JP2022546978A

JP2022546978A - Ｂ細胞成熟複合体ｃａｒｔコンストラクト及びプライマー

Info

Publication number: JP2022546978A
Application number: JP2022513371A
Authority: JP
Inventors: ジョージ，レベッカ; シェン，デー
Original assignee: ヤンセンバイオテツク，インコーポレーテツド
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2020-08-28
Publication date: 2022-11-10
Also published as: JOP20220049A1; CN114341365A; MX2022002466A; EP4022091A1; IL290926A; AU2020339086A1; BR112022003648A2; WO2021038524A1; KR20220051002A; CA3152237A1; US20210164045A1

Abstract

本発明は、Ｂ細胞成熟抗原キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を生成するための、プローブ及びプライマーセット並びに関連する方法及びキットを提供する。本発明はまた、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実行して、Ｂ細胞成熟抗原ＣＡＲトランスジーンのＣＡＲＴ薬物産物への組み込みを定量するための、プローブ及びプライマーセット並びに関連する方法及びキットを提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は２０１９年８月３０日に出願された米国仮出願第６２／８９４，６６３号の利益を主張する。上記出願の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。

（ＡＳＣＩＩテキストファイルでの資料の参照による組み込み）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年８月２８日に作成され、名称はＪＢＩ６１４８ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは８１７５バイトである。

Ｔ細胞療法では、特定の腫瘍関連抗原に対する特異性を高めるために遺伝子改変され単離されたＴ細胞を利用する。遺伝子改変は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は外因性Ｔ細胞受容体の発現を伴い、Ｔ細胞上に新たな抗原特異性を提供し得る。キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、腫瘍免疫反応性を誘導することができる。Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、成熟Ｂ細胞及び悪性血漿細胞の表面上で発現する分子であり、癌、例えば多発性骨髄腫の治療において標的となる分子である。ＣＡＲＴ細胞、特にＢＣＭＡ腫瘍関連抗原に特異的なＣＡＲＴ細胞を利用する、より良好な癌療法が必要とされている。

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、定量ＰＣＲのためのプローブ及びプライマーに関する。本発明はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための、本明細書に記載のプローブ及びプライマーを利用するキット及び方法に関する。

第１の態様では、本発明は、プローブ及びプライマーセットであって、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むプローブと、プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号１１の核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号１２の核酸配列を含む第２のプライマーとを含む、プローブ及びプライマーセット（実施例１、表１を参照）を提供する。

別の態様では、本発明は、プローブ及びプライマーセットであって、配列番号１のヌクレオチド配列を含むプローブと、プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号２の核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号３の核酸配列を含む第２のプライマーとを含む、プローブ及びプライマーセット（実施例１、表１を参照）を提供する。

別の態様では、本発明は、プローブ及びプライマーセットであって、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプローブと、プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマー、を含む、プローブ及びプライマーセット（表１を参照）を提供する。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標識は、放射性同位体、酵素基質、化学発光剤、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、化学物質、又はそれらの組み合わせを含む。

別の態様では、本発明は、ＣＡＲＴ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するためのキットであって、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むプローブと、プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号１１の核酸配列を含む第１のプライマーと、核酸配列１２の核酸配列を含む第２のプライマーとを含む、キットを提供する。

別の態様では、本発明は、ＣＡＲＴ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するためのキットであって、配列番号１のヌクレオチド配列を含むプローブと、プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号２の核酸配列を含む第１のプライマーと、核酸配列３の核酸配列を含む第２のプライマーとを含む、キットを提供する。

更なる態様では、本発明は、ＣＡＲＴ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するためのキットであって、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプローブと、プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第２のプライマーとを含む、キットを提供する。

本発明のキットのいくつかの実施形態では、プローブに結合している少なくとも１つの標識は、放射性同位体、酵素基質、化学発光剤、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、化学物質、又はそれらの組み合わせを含む。

一実施形態では、本発明のキットは、プローブを含むアレイを含む。いくつかの実施形態では、アレイは、マルチウェルアレイである。

一実施形態では、キットは、配列番号２２の核酸配列を含むヒトアルブミン（ｈＡＬＢ）プローブ（実施例２、表２、ｈＡＬＢセット１からのプローブを参照）と、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号２３の核酸配列（表２、ｈＡＬＢセット１からのフォワードプライマー）を含む第１のｈＡＬＢプライマーと、配列番号２４の核酸配列（表２、ｈＡＬＢセット１からのリバースプライマー）を含む第２のｈＡＬＢプライマーとを更に含む。特定の実施形態では、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識は、放射性同位体、酵素基質、化学発光剤、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、化学物質、又はそれらの組み合わせを含む。

別の実施形態では、キットは、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含むヒトアルブミン（ｈＡＬＢ）プローブと、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第１のｈＡＬＢプライマーと、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第２のｈＡＬＢプライマーとを更に含む（表２）。特定の実施形態では、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識は、放射性同位体、酵素基質、化学発光剤、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、化学物質、又はそれらの組み合わせを含む。

別の態様では、本発明は、ＣＡＲＴ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
配列番号１１の核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマー及び配列番号１２の核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
配列番号２３の核酸配列を含む第１のｈＡＬＢプライマー及び配列番号２４の核酸配列を含む第２のｈＡＬＢプライマーを用いてＣＡＲＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したｈＡＬＢ核酸を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅したｈＡＬＢ核酸と配列番号２２のヌクレオチド配列を含むｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む、方法を提供する。

別の態様では、本発明は、ＣＡＲＴ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
配列番号２の核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマー及び配列番号３の核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
配列番号２３の核酸配列を含む第１のｈＡＬＢプライマー及び配列番号２４の核酸配列を含む第２のｈＡＬＢプライマーを用いてＣＡＲＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したｈＡＬＢ核酸を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅したｈＡＬＢ核酸と配列番号２２のヌクレオチド配列を含むｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む、方法を提供する。

別の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、第１のＣＡＲプライマー、第２のＣＡＲプライマー、第１のｈＡＬＢプライマー、及び第２のｈＡＬＢプライマーと接触させること（ここで、第１のＣＡＲプライマーが、配列番号１１の核酸配列を含み、第２のＣＡＲプライマーが、配列番号１２の核酸配列を含み、第１のｈＡＬＢプライマーが、配列番号２３の核酸配列を含み、第２のｈＡＬＢプライマーが、配列番号２４の核酸配列を含む）と、
第１のＣＡＲプライマー及び第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲ核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
第１のｈＡＬＢプライマー及び第２のｈＡＬＢプライマーを用いてｈＡＬＢ核酸を増幅させ、それによって、増幅したｈＡＬＢ核酸を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅したｈＡＬＢ核酸とｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む、方法を提供する。

別の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、第１のＣＡＲプライマー、第２のＣＡＲプライマー、第１のｈＡＬＢプライマー、及び第２のｈＡＬＢプライマーと接触させること（ここで、第１のＣＡＲプライマーが、配列番号２の核酸配列を含み、第２のＣＡＲプライマーが、配列番号３の核酸配列を含むみ、第１のｈＡＬＢプライマーが、配列番号２３の核酸配列を含み、第２のｈＡＬＢプライマーが、配列番号２４の核酸配列を含む）と、
第１のＣＡＲプライマー及び第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲ核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
第１のｈＡＬＢプライマー及び第２のｈＡＬＢプライマーを用いてｈＡＬＢ核酸を増幅させ、それによって、増幅したｈＡＬＢ核酸を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅したｈＡＬＢ核酸とｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む、方法を提供する。

更なる態様では、本発明は、ＣＡＲＴ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマーと接触させることと、ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーと接触させることと、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第１のｈＡＬＢプライマーと接触させることと、ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第２のｈＡＬＢプライマーと接触させることと、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブと接触させることと、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むｈＡＬＢプローブと接触させることと、
第１のＣＡＲプライマー及び第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲ核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸分子を生成することと、
第１のｈＡＬＢプライマー及び第２のｈＡＬＢプライマーを用いてｈＡＬＢ核酸を増幅させ、それによって、増幅したｈＡＬＢ核酸分子を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸分子とＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅したｈＡＬＢ核酸分子とｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む、方法を提供する。

更なる態様では、本発明は、ＣＡＲＴ細胞を生成する方法であって、
ＣＡＲトランスジーンをＴ細胞に導入して、トランスジーンが組み込まれたＴ細胞を得ることと、ＣＡＲトランスジーンの組み込みを判定すること（ここで、判定は、
配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマー、並びに配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーを用いて、トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
第１の参照遺伝子プライマー及び第２の参照遺伝子プライマーを用いて、トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅した参照遺伝子核酸を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸と、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＣＡＲをプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅した参照遺伝子核酸と参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを、参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することと
を含む）と、
組み込まれたＣＡＲトランスジーンの少なくとも１つのコピーを含むＣＡＲＴ細胞を得ることとを含む、方法を提供する。

より更なる態様では、本発明は、ＣＡＲＴ細胞を生成する方法であって、
ＣＡＲトランスジーンをＴ細胞に導入して、トランスジーンが組み込まれたＴ細胞を得ることと、ＣＡＲトランスジーンの組み込みを判定すること（ここで、判定は、
トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマーと接触させることと、トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーと接触させることと、
トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第１のｈＡＬＢプライマーと接触させることと、トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第２のｈＡＬＢプライマーと接触させることと、
トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブと接触させることと、
トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むｈＡＬＢプローブと接触させることと、
第１のＣＡＲプライマー及び第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲ核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸分子を生成することと、
第１のｈＡＬＢプライマー及び第２のｈＡＬＢプライマーを用いてｈＡＬＢ核酸を増幅させ、それによって、増幅したｈＡＬＢ核酸分子を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸分子とＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅したｈＡＬＢ核酸分子とｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することと
を含む）と、
組み込まれたＣＡＲトランスジーンの少なくとも１つのコピーを含むＣＡＲＴ細胞を得ることとを含む、方法を提供する。

本発明の態様はまた、本明細書に記載の方法によって生成されたＣＡＲＴ細胞を提供する。

特定の実施形態では、増幅したＣＡＲ核酸分子とＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出するステップは、ハイブリダイゼーション前のＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後のＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む。

特定の実施形態では、増幅したｈＡＬＢ核酸分子とｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出するステップは、ハイブリダイゼーション前のｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後のｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む。

特定の実施形態では、増幅ステップのうちの少なくとも１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＲＴ－ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、又は転写媒介増幅（ＴＭＡ）を含む。

特定の実施形態では、増幅される核酸は、アンプリコンである。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識は、フルオロフォアを含む。

本特許又は出願書類は、カラーで作成した少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を備える、本特許又は特許出願公開のコピーは、申請すれば、必要な手数料を支払うことにより、特許庁によって提供される。
シングルプレックスプライマー／プローブスクリーニングアッセイからのゲル画像を示す。マルチプレックスプライマー／プローブスアッセイのゲル画像を示す。ｈＡＬＢセット１でマルチプレックス化されたトランスジーン（ＦＰ）セット１及び（ＲＰ）セット２のゲル画像を示す。トランスジーン（ＦＰ）セット１及び（ＲＰ）セット２の増幅曲線並びにｈＡＬＢセット１の標準曲線を示す。トランスジーン（ＦＰ）セット１及び（ＲＰ）セット２の増幅曲線並びにｈＡＬＢセット１の標準曲線を示す。トランスジーン（ＦＰ）セット１及び（ＲＰ）セット２の増幅曲線並びにｈＡＬＢセット１の標準曲線を示す。トランスジーン（ＦＰ）セット１及び（ＲＰ）セット２の増幅曲線並びにｈＡＬＢセット１の標準曲線を示す。新鮮対凍結の標準曲線（トランスジーン標的）を示す。新鮮対凍結の標準曲線（トランスジーン標的）を示す。環状対線形の標準曲線（トランスジーン標的）を示す。特徴付け対典型のトランスジーンｑＰＣＲ標準曲線を示す。特徴付けトランスジーン標準線形性プロットを示す。例示的なｑＰＣＲプレートレイアウトを示す。例示的な対照定量ｑＰＣＲプレートレイアウトを示す。例示的なトランスジーン線形性プロットを示す。例示的なｈＡＬＢ線形性プロットを示す。ヒト血清アルブミン（ｈＡＬＢ）遺伝子のヌクレオチド配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＭ１２５２３．１を示す。ヒト血清アルブミン（ｈＡＬＢ）遺伝子のヌクレオチド配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＭ１２５２３．１を示す。ヒト血清アルブミン（ｈＡＬＢ）遺伝子のヌクレオチド配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＭ１２５２３．１を示す。ヒト血清アルブミン（ｈＡＬＢ）遺伝子のヌクレオチド配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＭ１２５２３．１を示す。ヒト血清アルブミン（ｈＡＬＢ）遺伝子のヌクレオチド配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＭ１２５２３．１を示す。ヒト血清アルブミン（ｈＡＬＢ）遺伝子のヌクレオチド配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＭ１２５２３．１を示す。配列番号１１を開示する。

前述したことは、異なる図を通して同様の参照記号が同じ部分を表す付属の図に例示されているように、以下の例示的な実施形態のより具体的な説明から明白になるであろう。図面は、必ずしも縮尺どおりではなく、代わりに、実施形態を例示することが重視されている。

例示的実施形態の記述が以下に続く。

本発明のいくつかの態様は、例示のみを目的とした例を参照して、以下に記載される。本発明の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細、関係、及び方法が記載されていることを理解されたい。しかしながら、当業者であれば、本発明は、具体的な詳細のうちの１つ以上を伴わずに実施することができること、又は他の方法、プロトコル、試薬、細胞株、及び動物で実施することができることを容易に認識するであろう。いくつかの行為は、異なる順序で、及び／又は他の行為若しくは事象と並行して生じ得るため、本発明は、例示される行為又は事象の順序によって限定されない。更に、本発明による手法を実施するために、例示された全ての行為、ステップ、又は事象が必要とされるわけではない。本明細書に記載される又は参照される技術及び手順のうちの多くは、当業者によって十分に理解されており、従来の手法を使用して一般的に用いられている。

別途定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、及び他の科学用語、又は専門用語は、本発明が関係する当業者によって通常理解される意味を有することを意図している。場合によっては、通常理解される意味を有する用語は、明確にするため及び／又は即座に参照できるように本明細書に定義され、本明細書におけるかかる定義を含めることは、当該技術分野において概ね理解されているものと実質的な違いを表すと必ずしも解釈されるべきではない。通常使用される辞書で定義されているものなどの用語は、関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有するものとして、及び／又は本明細書において別様に定義されているものとして解釈する必要があることが更に理解されるであろう。

本明細書で使用される用語は、あくまで特定の実施形態を説明する目的のものに過ぎず、限定を目的としたものではない。本明細書で使用される場合、文脈により別途明確に示されない限り、冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数の指示物を含むものと理解されたい。

用語「含む（comprising）」、又は「含む（comprises）」若しくは「含む（comprising）」などの変形は、本明細書で使用するとき、記載された要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群を包含するが、任意の他の要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群を除外するものではないことを示すために使用され得る。

本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するためのキット及び方法に関する。更に、ＣＡＲＴ細胞へのトランスジーン組み込みを定量するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば定量ＰＣＲを実行するための、プローブ及びプライマーのパネルが提供される。

いくつかの実施形態では、本発明によって記載されるトランスジーンｑＰＣＲ方法及びキットは、ＣＡＲＴ薬物産物に組み込まれたＢＣＭＡＣＡＲトランスジーンプラスミドを定量するために設計されたマルチプレックス定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）アッセイを含む。（１）ＢＣＭＡＣＡＲトランスジーンプラスミド（トランスジーン）及び（２）ヒトアルブミン（ｈＡＬＢ）参照遺伝子の両方を、このｑＰＣＲ法で増幅させる。トランスジーン標的のためのプライマー及びプローブセットは、存在し、ＣＡＲＴ薬物産物に組み込まれたＢＣＭＡＣＡＲトランスジーンプラスミドのみを確実に検出するために、プラスミドのＣＤ１３７領域とＣＤ３ｚ領域との間の接合部を増幅させる。

キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結された抗体の抗原結合ドメインを含有する人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチド（ｓｃＦｖ）である。本明細書で使用するとき、用語「Ｔ細胞」、「Ｔ－細胞」、及び「Ｔリンパ球」は、互換的に使用される。ＣＡＲの特徴としては、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、非ＭＨＣ拘束的に、選択された標的に向けてＴ細胞の特異性及び反応性をリダイレクトする能力を挙げることができる。非ＭＨＣ制限抗原認識により、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、抗原プロセシングとは無関係に抗原を認識することができるため、腫瘍逃避の主要なメカニズムを迂回する。更に、Ｔ細胞において発現される場合、ＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖と有利には二量体化しない。

本明細書に記載のＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、以下に定義された刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞質シグナル伝達ドメイン」とも称される）とを含む、組み換えポリペプチドコンストラクトを提供する。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、本明細書では、ＣＡＲＴ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はＣＡＲ改変Ｔ細胞と称され、これらの用語は、本明細書において互換的に使用される。安定してその表面上で抗体結合ドメインを発現し、ＭＨＣ非依存性の新規抗原特異性を付与するように、細胞を遺伝的に改変することができる。

場合によっては、特異的抗体の抗原認識ドメインをＣＤ３－ゼータ鎖又はＦｃγＲＩタンパク質の細胞内ドメインと組み合わせて単一のキメラタンパク質にするＣＡＲを安定して発現するように、Ｔ細胞を遺伝的に改変する。一実施形態では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖である。

「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、本用語が本明細書において使用されるとき、分子の細胞内部分を指す。これは、タンパク質の機能的部分であり、セカンドメッセンジャを生成することにより定められたシグナル伝達経路を介して細胞活動を調節するために細胞内で情報を伝達することによって作用する、又はかかるメッセンジャに応答することによりエフェクタとして機能することによって作用する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクタ機能を促進するシグナルを発生させる。例えばＣＡＲＴ細胞における免疫エフェクタ機能の例としては、細胞溶解活性及びヘルパー活性（サイトカインの分泌を含む）が挙げられる。

一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。一次細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、一次刺激又は抗原依存性シミュレーションに関与する分子に由来するものが挙げられる。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、共刺激シグナル又は抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが挙げられる。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質配列を含み得、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体又は共刺激分子からの細胞質配列を含み得る。

一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＣＤ３－ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、並びにＣＤ６６ｄＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施形態では、シグナル伝達配列は、ＣＤ３－ゼータである。

用語「ゼータ」、あるいは「ゼータ鎖」、「ＣＤ３－ゼータ」、又は「ＴＣＲ－ゼータ」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、又は非ヒト種、例えば、ネズミ、ウサギ、霊長類、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価な残基として定義され、「ゼータ刺激ドメイン」、あるいは「ＣＤ３－ゼータ刺激ドメイン」又は「ＴＣＲ－ゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞の活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分なゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義される。一態様では、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４、又はその機能的オルソログである、非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する等価な残基を含む。

「共刺激分子」という用語は、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指し、共刺激リガンドと特異的に結合することにより、Ｔ細胞による共刺激応答（例えば、限定するものではないが、増殖）を媒介する。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ、及びＴｏｌｌリガンド受容体、並びにＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、及び４－１ＢＢ（本明細書では「ＣＤ１３７」とも称される）が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施形態では、共刺激分子は、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）である。

共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリー：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及び活性化ＮＫ細胞受容体で表すことができる。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。

細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体（すなわち、全長）若しくはネイティブの細胞内シグナル伝達ドメイン全体、又はそれらの機能的断片を含み得る。

用語「４－１ＢＢ」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列を有する腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバー、又は非ヒト種、例えば、哺乳類（マウス、げっ歯類、サル、類人猿など）からの等価な残基を指し、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４～２５５、又は非ヒト種、例えば、哺乳類（マウス、げっ歯類、サル、類人猿など）からの等価な残基として定義される。

いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、本明細書で定義される少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ又は２つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを更に含む。一実施形態では、共刺激分子は、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ３－ゼータ、及び／又はＣＤ２８から選択される。ＣＤ２８は、Ｔ細胞共刺激において重要なＴ細胞マーカーである。ＣＤ２７は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであり、共刺激免疫チェックポイント分子として機能する。４－１ＢＢは、Ｔ細胞に強力な共刺激シグナルを伝達し、分化を促進し、Ｔリンパ球の長期生存期間を向上させる。ＣＤ３－ゼータは、ＴＣＲと会合してシグナルを生成し、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs、ＩＴＡＭ）を含有する。

一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８を含む細胞内ヒンジドメインと、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ３－ゼータ、及びこれらの組み合わせを含む細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとを含む。

特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８ａ膜貫通、ＣＤ１３７、及びＣＤ３ｚコード領域を含む。

本開示は、ＣＡＲＴ産物、例えば、本明細書に記載のＣＡＲ、核酸、ポリペプチド、及びタンパク質の機能的バリアントに組み込まれたバリアントプラスミドを定量するのに有用なプライマー、プローブ、及び関連キットを更に提供する。本明細書で使用するとき、用語「バリアント」は、１つ以上の改変、例えば、置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドと異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用するとき、「機能的バリアント」という用語は、親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質と実質的又は著しい配列同一性又は類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を指し、これらの機能的バリアントは、バリアントであるＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質の生物活性を保持する。機能的バリアントは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質（親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質）のバリアントを包含し、親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質と同様の程度、同程度、又はより高い程度で標的細胞を認識する能力を保持する。親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に関して、機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に対して、アミノ酸配列が少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれ以上同一であり得る。

機能的バリアントは、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。別の実施形態では、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物活性を抑制又は阻害することができない。非保存的アミノ酸置換により、機能的バリアントの生物活性を向上させることができ、その結果、機能的バリアントの生物活性は、親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質と比較して増加する。

ＣＡＲのアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であってよい。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野において既知であり、特定の物理的及び／又は化学的特性を有する１つのアミノ酸を、同じ又は類似の化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸と交換するアミノ酸置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換は、別の酸性アミノ酸で置換された酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）、非極性側鎖を有する別のアミノ酸で置換された非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌなど）、別の塩基性アミノ酸で置換された塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇなど）、極性側鎖を有する別のアミノ酸で置換された極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）等であり得る。

ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列から本質的になっていてよく、その結果、他の構成成分、例えば、他のアミノ酸は、ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質の生物活性を実質的に変化させない。

本明細書に記載の方法／キットで利用されるポリペプチドを生成するために利用される組み換え核酸を生成するために使用することができる改変ヌクレオチドの例としては、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ^６－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ^６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、クエオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ^６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６－ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の核酸は、ＣＡＲ、ポリペプチド若しくはタンパク質、又はこれらの機能的部分若しくは機能的バリアントのいずれかをコードしている、任意の単離又は精製されたヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、ヌクレオチド配列は、配列のいずれかに縮重したヌクレオチド配列、又は縮重配列の組み合わせを含み得る。

本発明のいくつかの実施形態はまた、本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列、又は本明細書に記載の核酸のいずれかの核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸を利用する。

