JP2023516789A - 組換えベクター核酸の統合を定量化するための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
ある特定の態様では、本開示は、標的細胞のゲノムへの組換えベクター核酸の統合を定量化する方法に関する。本開示はまた、定量化を実施するための、特定のプライマー及びプローブを含む、組成物及びキットを提供する。
Description
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年３月９日出願の米国仮出願第６２／９８７，０１９号、及び２０２１年２月１１日出願の米国仮出願第６３／１４８，３００号の利益を主張するものであり、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年３月９日出願の米国仮出願第６２／９８７，０１９号、及び２０２１年２月１１日出願の米国仮出願第６３／１４８，３００号の利益を主張するものであり、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みである、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年２月２４日に作成され、名称はＰＲＤ４０７９ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２１，８６１バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みである、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年２月２４日に作成され、名称はＰＲＤ４０７９ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２１，８６１バイトである。
標的細胞ゲノムへのゲノム材料の送達及び統合の理解における最近の進歩は、標準治療を多様な疾患に合わせて変化させる大きな可能性を有している。キメラ抗原受容体（「Chimeric antigen receptor、ＣＡＲ」）Ｔ細胞療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍、並びにリンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、肉腫、神経芽腫、及びある特定の固形腫瘍がんなどの他のがんを治療する潜在性を示しており（例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ３：３８８－３９８（２０１３）及びＴｉｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ１２：１２５－１４６（２０２０）を参照されたい）、一般に、ＣＡＲを発現しているＴ細胞を生成するためのＴ細胞をインビトロで修飾することを含む。ヒト用途のために操作されたＴ細胞の遺伝子操作に対するほとんどのアプローチは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の安定な発現のために、レンチウイルスなどのレトロウイルスを使用している（Ｊｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｅｒｔｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。しかしながら、ウイルスベクター送達を使用する現在の統合技法の課題のうちの１つは、ベクターが細胞に入ったかどうかだけでなく、導入遺伝子が宿主ゲノムに首尾よく組み込まれている（「ウイルス統合」と呼ばれるプロセス）かどうか、及び何回組み込まれたのか（又はウイルスの統合頻度）を決定することである。
サザンブロットは、当初、レトロウイルスベクター配列コピー数の統合を測定するための好ましい技法であったが、必要な手動の労力に起因して遅くかつ高価である。最近、研究者は、形質導入効率及びコピー数を決定するための定量ＰＣＲ（「quantitative PCR、ｑＰＣＲ」）方法を開発した。いくつかの方法は、遊離した、組み込まれていないベクターを統合されているものから区別せず、したがって、コピー数を推定するのみである。例えば、Ｃｈａｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１８：４７９－４８７（２０１１）を参照されたい。いくつかの他の方法は、特定の導入遺伝子に特異的なプライマーを使用する。Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４：４９７－５０７（２００３）を参照されたい。しかしながら、これらの方法は、正確なコピー数を生成しないか、又は各導入遺伝子に特異的な異なるプライマーを設計する必要性に起因して費用がかかるかのいずれかである。
本開示は、標的細胞のゲノムへの組換えベクター核酸（典型的には導入遺伝子を含む）の統合を定量化する方法を提供し、この方法は、任意の特定の導入遺伝子によって限定されず、任意の特定の導入遺伝子に特異的ではない。本開示はまた、定量化を実施するための特定のプライマー及びプローブを含む、組成物及びキットを提供する。
一態様では、本開示は、細胞ゲノムへの組換えベクター核酸の統合を定量化するための方法であって、方法が、（ａ）宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供することと、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量的増幅技法を用いて、生体試料のゲノムＤＮＡを増幅することであって、プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、統合された組換えベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする、増幅することと、（ｃ）ステップ（ｂ）を通じて増幅されたゲノム核酸を定量化することと、を含む。
いくつかの実施形態では、定量化は、コピー数を決定することを含む。いくつかの実施形態では、定量的増幅技法は、定量ＰＣＲである。いくつかの実施形態では、定量的増幅技法は、デジタルＰＣＲである。いくつかの実施形態では、定量的増幅技法は、滴デジタルＰＣＲである。いくつかの実施形態では、定量的増幅技法は、エンドポイントＰＣＲである。
ある特定の実施形態では、宿主細胞ゲノムへの組換えベクター核酸の統合を定量化することは、生体試料の統合された組換えベクター配列コピー数を参照ポリヌクレオチド配列と比較することを更に含む。いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、ハウスキーピングタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ハウスキーピングタンパク質は、アルブミンである。いくつかの実施形態では、統合された組換えベクター配列コピー数及び参照ポリヌクレオチド配列コピー数は、マルチプレックスで測定される。いくつかの実施形態では、統合された組換えベクター配列コピー数及び参照ポリヌクレオチド配列コピー数は、シングルプレックスで測定される。
いくつかの実施形態では、方法は、以下からなる群から選択される１つ以上のアッセイ許容基準を評価することによって、組換えベクター核酸の統合を定量化するためのアッセイの確実性を評価することを更に含む：（ａ）テンプレートＤＮＡを含有しない対照の全ての複製物におけるプロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の閾値サイクルが、決定不可能であること、（ｂ）標準試料を使用する線形回帰によって生成された、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の標準曲線の相関係数が、０．９７以上であること、（ｃ）当該標準曲線の勾配からの、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の推定コピー値が、９０％～１１０％のＰＣＲ効率を示すこと、（ｄ）標準試料のうちのいずれかの複製物のうちのいずれにおいても、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の閾値サイクルが、決定不可能でないこと、（ｅ）塩基標準試料における、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の平均閾値サイクルが、２２．０以下であること、（ｆ）各標準試料における、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の閾値サイクルの標準偏差が、０．６０以下であること、（ｇ）１つ以上の陽性対照試料の参照ポリヌクレオチド配列の平均測定コピーが、公称予想値の３０％以内であること、（ｈ）１つ以上の陽性対照試料の測定平均ＶＣＮ／細胞値が、各対照の公称予想ＶＣＮ／細胞値の３０％以内であること、並びに（ｉ）１つ以上の陽性対照試料のＶＣＮ／細胞値の変動係数が、２０％以下であること。
