新型冠状病毒n蛋白的检测试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于免疫层析法的新型冠状病毒N蛋白的检测试纸条，包括底板，所述底板上表面上呈线性依次固接有上样垫、结合垫、硝酸纤维素薄膜和吸水纸；上样垫与结合垫部分贴合，结合垫与层析膜部分贴合，层析膜与吸水纸部分贴合；层析膜上嵌有检测线T和质控线C，结合垫上喷涂有含有N蛋白抗体1的金磁免疫探针，检测线T上包被有N蛋白抗体2，质控线C上包被有羊抗鼠IgG，检测线T靠近金磁免疫探针标记的结合垫端。本发明试纸条只需一步加样，上样后10‑15分钟内就能目测判定结果。能极大缓解当前巨大的临床诊疗压力，尤其适合用于在交通枢纽人群以及对密切接触人群进行大规模的初筛排查。
Description
技术领域
本发明属于子生物检测技术领域，具体涉及一种基于免疫层析法 的新型冠状病毒N蛋白的检测试纸条。
背景技术
2019新型冠状病毒(COVID-19)传染性极强，目前还未有针对 性的疫苗和药物，WHO宣布将COVID-19肺炎疫情列为国际关注 的突发公共卫生事件(PHEIC)。通过隔离和诊断测试来预防和控 制感染，是目前控制COVID-19的暴发的最有效手段之一。目前已 投入使用的COVID-19检测试纸条绝大部分都是基于核酸扩增技 术建立，如实时荧光定量PCR法和核酸等温扩增技术。这些方法使 用的样本采集多为上呼吸道样本(咽拭子为主)，采集过程对于医护人 员暴露风险极大，且需要依赖相关PCR实验室及昂贵仪器，不合 适供现场即时检测(POCT)。
目前有二十多家企业在短时间内成功研制出新型冠状病毒核酸 诊断试纸条，如Roche(罗氏诊断)、深圳华大基因、西安天隆科技 等公司研发的基于荧光定量PCR法的新型冠状病毒核酸检测试纸 条；中国疾病预防控制中心与江苏奇天基因生物科技有限公司联合 研制、陕西师范大学的基于等温扩增技术(LAMP)的新型冠状病毒
核酸检测试纸条。为全面发力狙击新型肺炎疫情，在机场、火车 站、长途汽车站等重点交通枢纽启动COVID-19病原体检测，可有 效防止其通过交通工具传播和扩散，而目前投入使用的核酸检测试纸 条需要依赖相关PCR实验室及昂贵仪器，不合适供现场即时检测POCT。此外，基于荧光定量PCR法的新型冠状病毒核酸检测试纸 条用时基本至少在1～2个小时，不适用于对乘客进行大规模检查， 因为测试耗时较长，此类措施会阻碍正常运营。而基于等温扩增技术 的新型冠状病毒核酸检测试纸条操作简便，耗时一般在15分钟左右，但需配备浊度仪检测以减少气溶胶污染，对引物要求高易造成假阳性， 且LAMP属于日本专利，试剂开发受到限制，成本较高不适宜大规 模排查检测。针对目前COVID-19疫情的防控，亟需一种检测准确， 用时短，操作简单，成本较低，无需大型仪器的检测方法，用于在交 通枢纽人群以及对密切接触人群进行大规模的初筛排查。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于免疫层析法的新型冠状病毒N 蛋白的检测试纸条，检测检测灵敏度高、时间短，可用于大规模新型 冠状病毒的初筛排查中。
本发明所采用的技术方案是：一种基于免疫层析法的新型冠状病 毒N蛋白的检测试纸条，包括底板，所述底板上表面上呈线性依次 固接有上样垫、结合垫、硝酸纤维素薄膜和吸水纸；上样垫与结合垫 部分贴合，结合垫与层析膜部分贴合，层析膜与吸水纸部分贴合；层 析膜上嵌有检测线T和质控线C，结合垫上喷涂有含有N蛋白抗体1 的金磁免疫探针，检测线T上包被有N蛋白抗体2，质控线C上包 被有羊抗鼠IgG，检测线T靠近金磁免疫探针标记的结合垫端。
本发明所采用第一种技术方案的特点还在于，
含有N蛋白抗体1的金磁免疫探针具体按照以下步骤制备：
取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡2次，将N蛋白抗体1按照与 金磁微粒质量比1:10加入经平衡处理后的金磁微粒中，置于0～25℃ 的空气恒温振荡器中充分反应100～220rpm反应2～12h即得。
偶联缓冲液为PH＝4～8h，0.01～0.1M的磷酸盐缓冲液的任一种。
金磁微粒在使用前采用聚阴离子电解质对其进行修饰。
金磁微粒为核壳结构的超顺磁性复合纳米微粒，核为超顺磁性氧 化铁微粒，表面为胶体金性质。
本发明的有益效果是：本发明试纸条选用金磁纳米微粒作为标记 材料，建立用于COVID-19核衣壳蛋白(N)检测的免疫层析试纸 条。该方法以血清、血浆作为检测样本，血液样本采集便捷，一般 血液样本含毒量低或者不含病毒，可以大大降低医护人员被感染风险。 采用双抗体夹心法原理进行检测，只需一步加样(血清/血浆)，简单、 高效、成本低，上样后10-15分钟内就能目测判定结果。能极大缓 解当前巨大的临床诊疗压力，尤其适合用于在交通枢纽人群以及对密 切接触人群进行大规模的初筛排查。
附图说明
图1为本发明检测层析试纸条结构示意图；
图2为本发明检测层析试纸条原理示意图；
图3是本发明基于免疫层析法的新型冠状病毒N蛋白的的阳性 检测结果图；
