KR20220051002A - B-세포 성숙 복합체 car t 작제물 및 프라이머 - Google Patents

B-세포 성숙 복합체 car t 작제물 및 프라이머 Download PDF

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KR20220051002A
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얀센 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 B-세포 성숙 항원 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하기 위한 프로브 및 프라이머 세트, 및 관련 방법 및 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 CAR T 의약품으로의 B-세포 성숙 항원 CAR 이식유전자 통합을 정량화하기 위해 정량적 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 위한 프로브 및 프라이머 세트, 및 관련 방법 및 키트를 제공한다.

Description

B-세포 성숙 복합체 CAR T 작제물 및 프라이머
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 8월 30일자로 출원된 미국 임시 출원 제62/894,663호의 이익을 주장한다. 전술된 출원의 전체 내용은 본원에 원용되어 포함된다.
원용에 의한 ASCII 텍스트 파일 내의 자료의 포함
본 출원은, ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었으며 그 전체가 원용되어 본원에 포함된 서열 목록을 포함한다. 2020년 8월 28일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 JBI6148WOPCT1_SL.txt이며, 크기가 8175 바이트이다.
T 세포 요법은 특정 종양 관련 항원에 대한 특이성을 향상시키도록 유전자 변형된 단리된 T 세포를 사용한다. 유전자 변형은 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor) 또는 외인성 T 세포 수용체를 발현시켜 T 세포 상에 새로운 항원 특이성을 제공하는 것을 수반할 수 있다. 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포(CAR T 세포)는 종양 면역반응성을 유도할 수 있다. B 세포 성숙 항원(BCMA: B cell maturation antigen)은 성숙한 B 세포 및 악성 원형질 세포의 표면 상에서 발현되는 분자이며, 예를 들어 다발성 골수종과 같은 암의 치료에서의 표적 분자이다. CAR T 세포, 특히 BCMA 종양 관련 항원에 특이적인 CAR T 세포를 사용하는 더 양호한 암 요법에 대한 필요가 존재한다.
발명의 내용
본 발명은 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction), 예를 들어 정량적 PCR을 위한 프로브 및 프라이머에 관한 것이다. 본 발명은 또한 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하기 위한 본원에 기술된 프로브 및 프라이머를 사용하는 키트 및 방법에 관한 것이다.
제1 양태에서, 본 발명은 프로브 및 프라이머 세트를 제공하며, 이는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 프로브; 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함한다(실시예 1, 표 1 참조).
또 다른 양태에서, 본 발명은 프로브 및 프라이머 세트를 제공하며, 이는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 프로브; 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함한다(실시예 1, 표 1 참조).
또 다른 양태에서, 본 발명은 프로브 및 프라이머 세트를 제공하며, 이는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13, 서열번호 16, 서열번호 19, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 프로브; 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17, 서열번호 20, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함한다(표 1 참조).
일부 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 표지는 방사성 동위원소, 효소 기질, 화학발광제, 형광단, 형광 소광제, 효소, 화학물질, 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하기 위한 키트를 제공하며, 이는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 프로브; 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하기 위한 키트를 제공하며, 이는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 프로브; 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 CAR T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하기 위한 키트를 제공하며, 이는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13, 서열번호 16, 서열번호 19, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 프로브; 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17, 서열번호 20, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 서열번호 3, 서열번호6, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함한다.
본 발명의 키트의 일부 실시형태에서, 상기 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지는 방사성 동위원소, 효소 기질, 화학발광제, 형광단, 형광 소광제, 효소, 화학물질, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 키트는 상기 프로브를 포함하는 어레이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 어레이는 다중-웰 플레이트(multi-well plate)이다.
일 실시형태에서, 상기 키트는 서열번호 22의 핵산 서열(실시예 2, 표 2, hALB 세트 1로부터의 프로브 참조) 및 인간 알부민(hALB: human albumin) 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 hALB 프로브, 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머(표 2, hALB 세트 1로부터의 순방향 프라이머), 및 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머(표 2, hALB 세트 1로부터의 역방향 프라이머)를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지는 방사성 동위원소, 효소 기질, 화학발광제, 형광단, 형광 소광제, 효소, 화학물질, 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 키트는 서열번호 22, 서열번호 25, 서열번호 28, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열 및 인간 알부민(hALB) 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 hALB 프로브, 서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 29, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머, 및 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머를 추가로 포함한다(표 2). 특정 실시형태에서, 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지는 방사성 동위원소, 효소 기질, 화학발광제, 형광단, 형광 소광제, 효소, 화학물질, 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법을 제공하며, 이는,
서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머 및 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 hALB 핵산을 생성하는 단계;
CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 증폭된 hALB 핵산과 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법을 제공하며, 이는,
서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머, 및 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머, 및 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 hALB 핵산을 생성하는 단계;
CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 증폭된 hALB 핵산과 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법을 제공하며, 이는,
CAR T 세포로부터의 핵산을 제1 CAR 프라이머, 제2 CAR 프라이머, 제1 hALB 프라이머, 및 제2 hALB 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는, 단계;
상기 제1 CAR 프라이머 및 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
상기 제1 hALB 프라이머 및 제2 hALB 프라이머를 사용하여 hALB 핵산을 증폭시켜, 증폭된 hALB 핵산을 생성하는 단계;
CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 증폭된 hALB 핵산과 상기 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법을 제공하며, 이는,
CAR T 세포로부터의 핵산을 제1 CAR 프라이머, 제2 CAR 프라이머, 제1 hALB 프라이머, 및 제2 hALB 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는, 단계;
상기 제1 CAR 프라이머 및 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
상기 제1 hALB 프라이머 및 제2 hALB 프라이머를 사용하여 hALB 핵산을 증폭시켜, 증폭된 hALB 핵산을 생성하는 단계;
CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 증폭된 hALB 핵산과 상기 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 CAR T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법을 제공하며, 이는,
CAR T 세포로부터의 핵산을 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17, 서열번호 20, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머와 접촉시키고, CAR T 세포로부터의 핵산을 서열번호 3, 서열번호6, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머와 접촉시키는 단계;
CAR T 세포로부터의 핵산을 서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 29, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머와 접촉시키고, CAR T 세포로부터의 핵산을 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머와 접촉시키는 단계;
CAR T 세포로부터의 핵산을 CAR 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 CAR 프로브는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13, 서열번호 16, 서열번호 19, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단계;
CAR T 세포로부터의 핵산을 hALB 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 hALB 프로브는 서열번호 22, 서열번호 25, 서열번호 28, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단계;
상기 제1 CAR 프라이머 및 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산 분자를 생성하는 단계;
상기 제1 hALB 프라이머 및 제2 hALB 프라이머를 사용하여 hALB 핵산을 증폭시켜, 증폭된 hALB 핵산 분자를 생성하는 단계;
상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산 분자와 상기 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 hALB 핵산 분자와 상기 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 CAR T 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 이는,
CAR 이식유전자를 T 세포에 도입하여 이식유전자 통합된 T 세포를 수득하는 단계; 하기를 포함하는, CAR 이식유전자 통합을 측정하는 단계:
서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17, 서열번호 20, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머, 및 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머를 사용하여 상기 이식유전자 통합된 T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
제1 기준 유전자 프라이머 및 제2 기준 유전자 프라이머를 사용하여 상기 이식유전자 통합된 T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 기준 유전자 핵산을 생성하는 단계;
CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13, 서열번호 16, 서열번호 19, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산과 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계;
및
적어도 한 카피의 통합된 CAR 이식유전자를 포함하는 CAR T 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 CAR T 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 이는,
CAR 이식유전자를 T 세포에 도입하여 이식유전자 통합된 T 세포를 수득하는 단계; 하기를 포함하는, CAR 이식유전자 통합을 측정하는 단계:
상기 이식유전자 통합된 T 세포로부터의 핵산을 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17, 서열번호 20, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머와 접촉시키고, 상기 이식유전자 통합된 T 세포로부터의 핵산을 서열번호 3, 서열번호6, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머와 접촉시키는 단계; 상기 이식유전자 통합된 세포로부터의 핵산을 서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 29, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머와 접촉시키고, 상기 이식유전자 통합된 T 세포로부터의 핵산을 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머와 접촉시키는 단계;
상기 이식유전자 통합된 T 세포로부터의 핵산을 CAR 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 CAR 프로브는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13, 서열번호 16, 서열번호 19, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단계;
상기 이식유전자 통합된 T 세포로부터의 핵산을 hALB 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 hALB 프로브는 서열번호 22, 서열번호 25, 서열번호 28, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단계;
상기 제1 CAR 프라이머 및 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산 분자를 생성하는 단계;
상기 제1 hALB 프라이머 및 제2 hALB 프라이머를 사용하여 hALB 핵산을 증폭시켜, 증폭된 hALB 핵산 분자를 생성하는 단계;
상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산 분자와 상기 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 hALB 핵산 분자와 상기 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계;
및
적어도 한 카피의 통합된 CAR 이식유전자를 포함하는 CAR T 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 양태들은 또한 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 CAR T 세포를 제공한다.
특정 실시형태에서, 상기 증폭된 CAR 핵산 분자 및 상기 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 증폭된 hALB 핵산 분자와 상기 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 증폭 단계들 중 적어도 하나는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 예를 들어 실시간 PCR, 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR: transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(rt RT-PCR), 리가제 연쇄 반응, 또는 전사 매개 증폭(TMA: transcription-mediated amplification)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 증폭되는 핵산은 앰플리콘(amplicon)이다.
일부 실시형태에서, 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지는 형광단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지는 형광단을 포함한다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 신청 및 필요한 수수료의 지불 시에 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 싱글플렉스(singleplex) 프라이머/프로브 스크리닝 분석의 겔 이미지를 보여준다.
도 2는 멀티플렉스(multiplex) 프라이머/프로브 분석의 겔 이미지를 보여준다.
도 3은 hALB 세트 1과 멀티플렉스화된 이식유전자 (FP) 세트 1 및 (RP) 세트 2의 겔 이미지를 보여준다.
도 4a 내지 도 4d는 이식유전자 (FP) 세트 1 및 (RP) 세트 2 및 hALB 세트 1 표준 곡선에 대한 증폭 곡선을 보여준다.
도 5a 내지 도 5b는 신선한(Fresh) 대 동결된(Frozen) 표준 곡선(이식유전자 표적)을 보여준다.
도 6은 원형(Circular) 대 선형(Linear) 표준 곡선(이식유전자 표적)을 보여준다.
도 7은 특성화(characterization) 대 전형적인(typical) 이식유전자 qPCR 표준 곡선을 보여준다.
도 8은 특성화 이식유전자 표준 선형성 플롯을 보여준다.
도 9는 예시적인 qPCR 플레이트 레이아웃을 보여준다.
도 10은 예시적인 대조군 적격성 평가 qPCR 플레이트 레이아웃을 보여준다.
도 11은 예시적인 이식유전자 선형성 플롯을 보여준다.
도 12는 예시적인 hALB 선형성 플롯을 보여준다.
도 13은 인간 혈청 알부민(hALB) 유전자인 GenBank 수탁 번호 M12523.1의 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 14는 서열번호 11을 개시한다.
전술된 내용은, 유사한 도면 부호가 상이한 도면들 전체에 걸쳐 동일한 부분을 지칭하는 첨부 도면들에 예시된 바와 같이, 예시적인 실시형태들에 대한 하기의 더 특정한 설명으로부터 명백해질 것이다. 도면들은 반드시 축척에 따른 것은 아니며, 대신에 실시형태들을 예시함에 주안점을 둔다.
예시적인 실시형태들에 대한 설명이 후술된다.
본 발명의 몇몇 양태들이 단지 예시적인 목적을 위한 예를 참조하여 하기에 기술된다. 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 많은 구체적인 상세사항, 관계, 및 방법이 제시되어 있음이 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 발명이 상기 구체적인 상세사항 중 하나 이상이 없이도 실시될 수 있거나 다른 방법, 프로토콜, 시약, 세포주, 및 동물을 사용하여 실시될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 본 발명은 행위 또는 사건의 예시된 순서에 의해 제한되지 않는데, 그 이유는, 일부 행위가 상이한 순서로 일어날 수 있고/거나, 다른 행위 또는 사건과 병행적으로 일어날 수 있기 때문이다. 더욱이, 본 발명에 따른 방법을 구현하기 위해, 예시된 모든 행위, 단계, 또는 사건이 요구되는 것은 아니다. 본원에 기술되거나 언급된 많은 기법 및 절차는 당업자에게 잘 이해되며, 종래의 방법을 사용하여 일반적으로 사용된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어, 표기, 및 다른 과학 용어 또는 전문용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에서, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어가 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되어 있으며, 본원에서의 이러한 정의의 포함이 반드시 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 상당한 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의된 것들과 같은 용어들은 관련 기술의 맥락에서 및/또는 본원에 달리 정의된 바와 같은 이들의 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다는 것이 또한 이해될 것이다.
본원에 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태들을 기술하는 목적을 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서, 문맥이 명확하게 달리 나타내지 않는 한, 단수 표현은 복수의 지시 대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서, 용어 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은, 언급된 요소나 정수 또는 요소들이나 정수들의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 요소나 정수 또는 요소들이나 정수들의 그룹은 배제함을 암시하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하기 위한 키트 및 방법에 관한 것이다. 또한, CAR T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하기 위한 중합효소 연쇄 반응(PCR), 예를 들어 정량적 PCR을 수행하기 위한 프로브 및 프라이머의 패널이 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 기술된 이식유전자 qPCR 방법 및 키트는 CAR T 의약품에 통합된 BCMA CAR 이식유전자 플라스미드의 정량화를 위해 설계된 멀티플렉스화된 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석을 포함한다. (1) BCMA CAR 이식유전자 플라스미드(이식유전자) 및 (2) 인간 알부민(hALB) 기준 유전자 둘 모두가 이 qPCR 방법에서 증폭된다. 이식유전자 표적에 대한 프라이머 및 프로브 세트는 플라스미드의 CD137과 CD3z 영역 간의 접합부를 증폭시켜, CAR T 의약품 내로 통합되어 존재하는 BCMA CAR 이식유전자 플라스미드만이 검출되도록 할 수 있다.
키메라 항원 수용체
키메라 항원 수용체(CAR)는 T 세포 신호전달 도메인에 연결된 항체의 항원 결합 도메인(scFv)을 함유하는 인공적으로 작제된 하이브리드 단백질 또는 폴리펩티드이다. 본원에서, 용어 "T 세포", "T-세포" 및 "T 림프구"는 상호교환적으로 사용된다. CAR의 특성은, 단일클론 항체의 항원-결합 특성을 사용하여, 비-MHC-제한된 방식(non-MHC-restricted manner)으로 T-세포 특이성과 반응성을 선택된 표적으로 재지시하는 능력을 포함할 수 있다. 비-MHC-제한된 항원 인식은, 항원 처리와 무관하게 항원을 인식하여 종양 회피의 주요 기전을 우회하는 능력을 CAR을 발현하는 T 세포에게 제공한다. 더욱이, T-세포에서 발현되는 경우, CAR은 유리하게도 내인성 T 세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 사슬과 이량체화되지 않는다.
본원에 기술된 CAR은, 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하기에 정의된 바와 같은 자극 분자로부터 유도된 기능성 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인(본원에서 "세포질 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 포함하는 재조합 폴리펩티드 작제물을 제공한다. CAR을 발현하는 T 세포는 본원에서 CAR T 세포, CAR T 세포 또는 CAR 변형된 T 세포로 지칭되며, 이들 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 세포는 이의 표면 상에 항체 결합 도메인을 안정하게 발현하도록 유전자 변형되어, MHC 독립적인 신규한 항원 특이성을 부여할 수 있다.
일부 경우에서, T 세포는, 특정 항체의 항원 인식 도메인을 CD3-제타 사슬 또는 FcγRI 단백질의 세포내 도메인과 조합하여 단일 키메라 단백질을 형성하는 CAR을 안정하게 발현하도록 유전자 변형된다. 일 실시형태에서, 상기 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 결합된 제타 사슬이다.
"세포내 신호전달 도메인"은, 이 용어가 본원에 사용되는 경우, 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 이것은, 제2 메신저를 발생시킴으로써 또는 이러한 메신저에 반응하여 이펙터로서 기능함으로써 정의된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하도록 세포 내의 정보를 전달함으로써 작용하는 단백질의 기능성 부분이다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR 함유 세포, 예를 들어 CAR T 세포의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 예를 들어 CAR T 세포에서의, 면역 이펙터 기능의 예는 사이토카인의 분비를 포함한 헬퍼 활성 및 세포용해 활성을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 1차 세포내 신호전달 도메인은 1차 자극 또는 항원 의존성 자극을 담당하는 분자로부터 유도된 것들을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호 또는 항원 비의존성 자극을 담당하는 분자로부터 유도된 것들을 포함한다. 예를 들어, CAR T의 경우에, 1차 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체의 세포질 서열을 포함할 수 있고, 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동수용체 또는 공동자극 분자로부터의 세포질 서열을 포함할 수 있다.
1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3-제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d DAP10 및 DAP12로부터 유도된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 상기 신호전달 서열은 CD3-제타이다.
용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타 사슬", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 GenBank 수탁 번호 BAG36664.1로 제공되는 단백질, 또는 비인간 종, 예를 들어 뮤린, 토끼, 영장류, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로 정의되고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한 제타 사슬의 세포질 도메인으로부터의 아미노산 잔기로 정의된다. 일 양태에서, 제타의 세포질 도메인은 GenBank 수탁 번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164, 또는 이의 기능적 오르소로그(ortholog)인 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 포함한다.
용어 "공동자극 분자"는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합함으로써, 비제한적인 예로서, 증식과 같은 T 세포에 의한 공동자극 반응을 매개하는 T 세포 상의 동종 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극 분자는 효율적인 면역 반응을 위해 요구되는, 항원 수용체 또는 이의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공동자극 분자는 MHC 클래스 1 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체뿐만 아니라 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18) 및 4-1BB(본원에서 "CD137"로도 지칭됨)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 상기 공동자극 분자는 4-1BB(CD137)이다.
공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공동자극 분자는 하기 단백질 패밀리로 나타낼 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질), 및 NK 세포 활성화 수용체. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1: lymphocyte function-associated antigen-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.
상기 세포내 신호전달 도메인은 이것이 유도되는 분자의, 전체(즉, "전장") 세포내 부분, 또는 전체 천연 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능성 단편을 포함할 수 있다.
용어 "4-1BB"는 GenBank 수탁 번호 AAA62478.2로 제공된 아미노산 서열을 갖는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR: tumor necrosis factor receptor) 슈퍼패밀리의 구성원, 또는 비인간 종, 예를 들어 포유동물(마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등)로부터의 등가 잔기를 지칭하고; "4-1BB 공동자극 도메인"은 GenBank 수탁 번호 AAA62478.2의 아미노산 잔기 214 내지 255, 또는 비인간 종, 예를 들어 포유동물(마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등)로부터의 등가 잔기로 정의된다.
일부 실시형태에서, 상기 세포질 신호전달 도메인은 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공동자극 분자로부터 유도된 하나 이상의 기능성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 공동자극 분자는 4-1BB(즉, CD137), CD27, CD3-제타 및/또는 CD28로부터 선택된다. CD28은 T 세포 공동자극에서 중요한 T 세포 마커이다. CD27은 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리의 구성원이며, 공동자극 면역 관문 분자로서 작용한다. 4-1BB는 강력한 공동자극 신호를 T 세포에 전달하여, T 림프구의 분화를 촉진하고 장기간 생존을 향상시킨다. CD3-제타는 TCR과 결합하여 신호를 생성하고, 면역수용체 티로신계 활성화 모티프(ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activation motif)를 함유한다.
일 실시형태에서, 상기 CAR은 CD8을 포함하는 세포내 힌지 도메인 및 CD28, 4-1BB, CD3-제타 및 이들의 조합을 포함하는 세포내 T 세포 수용체 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 CAR은 CD8a 막관통, CD137, 및 CD3z 암호화 영역을 포함한다.
본 개시내용은 CAR T 생성물 내로 통합된 변이체 플라스미드, 예를 들어 본원에 기술된 CAR, 핵산, 폴리펩티드 및 단백질의 기능적 변이체를 정량화하는 데 유용한 프라이머, 프로브 및 관련 키트를 추가로 제공한다. 본원에서, 용어 "변이체"는 하나 이상의 변형, 예를 들어 치환, 삽입, 또는 결실만큼 기준 폴리펩티드 또는 기준 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에서, 용어 "기능성 변이체"는 모체 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질과 실질적이거나 유의한 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질을 지칭하며, 이러한 기능성 변이체는 이러한 변이체의 유래가 되는 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질의 생물학적 활성을 보유한다. 기능성 변이체는, 예를 들어, 모체 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질과 유사한 정도로, 동일한 정도로, 또는 더 높은 정도로 표적 세포를 인식하는 능력을 보유하는, 본원에 기술된 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질(모체 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질)의 변이체를 포함한다. 모체 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질과 관련하여, 상기 기능성 변이체는, 예를 들어, 아미노산 서열에 있어서 상기 모체 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질과 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 초과로 동일할 수 있다.
기능성 변이체는, 예를 들어, 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모체 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 기능성 변이체는 적어도 하나의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 모체 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 경우에서, 상기 비보존적 아미노산 치환은 상기 기능성 변이체의 생물학적 활성을 방해하거나 억제하지 않을 수 있다. 상기 비보존적 아미노산 치환은, 상기 기능성 변이체의 생물학적 활성이 상기 모체 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질에 비하여 증가되도록 상기 기능성 변이체의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다.
상기 CAR의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 당업계에 알려져 있으며, 특정 물리적 및/또는 화학적 특성을 갖는 하나의 아미노산이 동일하거나 유사한 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 교환되는 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 상기 보존적 아미노산 치환은 또 다른 산성 아미노산으로 치환된 산성 아미노산(예를 들어, Asp 또는 Glu), 비극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환된 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val 등), 또 다른 염기성 아미노산으로 치환된 염기성 아미노산(Lys, Arg 등), 극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환된 극성 측쇄를 갖는 아미노산(Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr 등) 등일 수 있다.
상기 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질은 본원에 기술된, 명시된 아미노산 서열 또는 서열들로 본질적으로 구성될 수 있어서, 다른 성분, 예를 들어 다른 아미노산은 상기 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질의 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않는다.
본원에 기술된 방법/키트에 사용되는 폴리펩티드를 생성하는 데 사용되는 재조합 핵산을 생성하는 데 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록시메틸) 우라실, 카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, N6-치환된 아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 위부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 핵산은 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질, 또는 이의 기능성 부분 또는 기능성 변이체 중 임의의 것을 암호화하는 임의의 단리된 또는 정제된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 뉴클레오티드 서열은 상기 서열들 중 임의의 것에 대하여 축퇴된 뉴클레오티드 서열 또는 축퇴 서열들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태는 또한 본원에 기술된 핵산들 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 엄격한 조건 하에서 본원에 기술된 핵산들 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 또는 정제된 핵산을 사용한다.
엄격한 조건 하에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열은 높은 엄격성 조건(high stringency condition) 하에서 혼성화할 수 있다.
본원에서, "높은 엄격성 조건"은, 상기 뉴클레오티드 서열이 비특이적 혼성화보다 검출 가능하게 더 강한 양으로 표적 서열(본원에 기술된 핵산들 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열)과 특이적으로 혼성화함을 의미한다. 높은 엄격성 조건은 정확한 상보성 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 구별할 조건, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 매칭되는 몇몇의 작은 영역(예를 들어, 3 내지 12개의 염기)을 우연히 갖는 랜덤 서열로부터의 단지 몇몇의 산재하는 미스매칭만을 함유하는 조건을 포함한다. 이러한 작은 상보성 영역은 14 내지 17개 또는 그 초과의 염기의 전장 보체(full-length complement)보다 더 용이하게 융해되고, 높은 엄격성 혼성화는 이들을 용이하게 구별 가능하게 한다. 비교적 높은 엄격성 조건은, 예를 들어, 약 50 내지 70℃의 온도에서 약 0.02 내지 0.1 M NaCl 또는 등가물에 의해 제공되는 것과 같은 저염 및/또는 고온 조건을 포함할 것이다. 이러한 높은 엄격성 조건은 상기 뉴클레오티드 서열과 주형 또는 표적 가닥 간에 미스매칭이 만약 있다 하더라도 거의 허용하지 않으며, 본원에 기술된 CAR 핵산과 혼성화하기에 특히 적합하다. 일반적으로, 포름아미드 첨가량의 증가에 의해 조건이 더 엄격하게 될 수 있음이 이해된다.