いくつかの実施形態では、方法は、以下からなる群から選択される１つ以上の試料許容基準を評価することによって、試料の組換えベクター核酸の統合の定量化の確実性を評価することを更に含む：（ａ）試料における参照ポリヌクレオチド配列の平均コピー値が、３０，３０３．０３０コピーの予想値の３０％以内であること、（ｂ）試料が０．０２μｇ／μＬ未満のゲノムＤＮＡ（genomic DNA、ｇＤＮＡ）濃度を有する場合、その試料の参照ポリヌクレオチド配列の予想コピーが、反応に実際に充填されたＤＮＡの量から計算されること、（ｃ）試料における平均標的プロウイルスコピー値が、アッセイのコピー値の検証された範囲の間であること、（ｄ）試料における平均標的プロウイルスコピー値が、１２１，２１２．１２１～１９３．９３９コピーであること、（ｅ）標的試料の複製物のＶＣＮ／細胞値の変動係数が、２０％以下であること、並びに、（ｆ）試料における、標的プロウイルス及び標的参照ポリヌクレオチド配列の両方のサイクル閾値の標準偏差が、０．６０以下であること。
いくつかの実施形態では、組換えベクターは、導入遺伝子を含有する。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、遺伝子療法ベクターである。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが基づくレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス１（human immunodeficiency virus 1、ＨＩＶ－１）、又はヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）である。
いくつかの実施形態では、細胞ゲノムへの組換えベクター核酸の統合を定量化する方法は、導入遺伝子の同定のための方法を更に含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子の同定のための方法は、（ａ）宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供することと、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量的増幅技法を用いて、生体試料のゲノムＤＮＡを増幅することであって、プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、導入遺伝子に特異的にハイブリダイズする、を増幅することと、（ｃ）ステップ（ｂ）を通じて増幅されたゲノム核酸を検出及び／又は定量化することと、を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１９又は２１の配列を含む核酸配列によってコードされたポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、統合された組換えベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１、配列番号５、又は配列番号１４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えベクター核酸を増幅するための第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号２、配列番号６、又は配列番号１５の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、統合された組換えベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、統合された組換えベクター配列のＬＴＲ配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ３領域に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ３領域及びＲ領域に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルに特異的にハイブリダイズする。ある特定の実施形態では、プライマーは、天然に存在するレトロウイルス核酸配列に特異的にハイブリダイズしないであろう。
いくつかの実施形態では、方法は、増幅された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする検出可能な核酸プローブを利用する。いくつかの実施形態では、組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズするプローブは、配列番号３、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１６の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、統合された組換えベクター核酸のプローブは、統合された組換えベクター核酸のＬＴＲ配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）で使用されるレンチウイルスベクター核酸のプローブは、レンチウイルスの５’ＬＴＲのＵ３領域及びＲ領域に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）で使用されるレンチウイルスベクター核酸のプローブは、レンチウイルスの５’ＬＴＲのＵ５領域及びＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）で使用されるレンチウイルスベクター核酸のプローブは、レンチウイルスの５’ＬＴＲのＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）で使用されるレンチウイルスベクター核酸のプローブは、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＲ領域及びＵ５領域に特異的にハイブリダイズする。ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、インターカレート色素を利用する。いくつかの実施形態では、インターカレート色素は、ＳＹＢＲグリーンである。
いくつかの実施形態では、生体試料は、細胞試料又は組織試料である。具体的には、いくつかの実施形態では、組織試料は、血液、血漿、血清、唾液、又は組織生検である。いくつかの実施形態では、試料は、対象からのものである。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、組換えベクター核酸配列は、導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、キメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体域は、配列番号１８、配列番号２０、又は配列番号２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号１９又は配列番号２１の配列を含む核酸配列によってコードされるポリペピドである。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡ、ＫＬＫ２、又はＧＰＲＣ５Ｄを認識する。
いくつかの実施形態では、方法は、参照ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅する少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを同時に利用することを更に含む。
なお別の態様では、本開示は、組換えベクター核酸の形質導入効率を監視するための方法であって、ａ）組換えベクター核酸によって形質導入されたゲノムＤＮＡを含有する１つ以上の生体試料を提供することであって、組換えベクター核酸の一部分が、ゲノムＤＮＡに統合される、生体試料を提供することと、ｂ）本開示の方法に従って、宿主細胞ゲノムに統合された組換えベクター核酸を定量化することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、生体試料の組換えベクター配列コピー数を参照と比較することを更に含む。