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る。

本明細書で記載するとき、「高ストリンジェンシー条件」は、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に多い量で標的配列（本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件は、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド又は点在するミスマッチをほんのわずかに含むポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列とマッチしたいくつかの小領域（例えば、３～１２塩基）を有することになったランダム配列と識別する条件を含む。このような相補的な小領域は、１４～１７個又はそれ以上の塩基の完全長相補体よりも容易に融解し、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションにより、それらが容易に識別可能となる。比較的高ストリンジェンシーな条件は、例えば、約５０～７０℃の温度で約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌ又は等価物などによって提供されるものなど、低塩及び／又は高温条件を含む。このような高ストリンジェンシー条件は、ヌクレオチド配列とテンプレート鎖又は標的鎖との間にミスマッチがあったとしてもほとんど許容せず、本明細書に記載のＣＡＲ核酸へのハイブリダイゼーションに特に好適である。条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントになり得ることが、概ね理解される。

本明細書で使用するとき、用語「組み換え発現ベクター」とは、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの発現を可能にする、遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンストラクトを意味し、その場合、コンストラクトが、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを細胞内で発現させるのに十分な条件下で、ベクターを細胞と接触させる。本明細書に記載のベクターは、全体として天然には存在しない。しかしながら、ベクターの一部は、天然に存在し得る。記載される組み換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖であり得、合成されるか、又は一部が天然の供給源から得られ得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含有し得る）を含むがこれらに限定されない、任意のタイプのヌクレオチドを含み得る。組み換え発現ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間連結、若しくは天然に存在しないヌクレオチド間連結、又は両方のタイプの連結を含み得る。天然に存在しない又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間連結は、ベクターの転写又は複製を阻害しない。

一実施形態では、組み換え発現ベクターは、任意の好適な組み換え発現ベクターであってよく、任意の好適な宿主を形質転換又はトランスフェクトするために使用することができる。好適なベクターとしては、プラスミド及びウイルスなどの繁殖及び増殖のため、若しくは発現のため、又は両方のために設計されたベクターが挙げられる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（ＦｅｒｍｅｎｔａｓＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＧｌｅｎＢｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）からなる群から選択され得る。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのバクテリオファージベクターを使用することができる。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ０１．２、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１．３、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。組み換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであり得る。

一実施形態では、組換え発現ベクターは、例えば、ＡｕｓｕｂｅｌＦＭ，ＢｒｅｎｔＲ，ＫｉｎｇｓｔｏｎＲＥｅｔａｌ．（ｅｄｓ）（１９９９）ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈｅｄｎ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＷｉｌｅｙＧｒｅｅｎＭＲａｎｄＳａｍｂｒｏｏｋＪ．（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，４ｔｈｅｄｎ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋに記載の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製される。環状又は線状である発現ベクターのコンストラクトは、原核又は真核の宿主細胞において機能する複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、ＳＶ４０、２μプラスミド、λ、ウシ乳頭腫ウイルスなどに由来し得る。

特定の実施形態では、本開示によって利用される発現ベクターは、標準及び対照を作製するためのプラスミドの作業ストックを調製するために線形化される。

組み換え発現ベクターは、適宜、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、又は動物）に特異的な、転写及び翻訳の開始及び終止コドンなどの調節配列を含み得る。

組み換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクションされた宿主の選択を可能にする１つ以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性）、栄養要求性宿主における原栄養を提供するための補完などを含む。記載される発現ベクターに好適なマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ヒスチジノールｘ耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。

組み換え発現ベクターは、ＣＡＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質（機能的部分及びその機能的バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列に、又はＣＡＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的であるか若しくはそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列に、作動可能に連結された天然の又は規範のプロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例えば、強い、弱い、組織特異的、誘導性、及び発生特異的は、当業者の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることも当業者の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター又はウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、又はネズミ幹細胞ウイルスの長い末端反復に見出されるプロモーターであり得る。

組み換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のためのいずれか、又はその両方のために設計され得る。また、組み換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導性発現のために作製され得る。

更に、組み換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用するとき、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞に対し薬剤（例えば、薬物）に対する感受性を付与し、細胞が薬剤と接触したとき又は薬剤に曝露されたときに細胞を死に至らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野において既知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（Herpes Simplex Virus、ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（thymidine kinase、ＴＫ）遺伝子、シトシンダミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼが挙げられる。

ＣＡＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質（その機能的部分又はバリアントのいずれかを含む）、宿主細胞、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞集団、又は抗体、若しくはその抗原結合部分のいずれかを含むコンジュゲート、例えば、バイオコンジュゲートは、本発明の範囲内に含まれる。コンジュゲート、並びにコンジュゲートの合成方法は、概ね、当該技術分野において既知である（例えば、Ｈｕｄｅｃｚ，Ｆ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９８：２０９－２２３（２００５）及びＫｉｒｉｎｅｔａｌ．，ＩｎｏｒｇＣｈｅｍ．４４（１５）：５４０５－５４１５（２００５）を参照）。

特定の実施形態では、本発明の実施形態で利用される組換え発現ベクターは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体の様々な構成要素を含むベクターである。プラスミドは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０２５０３８（Ａ１）号における配列番号１７５～１９７、２０２～２０５、２１８～２２７、２３９、２６１～２６４、及び２７１～２７６によって開示されている通り、ＢＣＭＡキメラ抗原受容体の様々な構成要素をコードしている配列を含有する８，５１８塩基対（ｂｐ）のプラスミドである。一態様では、プラスミドは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインをコードしており、細胞外抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡ抗原に結合する。本明細書で使用するとき、用語「Ｂ細胞」、「Ｂ－細胞」、及び「Ｂリンパ球」は、互換的に使用される。一実施形態では、プラスミドは、国際公開第２０１７／０２５０３８（Ａ１）号からの配列番号１７５～１９７、２０２～２０５、２１８～２２７、２３９、２６１～２６４、及び２７１～２７６のいずれかの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、国際公開第２０１７／０２５０３８（Ａ１）号からの配列番号１７５～１９７、２０２～２０５、２１８～２２７、２３９、２６１～２６４、及び２７１～２７６のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。

「コード（すること）」という用語は、ヌクレオチドの特定された配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又はアミノ酸の特定された配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的配列の固有の特性、並びにそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、細胞又は他の生物系において、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳がタンパク質を生成する場合、その遺伝子、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡは、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖とはいずれも、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードするとして言及され得る。

別途記載のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であるヌクレオチド配列、及び同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列全てを包含する。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という句はまた、いくつかの場合においてそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列がイントロンを含有し得る程度にイントロンを包含し得る。

一実施形態では、本開示は、国際公開第２０１７／０２５０３８（Ａ１）号からの配列番号１７５～１９７、２０２～２０５、２１８～２２７、２３９、２６１～２６４、及び２７１～２７６のいずれかの核酸配列を含む発現ベクターを提供する。

「発現ベクター」という用語は、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含む、ベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用要素を含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、又はインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターとしては、組み換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、裸の、又はリポソームに含有されるもの）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含む、当該技術分野において既知の全てのベクターが挙げられる。

ＣＡＲＴ細胞を生成し、ＣＡＲＴ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量する方法
一態様では、本発明は、ＣＡＲＴ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマーと接触させることと、ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーと接触させることと、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第１のｈＡＬＢプライマーと接触させることと、ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む第２のｈＡＬＢプライマーと接触させることと、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブと接触させることと、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むｈＡＬＢプローブと接触させることと、
第１のＣＡＲプライマー及び第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲアンプリコンを増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸分子を生成することと、
第１のｈＡＬＢプライマー及び第２のｈＡＬＢプライマーを用いてｈＡＬＢアンプリコンを増幅させ、それによって、増幅したｈＡＬＢ核酸分子を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸分子とＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅したｈＡＬＢ核酸分子とｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲプライマーの接触ステップは、ｈＡＬＢプライマーとは別個の反応で行われる。他の実施形態では、接触ステップは、同じ反応で行われる（すなわち、マルチプレックス化）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲプローブの接触ステップは、ｈＡＬＢプローブとは別個の反応で行われる。他の実施形態では、接触ステップは、同じ反応で行われる（すなわち、マルチプレックス化）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲアンプリコンの増幅ステップは、ｈＡＬＢアンプリコンとは別個の反応で行われる。他の実施形態では、増幅ステップは、同じ反応で行われる（すなわち、マルチプレックス化）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ核酸及びＣＡＲプローブのハイブリダイゼーションの検出ステップは、ｈＡＬＢ核酸及びｈＡＬＢプローブとは別個の反応で行われる。他の実施形態では、検出ステップは、同じ反応で行われる（すなわち、マルチプレックス化）。

いくつかの実施形態では、方法は、約２０～約４０ヌクレオチド長の第１のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲ核酸を増幅させることを伴う。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、国際公開第２０１７／０２５０３８（Ａ１）号からの配列番号１７５～１９７、２０２～２０５、２１８～２２７、２３９、２６１～２６４、及び２７１～２７６のいずれかとして記載のＣＡＲ核酸配列に対して高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることができる。

プライマー、すなわち、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる。

いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、及び配列番号２０からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、及び配列番号２０からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、及び配列番号２０からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号２として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号２として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号２として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号５として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号５として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号５として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号８として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号８として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号８として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号１１として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号１１として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号１１として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号１４として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号１４として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号１４として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号１７として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号１７として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号１７として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号２０として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号２０として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のＣＡＲプライマーは、配列番号２０として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、約２０～約４０ヌクレオチド長の第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲ核酸を増幅させることを伴う。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、国際公開第２０１７／０２５０３８（Ａ１）号からの配列番号１７５～１９７、２０２～２０５、２１８～２２７、２３９、２６１～２６４、及び２７１～２７６のいずれかとして記載のＣＡＲ核酸配列に対して高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることができる。

いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、及び配列番号２１からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、及び配列番号２１からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、及び配列番号２１からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号３として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号３として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号３として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号６として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号６として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号６として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号９として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号９として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号９として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号１２として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号１２として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号１２として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号１５として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号１５として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号１５として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号１８として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号１８として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号１８として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号２１として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号２１として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のＣＡＲプライマーは、配列番号２１として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、約２０～約４０ヌクレオチド長のＣＡＲ特異的プローブにＣＡＲ核酸分子をハイブリダイズさせることと、ＣＡＲ核酸とプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することとを伴う。いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ特異的プローブは、国際公開第２０１７／０２５０３８（Ａ１）号からの配列番号１７５～１９７、２０２～２０５、２１８～２２７、２３９、２６１～２６４、及び２７１～２７６のいずれかとして記載のＣＡＲ核酸配列に対して高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることができる。

いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションを検出するステップは、ゲル電気泳動、サザンブロットなどであるがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の従来の分子生物学技術によって実施することができる。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ特異的プローブは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、及び配列番号１９からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、及び配列番号１９からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、プローブは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、及び配列番号１９からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ特異的プローブは、配列番号１として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号１として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、プローブは、配列番号１として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ特異的プローブは、配列番号４として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号４として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＡＲ特異的プローブは、配列番号４として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ特異的プローブは、配列番号７として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号７として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、プローブは、配列番号７として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ特異的プローブは、配列番号１０として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号１０として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、プローブは、配列番号１０として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ特異的プローブは、配列番号１３として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号１３として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、プローブは、配列番号１３として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ特異的プローブは、配列番号１６として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号１６として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、プローブは、配列番号１６として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ特異的プローブは、配列番号１９として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号１９として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、プローブは、配列番号１９として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、約２０～約４０ヌクレオチド長の第１のｈＡＬＢプライマーを用いてｈＡＬＢ核酸を増幅させることを伴う。いくつかの実施形態では、第１のｈＡＬＢプライマーは、配列番号３１として記載のｈＡＬＢ核酸配列（図１３）に対して高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることができる。

いくつかの実施形態では、第１のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２３、配列番号２６、及び配列番号２９からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２３、配列番号２６、及び配列番号２９からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２３、配列番号２６、及び配列番号２９からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２３として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２３として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２３として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２６として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２６として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２６として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２９として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２９として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２９として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、約２０～約４０ヌクレオチド長の第２のｈＡＬＢプライマーを用いてｈＡＬＢ核酸を増幅させることを伴う。いくつかの実施形態では、第２のｈＡＬＢプライマーは、配列番号３１として記載のｈＡＬＢ核酸配列に対して高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることができる。

いくつかの実施形態では、第２のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２４、配列番号２７、及び配列番号３０からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２４、配列番号２７、及び配列番号３０からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２４、配列番号２７、及び配列番号３０からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第２のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２４として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２４として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２４として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第２のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２７として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２７として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のｈＡＬＢプライマーは、配列番号２７として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第２のｈＡＬＢプライマーは、配列番号３０として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のｈＡＬＢプライマーは、配列番号３０として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のｈＡＬＢプライマーは、配列番号３０として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、約２０～約４０ヌクレオチド長のｈＡＬＢ特異的プローブにｈＡＬＢ核酸分子をハイブリダイズさせることと、ｈＡＬＢ核酸とプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することとを伴う。いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、ｈＡＬＢ特異的プローブは、配列番号３１として記載のｈＡＬＢ核酸配列に対して高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることができる。

いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号２２、配列番号２５、及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号２２、配列番号２５、及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、プローブは、配列番号２２、配列番号２５、及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号２２として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号２２として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、プローブは、配列番号２２として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号２５として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号２５として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、プローブは、配列番号２５として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号２８として記載の核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号２８として記載の核酸配列と少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態では、プローブは、配列番号２８として記載の核酸配列と少なくとも約９５％同一の核酸配列を含む。

特定の態様では、本発明は、ＣＡＲＴ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号１１の核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマーと接触させることと、ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号１２の核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーと接触させることと、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号２３の核酸配列を含む第１のｈＡＬＢプライマーと接触させることと、ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号２４の核酸配列を含む第２のｈＡＬＢプライマーと接触させることと、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブと接触させることと、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、配列番号２２のヌクレオチド配列を含むｈＡＬＢプローブと接触させることと、
第１のＣＡＲプライマー及び第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲ核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸分子を生成することと、
第１のｈＡＬＢプライマー及び第２のｈＡＬＢプライマーを用いてｈＡＬＢ核酸を増幅させ、それによって、増幅したｈＡＬＢ核酸分子を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸分子とＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅したｈＡＬＢ核酸分子とｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む、方法を提供する。

別の態様では、本発明は、ＣＡＲＴ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
配列番号１１の核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマー及び配列番号１２の核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
第１の参照遺伝子プライマー及び第２の参照遺伝子プライマーを用いてＣＡＲＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅した参照遺伝子核酸を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅した参照遺伝子核酸と参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを、参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む、方法を提供する。

更に別の態様では、本発明は、ＣＡＲＴ細胞を生成する方法であって、
ＣＡＲトランスジーンをＴ細胞に導入して、トランスジーンが組み込まれたＴ細胞を得ることと、
ＣＡＲトランスジーンの組み込みを判定する（ここで、判定は、
配列番号１１の核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマー及び配列番号１２の核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーを用いて、トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
第１の参照遺伝子プライマー及び第２の参照遺伝子プライマーを用いて、トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅した参照遺伝子核酸を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅した参照遺伝子核酸と参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを、参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することと
を含む）と、
組み込まれたＣＡＲトランスジーンの少なくとも１つのコピーを含むＣＡＲＴ細胞を得ることとを含む、方法を提供する。

「参照遺伝子」は、標的遺伝子とは異なる配列を有する内部反応対照を指す。参照と見なされる遺伝子については、いくつかの重要な基準を満たす必要がある（ＣｈｅｒｖｏｎｅｖａＩ，ＬｉＹ，ＳｃｈｕｌｚＳ，ＣｒｏｋｅｒＳ，ＷｉｌｓｏｎＣ，ＷａｌｄｍａｎＳＡ，ＨｙｓｌｏｐＴ．ＳｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｏｐｔｉｍａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｅｓｆｏｒｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ－ＰＣＲ．ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａ．２０１０；１１：２５３．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１０５－１１－２５３．）。最も重要なのは、その発現レベルが実験的要因によって影響を受けない必要があることである。また、生物の組織間及び生理学的状態間で発現が最小限の変動しか示さない必要がある。対象となる遺伝子と同様の閾値サイクルを示す参照遺伝子を選ぶことが望ましい。参照遺伝子は、使用される技術及び調製手順が不完全であることから生じる変動を示す必要があり、これにより、遺伝物質の量の任意の変動が、研究対象及び対照と同じ程度に関連することが保証される。前述の基準を満たす「参照遺伝子」の例は、ハウスキーピング遺伝子と呼ばれる基本的な代謝遺伝子であり、これは、定義により、細胞の生存に不可欠なプロセスに関与している。参照遺伝子として有用なハウスキーピング遺伝子はまた、安定かつ調節されない一定レベルで発現する必要がある（ＴｈｅｌｌｉｎＯ，ＺｏｒｚｉＷ，ＬａｋａｙｅＢ，ＤｅＢｏｒｍａｎＢ，ＣｏｕｍａｎｓＢ，ＨｅｎｎｅｎＧ，ＧｒｉｓａｒＴ，ＩｇｏｕｔＡ，ＨｅｉｎｅｎＥ．Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇｇｅｎｅｓａｓｉｎｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｓ：Ｕｓｅａｎｄｌｉｍｉｔｓ．ＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９；７５：２９１－２９５．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１６８－１６５６（９９）００１６３－７）。本発明の方法、キット、及びプライマー／プローブにおいて「参照遺伝子」として有用なハウスキーピング遺伝子としては、ＬＤＨＡ、ＮＯＮＯ、ＰＧＫ１、ＰＰＩＨ、Ｃ１ｏｒｆ４３、ＣＨＭＰ２Ａ、ＥＭＣ７、ＧＰＩ、ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＢ４、ＲＡＢ７Ａ、ＲＥＥＰ５、ＳＮＲＰＤ３、ＶＣＰ、及びＶＰＳ２９が挙げられるが、これらに限定されない。

別の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、第１のＣＡＲプライマー、第２のＣＡＲプライマー、第１の参照遺伝子プライマー、及び第２の参照遺伝子プライマーと接触させること（ここで、第１のＣＡＲプライマーが、配列番号１１の核酸配列を含み、第２のＣＡＲプライマーが、配列番号１２の核酸配列を含む）と、
第１のＣＡＲプライマー及び第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲ核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
第１の参照遺伝子プライマー及び第２の参照遺伝子プライマーを用いて参照遺伝子核酸を増幅させ、それによって、増幅した参照遺伝子核酸を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅した参照遺伝子核酸と参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを、参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、増幅したＣＡＲ核酸とＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションの検出は、ハイブリダイゼーション前のＣＡＲプローブに結合している標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後のＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む。いくつかの実施形態では、増幅した参照遺伝子核酸分子と参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションの検出は、ハイブリダイゼーション前の参照遺伝子プローブに結合している標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後の参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む。いくつかの実施形態では、参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識は、フルオロフォアを含む。

いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションを検出するステップは、ゲル電気泳動、サザンブロットなどであるがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の従来の分子生物学技術を用いて実施することができる。

ＰＣＲは、当業者に周知である。ＰＣＲは、特定のＤＮＡセグメントの多くのコピーを作製するために分子生物学で広く使用されている方法である。ＰＣＲを使用して、ＤＮＡ配列の単一のコピー（又はそれ以上）が指数関数的に増幅されて、その特定のＤＮＡセグメントが数千～数百万コピー生成される。ほとんどのＰＣＲ法は、熱サイクルに依存する。熱サイクルは、反応物質を加熱及び冷却の繰り返しサイクルに曝露して、異なる温度依存反応－ＤＮＡ融解及び酵素駆動ＤＮＡ複製を可能にする。ＰＣＲは、２つの主な試薬－プライマー（標的ＤＮＡ領域に相補的な配列であるオリゴヌクレオチドとして知られている短い単鎖ヌクレオチド断片）及びＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＰＣＲの最初のステップでは、ＤＮＡ融解によって、ＤＮＡ二重らせんの２本の鎖を高温で物理的に分離させる。第２のステップでは、温度を下げ、ＤＮＡの相補的配列にプライマーを結合させる。次いで、２本のＤＮＡ鎖がＤＮＡポリメラーゼのテンプレートとなり、反応混合物中の利用可能な遊離ヌクレオチドから新たなＤＮＡ鎖を酵素的に組み立てる。ＰＣＲが進行するにつれて、生成されたＤＮＡは、それ自体を複製のためのテンプレートとして使用するため、元のＤＮＡテンプレートが指数関数的に増幅される。典型的には、ＰＣＲ用途では、元々好熱性細菌サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）から単離された酵素であるＴａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる。

定量ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、当業者に知られているように、サンプル中に存在する所与の配列の量を推定することを可能にし、多くの場合、遺伝子発現のレベルを定量的に求めるために適用される技術である。定量ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅の各ラウンド後のＤＮＡ産物の蓄積を測定するＤＮＡ定量のための確立されたツールである。ｑＰＣＲは、合成プロセスが行われている間に濃度を測定するので、リアルタイムで特定のＤＮＡ配列を定量及び検出することができる。

逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）は、当業者に知られているように、ＰＣＲを使用してＲＮＡのＤＮＡ（相補的ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）への逆転写を特定のＤＮＡ標的の増幅と組み合わせた検査技術である。これは概して、特定のＲＮＡの量を測定するために使用される。これは、リアルタイムＰＣＲ又は定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）と呼ばれる技術によって、蛍光を使用して増幅反応をモニタリングすることによって達成される。ＲＴ－ＰＣＲ及びｑＰＣＲの組み合わせは、ＲＮＡの遺伝子発現及び定量の分析に日常的に使用される。

当業者に知られているように、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、ＤＮＡ増幅の方法である。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、２つのプローブ又は他の分子を互いに接合するために熱安定性リガーゼを伴うという点でＰＣＲとは異なる増幅プロセスであり、分子は、その後、標準的なＰＣＲサイクリングによって増幅され得る。

転写媒介増幅（ＴＭＡ）は、当業者に知られているように、２つの酵素、ＲＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素を利用する等温単一チューブ核酸増幅システムである。ＰＣＲ及びＬＣＲとは対照的に、ＴＭＡ法は、標的核酸からＲＮＡアンプリコン（増幅の供給源又は産物）を生成するために（ＲＮＡポリメラーゼを介した）ＲＮＡ転写及び（逆転写酵素を介した）ＤＮＡ合成を伴う。

いくつかの実施形態では、本開示によって記載される方法は、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）などであるがこれに限定されない、当該技術分野において公知の他の定量ＰＣＲ方法を利用する。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識は、フルオロフォアを含む。用語「フルオロフォア」は、本明細書で使用するとき、プローブがハイブリダイズするヌクレオチド配列の定量及び検出に使用することができる任意の蛍光化合物又はタンパク質を指す。

本開示はまた、ＣＡＲ核酸、例えば、ＣＡＲコンストラクトのＣＤ１３７／ＣＤ３ｚ接合部にまたがる核酸配列にハイブリダイズし、増幅させることができるプライマーに関する。記載されるプライマーは、本明細書に記載の方法で利用することができる。いくつかの実施形態では、これらのプライマーは、約２０～約４０ヌクレオチド長であり、国際公開第２０１７／０２５０３８（Ａ１）号からの配列番号１７５～１９７、２０２～２０５、２１８～２２７、２３９、２６１～２６４、及び２７１～２７６のいずれかとして記載のＣＡＲ核酸配列に対して超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる。

いくつかの実施形態では、これらのプライマーは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、又は配列番号２０として記載の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、これらのプライマーは、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、又は配列番号２１として記載の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を更に含む。