본원에서, 용어 "재조합 발현 벡터"는 유전자 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 작제물을 의미하며, 상기 작제물이 mRNA, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 벡터가 숙주 세포 내에서 발현되는 mRNA, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 갖기에 충분한 조건 하에서 숙주 세포와 접촉되는 경우, 상기 작제물은 상기 세포에 의한 mRNA, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 발현을 가능하게 한다. 본원에 기술된 벡터는, 전체로서는 자연적으로 발생하지 않지만, 상기 벡터의 일부는 자연적으로 발생할 수 있다. 기술된 재조합 발현 벡터는 DNA 및 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 이는 단일 가닥 또는 이중 가닥이거나, 합성되거나, 천연 공급원으로부터 부분적으로 획득될 수 있으며, 천연, 비천연, 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 상기 재조합 발현 벡터는 자연 발생적 또는 비자연 발생적 뉴클레오티드간 결합, 또는 두 결합 유형 모두를 포함할 수 있다. 비자연 발생적 또는 변경된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드간 결합은 상기 벡터의 전사 또는 복제를 방해하지 않는다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 임의의 적합한 숙주를 형질전환시키거나 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 증식 및 증폭을 위해 또는 발현을 위해 또는 둘 모두를 위해 설계된 것들, 예를 들어, 플라스미드 및 바이러스를 포함한다. 상기 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences, 미국 메릴랜드주 글렌 버니 소재), pBluescript 시리즈(Stratagene, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재), pET 시리즈(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라 소재), 및 pEX 시리즈(Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 박테리오파지 벡터, 예를 들어, λGT10, λGT11, λEMBL4, 및 λNM1149, λZapII(Stratagene)가 사용될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예는 pBI01, pBI01.2, pBI121, pBI101.3, 및 pBIN19(Clontech)를 포함한다. 동물 발현 벡터의 예는 pEUK-Cl, pMAM, 및 pMAMneo(Clontech)를 포함한다. 상기 재조합 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 감마 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 발현 벡터는 예를 들어 문헌[Ausubel FM, Brent R, Kingston RE et al. (eds) (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edn. New York: Wiley Green MR and Sambrook J. (2012) Molecular cloning: a laboratory manual, 4th edn. Cold Spring Harbor, New York]에 기술된 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조된다. 원형 또는 선형인 발현 벡터의 작제물은 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 기능적인 복제 시스템을 함유하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은, 예를 들어 ColEl, SV40, 2μ 플라스미드, λ, 소 유두종 바이러스 등으로부터 유도될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는 발현 벡터는 표준 및 대조군을 제조하기 위한 플라스미드의 작업 스톡의 제조를 위해 선형화된다.
상기 재조합 발현 벡터는, 적절한 경우에, 그리고 상기 벡터가 DNA-기반 또는 RNA-기반의 여부를 고려하여, 상기 벡터가 도입될 숙주(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물)의 유형에 특이적인 조절 서열, 예를 들어, 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함할 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터는 형질전환된 또는 형질감염된 숙주의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 살생제 저항성, 예를 들어 항생제, 중금속 등에 대한 저항성, 자가영양성을 제공하기 위한 영양요구성 숙주에서의 상보성 등을 포함한다. 기술된 발현 벡터에 적합한 마커 유전자는, 예를 들어 네오마이신/G418 저항성 유전자, 히스티디놀 x 저항성 유전자, 히스티디놀 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자, 및 암피실린 저항성 유전자를 포함한다.
상기 재조합 발현 벡터는 상기 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질(이의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에, 또는 상기 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상보적이거나 이것과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 천연 또는 표준적(normative) 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터의 선택, 예를 들어 강한, 약한, 조직-특이적, 유도성, 및 발생-특이적 프로모터의 선택은 당업자의 기술 내에 속한다. 유사하게, 뉴클레오티드 서열을 프로모터와 조합하는 것 또한 당업자의 기술 내에 속한다. 상기 프로모터는 비바이러스성 프로모터 또는 바이러스성 프로모터, 예를 들어 거대세포바이러스(CMV: cytomegalovirus) 프로모터, RSV 프로모터, SV40 프로모터, 또는 뮤린 줄기 세포 바이러스의 긴 말단 반복부에서 발견되는 프로모터일 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터는 일시적 발현을 위해, 안정한 발현을 위해, 또는 둘 모두를 위해 설계될 수 있다. 또한, 상기 재조합 발현 벡터는 구성적 발현을 위해 또는 유도성 발현을 위해 제조될 수 있다.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 자살 유전자를 포함하도록 제조될 수 있다. 본원에서, 용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현하는 세포가 죽게 하는 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는, 상기 유전자가 발현되는 세포 상의 작용제, 예를 들어 약물에 대한 감수성을 부여하고, 상기 세포가 상기 작용제와 접촉되거나 이에 노출되는 경우 상기 세포가 죽게 하는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 단순 헤르페스 바이러스(HSV: Herpes Simplex Virus) 티미딘 키나제(TK: thymidine kinase) 유전자, 시토신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 및 니트로리덕타제를 포함한다.
상기 CAR, 폴리펩티드, 또는 단백질(이의 기능성 부분 또는 변이체 중 임의의 것 포함) 중 임의의 것을 포함하는 접합체(conjugate), 예를 들어 바이오접합체, 숙주 세포, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포 집단, 또는 항체, 또는 이의 항원 결합 부분이 본 발명의 범주 내에 포함된다. 접합체뿐만 아니라, 일반적으로 접합체를 합성하는 방법이 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005)] 및 문헌[Kirin et al., Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005)] 참조).
특정 실시형태에서, 본 발명의 실시형태들에서 사용되는 재조합 발현 벡터는 B 세포 성숙 항원(BCMA) 키메라 항원 수용체의 다양한 성분을 포함하는 벡터이다. 상기 플라스미드는, 그 전체 내용이 원용되어 본원에 포함된 PCT 국제특허출원공개 WO2017/025038 A1호의 서열번호 175 내지 197, 202 내지 205, 218 내지 227, 239, 261 내지 264, 및 271 내지 276에 의해 개시된 바와 같은, BCMA 키메라 항원 수용체의 다양한 성분을 암호화하는 8,518 염기쌍(bp) 플라스미드 함유 서열이다. 일 양태에서, 플라스미드는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 암호화하며, 여기서 상기 세포외 항원 결합 도메인은 BCMA 항원에 결합한다. 본원에서, 용어 "B 세포", "B-세포", 및 "B 림프구"는 상호교환적으로 사용된다. 일 실시형태에서, 상기 플라스미드는 국제특허출원공개 WO2017/025038 A1호의 서열번호 175 내지 197, 202 내지 205, 218 내지 227, 239, 261 내지 264, 및 271 내지 276 중 임의의 것의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 플라스미드는, 국제특허출원공개 WO2017/025038 A1호의 서열번호 175 내지 197, 202 내지 205, 218 내지 227, 239, 261 내지 264, 및 271 내지 276 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "암호화"는 뉴클레오티드의 정의된 서열(예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 아미노산의 정의된 서열을 갖는, 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서의 역할을 하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 유전자, cDNA, 또는 mRNA 내의 뉴클레오티드들의 특이적 서열의 고유 특성 및 그로부터 발생되는 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA, 또는 RNA는, 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우, 단백질을 암호화한다. 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는, mRNA 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 암호화 가닥, 및 비암호화 가닥 둘 모두는 해당 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하는 것으로 지칭될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로의 축퇴 버전이면서 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 또한, 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도까지, 인트론을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 국제특허출원공개 WO2017/025038 A1호의 서열번호 175 내지 197, 202 내지 205, 218 내지 227, 239, 261 내지 264, 및 271 내지 276 중 임의의 것의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
용어 "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소(cis-acting element)를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소들은 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 외피 비보유(naked) 또는 리포좀 내에 수용된 것), 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한, 당업계에 알려진 모든 것들을 포함한다.
CAR T 세포를 생성하고 CAR T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법
일 양태에서, 본 발명은 CAR T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법을 제공하며, 이는,
CAR T 세포로부터의 핵산을 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17, 서열번호 20, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머와 접촉시키고, CAR T 세포로부터의 핵산을 서열번호 3, 서열번호6, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머와 접촉시키는 단계;
CAR T 세포로부터의 핵산을 서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 29, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머와 접촉시키고, CAR T 세포로부터의 핵산을 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머와 접촉시키는 단계;
CAR T 세포로부터의 핵산을 CAR 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 CAR 프로브는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13, 서열번호 16, 서열번호 19, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단계;
CAR T 세포로부터의 핵산을 hALB 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 hALB 프로브는 서열번호 22, 서열번호 25, 서열번호 28, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단계;
상기 제1 CAR 프라이머 및 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR 앰플리콘을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산 분자를 생성하는 단계;
상기 제1 hALB 프라이머 및 제2 hALB 프라이머를 사용하여 hALB 앰플리콘을 증폭시켜, 증폭된 hALB 핵산 분자를 생성하는 단계;
상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산 분자와 상기 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 hALB 핵산 분자와 상기 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 CAR 프라이머들에 대한 접촉 단계는 상기 hALB 프라이머들과는 별개의 반응에서 수행된다. 다른 실시형태에서, 상기 접촉 단계는 동일한 반응에서 수행된다(즉, 멀티플렉스화됨).
일부 실시형태에서, 상기 CAR 프로브들에 대한 접촉 단계는 상기 hALB 프로브들과는 별개의 반응에서 수행된다. 다른 실시형태에서, 상기 접촉 단계는 동일한 반응에서 수행된다(즉, 멀티플렉스화됨).
일부 실시형태에서, 상기 CAR 앰플리콘들에 대한 증폭 단계는 상기 hALB 앰플리콘들과는 별개의 반응에서 수행된다. 다른 실시형태에서, 상기 증폭 단계는 동일한 반응에서 수행된다(즉, 멀티플렉스화됨).
일부 실시형태에서, CAR 핵산 및 CAR 프로브의 혼성화에 대한 검출 단계는 상기 hALB 핵산 및 hALB 프로브와는 별개의 반응에서 수행된다. 다른 실시형태에서, 상기 검출 단계는 동일한 반응에서 수행된다(즉, 멀티플렉스화됨).
일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 20개 내지 약 40개 뉴클레오티드 길이의 제1 CAR 프라이머를 사용하여 CAR 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 높은 엄격성의 조건 하에, 국제특허출원공개 WO2017/025038 A1호의 서열번호 175 내지 197, 202 내지 205, 218 내지 227, 239, 261 내지 264, 및 271 내지 276 중 임의의 것으로 제시된 CAR 핵산 서열과 혼성화할 수 있다.
엄격한 조건 하에서 혼성화하는 프라이머, 즉, 뉴클레오티드 서열은 높은 엄격성 조건 하에서 혼성화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17, 및 서열번호 20으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17, 및 서열번호 20으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17, 및 서열번호 20으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 2로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 2로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 2로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 5로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 5로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 5로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 8로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 8로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 8로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 11로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 11로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 11로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 14로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 14로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 14로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 17로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 17로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 17로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 20으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 20으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 20으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 20개 내지 약 40개 뉴클레오티드 길이의 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 높은 엄격성의 조건 하에, PCT 국제특허출원공개 WO2017/025038 A1호의 서열번호 175 내지 197, 202 내지 205, 218 내지 227, 239, 261 내지 264, 및 271 내지 276 중 임의의 것으로 제시된 CAR 핵산 서열과 혼성화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 3, 서열번호6, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 3, 서열번호6, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 3, 서열번호6, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 3으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 3으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 3으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 6으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 6으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 6으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 9로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 9로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 9로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 12로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 12로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 12로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 15로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 15로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 15로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 18로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 18로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 18로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 21로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 21로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 21로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 CAR 핵산 분자를 약 20개 내지 약 40개 뉴클레오티드 길이의 CAR 특이적 프로브와 혼성화시키고, 상기 CAR 핵산과 상기 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 프로브는 검출 가능하게 표지된다. 일부 실시형태에서, 상기 CAR 특이적 프로브는 높은 엄격성의 조건 하에, PCT 국제특허출원공개 WO2017/025038 A1호의 서열번호 175 내지 197, 202 내지 205, 218 내지 227, 239, 261 내지 264, 및 271 내지 276 중 임의의 것으로 제시된 CAR 핵산 서열과 혼성화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 혼성화 검출 단계는, 비제한적인 예로서, 겔 전기영동, 서던 블롯 등과 같은 당업계에 알려진 전통적인 분자 생물학 기법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 CAR 특이적 프로브는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13, 서열번호 16, 및 서열번호 19로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13, 서열번호 16, 및 서열번호 19로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13, 서열번호 16, 및 서열번호 19로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 CAR 특이적 프로브는 서열번호 1로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 1로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 1로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 CAR 특이적 프로브는 서열번호 4로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 4로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 4로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 CAR 특이적 프로브는 서열번호 7로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 7로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 7로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 CAR 특이적 프로브는 서열번호 10으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 10으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 10으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 CAR 특이적 프로브는 서열번호 13으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 13으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 13으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 CAR 특이적 프로브는 서열번호 16으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 16으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 16으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 CAR 특이적 프로브는 서열번호 19로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 19로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 19로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 20개 내지 약 40개 뉴클레오티드 길이의 제1 hALB 프라이머를 사용하여 hALB 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 hALB 프라이머는 높은 엄격성의 조건 하에, 서열번호 31(도 13)로 제시된 hALB 핵산 서열과 혼성화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 23, 서열번호 26, 및 서열번호 29로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 23, 서열번호 26, 및 서열번호 29로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 23, 서열번호 26, 및 서열번호 29로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 23으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 23으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 23으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 26으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 26으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 26으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 29로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 29로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 29로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 20개 내지 약 40개 뉴클레오티드 길이의 제2 hALB 프라이머를 사용하여 hALB 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 hALB 프라이머는 높은 엄격성의 조건 하에, 서열번호 31로 제시된 hALB 핵산 서열과 혼성화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 24, 서열번호 27, 및 서열번호 30으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 24, 서열번호 27, 및 서열번호 30으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 24, 서열번호 27, 및 서열번호 30으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 24로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 24로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 24로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 27로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 27로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 27로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 30으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 30으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 30으로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 hALB 핵산 분자를 약 20개 내지 약 40개 뉴클레오티드 길이의 hALB 특이적 프로브와 혼성화시키고, 상기 hALB 핵산과 상기 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 프로브는 검출 가능하게 표지된다. 일부 실시형태에서, 상기 hALB 특이적 프로브는 높은 엄격성의 조건 하에, 서열번호 31로 제시된 hALB 핵산 서열과 혼성화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 혼성화 검출 단계는, 비제한적인 예로서, 겔 전기영동, 서던 블롯 등과 같은 당업계에 알려진 전통적인 분자 생물학 기법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 22, 서열번호 25, 및 서열번호 28로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 22, 서열번호 25, 및 서열번호 28로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 22, 서열번호 25, 및 서열번호 28로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 22로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 22로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 22로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 25로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 25로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 25로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 28로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 28로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 프로브는 서열번호 28로 제시된 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명은 CAR T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법을 제공하며, 이는,
CAR T 세포로부터의 핵산을 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머와 접촉시키고 CAR T 세포로부터의 핵산을 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머와 접촉시키는 단계;
CAR T 세포로부터의 핵산을 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머와 접촉시키고 CAR T 세포로부터의 핵산을 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머와 접촉시키는 단계;
CAR T 세포로부터의 핵산을 CAR 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 CAR 프로브는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단계;
CAR T 세포로부터의 핵산을 hALB 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 hALB 프로브는 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단계;
상기 제1 CAR 프라이머 및 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산 분자를 생성하는 단계;
상기 제1 hALB 프라이머 및 제2 hALB 프라이머를 사용하여 hALB 핵산을 증폭시켜, 증폭된 hALB 핵산 분자를 생성하는 단계;
상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산 분자와 상기 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
상기 hALB CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 hALB 핵산과 상기 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및 상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 증폭된 CAR 핵산 분자와 상기 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 증폭된 hALB 핵산 분자와 상기 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법을 제공하며, 이는,
서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
제1 기준 유전자 프라이머 및 제2 기준 유전자 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 기준 유전자 핵산을 생성하는 단계;
CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산과 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR T 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 이는,
CAR 이식유전자를 T 세포에 도입하여 이식유전자 통합된 T 세포를 수득하는 단계;
하기를 포함하는 CAR 이식유전자 통합을 측정하는 단계:
서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머를 사용하여 상기 이식유전자 통합된 T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
제1 기준 유전자 프라이머 및 제2 기준 유전자 프라이머를 사용하여 상기 이식유전자 통합된 T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 기준 유전자 핵산을 생성하는 단계;
CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산과 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계;
및
적어도 한 카피의 통합된 CAR 이식유전자를 포함하는 CAR T 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 양태들은 또한 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 CAR T 세포를 제공한다.
"기준 유전자"는 표적 유전자와 상이한 서열을 갖는 내부 반응 대조군을 의미한다. 일정 유전자가 기준으로 간주되기 위해서는, 몇 가지 중요한 기준을 충족해야 한다(문헌[Chervoneva I, Li Y, Schulz S, Croker S, Wilson C, Waldman SA, Hyslop T. Selection of optimal reference genes for normalization in quantitative RT-PCR. BMC Bioinforma. 2010; 11:253. doi: 10.1186/1471-2105-11-253.]). 가장 중요한 것은 발현 수준이 실험적 요인의 영향을 받지 않아야 한다는 것이다. 또한, 이것은 조직과 유기체의 생리학적 상태 간에서 이의 발현에 있어 최소의 가변성을 나타내야 한다. 관심 유전자와 유사한 임계값 주기를 나타내는 기준 유전자를 선택하는 것이 바람직하다. 상기 기준 유전자는 사용된 기술 및 준비 절차의 결함으로 인한 변동성을 보여줘야 한다(이는, 유전 물질의 양의 임의의 변동이 연구의 대상 및 대조군과 동일한 정도로 관련되도록 보장한다). 전술된 기준을 충족하는 "기준 유전자"의 예는 하우스키핑(housekeeping) 유전자로 지칭되는 기본 대사 유전자이며, 이는 정의 상, 세포의 생존에 필수적인 과정에 관여한다. 기준 유전자로 유용한 하우스키핑 유전자는 또한 안정적이고 조절되지 않은 일정한 수준으로 발현되어야 한다(문헌[Thellin O, Zorzi W, Lakaye B, De Borman B, Coumans B, Hennen G, Grisar T, Igout A, Heinen E. Housekeeping genes as internal standards: Use and limits. J Biotechnol. 1999; 75:291-295. doi: 10.1016/S0168-1656(99)00163-7]). 본 발명의 방법, 키트 및 프라이머/프로브에서 "기준 유전자"로 유용한 하우스키핑 유전자는 LDHA, NONO, PGK1, PPIH, C1orf43, CHMP2A, EMC7, GPI, PSMB2, PSMB4, RAB7A, REEP5, SNRPD3, VCP, 및 VPS29를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법을 제공하며, 이는,
CAR T 세포로부터의 핵산을 제1 CAR 프라이머, 제2 CAR 프라이머, 제1 기준 유전자 프라이머, 및 제2 기준 유전자 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는, 단계;
상기 제1 CAR 프라이머 및 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
상기 제1 기준 유전자 프라이머 및 상기 제2 기준 유전자 프라이머를 사용하여 기준 유전자 핵산을 증폭시켜, 증폭된 기준 유전자 핵산을 생성하는 단계;
CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산과 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 증폭된 CAR 핵산과 상기 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 CAR 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산 분자와 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지는 형광단을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 혼성화 검출 단계는, 비제한적인 예로서, 겔 전기영동, 서던 블롯 등과 같은 당업계에 알려진 전통적인 분자 생물학 기법을 사용하여 수행될 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 증폭 단계들 중 적어도 하나는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 예를 들어 실시간 PCR, 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 실시간 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(rt RT-PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 또는 전사 매개 증폭(TMA)을 포함한다.
PCR은 당업자에게 공지되어 있다. 이것은 많은 카피의 특정 DNA 분절을 제조하기 위해 분자 생물학에서 널리 사용되는 방법이다. PCR을 사용하면, 단일 카피(또는 그 초과)의 DNA 서열이 기하급수적으로 증폭되어 수천 내지 수백만 카피의 해당 특정 DNA 분절을 생성한다. 대부분의 PCR 방법은 열 순환에 의존한다. 열 순환은 반응물을 가열 및 냉각의 반복 주기에 노출시켜 다양한 온도-의존적 반응(DNA 융해 및 효소 구동 DNA 복제)을 허용한다. PCR은 2개의 주요 시약, 즉, 프라이머(표적 DNA 영역에 상보적인 서열인 올리고뉴클레오티드로 알려진 짧은 단일 가닥 뉴클레오티드 단편)와 DNA 중합효소를 사용한다. PCR의 제1 단계에서는, DNA 이중 나선의 두 가닥이 DNA 융해에 의해 고온에서 물리적으로 분리된다. 제2 단계에서는, 온도가 감소되고 프라이머가 DNA의 상보적인 서열에 결합한다. 이어서, 2개의 DNA 가닥은 DNA 중합효소의 주형이 되어, 반응 혼합물에서 사용 가능한 유리 뉴클레오티드로부터 새로운 DNA 가닥을 효소적으로 조립한다. PCR이 진행됨에 따라, 원래의 DNA 주형이 기하급수적으로 증폭되도록, 생성된 DNA 자체가 복제용 주형으로 사용된다. 일반적으로, PCR 응용 분야는, 호열성 박테리아 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus Aquaticus)로부터 애초에 단리된 효소인 Taq 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 사용한다.
당업자에게 알려진 바와 같은 정량적 PCR 또는 실시간 PCR(qPCR)은 샘플에 존재하는 특정 서열의 양을 추정할 수 있게 한다(유전자 발현 수준을 정량적으로 측정하기 위해 종종 적용되는 기법임). 정량적 PCR은 PCR 증폭의 각 라운드 후의 DNA 생성물의 축적을 측정하는 DNA 정량화를 위한 확립된 도구이다. qPCR은 합성 과정이 발생하는 동안 농도를 측정하므로, 특정 DNA 서열을 실시간으로 정량화하고 검출할 수 있다.
당업자에게 알려진 바와 같은 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)은 DNA(상보적 DNA 또는 cDNA)로의 RNA의 역전사 및 PCR을 사용한 특정 DNA 표적의 증폭을 조합한 실험 기법이다. 이것은 일반적으로, 특정 RNA의 양을 측정하는 데 사용된다. 이것은 실시간 PCR 또는 정량적 PCR(qPCR)로 지칭되는 기법에 의해 형광을 사용하여 증폭 반응을 모니터링함으로써 달성된다. RT-PCR 및 qPCR의 조합은 유전자 발현 분석 및 RNA 정량화에 일상적으로 사용된다.
당업자에게 알려진 바와 같이, 리가제 연쇄 반응(LCR)은 DNA 증폭 방법이다. 리가제 연쇄 반응(LCR)은, 표준 PCR 순환에 의해 증폭될 수 있는 2개의 프로브 또는 다른 분자를 함께 연결하는 열안정성 리가제를 포함한다는 점에서 PCR과 상이한 증폭 과정이다.
당업자에게 알려진 바와 같은 전사 매개 증폭(TMA)은 2개의 효소, 즉 RNA 중합효소 및 역전사효소를 사용하는 등온, 단일-튜브 핵산 증폭 시스템이다. PCR 및 LCR과 달리, TMA 방법은 표적 핵산으로부터 RNA 앰플리콘(증폭의 공급원 또는 생성물)을 생성하기 위한 RNA 전사(RNA 중합효소를 통함) 및 DNA 합성(역전사효소를 통함)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 방법은, 비제한적인 예로서, 디지털 PCR(dPCR)과 같은 당업계에 알려진 다른 정량적 PCR 방법을 사용한다.
일부 실시형태에서, 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지는 형광단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지는 형광단을 포함한다. 본원에서, 용어 "형광단"은 프로브가 혼성화하는 뉴클레오티드 서열의 정량화 및 검출에 사용될 수 있는 임의의 형광 화합물 또는 단백질을 지칭한다.
본 개시내용은 또한 CAR 핵산, 예를 들어 CAR 작제물의 CD137/CD3z 접합부에 걸쳐 있는 핵산 서열과 혼성화하고 이를 증폭할 수 있는 프라이머에 관한 것이다. 기술된 프라이머가 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 프라이머는 길이가 약 20개 내지 약 40개 뉴클레오티드이고, 매우 높은 엄격성 조건 하에, 국제특허출원공개 WO2017/025038 A1호의 서열번호 175 내지 197, 202 내지 205, 218 내지 227, 239, 261 내지 264, 및 271 내지 276 중 임의의 것으로 제시된 CAR 핵산 서열과 혼성화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 이들 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17, 또는 서열번호 20으로 제시된 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 프라이머는 서열번호 3, 서열번호6, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18 또는 서열번호 21로 제시된 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 추가로 포함한다.