更に別の態様では、本開示は、組換えベクターによって形質導入された細胞製品についてのロットリリース試験の方法であって、各ロットから、組換えベクターによって形質導入されたゲノムＤＮＡを含有する細胞製品の１つ以上の生体試料を提供することと、ｂ）本開示の方法に従って、各生体試料における、宿主細胞ゲノムに統合された組換えベクター核酸を定量化することと、ｃ）ステップ（ｂ）で定量化された生体試料の統合された組換えベクター配列コピー数を、参照と比較することと、ｄ）統合された組換えベクター配列コピー数が所定の基準に合格するロットをリリースすることと、を含む、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、細胞ゲノムへのレトロウイルスベクター核酸の統合を定量化する方法であって、方法が、（ａ）宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供することと、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量的増幅技法を用いて、生体試料のゲノムＤＮＡを増幅することであって、プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、統合されたレトロウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする、を増幅することと、（ｃ）ステップ（ｂ）を通じて増幅されたゲノム核酸を定量化することであって、宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスベクター核酸の統合を定量化することが、参照に対する増幅されたレトロウイルスベクター核酸の比を比較することを含む、定量化することと、を含み、レトロウイルスベクター核酸が、レンチウイルスベクター配列であり、オリゴヌクレオチドプライマー対が、それぞれ配列番号１の核酸配列及び配列番号２の核酸配列、又はそれぞれ配列番号５の核酸配列及び配列番号６の核酸配列、又はそれぞれ配列番号１４の核酸配列及び配列番号１５の核酸配列を含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、定量化は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１６の核酸配列を含む検出可能なプローブを使用する。別の態様では、本開示は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本開示は、統合された組換えベクター核酸コピー数を測定するためのキットであって、統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズするプライマー対のプライマーであって、プライマー対が、統合された組換えベクター核酸の一部分を特異的に増幅する、プライマーと、増幅された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする検出可能な核酸プローブと、を含む、キットを提供する。
別の態様では、本開示は、統合された組換えベクター核酸配列コピー数を測定するためのキットであって、統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする、配列番号１、配列番号５、又は配列番号１４の核酸配列を含む順方向プライマーと、統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする、配列番号２、配列番号６、又は配列番号１５の核酸配列を含む逆方向プライマーと、配列番号３、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１６の核酸配列を含む検出可能なプローブと、を含む、キットを提供する。
本開示は、前述の態様及び実施形態のうちのいずれかの全ての組み合わせ、並びに詳細な説明及び実施例に記載の実施形態のうちのいずれかとの組み合わせを企図する。
本発明を説明する目的で、本開示のある特定の実施形態が図面に図示されている。しかしながら、本開示は、図面に図示された実施形態の精密な配置及び手段に限定されるものでない。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子を含む、例示的なレンチウイルスベクタートランスファープラスミドを示す。パネル１Ａに示されるように、レンチウイルスベクター導入遺伝子は、５’－ＬＴＲ（部位Ｃ）及び３’－ＬＴＲ（部位Ｄ）に隣接するＣＡＲをコードする。長方形の黒色のボックスは、例示的なプライマー及び／又はプローブ結合部位を示し、「Ｘ」は、定量化可能なアンプリコンを作製するためのプライマー結合部位の欠如を示す。
標的細胞への当該ベクターの一部分の統合後の細胞、及び統合された導入遺伝子の細胞表面での発現を示す。パネル１Ｂに示されるように、レンチウイルスベクターが細胞のゲノムに組み込まれるとき、５’－ＬＴＲ領域の一部分（部位Ａ）が、３’－ＬＴＲ配列のΔＵ３部分に置き換えられている。長方形の黒色のボックスは、例示的なプライマー及び／又はプローブ結合部位を示し、「Ｘ」は、定量化可能なアンプリコンを作製するためのプライマー結合部位の欠如を示す。統合された５’－ＬＴＲ（部位Ａ）は、ΔＵ３部位を有し、トランスファープラスミド５’－ＬＴＲ（部位Ｃ）は有さない。
例示的なレンチウイルスベクター配列に対する、本開示の選択されたプライマー及びプローブのアラインメントを示す。以下の配列を示す：例示的なレンチウイルスベクター配列（配列番号１３）、５ＬＴＲ＿対１及び２＿Ｆプライマー（配列番号１）、５ＬＴＲ＿対１プローブ（配列番号３）、５ＬＴＲ＿対１及び２＿Ｒプライマー（配列番号２）、５ＬＴＲ＿対２＿プローブ（配列番号４）、５ＬＴＲ＿対３＿Ｆプライマー（配列番号５）、５ＬＴＲ＿対３＿プローブ（配列番号７）、５ＬＴＲ＿対３＿Ｒプライマー（配列番号６）、５ＬＴＲ＿対４＿Ｆプライマー（配列番号１４）、５ＬＴＲ＿対４＿Ｒプライマー（配列番号１５）、５ＬＴＲ＿対４＿プローブ（配列番号１６）。
ｑＰＣＲ（３Ａ）対フローサイトメトリー（３Ｂ）の血液中のＧＰＲｃ５ｄ ＣＡＲ－Ｔ定量化結果を、隣り合わせに示す。
ｑＰＣＲ（３Ａ）対フローサイトメトリー（３Ｂ）の血液中のＧＰＲｃ５ｄ ＣＡＲ－Ｔ定量化結果を、隣り合わせに示す。
概論
本発明は、宿主細胞のゲノムに送達される組換えベクター核酸、したがって導入遺伝子の統合を検出及び／又は定量化するための方法を提供する。ＣＡＲ－Ｔ細胞などの形質導入された細胞における、導入遺伝子配列を送達する組換えベクターの特異的検出及び／又は定量化に対する需要が存在する。この目的のために、発明者らは、ＣＡＲなどの導入遺伝子をコードする組換えベクター核酸の統合を検出及び／又は定量化するための方法を開発したが、導入遺伝子又は統合されていない組換えベクター核酸配列を送達するために使用された残留プラスミドを検出及び／又は定量化するための方法は開発されていない。細胞へベクターが首尾よく組み込まれているかどうかを、導入遺伝子に依存しない配列を用いて同定する能力は、定量ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、又は他の定量方法を使用して、より正確な、普遍的かつより安価な定量化を可能にする。本開示は、トランスファープラスミドベクターにおける５’－ＬＴＲの配列に対する、宿主ゲノムへの統合時の５’－ＬＴＲの変化を利用して、組換えベクターを介して送達及び組み込まれた遺伝情報を同定及び定量化する、方法及びキットを提供する。コピー数を含むそのような情報は、トランスフェクション又は形質導入の条件を理解及び最適化するために重要である。本発明の方法は、レンチウイルスベクターの形質導入効率の監視、及びインビボ特徴評価を容易にする。したがって、本開示は、標的細胞のゲノムへの組換えベクター核酸統合を定量化するための改善された方法を提供する。本明細書に記載の例示的な実施形態は、統合されたレトロウイルスベクター核酸の検出に関するが、発明の方法は、宿主ゲノムへの統合時に統合されていない核酸と区別可能である、任意の組換え核酸ベクター配列に適用することができる。