本開示はまた、様々なＣＡＲ核酸配列、例えば、ＣＡＲコンストラクトのＣＤ１３７／ＣＤ３ｚ接合部にまたがる様々な核酸配列にハイブリダイズし、識別することができるプローブに関する。記載されるプローブは、本明細書に記載の方法で利用することができる。いくつかの実施形態では、これらのプローブは、約２０～約４０ヌクレオチド長であり、国際公開第２０１７／０２５０３８（Ａ１）号からの配列番号１７５～１９７、２０２～２０５、２１８～２２７、２３９、２６１～２６４、及び２７１～２７６のいずれかとして記載のＣＡＲ核酸配列に対して超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、これらのプローブは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、又は配列番号１９として記載の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む。

一態様では、本発明は、プローブ及びプライマーセットであって、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブと、プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号１１の核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマーと、核酸配列１２の核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーとを含む、プローブ及びプライマーセットを提供する。一実施形態では、プローブ及びプライマーセットは、配列番号２２のヌクレオチド配列を含むｈＡＬＢプローブと、プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号２３の核酸配列を含む第１のｈＡＬＢプライマーと、核酸配列２４の核酸配列を含む第２のｈＡＬＢプライマーとを更に含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標識は、放射性同位体、酵素基質、化学発光剤、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、化学物質、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、標識を、光化学的、化学的、及び電気化学的手段を通して発光させるようにしてよい。

本発明はまた、ＣＡＲＴ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するためのキットを提供する。用語「キット」は、本明細書で使用するとき、試薬と他の材料との組み合わせを指す。キットは、緩衝剤、タンパク質安定化試薬、シグナル生成系（例えば、蛍光シグナル発生系）、抗体、対照タンパク質などの試薬、並びに試験容器（例えば、マイクロタイタープレートなど）を含み得ることが企図される。用語「キット」は、試薬及び／又は他の材料の特定の組み合わせに限定されることを意図するものではない。一実施形態では、キットは、試薬を使用するための説明書を更に含む。キットは、典型的には、試験を実施するための説明書のシートに加えて、単一の容器又は必要に応じて様々な容器内の要素と共に、任意の好適な様式でパッケージングされ得る。いくつかの実施形態では、キットは、陽性対照サンプルも含む。キットは、当該技術分野で公知の様々な方法で生産され得る。

一態様では、ＣＡＲＴ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するためのキットは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むプローブと、プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号１１の核酸配列を含む第１のプライマーと、核酸配列１２の核酸配列を含む第２のプライマーとを含む。一実施形態では、キットは、配列番号２２のヌクレオチド配列を含むｈＡＬＢプローブと、プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号２３の核酸配列を含む第１のｈＡＬＢプライマーと、核酸配列２４の核酸配列を含む第２のｈＡＬＢプライマーとを更に含む。

特定の実施形態では、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識は、放射性同位体、酵素基質、化学発光剤、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、化学物質、又はそれらの組み合わせを含む。

本発明によって記載される態様で使用するとき、用語「標識」は、検出可能なシグナルを生成することができる部分、すなわち、シグナルを発生させる検出手段によって少量を検出することができる部分を指す。好適なそのような手段の例としては、分光学的若しくは光化学的手段、例えば、蛍光若しくは発光、又は生化学的、免疫化学的、若しくは化学的手段、例えば、検出器分析化合物との接触時又は検出可能な複合体を形成するためのポリペプチド若しくはポリペプチド／酵素混合物との反応時の物理的、生化学的、免疫化学的、又は化学的特性の変化が挙げられる。したがって、本明細書で使用するとき、用語「標識」は、放射性同位体又は蛍光色素などの直接検出することができる部分、並びに基質と反応して分光光度法で検出することができる産物を形成する酵素などの検出可能な産物を形成する反応を介して間接的に検出される反応性部分の両方を含むことが意図される。標識試薬は、放射性同位体などの放射性標識部分を含有し得ることに留意されたい。一実施形態では、本明細書におけるハイブリダイゼーションプローブは、放射能分析に関連する不利を回避するために非放射活性物質で標識される。

本発明によって記載される方法及びキットにおける標的検出スキームの使用については、伸長しているＤＮＡプライマー／テンプレートにｄＮＴＰが組み込まれた後に蛍光又は化学発光シグナルが発生するように化合物を共有結合させることによって、ヌクレオチド塩基を標識する。

ｄＮＴＰを標識するための蛍光化合物の例としては、フルオレセイン、ローダミン、及びＢＯＤＩＰＹ（４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン）が挙げられるが、これらに限定されない。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）から入手可能な「ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓａｎｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＣｈｅｍｉｃａｌｓ」を参照。使用することができる化学発光系化合物の例としては、ルミノール及びジオキセタノンが挙げられるが、これらに限定されない（ＧｕｎｄｅｎｎａｎａｎｄＭｃＣａｐｒａ，「ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｌｅｂｅｒｇ，１９８７を参照）。

蛍光又は化学発光的に標識されたｄＮＴＰを、プライマーにアニーリングしたテンプレートＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、及び適切なバッファ条件を含有するＤＮＡテンプレート系に個別に添加する。反応間隔の後、過剰なｄＮＴＰを除去し、蛍光又は化学発光タグ付きヌクレオチドがＤＮＡテンプレートに組み込まれているかどうかを検出するために系をプロービングする。組み込まれたヌクレオチドの検出は、利用されるタグの種類に依存する様々な方法を使用して達成することができる。

蛍光タグ付きｄＮＴＰの場合、タグ本体によって強く吸収される波長における光放射をＤＮＡテンプレート系に照射してよい。例えば、励起波長での任意の散乱光を排除する光学フィルタと共に光検出器を使用して、タグからの蛍光を検出する。

本明細書に記載のキット及び方法において蛍光検出を利用する更なる実施形態では、蛍光タグが、光切断可能又は化学的に切断可能なリンカーによってｄＮＴＰに結合しており、伸長反応後にタグを切り離し、テンプレート系から検出細胞に移動させ、そこで、好適な波長における光励起及び蛍光の検出によってタグの存在及び量を求める。この実施形態では、テンプレート内の単一塩基反復領域に対して相補的に伸長したプライマー鎖上で互いに直接隣接している複数の蛍光タグの存在に起因して、蛍光消光の可能性が最小限に抑えられ、反復数を求めることができる正確度が最適化される。更に、別個のチャンバ内で蛍光を励起することにより、ＤＮＡプライマー／テンプレート系に対する光分解損傷の可能性が最小限に抑えられる。

一実施形態では、プローブは、５’６－ＦＡＭ（商標）（フルオレセイン）標識を含む。６－ＡＭ（商標）は、フルオレセインの単一異性体誘導体である。ＦＡＭ（商標）は、オリゴヌクレオチドのための蛍光色素結合であり、ほとんどの蛍光検出機器に適合する。それはプロトン化され、ｐＨ７未満で蛍光が減少し、典型的には、７．５～８．５のｐＨ範囲で使用される。ＦＡＭ（商標）は、オリゴの５’又は３’末端に結合することができる。

一実施形態では、プローブは、５’ＨＥＸ（商標）（ヘキサクロロフルオレセイン）標識を含む。ヘキサクロロフルオレセインは、ＦＡＭ（商標）を用いたマルチプレックスアッセイに利用されるフルオレセインの化学類縁体である。ＨＥＸ（商標）は、オリゴヌクレオチドの５’末端にのみ付加することができる。

本開示はまた、例えば、ＶＩＣ（登録商標）、ＴＥＴ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＮＥＤ（商標）、ＰＥＴ（登録商標）、ＲＯＸ（商標）、ＴＡＭＲＡ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商標）、ＡＴＴＯ（商標）５３２、Ｃｙ３、Ｔｙｅ（商標）５６３、Ｔｙｅ（商標）６６５、ＴＥＸ６１５（商標）、Ｃｙ５、ＺＥＮ（商標）、ＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ、ＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ、ＤＡＢＹＣＬ、及びＹａｋｉｍａＹｅｌｌｏｗ（商標）であるがこれらに限定されない、本明細書に記載のプローブの標識に使用される当該技術分野において既知の任意の他の標識の使用も企図する。

一実施形態では、プローブは、蛍光消光剤標識を含む。消光剤標識は、本明細書に開示される反応において二重消光剤として使用することができる。一実施形態では、プローブは、ＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ消光剤を含む。ＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＦＱは、４２０～６２０ｎｍの範囲の広い吸光度スペクトルを有し、ピーク吸光度は、５３１ｎｍである。この消光剤は、フルオレセイン及び緑色からピンク色のスペクトル範囲で発光する他の蛍光色素と共に利用される。本開示は、例えば、ＺＥＮ（商標）、ＢｌａｃｋＨｏｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、ＢＨＱ－３など）であるがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の蛍光消光剤標識の使用を企図する。

本発明によって記載されるトランスジーンｑＰＣＲ方法及びキットは、ＣＡＲＴ薬物産物に組み込まれたＢＣＭＡＣＡＲトランスジーンプラスミドを定量するために設計されたマルチプレックス定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）アッセイを含む。このｑＰＣＲ法では、２つの標的が増幅される：（１）ＢＣＭＡＣＡＲトランスジーンプラスミド（トランスジーン）及び（２）ヒトアルブミン（ｈＡＬＢ）参照遺伝子。トランスジーン標的のためのプライマー及びプローブセットは、存在し、ＣＡＲＴ薬物産物に組み込まれたＢＣＭＡＣＡＲトランスジーンプラスミドのみを確実に検出するために、プラスミドのＣＤ１３７領域とＣＤ３ｚ領域との間の接合部を増幅させる。ｈＡＬＢ参照遺伝子のコピー数の結果を使用して、ｑＰＣＲ反応で試験した各サンプルについて、細胞あたりのベクターコピー数（ＶＣＮ）の報告可能な結果を計算する。

以下に例示的実施形態を記載する。

実施形態１．プローブ及びプライマーセットであって、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むプローブと、プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号１１の核酸配列を含む第１のプライマーと、核酸配列１２の核酸配列を含む第２のプライマーとを含む、プローブ及びプライマーセット。

実施形態２．少なくとも１つの標識が、放射性同位体、酵素基質、化学発光剤、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、化学物質、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態１に記載のプローブ及びプライマーセット。

実施形態３．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するためのキットであって、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むプローブと、プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号１１の核酸配列を含む第１のプライマーと、核酸配列１２の核酸配列を含む第２のプライマーとを含む、キット。

実施形態４．プローブに結合している少なくとも１つの標識が、放射性同位体、酵素基質、化学発光剤、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、化学物質、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態３に記載のキット。

実施形態５．プローブを含むアレイを含む、実施形態３に記載のキット。

実施形態６．アレイが、マルチウェルプレートである、実施形態５に記載のキット。

実施形態７．配列番号２２の核酸配列を含むヒトアルブミン（ｈＡＬＢ）プローブと、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号２３の核酸配列を含む第１のｈＡＬＢプライマーと、配列番号２４の核酸配列を含む第２のｈＡＬＢプライマーとを更に含む、実施形態３に記載のキット。

実施形態８．ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識が、放射性同位体、酵素基質、化学発光剤、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、化学物質、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態７に記載のキット。

実施形態９．参照遺伝子プローブと、参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識と、第１の参照遺伝子プライマーと、第２の参照遺伝子プライマーとを更に含む、実施形態３に記載のキット。

実施形態１０．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
配列番号１１の核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマー及び配列番号１２の核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
配列番号２３の核酸配列を含む第１のｈＡＬＢプライマー及び配列番号２４の核酸配列を含む第２のｈＡＬＢプライマーを用いてＣＡＲＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したｈＡＬＢ核酸を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅したｈＡＬＢ核酸と配列番号２２のヌクレオチド配列を含むｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む、方法。

実施形態１１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、第１のＣＡＲプライマー、第２のＣＡＲプライマー、第１のｈＡＬＢプライマー、及び第２のｈＡＬＢプライマーと接触させること（ここで、第１のＣＡＲプライマーが、配列番号１１の核酸配列を含み、第２のＣＡＲプライマーが、配列番号１２の核酸配列を含み、第１のｈＡＬＢプライマーが、配列番号２３の核酸配列を含み、第２のｈＡＬＢプライマーが、配列番号２４の核酸配列を含む）と、
第１のＣＡＲプライマー及び第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲ核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
第１のｈＡＬＢプライマー及び第２のｈＡＬＢプライマーを用いてｈＡＬＢ核酸を増幅させ、それによって、増幅したｈＡＬＢ核酸を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅したｈＡＬＢ核酸とｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む、方法。

実施形態１２．増幅したＣＡＲ核酸とＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することが、ハイブリダイゼーション前のＣＡＲプローブに結合している標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後のＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む、実施形態１０又は１１に記載の方法。

実施形態１３．増幅したｈＡＬＢ核酸分子とｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することが、ハイブリダイゼーション前のｈＡＬＢプローブに結合している標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後のｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む、実施形態１０又は１１に記載の方法。

実施形態１４．増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、実施形態１０又は１１に記載の方法。

実施形態１５．ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＲＴ－ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、又は転写媒介増幅（ＴＭＡ）である、実施形態１４に記載の方法。

実施形態１６．ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識が、フルオロフォアを含む、実施形態１０に記載の方法。

実施形態１７．ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識が、フルオロフォアを含む、実施形態１０に記載の方法。

実施形態１８．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
配列番号１１の核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマー及び配列番号１２の核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
第１の参照遺伝子プライマー及び第２の参照遺伝子プライマーを用いてＣＡＲＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅した参照遺伝子核酸を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅した参照遺伝子核酸と参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを、参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む、方法。

実施形態１９．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、第１のＣＡＲプライマー、第２のＣＡＲプライマー、第１の参照遺伝子プライマー、及び第２の参照遺伝子プライマーと接触させること（ここで、第１のＣＡＲプライマーが、配列番号１１の核酸配列を含み、第２のＣＡＲプライマーが、配列番号１２の核酸配列を含む）と、
第１のＣＡＲプライマー及び第２のＣＡＲプライマーを用いてＣＡＲ核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
第１の参照遺伝子プライマー及び第２の参照遺伝子プライマーを用いて参照遺伝子核酸を増幅させ、それによって、増幅した参照遺伝子核酸を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅した参照遺伝子核酸と参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを、参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む、方法。

実施形態２０．増幅したＣＡＲ核酸とＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することが、ハイブリダイゼーション前のＣＡＲプローブに結合している標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後のＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む、実施形態１８又は１９に記載の方法。

実施形態２１．増幅した参照遺伝子核酸分子と参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することが、ハイブリダイゼーション前の参照遺伝子プローブに結合している標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後の参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む、実施形態１８又は１９に記載の方法。

実施形態２２．増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、実施形態１８又は１９に記載の方法。

実施形態２３．ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＲＴ－ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、又は転写媒介増幅（ＴＭＡ）である、実施形態２２に記載の方法。

実施形態２４．ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識が、フルオロフォアを含む、実施形態１８に記載の方法。

実施形態２５．参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識が、フルオロフォアを含む、実施形態１８に記載の方法。

実施形態２６．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を生成する方法であって、
ＣＡＲトランスジーンをＴ細胞に導入して、トランスジーンが組み込まれたＴ細胞を得ることと、
ＣＡＲトランスジーンの組み込みを判定すること（ここで、判定は、
配列番号１１の核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマー及び配列番号１２の核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーを用いて、トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
第１の参照遺伝子プライマー及び第２の参照遺伝子プライマーを用いて、トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅した参照遺伝子核酸を生成することと、
増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
増幅した参照遺伝子核酸と参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを、参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
基準シグナルに対して標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することとを含む）と、
組み込まれたＣＡＲトランスジーンの少なくとも１つのコピーを含むＣＡＲＴ細胞を得ることとを含む、方法。

実施形態２７．増幅したＣＡＲ核酸とＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することが、ハイブリダイゼーション前のＣＡＲプローブに結合している標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後のＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む、実施形態２６に記載の方法。

実施形態２８．増幅した参照遺伝子核酸分子と参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することが、ハイブリダイゼーション前の参照遺伝子プローブに結合している標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後の参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む、実施形態２６に記載の方法。

実施形態２９．増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、実施形態２６に記載の方法。

実施形態３０．ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＲＴ－ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、又は転写媒介増幅（ＴＭＡ）である、実施形態２９に記載の方法。

実施形態３１．ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識が、フルオロフォアを含む、実施形態２６に記載の方法。

実施形態３２．参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識が、フルオロフォアを含む、実施形態２６に記載の方法。

実施形態３３．実施形態２６～３２のいずれかに記載の方法によって生成されたＣＡＲＴ細胞。

本明細書にて開示した実施形態のいくつかを更に説明するために、以下の実施例を提供する。これらの実施例は、例示を目的とするものであって、本開示の実施形態を制限するものではない。

実施例１：トランスジーンｑＰＣＲ法の開発
方法の概要：
記載される例示的なトランスジーンｑＰＣＲ法は、ＣＡＲＴ薬物産物に組み込まれたＢＣＭＡＣＡＲトランスジーンプラスミド（実施例では「ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミド」と称される）を定量するために設計されたマルチプレックス定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）アッセイである。このｑＰＣＲ法では以下を増幅する。（１）トランスジーンｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミド（トランスジーン）（国際公開第２０１７／０２５０３８（Ａ１）号からの配列番号１７５～１９７、２０２～２０５、２１８～２２７、２３９、２６１～２６４、及び２７１～２７６のいずれかを含むヌクレオチド配列を有するトランスジーン）及び（２）ヒトアルブミン（ｈＡＬＢ）参照遺伝子。存在し、ＣＡＲＴ薬物産物に組み込まれたｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドのみを確実に検出するために、トランスジーン標的のためのプライマー及びプローブセットは、プラスミドのＣＤ１３７領域とＣＤ３ｚ領域との間の接合部を増幅させる。ｈＡＬＢ参照遺伝子のコピー数の結果を使用して、ｑＰＣＲ反応で試験した各サンプルについて、細胞あたりのベクターコピー数（ＶＣＮ）の報告可能な結果を計算する。トランスジーンｑＰＣＲ法のＶＮＣ／細胞サンプルの結果は、ＣＡＲＴ薬物産物サンプルの安全性、純度、及び同一性について報告される。

トランスジーンプライマー及びプローブの設計：
「ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミド」と呼ばれるＢＣＭＡＣＡＲトランスジーンプラスミドは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の様々な異なる構成要素をコードしている配列を含む、８，５１８塩基対（ｂｐ）のプラスミドである。ｑＰＣＲのトランスジーン標的は、存在し、ＣＡＲＴ薬物産物に組み込まれたｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドのみを検出することが必要であり、標的となる領域がＢＣＭＡＣＡＲコンストラクトに特異的に属することが必要であった。トランスジーンｑＰＣＲ標的の特異性を確保するために、ＣＡＲコンストラクトをコードしているｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドの少なくとも２つの領域間の少なくとも１つの接合部を標的とするように設計されたプライマー及びプローブ対を設計した。最初に、ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドの好適な領域を同定する必要があった。

ＣＡＲＴ薬物産物のゲノムに組み込まれ、かつＣＡＲコンストラクトに特異的な最長塩基対（ｂｐ）コード領域は、ＢＣＭＡＣＡＲコンストラクトの２つの可変重鎖部分に属する。これらの２つの領域は、短いリンカー配列によって分離されている。２つの可変重鎖部分及びリンカーに対応するプラスミドのヌクレオチド配列領域を、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）サイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）に入力して、これらの領域がトランスジーンｑＰＣＲ法に好適な標的となり得るかどうかを判定した。しかしながら、ＢＬＡＳＴ結果からは、ヒト（homo sapiens）を含む多くの異なる種にわたる様々な免疫グロブリン可変領域について複数のヒットが得られた。したがって、ＣＡＲの２つの可変重鎖構成要素のコード領域は、トランスジーンｑＰＣＲ法に好適な標的ではないと判定した。

ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドのＣＤ１３７領域とＣＤ３ｚ領域との間の接合部は、ＣＡＲＴ薬物産物のゲノムに組み込まれるプラスミドの領域に含まれ、ＢＣＭＡＣＡＲの構成要素である。ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドのＣＤ３ｚコード領域のサイズは、プラスミドのＣＡＲセグメントの２番目に長いｂｐのコード領域であり、標的にとってより好適な領域となり、その理由は、より大きなコード領域からはより多数の潜在的に好適なプライマー及びプローブ対を見出すことができる可能性があるためである。ＣＤ３ｚコード領域は、プラスミドのＣＤ１３７コード領域に直接隣接している。ＣＤ１３７コード領域の反対側には、ＢＣＭＡＣＡＲコンストラクトに特異的ではないプラスミド骨格配列がある。したがって、ＣＤ１３７とＣＤ３ｚとの間の接合は、より大きなＣＤ３ｚコード領域をプライマー及びプローブ設計に含める場合、標的とするのに好適な唯一の選択肢であった。

ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／Ｐｒｉｍｅｒｑｕｅｓｔ／Ｈｏｍｅ／Ｉｎｄｅｘ）製のＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔ（登録商標）Ｔｏｏｌを使用して、ｑＰＣＲ法の開発において試験するための好適なプライマー及びプローブ対を設計した。ＣＤ１３７及びＣＤ３ｚコード領域に対応するｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドのヌクレオチド配列を、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＴｏｏｌに入力した。最適なプライマー融解温度（Ｔｍ）を６０℃に設定し、フォワード又はリバースプライマーのいずれかがこの接合部に重なることを確めるために、ＣＤ１３７とＣＤ３ｚとの間の接合部に対応するヌクレオチドを「重複接合部リスト」に入力した。その結果、４つのプライマー及びプローブ対が得られた（表１参照）。２つの対は、ＣＤ１３７／ＣＤ３ｚ接合部にまたがるフォワードプライマーを有し、２つの対は、接合部にまたがるリバースプライマーを有する。次いで、アッセイ設計パラメータを調整して、ＣＤ１３７／ＣＤ３ｚ接合部にまたがるようにプローブ設計を制限した。その結果、３つの追加のプライマー及びプローブ対が得られ（表１参照）、ｑＰＣＲ法を開発するための試験に好適なプライマー及びプローブ対が合計７つになった。７つのプライマー／プローブ対全てをＮＣＢＩＢＬＡＳＴサイトに入力して、ヒトゲノムにおける交差反応性の可能性について調べた。７対のいずれかについてのＢＬＡＳＴ結果のいずれも、交差反応性の可能性を示さなかった。

注記：ＦＰ＝接合部にまたがるフォワードプライマー；ＲＰ＝接合部にまたがるリバースプライマー；ＰＲＢ＝接合部にまたがるプローブ

３つのｈＡＬＢプライマー及びプローブセットを使用して、ｑＰＣＲ法の開発において試験した（表２を参照）。１つのセットは公開されている論文から選び（ＳＣｈａｒｒｉｅｒｅｔａｌ．ＬｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｔａｒｇｅｔｉｎｇＷＡＳｐｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｏｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｔｒａｎｓｄｕｃｅａｎｄｃｏｒｒｅｃｔｃｅｌｌｓｆｒｏｍＷＡＳｐａｔｉｅｎｔｓ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ（２００７）１４，４１５－４２８．）、第２のセットは、最終的には使用しなかったＣＲＯデジタルＰＣＲ方法アッセイから選び、第３のセットは、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＴｏｏｌと、公開されている論文並びにＣＣＨＭＣｈＡＬＢプライマー及びプローブセットの両方によって標的とされているｈＡＬＢ遺伝子領域とを使用して設計した。３つのプライマー／プローブ対全てをＮＣＢＩＢＬＡＳＴサイトに入力して、ヒトゲノムにおける任意の非ｈＡＬＢ産物との交差反応性の可能性について調べた。３対のいずれかについてのＢＬＡＳＴ結果のいずれも、交差反応性の可能性を示さなかった。