본 개시내용은 또한 다양한 CAR 핵산 서열, 예를 들어 CAR 작제물의 CD137/CD3z 접합부에 걸쳐 있는 다양한 핵산 서열과 혼성화할 수 있고 이를 구별할 수 있는 프로브에 관한 것이다. 기술된 프로브가 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 프로브는 길이가 약 20개 내지 약 40개 뉴클레오티드이고, 매우 높은 엄격성 조건 하에, 국제특허출원공개 WO2017/025038 A1호의 서열번호 175 내지 197, 202 내지 205, 218 내지 227, 239, 261 내지 264, 및 271 내지 276 중 임의의 것으로 제시된 CAR 핵산 서열과 혼성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 프로브는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13, 서열번호 16, 또는 서열번호 19로 제시된 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 프로브 및 프라이머 세트를 제공하며, 이는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 CAR 프로브; 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머; 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 프로브 및 프라이머 세트는, 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 hALB 프로브; 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머; 및 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 표지는 방사성 동위원소, 효소 기질, 화학발광제, 형광단, 형광 소광제, 효소, 화학물질, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표지는 광화학적, 화학적, 및 전기화학적 수단을 통해 발광하도록 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 CAR T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하기 위한 키트를 제공한다. 본원에서, 용어 "키트"는 시약 및 기타 물질의 조합을 지칭한다. 상기 키트는 완충제, 단백질 안정화 시약, 신호 생성 시스템(예를 들어, 형광 신호 생성 시스템), 항체, 대조군 단백질뿐만 아니라 시험 용기(예를 들어, 미세역가 플레이트 등)와 같은 시약을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 용어 "키트"는 시약 및/또는 기타 물질의 특정 조합으로 제한되지 않도록 의도된다. 일 실시형태에서, 상기 키트는 상기 시약을 사용하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 상기 키트는, 일반적으로, 시험을 수행하기 위한 지침 시트와 함께 필요에 따라 단일 용기 또는 다양한 용기 내에 요소와 함께, 임의의 적절한 방식으로 포장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 또한 양성 대조군 샘플을 포함한다. 키트는 당업계에 알려진 다양한 방식으로 제조될 수 있다.
일 양태에서, CAR T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하기 위한 키트는, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 프로브; 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 키트는, 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 hALB 프로브; 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머; 및 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머를 추가로 포함한다.
본 발명의 키트의 일부 실시형태에서, 상기 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지는 방사성 동위원소, 효소 기질, 화학발광제, 형광단, 형광 소광제, 효소, 화학물질, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 키트는 상기 프로브를 포함하는 어레이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 어레이는 다중-웰 플레이트(multi-well plate)이다.
특정 실시형태에서, 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지는 방사성 동위원소, 효소 기질, 화학발광제, 형광단, 형광 소광제, 효소, 화학물질, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명에서 기술된 양태들에서 사용된 경우, 용어 "표지"는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는, 즉, 신호를 생성하는 검출 수단에 의해 소량으로 검출될 수 있는 모이어티를 지칭한다. 적합한 이러한 수단의 예는, 예를 들어 형광 또는 발광과 같은 분광 또는 광화학적 수단을 포함하거나, 또는 예를 들어 검출기 분석 화합물과의 접촉 시의, 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드/효소 혼합물과 반응하여 검출 가능한 복합체를 형성할 시의 물리적, 생화학적, 면역화학적, 또는 화학적 특성의 변화와 같은 생화학적, 면역화학적, 또는 화학적 수단을 포함한다. 따라서, 본원에서, 용어 "표지"는 직접적으로 검출될 수 있는 모이어티, 예를 들어 방사성 동위원소 또는 형광색소, 및 검출 가능한 생성물을 형성하는 반응을 통해 간접적으로 검출되는 반응성 모이어티, 예를 들어, 기질과 반응하여 분광광도법적으로 검출될 수 있는 생성물을 형성하는 효소를 포함하도록 의도된다. 상기 표지 시약은 방사성 동위원소와 같은 방사성 표지 모이어티를 함유할 수 있다는 것이 주목된다. 일 실시형태에서, 본원의 혼성화 프로브는 방사성 분석과 관련된 단점을 피하기 위해 비방사성으로 표지된다.
본 발명에 기술된 방법 및 키트에서의 표지 검출 방식의 사용을 위해, 연장 DNA 프라이머/주형 내로의 dNTP의 포함 후 형광 또는 화학발광 신호가 생성되도록 화합물을 공유 결합으로 부착함으로써, 뉴클레오티드 염기가 표지된다.
dNTP를 표지하기 위한 형광 화합물의 예는 플루오레세인, 로다민 및 BODIPY(4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Molecular Probes, Inc.(미국 오리건주 유진 소재)로부터 입수 가능한 문헌["Handbook of Molecular Probes and Fluorescent Chemicals"] 참조. 사용될 수 있는 화학발광 기반 화합물의 예는 루미놀 및 디옥세타논을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(문헌[Gundennan and McCapra, "Chemiluminescence in Organic Chemistry", Springer-Verlag, Berlin Heidleberg, 1987] 참조).
상기 프라이머에 어닐링된 주형 DNA, DNA 중합효소 및 적절한 완충제 조건을 포함하는 DNA 주형 시스템에, 형광 또는 화학발광으로 표지된 dNTP가 개별적으로 첨가된다. 반응 간격 후, 과량의 dNTP가 제거되고, 형광 또는 화학발광 태그된 뉴클레오티드가 DNA 주형에 포함되었는지 여부를 검출하기 위해 상기 시스템이 조사된다. 포함된 뉴클레오티드의 검출은, 사용되는 태그의 유형에 따라 결정되는 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
형광 태그된 dNTP의 경우, 상기 DNA 주형 시스템은 태그 개체에 의해 강하게 흡수되는 파장의 광방사(optical radiation)로 조사될 수 있다. 상기 태그로부터의 형광은 예를 들어, 여기 파장의 임의의 산란광을 배제하는 광학 필터와 함께 광검출기를 사용하여 검출된다.
본원에 기술된 키트 및 방법에서 형광 검출을 사용하는 추가 실시형태에서, 상기 형광 태그는 광절단성 또는 화학적으로 절단 가능한 링커에 의해 dNTP에 부착되고, 상기 태그는 연장 반응 후에 탈착되고, 상기 주형 시스템으로부터 검출 세포 내로 제거되며, 이 곳에서 상기 태그의 존재 여부 및 양이 적절한 파장에서의 광학 여기 및 형광 검출에 의해 측정된다. 이 실시형태에서, 주형의 단일 염기 반복 영역에 상보적으로 연장된 프라이머 가닥 상에서의 서로 바로 인접한 다수의 형광 태그의 존재로 인해, 형광 소광 가능성이 최소화되고, 반복 수가 측정될 수 있는 정확도가 최적화된다. 또한, 별도의 챔버에서의 형광의 여기는 상기 DNA 프라이머/주형 시스템에 대한 광분해 손상 가능성을 최소화한다.
일 실시형태에서, 상기 프로브는 5' 6-FAMTM(플루오레세인) 표지를 포함한다. 6-AMTM은 플루오레세인의 단일 이성질체 유도체이다. FAMTM은 올리고뉴클레오티드용 형광 염료 부가물이며 대부분의 형광 검출 장비와 양립 가능하다. 이것은 pH 7 미만에서 양성자화되고 감소된 형광을 가지며; 일반적으로 pH 범위 7.5 내지 8.5에서 사용된다. FAMTM은 올리고의 5' 또는 3' 말단에 부착될 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 프로브는 5'HEXTM(헥사클로로플루오레세인) 표지를 포함한다. 헥사클로로플루오레세인은 FAMTM을 사용하는 멀티플렉스화된 분석에 사용되는 플루오레세인의 화학적 관계물이다. HEXTM은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에만 첨가될 수 있다.
본 개시내용은 또한, 비제한적인 예로서, VIC®, TETTM, JOETM, NEDTM, PET®, ROXTM, TAMRATM, TETTM, Texas Red®, ATTOTM 532, Cy3, TyeTM 563, TyeTM 665, TEX 615TM, Cy5, ZENTM, Iowa Black® FQ, Iowa Black® RQ, DABYCL, 및 Yakima YellowTM와 같은 본원에 기술된 프로브의 표지를 위해 사용되는 당업계에 알려진 임의의 다른 표지의 사용을 고려한다.
일 실시형태에서, 상기 프로브는 형광 소광제 표지를 포함한다. 상기 소광제 표지는 본원에 개시된 반응에서 이중 소광제로서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 프로브는 Iowa Black® FQ 소광제를 포함한다. Iowa Black® FQ는 531 nm에서의 피크 흡광도와 함께 420 내지 620 nm 범위의 넓은 흡광도 스펙트럼을 갖는다 이 소광제는 플루오레세인, 및 녹색 내지 분홍색 스펙트럼 범위에서 방출하는 기타 형광 염료와 함께 사용된다. 본 개시내용은 비제한적인 예로서, ZENTM, Black Hole Quencher®(BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 등)와 같은 당업계에 알려진 임의의 형광 소광제 표지의 사용을 고려한다.
본 발명에 기술된 이식유전자 qPCR 방법 및 키트는 CAR T 의약품에 통합된 BCMA CAR 이식유전자 플라스미드의 정량화를 위해 설계된 멀티플렉스화된 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석을 포함한다. 이 qPCR 방법에서는 하기의 2개의 표적이 증폭된다: (1) BCMA CAR 이식유전자 플라스미드(이식유전자) 및 (2) 인간 알부민(hALB) 기준 유전자. 이식유전자 표적에 대한 프라이머 및 프로브 세트는 상기 플라스미드의 CD137과 CD3z 영역 간의 접합부를 증폭시켜, CAR T 의약품 내로 통합되어 존재하는 BCMA CAR 이식유전자 플라스미드만이 검출되도록 한다. hALB 기준 유전자 카피 수 결과는, qPCR 반응에서 시험된 각 샘플에 대해, 보고 가능한 세포 당 벡터 카피 수(VCN: vector copy number) 결과를 계산하는 데 사용된다.
예시적인 실시형태들에 대한 설명이 후술된다
실시형태 1. 프로브 및 프라이머 세트로서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 프로브; 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는, 프로브 및 프라이머 세트.
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 상기 적어도 하나의 표지가 방사성 동위원소, 효소 기질, 화학발광제, 형광단, 형광 소광제, 효소, 화학물질, 또는 이들의 조합을 포함하는, 프로브 및 프라이머 세트.
실시형태 3. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하기 위한 키트로서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 프로브; 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하기 위한 키트.
실시형태 4. 실시형태 3에 있어서, 상기 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 방사성 동위원소, 효소 기질, 화학발광제, 형광단, 형광 소광제, 효소, 화학물질, 또는 이들의 조합을 포함하는, 키트.
실시형태 5. 실시형태 3에 있어서, 상기 프로브를 포함하는 어레이를 포함하는, 키트.
실시형태 6. 실시형태 5에 있어서, 상기 어레이가 다중-웰 플레이트인, 키트.
실시형태 7. 실시형태 3에 있어서, 서열번호 22의 핵산 서열 및 인간 알부민(hALB) 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 hALB 프로브, 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머, 및 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머를 추가로 포함하는, 키트.
실시형태 8. 실시형태 7에 있어서, 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 방사성 동위원소, 효소 기질, 화학발광제, 형광단, 형광 소광제, 효소, 화학물질, 또는 이들의 조합을 포함하는, 키트.
실시형태 9. 실시형태 3에 있어서, 기준 유전자 프로브 및 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지, 제1 기준 유전자 프라이머, 및 제2 기준 유전자 프라이머를 추가로 포함하는, 키트.
실시형태 10. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법으로서,
서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머, 및 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 hALB 핵산을 생성하는 단계;
CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 증폭된 hALB 핵산과 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법.
실시형태 11. 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법으로서,
CAR T 세포로부터의 핵산을 제1 CAR 프라이머, 제2 CAR 프라이머, 제1 hALB 프라이머, 및 제2 hALB 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는, 단계;
상기 제1 CAR 프라이머 및 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
상기 제1 hALB 프라이머 및 제2 hALB 프라이머를 사용하여 hALB 핵산을 증폭시켜, 증폭된 hALB 핵산을 생성하는 단계;
CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 hALB 핵산과 상기 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법.
실시형태 12. 실시형태 10 또는 실시형태 11에 있어서, 상기 증폭된 CAR 핵산과 상기 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 CAR 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 13. 실시형태 10 또는 실시형태 11에 있어서, 상기 증폭된 hALB 핵산 분자와 상기 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 hALB 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 14. 실시형태 10 또는 실시형태 11에 있어서, 상기 증폭이 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하는, 방법.
실시형태 15. 실시형태 14에 있어서, 상기 PCR은 실시간 PCR, 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 실시간 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(rt RT-PCR), 디지털 PCR(dPCR), 리가제 연쇄 반응, 또는 전사 매개 증폭(TMA)인, 방법.
실시형태 16. 실시형태 10에 있어서, 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 형광단을 포함하는, 방법.
실시형태 17. 실시형태 10에 있어서, 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 형광단을 포함하는, 방법.
실시형태 18. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법으로서,
서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
제1 기준 유전자 프라이머 및 제2 기준 유전자 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 기준 유전자 핵산을 생성하는 단계;
CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산과 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법.
실시형태 19. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법으로서,
CAR T 세포로부터의 핵산을 제1 CAR 프라이머, 제2 CAR 프라이머, 제1 기준 유전자 프라이머, 및 제2 기준 유전자 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는, 단계;
상기 제1 CAR 프라이머 및 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
상기 제1 기준 유전자 프라이머 및 제2 기준 유전자 프라이머를 사용하여 기준 유전자 핵산을 증폭시켜, 증폭된 기준 유전자 핵산을 생성하는 단계;
CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산과 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법.
실시형태 20. 실시형태 18 또는 실시형태 19에 있어서, 상기 증폭된 CAR 핵산과 상기 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 CAR 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 21. 실시형태 18 또는 실시형태 19에 있어서, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산 분자와 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 22. 실시형태 18 또는 실시형태 19에 있어서, 상기 증폭이 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하는, 방법.
실시형태 23. 실시형태 22에 있어서, 상기 PCR은 실시간 PCR, 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 실시간 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(rt RT-PCR), 디지털 PCR(dPCR), 리가제 연쇄 반응, 또는 전사 매개 증폭(TMA)인, 방법.
실시형태 24. 실시형태 18에 있어서, 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 형광단을 포함하는, 방법.
실시형태 25. 실시형태 18에 있어서, 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 형광단을 포함하는, 방법.
실시형태 26. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 방법으로서,
CAR 이식유전자를 T 세포에 도입하여 이식유전자 통합된 T 세포를 수득하는 단계;
하기를 포함하는 CAR 이식유전자 통합을 측정하는 단계:
서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머를 사용하여 상기 이식유전자 통합된 T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
제1 기준 유전자 프라이머 및 제2 기준 유전자 프라이머를 사용하여 상기 이식유전자 통합된 T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 기준 유전자 핵산을 생성하는 단계;
CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산과 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계; 및
적어도 한 카피의 통합된 CAR 이식유전자를 포함하는 CAR T 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 방법.
실시형태 27. 실시형태 26에 있어서, 상기 증폭된 CAR 핵산과 상기 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 CAR 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 28. 실시형태 26에 있어서, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산 분자와 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는,
혼성화 전의 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 29. 실시형태 26에 있어서, 상기 증폭이 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하는, 방법.
실시형태 30. 실시형태 29에 있어서, 상기 PCR은 실시간 PCR, 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 실시간 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(rt RT-PCR), 디지털 PCR(dPCR), 리가제 연쇄 반응, 또는 전사 매개 증폭(TMA)인, 방법.
실시형태 31. 실시형태 26에 있어서, 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 형광단을 포함하는, 방법.
실시형태 32. 실시형태 26에 있어서, 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 형광단을 포함하는, 방법.
실시형태 33. CAR T 세포로서, 실시형태 26 내지 실시형태 32 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 CAR T 세포.
하기 실시예는 본원에 개시된 실시형태 중 일부를 추가로 기술하기 위해 제공된다. 실시예는 개시된 실시형태를 예시하고자 하는 것이며, 이를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 이식유전자 qPCR 방법 개발
방법 개요:
기술된 예시적인 이식유전자 qPCR 방법은 CAR T 의약품 내로 통합된 BCMA CAR 이식유전자 플라스미드(실시예에서 "pLLV-LICAR2SIN 플라스미드"로 지칭됨)의 정량화를 위해 설계된 멀티플렉스화된 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석이다. 하기가 이 qPCR 방법에서 증폭된다: (1) 이식유전자 pLLV-LICAR2SIN 플라스미드(이식유전자) (국제특허출원공개 WO2017/025038 A1호의 서열번호 175 내지 197, 202 내지 205, 218 내지 227, 239, 261 내지 264, 및 271 내지 276 중 임의의 것을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 이식유전자) 및 (2) 인간 알부민(hALB) 기준 유전자. 이식유전자 표적에 대한 프라이머 및 프로브 세트는 상기 플라스미드의 CD137과 CD3z 영역 간의 접합부를 증폭시켜, CAR T 의약품 내로 통합되어 존재하는 pLLV-LICAR2SIN 플라스미드만이 검출되도록 한다. hALB 기준 유전자 카피 수 결과는, qPCR 반응에서 시험된 각 샘플에 대해, 보고 가능한 세포 당 벡터 카피 수(VCN) 결과를 계산하는 데 사용된다. 이식유전자 qPCR 방법의 VNC/세포 샘플 결과는 CAR T 의약품 샘플의 안전성, 순도, 및 동일성에 대해 보고된다.
이식유전자 프라이머 및 프로브의 설계:
"pLLV-LICAR2SIN 플라스미드"로 명명된 BCMA CAR 이식유전자 플라스미드는, B-세포 성숙 항원(BCMA) 키메라 항원 수용체(CAR)의 다양한 상이한 성분을 암호화하는 서열을 함유하는 8,518 염기쌍(bp) 플라스미드이다. 상기 qPCR의 이식유전자 표적은, CAR T 의약품 내로 통합되어 존재하는 pLLV-LICAR2SIN 플라스미드만을 검출하도록 요구되었으며, 표적화된 영역은 BCMA CAR 작제물에 특이적으로 속해야 한다. 이식유전자 qPCR 표적의 특이성을 보장하기 위해, CAR 작제물을 암호화하는 pLLV-LICAR2SIN 플라스미드의 적어도 2개의 영역 간의 적어도 하나의 접합부를 표적화하도록 설계된 프라이머와 프로브 쌍을 설계하였다. 먼저, pLLV- LICAR2SIN 플라스미드의 적합한 영역을 식별해야 했다.
CAR T 의약품의 게놈 내로 통합되고 CAR 작제물에 특이적인 가장 긴 염기쌍(bp) 암호화 영역은 BCMA CAR 작제물의 2개의 가변 중쇄 부분에 속한다. 이 두 영역은 짧은 링커 서열에 의해 분리된다. 상기 2개의 가변 중쇄 부분 및 상기 링커에 해당하는 플라스미드의 뉴클레오티드 서열 영역은, 이들 영역이 상기 이식유전자 qPCR 방법에 적합한 표적이 될 수 있는지 결정하기 위해, 미국 국립생물공학 정보센터(NCBI: National Center for Biotechnology Information)의 Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 사이트(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에 입력되었다. 그러나, BLAST 결과는 호모 사피엔스(homo sapiens)를 포함한 많은 다양한 종에 걸쳐 다양한 면역글로불린 가변 영역에 대해 다수의 히트(hit)를 제공하였다. 따라서, CAR의 2개의 가변 중쇄 성분에 대한 암호화 영역은 상기 이식유전자 qPCR 방법에 적합한 표적이 아닌 것으로 결정되었다.
pLLV-LICAR2SIN 플라스미드의 CD137 영역과 CD3z 영역 간의 접합부는, CAR T 의약품의 게놈 내로 통합되고 BCMA CAR의 성분인 플라스미드 영역에 포함된다. pLLV-LICAR2SIN 플라스미드의 CD3z 암호화 영역의 크기는 상기 플라스미드의 CAR 분절에서 두 번째로 긴 bp 암호화 영역이므로, 상기 더 큰 암호화 영역에서 발견될 수 있는 더 많은 수의 잠재적으로 적합한 프라이머와 프로브 쌍의 가능성으로 인해, 표적화하기에 더 적합한 영역이 된다. CD3z 암호화 영역은 상기 플라스미드의 CD137 암호화 영역에 직접 인접한다. CD137 암호화 영역의 반대쪽에는 BCMA CAR 작제물에 특이적이지 않은 플라스미드 백본 서열이 존재한다. 따라서, 상기 프라이머 및 프로브 설계에 더 큰 CD3z 암호화 영역이 포함되어야 하는 경우, CD137과 CD3z 간의 접합부는 표적화하기에 적합한 유일한 옵션이었다.
Integrated DNA Technologies, Inc.(IDT) (미국 아이오와주 코랄빌 소재)의 PrimerQuest® 도구(https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)를 사용하여, qPCR 방법 개발에서 시험할 적절한 프라이머와 프로브 쌍을 설계하였다. CD137 및 CD3z 암호화 영역에 해당하는 pLLV-LICAR2SIN 플라스미드의 뉴클레오티드 서열을 PrimerQuest 도구에 입력하였다. 최적의 프라이머 융해 온도(Tm)는 60℃로 설정되었고, CD137과 CD3z 간의 접합부에 해당하는 뉴클레오티드는, 순방향 또는 역방향 프라이머가 이 접합부와 겹치는지를 확인하기 위해 "겹침 접합부 목록(Overlap Junction List)"에 입력되었다. 그 결과, 4개의 프라이머와 프로브 쌍이 생성되었다(표 1 참조). 두 쌍은 CD137/CD3z 접합부에 걸쳐 있는 정방향 프라이머를 갖고, 두 쌍은 상기 접합부에 걸쳐 있는 역방향 프라이머를 갖는다. 그런 다음, 분석 설계 매개변수를 조정하여, CD137/CD3z 접합부에 걸치도록 프로브 설계를 제한하였다. 그 결과, qPCR 방법 개발을 위한 시험에 적합한 총 7개의 프라이머와 프로브 쌍에 대해 3개의 추가 프라이머와 프로브 쌍(표 1 참조)이 생성되었다. 7개의 프라이머/프로브 쌍 모두를 NCBI BLAST 사이트에 연결하여 인간 게놈에서의 교차 반응성의 가능성을 확인하였다. 7개 쌍 중 임의의 것에 대한 BLAST 결과 중 어느 것도 교차 반응성의 가능성을 나타내지 않았다.
[표 1]
Figure pct00001
3개의 hALB 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 qPCR 방법 개발을 시험하였다(표 2 참조). 한 세트는 공개된 논문(문헌[S Charrier et al. Lentiviral vectors targeting WASp expression to hematopoietic cells, efficiently transduce and correct cells from WAS patients. Gene Therapy (2007) 14, 415-428.])으로부터 취하였고, 제2 세트는 궁극적으로 사용되지 않은 CRO 디지털 PCR 방법 분석으로부터 취하였고, 제3 세트는 PrimerQuest 도구 및 공개된 논문뿐만 아니라 CCHMC hALB 프라이머 및 프로브 세트에 의해 표적화된 hALB 유전자 영역을 사용하여 설계되었다. 3개의 프라이머/프로브 쌍 모두를 NCBI BLAST 사이트에 연결하여 인간 게놈에서의 임의의 비-hALB 생성물과의 교차 반응성의 가능성을 확인하였다. 상기 3개 쌍 중 임의의 것에 대한 BLAST 결과 중 어느 것도 교차 반응성의 가능성을 나타내지 않았다.