本発明は、宿主細胞のゲノムに送達される組換えベクター核酸、したがって導入遺伝子の統合を検出及び／又は定量化するための方法を提供する。ＣＡＲ－Ｔ細胞などの形質導入された細胞における、導入遺伝子配列を送達する組換えベクターの特異的検出及び／又は定量化に対する需要が存在する。この目的のために、発明者らは、ＣＡＲなどの導入遺伝子をコードする組換えベクター核酸の統合を検出及び／又は定量化するための方法を開発したが、導入遺伝子又は統合されていない組換えベクター核酸配列を送達するために使用された残留プラスミドを検出及び／又は定量化するための方法は開発されていない。細胞へベクターが首尾よく組み込まれているかどうかを、導入遺伝子に依存しない配列を用いて同定する能力は、定量ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、又は他の定量方法を使用して、より正確な、普遍的かつより安価な定量化を可能にする。本開示は、トランスファープラスミドベクターにおける５’－ＬＴＲの配列に対する、宿主ゲノムへの統合時の５’－ＬＴＲの変化を利用して、組換えベクターを介して送達及び組み込まれた遺伝情報を同定及び定量化する、方法及びキットを提供する。コピー数を含むそのような情報は、トランスフェクション又は形質導入の条件を理解及び最適化するために重要である。本発明の方法は、レンチウイルスベクターの形質導入効率の監視、及びインビボ特徴評価を容易にする。したがって、本開示は、標的細胞のゲノムへの組換えベクター核酸統合を定量化するための改善された方法を提供する。本明細書に記載の例示的な実施形態は、統合されたレトロウイルスベクター核酸の検出に関するが、発明の方法は、宿主ゲノムへの統合時に統合されていない核酸と区別可能である、任意の組換え核酸ベクター配列に適用することができる。
本出願全体を通じて、様々な文書が参照されている。これらの文書の全体の開示が、参照により本出願に組み込まれる。
本明細書で別途定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって別途必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、細胞及びがん生物学、ウイルス学、免疫学、微生物学、遺伝子及びタンパク質及び核酸化学に関連して使用される命名法、並びにそれらの技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されているものである。本明細書に記載の本発明の各実施形態は、単独で、又は本発明の１つ以上の他の実施形態と組み合わせて理解され得る。
本発明の方法及び技法は、別途示されない限り、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、かつ本明細書全体を通じて引用され論じられる様々な一般的かつより具体的な参考文献に記載されるように、実施される。様々な実施形態の方法及び技法は、別途示されない限り、一般に、当該技術分野で周知の分子生物学、細胞生物学、生化学、マイクロアレイ及び配列決定技術の方法に従って、かつ本明細書全体を通じて引用され論じられる様々な一般的かつより具体的な参考文献に記載されているように、実施される。例えば、Ｍｏｔｕｌｓｋｙ，「Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ」，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００３）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９７）、Ｂａｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｆｒｅｉ，Ｅｍｉｌ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＢＣ Ｄｅｃｋｅｒ Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ（２０００）、Ｌｏｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，７ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（２０００）、及びＣｏｏｐｅｒ，Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（２０００）を参照されたい。
本明細書で使用される化学用語は、「Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ」，Ｐａｒｋｅｒ Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃ．Ａ．（１９８５）によって例示される、当該技術分野における従来の使用法に従って使用される。
本出願において参照される上の全て、並びに任意の他の刊行物、特許、及び公開特許出願は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。矛盾が生じる場合、その特定の定義を含め本明細書が優先される。
定義
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸分子」という用語は、互換的に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、及びそれらの類似体を指す。核酸分子は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、多鎖ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、非コードＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（microRNA、ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（small nucleolar RNA、ｓｎｏＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ribosomal RNA、ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（transfer RNA、ｔＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（small interfering RNA、ｓｉＲＮＡ）、ヘテロ核ＲＮＡ（heterogeneous nuclear RNA、ｈｎＲＮＡ）、又は小ヘアピンＲＮＡ（small hairpin RNA、ｓｈＲＮＡ）であり得る。ある特定の実施形態では、方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡなどの核酸試料で実施され得る。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸分子」という用語は、互換的に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、及びそれらの類似体を指す。核酸分子は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、多鎖ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、非コードＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（microRNA、ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（small nucleolar RNA、ｓｎｏＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ribosomal RNA、ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（transfer RNA、ｔＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（small interfering RNA、ｓｉＲＮＡ）、ヘテロ核ＲＮＡ（heterogeneous nuclear RNA、ｈｎＲＮＡ）、又は小ヘアピンＲＮＡ（small hairpin RNA、ｓｈＲＮＡ）であり得る。ある特定の実施形態では、方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡなどの核酸試料で実施され得る。
ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーションなどによって更に修飾され得る。「組換え」ポリヌクレオチドという用語は、天然に存在しないか、又は非天然配置で別のポリヌクレオチドに連結されているかのいずれかである、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、又は合成起源のポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは、遺伝子の発現を調節するヌクレオチド配列を指す「発現制御配列」に操作可能に連結され得る。
「内因性」という用語は、対象の内側の供給源に由来するタンパク質、核酸、細胞、又は別の分子を指す。