注記：セット１＝ＣＣＨＭＣｈＡＬＢセット、セット２＝公開されている論文のｈＡＬＢセット、セット３＝内部設計したｈＡＬＢセット

スクリーニングプライマー及びプローブ：
ＣＡＲＴ薬物産物、ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドを加えたサンプルとしてのモックＴ細胞ＤＮＡ、及びモックＴ細胞ＤＮＡを用いたシングルプレックスｑＰＣＲ反応を実行することによって、７つの異なるトランスジーンプライマー及びプローブセット並びに３つの異なるｈＡＬＢプライマー及びプローブセットをスクリーニングした。レンチベクターを形質導入する前に、ＣＡＲＴ産物と同じ選択及び増幅プロセスを経たＴ細胞からモックＴ細胞ＤＮＡを採取した。次いで、ＣＡＲＴ細胞、モックＴ細胞、ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドを加えたモックＴ細胞ＤＮＡのｑＰＣＲ産物、及び「テンプレート対照なし」（ＮＴＣ）サンプルのｑＰＣＲ産物を、アガロースゲルに流した。予想されたＰＣＲ産物サイズの単一のバンドが生じなかった任意のプライマー／プローブセットは、更なるトランスジーンｑＰＣＲ法の開発から除外した。ＮＴＣサンプルを含む全てのｑＰＣＲ産物では更に約２５ｂｐのプライマーダイマーバンドの存在がみられたが、このバンドはｑＰＣＲ反応の予想された副産物である。予想された標的バンドはトランスジーン（ＦＰ）セット１及びトランスジーン（ＲＰ）セット２のプライマー／プローブセットのみから生じ、ゲル上には２つの＜５０ｂｐのバンドのみがみられた。＜５０ｂｐのバンドのうちの１つは、予想されたプライマーダイマーである可能性が高かった。第２の＜５０ｂｐのバンドは、ＮＴＣサンプルでは明確にみることができず、この更なる低分子量バンドが何に由来している可能性があるのかは未確定であった。シングルプレックスプライマー／プローブスクリーニングアッセイからのゲル画像の例については図１を参照。ＣＡＲＴ、モックＴ細胞、及びプラスミドサンプルを加えたモックＴ細胞ＤＮＡのｑＰＣＲ産物にみられる更なる予想外のバンドにより、更なるｑＰＣＲ法の開発からｈＡＬＢセット３のプライマー／プローブセットのみを排除した。また、３つのｈＡＬＢプライマー／プローブセットの全てから、ゲル上にみられる２つの＜５０ｂｐのバンドが生じた。＜５０ｂｐのバンドのうちの１つは、予想されたプライマーダイマーである可能性が高かった。第２の＜５０ｂｐのバンドは、ＮＴＣサンプルでは明確にはみられず、この更なる低分子量バンドが何に由来している可能性があるのかは未確定であった。しかしながら、これは、更に全てのトランスジーンプライマー／プローブセットでみられる同じ低分子量結合パターンであり、反応におけるプライマー又はプローブの量を最適化し、異なるアニーリング温度を試験してもバンドがなくならなかったことに鑑みて、この更なるバンドは、ｑＰＣＲマスターミックス中のウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）又はいくつかの他の無関係なｑＰＣＲ副産物が存在する結果であると予想された。

トランスジーンプライマー／プローブセットのスクリーニングプロセスにおける次のステップは、標準曲線を使用して、２つの許容可能なｈＡＬＢプライマー／プローブセット（セット１及びセット２）と共に、マルチプレックスｑＰＣＲ反応で２つの許容可能なセット（ＦＰセット１及びＲＰセット２）を実行することであった。モックＴ細胞ＤＮＡに既知の濃度のｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドを加え、希釈剤として低ＥＤＴＡＴＥバッファを使用して、このプラスミドを加えたモックＴ細胞サンプルの５倍段階希釈液を５つ作製することによって、標準曲線を作成した。標準曲線の各点を作製し、単回使用アリコートとして凍結した。最初に、トランスジーンプライマー／プローブセットの両方を、ｈＡＬＢセット２と共にマルチプレックスｑＰＣＲで試験した。更に、ＣＡＲＴＤＮＡ及びモックＴ細胞ＤＮＡサンプルで実行して、マルチプレックス反応の特異度を入手した。更なるトランスジーンｑＰＣＲ法の開発に許容可能であるトランスジーン及びｈＡＬＢ標的の両方について標準曲線が満たすと予想される基準は、以下の通りであった：（１）Ｒ^２≧０．９８及び（２）ｑＰＣＲ効率９０～１１０％。ＣＡＲＴＤＮＡは、トランスジーン及びｈＡＬＢ標的の両方において測定可能に増幅することが必要であったが、モックＴ細胞ＤＮＡサンプルは、アッセイ特異度についての要件を満たすために、ｈＡＬＢ標的においてのみ測定可能な増幅を有し、トランスジーン標的では増幅する量がないことが必要であった。

トランスジーン（ＦＰ）セット１及びｈＡＬＢセット２のマルチプレックス反応により、トランスジーン及びｈＡＬＢ標的の両方について＞０．９８という許容可能なＲ^２結果が得られたが、いずれの標的標準曲線からも、許容範囲内のｑＰＣＲ効率は得られなかった。トランスジーン（ＲＰ）セット２及びｈＡＬＢセット２のマルチプレックス反応からも、トランスジーン及びｈＡＬＢ標的の両方について＞０．９８という許容可能なＲ^２結果が得られた。また、トランスジーン標準曲線からは、許容範囲内のｑＰＣＲ効率が得られたが、ｈＡＬＢ標準曲線では得られなかった。トランスジーン（ＦＰ）セット１／ｈＡＬＢセット２及びトランスジーン（ＲＰ）セット２／ｈＡＬＢセット２のマルチプレックス反応の両方から許容可能な特異度の結果が得られ、ＣＡＲＴＤＮＡサンプルは、両方の標的において測定可能に増幅し、モックＴ細胞ＤＮＡは、ｈＡＬＢ標的でしか測定可能に増幅せず、トランスジーン標的では増幅がみられなかった。２つのプライマー／プローブセットをマルチプレックス化したときに何らかのオフターゲットバンドが存在するかどうかを判定するために、マルチプレックスｑＰＣＲ産物もゲルに流した（例示的なゲル画像については図２を参照）。マルチプレックス反応のいずれについても、ゲルの結果において予想外のバンドはみられなかった。反応のマルチプレックス化がｑＰＣＲ効率に潜在的に影響を与えたかどうかを判定するために、シングルプレックス反応において標準曲線を試験することにした。マルチプレックス反応においてトランスジーン（ＲＰ）セット２反応の効率のみが許容範囲内にあったことに鑑みて、トランスジーン（ＲＰ）セット２及びｈＡＬＢセット２プライマー／プローブセットのみをシングルプレックスで試験した。トランスジーン（ＲＰ）セット２のシングルプレックス反応の結果、ｑＰＣＲ効率が低くなり、許容範囲外であった。ｈＡＬＢセット２のシングルプレックス反応の結果、ｑＰＣＲ効率が高くなり、許容範囲内であった。両方の標的オリゴセットのプライマー／プローブ濃度を最適化しようとしても、より高いアニーリング温度を試みても、マルチプレックス反応におけるいずれの標的標準曲線の効率も改善しなかった。次いで、両方の許容可能なトランスジーンプライマー／プローブセットを、ｈＡＬＢセット１プライマー／プローブとのマルチプレックス反応で実行した。

最初に、トランスジーン（ＦＰ）セット１及びｈＡＬＢセット１のマルチプレックス反応を試みたところ、ｈＡＬＢ標準曲線のみがＲ^２＞０．９８を有していた。トランスジーン標的標準曲線のＲ^２は＜０．９７であった。トランスジーン及びｈＡＬＢ標的標準曲線のいずれからも、許容範囲外の効率が得られ、トランスジーン標的は、ｈＡＬＢセット２のプライマー／プローブとのマルチプレックス反応についてみられた効率よりも低い効率を有していた。ｈＡＬＢセット１のシングルプレックス反応はＲ^２≧０．９８を有しており、マルチプレックス反応でみられた効率と同様の効率が得られた。５点、４倍希釈スキームを使用して新規標準曲線を作成し、これは、標準＃１において、より少量のｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミド及びモックＴ細胞ＤＮＡを含有していた。これは、モックＴ細胞ＤＮＡストック中に存在し得る任意の可能性のあるＰＣＲ阻害剤を潜在的に希釈するとともに、より大きなロットの標準を作製するために必要なモックＴ細胞ＤＮＡの量を減少させることによってｑＰＣＲ効率を改善する試みにおいて行った。次いで、許容可能なトランスジーンプライマー／プローブセット及びｈＡＬＢセット１プライマー／プローブセットの両方を、この新規標準曲線を使用してマルチプレックス反応で試験した。トランスジーン及びｈＡＬＢ標準曲線の両方のＲ^２及び効率は、新規標準曲線を使用した、トランスジーン（ＦＰ）セット１／ｈＡＬＢセット１のマルチプレックス反応及びトランスジーン（ＲＰ）セット２／ｈＡＬＢセット１のマルチプレックス反応の両方について、十分許容範囲内であった。マルチプレックスｑＰＣＲ反応産物もゲルに流して、オフターゲットバンドが検出されないことを確認した（図３参照）。マルチプレックス反応のいずれについてもオフターゲットバンドは検出されなかった。２つのトランスジーンプライマー／プローブセットのマルチプレックス反応間で効率は同様であったが、トランスジーン（ＲＰ）セット２／ｈＡＬＢセット１のマルチプレックス反応についてのトランスジーン標的増幅曲線の形状は、トランスジーン（ＦＰ）セット１／ｈＡＬＢセット１のマルチプレックス反応よりも明確な上方プラトーを有する、より典型的なシグモイド曲線であった（図４参照）。したがって、更なるトランスジーンｑＰＣＲ法の開発のために、トランスジーン（ＲＰ）セット２及びｈＡＬＢセット１プライマー／プローブセットを選択した。

トラブルシューティング効率の再現性：
Ｒ^２及び効率の許容可能な結果が再現可能であるかどうかを判定するために、新規標準曲線スキームを使用したトランスジーン（ＲＰ）セット２／ｈＡＬＢセット１のマルチプレックス反応を繰り返した。しかしながら、トランスジーン及びｈＡＬＢ標的の両方の標準曲線は、反復アッセイについて、それぞれわずか８８％及び８９％であった。両方の標的についてプライマー／プローブの濃度を最適化する試みは、両方の標的の効率をわずかに改善したが、アニーリング温度を上昇させる試み、並びにＰＣＲエンハンサーＤＭＳＯ、ＴＭＡＣ、及びベタインの試みでは改善されなかった。同時に、効率の結果の再現性についても調べており、アッセイの潜在的なＬＯＱを低下させるために、４倍標準曲線によって網羅されるＶＣＮ／細胞範囲を増加させることができるかどうかが問われた。したがって、５つの凍結４倍標準点サンプルを使用してマルチプレックス反応を実行するとともに、凍結標準＃１を希釈することによって５点５倍標準曲線を作成した。次いで、マルチプレックスｑＰＣＲ反応において２本の標準曲線を並べて実行した。４倍標準曲線からは、トランスジーン及びｈＡＬＢ標的について、それぞれ９４％及び９１％の効率が得られた。５倍標準曲線からは、トランスジーン及びｈＡＬＢ標的について、それぞれ１０２％及び９９％の効率が得られた。４倍標準曲線に対して５倍標準曲線でみられる効率の増加は、アッセイで曲線において実行する直前に凍結標準＃１を希釈して新鮮な標準＃２～５を作製した場合に対して、より低い標準点を凍結させた場合、より低い標準曲線点の変動が大きくなることに起因する可能性があると考えられた。

４倍及び５倍の標準曲線を繰り返して、４倍「凍結」標準曲線点に対して５倍「新鮮」標準曲線では効率が依然として改善を示すかどうかを確認した。反復アッセイにおいて、４倍「凍結」標準曲線からは、トランスジーン及びｈＡＬＢ標的について、それぞれ９４％及び８８％の効率が得られた。５倍「新鮮」標準曲線からは、トランスジーン及びｈＡＬＢ標的について、それぞれ１０２％及び９９％の効率が得られた。これらの「新鮮」対「凍結」標準曲線の結果の再現性を更に確認するために、追加実行を行った（図５を参照）。標準曲線に効率においてみられる変動の問題の主な原因は、凍結標準曲線点を使用することに起因するものであると判定された。したがって、標準＃１のみを作製し、単回使用アリコートとして凍結させることにした。この凍結標準＃１は、将来的にいずれかのアッセイを実行する直前に新鮮な標準＃２～５を作製するために使用される。また、将来的にアッセイのＶＣＮ／細胞範囲を増加させるために、５倍標準曲線を使用することも決定した。

トラブルシューティングＶＣＮ／細胞のＤＤＰＣＲとの不一致
アッセイを実行してデータを収集するとともに、少なくとも最初の６つのバッチの材料を放出した。ＶＣＮ／細胞アッセイの実行は、ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミド骨格のＲＵ５プロモーター領域を標的とする［発明者：これらの領域を説明するために必要な更なる詳細は、当業者にとって十分に具体的であろうか？］ＶＣＮ／細胞ｑＰＣＲアッセイは細胞療法のためのＣＡＲプラスミドのトランスジーン部分を標的とすることが規制要件であるので、トランスジーンｑＰＣＲ法は、この骨格法を代替することを意図している。したがって、方法ＶＣＮ／細胞の結果がトランスジーンｑＰＣＲ法の結果に匹敵することが要件であった。ＣＡＲＴからのゲノムＤＮＡをトランスジーンｑＰＣＲ法で試験し、ＬＢ＿１２サンプルの結果と比較した。割り当てられたトランスジーン及びｈＡＬＢコピー値が正しいかどうかを判定するために、トランスジーン標準及び対照をｄｄＰＣＲで実行した。真のＶＣＮ／細胞の値を求めるために、ＬＢ＿１２ＤＮＡサンプルもｄｄＰＣＲで実行した。

ｄｄＰＣＲ反応では、ＢｉｏＲａｄＳｕｐｅｒｍｉｘｆｏｒＰｒｏｂｅｓｄｄＰＣＲマスターミックスにおけるトランスジーン（ＲＰ）セット２及びｈＡＬＢセット１のプライマー／プローブを使用した。使用した熱サイクル条件は、Ｓｕｐｅｒｍｉｘキットで推奨されたものであった。最も正確なｄｄＰＣＲ結果を得るためにＤＮＡを酵素消化することが推奨されるので、ＥｃｏＲＩをマスターミックスに添加した。ＥｃｏＲＩは、ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドを１回だけ切断することが確認され、トランスジーン又はｈＡＬＢ標的のいずれの増幅領域も切断しなかった。ｄｄＰＣＲの結果から、トランスジーン標準及び対照のトランスジーン及びｈＡＬＢのコピーは正しかったが、ＬＢ＿１２の結果はＲＵ５ＶＣＮ／細胞の結果に、より匹敵するものであることが確認された。ＬＢ＿１２ｑＰＣＲの結果についてのＶＣＮ／細胞の結果はｄｄＰＣＲによって不正確であると判定されたが、トランスジーン標準及び対照がどの程度正しいものであり得るかは未知であった。したがって、ＬＢ＿１２ｇＤＮＡのＤＮＡ片が小さいほどより正確な結果が得られる可能性があることを考慮して、複数回ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドを切断した酵素を使用した。一方は２回切断し、一方は３回切断する２つの追加の酵素を試みたが、ＶＣＮ／細胞ｄｄＰＣＲの結果は変化しなかった。したがって、いくつかのＣＡＲＴＤＮＡサンプル及び２つのトランスジーン対照を酵素消化し、反応をクリーンアップし、未消化の標準、対照、及びＣＡＲＴサンプルと共にＤＮＡをトランスジーンｑＰＣＲで実行した。消化された対照のＶＣＮ／細胞の結果は、未消化のＶＣＮ／細胞の結果よりも約３．８倍高かったが、消化されたＣＡＲＴサンプルのＶＣＮ／細胞の結果は、未消化のＣＡＲＴサンプルよりも約１．３倍低かった。これらの結果から、正確なサンプルＶＣＮ／細胞の結果を得るために、ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドを線形化する必要があるかどうかが問われた。

ＥｃｏＲＩ酵素を使用してプラスミドを消化することによって、ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドのアリコートを線形化した。酵素消化をクリーンアップし、線形化されたプラスミドを定量した。この線形化プラスミドを５倍トランスジーン標準曲線のトランスジーンコピー値に希釈し、トランスジーンｑＰＣＲアッセイで実行した。ＬＢ＿１２ＣＡＲＴＤＮＡもアッセイで実行し、環状（未消化）及び線形化された標準曲線結果の両方からＶＣＮ／細胞の結果を計算した。線形化された標準曲線点のＣｔ値は、未消化の標準曲線点よりも約２倍低かった（図６参照）。更に、線形化標準曲線から計算されたＬＢ＿１２ＶＣＮ／細胞の結果は、ｄｄＰＣＲで得られたもの及び追加のＲＵ５ｑＰＣＲ法によって得られたものに匹敵したが、環状（未消化）標準曲線から計算されたＶＣＮ／細胞の結果は、約４倍高かった。これにより、正確なＶＣＮ／細胞の結果を得るために、ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミドを線形化する必要があることが確認された。一方は、臨床バッチ放出試験及び任意の他のＧＭＰ試験用のＧＭＰロットとして使用される大きなロットであり、一方は、分析者の訓練及び任意の非ＧＭＰ活性に使用されるより小さいロットである、線形化されたプラスミド標準及び対照の２つのロットを作製した。

サンプルに典型的な一定量のＤＮＡにおける線形性：
サンプルＤＮＡを０．０２ｕｇ／ｕＬの濃度に希釈し、反応あたり合計１００ｎｇのＤＮＡにつき５ｕＬをｑＰＣＲアッセイにロードした。＜０．０２ｕｇ／ｕＬのストック濃度を有するサンプルは、そのままアッセイで実行することができるが、反応にロードされるＤＮＡの量に基づいて、ｈＡＬＢコピーの許容範囲を調整する必要がある。トランスジーン及びｈＡＬＢ標的の両方について標準曲線を得るために、０．０５ｕｇ／ｕＬの出発モックＴ細胞ＤＮＡ濃度を用いて標準曲線を作成し、低ＥＤＴＡＴＥバッファで希釈した（表３を参照）。サンプルに典型的な一定量のモックＴ細胞ｇＤＮＡで標準曲線を作成した場合、アッセイの線形性が許容範囲内に留まることを確認するために、０．０２ｕｇ／ｕＬのモックＴ細胞ＤＮＡ濃度を使用して特徴付け標準曲線を作成し、０．０２ｕｇ／ｕＬのモックＴ細胞ＤＮＡを使用して段階希釈した（表４参照）。次いで、アッセイの線形性を確認するために、この標準曲線を典型的な標準曲線と並べて実行した（図７参照）。ｌｏｇコピー実測値対ｌｏｇコピー予想値もプロットして、特徴付け標準曲線についての測定されたトランスジーンコピーの結果からＲ^２≧０．９８の線形応答が得られることを確認した（図８参照）。

特徴付け標準曲線の結果は、典型的なサンプル濃度（０．０２ｕｇ／ｕＬ）と一致するＤＮＡ濃度でトランスジーンコピーを依然として正確に定量することができることを示した。

方法の適格性確認：
医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）及びＭＩＱＥ（定量リアルタイムＰＣＲ実験の発表用の最低限の情報）ガイドラインに従って、トランスジーンｑＰＣＲ法の適格性を確認した。方法の適格性確認を完了するために、３つのアッセイを実行した。アッセイは、方法適格性確認プロトコルで指定された全ての方法適格性確認パラメータの許容基準に合格した。表５は、方法適格性確認パラメータ、許容基準、及び適格性確認結果を要約する（実施例２を参照）。

実施例２：トランスジーンｑＰＣＲ法
１．０目的
１．１この実施例は、ＣＡＲＴ産物に組み込まれたＬｉＣＡＲプラスミドを定量するための定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを実施するための例示的な手順について説明する。アッセイは、ＬｉＣＡＲプラスミドのＣＤ１３７領域とＣＤ３ｚ領域との間の接合部並びにヒトアルブミン（参照遺伝子）を標的とするマルチプレックスｑＰＣＲとして設計される。

２．０範囲
２．１この方法は、以下を求めるために用量の処方直前に、収集後のＣＡＲＴ細胞に適用可能である：
２．１．１ベクターのコピー数
２．１．２形質導入効率
２．１．３ＬｉＣＡＲ発現の同一性

３．０定義及び略記
３．１ＬＯＱ（定量限界）
３．２ＮＴＣ（テンプレート対照なし）
３．３Ｃｔ（サイクル閾値）
３．４ＣＶ（変動係数）
３．５ＳＤ（標準偏差）
３．６ｈＡＬＢ（ヒトアルブミン）
３．７ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）
３．８ＶＣＮ（ベクターのコピー数）

４．０機器
４．１９６ウェルＰＣＲプレートをスピン可能な遠心分離器（例えば、ＳＸ４７５０ロータ及び９６ウェルプレート用のスイングセットを備えるＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、ＡｌｌｅｇｒａＸ－１４Ｒ）
４．２ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６リアルタイムＰＣＲシステム
４．３－７０℃が可能な冷凍庫
４．４－２０℃が可能な冷凍庫
４．５較正された８又は１２チャネルのピペット（２０、５０ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎピペット
４．６較正されたシングルチャネルのピペット（２０、１００、２００、１０００ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎピペット
４．７２～８℃を維持することが可能な冷蔵庫又は低温室
４．８ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＰＣＲソフトウェアｖ１．３以上
４．９ボルテックスミキサー
４．１０バイオセーフティキャビネット

５．０材料
注記：「例えば」と指定された材料は、事前の適格性確認なしに類似の材料によって代替してもよい。
「又は等価物」と指定された材料については、サンプルを試験するために使用する前に、代替物が等価であることを実証する必要がある。
５．１ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０９７７０１５。
５．２ＴａｑＰａｔｈＰｒｏＡｍｐＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ３０８６６、又は等価物。
５．３ＢＣＭＡトランスジーン及びＡＬＢのプライマー及びプローブの適格性確認されたロット、ＩＤＴを通したカスタム配列又は等価物。
５．４ＢＣＭＡトランスジーン標準＃１の適格性確認されたロット
５．５ＢＣＭＡトランスジーン中及び低対照の適格性確認されたロット
５．６１×低ＥＤＴＡＴＥバッファｐＨ８．０、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、ＱｕａｌｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号３５１－３２４－７２１。
５．７０．５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１００５
５．８１．５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１０２１
５．９２ｍＬの遠心管、滅菌済、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１０４８
５．１０５ｍＬの遠心管、滅菌済、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号００３０１１９４６０
５．１１ピペットチップ、滅菌済、濾過済、（２０、２００、１０００ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎカタログ番号３０３８９２２６、３０３８９２４０、３０３９８２１３
５．１２９６ウェルＰＣＲプレート、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４４８３３４３、４４８３３５４、４４８３３４９、４４８３３５０、４４８３３９５、又は等価物
５．１３ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学接着フィルム、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３１１９７１、又は等価物
５．１４試薬リザーバ、滅菌済、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、ＶｉｓｔａＬａｂｓカタログ番号３０５４－１００２