图4是本发明基于免疫层析法的新型冠状病毒N蛋白的的阴性 检测结果图。
图中：1.底板，2.上样垫，3.结合垫，4.硝酸纤维素膜，5.吸收 垫，6.检测线T，7.质控线C。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
如图1所示，为本发明一种基于免疫层析法的新型冠状病毒N 蛋白的检测试纸条的试纸条结构示意图，包括底板1，底板1上表面 上呈线性依次固接有上样垫2、结合垫3、硝酸纤维素薄膜4和吸水 纸5；上样垫2与结合垫3部分贴合，结合垫3与层析膜4部分贴合， 层析膜4与吸水纸5部分贴合；层析膜4上嵌有检测线T6和质控线 C7，结合垫3上喷涂有含有N蛋白抗体1的金磁免疫探针，检测线 T6上包被有N蛋白抗体2，质控线C7上包被有羊抗鼠IgG，检测 线T6靠近金磁免疫探针标记的结合垫3端。
含有N蛋白抗体1的金磁免疫探针具体按照如下步骤制备：
取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡2次，将N蛋白抗体1按照与 金磁微粒质量比1:10加入经平衡处理后的金磁微粒中，置于0～25℃ 的空气恒温振荡器中充分反应100～220rpm反应2～12h即得
偶联缓冲液为PH＝4～8h，0.01～0.1M的磷酸盐缓冲液的任一种。 修饰后的金磁纳米微粒在偶联抗体后粒径均一，为后续应用于免疫层 析技术奠定了良好的基础。
上述金磁微粒为核壳结构的超顺磁性复合纳米微粒，核为超顺磁 性氧化铁微粒，表面为胶体金性质，无需共价偶联试剂。
金磁微粒在使用前采用聚阴离子电解质对其进行修饰。由于金磁 纳米微粒表面性质较为复杂，且在缓冲液中分散性降低，易出现团聚 现象。因此，通过聚阴离子电解质对金磁微粒进行修饰后，才将其 用于免疫探针的构建。修饰后的金磁纳米微粒在偶联抗体后粒径均 一，为后续应用于免疫层析技术奠定了良好的基础。
如图2所示，本发明的检测过程如下：将待测样本滴加在上样垫 2上，待检测血清/血浆样品首先与金磁免疫探针混合，由于吸水纸及 毛细管作用，液体会自发流向另一端，沿NC膜向上层析依次通过 T线、C线。当待检测物中含有病毒N蛋白时，液体在结合垫3时，病毒N蛋白与免疫探针中的N蛋白抗体1产生作用，再流经NC 膜上的T线，遇到捕获剂时，即可形成“检测显色剂-病毒N蛋白- 捕获剂”双抗体夹心复合物，并在检测线处形成一条红色条带。同时， 无论待测样本中是否含有病毒N蛋白，C线上处总会形成金磁免疫 探针和羊抗鼠Ig G结合形成的复合物，并出现一条紫红色条带。
检测判定标准为：当C线和T线同时出现条带时，判定为阳 性，阳性检测结果图为图3所示；当仅有C线出现条带时，表明本 次测试的有效和操作正确，判定为阴性，阴性检测结果图如图4所示； 当质控线不出现条带时，判定为实验或检测失败。
本发明试纸条以血清、血浆作为检测样本，采用双抗体夹心法原 理进行检测，只需一步加样(血清/血浆)，简单、高效、成本低， 上样后10-15分钟内就能目测判定结果。能极大缓解当前巨大的临 床诊疗压力，尤其适合用于在交通枢纽人群以及对密切接触人群进行 大规模的初筛排查。
Claims (5)
1.一种基于免疫层析法的新型冠状病毒N蛋白的检测试纸条，其特征在于，包括底板(1)，所述底板(1)上表面上呈线性依次固接有上样垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素薄膜(4)和吸水纸(5)；所述上样垫(2)与结合垫(3)部分贴合，所述结合垫(3)与层析膜(4)部分贴合，所述层析膜(4)与吸水纸(5)部分贴合；所述层析膜(4)上嵌有检测线T(6)和质控线C(7)，所述结合垫(3)上喷涂有含有N蛋白抗体1的金磁免疫探针，所述检测线T(6)上包被有N蛋白抗体2，所述质控线C(7)上包被有羊抗鼠IgG，所述检测线T(6)靠近金磁免疫探针标记的结合垫(3)端。
2.根据权利要求1所述的一种基于免疫层析法的新型冠状病毒N蛋白的检测试纸条，其特征在于，所述含有N蛋白抗体1的金磁免疫探针具体按照以下步骤制备：
取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡2次，将N蛋白抗体1按照与金磁微粒质量比1:10加入经平衡处理后的金磁微粒中，置于0～25℃的空气恒温振荡器中充分反应100～220rpm反应2～12h即得。
3.根据权利要求2所述的一种基于免疫层析法的新型冠状病毒N蛋白的检测试纸条，其特征在于，所述偶联缓冲液为PH＝4～8h，0.01～0.1M的磷酸盐缓冲液的任一种。
4.根据权利要求2所述的一种基于免疫层析法的新型冠状病毒N蛋白的检测试纸条，其特征在于，所述金磁微粒在使用前采用聚阴离子电解质对其进行修饰。
5.根据权利要求1所述的一种基于免疫层析法的新型冠状病毒N蛋白的检测试纸条，其特征在于，所述金磁微粒为核壳结构的超顺磁性复合纳米微粒，核为超顺磁性氧化铁微粒，表面为胶体金性质。
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