「外因性」という用語は、対象の外側の供給源に由来するタンパク質、核酸、細胞、又は別の分子を指す。外因性分子の非限定的な例としては、組換えタンパク質、プラスミド、ウイルス、ドナー対象からの細胞、ドナー対象からの組織、ドナー対象からの臓器、又は合成化学物質が挙げられる。
本明細書全体を通じて、「含む（comprise）」という用語及び「含む（comprises）」又は「含むこと（comprising）」などの変形は、記載される整数又は整数の群を含むが、任意の他の整数又は整数の群を除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。
別途文脈が明らかに既定しない限り、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、複数の指示対象を含む。
「含む」という用語は、「含むが、これに限定されない」を意味するために使用される。「含む」及び「含むが、これらに限定されない」は、互換的に使用される。
「対象」又は「個体」は互換的に使用され、イヌ、ネコ、鳥類、家畜、特に哺乳類などの任意の動物、好ましくはヒトを指す。
「組換えベクター核酸」という用語は、天然に存在する配列と比較して少なくとも１つの修飾を含む核酸を送達するためのベクターを含み、形質導入された細胞のゲノムにおいて発現する外因性タンパク質をコードする導入遺伝子を含有し得る核酸配列を指す。
「レトロウイルスベクター核酸」という用語は、天然に存在するレトロウイルス配列への少なくとも１つの修飾を含むレトロウイルスベクターの少なくとも一部分であり、形質導入された細胞のゲノム、例えばレンチウイルスベクタートランスファープラスミドの一部分で発現する外因性タンパク質をコードする導入遺伝子を含有し得る核酸配列を指す。「レトロウイルスベクター核酸配列」は、レトロウイルスベクターに関連しない天然に存在するレトロウイルス核酸を含まない。宿主細胞ゲノムに統合されたレトロウイルスベクター核酸は、時折、「プロウイルス核酸」と称される。
「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的かつ機能的遺伝的要素を含有するベクターを指す。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、線状二本鎖ＤＮＡコピーにそのゲノムＲＮＡを逆転写し、その後宿主ゲノムにそのゲノムＤＮＡを共有結合的に統合するＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態での使用に好適な例示的なレトロウイルスとしては、限定されないが、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia virus、ＭｏＭＬＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス（Moloney murine sarcoma virus、ＭｏＭＳＶ）、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス（Harvey murine sarcoma virus、ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（murine mammary tumor virus、ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（gibbon ape leukemia virus、ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（feline leukemia virus、ＦＬＶ）、スピューマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（Murine Stem Cell Virus、ＭＳＣＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus、ＲＳＶ）、及びレンチウイルスが挙げられる。
「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来する構造的及び機能的遺伝的要素を含有するベクターを指すレトロウイルスベクターのサブセットである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、既知の方法に従って生成される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９、Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９を参照されたい。本発明は、細胞に直接形質導入することができる導入遺伝子を発現している、組換え、レトロウイルス、及びレンチウイルスベクター構築物を含む。特定の実施形態では、レンチウイルスベクターを使用して、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを細胞に送達する。
本明細書で企図されるある特定の具体的な実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列のうちのほとんど又は全ては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ－１に由来する。しかしながら、レトロウイルス配列及び／若しくはレンチウイルス配列の多くの異なる供給源が使用され得るか、又は本明細書に記載の機能を実施するためのトランスファーベクターの能力を損なうことなく、ある特定のレンチウイルス配列における組み合わされた多数の置換及び変更を、対応させることができることが理解されるものである。更に、多様なレンチウイルスベクターが当該技術分野で既知であり、（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ，（１９９６ａ，１９９６ｂ，ａｎｄ １９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ，（１９９７）、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ，１９９８、米国特許第６、０１３、５１６号、及び同第５、９９４、１３６号を参照されたい）、これらのうちの多くを、本明細書で企図されるウイルスベクター又はトランスファープラスミドを生成するように適合させることができる。
「レンチウイルス」は、ゆっくりと発症する疾患を生じるレトロウイルスの群（又は属）を指す。この群内に含まれるウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型、及びＨＩＶ２型を含む）、ヒト後天性免疫不全症候群（etiologic agent of the human acquired immunodeficiency syndrome、ＡＩＤＳ）の病因物質；ヒツジに脳炎（ビスナ）又は肺炎（マエディ）を引き起こすビスナ－マエディ、ヤギに免疫不全、関節炎、及び脳症を引き起こすカプリン関節炎－脳炎ウイルス；ウマに自己免疫溶血性貧血及び脳症を引き起こすウマ感染性貧血ウイルス；ネコに免疫不全を引き起こすネコ免疫不全ウイルス（feline immunodeficiency virus、ＦＩＶ）；ウシにリンパ節症、リンパ球症、及び場合によっては中枢神経系感染を引き起こすウシ免疫不全ウイルス（bovine immune deficiency virus、ＢＩＶ）；類人猿に免疫不全及び脳症を引き起こす類人猿免疫不全ウイルス（simian immunodeficiency virus、ＳＩＶ）が挙げられる。これらのウイルスによって引き起こされる疾患は、長いインキュベーション期間及び長い経過を特徴とする。通常、ウイルスは、単球及びマクロファージを急激に感染させ、それから他の細胞に広がる。ＨＩＶ、ＦＩＶ、及びＳＩＶはまた、Ｔリンパ球（すなわち、Ｔ細胞）に容易に感染する。様々な実施形態では、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、１つ以上のＬＴＲ、及び以下のアクセサリー要素、すなわち、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、輸出要素、ポリ（Ａ）配列のうちの１つ以上又は全てを含み、任意選択的に、本明細書の他の箇所で論じられるＷＰＲＥ又はＨＰＲＥ、インスレーター要素、選択可能なマーカー、及び細胞自殺遺伝子を含み得る。
レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲを修飾する結果としてのいくつかの安全性向上を含む。「自己不活性化」（Self-inactivating、ＳＩＮ）ベクターは、複製欠陥ベクターを指す。「自己不活性化ベクター」という用語は、Ｕ３領域として知られる右（３’）ＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域が、ウイルス複製の最初のラウンドを超えるウイルス転写を防止するために（例えば、欠失又は置換によって）修飾されているベクターを指す。ある特定の実施形態では、ＬＴＲ Ｕ３は、ΔＵ３である。結果的に、ベクターは、宿主ゲノムを感染させ、次いで宿主ゲノムに１回のみ統合することが可能であり、更に受け継がれることができない。これは、右（３’）ＬＴＲ Ｕ３領域が、ウイルス複製中に左（５’）ＬＴＲ Ｕ３領域のテンプレートとして使用され、したがって、ウイルス転写物が、Ｕ３エンハンサー－プロモーターを用いずに作製されることができないことが理由である。ウイルス転写物が作製されない場合、ビリオンへと処理又は包装されることができず、したがって、ウイルスの寿命サイクルは終了する。したがって、ＳＩＮベクターは、右（３’）ＬＴＲ Ｕ３領域が、第１の複製ラウンドを超えるウイルス転写を防止するように修飾されているので、望ましくない複製コンピテントウイルスを作り出すリスクを大幅に低減し、したがって、ウイルスが受け継がれる能力が排除される。更なる安全性向上は、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換えてウイルス粒子の生成中にウイルスゲノムの転写を推進することによって提供される。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性シミアンウイルス４０（simian virus、ＳＶ４０）（例えば、早発性又は遅発性）、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）（例えば、即時早発性）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus、ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。
「長い末端反復（long terminal repeat、ＬＴＲ）」という用語は、レトロウイルスなどのある特定の組換えＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指し、これは、それらの天然配列の文脈において、直接反復であり、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５領域を含有する。ＬＴＲは、一般に、組換え遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写物の促進、開始、及びポリアデニル化）及びウイルス複製に基本的な機能を提供する。
「Ｒ領域」という用語は、キャッピング基の開始（すなわち、転写開始）位置で始まり、ポリＡトラクトの開始位置直前に終了する、組換えＬＴＲ内の領域を指す。Ｒ領域はまた、Ｕ３及びＵ５領域に隣接するものとして定義される。Ｒ領域は、ゲノムの一方の末端から他方への新生ＤＮＡの移植を可能にする逆転写中に重要な役割を果たす。「ＰＢＳ領域」という用語は、ｔＲＮＡＬｙｓプライマーのプライマー結合部位（primer binding site、ＰＢＳ）として機能し、逆転写の開始に必要である、５’－ＬＴＲのＵ５領域の下流の領域を指す。
「統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする」という用語は、宿主細胞のゲノムに統合されている組換えベクター核酸への、核酸、例えば、プライマーの特異的ハイブリダイゼーションを指すが、導入遺伝子又は統合されていない組換えベクター核酸配列を送達するために使用された残留プラスミドは指さない。
試験のためのアッセイ
本開示の組換えベクター核酸の有効性及び特性は、多くの利用可能なインビトロ又はインビボアッセイのうちのいずれかを利用することによって容易に試験することができる。いくつかのそのようなアッセイを以下に記載する。本開示は、開示の任意の組換えベクター核酸が、これらのアッセイのうちのいずれか、並びに当該技術分野で既知の他のものを使用して試験され得ることを企図する。
本開示の組換えベクター核酸の有効性及び特性は、多くの利用可能なインビトロ又はインビボアッセイのうちのいずれかを利用することによって容易に試験することができる。いくつかのそのようなアッセイを以下に記載する。本開示は、開示の任意の組換えベクター核酸が、これらのアッセイのうちのいずれか、並びに当該技術分野で既知の他のものを使用して試験され得ることを企図する。
いくつかの実施形態では、標的細胞のゲノムへの組換えベクター核酸統合を定量化するために、定量ポリメラーゼ連鎖反応（quantitative Polymerase Chain Reaction、ｑＰＣＲ）が用いられる。いくつかの実施形態では、標的細胞のゲノムへの組換えベクター核酸統合を定量化するために、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（digital Polymerase Chain Reaction、ｄＰＣＲ）が用いられる。いくつかの実施形態では、標的細胞のゲノムへの組換えベクター核酸統合を定量化するために、滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（droplet digital Polymerase Chain Reaction、ｄｄＰＣＲ）が用いられる。これらの実施形態では、統合された組換えベクター核酸のＬＴＲ配列に特異的なプライマーを使用するｑＰＣＲ又はｄＰＣＲのための、組換えベクター核酸を発現している細胞（例えば、ＰＢＭＣ細胞）の培養物が採取され、調製される。そのような実験は、形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞のゲノムにおけるＣＡＲをコードする統合された組換えベクター核酸配列を検出するが、残留する統合されていないトランスファープラスミドは検出しない。
本開示の方法及び使用
本開示は、細胞ゲノムへの組換えベクター核酸の統合を検出及び／又は定量化する方法を提供する。この方法では、ある特定の実施形態では、宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供する。生体材料を提供することは、この分析の目的のために所与の時間に取得された生体材料などの新鮮な生体材料を提供することを含む。生体材料を提供することはまた、この目的若しくは他の目的のために患者の治療中の別の時点で取得された以前に得られた生体材料を使用すること、又はアーカイブされた患者材料を使用することを含む。生体材料は、新たに得られても前もって得られてもよく、前もって得られた場合、使用前に（例えば、室温、冷蔵、又は凍結で）保存されていてもよい。例示的な生体材料としては、限定されないが、全血、血清、血漿、尿、糞便、脳脊髄液、腹水などが挙げられる。
本開示は、細胞ゲノムへの組換えベクター核酸の統合を検出及び／又は定量化する方法を提供する。この方法では、ある特定の実施形態では、宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供する。生体材料を提供することは、この分析の目的のために所与の時間に取得された生体材料などの新鮮な生体材料を提供することを含む。生体材料を提供することはまた、この目的若しくは他の目的のために患者の治療中の別の時点で取得された以前に得られた生体材料を使用すること、又はアーカイブされた患者材料を使用することを含む。生体材料は、新たに得られても前もって得られてもよく、前もって得られた場合、使用前に（例えば、室温、冷蔵、又は凍結で）保存されていてもよい。例示的な生体材料としては、限定されないが、全血、血清、血漿、尿、糞便、脳脊髄液、腹水などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、生体材料は、生体試料のゲノムＤＮＡを単離するために、精製されても、又は別の方法で処理されてもよい。そのような処理としては、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、市販のＤＮＡ抽出若しくは精製キット、又は他の精製技法を挙げることができる。