６．０注意事項
６．１実験室で作業するときは適切なＰＰＥを着用する。
６．２危険な化学物質を用いた作業についての施設の詳しい指針に従う。更なる詳細については、製造業者のＳＤＳを参照する。
６．３全てのピペッティングステップは、ＢＳＣにおいて無菌技術を使用して実施する必要がある。材料又は試薬のいずれかへの混入のリスクを最小限に抑えるために、手順の全てのステップ中、分析者は使い捨てスリーブカバーを着用することが推奨される。

７．０手順
７．１以下のそれぞれのアリコートを得る：
７．１．１ＢＣＭＡトランスジーンフォワードプライマー１０μＭ作業ストック
７．１．２ＢＣＭＡトランスジーンリバースプライマー１０μＭ作業ストック
７．１．３ＢＣＭＡトランスジーンプローブ１０μＭ作業ストック
７．１．４ｈＡＬＢフォワードプライマー１０μＭ作業ストック
７．１．５ｈＡＬＢリバースプライマー１０μＭ作業ストック
７．１．６ｈＡＬＢプローブ１０μＭ作業ストック
７．１．７適格性確認されたＢＣＭＡトランスジーンｑＰＣＲ標準＃１
７．１．８適格性確認されたＢＣＭＡトランスジーンｑＰＣＲ２．００コピー／細胞の中対照
７．１．９適格性確認されたＢＣＭＡトランスジーンｑＰＣＲ０．２０コピー／細胞の低対照
７．２表６に従って適切な数の反応についてマルチプレックスマスターミックスを調製する。実際にアッセイで実行するよりも多くのサンプルを含めることによって、更なる超過の反応を追加することができる。例えば、１０個のサンプルで実行するが、以下の表の計算に既に含まれている１０個を上回る超過の反応が望まれる場合、１１個のサンプルで実行する（すなわち、Ｎ＝１１）。各追加のサンプルは、３つの反応液の体積を加える。

^＊式は、単一の２５ｕＬ反応に必要な成分の体積に、２４個の標準／対照ウェル＋１０個の超過の反応（３４）と３×サンプル数（サンプルあたり３個の反応ウェル）との合計を乗じたものである。
７．３マスターミックスチューブを短時間ボルテックス混合し、傍らに置いた。
７．４表７に従って低ＥＤＴＡＴＥバッファを使用して標準＃２～５を調製する。次の希釈液を作製するために移動させる前に、必ず各希釈液を短時間混合する。

７．５再度マスターミックス溶液を短時間ボルテックス混合し、ミックスを試薬リザーバにピペットで入れる。
７．６マルチチャネルピペットを使用して、９６ウェルＰＣＲプレートの適切なウェルに２０μＬのマスターミックスをピペットで入れる（図９参照）。
７．７図９のプレートレイアウトに従って、シングルチャネルピペットを使用して、９６ウェルＰＣＲプレートの適切なウェルに５μＬの標準、対照、及びサンプルＤＮＡをロードする。５ｕＬの低ＥＤＴＡＴＥバッファをＮＴＣウェルにロードする。
７．８プレートを光学接着フィルムで密封し、約３００×ｇで短時間遠心分離する。
７．９ＰＣＲプレートをＰＣＲ機器にロードする。
７．１０「ＡｓｓａｙＴｅｍｐｌａｔｅ．ｅｄｔ」を開き、「ＳａｖｅＡｓ」を選択し、ｑＰＣＲ実験のための適切な名称を入力し、．ｅｄｓファイルとして保存する。テンプレートファイルを上書きしない。
７．１１名称の項に実験の名称を入力する。
７．１２実験特性が以下に指定の通りであり、２５ｕＬの反応体積を使用して表８に指定されたものに従って熱サイクル条件（ＲｕｎＭｅｔｈｏｄタブ）が正しく設定されていることを確認する。
７．１２．１機器の種類：ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６ＦｌｅｘＳｙｓｔｅｍ
７．１２．２ブロックの種類：９６ウェル（０．２ｍＬ）
７．１２．３実験の種類：標準曲線
７．１２．４検出試薬：ＴａｑＭａｎ試薬
７．１２．５機器の特性：標準

７．１３実行を選択し、機器のシリアルナンバーをクリックしてアッセイを実行する。

８．０データ解析
８．１Ａｎａｌｙｚｅをクリックすることによってデータを解析するために、ソフトウェアの自動ベースライン及び自動Ｃｔ特徴を使用する。次いで、保存をクリックして解析を保存する。
８．２レポートＰＤＦを印刷し、これをアッセイ資料に含める。
８．３以下のように、各サンプル及び陽性対照についてトリプリケートでＶＣＮ／細胞を計算する。

８．４各サンプル及び陽性対照についてトリプリケートのＶＣＮ／細胞の値の平均、標準偏差、及びＣＶ％を計算する。

９．０アッセイの許容基準
９．１アッセイの許容基準
９．１．１トランスジーン及びｈＡＬＢ標準曲線の両方のＲ^２値が、≧０．９７以上である必要がある。
９．１．２標準曲線の勾配が、－３．５８５～－３．１０４である必要がある（ＰＣＲ効率９０．０８～１０９．９７％に等しい）
９．１．３いずれの標準についてもＣｔレプリケートが「未確定」にはなり得ない。
９．１．４ＮＴＣの全てのＣｔレプリケートが、トランスジーン及びｈＡＬＢ標的の両方について「未確定」である必要がある。
９．１．５標準＃１の平均Ｃｔが、トランスジーン標的については＜２３．０であり、ｈＡＬＢ標的については＜２２．０である必要がある。
９．１．６各標準のＣｔＳＤが、トランスジーン及びｈＡＬＢ標的の両方について≦０．６０である必要がある。
９．１．７中及び低対照の両方についての平均ｈＡＬＢコピーが、３０，３０３．０３０コピー±３０％である必要がある（予想範囲：２１，２１２．１２１～３９，３９３．９３９コピー）。
９．１．８２．００ＶＣＮ／細胞の中対照及び
０．２０ＶＣＮ／細胞の低対照についての平均ＶＣＮ／細胞の結果が、各対照についての標的ＶＣＮ／細胞の値の±３５％である必要がある。
９．１．９中及び低陽性対照のＶＣＮ／細胞レプリケートについてのＣＶ％が、≦２０％である必要がある。
９．１．１０上記基準のいずれかが満たされていない場合、アッセイは無効である。
９．２サンプルの許容基準
９．２．１各サンプルついての平均ｈＡＬＢコピーが、３０，３０３．０３０コピー±３０％である必要がある（予想範囲：２１，２１２．１２１～３９，３９３．９３９コピー）。
９．２．１．１サンプルｇＤＮＡの濃度が＜０．０２ｕｇ／ｕＬである場合、実際に反応にロードされたＤＮＡの量からそのサンプルについてのｈＡＬＢの予想コピーを計算する。
例：サンプルｇＤＮＡの濃度が、０．０１ｕｇ／ｕＬである。（５ｕＬ）（０．０１ｕｇ／ｕＬ）＝０．０５ｕｇ＝反応あたり５０ｎｇのサンプルｇＤＮＡ（５０ｎｇＤＮＡ）（１コピーＡＬＢ／０．００３３ｎｇｇＤＮＡ）＝１５，１５２コピーのＡＬＢの予想範囲：１０，６０６～１９，６９７コピーのＡＬＢ
９．２．２サンプルについてのトリプリケートのｈＡＬＢ標的コピー値が、ｈＡＬＢ標準曲線によって網羅されるＣｔ範囲内である必要がある。Ｃｔ範囲は、標準＃１のトリプリケートのうちの最低Ｃｔ値及び標準＃５のトリプリケートのうちの最高Ｃｔ値として定義される。
９．２．３サンプルについてのトリプリケートのトランスジーン標的コピー値が、３０３．０３０のトランスジーンＬＯＱコピーを上回る必要がある。
９．２．３．１トランスジーン標的についてのサンプルの１つ以上のレプリケートが３０３．０３０コピーのトランスジーンＬＯＱよりも低い場合、そのサンプルはＬＯＱ未満として報告する必要がある。
９．２．４トランスジーン標的についてのサンプルの１つ以上のレプリケートが標準＃１の最低トランスジーンＣｔ値よりも低い場合、そのサンプルは標準曲線範囲を上回り、サンプルは定量不可であると報告する必要がある。例えば、サンプルのトランスジーンＣｔ値が２０．１、１９．９、及び２０．２であるが、標準＃１で得られた最低のトランスジーンＣｔ値がわずか２０．０である場合、１９．９のサンプルのレプリケートは正確に定量することができないので、そのサンプルは標準曲線範囲を上回り、サンプルは定量不可であると報告する必要がある。サンプルが定量不可であると判定された場合、管理及び試験責任者に通知する。
９．２．５サンプルＶＣＮ／細胞レプリケートのＣＶ％が、≦２０％である必要がある。
注記：ＬＯＱを下回るレプリケートを有するサンプル又は定量不可であると判定されたサンプルでは、ＣＶ％を利用しない。
９．２．６全てのトリプリケートのトランスジーンコピー値がＬＯＱを上回り、上記許容基準の全てを満たす任意のサンプルは、平均ＶＣＮ／細胞の値を小数第２位まで報告する（例：２．０２ＶＣＮ／細胞）。
９．２．７上記許容基準を全て満たすわけではない任意のサンプルは、無効である。

ゲノムＤＮＡの単離、適格性確認、及び希釈
１．０目的
１．１ＣＡＲＴサンプル又はモックＴ細胞懸濁液又は凍結細胞ペレットからｇＤＮＡを単離及び定量するための例示的な手順について記載する。

２．０範囲
２．１以下からｇＤＮＡを単離するための手順を記載する：
２．１．１凍結細胞ペレット又は新鮮細胞懸濁液として供給される収集後のＣＡＲＴ細胞サンプル。
２．１．２凍結細胞ペレット又は新鮮細胞懸濁液として供給されるモックＴ細胞。

３．０機器
３．１１．５ｍＬ及び５ｍＬのマイクロ遠心管をスピンさせることができる遠心分離機（例えば、１．５ｍＬのマイクロ遠心管用のアダプタを備えるＳＸ４７５０ロータを備えたＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、ＡｌｌｅｇｒａＸ－１４Ｒ）
３．２Ｑｕｂｉｔ４蛍光光度計、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｑ３３２２６
３．３－７０℃が可能な冷凍庫
３．４－２０℃が可能な冷凍庫
３．５較正されたシングルチャネルのピペット（２０、１００、２００、１０００ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎピペット
３．６５５℃が可能であり、１．５ｍＬ及び２ｍＬのマイクロ遠心管に好適なヒートブロック
３．７２～８℃を維持することが可能な冷蔵庫又は低音室
３．８ボルテックスミキサー
３．９バイオセーフティキャビネット

４．０材料
注記：「例えば」と指定された材料は、事前の適格性確認なしに類似の材料によって代替してもよい。「又は等価物」と指定された材料については、サンプルを試験するために使用する前に、代替物が等価であることを実証する必要がある。
４．１ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０９７７０１５。
４．２Ｌ－グルタミン及び２５ｍＭＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号１０－０４１－ＣＶ
４．３１×低ＥＤＴＡＴＥバッファｐＨ８．０、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、分子生物学グレード、例えば、ＱｕａｌｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号３５１－３２４－７２１。
４．４２００プルーフ（９６～１００％）エタノール分子生物学グレード、例えば、ＤｅｃｏｎＬａｂｓカタログ番号３６１６ＥＡ
４．５１０×ＰＢＳ分子生物学グレード、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｉｒｘカタログ番号７５８８９
４．６ＰｕｒｅＬｉｎｋゲノムＤＮＡミニキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｋ１８２００１
４．７Ｑｕｂｉｔ（商標）アッセイチューブ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）カタログ番号Ｑ３２８５６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。４．９ＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＢＲアッセイキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｑ３２８３５０
４．９０．５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１００５
４．１０１．５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１０２１
４．１１２ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１０４８
４．１２５ｍＬの遠心管、滅菌済、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号００３０１１９４６０
４．１３１５ｍＬのコニカルチューブ、滅菌、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号４３１４７０
４．１４ピペットチップ、滅菌済、濾過済、（２０、２００、１０００ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎカタログ番号３０３８９２２６、３０３８９２４０、３０３９８２１３

５．０注意事項
５．１実験室で作業するときは適切なＰＰＥを着用する。
５．２危険な化学物質を用いた作業についての施設の詳しい指針に従う。更なる詳細については、製造業者のＳＤＳを参照する。
５．２全てのピペッティングステップは、ＢＳＣにおいて無菌技術を使用して実施する必要がある。任意の材料又は試薬への混入のリスクを最小限に抑えるために、手順の全てのステップ中、分析者は使い捨てスリーブカバーを着用することが推奨される。

６．０手順
６．１新たなＰｕｒｅＬｉｎｋゲノムＤＮＡミニキットを開けたとき、各瓶のラベルの説明書に従って、洗浄バッファ１及び洗浄バッファ２の瓶にエタノールを確実に添加する。エタノールを添加し、エタノールを添加した各ラベルに印を付けた後、瓶を十分に混合する。エタノール添加の印とともにイニシャル及び日付を含める。全ての成分を室温で保存する場合、キットは最長１年間安定である。
６．２ヒートブロックを５５℃に設定し、ＤＮＡ抽出を開始する前に適正温度に到達させる。
６．３細胞ペレットを使用してＤＮＡ抽出を行う。新鮮細胞ペレット又は－７０℃で凍結保存しておいた細胞ペレットのいずれを使用してもよい。カラムあたり最低２×１０^６個の細胞が抽出されることが推奨されるが、いずれにしてもカラムあたり最高４×１０^６個の生存細胞を抽出することができる。
注記：製造業者の仕様書には、カラムあたり最高５×１０^６個の細胞を抽出できると記載されているが、この方法では、ＤＮＡ単離を実行するための細胞数を求めるのに生存細胞数を使用する。したがって、同様に細胞懸濁液中に存在する死細胞の存在を見越して、２０％のバッファが与えられる。仕様のカラムあたり４×１０^６個の生存細胞を上回らない。生存百分率が８０％未満である場合、細胞懸濁液中に存在する＞２０％の死細胞を補うために、カラムあたりの抽出される生存細胞の最大数を減少させる必要がある。
６．４新鮮細胞懸濁液からの細胞ペレットの調製。
６．４．１ＮＣ－２００でカウントするためには、細胞懸濁液の少なくとも１５０ｕＬのアリコートが必要である。アリコートは、ＮＣ－２００（５．０×１０^４～５．０×１０^６細胞／ｍＬ）のダイナミックレンジ内にとどめるために、必要に応じて、ＲＰＭＩ培地でストック細胞懸濁液を希釈したものであってよい。
６．４．２計数プロトコルを使用して、細胞を計数する。
６．４．３生存細胞数を使用して、ＰｕｒｅＬｉｎｋカラムあたりの抽出される細胞の所望の数を達成し、細胞懸濁液を１．５ｍＬ又は２ｍＬのマイクロ遠心管に分注するために必要な、細胞の体積を求める。
例えば、ＮＣ－２００からの生細胞数は２×１０^７細胞／ｍＬであり、生存率は８８％である。ＰｕｒｅＬｉｎｋカラムあたりの抽出される細胞の所望の数は、４×１０^６個の生存細胞である：