[표 2]
Figure pct00002
프라이머 및 프로브 스크리닝:
CAR T 의약품, pLLV-LICAR2SIN 플라스미드로 스파이킹(spike)된 샘플로서의 모의 T-세포 DNA 및 모의 T-세포 DNA를 사용한 싱글플렉스 qPCR 반응을 실행함으로써, 상기 7개의 상이한 이식유전자 프라이머 및 프로브 세트 및 상기 3개의 상이한 hALB 프라이머 및 프로브 세트를 스크리닝하였다. 모의 T-세포 DNA는 렌티벡터로 형질도입하기 전에 CAR T 생성물과 동일한 선택 및 증폭 과정을 거친 T-세포로부터 수확되었다. CAR T 세포의 qPCR 생성물, 모의 T-세포, pLLV-LICAR2SIN 플라스미드로 스파이킹된 모의 T-세포 DNA, 및 "무주형 대조군"(NTC: no template control) 샘플 qPCR 생성물을 아가로스 겔 상에서 실행하였다. 예상되는 PCR 생성물 크기의 단일 밴드를 생성하지 않은 임의의 프라이머/프로브 세트는, 추가 이식유전자 qPCR 방법 개발에서 제외되었다. NTC 샘플을 포함한 모든 qPCR 생성물에서도 약 25 bp 프라이머 이합체 밴드의 존재가 나타났지만, 이 밴드는 qPCR 반응의 예상되는 부산물이다. 이식유전자 (FP) 세트 1 및 이식유전자 (RP) 세트 2 프라이머/프로브 세트만이, 단지 2개의 <50 bp 밴드가 상기 겔 상에서 관찰되는 예상되는 표적 밴드를 생성하였다. <50 bp 밴드 중 하나는 예상되는 프라이머 이합체일 가능성이 있었다. 제2 <50 bp 밴드는 NTC 샘플에서 명확하게 관찰되지 않았고, 이 추가적인 저분자량 밴드가 무엇의 결과인지는 확인되지 않았다. 싱글플렉스 프라이머/프로브 스크리닝 분석의 겔 이미지의 예에 대해서는 도 1을 참조한다. hALB 세트 3 프라이머/프로브 세트만이, CAR T의 qPCR 생성물, 모의 T-세포 및 플라스미드 샘플로 스파이킹된 모의 T-세포 DNA에서 관찰된 추가적인 예상치 못한 밴드로 인해, 추가 qPCR 방법 개발에서 제거되었다. 3개의 hALB 프라이머/프로브 세트 모두 또한 상기 겔 상에서 관찰된 2개의 <50 bp 밴드를 생성하였다. <50 bp 밴드 중 하나는 예상되는 프라이머 이합체일 가능성이 있었다. 제2 <50 bp 밴드는 NTC 샘플에서 명확하게 관찰되지 않았고, 이 추가적인 저분자량 밴드가 무엇의 결과인지는 확인되지 않았다. 그러나, 이것은 모든 이식유전자 프라이머/프로브 세트에서도 관찰되는 동일한 저분자량 밴딩 패턴이고, 반응에서 프라이머 또는 프로브의 양을 최적화하고 다양한 어닐링 온도를 시험해도 상기 밴드가 제거되지 않았다는 점을 감안할 때, 이 추가 밴드는 qPCR 마스터 믹스 또는 일부 다른 관련 없는 qPCR 부산물에 우라실-DNA 글리코실라제(UNG: uracil-DNA glycosylase)를 갖는 것의 결과일 것으로 예상되었다.
이식유전자 프라이머/프로브 세트 스크리닝 과정의 다음 단계는, 표준 곡선을 사용하여 2개의 허용 가능한 hALB 프라이머/프로브 세트(세트 1 및 세트 2)를 갖는 멀티플렉스 qPCR 반응에서 2개의 허용 가능한 세트(FP 세트 1 및 RP 세트 2)를 실행하는 것이었다. 알려진 농도의 pLLV-LICAR2SIN 플라스미드로 모의 T-세포 DNA를 스파이킹하고 희석제로서 낮은 EDTA TE 완충제를 사용하여 이 스파이킹된 모의 T-세포 샘플의 5배 연속 희석물 5개를 제조함으로써 표준 곡선을 만들었다. 각각의 표준 곡선 포인트를 만들고 일회용 분취량으로 동결하였다. 멀티플렉스 qPCR에서 hALB 세트 2를 사용하여 이식유전자 프라이머/프로브 세트 둘 모두를 먼저 시험하였다. 또한, 멀티플렉스 반응의 특이성에 접근하기 위해 CAR T DNA 및 모의 T-세포 DNA 샘플을 실행하였다. 추가 이식유전자 qPCR 방법 개발에 허용 가능한 이식유전자 및 hALB 표적 모두에 대해 상기 표준 곡선이 충족할 것으로 예상된 기준은 하기와 같았다: (1) ≥0.98의 R2 및 (2) 90 내지 110%의 qPCR 효율. CAR T DNA는 이식유전자와 hALB 표적 모두에서 측정 가능한 증폭을 가질 필요가 있었던 반면, 모의 T-세포 DNA 샘플은 분석 특이성에 대한 요건을 충족하기 위해, hALB 표적에서만 측정 가능한 증폭을 갖고 이식유전자 표적에서는 증폭의 양이 없어야 했다.
이식유전자 (FP) 세트 1 및 hALB 세트 2 멀티플렉스 반응은 이식유전자 및 hALB 표적 둘 모두에 대해 >0.98의 허용 가능한 R2 결과를 제공했지만, 표적 표준 곡선 중 어느 것도 상기 허용 가능한 범위 내에서 qPCR 효율을 나타내지 않았다. 이식유전자 (RP) 세트 2 및 hALB 세트 2 멀티플렉스 반응 또한 이식유전자 및 hALB 표적 둘 모두에 대해 >0.98의 허용 가능한 R2 결과를 제공하였다. 이식유전자 표준 곡선은 또한 상기 허용 가능한 범위 내에서 qPCR 효율을 나타내었지만, hALB 표준 곡선은 그렇지 않았다. 이식유전자 (FP) 세트 1/hALB 세트 2 및 이식유전자 (RP) 세트 2/hALB 세트 2 멀티플렉스 반응 둘 모두는 허용 가능한 특이성 결과를 나타냈으며, CAR T DNA 샘플은 두 표적 모두에서 측정 가능한 증폭을 가졌고, 모의 T-세포 DNA는 hALB 표적에서만 측정 가능한 증폭을 가졌으며 이식유전자 표적에서는 증폭을 나타내지 않았다. 상기 2개의 프라이머/프로브 세트가 멀티플렉스화되었을 때 임의의 표적외(off-target) 밴드가 존재하는지를 측정하기 위해, 멀티플렉스 qPCR 생성물 또한 겔 상에서 실행하였다(예시적인 겔 이미지에 대해서는 도 2 참조). 각각의 멀티플렉스 반응에 대한 겔 결과에서는 예상치 못한 밴드가 나타나지 않았다. 반응을 멀티플렉싱하는 것이 잠재적으로 qPCR 효율에 영향을 미치는지 여부를 측정하기 위해 싱글플렉스 반응에서 표준 곡선을 시험하기로 결정하였다. 멀티플렉스 반응에서 이식유전자 (RP) 세트 2 반응의 효율만이 허용 가능한 범위 내였다는 점을 감안하여, 이식유전자 (RP) 세트 2 및 hALB 세트 2 프라이머/프로브 세트만이 싱글플렉스에서 시험되었다. 이식유전자 (RP) 세트 2 싱글플렉스 반응은 허용 가능한 범위를 벗어난 더 낮은 qPCR 효율을 유도하였다. hALB 세트 2 싱글플렉스 반응은 허용 가능한 범위 내의 더 높은 qPCR 효율을 유도하였다. 두 표적 올리고 세트의 프라이머/프로브 농도를 최적화하려는 시도도, 더 높은 어닐링 온도를 시도하는 것도, 멀티플렉스 반응에서의 각각의 표적 표준 곡선의 효율성을 개선하지 않았다. 그런 다음, hALB 세트 1 프라이머/프로브를 사용한 멀티플렉스 반응에서 허용 가능한 이식유전자 프라이머/프로브 세트 둘 모두를 실행하였다.
이식유전자 (FP) 세트 1 및 hALB 세트 1 멀티플렉스 반응을 먼저 시도하였고, 이는 hALB 표준 곡선에 대해서만 R2>0.98을 가졌다. 이식유전자 표적 표준 곡선 R2는 <0.97이었다. 이식유전자 및 hALB 표적 표준 곡선은 둘 모두 허용 가능한 범위를 벗어난 효율성을 유도하였고, 이식유전자 표적은 hALB 세트 2 프라이머/프로브를 사용한 멀티플렉스 반응에서 관찰되는 것보다 더 낮은 효율성을 가졌다. hALB 세트 1 싱글플렉스 반응은 ≥0.98의 R2를 가졌고, 멀티플렉스 반응에서 관찰되는 것과 유사한 효율을 나타냈다. 5포인트 4배 희석 계획을 사용하여 새로운 표준 곡선을 만들었고, 이것은 표준 #1에 더 적은 양의 pLLV- LICAR2SIN 플라스미드 및 모의 T-세포 DNA를 함유하였다. 이것은, 모의 T-세포 DNA 스톡에 존재할 수 있는 임의의 가능한 PCR 억제제를 잠재적으로 희석할 뿐만 아니라 더 많은 표준을 제조하는 데 필요한 모의 T-세포 DNA의 양을 감소시킴으로써 qPCR 효율성을 개선하기 위해, 수행되었다. 그런 다음, 이 새로운 표준 곡선을 사용하여, 허용 가능한 이식유전자 프라이머/프로브 세트 및 hALB 세트 1 프라이머/프로브 세트 둘 모두를 멀티플렉스 반응에서 시험하였다. 이식유전자 및 hALB 표준 곡선 둘 모두의 R2 및 효율성은, 상기 새로운 표준 곡선을 사용하는 이식유전자 (FP) 세트 1/hALB 세트 1 멀티플렉스 반응 및 이식유전자 (RP) 세트 2/hALB 세트 1 멀티플렉스 반응 둘 모두에 대해 허용 가능한 범위 내에 존재하였다. 표적외 밴드가 검출되지 않도록 하기 위해, 멀티플렉스 qPCR 반응 생성물 또한 겔 상에서 실행하였다(도 3 참조). 각각의 멀티플렉스화된 반응에 대해 표적외 밴드가 검출되지 않았다. 효율은 상기 2개의 이식유전자 프라이머/프로브 세트의 멀티플렉스 반응 간에 유사했지만, 이식유전자 (RP) 세트 2/hALB 세트 1 멀티플렉스 반응에 대한 이식유전자 표적 증폭 곡선의 형태가 전형적인 S자형 곡선에 더 가까웠으며, 이식유전자 (FP) 세트 1/hALB 세트 1 멀티플렉스 반응의 것보다 더 명확한 상부 정체기(plateau)를 가졌다(도 4 참조). 따라서, 추가 이식유전자 qPCR 방법 개발을 위해 이식유전자 (RP) 세트 2 및 hALB 세트 1 프라이머/프로브 세트가 선택되었다.
효율성 반복성 문제 해결:
R2 및 효율성에 대한 허용 가능한 결과가 반복 가능한지 여부를 측정하기 위해, 상기 새로운 표준 곡선 계획을 사용하는 이식유전자 (RP) 세트 2/hALB 세트 1 멀티플렉스 반응을 반복하였다. 그러나, 반복 분석의 경우, 이식유전자 및 hALB 표적 둘 모두에 대한 표준 곡선은 각각 88% 및 89%에 불과하였다. 두 표적 모두에 대한 프라이머/프로브 농도를 최적화하려고 시도하면 두 표적 모두에 대한 효율성이 약간 개선되었지만, 어닐링 온도를 높이려고 시도하고 PCR 인핸서인 DMSO, TMAC 및 베타인을 시도하면 그렇지 않았다. 동시에, 효율성 결과의 반복성을 조사하였고, 분석의 잠재적 LOQ를 낮추기 위해 4배 표준 곡선에 포함되는 VCN/세포 범위를 늘릴 수 있는지를 질문하였다. 따라서, 5개의 동결된 4배 표준 포인트 샘플을 사용할 뿐만 아니라 동결된 표준 #1을 희석함으로써 5포인트 5배 표준 곡선을 만듦으로써 멀티플렉스 반응을 실행하였다. 그런 다음, 상기 2개의 표준 곡선을 멀티플렉스 qPCR 반응에서 함께 실행하였다. 4배 표준 곡선은 이식유전자 및 hALB 표적에 대해 각각 94% 및 91%의 효율을 나타냈다. 5배 표준 곡선은 이식유전자 및 hALB 표적에 대해 각각 102% 및 99%의 효율을 나타냈다. 4배 표준 곡선에 대비해 5배 표준 곡선에서 관찰되는 효율성의 증가는, 분석에서 곡선을 실행하기 직전에 표준 #2 내지 5를 신선하게 제조하기 위해 동결된 표준 #1을 희석하는 것에 대비해, 더 낮은 표준 포인트들이 동결되는 경우, 더 낮은 표준 곡선 포인트들의 변동성이 증가하기 때문일 수 있다고 여겨졌다.
4배 "동결된" 표준 곡선 포인트에 대비해 5배 "신선한" 표준 곡선에서 여전히 효율성이 개선을 나타내는지를 확인하기 위해, 4배 및 5배 표준 곡선을 반복하였다. 반복 분석의 경우, 4배 "동결된" 표준 곡선은 이식유전자 및 hALB 표적에 대해 각각 94% 및 88%의 효율성을 나타냈다. 5배 "신선한" 표준 곡선은 이식유전자 및 hALB 표적에 대해 각각 102% 및 99%의 효율을 나타냈다. 이러한 "신선한" 대 "동결된" 표준 곡선 결과의 반복성을 추가로 보장하기 위해 추가 실행을 수행하였다(도 5 참조). 표준 곡선 효율성에서 관찰되는 변동성 문제의 주요 원인은 동결된 표준 곡선 포인트를 사용하기 때문인 것으로 결정되었다. 따라서 표준 #1만 제조하여 일회용 분취량으로 동결하기로 결정하였다. 이 동결된 표준 #1은 앞으로 임의의 분석을 실행하기 직전에 표준 #2-5를 신선하게 제조하는 데 사용될 것이다. 또한, 분석의 VCN/세포 범위를 증가시키기 위해 5배 표준 곡선이 앞으로 사용될 것으로 결정되었다.
DDPCR을 사용한 VCN/세포 불일치 문제 해결
데이터를 수집할 뿐만 아니라 적어도 처음 6개 배치(batch)의 물질을 방출하기 위해 분석을 실행하였다. VCN/세포 분석 실행은 pLLV-LICAR2SIN 플라스미드 백본의 RU5 프로모터 영역을 표적화한다 [발명자: 이러한 영역을 기술하는 데 더 많은 세부 사항이 필요합니까? 이것이 당업자에게 충분히 구체적입니까?] VCN/세포 qPCR 분석이 세포 요법을 위한 CAR 플라스미드의 이식유전자 부분을 표적화하는 것이 규제 요건이기 때문에, 상기 이식유전자 qPCR 방법은 이 백본 방법을 대체하도록 의도된다. 따라서, 상기 방법의 VCN/세포 결과가 이식유전자 qPCR 방법 결과와 유사해야 한다는 요건이 존재하였다. CAR T로부터의 게놈 DNA를 이식유전자 qPCR 방법에서 시험하고 LB_12 샘플의 결과와 비교하였다. 할당된 이식유전자 및 hALB 카피 값이 정확한지 여부를 측정하기 위해, 이식유전자 표준 및 대조군을 ddPCR에서 실행하였다. 실제 VCN/세포 값을 측정하기 위해 LB_12 DNA 샘플 또한 ddPCR에서 실행하였다.
ddPCR 반응은 BioRad 프로브용 슈퍼믹스(BioRad Supermix for Probes) ddPCR 마스터 믹스에서 이식유전자 (RP) 세트 2 및 hALB 세트 1 프라이머/프로브를 사용하였다. 사용된 열 순환 조건은 상기 슈퍼믹스 키트에서 권장하는 조건이었다. 가장 정확한 ddPCR 결과를 얻기 위해 DNA를 효소 분해하는 것이 권장되므로, EcoRI를 마스터 믹스에 첨가하였다. EcoRI는 pLLV-LICAR2SIN 플라스미드를 한 번만 절단하는 것으로 확인되었으며, 이식유전자 또는 hALB 표적의 증폭 영역에서는 절단하지 않았다. ddPCR 결과는, 이식유전자 표준 및 대조군 이식유전자 및 hALB 카피는 정확하지만 LB_12 결과가 RU5 VCN/세포 결과와 더 유사함을 확인시켜 주었다. LB_12 qPCR 결과에 대한 VCN/세포 결과가 ddPCR에 의해서는 부정확한 것으로 결정된 반면 이식유전자 표준 및 대조군은 어떻게 정확할 수 있었는지는 알려지지 않았다. 따라서, LB_12 gDNA의 더 작은 DNA 조각이 더 정확한 결과를 얻을 수 있다는 점을 고려하여, pLLV-LICAR2SIN 플라스미드를 1회 초과로 절단하는 효소를 사용하였다. 2개의 추가 효소를 시도하였으며, 하나는 2회 절단하고 다른 하나는 3회 절단했지만, VCN/세포 ddPCR 결과는 변화하지 않았다. 따라서, 일부 CAR T DNA 샘플 및 2개의 이식유전자 대조군을 효소 분해하였고, 반응을 클린업(clean up)하고, 분해되지 않은 표준, 대조군 및 CAR T 샘플과 함께 이식유전자 qPCR에서 DNA를 실행하였다. 분해된 대조군의 VCN/세포 결과는 분해되지 않은 VCN/세포 결과보다 약 3.8배 더 높았지만, 분해된 CAR T 샘플 VCN/세포 결과는 분해되지 않은 CAR T 샘플의 경우보다 약 1.3배 더 낮았다. 이러한 결과는, 정확한 샘플 VCN/세포 결과를 얻기 위해 pLLV- LICAR2SIN 플라스미드를 선형화해야 하는지 여부에 대해 의문을 제기하였다.
EcoRI 효소를 사용하여 플라스미드를 분해함으로써, pLLV-LICAR2SIN 플라스미드의 분취량을 선형화하였다. 효소 분해를 클린업하고 선형화된 플라스미드를 정량화하였다. 이 선형화된 플라스미드를 5배 이식유전자 표준 곡선의 이식유전자 카피 값까지 희석하고 이식유전자 qPCR 분석에서 실행하였다. LB_12 CAR T DNA 또한 상기 분석에서 실행하였으며, 원형(분해되지 않음) 및 선형화된 표준 곡선 결과 둘 모두로부터 VCN/세포 결과를 계산하였다. 선형화된 표준 곡선 포인트에 대한 Ct 값은 분해되지 않은 표준 곡선 포인트의 것들보다 약 2배 더 낮았다(도 6 참조). 또한, 선형화된 표준 곡선으로부터 계산된 LB_12 VCN/세포 결과는 ddPCR에서 얻은 결과뿐만 아니라 추가 RU5 qPCR 방법으로 얻은 결과와도 유사했지만, 원형(분해되지 않음) 표준 곡선으로부터 계산된 VCN/세포 결과는 약 4배 더 높았다. 이는, 정확한 VCN/세포 결과를 얻기 위해 pLLV-LICAR2SIN 플라스미드를 선형화해야 함을 확인시켜 주었다. 2개의 로트의 선형화된 플라스미드 표준 및 대조군을 제조하였으며, 하나는 임상 배치 방출 시험(clinical batch release testing) 및 임의의 다른 GMP 연구를 위한 GMP 로트로 사용할 대형 로트였고, 다른 하나는 분석자 교육 및 임의의 비-GMP 활동에 사용할 소형 로트였다.
샘플을 대표하는 DNA의 일정한 양에 있어서의 선형성:
샘플 DNA를 0.02 ug/uL의 농도로 희석하고 5 uL를 qPCR 분석에 로딩하여 반응 당 총 100 ng의 DNA가 되도록 한다. 스톡 농도가 <0.02 ug/uL인 샘플은 상기 분석에서 바로 실행될 수 있지만, hALB 카피에 대한 허용 범위는 반응에 로딩된 DNA의 양에 따라 조정되어야 한다. 0.05 ug/uL의 출발 모의 T-세포 DNA 농도로 표준 곡선을 만들고, 이식유전자 및 hALB 표적 둘 모두에 대한 표준 곡선을 달성하기 위해 낮은 EDTA TE 완충제로 희석한다(표 3 참조). 표준 곡선이 일정한 양의, 샘플을 대표하는 모의 T-세포 gDNA로 만들어진 경우 분석의 선형성이 허용 가능한 범위 내로 유지되도록 하기 위해, 0.02 ug/uL의 모의 T-세포 DNA 농도를 사용하여 특성화 표준 곡선을 만들었고 0.02 ug/uL 모의 T-세포 DNA를 사용하여 연속 희석하였다(표 4 참조). 그런 다음, 분석의 선형성을 보장하기 위해, 이 표준 곡선을 전형적인 표준 곡선과 함께 실행하였다(도 7 참조). 특성화 표준 곡선에 대한 측정된 이식유전자 카피 결과가 ≥0.98의 R2를 갖는 선형 반응을 나타냄을 보장하기 위해, 로그 관찰된 카피 대 로그 예상되는 카피를 또한 플롯팅하였다(도 8 참조).
특성화 표준 곡선 결과는, 전형적인 샘플 농도(0.02 ug/uL)와 일치하는 DNA 농도에서도 이식유전자 카피가 여전히 정확하게 정량화될 수 있음을 보여주었다.
[표 3]
Figure pct00003
[표 4]
Figure pct00004
방법 적격성 평가:
국제 의약 조화 회의(ICH: International Conference on Harmonization) 및 MIQE(정량적 실시간 PCR 실험의 공개를 위한 최소 정보(minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments)) 지침에 따라, 이식유전자 qPCR 방법에 대해 적격성을 평가하였다. 방법 적격성 평가를 완료하기 위해 3개의 분석을 실행하였다. 상기 분석은 방법 적격성 평가 프로토콜에 명시된 모든 방법 적격성 평가 매개변수에 대한 허용 기준을 통과하였다. 표 5는 방법 적격성 평가 매개변수, 허용 기준 및 적격성 평가 결과를 요약한다(실시예 2 참조).
[표 5]
Figure pct00005
실시예 2: 이식유전자 qPCR 방법
1.0 목적
1.1 이 실시예는 CAR T 생성물 내로 통합된 LiCAR 플라스미드의 정량화를 위한 정량적 실시간 PCR(qPCR) 분석을 수행하기 위한 예시적인 절차를 기술한다. 상기 분석은 LiCAR 플라스미드의 CD137 및 CD3z 영역 간의 접합부뿐만 아니라 인간 알부민(기준 유전자)이 표적화되는 멀티플렉스 qPCR로 설계되었다.
2.0 범위
2.1 이 방법은 하기를 측정하기 위한 용량 제형 직전에, 수확-후 CAR T 세포에 적용할 수 있다.
2.1.1 벡터 카피 수
2.1.2 형질도입 효율
2.1.3 LiCAR 발현 동일성
3.0 정의 및 약어
3.1 LOQ(정량화 한계: Limit of Quantitation)
3.2 NTC(무주형 대조군: No Template Control)
3.3 Ct(주기 임계값: Cycle Threshold)
3.4 CV(변동 계수: Coefficient of Variation)
3.5 SD(표준 편차: Standard Deviation)
3.6 hALB(인간 알부민: human Albumin)
3.7 BCMA(B-세포 성숙 항원: B-cell Maturation Antigen)
3.8 VCN(벡터 카피 수: Vector Copy Number)
4.0 장비
4.1 96 웰 PCR 플레이트를 회전시킬 수 있는 원심분리기(예를 들어, Beckman Coulter, SX4750 로터 및 96 웰 플레이트용 스윙 세트를 갖는 Allegra X-14R)
4.2 QuantStudio 6 실시간 PCR 시스템
4.3 -70℃가 가능한 냉동고
4.4 -20℃가 가능한 냉동고
4.5 보정된 8 또는 12 채널 피펫(20, 50 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin 피펫
4.6 보정된 단일 채널 피펫(20, 100, 200, 1000 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin 피펫
4.7 2 내지 8℃를 유지할 수 있는 냉장고 또는 냉장실
4.8 QuantStudio PCR 소프트웨어 v1.3 이상
4.9 와동 혼합기
4.10 생물안전 작업대
5.0 물질
참고: "예를 들어"로 지정된 물질은 이전의 적격성 평가 없이 유사한 물질로 대체될 수 있다.
"또는 등가물"로 지정된 물질의 경우, 샘플을 시험하는 데 사용하기 전에 대체물이 동등함을 입증해야 한다.
5.1 DNase/RNase 무함유수, 예를 들어, Invitrogen Cat# 10977015.
5.2 TaqPath ProAmp 마스터 믹스, ThermoFisher Cat# A30866, 또는 등가물.
5.3 적격인 로트의 BCMA 이식유전자 및 ALB 프라이머 및 프로브, IDT를 통한 사용자 지정 서열 또는 등가물.
5.4 적격인 로트의 BCMA 이식유전자 표준 #1
5.5 적격인 로트의 BCMA 이식유전자 중간 및 하위 대조군
5.6 1X 낮은 EDTA TE 완충제 pH 8.0, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Quality Biological Cat# 351-324-721.