生体試料のゲノムＤＮＡを増幅する方法としては、限定されないが、参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献に開示されている、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、線状ポリメラーゼ反応、核酸配列に基づく増幅（nucleic acid sequence-based amplification、ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、エンドポイントＰＣＲなどが挙げられる：Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ、米国特許第４、６８３、１９５号、同第４，９６５，１８８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号（ＰＣＲ）、Ｇｅｌｆａｎｄ ｅｔ ａｌ、米国特許第５，２１０，０１５号（「ＴＡＱＭＡＮ商標」プローブを用いるリアルタイムＰＣＲ）、Ｗｉｔｔｗｅｒ ｅｔ ａｌ、米国特許第６，１７４，６７０号、Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ、米国特許第５，３９９，４９１号（「ＮＡＳＢＡ」）、Ｌｉｚａｒｄｉ、米国特許第５，８５４，０３３号、Ａｏｎｏ ｅｔ ａｌ、日本特許出願公開第４－２６２７９９号（ローリングサークル増幅）、及び同様物。
ある特定の実施形態では、次いで、定量的増幅技法を使用して、生体試料のゲノムＤＮＡを増幅する。定量的増幅技法は、当業者に既知であり、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、及びエンドポイントＰＣＲが挙げられる。「ｑＰＣＲ」又は「リアルタイム定量ＰＣＲ」（リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応）は、ＰＣＲを使用して標的核酸を同時に増幅及び定量化する実験方法を指す。定量化は、複数の測定化学物質（例えば、蛍光染料のＳＹＢＲ（商標）グリーン又は蛍光レポーターオリゴヌクレオチドプローブのＴａｑｍａｎプローブを含む）を使用して実施され、リアルタイム定量化は、増幅されたＤＮＡが全ての増幅サイクル後に反応物中に蓄積された状態で実施される。デジタルＰＣＲ方法の説明については、例えば、Ｈｉｎｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３（２２）：８６０４－８６１０、Ｐｏｈｌ ａｎｄ Ｓｈｉｈ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４（１）：４１－４７、Ｐｅｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １１（１３）：２１５６－２１６６、Ｐｉｎｈｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８４（２）：１００３－１０１１、Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ５９（１）：１０１－１０７を参照されたく、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、核酸鎖（テンプレート）に相補的なプライマー伸長生成物の合成を誘導する条件下、すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼを含む重合混合物の存在下、並びに好適な温度及びｐＨ条件で、合成の開始点として機能することができるオリゴヌクレオチドを意味する。ある特定の実施形態では、プライマーは、デオキシリボヌクレオチドであり、一本鎖である。本発明で使用されるプライマーとしては、天然に存在するｄＮＭＰ（すなわち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、及びｄＴＭＰ）、修飾ヌクレオチド、又は非天然ヌクレオチドを挙げることができる。加えて、プライマーとしてはまた、リボヌクレオチドを挙げることができる。
プライマーは、重合混合物の存在下で伸長生成物の合成を刺激することが可能なほどに十分に長くなければならない。プライマーの好適な長さは、プライマーの温度、用途、及び供給源などのいくつかの要因によって決定され、典型的には１５～３０ヌクレオチドである。短いプライマー分子は、一般に、テンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を必要とする。
いくつかの実施形態では、増幅生成物（例えば、統合されたレトロウイルス核酸アンプリコン又は対照核酸アンプリコン）に特異的にハイブリダイズする検出可能な核酸プローブは、増幅反応において検出可能なシグナルを生成する。いくつかの実施形態では、検出可能な核酸プローブは、検出可能な薬剤を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な核酸プローブは、クエンチャーを含む。検出可能な薬剤及びクエンチャーは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１９／０２８４６１０号に開示されているとおりである。
ある特定の実施形態では、蛍光分析は、市販の検出器（例えば、ｂｉｏｒａｄからのＤｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ）によって実施され得、各試料の滴蛍光シグナルは装置で検出され得、ポジティブ及びネガティブ滴の数が計数され得、分析は、自動的に完了され得る。
ある特定の実施形態では、「検出可能な核酸プローブ」という用語は、定量ＰＣＲに使用されるＴａｑＭａｎプローブを意味する。ある特定の実施形態では、蛍光材料（ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＦＡＭ色素）がプローブに結合している。ある特定の実施形態では、３ｌＡＢｋＦＱは、プローブの３’側のクエンチャーとして使用され得る。ＴａｑＭａｎプローブは、それぞれ、５’末端に蛍光物質、３’末端にクエンチャー物質でタグ付けされたオリゴヌクレオチドである。ＴａｑＭａｎプローブは、アニーリングステップでテンプレートＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブの３’末端にクエンチャーが存在するので、光が適用された場合でさえも蛍光を呈さない。以下の伸長ステップでは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性は、テンプレートにハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブを分解する。次いで、蛍光物質がプローブから分離され、クエンチャーによる阻害が放出される。そのような原理を通じて、ＰＣＲ反応に起因する蛍光が定量的に示される。
ある特定の実施形態では、本発明によるプローブが、フルオロフォア、並びに標的核酸の非存在下で、かつプローブのＴｍ未満の温度で、蛍光がクエンチングされるような位置にあるクエンチャーを含む、蛍光クエンチングアッセイが使用され得る。本発明によるプローブ及びプライマーには、広範なフルオロフォアが使用され得る。利用可能なフルオロフォアとしては、クマリン、フルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、ルシファーイエロー、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、エオシン、テキサスレッド、及びＲＯＸが挙げられる。例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：２８１６によって記載される、フルオレセイン－ローダミン二量体などの組み合わせたフルオロフォアも好適である。フルオロフォアは、可視スペクトル、又は紫外線若しくは赤外線範囲などの可視スペクトルの外側で吸収及び放出するように選択され得る。当該技術分野で記載の好適なクエンチャーとしては、３ｌＡＢｋＦＱ、ＤＡＢＣＹＬ、並びにＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＭＩ、及びメチルレッドなどのそれらのバリアントが挙げられる。フルオロフォアはまた、ある特定の他のフルオロフォアの近くにある場合、蛍光をクエンチする傾向があるので、クエンチャーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、好ましいクエンチャーは、３ｌＡＢｋＦＱである。いくつかの実施形態では、好ましいフルオロフォアは、フルオレセイン（ＦＡＭ）である。いくつかの実施形態では、好ましい内部クエンチャーは、ＺＥＮである。いくつかの実施形態では、好ましいフルオロフォアは、ＶＩＣである。