２００ｕＬの細胞懸濁液を１．５ｍＬ又は２ｍＬのマイクロ遠心管に分注する。
６．４．３．１マイクロ遠心管あたり１００ｕＬ未満の細胞を分注するのは推奨されない。必要に応じて、チューブあたり最低１００ｕＬの細胞懸濁液を分注することができる細胞数を達成するために、細胞をＲＰＭＩ培地中で希釈する。
６．４．４チューブを３００ｘｇで５分間、室温で遠心分離して、細胞をペレット化する。
６．４．５細胞ペレットから培地を慎重に除去し、廃棄する。
６．４．６細胞ペレットは、ＤＮＡを単離するために直接使用してもよく、又は－７０℃で保存してもよい。
６．５ＤＮＡ抽出：
６．５．１凍結細胞ペレットから抽出する場合、ＤＮＡ抽出手順を開始する前に、細胞ペレットを室温で解凍する。
６．５．２ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水を使用して、１０×ＰＢＳバッファを１×に希釈する。細胞ペレットあたり２００ｕＬの１×ＰＢＳを使用する。抽出される細胞ペレットの総数を再懸濁させるのに十分な１×ＰＢＳを調製する。
６．５．３各細胞ペレットを２００ｕＬの１×ＰＢＳに再懸濁させる。ピペットで混合して、細胞ペレットを確実に完全に再懸濁させる。
６．５．４各チューブに２０ｕＬのプロテイナーゼＫを添加し、短時間ボルテックス混合する。
６．５．５各チューブに２０ｕＬのＲＮａｓｅＡを添加し、短時間ボルテックス混合する。
６．５．６チューブを室温で２分間インキュベートする。
６．５．７各チューブに２００ｕＬのＰｕｒｅＬｉｎｋゲノム溶解／結合バッファを添加し、短時間ボルテックスして均質な溶液を得る。
６．５．８予熱しておいた５５℃のヒートブロックにチューブを入れ、１０分間インキュベートする。
６．５．９インキュベーションが完了してから、チューブをヒートブロックから取り出し、各チューブに２００ｕＬの９６～１００％エタノールを添加する。短時間ボルテックス混合して、均質な溶液を得る。
注記：５５℃でのインキュベーション中にチューブの蓋に結露が蓄積する。チューブを開けるとき、内容物が蓋から飛び散らないように注意する。
６．５．１０各サンプルチューブ用の回収チューブ内に単一のＰｕｒｅＬｉｎｋスピンカラムを設置する。サンプルが不注意に混ざらないように、特定のサンプル識別名を記載したラベルを各スピンカラムの蓋に付ける。例えば、サンプルロット番号を記載したラベルをスピンカラムに付けてよい。抽出プロトコル全体を通して定期的に回収チューブを廃棄するので、回収チューブにラベルを付けない。
６．５．１１ステップ５．５．９から得られた各サンプルチューブの内容物を、対応するラベルの付いたスピンカラムに添加する。
６．５．１２１０，０００×ｇで１分間、室温でカラムを遠心分離する。遠心分離中、各サンプルに新しい清浄な回収チューブを設置する。
６．５．１３遠心分離後、遠心分離機からスピンカラム／回収チューブを取り出す。各スピンカラムを新しい清浄な回収チューブに移し、古い回収チューブをフロースルーと共に廃棄する。
６．５．１４５００ｕＬの洗浄バッファ１を各スピンカラムに添加する。
６．５．１５室温で１分間、１０，０００×ｇでカラムを遠心分離する。遠心分離中、各サンプルに新しい清浄な回収チューブを設置する。
６．５．１６遠心分離後、遠心分離機からスピンカラム／回収チューブを取り出す。各スピンカラムを新しい清浄な回収チューブに移し、古い回収チューブをフロースルーと共に廃棄する。
６．５．１７５００ｕＬの洗浄バッファ２を各スピンカラムに添加する。
６．５．１８最高速度で３分間、室温でカラムを遠心分離する。遠心分離中、各サンプルに単一の２ｍＬマイクロ遠心管を設置する。
６．５．１９遠心分離後、遠心分離機からスピンカラム／回収チューブを取り出す。各スピンカラムを２ｍＬマイクロ遠心管に移し、古い回収チューブをフロースルーと共に廃棄する。注記：ステップ５．５．１９のＰｕｒｅＬｉｎｋキットで供給される回収チューブを使用しない。追加された遠心分離ステップのための追加のチューブは、キットによって供給されないので、２ｍＬのマイクロ遠心管を使用する必要がある。
６．５．２０最高速度で２分間、室温でカラムを遠心分離して、カラムを乾燥させる。遠心分離中、各サンプルに単一の１．５ｍＬマイクロ遠心管を設置する。最低限サンプル名及び抽出日を記載したラベルを各チューブに付ける。これらは、ＤＮＡが溶出されるチューブである。
６．５．２１遠心分離後、遠心分離機からスピンカラム／チューブを取り出す。各スピンカラムを、対応するラベルの付いた１．５ｍＬのマイクロ遠心管に移し、２ｍＬのマイクロ遠心管を任意のフロースルーと共に廃棄する。
６．５．２２２５ｕＬのＰｕｒｅＬｉｎｋゲノム溶出バッファをカラムに添加する。ピペットチップが膜に接触したり、穴を開けたりすることのないように、溶出バッファをシリカ膜上に確実に置く。
６．５．２３カラムを室温で１分間インキュベートする。
６．５．２４最高速度で１分間、室温でカラム／チューブを遠心分離して、ＤＮＡを溶出させる。
６．５．２５遠心分離機からカラム／チューブを取り出し、追加の２５ｕＬのＰｕｒｅＬｉｎｋゲノム溶出バッファを用いてステップ５．５．２２～５．５．２３を繰り返す。
６．５．２６インキュベーション後、最高速度で１．５分間、室温でカラム／チューブを遠心分離して、更にＤＮＡを溶出させる。
６．５．２７遠心分離機からスピンカラム／チューブを取り出す。１．５ｍＬのチューブからカラムを取り出し、カラムを廃棄する。
６．５．２８溶出されたＤＮＡは、－２０℃で保存してもよく、直ちに定量し、作業濃度に希釈してもよい。
注記：定量後直ちに作業濃度に希釈する場合を除いて、ＤＮＡを定量しない。サンプルを定量するが、ｑＰＣＲ作業濃度に直ちに希釈することができない場合、サンプルを－２０℃に置く必要があり、解凍後にｑＰＣＲ作業濃度に希釈する前に再定量する必要がある。
６．６ＤＮＡ定量：
６．６．１ＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＢｒｏａｄＲａｎｇｅキット及びＱｕｂｉｔ４蛍光光度計を使用してＤＮＡを定量する。キットは、ＲＮＡよりも二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対して高度に選択的であり、１００ｐｇ／ｕＬ～１，０００ｎｇ／ｕＬの初期サンプル濃度に対して正確であるように設計されている。全てのキット構成要素は、任意のキット構成要素の混入を防ぐために、ＢＳＣで取り扱い、無菌的に取り扱う必要がある。
注記：ＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＢＲ試薬は、ＤＭＳＯを含み、ＲＴ未満の温度で凍結する。Ｑｕｂｉｔ試薬の凍結／解凍サイクルを繰り返すことは避ける必要があるので、試薬はＲＴで保存する必要がある。Ｑｕｂｉｔバッファは、ＲＴで保存されるように設計され、推奨保存条件である。Ｑｕｂｉｔ標準は２～８℃で保存する必要がある。
６．６．２ＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＢｒｏａｄＲａｎｇｅキットで供給される２つの標準物質を使用して、Ｑｕｂｉｔ４蛍光光度計を較正する。標準物質を調製し、定量されるＤＮＡサンプルの各セットと共に実行する必要がある。同じＱｕｂｉｔ作業溶液を使用して標準及びＤＮＡサンプルを調製した場合に最も正確な定量が達成されるので、前の実行からの較正は決して再使用しない。
６．６．３各標準及び定量されるサンプルに１本のＱｕｂｉｔアッセイチューブにラベルを付ける。チューブの蓋のみにラベルを付ける。定量を妨害するので、チューブの側面にラベルを付けない。
注記：Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計ではＱｕｂｉｔアッセイチューブしか使用することはできない。これらのチューブは、最も正確な結果を与えるように特別に設計されている。
６．６．４ＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＢＲ試薬をＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＢＲバッファで１：２００希釈することにより、Ｑｕｂｉｔ作業溶液を調製する。標準及び全ての定量されるサンプルの両方を用立るの十分な作業溶液を確実に調製する。必要最低限の体積は、（２（２つの標準）＋定量されるサンプル数＋１）×２００に等しい。
例えば、８つのサンプルを定量するためには、サンプル及び２つの標準に加えて余剰分のための少なくとも１つの追加のサンプルに十分な作業溶液を調製する。１１本のチューブ（８＋２＋１＝１１サンプル）においてチューブ１本あたり２００ｕＬの作業試薬を想定する：（２００ｕＬ）（１１本のチューブ）＝２２００ｍＬのＱｕｂｉｔ作業溶液（１１ｕＬのＱｕｂｉｔ試薬＋２１８９ｕＬのＱｕｂｉｔバッファ）。
６．６．５１９０ｕＬのＱｕｂｉｔ作業溶液を２本の標準チューブの各々に添加する。反応液に気泡が入るのを防ぐために、チューブに溶液を添加する前に、ピペットチップをＱｕｂｉｔ作業溶液で確実に予め湿らせておく。
６．６．６総体積アッセイチューブ体積２００μＬでＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＢｒｏａｄＲａｎｇｅキットを用いて定量するためには、３～２０ｕＬのサンプルＤＮＡを使用することができる。必要な体積のＱｕｂｉｔ作業溶液を各アッセイチューブに添加する。例えば、３μＬのサンプルを定量に使用する場合、１９７ｕＬのＱｕｂｉｔ作業溶液をサンプルチューブに添加する。チューブに溶液を添加する前に、ピペットチップをＱｕｂｉｔ作業溶液で確実に予め湿らせておく。
６．６．７各標準１０ｕＬを適切な標準チューブに添加する。各標準チューブを短時間ボルテックス混合する。
６．６．８必要量のサンプルストックＤＮＡを適切なサンプルチューブに添加して、２００ｕＬの総反応体積を得る。例えば、１９７ｕＬのＱｕｂｉｔ作業溶液を入れたサンプル反応チューブに対して３ｕＬのサンプルＤＮＡ。各標準チューブを短時間ボルテックス混合する。
６．６．９全ての標準及びチューブを室温で２分間インキュベートする。
６．６．１０最初に、標準を使用してＱｕｂｉｔ４蛍光光度計を較正する。
６．６．１０．１蛍光光度計のスクリーンをタップして、機器をスタンバイモードから復帰させる。
６．６．１０．２ホームスクリーン上のｄｓＤＮＡオプションを選択する。
６．６．１０．３次のスクリーンで、ｄｓＤＮＡ：Ｂｒｏａｄｒａｎｇｅを選択する。
６．６．１０．４蛍光光度計は、新たな標準を読み取るか、以前の較正を使用するか選択することを促す。常にＲｅａｄＳｔａｎｄａｒｄｓを選択する。注記：最も正確なサンプル濃度が得られなくなるので、以前の較正を使用してサンプルを読み取ること（Run samples selection）を決して選択しない。
６．６．１０．５促されたら、標準＃１サンプルをＱｕｂｉｔに挿入する。サンプルチャンバの蓋を閉じる。ＲｅａｄＳｔａｎｄａｒｄを選択して標準＃１を読み取る。
６．６．１０．６促されたとき、サンプルチャンバから標準＃１を取り出し、標準＃２を挿入する。サンプルチャンバの蓋を閉じ、ＲｅａｄＳｔａｎｄａｒｄを選択して標準＃２を読み取る。
６．６．１０．７較正が成功した場合、Ｑｕｂｉｔは、標準＃２の読み取りが行われてから較正の結果を表示する。
較正が失敗した場合、Ｑｕｂｉｔは較正エラーメッセージを表示する。
６．６．１０．８標準＃２について与えられた読み取り値が、標準＃１について与えられた読み取り値よりも少なくとも１０倍大きいことを確認する。
６．６．１０．９較正エラーが表示された場合、又は標準＃２が標準＃１よりも１０倍大きくない場合。新鮮なＱｕｂｉｔ作業溶液を用いてサンプル及び標準を再度作製する必要がある。以前のＱｕｂｉｔ作業溶液を作製するために使用したチューブを再使用しない。新鮮な標準を使用して較正を繰り返す。
６．６．１０．９．１較正が合格し、標準＃２の読み取り値が標準＃１よりも少なくとも１０倍大きい場合、サンプルの読み取りを継続する（ステップ５．６．９．１０～５．６．９．１４を参照）。
６．６．１０．９．２別の較正エラーが表示された場合、又は標準＃２が標準＃１よりも１０倍大きくない場合、アッセイのＳＭＥ又は管理者に連絡する。
６．６．１０．１０較正が成功したと判定されてから、Ｓｔａｎｄａｒｄｓｒｅｓｕｌｔｓスクリーンの底部でＲｕｎｓａｍｐｌｅｓを選択してサンプルの実行を開始する。
６．６．１０．１１第１のサンプルで実行する前に、サンプル体積スクリーンが表示される。＋又は－記号を使用して、実行するサンプルの全てに使用するサンプル体積（３～２０ｕＬ）を選択する。次いで、ドロップダウンメニューからサンプル濃度の出力について単位（ｕｇ／ｕＬ）を選択する。
６．６．１０．１２正しいサンプル体積及びサンプル濃度単位を選択してから、サンプル１をサンプルチャンバに挿入する。サンプルチャンバの蓋を閉じ、Ｒｅａｄｔｕｂｅを選択する。
６．６．１０．１３元の計算されたサンプル濃度及びＱｕｂｉｔチューブにおけるサンプルの濃度が両方表示される。元の計算されたサンプル濃度は、ストックＤＮＡサンプルのものである。
６．６．１０．１３．１サンプル濃度がキット範囲のサンプル濃度の範囲外である場合、ＯｕｔｏｆＲａｎｇｅエラーが表示される。
６．６．１０．１３．２右矢印を押して標準及びサンプルの結果のグラフを開き、サンプルの結果が高すぎるか又は低すぎるかを判定する。
６．６．１０．１３．３範囲外のサンプルで再度実行する必要がある。低すぎたサンプル濃度については、より多いサンプル体積を使用する。高すぎたサンプル濃度については、より少ないサンプル体積、又はストックＤＮＡの希釈液（低ＥＤＴＡＴＥバッファで作製）のいずれかを使用する。
繰り返しサンプルは、新しい標準に対して実行する必要がある。サンプル及び標準はいずれも、新鮮なＱｕｂｉｔ作業溶液を使用して設定する必要がある（以前のＱｕｂｉｔ作業溶液のチューブを再使用しない）。
６．６．１０．１４サンプルチャンバからサンプル１を取り出す。複数のサンプルを読み取る場合、次のサンプルをサンプルチャンバに挿入し、サンプルチャンバの蓋を閉じ、Ｒｅａｄｔｕｂｅを選択する。
６．６．１０．１５全てのサンプルで実行するまで５．６．９．１４を繰り返すことを続ける。
６．６．１０．１６Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計の付いたＵＳＢケーブルを使用してＱｕｂｉｔをコンピュータに接続し、ＡｕｔｏＰｌａｙウインドウが開いたとき、Ｏｐｅｎｄｅｖｉｃｅを選択してファイルを見る。コンピュータにおいて何らかの更なる選択を行う前に、Ｑｕｂｉｔにおいてステップ５．６．９．１７を続ける。
６．６．１０．１７最後のサンプルの読み取りについてはＳａｍｐｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎスクリーンから又はＨｏｍｅスクリーンからデータを選択して、Ｑｕｂｉｔにおけるアッセイ実行のリストを示すＥｘｐｏｒｔｄａｔａスクリーンを開く。
データはアッセイに列挙され、アッセイの日時、アッセイ名（ｄｓＤＮＡＢｒｏａｄＲａｎｇｅ）、及びそのアッセイにおけるサンプル実行ラの数を示す。
注記：Ｑｕｂｉｔ４蛍光光度計は、最大１０００個のサンプルのデータを保存する。
６．６．１０．１８エクスポートされるアッセイデータの隣のボックスにタッチする。ボックスにチェックマークが現れる。次いで、Ｅｘｐｏｒｔを選択して、データセット全体をコンピュータにエクスポートする。
６．６．１０．１９コンピュータで、Ｉｎｔｅｒｎａｌｓｔｏｒａｇｅ、次いで、Ｑｕｂｉｔ４フォルダをダブルクリックして、エクスポートされたデータを入手する。
注記：フォルダは、エクスポートされたデータが実行された日付ではなく、データがエクスポートされた日付を用いて、ＱｕｂｉｔＤａｔａ＿日－月－年と命名される。
６．６．１０．２０データフォルダを開き、ＱｕｂｉｔＤａｔａ＿日－月－年＿分－時－秒．ｃｓｖファイルをセキュアデータバックアップシステム（例えば、ＯｐｅｎＬａｂ）に、又は施設の詳しい手順に従って保存する。施設の詳しい手順に従ってこのファイルをアッセイの文書に添付する必要がある。注記：フォルダは、ＲＮＡＩＱアッセイのみに特有のＱｕｂｉｔＤａｔａ＿Ｒｎａ＿ｉｑ＿日－月－年＿分－時－秒．ｃｓｖファイルも含む。
この．ｃｓｖファイルは、ＲＮＡＩＱ以外の任意のアッセイを実行するときには空であるので、保存する必要はない。
６．６．１０．２１．ｃｓｖファイルは、アッセイ実行の結果を含む。結果は、サンプルを読み取ったのと逆の順序（すなわち、最後のサンプルの読み取りから最初のサンプルの読み取りの順）で与えられる。ＴｅｓｔＤａｔｅの列は、各サンプルが読み取られた時間も示し、サンプル順序を確認するために使用することができ、最初のサンプルでの実行がより早いタイムスタンプを有するのに対し、最後のサンプルでの実行はより遅いタイムスタンプを有する。
６．６．１０．２２元のサンプル濃度は、ストックＤＮＡの濃度である。ＱｕｂｉｔアッセイにおいてストックＤＮＡの希釈液で実行した場合、元のサンプル濃度にＱｕｂｉｔアッセイで使用する希釈したＤＮＡストックの希釈係数を乗じて、ストックＤＮＡの濃度を求める必要がある。例えば、低ＥＤＴＡＴＥバッファでストックＤＮＡを１：１０希釈し、１：１０希釈液３μＬをＱｕｂｉｔアッセイで使用し、Ｑｕｂｉｔからの元のサンプル濃度が０．０５６１ｕｇ／ｕＬである場合、未希釈のストックＤＮＡ濃度は（０．０５６１ｕｇ／ｕＬ）（１０）＝０．５６１ｕｇ／ｕＬである。
６．７トランスジーンｑＰＣＲアッセイにおける実行の準備におけるサンプルＤＮＡの希釈：
６．７．１．１低ＥＤＴＡＴＥバッファでサンプルを０．０２０ｕｇ／ｕＬに希釈する必要がある。ストックＤＮＡを定量した直後。０．０２０ｕｇ／ｕＬ未満のストックＤＮＡ濃度を有するサンプルは、ステップ５．７．１．５に従って分注し、ｑＰＣＲアッセイでそのまま（未希釈）使用する必要がある。
６．７．１．２以下の式を使用して、作製することができる０．０２０ｕｇ／ｕＬの希釈ＤＮＡの総体積を求める：

６．７．１．３次いで、以下の通りストックＤＮＡを０．０２０ｕｇ／ｕＬに希釈するために必要な低ＥＤＴＡＴＥバッファの量を求める。

６．７．１．４５．７．１．３で計算した低ＥＤＴＡＴＥバッファの体積の計算値を用いて所望の体積のストックＤＮＡを希釈して、０．０２０ｕｇ／ｕＬの作業濃度のＤＮＡを作製する。可能な限り多くのストックＤＮＡを０．０２０ｕｇ／ｕＬのｑＰＣＲ作業濃度に希釈して、サンプルの可能な限り多くの単回使用アリコートを作製することが推奨される。しかしながら、最低３回のｑＰＣＲアッセイに十分なアリコートを確保するために、０．０２０ｕｇ／ｕＬのサンプルＤＮＡの最低３つの単回使用アリコートを作製する必要がある。
例えば、０．０５６１ｕｇ／ｕＬのストックＤＮＡ濃度。Ｑｕｂｉｔアッセイにおいて３ｕＬのＤＮＡを使用した後、最低４７ｕＬのストックＤＮＡが残る。４０ｕＬのストックＤＮＡを使用して、０．０２０ｕｇ／ｕＬのｑＰＣＲ作業濃度に希釈する。

４０ｕＬのストックＤＮＡを７２．２ｕＬの低ＥＤＴＡＴＥバッファで希釈して、総体積１１２．２ｕＬの０．０２０ｕｇ／ｕＬのｑＰＣＲ作業ストックサンプルＤＮＡを作製する。
６．７．１．５可能な限り多くの０．０２０ｕｇ／ｕＬの作業ストックサンプルＤＮＡの２０ｕＬの単回使用アリコートを作製する。各ｑＰＣＲアッセイで１５ｕＬのＤＮＡを使用するので、各アリコートは約５ｕＬの超過分のＤＮＡを有する。いつでも可能であれば、最低３つの単回使用アリコートを作製することが推奨される。
６．７．１．６全てのアリコートに、最低限サンプル名、アリコートの濃度（ストック濃度が０．０２０ｕｇ／ｕＬ未満である場合、０．０２０ｕｇ／ｕＬ又はストック濃度のいずれか）、及びアリコートを作製した日付が記載されたラベルを付ける。
６．７．１．７全てのアリコート並びに任意の残りのストックサンプルＤＮＡは－２０℃で保存する必要がある。

オリゴの新規ロットの作製及び適格性確認
１．０目的
１．１トランスジーンｑＰＣＲ法のためのオリゴの新規ロットを作製及び適格性確認するための例示的な手順について記載する。

２．０機器
２．１１．５ｍＬのマイクロ遠心管をスピンさせることができる遠心分離機（例えば、ＳＸ４７５０ロータ及び９６ウェルプレート用のスウィングセット及び１．５ｍＬのマイクロ遠心管用のアダプタを備えたＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、ＡｌｌｅｇｒａＸ－１４Ｒ）
２．２ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６リアルタイムＰＣＲシステム
２．３－２０℃が可能な冷凍庫
２．４較正された８又は１２チャネルのピペット（２０、５０ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎピペット
２．５較正されたシングルチャネルのピペット（２０、１００、２００、１０００ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎピペット
２．６２～８℃を維持することが可能な冷蔵庫又は低音室
２．７ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＰＣＲソフトウェアｖ１．３以上
２．８５５℃が可能であり、１．５ｍＬのマイクロ遠心管に好適なヒートブロック
２．９ボルテックスミキサー

３．０材料
注記：「例えば」と指定された材料は、事前の適格性確認なしに類似の材料によって代替してもよい。「又は等価物」と指定された材料については、サンプルを試験するために使用する前に、代替物が等価であることを実証する必要がある。
３．１ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０９７７０１５。
３．２ＴａｑＰａｔｈＰｒｏＡｍｐＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ３０８６６、又は等価物。
３．３ＢＣＭＡトランスジーン及びｈＡＬＢのプライマー及びプローブ凍結乾燥ストック、ＩＤＴを通したカスタム配列又は等価物。
３．４ＢＣＭＡトランスジーン及びＡＬＢのプライマー及びプローブの適格性確認されたロット、ＩＤＴを通したカスタム配列又は等価物。
３．５ＢＣＭＡトランスジーン標準＃１の適格性確認されたロット
３．６ＢＣＭＡトランスジーンの中及び低対照の適格性確認されたロット
３．７１×低ＥＤＴＡＴＥバッファｐＨ８．０、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、ＱｕａｌｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号３５１－３２４－７２１。
３．８０．５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、ＶＷＲＳｃｒｅｗ－ＣａｐＭｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅＴｕｂｅｓカタログ番号８９００４－２８６又はＥｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１００５
３．９１．５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１０２１
３．１０２ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１０４８
３．１１５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号００３０１１９４６０
３．１２ピペットチップ、滅菌済、濾過済、（２０、２００、１０００ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎカタログ番号３０３８９２２６、３０３８９２４０、３０３９８２１３
３．１３９６ウェルＰＣＲプレート、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４４８３３４３、４４８３３５４、４４８３３４９、４４８３３５０、４４８３３９５、又は等価物
３．１４ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学接着フィルム、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３１１９７１、又は等価物
３．１５試薬リザーバ、滅菌済、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、ＶｉｓｔａＬａｂｓカタログ番号３０５４－１００２

４．０注意事項
４．１実験室で作業するときは適切なＰＰＥを着用する。
４．２危険な化学物質を用いた作業についての施設の詳しい指針に従う。更なる詳細については、製造業者のＳＤＳを参照する。
４．３全てのピペッティングステップは、ＢＳＣにおいて無菌技術を使用して実施する必要がある。任意の材料又は試薬への混入のリスクを最小限に抑えるために、手順の全てのステップ中、分析者は使い捨てスリーブカバーを着用することが推奨される。

６．０手順
注記：オリゴは、マルチプレックスセット（ＢＣＭＡトランスジーン及びｈＡＬＢ）として適格性確認される。セット中の６つのオリゴのうちのいずれかの最後のアリコートが使用されてから、ロットのオリゴが枯渇する。１つの適格性確認されたセットからのオリゴを別の適格性確認されたセットのオリゴと混合し、マッチさせない。枯渇した、既に適格性確認されたセットからの任意の残りのオリゴは、廃棄する必要がある。
６．１ＢＣＭＡトランスジーンオリゴ及びｈＡＬＢオリゴを注文する（配列については表９を参照）。

６．２オリゴは、各オリゴの仕様シートと共に、ベンダーから凍結乾燥した状態で供給される。再構成の準備が整うまで、凍結乾燥オリゴを－２０℃で保存する。凍結乾燥オリゴは、最長１２ヶ月間－２０℃で保存することができる。注記：平均して、製造業者からオリゴを受け取るのに少なくとも２週間かかる。したがって、新規又は適格性確認されたロットのオリゴのいずれかに問題が発生した場合、サンプル試験への影響を最小限に抑えるために、少なくとも１セットのバックアップ凍結乾燥オリゴを常時保持しておく必要がある。
６．３オリゴの再構成
６．３．１凍結乾燥オリゴストックを－２０℃から取り出し、１０，０００×ｇで３０秒間遠心分離して、チューブを開ける前に全てのオリゴストックを確実にチューブの底部に落とす。
輸送中にチューブの底部から除去される任意のオリゴの損失を防止するために、遠心分離前にチューブを開けない。
６．３．２以下の通り、低ＥＤＴＡＴＥバッファを使用して各オリゴを１００ｕＭストックに再構成する。
６．３．２．１個々のオリゴ仕様シートに各オリゴのｎｍｏｌ量を見つける。
６．３．２．２１００ｕＭのストックを作製するためにオリゴチューブに添加する必要のあるＴＥバッファの体積を得るために、ｎｍｏｌ量に１０を乗じる。
６．３．２．３各オリゴについてステップ１１．３．２．２で計算したＴＥバッファの体積をそれぞれのオリゴチューブに添加する。
６．３．２．４各オリゴチューブを短時間ボルテックスして、凍結乾燥オリゴをＴＥバッファに完全に再懸濁させる。
６．３．２．５プライマーチューブを調べて、全ての凍結乾燥オリゴがＴＥバッファに完全に溶解していることを確認する。ＴＥバッファに完全には溶解していないオリゴの粒子がいくつか存在しているかもしれないように見える場合、再懸濁を支援するためにチューブを５５℃で１～５分間加熱してもよい。加熱後、チューブを再度短時間ボルテックスする。
６．３．３１００ｕＭのストックをオリゴ作業ストック濃度に希釈する
６．３．３．１低ＥＤＴＡＴＥバッファを使用して、１００ｕＭのプライマーストックを１０ｕＭの作業ストックに希釈する
６．３．３．２低ＥＤＴＡＴＥバッファを使用して、１００ｕＭのプローブストックを１０ｕＭの作業ストックに希釈する

６．３．３．３全てのプライマーの２０ｕＬのアリコート及び全てのプローブの３５ｕＬのアリコートを、０．５ｍＬのスクリューキャップチューブ内で作製する。指定のアリコート体積は、ハーフＰＣＲプレートアッセイに十分である。プライマー及びプローブは、必要に応じてフルプレートアッセイまで対応するように、より大きな体積で分注してもよい。
６．３．３．４全てのアリコートに最低限の情報が記載されたラベルを付ける。
６．３．３．４．１オリゴの名称
６．３．３．４．２ｕＭ濃度
６．３．３．４．３ロット番号
６．３．３．４．４使用期限（再構成日から１年間）
６．３．３．４．５全ての作業ストックを－２０℃で保存する。
６．３．４オリゴの新規ロットの適格性確認
６．３．４．１オリゴの現在適格性確認されているロット及びオリゴの新規ロットの両方を、以下の通りプロトコルに従って、標準＃１、中及び低対照の適格性確認されたロットを使用して最低３つの独立したトランスジーンｑＰＣＲアッセイで実行する。
６．３．４．１．１３つのアッセイの各々のために２つのマスターミックスを設定し、一方のマスターミックスは、オリゴの現在適格性確認されているロットを使用して作製し、第２のマスターミックスは、オリゴの新規ロットを使用して作製する。
６．３．４．１．２プレートマップに従って、ｑＰＣＲプレートにロードする。
６．３．４．１．３「ＯｌｉｇｏＱｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｅｄｔ」テンプレートを開き、「ＳａｖｅＡｓ」を選択し、ｑＰＣＲ実験のための適切な名称を入力し、．ｅｄｓファイルとして保存する。テンプレートファイルを上書きしない。
６．３．４．１．４プロトコルに従ってｑＰＣＲプレートにロードし、実行する。
６．３．４．２Ｓｅｔｕｐの項で、Ａｓｓｉｇｎを選択する。ウェルＤ１～Ｅ１２をハイライトし、右クリックし、省略を選択する。これにより、分析から新規のオリゴロットの反応を省略する。プレート全体を選択し、Ａｎａｌｙｚｅをクリックする。
６．３．４．３データのＰＤＦレポートを印刷し、それが適格性確認されたオリゴロットの分析であることを示す。
６．３．４．３．１ＤＳＴＭＤ－２４４４８に記載されているアッセイ許容基準を全て満たす必要がある。アッセイ許容基準のいずれかが満たされていない場合、アッセイは無効であり、繰り返す必要がある。試薬の適格性確認レポートに、任意の無効なアッセイを記録する。
６．３．４．４Ｓｅｔｕｐの項で、Ａｓｓｉｇｎを選択する。ウェルＤ１～Ｅ１２をハイライトし、右クリックし、包含を選択する。ウェルＡ１～Ｂ１２をハイライトし、右クリックし、省略を選択する。これにより、分析から適格性確認されたオリゴロットの反応を省略する。プレート全体を選択し、Ａｎａｌｙｚｅをクリックする。
６．３．４．５データのＰＤＦレポートを印刷し、それが新規のオリゴロットの分析であることを示す。
６．３．４．５．１新規のオリゴロットの分析からの全ての結果は、本明細書に記載されているアッセイ許容基準を全て満たす必要がある。
６．３．４．５．２以下の通り、適格性確認された、及び新規のオリゴロット反応における各標準についての平均Ｃｔ値の差％を計算する。