5.7 0.5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 022431005
5.8 1.5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 022431021
5.9 2 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat#022431048
5.10 5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat#0030119460
5.11 피펫 팁, 멸균, 여과됨(20, 200, 1000 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin Cat# 30389226, 30389240, 30398213
5.12 96 웰 PCR 플레이트, Applied Biosystems, Cat# 4483343, 4483354, 4483349, 4483350, 4483395, 또는 등가물
5.13 Micro Amp 광학 접착 필름, Applied Biosystems, Cat# 4311971, 또는 등가물
5.14 시약 저장소, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, VistaLabs Cat# 3054-1002
6.0 주의사항
6.1 실험실에서 작업할 때는 적절한 PPE를 착용한다.
6.2 위험한 화학물질 작업에 대한 현장별 지침을 따른다. 자세한 내용은 제조업체의 SDS를 참조한다.
6.3 모든 피펫팅 단계는 BSC에서 무균 기법을 사용하여 수행해야 한다. 분석자는 임의의 물질 또는 시약에 대한 오염 위험을 최소화하기 위해 절차의 모든 단계 동안 일회용 슬리브 덮개(sleeve cover)를 착용하는 것이 바람직하다.
7.0 절차
7.1 하기에 대한 각각의 분취물을 수득한다:
7.1.1 BCMA 이식유전자 순방향 프라이머 10 μM 작업 스톡
7.1.2 BCMA 이식유전자 역방향 프라이머 10 μM 작업 스톡
7.1.3 BCMA 이식유전자 프로브 10 μM 작업 스톡
7.1.4 hALB 순방향 프라이머 10 μM 작업 스톡
7.1.5 hALB 역방향 프라이머 10 μM 작업 스톡
7.1.6 hALB 프로브 10 μM 작업 스톡
7.1.7 적격인 BCMA 이식유전자 qPCR 표준 #1
7.1.8 적격인 BCMA 이식유전자 qPCR 2.00 카피/세포 중간 대조군
7.1.9 적격인 BCMA 이식유전자 qPCR 0.20 카피/세포 하위 대조군
7.2 표 6에 따라 적절한 수의 반응에 대한 멀티플렉스 마스터 믹스를 제조한다. 분석에서 실제로 실행되는 것보다 더 많은 샘플을 포함함으로써, 추가적인 초과 반응을 추가할 수 있다. 예를 들어, 10개의 샘플이 실행되지만 아래 표의 계산에 이미 포함된 10개의 초과 반응보다 초과로 필요한 경우, 11개의 샘플이 실행된다고 표시한다(즉, N=11). 각각의 추가 샘플은 3개의 반응의 부피를 첨가한다.
[표 6]
Figure pct00006
7.3 마스터 믹스 튜브를 잠시 와동 혼합하고 따로 저장한다.
7.4 표 7에 따라 낮은 EDTA TE 완충제를 사용하여 표준 #2 내지 5를 제조한다. 다음 희석액을 제조하기 전에 각각의 희석액을 잠시 혼합해야 한다.
[표 7]
Figure pct00007
5 7.5 마스터 믹스 용액을 다시 잠시 와동 혼합하고 상기 믹스를 시약 저장소로 피펫팅한다.
7.6 다중채널 피펫을 사용하여 96 웰 PCR 플레이트의 적절한 웰에 20 μL의 마스터 믹스를 피펫팅한다(도 9 참조).
7.7 도 9의 플레이트 레이아웃에 따라 단일 채널 피펫을 사용하여 96 웰 PCR 플레이트의 적절한 웰에 5 μL의 표준, 대조군 및 샘플 DNA를 로딩한다. NTC 웰에 5 uL의 낮은 EDTA TE 완충제를 로딩한다.
7.8 광학 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하고 약 300 x g에서 잠시 원심분리한다.
7.9 PCR 기기에 PCR 플레이트를 로딩한다.
7.10 "Assay Template.edt"를 열고 "다른 이름으로 저장(Save As)"을 선택하고 qPCR 실험에 대한 적절한 이름을 입력하고.eds 파일로 저장한다. 템플릿 파일(template file) 위에 저장하지 않는다.
7.11 명칭 섹션에 실험에 대한 명칭을 입력한다.
7.12 실험 속성(Experiment Properties)이 하기에 명시된 대로 설정되고 열 순환 조건(방법 실행(Run Method) 탭)이 25 uL 반응 부피를 사용하여 표 8에 명시된 것들에 따라 올바르게 설정되었는지를 확인한다.
7.12.1 기기 유형: QuantStudio 6 Flex 시스템
7.12.2 블록 유형: 96-웰 (0.2 mL)
7.12.3 실험 유형: 표준 곡선
7.12.4 검출 시약: TaqMan 시약
7.12.5 기기 속성: 표준
[표 8]
Figure pct00008
7.13 실행(run)을 선택하고 기기 일련 번호를 클릭하여 분석을 실행한다.
8.0 데이터 분석
8.1 분석(Analyze)을 클릭함으로써 데이터를 분석하는 소프트웨어의 자동 기준선 및 자동 Ct 기능을 사용한다. 그런 다음, 저장(save)을 클릭하여 분석을 저장한다.
8.2 보고서 PDF를 인쇄하고 이를 분석 문서에 포함한다.
8.3 각 샘플 및 양성 대조군에 대한 VCN/세포를 하기와 같이 3중으로 계산한다.
Figure pct00009
8.4 각 샘플 및 양성 대조군에 대한 3중 VCN/세포 값에 대한 평균, 표준 편차 및 %CV를 계산한다.
9.0 분석 허용 기준
9.1 분석 허용 기준
9.1.1 이식유전자 및 hALB 표준 곡선 둘 모두에 대한 R2 값은 ≥ 0.97이어야 한다.
9.1.2 표준 곡선의 기울기는 -3.585 내지 -3.104(90.08 내지 109.97%의 PCR 효율과 동일함)이어야 한다.
9.1.3 표준 중 임의의 것에 대한 Ct 복제물 중 어느 것도 "미확인"일 수 없다.
9.1.4 NTC의 모든 Ct 복제물은 이식유전자 및 hALB 표적 둘 모두에 대해 "미확인"이어야 한다.
9.1.5 표준 #1의 평균 Ct는 이식유전자 표적의 경우 <23.0이어야 하고, hALB 표적의 경우 <22.0이어야 한다.
9.1.6 각 표준에 대한 Ct SD는 이식유전자 및 hALB 표적 둘 모두에 대해 ≤0.60이어야 한다.
9.1.7 중간 및 하위 대조군 둘 모두에 대한 평균 hALB 카피는 30,303.030 카피 +/ - 30%이어야 한다(예상 범위: 21,212.121 내지 39,393.939 카피).
9.1.8 2.00 VCN/세포 중간 대조군 및 0.20 VCN/세포 하위 대조군에 대한 평균 VCN/세포 결과는 각 대조군에 대한 표적 VCN/세포 값의 +/- 35%이어야 한다.
9.1.9 중간 및 하위 양성 대조군 VCN/세포 복제물에 대한 %CV는 ≤20%이어야 한다.
9.1.10 상기 기준 중 하나라도 충족되지 않으면, 분석이 유효하지 않다.
9.2 샘플 허용 기준
9.2.1 각 샘플의 평균 hALB 카피는 30,303.030 +/- 30%이어야 한다(예상 범위: 21,212.121 내지 39,393.939 카피).
9.2.1.1 샘플 gDNA의 농도가 <0.02 ug/uL인 경우, 반응에 실제로 로딩된 DNA의 양으로부터 해당 샘플에 대한 hALB의 예상 카피를 계산한다.
예: 샘플 gDNA의 농도는 0.01 ug/uL이다. (5 uL)(0.01 ug/uL) = 0.05 ug = 반응 당 50 ng의 샘플 gDNA(50 ng DNA) (1 카피 ALB / 0.0033 ng gDNA) = 15,152 카피 ALB 예상 범위: 10,606 내지 19,697 카피의 ALB
9.2.2 샘플에 대한 3중 hALB 표적 카피 값은 hALB 표준 곡선에 포함되는 Ct 범위 내에 존재해야 한다. Ct 범위는 표준 #1 3중물의 가장 낮은 Ct 값과 표준 #5 3중물의 가장 높은 Ct 값으로 정의된다.
9.2.3 샘플에 대한 3중 이식유전자 표적 카피 값은 303.030의 이식유전자 LOQ 카피보다 높아야 한다.
9.2.3.1 이식유전자 표적에 대한 샘플의 하나 이상의 복제물이 303.030 카피의 이식유전자 LOQ보다 낮은 경우, 상기 샘플은 LOQ 미만으로 보고되어야 한다.
9.2.4 이식유전자 표적에 대한 샘플의 하나 이상의 복제물이 표준 #1에 대한 최저 이식유전자 Ct 값보다 낮은 경우, 상기 샘플은 표준 곡선 범위 초과(Above Standard Curve Range), 샘플 정량 불가능(Sample Unquantifiable)으로 보고되어야 한다. 예를 들어, 샘플의 이식유전자 Ct 값이 20.1, 19.9, 및 20.2이지만 표준 #1에서 달성된 가장 낮은 이식유전자 Ct 값이 단지 20.0인 경우, 상기 19.9 샘플 복제물은 정확하게 정량화될 수 없으므로 상기 샘플은 표준 곡선 범위 초과, 샘플 정량 불가능으로 보고되어야 한다. 샘플이 정량 불가능한 것으로 결정되면 관리자 및 연구 책임자에게 알린다.
9.2.5 샘플 VCN/세포 복제물의 %CV는 ≤20%이어야 한다.
참고: LOQ 미만의 복제물을 갖는 샘플 또는 정량 불가능한 것으로 결정된 샘플에서 대해서는 %CV가 접근되지 않는다.
9.2.6 LOQ를 초과하는 모든 3중 이식유전자 카피 값을 가지며 위의 모든 허용 기준을 충족하는 임의의 샘플은, 평균 VCN/세포 값을 소수점 이하 2자리까지 보고한다(예를 들어, 2.02 VCN/세포).
9.2.7 위의 모든 허용 기준을 충족하지 않는 임의의 샘플은 유효하지 않다.
게놈 DNA 단리, 적격성 평가 및 희석
1.0 목적
1.1 CAR T 샘플 또는 모의 T-세포 현탁액 또는 동결된 세포 펠렛으로부터 gDNA를 단리하고 정량화하는 예시적인 절차를 기술하였다.
2.0 범위
2.1 하기로부터 gDNA를 단리하는 것에 대한 절차를 기술한다:
2.1.1 동결된 세포 펠렛 또는 신선한 세포 현탁액으로 제공된 수확-후 CAR T 세포 샘플
2.1.2 동결된 세포 펠렛 또는 신선한 세포 현탁액으로 제공된 모의 T-세포
3.0 장비
3.1 1.5 mL 및 5 mL 미세원심분리기 튜브를 회전시킬 수 있는 원심분리기(예를 들어, Beckman Coulter, 1.5 mL 미세원심분리기 튜브용 어댑터를 갖는 SX4750 로터를 갖는 Allegra X-14R)
3.2 Qubit 4 형광계, Invitrogen Cat # Q33226
3.3 -70℃가 가능한 냉동고
3.4 -20℃가 가능한 냉동고
3.5 보정된 단일 채널 피펫(20, 100, 200, 1000 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin 피펫
3.6 55℃가 가능하고 1.5 mL 및 2 mL 미세원심분리기 튜브에 적합한 열 블록
3.7 2 내지 8℃를 유지할 수 있는 냉장고 또는 냉장실
3.8 와동 혼합기
3.9 생물안전 작업대
4.0 물질
참고: "예를 들어"로 지정된 물질은 이전의 적격성 평가 없이 유사한 물질로 대체될 수 있다. "또는 등가물"로 지정된 물질의 경우, 샘플을 시험하는 데 사용하기 전에 대체물이 동등함을 입증해야 한다.
4.1 DNase/RNase 무함유수, 예를 들어, Invitrogen Cat# 10977015.
4.2 L-글루타민 및 25 mM HEPES가 포함된 RPMI 1640 배지, 예를 들어, Corning Cat# 10-041-CV
4.3 1X 낮은 EDTA TE 완충제 pH 8.0, RNase/DNase 무함유, 분자 생물학 등급, 예를 들어, Quality Biological Cat# 351-324-721.
4.4 200 프루프(Proof) (96 내지 100%) 에탄올 분자 생물학 등급, 예를 들어, Decon Labs Cat# 3616EA
4.5 10X PBS 분자 생물학 등급, 예를 들어, Affymetirx Cat# 75889
4.6 PureLink Genomic DNA 미니 키트, Invitrogen Cat# K182001
4.7 QubitTM 분석 튜브, InvitrogenTM Cat# Q32856(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재). 4.9 Qubit dsDNA BR 분석 키트, Invitrogen Cat# Q328350
4.9 0.5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 022431005
4.10 1.5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 022431021
4.11 2 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 022431048
4.12 5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat#0030119460
4.13 15 mL 원뿔형 튜브, 멸균, 예를 들어, Corning Cat# 431470
4.14 피펫 팁, 멸균, 여과됨(20, 200, 1000 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin Cat# 30389226, 30389240, 30398213
5.0 주의사항
5.1 실험실에서 작업할 때는 적절한 PPE를 착용한다.
5.2 위험한 화학물질 작업에 대한 현장별 지침을 따른다. 자세한 내용은 제조업체의 SDS를 참조한다.
5.2 모든 피펫팅 단계는 BSC에서 무균 기법을 사용하여 수행해야 한다. 분석자는 임의의 물질 또는 시약에 대한 오염 위험을 최소화하기 위해 절차의 모든 단계 동안 일회용 슬리브 덮개를 착용하는 것이 바람직하다.
6.0 절차
6.1 새로운 PureLink 게놈 DNA 미니 키트를 개방할 때, 각 병 표지의 지침에 따라 세척 완충제 1 및 세척 완충제 2의 병에 에탄올을 첨가해야 한다. 에탄올을 첨가한 후 병을 잘 섞고 각 표지에 에탄올이 첨가되었음을 표시한다. 에탄올 첨가 표시와 함께 이니셜과 날짜를 포함한다. 모든 성분이 실온에서 저장되는 경우, 상기 키트는 최대 1년 동안 안정적이다.
6.2 열 블록을 55℃로 설정하고 DNA 추출을 시작하기 전에 온도에 도달하도록 한다.
6.3 DNA 추출은 세포 펠렛을 사용하여 수행한다. 신선한 세포 펠렛 또는 -70℃에서 동결 저장된 세포 펠렛을 사용할 수 있다. 컬럼 당 최소 2x106개의 세포가 추출되는 것이 바람직하지만, 컬럼 당 최대 4x106개 정도의 생존 가능한 세포가 추출될 수 있다.
참고: 제조업체 사양에는 컬럼 당 최대 5x106개의 세포가 추출될 수 있다고 명시되어 있는 반면, 이 방법은 생존 가능한 세포 수를 사용하여 DNA 단리를 수행할 세포의 수를 결정한다. 따라서, 세포 현탁액에도 존재할 죽은 세포의 존재를 허용하기 위해 20% 완충제가 제공된다. 컬럼 당, 명시된 4x106개의 생존 가능한 세포를 초과하지 않도록 한다. 퍼센트 생존율이 80% 미만인 경우, 세포 현탁액에 존재하는 >20%의 죽은 세포를 보상하기 위해, 컬럼 당 추출된 생존 가능한 세포의 최대 수는 감소되어야 한다.
6.4 신선한 세포 현탁액으로부터의 세포 펠렛의 제조.
6.4.1 NC-200을 계산하려면 적어도 150 uL 분취량의 세포 현탁액이 필요하다. 분취량은 NC-200의 동적 범위(5.0 x 104- 5.0 x 106개 세포/ml) 내에서 유지하는 데 필요한 RPMI 배지 내의 스톡 세포 현탁액의 희석액일 수 있다.
6.4.2 계산 프로토콜을 사용하여 세포를 계산한다.
6.4.3 생존 가능한 세포 수를 사용하여, PureLink 컬럼 당 추출할 세포의 원하는 수를 달성하는 데 필요한 세포의 부피를 결정하고, 세포 현탁액을 1.5 mL 또는 2 mL 미세원심분리기 튜브로 분취한다.
예를 들어, NC-200로부터의 생존 가능한 세포 수는 2x107개 세포/mL이고 퍼센트 생존율은 88%이다. PureLink 컬럼 당 추출할 세포의 원하는 수는 4x106개의 생존 가능한 세포이다:
Figure pct00010
200 uL의 세포 현탁액을 1.5 mL 또는 2 mL 미세원심분리기 튜브로 분취한다.
6.4.3.1 미세원심분리기 튜브 당 100 uL 미만의 세포를 분취하는 것은 권장되지 않는다. 필요한 경우, 튜브 당 최소 100 uL의 세포 현탁액을 분취할 수 있는 세포 수를 달성하기 위해, RPMI 배지에 세포를 희석한다.
6.4.4 실온에서 5분 동안 300xg에서 튜브를 원심분리하여 세포를 펠렛화한다.
6.4.5 세포 펠렛(들)으로부터 배지를 조심스럽게 제거하고 폐기한다.
6.4.6 세포 펠렛(들)은 DNA를 단리하는 데 직접 사용되거나 -70℃에서 저장될 수 있다
6.5 DNA 추출:
6.5.1 동결된 세포 펠렛으로부터 추출하는 경우, DNA 추출 절차를 시작하기 전에 실온에서 세포 펠렛을 해동한다.
6.5.2 RNase/DNase 무함유수를 사용하여 10X PBS 완충제를 1X로 희석한다. 세포 펠렛 당 200 uL의 1X PBS가 사용된다. 추출될 세포 펠렛의 총 수를 재현탁시키기에 충분한 1X PBS를 준비한다.
6.5.3 200 uL의 1X PBS에 각 세포 펠렛을 재현탁시킨다. 세포 펠렛이 완전히 재현탁되도록 피펫 혼합한다.
6.5.4 각 튜브에 20 uL의 프로테이나제 K를 첨가하고 잠시 와동 혼합한다.
6.5.5 각 튜브에 20 uL의 RNase A를 첨가하고 잠시 와동 혼합한다.
6.5.6 실온에서 2분 동안 튜브를 배양한다.
6.5.7 200 uL의 PureLink 게놈 용해/결합 완충제(PureLink Genomic Lysis/Binding Buffer)를 각 튜브에 첨가하고 잠시 와동 혼합하여 균질한 용액을 수득한다.
6.5.8 미리 예열된 55℃ 열 블록에 튜브를 배치하고 10분 동안 배양한다.
6.5.9 배양이 완료되면, 열 블록으로부터 튜브를 제거하고 각 튜브에 200 uL의 96 내지 100% 에탄올을 첨가한다. 잠시 와동 혼합하여 균질한 용액을 생성한다.
참고: 55℃에서 배양하는 동안 튜브 뚜껑에 응결이 축적된다 튜브를 개방할 때 내용물이 뚜껑으로부터 튀지 않도록 주의한다.
6.5.10 각 샘플 튜브를 위한 수집 튜브에 단일 PureLink 스핀 컬럼(PureLink Spin Column)을 설치한다. 샘플이 실수로 섞이지 않도록 각 스핀 컬럼의 뚜껑에 특정 샘플 식별자로 표지한다. 예를 들어, 스핀 컬럼에 샘플 로트#로 표지할 수 있다. 수집 튜브는 추출 프로토콜 전반에 걸쳐 주기적으로 폐기되므로, 수집 튜브에는 표지하지 않는다.
6.5.11 단계 5.5.9로부터의 각 샘플 튜브의 내용물을 해당하는 표지된 스핀 컬럼에 첨가한다.
6.5.12 실온에서 1분 동안 10,000 x g에서 컬럼(들)을 원심분리한다. 원심분리하는 동안, 각 샘플에 대해 새로운 깨끗한 수집 튜브를 설치한다.
6.5.13 원심분리 후, 원심분리기로부터 스핀 컬럼/수집 튜브를 제거한다. 각 스핀 컬럼을 새로운 깨끗한 수집 튜브로 옮기고 통과액과 함께 기존 수집 튜브를 폐기한다.
6.5.14 각 스핀 컬럼에 500 uL의 세척 완충제 1을 첨가한다.
6.5.15 실온에서 1분 동안 10,000 x g에서 컬럼(들)을 원심분리한다. 원심분리하는 동안, 각 샘플에 대해 새로운 깨끗한 수집 튜브를 설치한다.
6.5.16 원심분리 후, 원심분리기로부터 스핀 컬럼/수집 튜브를 제거한다. 각 스핀 컬럼을 새로운 깨끗한 수집 튜브로 옮기고 통과액과 함께 기존 수집 튜브를 폐기한다.
6.5.17 각 스핀 컬럼에 500 uL의 세척 완충제 2를 첨가한다.
6.5.18 실온에서 3분 동안 최대 속도로 컬럼(들)을 원심분리한다. 원심분리하는 동안 각 샘플에 대해 단일 2 mL 미세원심분리기 튜브를 설치한다.
6.5.19 원심분리 후, 원심분리기로부터 스핀 컬럼(들)/수집 튜브를 제거한다. 각 스핀 컬럼을 2 mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고 통과액과 함께 기존 수집 튜브를 폐기한다. 참고: 단계 5.5.19에 대해 PureLink 키트에 제공된 수집 튜브를 사용하지 않는다. 상기 키트는 추가된 원심분리 단계를 위한 추가 튜브를 제공하지 않으므로, 2 mL 미세원심분리기 튜브를 사용해야 한다.
6.5.20 실온에서 최대 속도로 2분 동안 컬럼(들)을 원심분리하여 컬럼을 건조한다. 원심분리하는 동안, 각 샘플에 대해 단일 1.5 mL 미세원심분리기 튜브를 설치한다. 각 튜브에 최소한도로 샘플 명칭과 추출 날짜로 표지한다. 이들은 DNA가 용출될 튜브이다.
6.5.21 원심분리 후, 원심분리기로부터 스핀 컬럼(들)/튜브(들)를 제거한다. 각 스핀 컬럼을 해당하는 표지된 1.5 mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고, 임의의 통과액과 함께 2 mL 미세원심분리기 튜브를 폐기한다.
6.5.22 컬럼에 25 uL의 PureLink 게놈 용출 완충제(PureLink Genomic Elution Buffer)를 첨가한다. 실리카 멤브레인 위에 용출 완충제를 배치해야 하며, 피펫 팁으로 멤브레인을 건드리거나 뚫지는 않아야 한다.
6.5.23 실온에서 1분 동안 컬럼을 배양한다.
6.5.24 실온에서 1분 동안 최대 속도로 컬럼(들)/튜브(들)를 원심분리하여 DNA를 용출한다.
6.5.25 원심분리기로부터 컬럼(들)/튜브(들)를 제거하고 25 uL의 추가적인 PureLink 게놈 용출 완충제를 사용하여 단계 5.5.22 내지 5.5.23을 반복한다.
6.5.26 배양 후, 실온에서 1.5분 동안 최대 속도로 컬럼(들)/튜브(들)를 원심분리하여 추가 DNA를 용출한다.
6.5.27 원심분리기로부터 컬럼(들)/튜브(들)를 제거한다. 1.5 mL 튜브로부터 컬럼을 제거하고 컬럼을 폐기한다.
6.5.28 용출된 DNA를 -20℃에 저장하거나, 또는 즉시 정량화하고 작업 농도로 희석할 수 있다.
참고: 정량화 후 작업 농도로 즉시 희석되지 않는 한, DNA를 정량화하지 않는다. 샘플이 정량화되지만 qPCR 작업 농도로 즉시 희석될 수 없는 경우, 샘플을 -20℃에 놓아 두어야 하며, 해동 후 qPCR 작업 농도로 희석하기 전에 재정량화해야 한다.
6.6 DNA 정량화:
6.6.1 Qubit dsDNA 광범위 키트(Qubit dsDNA Broad Range kit)와 Qubit 4 형광계를 사용하여 DNA를 정량화한다. 상기 키트는 RNA보다 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 대해 선택성이 높으며, 100 pg/uL 내지 1,000 ng/uL의 초기 샘플 농도에 대해 정확하도록 설계되었다. 모든 키트 성분은 BSC에서 취급되어야 하며 임의의 키트 성분의 오염을 방지하기 위해 무균으로 처리되어야 한다.
참고: Qubit dsDNA BR 시약은 DMSO를 함유하고 있으며 실온 미만의 온도에서 동결된다. Qubit 시약의 반복적인 동결/해동 주기를 피해야 하므로, 상기 시약은 실온에서 저장되어야 한다. Qubit 완충제는 실온에서 저장되도록 설계되었으며 권장 저장 조건이다. Qubit 표준은 2 내지 8℃에서 저장해야 한다.