６．３．４．５．３全ての差％は、≦１．６０％である必要がある
６．３．４．６新規のオリゴロットが適格性確認に合格するためには、全ての有効な適格性確認アッセイがＣｔ％の差の基準を満たす必要がある。
６．３．４．７新規のロットが許容基準を満たさない場合、ロットは適格性確認に不合格となり、廃棄する必要がある。別の新規ロットのオリゴを調製し、新規のロットの適格性確認を実行する。

線形ＬｉＣＡＲプラスミド作業ストックの作製
１．０目的
１．１この実施例は、トランスジーンｑＰＣＲ法用の標準及び対照の作製において使用するための線形プラスミドの作業ストックを作製するために、ＬｉＣＡＲプラスミドを線形化し、ｍｇ／ｍＬのプラスミド濃度をコピー／ｕＬに変換するための例示的な手順について説明する。

２．０機器
２．１１．５ｍＬ及び５ｍＬのマイクロ遠心管をスピンさせることができる（例えば、１．５ｍＬのマイクロ遠心管用のアダプタを備えるＳＸ４７５０ロータを備えたＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、ＡｌｌｅｇｒａＸ－１４Ｒ）。
２．２電気泳動装置、例えば、ＬｏｎｚａＦｌａｓｈＧｅｌＤＮＡシステム及びＦｌａｓｈＧｅｌＤｏｃｋ、又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＥ－Ｇｅｌ電気泳動装置
２．３－７０℃が可能な冷凍庫
２．４２～８℃を維持することが可能な冷蔵庫又は低音室
２．５較正されたシングルチャネルのピペット（２０、１００、２００、１０００ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎピペット
２．６Ｑｕｂｉｔ４蛍光光度計、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｑ３３２２６
２．７３７℃が可能であり、１．５ｍＬのマイクロ遠心管に好適なヒートブロック
２．８バイオセーフティキャビネット
２．９ボルテックスミキサー

３．０材料
注記：「例えば」と指定された材料は、事前の適格性確認なしに類似の材料によって代替してもよい。「又は等価物」と指定された材料については、サンプルを試験するために使用する前に、代替物が等価であることを実証する必要がある。
３．１ｐＬＬＶ－ＬｉＣＡＲ２ＳＩＮＬｉＣＡＲプラスミドストック
３．２ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０９７７０１５
３．３ＥｃｏＲＩＨＦ酵素、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｒ３１０１Ｓ、又は等価物
３．４ＧｅｎｅＪｅｔゲル抽出及びＤＮＡＣｌｅａｎｕｐキット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｋ０８３１、又は等価物
３．５プレキャスト電気泳動ゲル、例えば、高分子量バンドの分解に好適なＬｏｎｚａＦｌａｓｈＧｅｌＤＮＡカセット又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＥ－Ｇｅｌ（例えば、ＦｌａｓｈＧｅｌＤＮＡカセット、１．２％１２＋１単層、Ｌｏｎｚａカタログ番号５７０２３）
３．６少なくとも８０００ｋｂのバンドサイズの決定に好適な分子量ＤＮＡラダー（例えば、Ｅ－Ｇｅｌ１ＫｂＰｌｕｓＤＮＡラダー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０４８８０９０）１．１１．５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１０２１１．２２ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１０４８
３．７５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号００３０１１９４６０
３．８１×低ＥＤＴＡＴＥバッファｐＨ８．０、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、ＱｕａｌｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号３５１－３２４－７２１。
３．９０．５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、ＶＷＲＳｃｒｅｗ－Ｃａｐマイクロ遠心管カタログ番号８９００４－２８６又はＥｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１００５
３．１０ピペットチップ、滅菌済、濾過済、（２０、２００、１０００ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎカタログ番号３０３８９２２６、３０３８９２４０、３０３９８２１３

５．０手順
５．１プラスミド消化を開始する前に、ヒートブロックを３７℃に予め加温しておく。
５．２ＬｉＣＡＲプラスミドストックのバイアルを解凍する。
５．３Ｑｕｂｉｔ４蛍光光度計及び本明細書に前述した手順を使用して、ＬｉＣＡＲＤＮＡの濃度を求める。ＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＢＲキットの範囲内（２～１０００ｎｇのＤＮＡ）にするために、プラスミドストックを希釈する必要がある場合がある。
５．４０．０９ｕｇ／ｕＬのプラスミドＤＮＡを消化するために必要な必要量のプラスミドを水で希釈する。
例えば、３．６３ｕＬのプラスミドＤＮＡを４６．３７ｕＬのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水に添加することによって、１．２４ｕｇ／ｕＬのプラスミドストック濃度を０．０９ｕｇ／ｕＬに希釈する。
５．５室温でＥｃｏＲＩＨＦ酵素消化反応混合物を調製し、各試薬を表１１に示す順序で添加する。

注記：標準及び対照を作製するためにＬｉＣＡＲプラスミドの作業ストックを調製するのに十分な量の線形化ＤＮＡを得るために、必要に応じて、複数回の５０ｕＬの酵素消化反応を繰り返し実行してもよい。
５．６少なくとも５ｕＬの未消化プラスミドＤＮＡを準備して、ゲル上のインタクトなプラスミドＤＮＡ対照として機能させる。
５．７ピペット混合又はチューブを軽くたたくことによって消化チューブを穏やかに混合する（反応液をボルテックスしない）。３００×ｇで５秒間、反応液を短時間スピンダウンする。
５．８３７℃のヒートブロックで１５分間チューブをインキュベートする。
５．９ＧｅｎｅＪｅｔゲル抽出及びＤＮＡクリーンアップミニキットを使用して、消化されたプラスミドＤＮＡを精製する。
注記：ＤＮＡ精製に使用する体積は２００ｕＬを上回らない必要があり、精製されたプラスミドＤＮＡの総量は１０ｕｇを上回らない必要がある。総体積が２００ｕＬを上回る場合、以下の精製ステップに進む前に、体積を２本以上のチューブに等しく分割する。
５．１０新たなＧｅｎＪｅｔキットを開いたとき、ＤＮＡクリーンアップ手順を開始する前に、各ボトルの説明書に従って９６～１００％エタノールを洗浄バッファボトルに添加する。添加した日付及びイニシャルをラベルに記載することによって、エタノールの添加を確認する。洗浄バッファを室温でエタノールと共に保存する。また、使用前の任意の塩析のためにキット内の全ての溶液を確認する。溶液を３７℃に加温することによって任意の沈殿物を溶解させ、次いで、使用前に室温に平衡化する。
注記：ＤＮＡ精製カラムは、キット到着時、そして、カラムが使用されていないときには、２～８℃で保存すべきである。各使用後に、ＤＮＡ精製カラムの入った袋を確実に閉じる。
５．１１反応混合物の体積を、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水で２００ｕＬに調整する。例えば、５０ｕＬの消化されたＤＮＡ混合物に１５０ｕＬの水を添加する。
５．１２１００μＬの結合バッファを添加する。ピペッティングによって十分に混合する。
５．１３３００μＬのエタノール（９６～１００％）を添加し、ピペッティングによって混合する。
５．１４混合物をＤＮＡ精製マイクロカラム及び回収チューブに移す。カラムを１４，０００×ｇで１分間遠心分離する。フロースルーを廃棄する。ＤＮＡ精製マイクロカラムを回収チューブに戻す。あるいは、チューブを２ｍＬのマイクロ遠心管に入れ、回収チューブを廃棄してもよい。
５．１５７００μＬの洗浄バッファ（エタノールを補充）をカラムに添加し、１４，０００×ｇで１分間遠心分離する。フロースルーを廃棄し、カラムを回収チューブに戻す。あるいは、チューブを２ｍＬのマイクロ遠心管に入れ、回収チューブを廃棄してもよい。
５．１６７００μＬの洗浄バッファをカラムに添加し、１４，０００×ｇで１分間遠心分離することによって別の洗浄ステップを行う。フロースルーを廃棄し、カラムを同じ回収チューブに戻す。あるいは、チューブを２ｍＬのマイクロ遠心管に入れ、回収チューブを廃棄してもよい。
５．１７カラムを１４，０００×ｇで更に１分間遠心分離して、任意の残留洗浄バッファを完全に除去する。
５．１８カラムを清浄な１．５ｍＬのマイクロ遠心管に移し、１０ｕＬの溶出バッファ（ＧｅｎｅＪｅｔキットと共に供給）をカラムの中心に添加する。ピペットチップでシリカ膜に接触したり、穴を開けたりしない。
５．１９１４，０００×ｇで１分間遠心分離してＤＮＡを溶出する。
５．２０インタクトな環状（非消化ＤＮＡ）及び線形化ＤＮＡのゲル電気泳動によって、ＶＳＶ－Ｇプラスミドの消化を確認する。可能な最大量の線形化プラスミドを保存するために、ゲル電気泳動に使用するための線形化プラスミドストックの希釈液を作製することが推奨される。
５．２１Ｑｕｂｉｔ４蛍光光度計及び本明細書に前述した手順を使用して、精製された線形ＶＳＶ－ＧプラスミドＤＮＡの濃度を求める。
５．２２以下の通り、ステップ５．２１で求めた線形プラスミド濃度をＬｉＣＡＲプラスミドのコピー数／ｕＬに変換する。

例えば、ＬｉＣＡＲＤＮＡ濃度は、１．０３ｕｇ／ｕＬである。

５．２３低ＥＤＴＡＴＥバッファで標準及び対照を作製するのに適切な作業濃度にプラスミドストックを希釈する。
５．２４標準及び対照を作製するのに適切な作業ストック線形ＬｉＣＡＲプラスミドを作製するために、必要に応じて低ＥＤＴＡＴＥバッファで線形ＬｉＣＡＲプラスミドストックを希釈する。
５．２５最低限の情報が記載されたラベルの付いた、作業プラスミド濃度の適切なサイズの単回使用アリコートを作製する。
５．２５．１線形プラスミド
５．２５．２プラスミド濃度（コピー／ｕＬ）
５．２５．３アリコートサイズ
５．２５．４使用期限
５．２６プラスミドは－７０℃で１２ヶ月間安定である。

標準の新規ロットの作製及び適格性確認
１．０目的
１．１トランスジーンｑＰＣＲ法のための標準の新規ロットを作製及び適格性確認するための例示的な手順について記載する。

２．０機器
２．１１．５ｍＬのマイクロ遠心管をスピンさせることができる遠心分離機（例えば、ＳＸ４７５０ロータ及び９６ウェルプレート用のスウィングセット及び１．５ｍＬのマイクロ遠心管用のアダプタを備えたＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、ＡｌｌｅｇｒａＸ－１４Ｒ）
２．２ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６リアルタイムＰＣＲシステム
２．３－２０℃が可能な冷凍庫
２．４－７０℃が可能な冷凍庫
２．５較正された８又は１２チャネルのピペット（２０、５０ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎピペット
２．６較正されたシングルチャネルのピペット（２０、１００、２００、１０００ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎピペット
２．７２～８℃を維持することが可能な冷蔵庫又は低音室
２．８ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＰＣＲソフトウェアｖ１．３以上
２．９５５℃が可能であり、１．５ｍＬのマイクロ遠心管に好適なヒートブロック
２．１０ボルテックスミキサー
２．１１バイオセーフティキャビネット

３．０材料
注記：「例えば」と指定された材料は、事前の適格性確認なしに類似の材料によって代替してもよい。「又は等価物」と指定された材料については、サンプルを試験するために使用する前に、代替物が等価であることを実証する必要がある。
３．１ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０９７７０１５。
３．２ＴａｑＰａｔｈＰｒｏＡｍｐＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ３０８６６、又は等価物。
３．３ペレットあたり２×１０６～４×１０６個の細胞を有するモックＴ細胞ペレット。
３．４ＢＣＭＡトランスジーン及びＡＬＢのプライマー及びプローブの適格性確認されたロット、ＩＤＴを通したカスタム配列又は等価物。
３．５ＢＣＭＡトランスジーン標準＃１の適格性確認されたロット
３．６ＢＣＭＡトランスジーンの中及び低対照の適格性確認されたロット
３．７ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮの作業ストックアリコート
３．８１×低ＥＤＴＡＴＥバッファｐＨ８．０、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、ＱｕａｌｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号３５１－３２４－７２１。
３．９０．５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、ＶＷＲＳｃｒｅｗ－ＣａｐＭｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅＴｕｂｅｓカタログ番号８９００４－２８６又はＥｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１００５
３．１０１．５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１０２１
３．１１２ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１０４８
３．１２５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号００３０１１９４６０
３．１３ピペットチップ、滅菌済、濾過済、（２０、２００、１０００ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎカタログ番号３０３８９２２６、３０３８９２４０、３０３９８２１３
３．１４９６ウェルＰＣＲプレート、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４４８３３４３、４４８３３５４、４４８３３４９、４４８３３５０、４４８３３９５、又は等価物
３．１５ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学接着フィルム、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３１１９７１、又は等価物
３．１６試薬リザーバ、滅菌済、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、ＶｉｓｔａＬａｂｓカタログ番号３０５４－１００２

５．０手順
５．１本明細書に既に記載したプロトコルに従って、モックＴ細胞ペレットからｇＤＮＡを単離する。モックＴ細胞は、ＣＡＲＴ製造プロセスを代表するものであるが、レンチベクターを形質導入していないものである必要がある。
５．２数本のシリカＤＮＡ抽出カラムを使用して、必要量のｇＤＮＡを単離する。全てのカラムから溶出したＤＮＡを合わせて、定量前にモックＴ細胞ｇＤＮＡの単一ストックを作製する。
５．３定量後、少なくとも４ヶ月間の試験に対応するのに十分な数のアリコートを作製するために、十分なｇＤＮＡを確実に単離する。
５．３．１少なくとも４ヶ月間継続するのに十分大きなロットを作製するのに十分なｇＤＮＡが、最初のｇＤＮＡ単離から得られなかった場合、追加のモックＴ細胞ペレットを単離し、最初のモックＴ細胞ｇＤＮＡストックと合わせ、合わせたストックを、Ｑｕｂｉｔを使用して定量してよい。
５．４５ｕＬの標準＃１が１２１，２１２．１２１２コピーのＬｉＣＡＲプラスミドを含有するように、標準＃１は、ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミド（ＬｉＣＡＲプラスミド）を加えた０．０５ｕｇ／ｕＬの濃度のモックＴ細胞ＤＮＡで構成される。
５．４．１以下の通り、モックＴ細胞ＤＮＡのストックから作製され得る標準＃１の総体積を求める。

例えば、約３９７．０ｕＬのモックＴ細胞ｇＤＮＡが、ＤＮＡの定量後に残る。ｇＤＮＡの濃度は、０．０８５３ｕｇ／ｕＬである。３９２．０ｕＬのｇＤＮＡを取り出して、標準＃１を作製する。

５．４．２次いで、以下の通りｇＤＮＡを０．０５ｕｇ／ｕＬに希釈するために必要な低ＥＤＴＡバッファ＋プラスミドの体積を求める。

例えば、３９２．０ｕＬのｇＤＮＡストックｇＤＮＡを取り出して、総体積６６８．８ｕＬの標準＃１を作製する。

５．４．３次いで、以下の通り、５ｕＬの標準＃１当たり１２１，２１２．１２１コピーのＬｉＣＡＲプラスミドを達成するためにちょうど必要なプラスミドの体積を求める。

例えば、総体積６６８．８ｕＬの標準＃１。１．１０３５×１０６コピー／ｕＬのＬｉＣＡＲプラスミド作業ストック。

５．４．４最後に、上記総体積の標準＃１を作製するためにちょうど必要な低ＥＤＴＡバッファの体積を求める。

例えば、３９２．０ｕＬのモックＴ細胞ｇＤＮＡ及び１４．７ｕＬのＬｉＣＡＲプラスミドから総体積６６８．８ｕＬの標準＃１。

５．５作製される標準＃１の総体積（ステップ５．４．１で計算）を収容するのに適切なサイズのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーチューブに、上記体積のストックモックＴ細胞ｇＤＮＡを移すことによって、標準＃１の作製を開始する
５．６ステップ５．５からのチューブに、ステップ５．４．４で計算した体積の低ＥＤＴＡＴＥバッファを添加する。
５．７次いで、ステップ５．４．３で計算した体積のＬｉＣＡＲプラスミドを添加する。チューブを短時間ボルテックス混合する。
５．８最低限の情報が記載されたラベルの付いた標準＃１の２０μＬの単回使用アリコートを作製する：
５．８．１ＢＣＭＡトランスジーン標準＃１
５．８．２ロット番号
５．８．３標準＃１を作製した日付
５．９全ての単回使用アリコートを－２０℃で保存する。
５．９．１標準＃の新規ロットの適格性確認
５．９．１．１現在適格性確認されている標準＃１及び新規ロットの標準＃１の両方を、以下の通り本明細書に既に記載したプロトコルに従って、オリゴ、中及び低対照の適格性確認されたロットを使用して最低３つの独立したトランスジーンｑＰＣＲアッセイで実行する。
５．９．１．１．１全ての標準及び対照サンプルにつき、１つのマスターミックスを作製する。
５．９．１．１．２１本は標準＃１の適格性確認されたロットを使用し、１本は標準＃１の新規ロットを使用する、２本の５点標準曲線を作成する。
５．９．１．１．３プレートマップに従って、ｑＰＣＲプレートにロードする。
５．９．１．１．４「ＳｔａｎｄａｒｄＱｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｅｄｔ」テンプレート」を開き、「ＳａｖｅＡｓ」を選択し、ｑＰＣＲ実験のための適切な名称を入力し、．ｅｄｓファイルとして保存する。テンプレートファイルを上書きしない。
５．９．１．１．５本明細書に記載のプロトコルに従ってｑＰＣＲプレートにロードし、実行する。
５．９．１．２Ｓｅｔｕｐの項で、Ａｓｓｉｇｎを選択する。ウェルＣ１～Ｄ３をハイライトし、右クリックし、省略を選択する。これにより、分析から新規の標準＃１ロットの標準曲線を省略する。プレート全体を選択し、Ａｎａｌｙｚｅをクリックする。
５．９．１．３データのＰＤＦレポートを印刷し、それが適格性確認された標準＃１ロットの分析であることを示す。
５．９．１．３．１本明細書に記載されているアッセイ許容基準を全て満たす必要がある。アッセイ許容基準のいずれかが満たされていない場合、アッセイは無効であり、繰り返す必要がある。試薬の適格性確認レポートに、任意の無効なアッセイを記録する。
５．９．１．４Ｓｅｔｕｐの項で、Ａｓｓｉｇｎを選択する。ウェルＣ１～Ｄ３をハイライトし、右クリックし、包含を選択する。ウェルＡ１～Ｂ３をハイライトし、右クリックし、省略を選択する。これにより、分析から適格性確認された標準＃１ロットの標準曲線を省略する。プレート全体を選択し、Ａｎａｌｙｚｅをクリックする。
５．９．１．５データのＰＤＦレポートを印刷し、それが新規の標準＃１ロットの分析であることを示す。
５．９．１．５．１新規の標準＃１ロット分析からの全ての結果が、本明細書に記載のアッセイ許容基準を全て満たす必要がある。
５．９．１．６適格性確認に合格するためには、全ての有効な適格性確認アッセイにわたる中及び低対照についての全てのトリプリケートのＶＣＮ／細胞の結果の平均が、標準＃１の新規ロットについて予想されるＶＣＮ／細胞の結果の≦２０％である必要がある。

中及び低対照の新規ロットの作製及び適格性確認
１．０目的
１．１トランスジーンｑＰＣＲ法のための標準の新規ロットを作製及び適格性確認するための例示的な手順について記載する。

３．０材料
注記：「例えば」と指定された材料は、事前の適格性確認なしに類似の材料によって代替してもよい。「又は等価物」と指定された材料については、サンプルを試験するために使用する前に、代替物が等価であることを実証する必要がある。
３．１ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０９７７０１５。
３．２ＴａｑＰａｔｈＰｒｏＡｍｐＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ３０８６６、又は等価物。
３．３ペレットあたり２×１０６～４×１０^６個の細胞を有するモックＴ細胞ペレット。
３．４ＢＣＭＡトランスジーン及びＡＬＢのプライマー及びプローブの適格性確認されたロット、ＩＤＴを通したカスタム配列又は等価物。
３．５ＢＣＭＡトランスジーン標準＃１の適格性確認されたロット
３．６ＢＣＭＡトランスジーンの中及び低対照の適格性確認されたロット
３．７ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮの作業ストックアリコート
３．８１×低ＥＤＴＡＴＥバッファｐＨ８．０、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、ＱｕａｌｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号３５１－３２４－７２１。
３．９０．５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、ＶＷＲＳｃｒｅｗ－ＣａｐＭｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅＴｕｂｅｓカタログ番号８９００４－２８６又はＥｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１００５
３．１０１．５ｍＬの遠心管、滅菌、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１０２１
３．１１２ｍＬの遠心管、滅菌済、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２４３１０４８
３．１２５ｍＬの遠心管、滅菌済、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号００３０１１９４６０
３．１３ピペットチップ、滅菌済、濾過済、（２０、２００、１０００ｕＬ、又は他の適切なサイズ）、例えば、Ｒａｉｎｉｎカタログ番号３０３８９２２６、３０３８９２４０、３０３９８２１３
３．１４９６ウェルＰＣＲプレート、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４４８３３４３、４４８３３５４、４４８３３４９、４４８３３５０、４４８３３９５、又は等価物
３．１５ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学接着フィルム、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３１１９７１、又は等価物
３．１６試薬リザーバ、滅菌済、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー、例えば、ＶｉｓｔａＬａｂｓカタログ番号３０５４－１００２

５．０手順
５．１本明細書に既に記載したプロトコルにおけるプロトコルに従って、モックＴ細胞ペレットからｇＤＮＡを単離する。モックＴ細胞は、ＣＡＲＴ製造プロセスを代表するものであるが、レンチベクターを形質導入していないものである必要がある。
５．２数本のシリカＤＮＡ抽出カラムを使用して、必要量のｇＤＮＡを単離する。全てのカラムから溶出したＤＮＡを合わせて、定量前にモックＴ細胞ｇＤＮＡの単一ストックを作製する。
５．３定量後、少なくとも４ヶ月間の試験に対応するのに十分な数のアリコートを作製するために、十分なｇＤＮＡを確実に単離する。低対照は、希釈剤として０．０２ｕｇ／ｕＬのモックＴ細胞ｇＤＮＡを使用した中対照の１：１０希釈液である。低及び中対照は、同じモックＴ細胞ｇＤＮＡストックから一緒に作製する必要はないが、一緒に作成する場合、単離されたモックＴ細胞ＤＮＡストックの一部分を、低対照を作製するために保存する必要がある。以下のステップに示す例は、モックＴ細胞ｇＤＮＡの同じストックを用いて中及び低対照を作製する方法の例である。
５．３．１少なくとも４ヶ月間継続するのに十分大きな両対照のロットを作製するのに十分なｇＤＮＡが、最初のｇＤＮＡ単離から得られなかった場合、追加のモックＴ細胞ペレットを単離し、最初のモックＴ細胞ｇＤＮＡストックと合わせ、合わせたストックを、Ｑｕｂｉｔを使用して定量してよい。
５．４５ｕＬの中対照が３０，３０３．０３０コピーのＬｉＣＡＲプラスミドを含有するように、ＢＣＭＡトランスジーン中対照は、ｐＬＬＶ－ＬＩＣＡＲ２ＳＩＮプラスミド（本明細書では「ＬｉＣＡＲプラスミド」とも称される）を加えた０．０２ｕｇ／ｕＬの濃度のモックＴ細胞ＤＮＡで構成される。これは、５ｕＬの対照中２．００コピー／細胞のベクターコピー数に等しい。
５．４．１以下の通り、モックＴ細胞ＤＮＡのストックから作製することができる中対照の総体積を求める。

例えば、約５４７．０ｕＬのモックＴ細胞ｇＤＮＡが、ＤＮＡの定量後に残る。ｇＤＮＡの濃度は、０．０９１３ｕｇ／ｕＬである。２９８ｕＬのｇＤＮＡを取り出して、中対照を作製する。

５．４．２次いで、以下の通りｇＤＮＡを０．０２ｕｇ／ｕＬに希釈するために必要な低ＥＤＴＡバッファ＋プラスミドの体積を求める。

例えば、２９８．０ｕＬのｇＤＮＡストックｇＤＮＡを取り出して、総体積１３６０．４ｕＬの中対照を作製する。

５．４．３次いで、以下の通り、５ｕＬの中対照当たり３０，３０３．０３０３コピーのＬｉＣＡＲプラスミドを達成するためにちょうど必要なプラスミドの体積を求める。

例えば、総体積１３６０．４ｕＬの中対照。１．１０３５×１０６コピー／ｕＬのＬｉＣＡＲプラスミド作業ストック。

５．４．４最後に、上記総体積の中対照を作製するためにちょうど必要な低ＥＤＴＡバッファの体積を求める。

例えば、２９８ｕＬのモックＴ細胞ｇＤＮＡ及び７．５ｕＬのＬｉＣＡＲプラスミドから総体積１３６０．４ｕＬの中対照。

５．５作製される中対照の総体積（ステップ５．４．１で計算）を収容するのに適切なサイズのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーチューブに上記体積のストックモックＴ細胞ｇＤＮＡを移すことによって、中対照を作製する。
５．６ステップ５．５からのチューブに、ステップ５．４．４で計算した体積の低ＥＤＴＡＴＥバッファを添加する。
５．７次いで、ステップ５．４．３で計算した体積のＬｉＣＡＲプラスミドを添加する。チューブを短時間ボルテックス混合する。
５．８希釈剤として０．０２ｕｇ／ｕＬのモックＴ細胞ｇＤＮＡを使用して中対照を１：１０希釈することによって、中対照から低対照を作製する。例えば、中対照ストックから総体積１２３０．０ｕＬの低対照を作製する。

この例は、モックＴ細胞ｇＤＮＡの１つのストックから低及び中対照を作製する方法を示しているので、中対照の残りの体積が、中対照の新規ロットとして使用される。

５．９所望の総体積の低対照を作製するために必要な０．０２ｕｇ／ｕＬのモックＴ細胞ｇＤＮＡの量を求める。例えば、中対照を１：１０希釈することにより（１２３．０ｕＬの中対照）作製される低対照ストックの総体積は、１２３０．０ｕＬである。

５．１０次いで、必要な体積の単離されたモックＴ細胞ｇＤＮＡを、低ＥＤＴＡＴＥバッファを使用して０．０２ｕｇ／ｕＬに希釈する。低対照を作製するために必要な、十分な体積の０．０２ｕｇ／ｕＬのｇＤＮＡ（余剰分を含む）を作製する（ステップ５．９）。例えば、１２３０．０ｕＬの低対照を作製するためには、０．０２ｕｇ／ｕＬのモックＴ細胞ｇＤＮＡが１１０７．０ｕＬ必要である。０．０９１３ｕｇ／ｕＬのモックＴ細胞ストックを０．０２ｕｇ／ｕＬに希釈する。

１２３０．０ｕＬの低対照を作製するのに十分な体積の０．０２ｕｇ／ｕＬのモックＴ細胞ｇＤＮＡを作製するために、０．０９１３ｕｇ／ｕＬの濃度のストックモックＴ細胞ｇＤＮＡ２４４．０ｕＬを、８６９．９ｕＬの低ＥＤＴＡＴＥバッファで希釈する。
５．１１作製される低対照の所望の体積を収容するのに適切なサイズのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーチューブに上記体積のストックモックＴ細胞ｇＤＮＡを移すことによって、低対照を作製する。
５．１２ステップ５．１１からのチューブに、ステップ５．１０で計算した体積の低ＥＤＴＡＴＥバッファを添加する。
５．１３次いで、低対照を作製するために必要な体積の中対照を添加する。チューブを短時間ボルテックス混合する。
５．１４最低限の情報が記載されたラベルの付いた中及び低対照の２０μＬの単回使用アリコートを作製する：
５．１４．１ＢＣＭＡトランスジーン中／低対照
５．１４．２ロット番号
５．１４．３対照を作製した日付
５．１５全ての単回使用アリコートを－２０℃で保存する。
５．１５．１対照の新規ロットの適格性確認
５．１５．１．１現在適格性確認されている中及び低対照並びに新規ロットの対照の両方を、以下の通り本明細書に既に記載したプロトコルに従って、オリゴ及び標準＃１の適格性確認されたロットを使用して最低３つの独立したトランスジーンｑＰＣＲアッセイで実行する。
５．１５．１．１．１全ての標準及び対照サンプルにつき、１つのマスターミックスを作製する。
５．１５．１．１．２標準＃１の適格性確認されたロットを使用して、１本の５点標準曲線を作成する。
５．１５．１．１．３図１０のプレートマップに従って、ｑＰＣＲプレートにロードする。
５．１５．１．１．４ＣｏｎｔｒｏｌｓＱｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎテンプレートファイルを開き、「ＳａｖｅＡｓ」を選択し、ｑＰＣＲ実験のための適切な名称を入力し、．ｅｄｓファイルとして保存する。テンプレートファイルを上書きしない。
５．１５．１．１．５ＣｏｎｔｒｏｌｓＱｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎテンプレートファイルに従って、ｑＰＣＲプレートにロードし、実行する。
５．１５．１．２サンプルとして分析された新規ロットの対照を用いて、ＣｏｎｔｒｏｌｓＱｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎテンプレートファイルに従ってデータを分析する。
５．１５．１．２．１ＣｏｎｔｒｏｌｓＱｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎテンプレートファイルに記載されているアッセイ許容基準を全て満たす必要がある。
５．１５．１．３適格性確認の許容基準
５．１５．１．３．１適格性確認に合格するためには、全ての有効な適格性確認アッセイにわたる中及び低対照の新規ロットについての全てのトリプリケートのＶＣＮ／細胞の結果の平均が、中及び低対照の新規ロットについて予想されるＶＣＮ／細胞の結果の≦３５％である必要がある。
５．１５．１．３．２全ての有効な適格性確認アッセイにわたる中及び低対照の新規ロットについての全てのトリプリケートのＶＣＮ／細胞の結果のＣＶ％が、≦２０％である必要がある。

実施例３：トランスジーンｑＰＣＲ法の適格性確認
１．０目的
１．１この実施例の目的は、トランスジーンｑＰＣＲ法の適格性確認プロトコルの実行中に得られた結果について説明することである。

２．０範囲
２．１以下の適格性確認パラメータを調べることによって、ＣＡＲＴ産物に組み込まれたＬｉＣＡＲプラスミドを定量するためのｑＰＣＲアッセイを適格性確認した：特異度、正確度、線形性、精度（再現性及び中間精度）、範囲、及びＬＯＱ。

３．０定義及び略記
３．１ｑＰＣＲ定量ポリメラーゼ連鎖反応
３．２ｈＡＬＢヒトアルブミン
３．３ＶＣＮベクターコピー数
３．４ＣＶ変動係数
３．５ＳＤ標準偏差
３．６Ｃｔサイクル閾値
３．７ＬＯＱ定量限界
３．８ＢＭＤバイオアッセイ法の開発
３．９ＱＣ品質管理

４．０試験アプローチ
４．１トランスジーンｑＰＣＲ標準＃１の５倍段階希釈を行い、Ｌｏｇ１０量としての標準曲線の結果をＣｔに対してプロットすることによって作成された５点標準曲線を試験することによって、アッセイの線形性を適格性確認した。
４．２５点標準曲線並びに中及び低アッセイ対照を試験することによって、アッセイ精度、すなわち再現性及び中間精度の両方を適格性確認した。
４．３中及び低アッセイ対照を試験することによって、アッセイ正確度を適格性確認した。
４．４モックＴ細胞ＤＮＡサンプル及び代表的なＣＡＲＴ１０日目収集ＤＮＡサンプルを試験することによって、アッセイ特異度を実証した。
４．５０．０２ＶＣＮ／細胞及び０．０１４ＶＣＮ／細胞のＬＯＱサンプルを試験することによって、アッセイのＬＯＱを求めた。
４．６３つの適格性確認アッセイを２人の分析者によって実施し、３つのアッセイのうちの１つを別々の日に実行した。

５．０材料
５．１トランスジーンｑＰＣＲアッセイを実施するために必要な材料の完全なリストについては、本明細書に記載の適格性確認プロトコルを参照する。
５．２アッセイ標準及び対照：
５．２．１ＢＣＭＡトランスジーン標準＃１、ロット番号ＬＭ－ＲＰ３－００５３３Ａ。
５．２．２ＢＣＭＡトランスジーン中対照、ロット番号ＬＭ－ＲＰ３－００５３３Ｂ。
５．２．３ＢＣＭＡトランスジーン低対照、ロット番号ＬＭ－ＲＰ３－００５３３Ｃ。
５．３アッセイ特異度サンプル：
５．３．１モックＴ細胞ＤＮＡ、ロット番号ＬＭ－ＲＰ３－００５３３。
５．３．２ＣＡＲＴＤＮＡ、ＬＭ－ＲＰ３－００５４１。
５．４アッセイＬＯＱサンプル：
５．４．１０．０２ＶＣＮ／細胞及び０．０１４ＶＣＮ／細胞のＬＯＱサンプル、ロット番号ＬＭ－ＲＰ３－００５３３。
５．４．２トランスジーン法オリゴセット、ロット番号ＬＭ－ＲＰ３－００４６０

６．０概要
６．１この実施例は、トランスジーンｑＰＣＲ法の適格性確認プロトコルの実行中に得られた結果を概説する。
６．２この方法は、表１２（１０．２～１０．５）に要約されているように、許容可能な正確度、精度、特異度、及び線形性を示した。加えて、トランスジーン及びｈＡＬＢ標的の両方について、アッセイ範囲及びＬＯＱを特定した。したがって、この方法は、凍結保存培地を用いて製剤化する前のＣＡＲＴ薬物産物材料の試験として適格である。

７．０手順
７．１方法の適格性確認プロトコルに記載の通り、全てのアッセイを実施した。方法で指定されたアッセイ許容基準を満たしたアッセイのみを、方法の適格性確認の許容基準の評価に含めた。

８．０結果及び考察
８．１標準曲線の線形性及び精度（再現性及び中間精度）
８．１．１トランスジーン及びｈＡＬＢ標的の両方についての全ての有効な適格性確認アッセイのための５点標準曲線の結果を、表１３～１４及び図１１～１２に要約する。トランスジーン及びｈＡＬＢ標的の両方についてのＬｏｇ１０対Ｃｔ値プロットのＲ２値は、１．００である。各標準の再現性は、トランスジーン標的については０．０６～０．５４％の範囲であり、ｈＡＬＢ標的については０．０３～０．４１％の範囲であった。中間精度は、トランスジーン標的については０．２６～０．４７％の範囲であり、ｈＡＬＢ標的については０．１７～０．５５％の範囲であった。

８．２ＱＣ対照の正確度及び精度（再現性及び中間精度）
８．２．１２．００ＶＣＮ／細胞の中対照及び０．２０ＶＣＮ／細胞の低対照の結果を表１５に要約する。中対照についての平均ＶＣＮ／細胞の結果の復元率は、９３～９５％の範囲である。
低対照についての平均ＶＣＮ／細胞の結果の復元率は、７９～８４％の範囲である。中及び低対照の両方の再現性は、４～６％の範囲である。中及び低対照の中間精度は、それぞれ４％及び６％である。

８．３特異度
８．３．１アッセイ特異度を評価するために実行されるモックＴ細胞ＤＮＡ及びＣＡＲＴＤＮＡサンプルの結果を表１６に要約する。モックＴ細胞ＤＮＡサンプルの全てのレプリケートが、トランスジーン標的については「未確定」であった。ＣＡＲＴＤＮＡの全てのレプリケートが、定量可能なトランスジーン標的コピーの結果を有していた。加えて、モックＴ細胞ＤＮＡ及びＣＡＲＴＤＮＡサンプルの両方が、１００ｎｇのＤＮＡについて予想される３０，３０３．０３０コピーのｈＡＬＢコピーのｈＡＬＢサンプル許容基準±３０％を満たしていた。

８．４範囲及びＬＯＱ
８．４．１ｔトランスジーン及びｈＡＬＢ標的の両方が、正確度、線形性、及び中間精度についての許容基準を全て満たしていた。したがって、トランスジーン及びｈＡＬＢ標的の両方の範囲が、５点標準曲線のコピー範囲として定義される。トランスジーンの範囲は、１９３．９３９～１２１２１２．１２１コピーである。ｈＡＬＢの範囲は、１２１．２１２～７５７５７．５７６コピーである。更に、ｈＡＬＢ標的のＬＯＱは１２１．２１２コピーとして定義される。
８．４．２０．０１４ＶＣＮ／細胞及び０．０２ＶＣＮ／細胞のＬＯＱサンプルの結果を表１７に要約する。０．０１４ＶＣＮ／細胞のＬＯＱサンプルのトリプリケートのＣｔ値のうちの少なくとも１つは、各有効な適格性確認アッセイにおけるトランスジーン標準曲線のＣｔ範囲内ではなかった。したがって、トランスジーンコピー値を正確に求めることはできず、ＬＯＱ基準を評価することはできなかった。しかしながら、０．０２ＶＣＮ／細胞のＬＯＱサンプルからは、７３～８０％の復元率が得られた。０．０２ＶＣＮ／細胞のＬＯＱサンプルからはまた、それぞれ１～９％及び２～１１％の平均トランスジーンコピー値及び平均ＶＣＮ／細胞の結果のＣＶ％が得られた。したがって、トランスジーン標的のＬＯＱは、３０３．０３０コピーの０．０２ＶＣＮ／細胞のＬＯＱサンプルの予想されるトランスジーンコピー値として定義される。

本明細書で引用する全ての特許、公開特許、及び引用文献による教示はその全体が参照により組み込まれる。

例示的実施形態について具体的に示し、記載してきたが、当業者らは、添付の特許請求の範囲に包含される実施形態の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更を行い得ることを理解する。

Claims

プローブ及びプライマーセットであって、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むプローブと、前記プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号１１の核酸配列を含む第１のプライマーと、核酸配列１２の核酸配列を含む第２のプライマーと
を含む、前記プローブ及びプライマーセット。
前記少なくとも１つの標識が、放射性同位体、酵素基質、化学発光剤、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、化学物質、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のプローブ及びプライマーセット。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するためのキットであって、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むプローブと、前記プローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号１１の核酸配列を含む第１のプライマーと、核酸配列１２の核酸配列を含む第２のプライマーと
を含む、前記キット。
前記プローブに結合している前記少なくとも１つの標識が、放射性同位体、酵素基質、化学発光剤、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、化学物質、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３に記載のキット。
前記プローブを含むアレイを含む、請求項３に記載のキット。
前記アレイが、マルチウェルプレートである、請求項５に記載のキット。
配列番号２２の核酸配列を含むヒトアルブミン（ｈＡＬＢ）プローブと、前記ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識と、配列番号２３の核酸配列を含む第１のｈＡＬＢプライマーと、配列番号２４の核酸配列を含む第２のｈＡＬＢプライマーとを更に含む、請求項３に記載のキット。
前記ｈＡＬＢプローブに結合している前記少なくとも１つの標識が、放射性同位体、酵素基質、化学発光剤、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、化学物質、又はそれらの組み合わせを含む、請求項７に記載のキット。
参照遺伝子プローブと、前記参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識と、第１の参照遺伝子プライマーと、第２の参照遺伝子プライマーとを更に含む、請求項３に記載のキット。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
配列番号１１の核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマー及び配列番号１２の核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーを用いて前記ＣＡＲＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
配列番号２３の核酸配列を含む第１のｈＡＬＢプライマー及び配列番号２４の核酸配列を含む第２のｈＡＬＢプライマーを用いて前記ＣＡＲＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したｈＡＬＢ核酸を生成することと、
前記増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、前記ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
前記増幅したｈＡＬＢ核酸と配列番号２２のヌクレオチド配列を含むｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを、前記ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
前記基準シグナルに対して前記標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することと
を含む、前記方法。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
前記ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、第１のＣＡＲプライマー、第２のＣＡＲプライマー、第１のｈＡＬＢプライマー、及び第２のｈＡＬＢプライマーと接触させること（ここで、前記第１のＣＡＲプライマーが、配列番号１１の核酸配列を含み、前記第２のＣＡＲプライマーが、配列番号１２の核酸配列を含み、前記第１のｈＡＬＢプライマーが、配列番号２３の核酸配列を含み、前記第２のｈＡＬＢプライマーが、配列番号２４の核酸配列を含む）と、
前記第１のＣＡＲプライマー及び前記第２のＣＡＲプライマーを用いて前記ＣＡＲ核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
前記第１のｈＡＬＢプライマー及び前記第２のｈＡＬＢプライマーを用いてｈＡＬＢ核酸を増幅させ、それによって、増幅したｈＡＬＢ核酸を生成することと、
前記増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、前記ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
前記増幅したｈＡＬＢ核酸と前記ｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを、前記ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
前記基準シグナルに対して前記標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することと
を含む、前記方法。
前記増幅したＣＡＲ核酸と前記ＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することが、ハイブリダイゼーション前の前記ＣＡＲプローブに結合している前記標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後の前記ＣＡＲプローブに結合している前記少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
前記増幅したｈＡＬＢ核酸分子と前記ｈＡＬＢプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することが、ハイブリダイゼーション前の前記ｈＡＬＢプローブに結合している前記標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後の前記ｈＡＬＢプローブに結合している前記少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
前記ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＲＴ－ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、又は転写媒介増幅（ＴＭＡ）である、請求項１４に記載の方法。
前記ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識が、フルオロフォアを含む、請求項１０に記載の方法。
前記ｈＡＬＢプローブに結合している少なくとも１つの標識が、フルオロフォアを含む、請求項１０に記載の方法。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
配列番号１１の核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマー及び配列番号１２の核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーを用いて前記ＣＡＲＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
第１の参照遺伝子プライマー及び第２の参照遺伝子プライマーを用いて前記ＣＡＲＴ細胞からの前記核酸を増幅させ、それによって、増幅した参照遺伝子核酸を生成することと、
前記増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、前記ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
前記増幅した参照遺伝子核酸と前記参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを、前記参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
前記基準シグナルに対して前記標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することと
を含む、前記方法。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞へのトランスジーンの組み込みを定量するための方法であって、
前記ＣＡＲＴ細胞からの核酸を、第１のＣＡＲプライマー、第２のＣＡＲプライマー、第１の参照遺伝子プライマー、及び第２の参照遺伝子プライマーと接触させること（ここで、前記第１のＣＡＲプライマーが、配列番号１１の核酸配列を含み、前記第２のＣＡＲプライマーが、配列番号１２の核酸配列を含む）と、
前記第１のＣＡＲプライマー及び前記第２のＣＡＲプライマーを用いて前記ＣＡＲ核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
前記第１の参照遺伝子プライマー及び前記第２の参照遺伝子プライマーを用いて参照遺伝子核酸を増幅させ、それによって、増幅した参照遺伝子核酸を生成することと、
前記増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、前記ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
前記増幅した参照遺伝子核酸と前記参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを、前記参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
前記基準シグナルに対して前記標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することと
を含む、前記方法。
前記増幅したＣＡＲ核酸と前記ＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することが、ハイブリダイゼーション前の前記ＣＡＲプローブに結合している前記標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後の前記ＣＡＲプローブに結合している前記少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
前記増幅した参照遺伝子核酸分子と前記参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することが、ハイブリダイゼーション前の前記参照遺伝子プローブに結合している前記標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後の前記参照遺伝子プローブに結合している前記少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
前記ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＲＴ－ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、又は転写媒介増幅（ＴＭＡ）である、請求項２２に記載の方法。
前記ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識が、フルオロフォアを含む、請求項１８に記載の方法。
前記参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識が、フルオロフォアを含む、請求項１８に記載の方法。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を生成する方法であって、ＣＡＲトランスジーンをＴ細胞に導入して、トランスジーンが組み込まれたＴ細胞を得ることと、
ＣＡＲトランスジーンの組み込みを判定すること（ここで、判定は、
配列番号１１の核酸配列を含む第１のＣＡＲプライマー及び配列番号１２の核酸配列を含む第２のＣＡＲプライマーを用いて、前記トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅したＣＡＲ核酸を生成することと、
第１の参照遺伝子プライマー及び第２の参照遺伝子プライマーを用いて、前記トランスジーンが組み込まれたＴ細胞からの核酸を増幅させ、それによって、増幅した参照遺伝子核酸を生成することと、
前記増幅したＣＡＲ核酸と配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを、前記ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識からの標的シグナルを介して検出することと、
前記増幅した参照遺伝子核酸と前記参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを、前記参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識からの基準シグナルを介して検出することと、
前記基準シグナルに対して前記標的シグナルを比較することによってトランスジーンのコピー数を定量することと
を含む）と、
組み込まれたＣＡＲトランスジーンの少なくとも１つのコピーを含むＣＡＲＴ細胞を得ることと
を含む、前記方法。
前記増幅したＣＡＲ核酸と前記ＣＡＲプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することが、ハイブリダイゼーション前の前記ＣＡＲプローブに結合している前記標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後の前記ＣＡＲプローブに結合している前記少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む、請求項２６に記載の方法。
前記増幅した参照遺伝子核酸分子と前記参照遺伝子プローブとの間のハイブリダイゼーションを検出することが、ハイブリダイゼーション前の前記参照遺伝子プローブに結合している前記標識からの標的シグナルに対する、ハイブリダイゼーション中又はハイブリダイゼーション後の前記参照遺伝子プローブに結合している前記少なくとも１つの標識からの標的シグナルの変化を検出することを含む、請求項２６に記載の方法。
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項２６に記載の方法。
前記ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＲＴ－ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、又は転写媒介増幅（ＴＭＡ）である、請求項２９に記載の方法。
前記ＣＡＲプローブに結合している少なくとも１つの標識が、フルオロフォアを含む、請求項２６に記載の方法。
前記参照遺伝子プローブに結合している少なくとも１つの標識が、フルオロフォアを含む、請求項２６に記載の方法。
請求項２６～３２のいずれかに記載の方法によって生成されたＣＡＲＴ細胞。