6.6.2 Qubit 4 형광계는 Qubit dsDNA 광범위 키트에 제공된 2개의 표준을 사용하여 보정된다. 표준을 준비하고 정량화할 각 DNA 샘플 세트와 함께 실행해야 한다. 동일한 Qubit 작업 용액을 사용하여 표준과 DNA 샘플을 제조하는 경우 가장 정확한 정량화가 달성되므로, 이전 실행으로부터의 보정을 재사용하지 않는다.
6.6.3 정량화할 각 표준 및 샘플에 대한 하나의 Qubit 분석 튜브에 표지한다. 튜브의 뚜껑에만 표지한다. 정량화를 방해할 수 있으므로 튜브의 측면에는 표지하지 않는다.
참고: Qubit 형광계에서는 Qubit 분석 튜브만 사용할 수 있다. 이 튜브는 가장 정확한 결과를 제공하도록 특별히 설계되었다.
6.6.4 Qubit dsDNA BR 완충제에 Qubit dsDNA BR 시약을 1:200 희석함으로써 Qubit 작업 용액을 제조한다. 정량화할 표준과 모든 샘플 둘 모두를 수용할 수 있는 충분한 작업 용액을 제조해야 한다. 필요한 최소 부피는 (2 (2 표준) + 정량할 샘플 수 +1)*200이다.
예를 들어, 8개의 샘플을 정량화하려면, 샘플 및 2 표준 + 과잉 공급을 위한 적어도 하나의 추가 샘플을 위해 충분한 작업 용액을 제조한다. 11개의 튜브(8+2+1 = 11개 샘플) 내의 튜브 당 200 uL의 작업 시약을 가정한다: (200 uL)(11개의 튜브) = 2200 mL의 Qubit 작업 용액 (11 uL의 Qubit 시약 + 2189 uL의 Qubit 완충제).
6.6.5 2개의 표준 튜브 각각에 190 uL의 Qubit 작업 용액을 첨가한다. 반응에 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해, 튜브에 용액을 첨가하기 전에 피펫 팁을 Qubit 작업 용액으로 미리 적신다.
6.6.6 200 uL의 총 부피 분석 튜브 부피를 갖는 Qubit dsDNA 광범위 키트를 사용한 정량화를 위해 3 내지 20 uL의 샘플 DNA가 사용될 수 있다. 각 분석 튜브에 필요한 부피의 Qubit 작업 용액을 첨가한다. 예를 들어, 3 uL의 샘플이 정량화에 사용되는 경우, 샘플 튜브에 197 uL의 Qubit 작업 용액을 첨가한다. 튜브에 용액을 첨가하기 전에 피펫 팁을 Qubit 작업 용액으로 미리 적신다.
6.6.7 적절한 표준 튜브에 10 uL의 각 표준을 첨가한다. 각 표준 튜브를 잠시 와동 혼합한다.
6.6.8 필요한 양의 샘플 스톡 DNA를 적절한 샘플 튜브에 첨가하여 총 반응 부피가 200 uL가 되도록 한다. 예를 들어, 197 uL의 Qubit 작업 용액을 함유하는 샘플 반응 튜브로 3 uL의 샘플 DNA. 각 샘플 튜브를 잠시 와동 혼합한다.
6.6.9 실온에서 2분 동안 모든 표준 및 샘플 튜브를 배양한다.
6.6.10 먼저, 표준을 사용하여 Qubit 4 형광계를 보정한다.
6.6.10.1 형광계의 화면을 탭(tap)하여, 기기를 대기 모드에서 해제한다.
6.6.10.2 홈(home) 화면에서 dsDNA 옵션(dsDNA option)을 선택한다.
6.6.10.3 다음 화면에서, dsDNA: 광범위(dsDNA: Broad range)를 선택한다.
6.6.10.4 형광계가, 새 표준을 판독할지 이전 보정을 사용할지 선택하라는 메시지를 표시한다. 항상 표준 판독(Read Standards)을 선택한다. 참고: 이전 보정을 사용하여 샘플을 판독하면(샘플 실행(Run samples) 선택) 가장 정확한 샘플 농도가 생성되지 않으므로, 이를 선택하지 않아야 한다.
6.6.10.5 메시지가 표시되면, 표준 #1 샘플을 Qubit에 삽입한다. 샘플 챔버의 뚜껑을 닫는다. 표준 판독을 선택하여 표준 #1을 판독한다.
6.6.10.6 메시지가 표시되면, 샘플 챔버에서 표준 #1을 제거하고 표준 #2를 삽입한다. 샘플 챔버 뚜껑을 닫고 표준 판독을 선택하여 표준 #2를 판독한다.
6.6.10.7 보정이 성공하면, 표준 #2를 판독한 후 Qubit이 보정 결과를 표시한다.
보정이 실패하면, Qubit은 보정 오류(Calibration error) 메시지를 표시한다.
6.6.10.8 표준 #2에 대해 제시된 판독값이 표준 #1에 대해 제시된 판독값보다 적어도 10배 큰지 확인한다.
6.6.10.9 보정 오류가 표시되거나, 표준 #2가 표준 #1보다 10배 크지 않은 경우. 신선한 Qubit 작업 용액을 사용하여 샘플과 표준을 다시 제조해야 한다. 이전 Qubit 작업 용액을 제조하기 위해 사용된 튜브를 재사용하지 않는다. 신선한 표준을 사용하여 보정을 반복한다.
6.6.10.9.1 보정에 합격하고, 표준 #2에 대해 제시된 판독값이 표준 #1에 대해 제시된 판독값보다 적어도 10배 큰 경우, 샘플 판독을 계속한다(단계 5.6.9.10 내지 5.6.9.14 참조).
6.6.10.9.2 또 다른 보정 오류가 표시되거나, 표준 #2가 표준 #1보다 10배 크지 않은 경우, 분석 SME 또는 관리자에게 문의한다.
6.6.10.10 보정이 성공한 것으로 확인되면 표준 결과(Standards results) 화면 하단에서 샘플 실행을 선택하여 샘플 실행을 시작한다.
6.6.10.11 제1 샘플을 실행하기 전에 샘플 부피 화면이 표시된다. + 또는 - 기호를 사용하여 실행할 모든 샘플에 대해 사용되는 샘플 부피(3 내지 20 uL)를 선택한다. 그런 다음, 드롭다운 메뉴에서 샘플 농도의 출력 단위(ug/uL)를 선택한다.
6.6.10.12 올바른 샘플 부피와 샘플 농도 단위가 선택되고 나면, 샘플 1을 샘플 챔버에 삽입한다. 샘플 챔버 뚜껑을 닫고 튜브 판독(Read tube)을 선택한다.
6.6.10.13 원래의 계산된 샘플 농도와 Qubit 튜브 내의 샘플 농도 둘 모두가 표시된다. 원래의 계산된 샘플 농도는 스톡 DNA 샘플의 농도이다.
6.6.10.13.1 샘플 농도가 키트 범위를 벗어나면, 범위 넘음 오류(Out of Range error)가 표시된다.
6.6.10.13.2 오른쪽 화살표를 눌러 표준 및 샘플 결과의 그래프를 열어서, 샘플이 너무 높거나 너무 낮은지 여부를 확인한다.
6.6.10.13.3 범위를 벗어난 샘플은 다시 실행해야 한다. 너무 낮은 샘플 농도에 대해서는 더 큰 샘플 부피를 사용한다. 너무 높은 샘플 농도에 대해서는, 더 작은 샘플 부피 또는 스톡 DNA의 희석액(낮은 EDTA TE 완충제로 제조됨)을 사용한다.
반복 샘플은 새로운 표준에 대해 실행되어야 한다. 샘플과 표준 둘 모두는 신선한 Qubit 작업 용액을 사용하여 준비되어야 한다(이전 Qubit 작업 용액을 위한 튜브를 재사용하지 않는다).
6.6.10.14 샘플 챔버로부터 샘플 1을 제거한다. 하나 초과의 샘플을 판독해야 하는 경우, 다음 샘플을 샘플 챔버에 삽입하고, 샘플 챔버 뚜껑을 닫고 튜브 판독을 선택한다.
6.6.10.15 모든 샘플이 실행될 때까지 5.6.9.14를 계속 반복한다.
6.6.10.16 Qubit 형광계와 함께 제공된 USB 케이블을 사용하여 Qubit을 컴퓨터에 연결하고, 자동 실행(AutoPlay) 창이 열리면, 장치 열기(Open device)를 선택하여 파일을 본다. 컴퓨터에서 임의의 추가 선택을 하기 전에, Qubit에서 단계 5.6.9.17을 계속 진행한다.
6.6.10.17 마지막으로 판독된 샘플에 대한 샘플 농도(Sample concentration) 화면 또는 홈 화면에서 데이터(Data)를 선택하여, Qubit에서 실행된 분석의 목록을 보여주는 데이터 내보내기(Export data) 화면을 연다.
데이터는 분석별로 나열되며, 분석 날짜/시간, 분석 명칭(dsDNA 광범위) 및 해당 분석에서 실행된 샘플(들)의 수를 보여준다.
참고: Qubit 4 형광계는 최대 1000개의 샘플에 대한 데이터를 저장한다.
6.6.10.18 내보낼 분석 데이터 옆에 있는 상자를 터치한다. 상자에 확인(check) 표시가 나타난다. 그런 다음, 내보내기(Export)를 선택하여 전체 데이터 세트를 컴퓨터로 내보낸다.
6.6.10.19 컴퓨터에서, 내부 저장소(Internal storage)를 더블 클릭한 다음, Qubit 4 폴더를 더블 클릭하여, 내보낸 데이터에 접근한다.
참고: 폴더 명칭은, 내보낸 데이터가 실행된 날짜가 아니라 데이터를 내보낸 날짜를 사용하여, QubitData_Day-Month-Year로 지정된다.
6.6.10.20 데이터 폴더를 열고 QubitData_Day-Month- Year_Minute-Hour- Seconds.csv 파일을 안전한 데이터 백업 시스템 (예를 들어, OpenLab)에 또는 현장별 절차에 따라 저장한다. 이 파일은 또한 현장별 절차에 따라 분석 문서에 첨부되어야 한다. 참고: 상기 폴더는, RNA IQ 분석에만 해당하는 QubitData_Rna_iq_Day- Month-Year_Minute-Hour-Seconds.csv 파일도 포함한다.
이.csv 파일은 RNA IQ 이외의 분석을 실행할 때는 비어 있으므로 저장할 필요가 없다.
6.6.10.21 상기.csv 파일은 분석 실행에 대한 결과를 포함한다. 결과는 샘플 판독에 대한 역순으로(즉, 판독된 마지막 샘플에서 판독한 첫 번째 샘플로) 제공된다. 시험 날짜(Test Date) 열은 또한 각 샘플이 판독된 시간을 나타내며, 샘플 순서를 확인하는 데 사용될 수 있으며, 먼저 실행된 샘플은 더 빠른 타임 스탬프(time stamp)를 갖고 마지막으로 실행된 샘플은 더 늦은 타임 스탬프를 갖는다.
6.6.10.22 원래의 샘플 농도는 스톡 DNA의 농도이다. Qubit 분석에서 스톡 DNA의 희석이 실행된 경우, 스톡 DNA의 농도를 측정하기 위해, 원래의 샘플 농도는 Qubit 분석에서 사용된 희석된 DNA 스톡의 희석률로 곱해져야 한다. 예를 들어, 낮은 EDTA TE 완충제에 1:10으로 희석된 스톡 DNA 및 3 uL의, Qubit 분석에 사용된 1:10 희석액, Qubit으로부터의 원래의 샘플 농도 값이 0.0561 ug/uL이면, 희석되지 않은 스톡 DNA 농도는 (0.0561 ug/uL)(10) = 0.561 ug/uL이다.
6.7 이식유전자 qPCR 분석에서의 실행 준비 시에서의 샘플 DNA의 희석:
6.7.1.1 낮은 EDTA TE 완충제에 0.020 ug/uL로 샘플을 희석해야 한다. 스톡 DNA를 정량화한 직후. 스톡 DNA 농도가 0.020 ug/uL 미만인 샘플을 단계 5.7.1.5에 따라 분취하고, 아무것도 타지 않고(순수하게) qPCR 분석에서 사용해야 한다.
6.7.1.2 하기 공식을 사용하여, 제조될 수 있는 0.020 ug/uL의 희석된 DNA의 총 부피를 결정한다:
Figure pct00011
6.7.1.3 그런 다음, 스톡 DNA를 0.020 ug/uL로 희석하는 데 필요한 낮은 EDTA TE 완충제의 양을 하기와 같이 결정한다:
Figure pct00012
6.7.1.4 5.7.1.3에서 계산된, 낮은 EDTA TE 완충제의 계산된 부피를 사용하여 원하는 부피의 스톡 DNA를 희석하여 0.020ug/uL 작업 농도의 DNA를 만든다. 가능한 한 많은, 샘플의 일회용 분취량을 만들 수 있도록, 가능한 많은 스톡 DNA를 0.020 ug/uL의 qPCR 작업 농도로 희석하는 것이 바람직하다. 그러나, 최소 3회의 qPCR 분석을 위한 충분한 분취량을 보장하려면, 0.020 ug/uL 샘플 DNA의 최소 3개의 일회용 분취량을 만들어야 한다.
예를 들어, 0.0561 ug/uL의 스톡 DNA 농도. Qubit 분석에서 3 uL의 DNA를 사용한 후, 최소 47 uL의 스톡 DNA가 남는다. 40 uL의 스톡 DNA를 사용하여 0.020 ug/uL의 qPCR 작업 농도로 희석한다.
Figure pct00013
40 uL의 스톡 DNA를 72.2 uL의 낮은 EDTA TE 완충제에 희석하여, 112.2 uL 총 부피의 0.020 ug/uL qPCR 작업 스톡 샘플 DNA를 만든다.
6.7.1.5 0.020 ug/uL 작업 스톡 샘플 DNA의 20 uL 일회용 분취량을 최대한 많이 만든다. 15 uL의 DNA가 각 qPCR 분석에 사용되므로, 각 분취량은 약 5 uL의 초과 DNA를 갖는다. 가능한 한 최소 3개의 일회용 분취량을 만드는 것이 바람직하다.
6.7.1.6 모든 분취량에는 최소한 샘플 명칭, 분취량의 농도(0.020 ug/uL, 또는 스톡 농도가 0.020 ug/uL 미만인 경우, 스톡 농도) 및 분취량이 만들어진 날짜가 표지되어야 한다.
6.7.1.7 모든 분취량뿐만 아니라 임의의 잔류 스톡 샘플 DNA는 -20℃에서 저장해야 한다.
새로운 로트의 올리고의 제조 및 적격성 평가
1.0 목적
1.1 이식유전자 qPCR 방법을 위한 새로운 로트의 올리고를 제조하고 적격성을 평가하기 위한 예시적인 절차를 기술한다.
2.0 장비
2.1 1.5 mL 미세원심분리기 튜브를 회전시킬 수 있는 원심분리기(예를 들어, Beckman Coulter, SX4750 로터 및 96 웰 플레이트용 스윙 세트 및 1.5 mL 미세원심분리기 튜브용 어댑터를 갖는 Allegra X-14R)
2.2 QuantStudio 6 실시간 PCR 시스템
2.3 -20℃가 가능한 냉동고
2.4 보정된 8 또는 12 채널 피펫(20, 50 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin 피펫
2.5 보정된 단일 채널 피펫(20, 100, 200, 1000 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin 피펫
2.6 2 내지 8℃를 유지할 수 있는 냉장고 또는 냉장실
2.7 QuantStudio PCR 소프트웨어 v1.3 이상
2.8 55℃가 가능하고 1.5 mL 미세원심분리기 튜브에 적합한 열 블록
2.9 와동 혼합기
3.0 물질
참고: "예를 들어"로 지정된 물질은 이전의 적격성 평가 없이 유사한 물질로 대체될 수 있다. "또는 등가물"로 지정된 물질의 경우, 샘플을 시험하는 데 사용하기 전에 대체물이 동등함을 입증해야 한다.
3.1 DNase/RNase 무함유수, 예를 들어, Invitrogen Cat# 10977015.
3.2 TaqPath ProAmp 마스터 믹스, ThermoFisher Cat# A30866, 또는 등가물.
3.3 BCMA 이식유전자 및 hALB 프라이머 및 프로브 동결건조 스톡, IDT를 통한 사용자 지정 서열 또는 등가물.
3.4 적격인 로트의 BCMA 이식유전자 및 ALB 프라이머 및 프로브, IDT를 통한 사용자 지정 서열 또는 등가물.
3.5 적격인 로트의 BCMA 이식유전자 표준 #1
3.6 적격인 로트의 BCMA 이식유전자 중간 및 하위 대조군
3.7 1X 낮은 EDTA TE 완충제 pH 8.0, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Quality Biological Cat# 351-324-721.
3.8 0.5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, VWR 스크류-캡 미세원심분리기 튜브(VWR Screw-Cap Microcentrifuge Tube) Cat# 89004-286 또는 Eppendorf Cat# 022431005
3.9 1.5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 022431021
3.10 2 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 022431048
3.11 5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 0030119460
3.12 피펫 팁, 멸균, 여과됨(20, 200, 1000 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin Cat# 30389226, 30389240, 30398213
3.13 96 웰 PCR 플레이트, Applied Biosystems, Cat# 4483343, 4483354, 4483349, 4483350, 4483395, 또는 등가물
3.14 Micro Amp 광학 접착 필름, Applied Biosystems, Cat# 4311971, 또는 등가물
3.15 시약 저장소, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, VistaLabs Cat# 3054-1002
4.0 주의사항
4.1 실험실에서 작업할 때는 적절한 PPE를 착용한다.
4.2 위험한 화학물질 작업에 대한 현장별 지침을 따른다. 자세한 내용은 제조업체의 SDS를 참조한다.
4.3 모든 피펫팅 단계는 BSC에서 무균 기법을 사용하여 수행해야 한다. 분석자는 임의의 물질 또는 시약에 대한 오염 위험을 최소화하기 위해 절차의 모든 단계 동안 일회용 슬리브 덮개를 착용하는 것이 바람직하다.
6.0 절차
참고: 올리고는 멀티플렉스 세트(BCMA 이식유전자 및 hALB)로서 적격이다. 세트 내의 6개의 올리고 중 임의의 것의 마지막 분취량이 사용되고 나면, 하나의 로트의 올리고가 고갈된다. 하나의 적격인 세트로부터의 올리고를 또 다른 세트로부터의 것과 혼합 및 매칭시키지 않는다. 고갈된 이전의 적격인 세트로부터의 임의의 잔류 올리고는 폐기되어야 한다.
6.1 BCMA 이식유전자 올리고 및 hALB 올리고를 주문한다(서열에 대해서는 표 9 참조).
[표 9]
Figure pct00014
6.2 올리고는, 각 올리고에 대한 사양 시트와 함께 공급업체로부터 동결건조되어 공급된다. 동결건조된 올리고는 재구성할 준비가 될 때까지 -20℃에서 저장한다. 동결건조된 올리고는 최대 12개월 동안 -20℃에서 저장할 수 있다. 참고: 제조업체로부터 올리고를 수령하는 데 평균적으로 적어도 2주가 소요된다. 따라서, 새로운 또는 적격인 로트의 올리고에서 문제가 발생할 경우 샘플 시험에 대한 영향을 최소화하기 위해, 적어도 하나의 동결건조된 예비 올리고 세트를 항상 보관해야 한다.
6.3 올리고 재구성
6.3.1 동결건조된 올리고 스톡을 -20℃로부터 제거하고 30초 동안 10,000 x g에서 원심분리하여, 모든 올리고 스톡이 튜브 바닥으로 내려오게 한 다음, 튜브를 연다.
운송 중 튜브 바닥으로부터 벗어난 임의의 올리고의 손실을 방지하기 위해, 원심분리하기 전에 튜브를 열지 않는다.
6.3.2 낮은 EDTA TE 완충제를 사용하여 각 올리고를 100 uM 스톡으로 하기와 같이 재구성한다:
6.3.2.1 개별 올리고 사양 시트에서 각 올리고에 대한 nmole 수량을 찾는다.
6.3.2.2 100 uM 스톡을 생성하기 위해 올리고 튜브에 첨가해야 하는 TE 완충제의 부피를 얻기 위해, nmole 수량에 10을 곱한다.
6.3.2.3 각 올리고 튜브에, 각 올리고에 대해 단계 11.3.2.2에서 계산된 TE 완충제의 부피를 첨가한다.
6.3.2.4 각 올리고 튜브를 잠시 와동시켜, 동결건조된 올리고를 TE 완충제에 완전히 재현탁시킨다.
6.3.2.5 모든 동결건조된 올리고가 TE 완충제에 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 프라이머 튜브를 확인한다. TE 완충제에 완전히 용해되지 않은 올리고 입자가 일부 존재하는 것으로 보이는 경우, 55℃에서 1 내지 5분 동안 튜브를 가열하여 재현탁을 돕는다. 가열 후, 튜브를 잠시 다시 와동시킨다.
6.3.3 올리고 작업 스톡 농도로의 100 uM 스톡의 희석
6.3.3.1 낮은 EDTA TE 완충제를 사용하여 100 uM 프라이머 스톡을 10 uM 작업 스톡으로 희석한다.
6.3.3.2 낮은 EDTA TE 완충제를 사용하여 100 uM 프로브 스톡을 10 uM 작업 스톡으로 희석한다.
[표 10]
Figure pct00015
6.3.3.3 0.5 mL 스크류-캡 튜브에 모든 프라이머의 20 uL 분취량과 모든 프로브의 35 uL 분취량을 만든다. 명시된 분취량 부피는 절반 PCR 플레이트 분석에 충분하다. 프라이머 및 프로브는, 필요한 경우 전체 플레이트 분석까지 지원하도록 더 큰 부피로 분취될 수 있다.
6.3.3.4 모든 분취량에 최소 정보를 표지한다:
6.3.3.4.1 올리고 명칭
6.3.3.4.2 uM 농도
6.3.3.4.3 로트#
6.3.3.4.4 유효 기간(재구성 날짜로부터 1년)
6.3.3.4.5 모든 작업 스톡을 -20℃에서 저장한다.
6.3.4 새로운 로트의 올리고의 적격성 평가
6.3.4.1 하기 프로토콜에 따라, 적격인 로트의 표준 #1, 중간 및 하위 대조군을 사용하는 최소 3개의 독립적인 이식유전자 qPCR 분석에서, 현재 적격인 로트의 올리고와 새로운 로트의 올리고를 실행한다.
6.3.4.1.1 3개의 분석 각각에 대해 2개의 마스터 믹스가 설정되며, 하나의 마스터 믹스는 현재 적격인 로트의 올리고를 사용하여 제조되고, 제2 마스터 믹스는 새로운 로트의 올리고를 사용하여 제조된다.
6.3.4.1.2 플레이트 맵에 따라 qPCR 플레이트를 로딩한다.
6.3.4.1.3 "Oligo Qualification.edt" 템플릿을 열고 "다른 이름으로 저장"을 선택하고 qPCR 실험에 대한 적절한 명칭을 입력하고.eds 파일로 저장한다. 템플릿 파일 위에 저장하지 않는다.
6.3.4.1.4 프로토콜에 따라 qPCR 플레이트를 로딩하고 실행한다.
6.3.4.2 설정(Setup) 섹션에서, 할당(Assign)을 선택한다. 웰 D1 내지 E12에 하이라이트 표시를 하고(Highlight) 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 생략(omit)을 선택한다. 이렇게 하면, 분석으로부터 새로운 올리고 로트 반응이 생략된다. 전체 플레이트를 선택하고 분석(Analyze)을 클릭한다.
6.3.4.3 데이터의 PDF 보고서를 인쇄하고 이것이 적격 올리고 로트에 대한 분석임을 표시한다.
6.3.4.3.1 DSTMD-24448에 기술된 모든 분석 허용 기준이 충족되어야 한다. 상기 분석 허용 기준 중 하나라도 충족되지 않으면, 분석은 유효하지 않으며 반복되어야 한다. 시약 적격성 평가 보고서에 임의의 무효 분석을 기록한다.
6.3.4.4 설정 섹션에서, 할당을 선택한다. 웰 D1 내지 E12에 하이라이트 표시를 하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 포함(include)을 선택한다. 웰 A1 내지 B12에 하이라이트 표시를 하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 생략을 선택한다. 이렇게 하면, 분석으로부터 적격인 올리고 로트 반응이 생략된다. 전체 플레이트를 선택하고 분석(Analyze)을 클릭한다.
6.3.4.5 데이터의 PDF 보고서를 인쇄하고 이것이 새로운 올리고 로트에 대한 분석임을 표시한다.
6.3.4.5.1 새로운 올리고 로트 분석으로부터의 모든 결과는 본원에 기술된 모든 분석 허용 기준을 충족해야 한다.
6.3.4.5.2 적격인 및 새로운 올리고 로트 반응에서의 각 표준에 대한 평균 Ct 값의 %차이를 하기와 같이 계산한다:
Figure pct00016
6.3.4.5.3 모든 %차이는 ≤1.60%이어야 한다.
6.3.4.6 새로운 올리고 로트가 적격성 평가를 통과하기 위해서는, 모든 유효한 적격성 분석이 Ct % 차이 기준을 충족해야 한다.
6.3.4.7 새로운 로트가 허용 기준을 충족하지 않으면, 해당 로트는 적격성 평가에서 실패하며, 폐기되어야 한다. 또 다른 새로운 로트의 올리고를 준비하고 상기 새로운 로트에 대해 적격성 평가를 실행한다.
작업 선형 LiCAR 플라스미드 스톡 제조
1.0 목적
1.1 이 실시예는, 이식유전자 qPCR 방법에 대한 표준 및 대조군을 제조하는 데 사용할 선형 플라스미드의 작업 스톡을 제조하기 위해, LiCAR 플라스미드를 선형화하고 mg/mL 플라스미드 농도를 카피/uL로 변환하는 예시적인 절차를 기술한다.
2.0 장비
2.1 1.5 mL 및 5 mL 미세원심분리기 튜브를 회전시킬 수 있음(예를 들어, Beckman Coulter, 1.5 mL 미세원심분리기 튜브용 어댑터를 갖는 SX4750 로터를 갖는 Allegra X-14R)
2.2 전기영동 장치, 예를 들어 Lonza FlashGel DNA 시스템 및 FlashGel Dock 또는 Invitrogen E-Gel 전기영동 장치
2.3 -70℃가 가능한 냉동고
2.4 2 내지 8℃를 유지할 수 있는 냉장고 또는 냉장실
2.5 보정된 단일 채널 피펫(20, 100, 200, 1000 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin 피펫
2.6 Qubit 4 형광계, Invitrogen Cat # Q33226
2.7 37℃가 가능하고 1.5 mL 미세원심분리기 튜브에 적합한 열 블록
2.8 생물안전 작업대
2.9 와동 혼합기
3.0 물질
참고: "예를 들어"로 지정된 물질은 이전의 적격성 평가 없이 유사한 물질로 대체될 수 있다. "또는 등가물"로 지정된 물질의 경우, 샘플을 시험하는 데 사용하기 전에 대체물이 동등함을 입증해야 한다.
3.1 pLLV-LICAR2SIN LiCAR 플라스미드 stock
3.2 DNase/RNase 무함유수, 예를 들어, Invitrogen Cat# 10977015
3.3 EcoRI HF 효소, New England Biolabs Cat # R3101S, 또는 등가물
3.4 GeneJet 겔 추출 및 DNA 클린업 키트(GeneJet Gel Extraction & DNA Cleanup Kit), ThermoFisher, Cat# K0831 또는 동급
3.5 프리캐스트(pre-cast) 전기영동 겔, 예를 들어 고분자량 밴드 분해능에 적합한 Lonza FlashGel DNA 카세트 또는 Invitrogen E-Gel(예를 들어, FlashGel DNA 카세트, 1.2% 12+1 단일 층, Lonza Cat# 57023)
3.6 적어도 8000 kb 밴드 크기 측정에 적합한 분자량 DNA 래더(예를 들어, E-Gel 1 Kb 플러스 DNA 래더(E-Gel 1 Kb Plus DNA Ladder), Invitrogen Cat# 10488090) 1.1 1.5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 022431021 1.2 2 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 022431048
3.7 5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 0030119460
3.8 1X 낮은 EDTA TE 완충제 pH 8.0, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Quality Biological Cat# 351-324-721.
3.9 0.5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, VWR 스크류-캡 미세원심분리기 튜브 Cat# 89004-286 또는 Eppendorf Cat# 022431005
3.10 피펫 팁, 멸균, 여과됨(20, 200, 1000 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin Cat# 30389226, 30389240, 30398213
4.0 주의사항
4.1 실험실에서 작업할 때는 적절한 PPE를 착용한다.
4.2 위험한 화학물질 작업에 대한 현장별 지침을 따른다. 자세한 내용은 제조업체의 SDS를 참조한다.
4.3 모든 피펫팅 단계는 BSC에서 무균 기법을 사용하여 수행해야 한다. 분석자는 임의의 물질 또는 시약에 대한 오염 위험을 최소화하기 위해 절차의 모든 단계 동안 일회용 슬리브 덮개를 착용하는 것이 바람직하다.
5.0 절차
5.1 플라스미드 분해를 시작하기 전에 열 블록을 37℃로 예열한다.
5.2 LiCAR 플라스미드 스톡의 바이알을 해동한다.
5.3 Qubit 4 형광계 및 본원에 이전에 기술된 절차를 사용하여 LiCAR DNA의 농도를 측정한다. Qubit dsDNA BR 키트의 범위(2 내지 1000 ng의 DNA) 내에 존재하기 위해서는 플라스미드 스톡을 희석해야 할 수 있다.
5.4 0.09 ug/uL의 플라스미드 DNA를 물에서 분해하는 데 필요한 플라스미드의 양을 희석한다.
예를 들어, 3.63 uL의 플라스미드 DNA를 46.37 uL의 DNase/RNase 무함유수에 첨가함으로써 1.24 ug/uL의 플라스미드 스톡 농도를 0.09 ug/uL로 희석한다.
5.5 EcoRI HF 효소 분해 반응 혼합물을 실온에서 제조하고 각 시약을 표 11에 표시된 순서대로 첨가한다.
[표 11]
Figure pct00017
참고: 필요한 경우, 다수의 50 uL 효소 분해 반응을 반복하여 수행하여, 표준 및 대조군을 제조하기 위한 LiCAR 플라스미드의 작업 스톡의 제조를 위한 충분한 양의 선형화된 DNA를 생성할 수 있다.
5.6 겔 상에서 온전한 플라스미드 DNA 대조군 역할을 하기 위해 적어도 5 uL의 분해되지 않은 플라스미드 DNA를 따로 남겨둔다.
5.7 피펫 혼합하거나 튜브를 가볍게 두드림으로써, 분해 튜브를 부드럽게 혼합한다(반응을 와동시키지 않는다). 300 x g에서 5초 동안 잠시 반응을 스핀 다운(spin down)한다.
5.8 37℃ 열 블록에서 15분 동안 튜브를 배양한다.
5.9 GeneJet 겔 추출 및 DNA 클린업 미니 키트(GeneJet Gel Extraction and DNA clean-up Mini Kit)를 사용하여 분해된 플라스미드 DNA를 정제한다.
참고: DNA 정제에 사용되는 부피는 200 uL를 초과해서는 안 되며, 정제된 플라스미드 DNA의 총량은 10 ug를 초과해서는 안 된다. 총 부피가 200 uL를 초과하는 경우, 하기 정제 단계를 진행하기 전에 부피를 2개 이상의 튜브로 균등하게 분할한다.
5.10 DNA 클린업 절차를 시작하기 전에, 새로운 GenJet 키트를 열 때, 각 병 상의 지침에 따라 세척 완충제 병에 96 내지 100% 에탄올을 첨가한다. 첨가 날짜와 이니셜을 표지에 표시함으로써 에탄올 첨가를 확인한다. 실온에서 에탄올과 함께 세척 완충제를 저장한다. 또한, 사용하기 전에 키트 내의 모든 용액에 염 침전이 있는지 확인한다. 용액을 37℃로 가온하고 사용하기 전에 실온까지 평형화함으로써, 임의의 침전물을 용해시킨다.
참고: DNA 정제 컬럼은, 키트 도착 시 및 컬럼을 사용하지 않을 때는, 2 내지 8℃에서 저장해야 한다. 사용 후에는, DNA 정제 컬럼을 갖는 백(bag)을 반드시 단단히 닫는다.
5.11 DNase/RNase 무함유수를 사용하여 반응 혼합물의 부피를 200 uL로 조정한다. 예를 들어, 50 uL의 분해된 DNA 혼합물에 150 uL의 물을 첨가한다.
5.12 100 μL의 결합 완충제를 첨가한다. 피펫팅으로 철저히 혼합한다.
5.13 300 μL의 에탄올(96 내지 100%)을 첨가하고 피펫팅으로 혼합한다.
5.14 혼합물을 DNA 정화 마이크로 컬럼 및 수집 튜브로 옮긴다. 1분 동안 14,000 x g에서 컬럼을 원심분리한다. 통과액을 폐기한다. DNA 정제 마이크로 컬럼을 다시 수집 튜브에 넣는다. 대안적으로, 상기 튜브를 2 mL 미세원심분리기 튜브에 넣고 상기 수집 튜브를 폐기할 수 있다.
5.15 컬럼에 700 μL의 세척 완충제(에탄올 보충됨)를 첨가하고 14,000 × g에서 1분 동안 원심분리한다. 통과액을 폐기하고 컬럼을 다시 수집 튜브에 넣는다. 대안적으로, 상기 튜브를 2 mL 미세원심분리기 튜브에 넣고 상기 수집 튜브를 폐기할 수 있다.
5.16 컬럼에 700 μL의 세척 완충제를 첨가함으로써 또 다른 세척 단계를 수행하고, 14,000 × g에서 1분 동안 원심분리한다. 통과액을 폐기하고 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 넣는다. 대안적으로, 상기 튜브를 2 mL 미세원심분리기 튜브에 넣고 상기 수집 튜브를 폐기할 수 있다.
5.17 컬럼을 14,000 × g에서 추가로 1분 동안 원심분리하여 임의의 잔류 세척 완충제를 완전히 제거한다.
5.18 컬럼을 깨끗한 1.5 mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고 10 uL의 용출 완충제(GeneJet 키트와 함께 제공됨)를 컬럼 중앙에 첨가한다. 피펫 팁으로 실리카 멤브레인을 건드리거나 뚫지 않는다.
5.19 14,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용출한다.
5.20 온전한 원형(분해되지 않은 DNA) 및 선형화된 DNA의 겔 전기영동에 의해 VSV-G 플라스미드의 분해를 확인한다. 가능한 선형화된 플라스미드의 최대량을 보존하기 위해, 겔 전기영동에 사용할 선형화된 플라스미드 스톡의 희석액을 제조하는 것이 바람직하다.
5.21 Qubit 4 형광계 및 본원에 이전에 기술된 절차를 사용하여, 정제된 선형 VSV-G 플라스미드 DNA의 농도를 측정한다.
5.22 단계 5.21에서 측정된 선형 플라스미드 농도를 하기와 같이 카피 수/LiCAR 플라스미드의 uL로 변환한다:
Figure pct00018
예를 들어, LiCAR DNA 농도는 1.03 ug/uL이다.
Figure pct00019
Figure pct00020
5.23 낮은 EDTA TE 완충제에서 표준 및 대조군을 제조하는 데 적합한 작업 농도로 플라스미드 스톡을 희석한다.
5.24 표준 및 대조군을 제조하는 데 적합한 작업 스톡 선형 LiCAR 플라스미드를 제조하는 데 필요한 낮은 EDTA TE 완충제에 선형 LiCAR 플라스미드 스톡을 희석한다.
5.25 최소 정보로 표지된 작업 플라스미드 농도의 적절한 크기의 일회용 분취량을 만든다:
5.25.1 선형 플라스미드
5.25.2 카피/uL 단위의 플라스미드 농도
5.25.3 분취량 크기
5.25.4 유효 기간
5.26 플라스미드는 -70℃에서 12개월 동안 안정하다.
새로운 로트의 표준의 제조 및 적격성 평가
1.0 목적
1.1 이식유전자 qPCR 방법을 위한 새로운 로트의 표준을 제조하고 적격성을 평가하기 위한 예시적인 절차가 기술된다.
2.0 장비
2.1 1.5 mL 미세원심분리기 튜브를 회전시킬 수 있는 원심분리기(예를 들어, Beckman Coulter, SX4750 로터 및 96 웰 플레이트용 스윙 세트 및 1.5 mL 미세원심분리기 튜브용 어댑터를 갖는 Allegra X-14R)
2.2 QuantStudio 6 실시간 PCR 시스템
2.3 -20℃가 가능한 냉동고
2.4 -70℃가 가능한 냉동고
2.5 보정된 8 또는 12 채널 피펫(20, 50 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin 피펫
2.6 보정된 단일 채널 피펫(20, 100, 200, 1000 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin 피펫
2.7 2 내지 8℃를 유지할 수 있는 냉장고 또는 냉장실
2.8 QuantStudio PCR 소프트웨어 v1.3 이상
2.9 55℃가 가능하고 1.5 mL 미세원심분리기 튜브에 적합한 열 블록
2.10 와동 혼합기
2.11 생물안전 작업대
3.0 물질
참고: "예를 들어"로 지정된 물질은 이전의 적격성 평가 없이 유사한 물질로 대체될 수 있다. "또는 등가물"로 지정된 물질의 경우, 샘플을 시험하는 데 사용하기 전에 대체물이 동등함을 입증해야 한다.
3.1 DNase/RNase 무함유수, 예를 들어, Invitrogen Cat# 10977015.
3.2 TaqPath ProAmp 마스터 믹스, ThermoFisher Cat# A30866, 또는 등가물.
3.3 펠렛 당 2x106-4x106개 세포를 갖는 모의 T-세포 펠렛.
3.4 적격인 로트의 BCMA 이식유전자 및 ALB 프라이머 및 프로브, IDT를 통한 사용자 지정 서열 또는 등가물.
3.5 적격인 로트의 BCMA 이식유전자 표준 #1
3.6 적격인 로트의 BCMA 이식유전자 중간 및 하위 대조군
3.7 pLLV-LICAR2SIN의 작업 스톡 분취량
3.8 1X 낮은 EDTA TE 완충제 pH 8.0, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Quality Biological Cat# 351-324-721.
3.9 0.5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, VWR 스크류-캡 미세원심분리기 튜브 Cat# 89004-286 또는 Eppendorf Cat# 022431005
3.10 1.5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 022431021
3.11 2 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 022431048
3.12 5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat# 0030119460
3.13 피펫 팁, 멸균, 여과됨(20, 200, 1000 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin Cat# 30389226, 30389240, 30398213
3.14 96 웰 PCR 플레이트, Applied Biosystems, Cat# 4483343, 4483354, 4483349, 4483350, 4483395, 또는 등가물
3.15 Micro Amp 광학 접착 필름, Applied Biosystems, Cat# 4311971, 또는 등가물
3.16 시약 저장소, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, VistaLabs Cat# 3054-1002
4.0 주의사항
4.1 실험실에서 작업할 때는 적절한 PPE를 착용한다.
4.2 위험한 화학물질 작업에 대한 현장별 지침을 따른다. 자세한 내용은 제조업체의 SDS를 참조한다.
4.3 모든 피펫팅 단계는 BSC에서 무균 기법을 사용하여 수행해야 한다. 분석자는 임의의 물질 또는 시약에 대한 오염 위험을 최소화하기 위해 절차의 모든 단계 동안 일회용 슬리브 덮개를 착용하는 것이 바람직하다.
5.0 절차
5.1 본원에서 이전에 설명된 프로토콜에 따라 모의 T-세포 펠렛으로부터 단리된 gDNA. 모의 T-세포는 CAR T 제조 공정을 대표해야 하지만 렌티벡터 형질도입은 없어야 한다.
5.2 여러 개의 실리카 DNA 추출 컬럼을 사용하여 필요한 양의 gDNA를 단리한다. 모든 컬럼으로부터의 용출된 DNA를 조합하여, 정량화 전에 모의 T-세포 gDNA의 단일 스톡을 제조한다.
5.3 정량화 후, 적어도 4개월의 시험을 지원하기에 충분한 수의 분취량을 만들기에 충분한 gDNA가 단리되었는지를 확인한다.
5.3.1 초기 gDNA 단리가, 적어도 4개월 동안 지속할 만큼 충분히 큰 로트를 만들기에 충분한 gDNA를 생성하지 않는 경우, 추가 모의 T-세포 펠렛을 단리하고, 초기 모의 T-세포 gDNA 스톡과 조합하고, Qubit을 사용하여, 조합된 스톡을 정량화할 수 있다.
5.4 표준 #1은, 5 uL의 표준 #1이 121,212.1212 카피의 LiCAR 플라스미드를 함유하도록 pLLV-LICAR2SIN 플라스미드(LiCAR 플라스미드)로 스파이킹된 0.05 ug/uL 농도의 모의 T-세포 DNA로 구성된다.
5.4.1 모의 T-세포 DNA의 스톡으로부터 제조될 수 있는 표준 #1의 총 부피를 하기와 같이 결정한다:
Figure pct00021
예를 들어, DNA 정량화 후에 대략 397.0 uL의 모의 T-세포 gDNA가 잔류한다. gDNA의 농도는 0.0853 ug/uL이다. 표준 #1을 제조하기 위해 392.0 uL의 gDNA가 소요된다.
Figure pct00022
5.4.2 그런 다음, gDNA를 0.05 ug/uL로 희석하는 데 필요한 낮은 EDTA TE 완충제 + 플라스미드의 부피를 하기와 같이 결정한다:
Figure pct00023
예를 들어, 총 부피 668.8 uL의 표준 #1을 제조하는 데 392.0 uL의 gDNA 스톡 gDNA가 소요된다.
Figure pct00024
5.4.3 그런 다음, 5 uL의 표준 #1 당 121,212.121 카피의 LiCAR 플라스미드를 달성하는 데 필요한 플라스미드의 부피를 하기와 같이 결정한다:
Figure pct00025
Figure pct00026
예를 들어, 총 부피 668.8 uL의 표준 #1. 1.1035x106 카피/uL의 LiCAR 플라스미드 작업 스톡.
Figure pct00027
5.4.4 마지막으로, 표준 #1의 총 부피를 제조하는 데 필요한 낮은 EDTA TE 완충제의 부피를 결정한다.
Figure pct00028
예를 들어, 392.0 uL의 모의 T-세포 gDNA 및 14.7 uL의 LiCAR 플라스미드로부터의 총 부피 668.8 uL의 표준 #1.
Figure pct00029
5.5 제조될 표준 #1의 총 부피(단계 5.4.1에서 계산됨)를 수용하도록 적절한 크기의 DNase/RNase 무함유 튜브로 스톡 모의 T-세포 gDNA의 부피를 옮김으로써, 표준 #1을 제조하기 시작한다.
5.6 단계 5.5의 튜브에, 단계 5.4.4에서 계산된 낮은 EDTA TE 완충제의 부피를 첨가한다.
5.7 그런 다음, 단계 5.4.3에서 계산된 LiCAR 플라스미드의 부피를 첨가한다. 튜브를 잠시 와동 혼합한다.
5.8 최소 정보가 표지된 표준 #1의 20 uL 일회용 분취량을 만든다:
5.8.1 BCMA 이식유전자 표준 #1
5.8.2 로트 #
5.8.3 표준 #1이 제조된 날짜
5.9 모든 일회용 분취량은 -20℃에 저장한다.
5.9.1 새로운 로트의 표준 #의 적격성 평가
5.9.1.1 하기와 같은 본원에서 이전에 기술된 프로토콜에 따라, 적격인 로트의 올리고, 중간 및 하위 대조군을 사용하는 최소 3개의 독립적인 이식유전자 qPCR 분석에서, 현재 적격인 표준 #1 및 새로운 로트의 표준 #1 둘 모두를 하기와 같이 실행한다.
5.9.1.1.1 모든 표준 및 대조군 샘플에 대해 하나의 마스터 믹스를 제조한다.
5.9.1.1.2 2개의 5포인트 표준 곡선을 만들며, 하나는 적격인 로트의 표준 #1을 사용하고 다른 하나는 새로운 로트의 표준 #1을 사용한다.
5.9.1.1.3 플레이트 맵에 따라 qPCR 플레이트를 로딩한다.
5.9.1.1.4 "Standard Qualification.edt" 템플릿을 열고 "다른 이름으로 저장"을 선택하고 qPCR 실험에 대한 적절한 명칭을 입력하고.eds 파일로 저장한다. 템플릿 파일 위에 저장하지 않는다.
5.9.1.1.5 본원에 기술된 프로토콜에 따라 qPCR 플레이트를 로딩하고 실행한다.
5.9.1.2 설정 섹션에서, 할당을 선택한다. 웰 C1 내지 D3에 하이라이트 표시를 하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 생략을 선택한다. 이렇게 하면, 분석으로부터 새로운 표준 #1 로트 표준 곡선이 생략된다. 전체 플레이트를 선택하고 분석(Analyze)을 클릭한다.
5.9.1.3 데이터의 PDF 보고서를 인쇄하고 이것이 적격인 표준 #1 로트에 대한 분석임을 표시한다.
5.9.1.3.1 본원에 기술된 모든 분석 허용 기준이 충족되어야 한다. 상기 분석 허용 기준 중 하나라도 충족되지 않으면, 분석은 유효하지 않으며 반복되어야 한다. 시약 적격성 평가 보고서에 임의의 무효 분석을 기록한다.
5.9.1.4 설정 섹션에서, 할당을 선택한다. 웰 C1 내지 D3에 하이라이트 표시를 하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 포함을 선택한다. 웰 A1 내지 B3에 하이라이트 표시를 하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 생략을 선택한다. 이렇게 하면, 분석으로부터 적격인 표준 #1 로트 표준 곡선이 생략된다. 전체 플레이트를 선택하고 분석(Analyze)을 클릭한다.
5.9.1.5 데이터의 PDF 보고서를 인쇄하고 이것이 새로운 표준 #1 로트에 대한 분석임을 표시한다.
5.9.1.5.1 새로운 표준 #1 로트 분석으로부터의 모든 결과는 본원에 기술된 모든 분석 허용 기준을 충족해야 한다.
5.9.1.6 모든 유효한 적격성 평가 분석에서의 중간 및 하위 대조군에 대한 모든 3중 VCN/세포 결과의 평균은, 새로운 로트의 표준 #1이 적격성 평가를 통과하기 위한 예상 VCN/세포 결과의 20% 이하이어야 한다.
새로운 로트의 중간 및 하위 대조군의 제조 및 적격성 평가
1.0 목적
1.1 이식유전자 qPCR 방법을 위한 새로운 로트의 표준을 제조하고 적격성을 평가하기 위한 예시적인 절차가 기술된다.
2.0 장비
2.1 1.5 mL 미세원심분리기 튜브를 회전시킬 수 있는 원심분리기(예를 들어, Beckman Coulter, SX4750 로터 및 96 웰 플레이트용 스윙 세트 및 1.5 mL 미세원심분리기 튜브용 어댑터를 갖는 Allegra X-14R)
2.2 QuantStudio 6 실시간 PCR 시스템
2.3 -20℃가 가능한 냉동고
2.4 -70℃가 가능한 냉동고
2.5 보정된 8 또는 12 채널 피펫(20, 50 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin 피펫
2.6 보정된 단일 채널 피펫(20, 100, 200, 1000 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin 피펫
2.7 2 내지 8℃를 유지할 수 있는 냉장고 또는 냉장실
2.8 QuantStudio PCR 소프트웨어 v1.3 이상
2.9 55℃가 가능하고 1.5 mL 미세원심분리기 튜브에 적합한 열 블록
2.10 와동 혼합기
2.11 생물안전 작업대
3.0 물질
참고: "예를 들어"로 지정된 물질은 이전의 적격성 평가 없이 유사한 물질로 대체될 수 있다. "또는 등가물"로 지정된 물질의 경우, 샘플을 시험하는 데 사용하기 전에 대체물이 동등함을 입증해야 한다.
3.1 DNase/RNase 무함유수, 예를 들어, Invitrogen Cat# 10977015.
3.2 TaqPath ProAmp 마스터 믹스, ThermoFisher Cat# A30866, 또는 등가물.
3.3 펠렛 당 2x106 내지 4x106개 세포를 갖는 모의 T-세포 펠렛.
3.4 적격인 로트의 BCMA 이식유전자 및 ALB 프라이머 및 프로브, IDT를 통한 사용자 지정 서열 또는 등가물.
3.5 적격인 로트의 BCMA 이식유전자 표준 #1
3.6 적격인 로트의 BCMA 이식유전자 중간 및 하위 대조군
3.7 pLLV-LICAR2SIN의 작업 스톡 분취량
3.8 1X 낮은 EDTA TE 완충제 pH 8.0, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Quality Biological Cat# 351-324-721.
3.9 0.5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, VWR 스크류-캡 미세원심분리기 튜브 Cat# 89004-286 또는 Eppendorf Cat# 022431005
3.10 1.5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat#022431021
3.11 2 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat#022431048
3.12 5 mL 원심분리기 튜브, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, Eppendorf Cat#0030119460
3.13 피펫 팁, 멸균, 여과됨(20, 200, 1000 uL, 또는 기타 적절한 크기), 예를 들어, Rainin Cat# 30389226, 30389240, 30398213
3.14 96 웰 PCR 플레이트, Applied Biosystems, Cat# 4483343, 4483354, 4483349, 4483350, 4483395, 또는 등가물
3.15 Micro Amp 광학 접착 필름, Applied Biosystems, Cat# 4311971, 또는 등가물
3.16 시약 저장소, 멸균, RNase/DNase 무함유, 예를 들어, VistaLabs Cat# 3054-1002
4.0 주의사항
4.1 실험실에서 작업할 때는 적절한 PPE를 착용한다.
4.2 위험한 화학물질 작업에 대한 현장별 지침을 따른다. 자세한 내용은 제조업체의 SDS를 참조한다.
4.3 모든 피펫팅 단계는 BSC에서 무균 기법을 사용하여 수행해야 한다. 분석자는 임의의 물질 또는 시약에 대한 오염 위험을 최소화하기 위해 절차의 모든 단계 동안 일회용 슬리브 덮개를 착용하는 것이 바람직하다.
5.0 절차
5.1 본원에서 이전에 설명된 프로토콜의 프로토콜에 따라 모의 T-세포 펠렛으로부터 단리된 gDNA. 모의 T-세포는 CAR T 제조 공정을 대표해야 하지만 렌티벡터 형질도입은 없어야 한다.
5.2 여러 개의 실리카 DNA 추출 컬럼을 사용하여 필요한 양의 gDNA를 단리한다. 모든 컬럼으로부터의 용출된 DNA를 조합하여, 정량화 전에 모의 T-세포 gDNA의 단일 스톡을 제조한다.
5.3 정량화 후, 적어도 4개월의 시험을 지원하기에 충분한 수의 분취량을 만들기에 충분한 gDNA가 단리되었는지를 확인한다. 하위 대조군은 희석제로서 0.02 ug/uL 모의 T-세포 gDNA를 사용하는 중간 대조군의 1:10 희석액이다. 하위 및 중간 대조군은 동일한 모의 T-세포 gDNA 스톡으로부터 함께 제조될 필요는 없지만, 함께 제조되는 경우, 단리된 모의 T-세포 DNA 스톡의 일부는 하위 대조군을 제조하기 위해 보존되어야 한다. 아래 단계들에 표시된 예는 동일한 스톡의 모의 T-세포 gDNA로 중간 및 하위 대조군을 제조하는 방법의 예이다.
5.3.1 초기 gDNA 단리가 적어도 4개월 동안 지속할 만큼 충분히 큰 로트의 두 대조군을 만들기에 충분한 gDNA를 생성하지 않는 경우, 추가 모의 T-세포 펠렛을 분리하고, 초기 모의 T-세포 gDNA 스톡과 조합하고, Qubit을 사용하여, 조합된 스톡을 정량화할 수 있다.
5.4 BCMA 이식유전자 중간 대조군은, 5 uL의 중간 대조군이 30,303.030 카피의 LiCAR 플라스미드를 함유하도록, pLLV-LICAR2SIN 플라스미드(본원에서 "LiCAR" 플라스미드로도 지칭됨)로 스파이킹된 0.02 ug/uL 농도의 모의 T-세포 DNA로 구성된다. 이것은 5 uL의 대조군에서의 2.00 카피/세포의 벡터 카피 수와 같다.
5.4.1 모의 T-세포 DNA의 스톡으로부터 제조될 수 있는 중간 대조군의 총 부피는 하기와 같이 결정한다:
Figure pct00030
예를 들어, DNA 정량화 후에 대략 547.0 uL의 모의 T-세포 gDNA가 잔류한다. gDNA의 농도는 0.0913 ug/uL이다. 중간 대조군을 제조하는 데 298 uL의 gDNA가 소요된다.
Figure pct00031
5.4.2 그런 다음, gDNA를 0.02 ug/uL로 희석하는 데 필요한 낮은 EDTA TE 완충제 + 플라스미드의 부피를 하기와 같이 결정한다:
Figure pct00032
예를 들어, 총 부피 1360.4 uL의 중간 대조군을 제조하는 데 298.0 uL의 gDNA 스톡 gDNA가 소요된다.
Figure pct00033
5.4.3 그런 다음, 5 uL의 중간 대조군 당 30,303.0303 카피의 LiCAR 플라스미드를 달성하는 데 필요한 플라스미드의 부피를 하기와 같이 결정한다:
Figure pct00034
Figure pct00035
예를 들어, 총 부피 1360.4 uL의 중간 대조군. 1.1035x106 카피/uL의 LiCAR 플라스미드 작업 스톡.
Figure pct00036
5.4.4 마지막으로, 중간 대조군의 총 부피를 제조하는 데 필요한 낮은 EDTA TE 완충제의 부피를 결정한다.
Figure pct00037
예를 들어, 298 uL의 모의 T-세포 gDNA 및 7.5 uL의 LiCAR 플라스미드로부터의 총 부피 1360.4 uL의 중간 대조군.
Figure pct00038
5.5 제조될 중간 대조군의 총 부피(단계 5.4.1에서 계산됨)를 수용하도록 적절한 크기의 DNase/RNase 무함유 튜브로 스톡 모의 T-세포 gDNA의 부피를 옮김으로써, 중간 대조군을 제조한다.
5.6 단계 5.5의 튜브에, 단계 5.4.4에서 계산된 낮은 EDTA TE 완충제의 부피를 첨가한다.
5.7 그런 다음, 단계 5.4.3에서 계산된 LiCAR 플라스미드의 부피를 첨가한다. 튜브를 잠시 와동 혼합한다.
5.8 희석제로서 0.02 ug/uL의 모의 T-세포 gDNA를 사용하여 중간 대조군을 1:10으로 희석함으로써 중간 대조군 스톡으로부터 하위 대조군을 제조한다. 예를 들어, 중간 대조군 스톡으로부터 총 부피 1230.0 uL의 하위 대조군을 제조한다.
Figure pct00039
상기 예는 하나의 스톡의 모의 T-세포 gDNA로부터 하위 및 중간 대조군을 제조하는 방법을 보여주기 위한 것이므로, 중간 대조군의 잔류 부피가 새로운 로트의 중간 대조군으로 사용된다.
Figure pct00040
5.9 하위 대조군의 원하는 총 부피를 제조하는 데 필요한 0.02ug/uL 모의 T-세포 gDNA의 양을 결정한다. 예를 들어, 중간 대조군(123.0 uL 중간 대조군)을 1:10으로 희석함으로써, 제조될 하위 대조군 스톡의 총 부피는 1230.0 uL이다.
Figure pct00041
5.10 그런 다음, 낮은 EDTA TE 완충제를 사용하여, 필요한 부피의 단리된 모의 T-세포 gDNA를 0.02 ug/uL로 희석한다. 하위 대조군을 제조하는 데 필요한 0.02 ug/uL gDNA의 충분한 부피(과잉 공급 포함)를 제조한다(단계 5.9). 예를 들어, 1230.0 uL의 하위 대조군을 제조하는 데 1107.0 uL의 0.02 ug/uL 모의 T-세포 gDNA가 필요하다. 0.0913 ug/uL 모의 T-세포 스톡을 0.02 ug/uL로 희석한다.
Figure pct00042
869.9 uL의 낮은 EDTA TE 완충제를 사용하여 244.0 uL의 스톡 모의 T-세포 gDNA를 0.0913 ug/uL의 농도로 희석하여, 0.02 ug/uL 모의 T세포 gDNA의 충분한 부피를 제조하여 1230.0 uL의 하위 대조군을 제조한다.
5.11 스톡 모의 T-세포 gDNA의 부피를 적절한 크기의 DNase/RNase 무함유 튜브로 옮겨서, 필요한 하위 대조군의 총 부피를 수용하도록 함으로써, 하위 대조군을 제조한다.
5.12 단계 5.11의 튜브에, 단계 5.10에서 계산된 낮은 EDTA TE 완충제의 부피를 첨가한다.
5.13 그런 다음, 하위 대조군을 제조하는 데 필요한 중간 대조군의 부피를 첨가한다. 튜브를 잠시 와동 혼합한다.
5.14 최소 정보가 표지된 중간 및 하위 대조군의 20 uL 일회용 분취량을 만든다:
5.14.1 BCMA 이식유전자 중간/하위 대조군
5.14.2 로트 #
5.14.3 대조군이 제조된 날짜
5.15 모든 일회용 분취량은 -20℃에 저장한다.
5.15.1 새로운 로트의 대조군의 적격성 평가
5.15.1.1 하기와 같은 본원에서 이전에 기술된 프로토콜에 따라, 적격인 로트의 올리고 및 표준 #1을 사용하는 최소 3개의 독립적인 이식유전자 qPCR 분석에서, 현재 적격인 중간 및 하위 대조군 및 새로운 로트의 대조군 둘 모두를 실행한다.
5.15.1.1.1 모든 표준 및 대조군 샘플에 대해 하나의 마스터 믹스를 제조한다.
5.15.1.1.2 적격인 로트의 표준 #1을 사용하여 하나의 5포인트 표준 곡선을 만든다.
5.15.1.1.3 도 10의 플레이트 맵에 따라 qPCR 플레이트를 로딩한다.
5.15.1.1.4 대조군 적격성 평가(Controls Qualification) 템플릿 파일을 열고 "다른 이름으로 저장"을 선택하고 qPCR 실험에 대한 적절한 이름을 입력하고.eds 파일로 저장한다. 템플릿 파일 위에 저장하지 않는다.
5.15.1.1.5 대조군 적격성 평가 템플릿 파일에 따라 qPCR 플레이트를 로딩하고 실행한다.
5.15.1.2 샘플로서 분석된 새로운 로트의 대조군을 사용하여 대조군 적격성 평가 템플릿 파일에 따라 데이터를 분석한다.
5.15.1.2.1 대조군 적격성 평가 템플릿 파일에 기술된 모든 분석 허용 기준이 충족되어야 한다.
5.15.1.3 적격성 평가 허용 기준
5.15.1.3.1 모든 유효한 적격성 평가 분석에서의 새로운 로트의 중간 및 하위 대조군에 대한 모든 3중 VCN/세포 결과의 평균은, 새로운 로트의 대조군이 적격성 평가를 통과하기 위한 예상 VCN/세포 결과의 35% 이하이어야 한다
5.15.1.3.2 모든 유효한 적격성 평가 분석에서의 새로운 로트의 중간 및 하위 대조군에 대한 모든 3중 VCN/세포 결과의 %CV는 ≤20%이어야 한다.
실시예 3: 이식유전자 qPCR 방법 적격성 평가
1.0 목적
1.1 이 실시예의 목적은 이식유전자 qPCR 방법 적격성 평가 프로토콜을 실행하는 동안 얻은 결과를 설명하는 것이다.
2.0 범위
2.1 하기 적격성 평가 매개변수, 즉, 특이성, 정확도, 선형성, 정밀성(반복성 및 실험실내 정밀성), 범위 및 LOQ를 검사함으로써, CAR T 생성물 내로 통합된 LiCAR 플라스미드의 정량화를 위한 qPCR 분석에 대해 적격성을 평가하였다.
3.0 정의 및 약어
3.1 qPCR 정량적 중합효소 연쇄 반응
3.2 hALB 인간 알부민
3.3 VCN 벡터 카피 수
3.4 CV 변동 계수
3.5 SD 표준 편차
3.6 Ct 주기 임계값
3.7 LOQ 정량화 한계
3.8 BMD 생물학적분석 방법 개발
3.9 QC 품질 관리
4.0 연구 접근법
4.1 이식유전자 qPCR 표준 #1의 5배 연속 희석물을 제조함으로써 만든 5포인트 표준 곡선을 시험하고 상기 표준 곡선의 결과를 Log10 수량 대 Ct로 플롯팅함으로써, 분석 선형성에 대해 적격성을 평가하였다.
4.2 5포인트 표준 곡선과 중간 및 하위 분석 대조군을 시험함으로써, 분석 정밀성, 즉, 반복성 및 실험실내 정밀성 둘 모두에 대해 적격성을 평가하였다.
4.3 중간 및 하위 분석 대조군을 시험함으로써, 분석 정확도에 대해 적격성을 평가하였다.
4.4 모의 T-세포 DNA 샘플 및 대표적인 CAR T 10일째 수확 DNA 샘플을 시험함으로써, 분석 특이성을 입증하였다.
4.5 0.02 VCN/세포 및 0.014 VCN/세포 LOQ 샘플을 시험함으로써, 분석 LOQ를 측정하였다.
4.6 두 명의 분석자가 3개의 적격성 평가 분석을 수행했으며 상기 3개의 분석 중 하나는 별도의 날짜에 실행되었다.
5.0 물질
5.1 이식유전자 qPCR 분석을 수행하는 데 필요한 물질의 전체 목록에 대해서는 본원에 기술된 적격성 평가 프로토콜을 참조한다.
5.2 분석 표준 및 대조군:
5.2.1 BCMA 이식유전자 표준 #1, 로트# LM-RP3-00533A.
5.2.2 BCMA 이식유전자 중간 대조군, 로트# LM-RP3-00533B.
5.2.3 BCMA 이식유전자 하위 대조군, 로트# LM-RP3-00533C.
5.3 분석 특이성 샘플:
5.3.1 모의 T-세포 DNA, 로트# LM-RP3-00533.
5.3.2 CAR T DNA, LM-RP3-00541.
5.4 분석 LOQ 샘플:
5.4.1 0.02 VCN/세포 및 0.014 VCN/세포 LOQ 샘플, 로트# LM-RP3-00533.
5.4.2 이식유전자 방법 올리고 세트 로트# LM-RP3-00460
6.0 요약
6.1 이 실시예는 이식유전자 qPCR 방법 적격성 평가 프로토콜을 실행하는 동안 얻은 결과를 간략하게 설명한다.
6.2 상기 방법은 표 12에 요약된 바와 같은 허용 가능한 정확도, 정밀성, 특이성, 및 선형성을 입증하였다(10.2 내지 10.5). 또한, 이식유전자 및 hALB 표적 둘 모두에 대해 분석 범위 및 LOQ가 정의되었다. 따라서, 상기 이 방법은 동결보존 배지로 제형화하기 전에 CAR T 의약품 물질을 시험하는 데 적합하다.
[표 12]
Figure pct00043
Figure pct00044
7.0 절차
7.1 모든 분석은 방법 적격성 평가 프로토콜에 기술된 대로 수행되었다. 상기 방법에 명시된 분석 허용 기준을 충족하는 분석만이 방법 적격성 평가 허용 기준의 평가에 포함되었다.
8.0 결과 및 논의
8.1 표준 곡선 선형성 및 정밀성(반복성 및 실험실내 정밀성)
8.1.1 이식유전자 및 hALB 표적 둘 모두에 대한 모든 유효한 적격성 평가 분석에 대한 5포인트 표준 곡선 결과를 표 13 내지 14 및 도 11 내지 12에 요약하였다. 이식유전자 및 hALB 표적 둘 모두에 대한 Log10 대 Ct 값 플롯의 R2 값은 1.00이다. 각 표준의 반복성은 이식유전자 표적의 경우 0.06 내지 0.54% 범위였고, hALB 표적의 경우 0.03 내지 0.41% 범위였다. 실험실내 정밀성은 이식유전자 표적의 경우 0.26 내지 0.47%였고, hALB 표적의 경우 0.17 내지 0.55% 범위였다.
[표 13]
Figure pct00045
[표 14]
Figure pct00046
8.2 QC 대조군 정확도 및 정밀성(반복성 및 실험실내 정밀성)
8.2.1 2.00 VCN/세포 중간 대조군 및 0.20 VCN/세포 하위 대조군에 대한 결과를 표 15에 요약하였다. 중간 대조군에 대한 평균 VCN/세포 결과의 %회수율은 93 내지 95% 범위이다.
하위 대조군에 대한 평균 VCN/세포 결과의 %회수율은 79 내지 84% 범위이다. 중간 및 하위 대조군 둘 모두의 반복성은 4 내지 6% 범위이다. 중간 및 하위 대조군의 실험실내 정밀성은 각각 4% 및 6%이다.
[표 15]
Figure pct00047
8.3 특이성
8.3.1 분석 특이성 평가를 위해 실행된 모의 T-세포 DNA 및 CAR T DNA 샘플에 대한 결과를 표 16에 요약하였다. 이식유전자 표적에 대해, 모의 T-세포 DNA 샘플의 모든 복제물은 "미확인"이었다. CAR T DNA의 모든 복제물은 정량화 가능한 이식유전자 표적 카피 결과를 가졌다. 또한, 모의 T-세포 DNA 및 CAR T DNA 샘플 둘 모두가, hALB 카피 +/- 100 ng의 DNA에 대해 예상되는 30,303.030 카피의 30%의 hALB 샘플 허용 기준을 충족하였다.
[표 16]
Figure pct00048
8.4 범위 및 LOQ
8.4.1 t이식유전자와 hALB 표적은 둘 모두 정확도, 선형성 및 실험실내 정밀성에 대한 모든 허용 기준을 충족하였다. 따라서, 이식유전자 및 hALB 표적 둘 모두에 대한 범위는 5포인트 표준 곡선의 카피 범위로 정의된다. 이식유전자 범위는 193.939 내지 121212.121 카피이다.
hALB 범위는 121.212 내지 75757.576 카피이다. 또한, hALB 표적에 대한 LOQ는 121.212 카피로 정의된다.
8.4.2 0.014 VCN/세포 및 0.02 VCN/세포 LOQ 샘플에 대한 결과를 표 17에 요약하였다. 0.014 VCN/세포 LOQ 샘플에 대한 3중 Ct 값 중 적어도 하나는, 각 유효한 적격성 평가 분석에서의 이식유전자 표준 곡선의 Ct 범위 내에 속하지 않았다. 따라서, 이식유전자 카피 값을 정확하게 측정할 수 없었고 LOQ 기준을 평가할 수 없었다. 그러나, 0.02 VCN/세포 LOQ 샘플은 73 내지 80%의 %회수율을 보였다. 0.02 VCN/세포 LOQ 샘플은 또한, 각각 1 내지 9% 및 2 내지 11%의, 평균 이식유전자 카피 값 및 평균 VCN/세포 결과의 %CV를 나타냈다. 따라서, 이식유전자 표적 LOQ는 303.030 카피의 0.02 VCN/세포 LOQ 샘플의 예상 이식유전자 카피 값으로 정의된다.
[표 17]
Figure pct00049
본원에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참고문헌의 교시 내용은 그 전체가 본원에 원용되어 포함된다.
예시적인 실시형태들이 구체적으로 제시되어 있고 기술되어 있지만, 첨부된 청구범위에 포함되는 실시형태들의 범주로부터 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항에 있어서의 다양한 변화들이 예시적인 실시형태들 내에서 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH, INC. <120> B-CELL MATURATION COMPLEX CAR T CONSTRUCT AND PRIMERS <130> JBI6148WOPCT1 <140> <141> <150> 62/894,663 <151> 2019-08-30 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 1 agcagggcca gaaccagctc tata 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 tgaactgaga gtgaagttca gca 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 3 cttcgtccta gattgagctc gt 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 4 ttatagagct ggttctggcc ctgc 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Claims (33)

  1. 프로브 및 프라이머 세트로서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 프로브; 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는, 프로브 및 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 표지가 방사성 동위원소, 효소 기질, 화학발광제, 형광단, 형광 소광제, 효소, 화학물질, 또는 이들의 조합을 포함하는, 프로브 및 프라이머 세트.
  3. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하기 위한 키트로서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 및 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 프로브; 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하기 위한 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 방사성 동위원소, 효소 기질, 화학발광제, 형광단, 형광 소광제, 효소, 화학물질, 또는 이들의 조합을 포함하는, 키트.
  5. 제3항에 있어서, 상기 프로브를 포함하는 어레이를 포함하는, 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 어레이가 다중-웰 플레이트인, 키트.
  7. 제3항에 있어서, 서열번호 22의 핵산 서열 및 인간 알부민(hALB) 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지를 포함하는 hALB 프로브, 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머, 및 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머를 추가로 포함하는, 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 방사성 동위원소, 효소 기질, 화학발광제, 형광단, 형광 소광제, 효소, 화학물질, 또는 이들의 조합을 포함하는, 키트.
  9. 제3항에 있어서, 기준 유전자 프로브 및 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지, 제1 기준 유전자 프라이머,　및 제2 기준 유전자 프라이머를 추가로 포함하는, 키트.
  10. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법으로서,
    서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
    서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 제1 hALB 프라이머, 및 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는 제2 hALB 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 hALB 핵산을 생성하는 단계;
    CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
    hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 hALB 핵산과 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
    상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법.
  11. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법으로서,
    CAR T 세포로부터의 핵산을 제1 CAR 프라이머, 제2 CAR 프라이머, 제1 hALB 프라이머, 및 제2 hALB 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제1 hALB 프라이머는 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 hALB 프라이머는 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는, 단계;
    상기 제1 CAR 프라이머 및 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
    상기 제1 hALB 프라이머 및 제2 hALB 프라이머를 사용하여 hALB 핵산을 증폭시켜, 증폭된 hALB 핵산을 생성하는 단계;
    CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
    hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 hALB 핵산과 상기 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
    상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 증폭된 CAR 핵산과 상기 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 CAR 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 증폭된 hALB 핵산 분자와 상기 hALB 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 hALB 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 증폭이 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 PCR은 실시간 PCR, 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 실시간 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(rt RT-PCR), 디지털 PCR(dPCR), 리가제 연쇄 반응, 또는 전사 매개 증폭(TMA)인, 방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 형광단을 포함하는, 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 hALB 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 형광단을 포함하는, 방법.
  18. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법으로서,
    서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
    제1 기준 유전자 프라이머 및 제2 기준 유전자 프라이머를 사용하여 CAR T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 기준 유전자 핵산을 생성하는 단계;
    CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
    상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산과 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
    상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법.
  19. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법으로서,
    CAR T 세포로부터의 핵산을 제1 CAR 프라이머, 제2 CAR 프라이머, 제1 기준 유전자 프라이머, 및 제2 기준 유전자 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 CAR 프라이머는 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 CAR 프라이머는 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는, 단계;
    상기 제1 CAR 프라이머 및 상기 제2 CAR 프라이머를 사용하여 CAR 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
    상기 제1 기준 유전자 프라이머 및 제2 기준 유전자 프라이머를 사용하여 기준 유전자 핵산을 증폭시켜, 증폭된 기준 유전자 핵산을 생성하는 단계;
    CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
    상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산과 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
    상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 내로의 이식유전자 통합을 정량화하는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 증폭된 CAR 핵산과 상기 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 CAR 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산 분자와 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 증폭이 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 PCR은 실시간 PCR, 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 실시간 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(rt RT-PCR), 디지털 PCR(dPCR), 리가제 연쇄 반응, 또는 전사 매개 증폭(TMA)인, 방법.
  24. 제18항에 있어서, 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 형광단을 포함하는, 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 형광단을 포함하는, 방법.
  26. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 방법으로서, CAR 이식유전자를 T 세포에 도입하여 이식유전자 통합된 T 세포를 수득하는 단계;
    하기를 포함하는 CAR 이식유전자 통합을 측정하는 단계:
    서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 제1 CAR 프라이머 및 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 제2 CAR 프라이머를 사용하여 상기 이식유전자 통합된 T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 CAR 핵산을 생성하는 단계;
    제1 기준 유전자 프라이머 및 제2 기준 유전자 프라이머를 사용하여 상기 이식유전자 통합된 T 세포로부터의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 기준 유전자 핵산을 생성하는 단계;
    CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호를 통해, 상기 증폭된 CAR 핵산과 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계;
    상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 기준 신호를 통해, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산과 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
    상기 기준 신호에 대비한 상기 표적 신호의 비교에 의해 이식유전자 카피 수를 정량화하는 단계;
    및
    적어도 한 카피의 통합된 CAR 이식유전자를 포함하는 CAR T 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 증폭된 CAR 핵산과 상기 CAR 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 CAR 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 증폭된 기준 유전자 핵산 분자와 상기 기준 유전자 프로브 간의 혼성화를 검출하는 단계는, 혼성화 전의 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 표지로부터의 표적 신호에 대비한, 혼성화 동안 또는 후의 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지로부터의 표적 신호의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 증폭이 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 PCR은 실시간 PCR, 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 실시간 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(rt RT-PCR), 디지털 PCR(dPCR), 리가제 연쇄 반응, 또는 전사 매개 증폭(TMA)인, 방법.
  31. 제26항에 있어서, 상기 CAR 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 형광단을 포함하는, 방법.
  32. 제26항에 있어서, 상기 기준 유전자 프로브에 부착된 적어도 하나의 표지가 형광단을 포함하는, 방법.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 CAR T 세포.
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