ある特定の実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅する少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、かつ第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量ＰＣＲを用いて、生体試料のゲノムＤＮＡを同時に増幅し、プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、統合されたレトロウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする。具体的には、図１Ｂに示されるように、参照ポリヌクレオチド配列を使用して、ゲノム情報を用いて試料中に存在する細胞の数を決定し、したがってコピー数の推定を可能にすることができる。これは、試料における遺伝物質の質量からの変換因子を一般的に使用してコピー数を決定する先行方法の精度を改善することができる。また図１Ｂに示されるように、ポリヌクレオチドをコードするＣＡＲを含むレトロウイルスベクター配列を、宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。とりわけ、この組み込まれたレトロウイルスベクター配列は、図１Ａに示されるように、組み込まれていないベクターに存在しない５’－ＬＴＲデルタＵ３領域を含む。したがって、図１Ｂの５’－ＬＴＲデルタＵ３領域のみに相補的なプライマーを含むことによって、方法は、統合されたレトロウイルスベクター配列のみに選択的であり、統合されていないレトロウイルスベクターに選択的ではない。
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター核酸は、レンチウイルス属のメンバーに基づく。具体的には、レンチウイルスは、強いトランスフェクション効率を示し、遺伝情報を宿主細胞に組み込むための証明されたツールである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、又はヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）である。いくつかの実施形態では、統合されたレトロウイルスベクター核酸を増幅するためのプライマーは、統合されたレトロウイルスベクター配列のＬＴＲ配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター核酸を増幅するためのプライマーは、レンチウイルスの５’ＬＴＲのＵ３領域に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター核酸を増幅するためのプライマーは、レンチウイルスの５’ＬＴＲのＵ３領域及びＲ領域に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター核酸を増幅するためのプライマーは、レンチウイルスの５’ＬＴＲのＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター核酸を増幅するためのプライマーは、レンチウイルスの５’ＬＴＲのＰＢＳ領域及びＲ領域に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター核酸を増幅するためのプライマーは、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルに特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、組み込まれたレトロウイルスベクター核酸に特異的な配列は、配列番号１、配列番号５又は配列番号１４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組み込まれたレトロウイルスベクター核酸に特異的な配列は、配列番号２、配列番号６、又は配列番号１５の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、増幅されたレトロウイルスベクター核酸に特異的にハイブリダイズする検出可能な核酸プローブを使用する。具体的には、いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター核酸に特異的にハイブリダイズするプローブは、配列番号３、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１６の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１６の核酸配列を含むレトロウイルスベクター核酸に特異的にハイブリダイズするプローブは、配列の５’末端から測定して、プローブの５’末端、３’末端、及び／又はプローブの第９と第１０ヌクレオチドとの間にフルオロフォア又はクエンチャーを更に含む。いくつかの実施形態では、５’末端、３’末端、及び／又は内部にフルオロフォア又はクエンチャーを含むレトロウイルスベクター核酸に特異的にハイブリダイズするプローブは、配列番号３、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１６の核酸配列からなる。特定の実施形態では、内部クエンチャーは、配列の５’末端から測定して、プローブの第９と第１０ヌクレオチドとの間にある。いくつかの実施形態では、プローブは、５’末端にフルオロフォア、内部クエンチャー、及び３’末端に第２のクエンチャーを有する。いくつかの実施形態では、好ましいクエンチャーは、３ｌＡＢｋＦＱである。いくつかの実施形態では、好ましいフルオロフォアは、フルオレセイン（ＦＡＭ）である。いくつかの実施形態では、好ましい内部クエンチャーは、ＺＥＮである。いくつかの実施形態では、好ましいフルオロフォアは、ＶＩＣである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター核酸に特異的にハイブリダイズするプローブは、／ＦＡＭ／ＣＴＴＴＣＡＡＧＴ／ＺＥＮ／ＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＧＣＣ／３ｌＡＢｋＦＱ／（配列番号１２）、又は／５６－ＦＡＭ／ＴＧＣＣＴＴＧＡＧ／ＺＥＮ／ＴＧＣＴＴＣＡＡＧＴＡＧＴＧＴＧＴ／３ＩＡＢｋＦＱ／（配列番号１７）である。いくつかの実施形態では、全ての宿主細胞に存在する参照配列を増幅するプライマーは、ハウスキーピングタンパク質をコードする配列の一部分に特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。具体的には、いくつかの実施形態では、ハウスキーピングタンパク質は、アルブミンである。いくつかの実施形態では、アルブミン遺伝子の一部分に特異的にハイブリダイズするプライマー配列は、配列番号８及び／又は９である。いくつかの実施形態では、アルブミン核酸に特異的にハイブリダイズするプローブの配列は、配列番号１０である。いくつかの実施形態では、アルブミン核酸に特異的にハイブリダイズするプローブは、／５ＨＥＸ／ＡＧＧＧＡＧＡ／ＺＥＮ／ＧＡＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＣＡＴＧＡＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／（配列番号１１）である。
この方法では、ある特定の実施形態では、次いで、増幅されたゲノム核酸を検出及び／又は定量化し、参照核酸に対する増幅されたレトロウイルスベクター核酸の比が、細胞ゲノムに統合されたレトロウイルスベクター核酸のコピー数と相関する。具体的には、上に論じられるように、１つのプライマーは、レトロウイルスベクターが宿主細胞ゲノムに組み込まれる場合のみ現れるポリヌクレオチド配列に特異的であるので、ｑＰＣＲによって計数される配列の数は、試料における、統合されたレトロウイルスベクターの数に正比例する。検出された参照ポリヌクレオチド配列の数によって除算することによって、所与の生体試料のコピー数の直接計算が可能になる。
ある特定の実施形態では、本開示は、対象のゲノムに統合されたレトロウイルスベクター核酸コピー数を決定するための方法を提供する。方法のいくつかの実施形態では、対象のゲノムＤＮＡを含有する生体試料を提供する。方法のいくつかの実施形態では、生体試料における、対象のゲノム内の統合されたレトロウイルスベクター核酸の一部分及び参照ポリヌクレオチド配列を定量ＰＣＲによって増幅する。方法のいくつかの実施形態では、（ｉ）レトロウイルスベクター核酸配列を含有する増幅されたポリヌクレオチドの量、及び（ｉｉ）参照ポリヌクレオチド配列を含有する増幅されたポリヌクレオチドの量、を決定し、（ｉ）と（ｉｉ）との比を決定し、比が、統合されたレトロウイルスベクター核酸コピー数に対応する。
いくつかの実施形態では、増幅は、試料を、統合されたレトロウイルスベクター核酸配列に特異的なプライマー対を含む組成物と組み合わせることと、定量ＰＣＲを実行することと、を含む。いくつかの実施形態では、増幅は、試料を、統合されたレトロウイルスベクター核酸配列に特異的なプライマー対を含む組成物と組み合わせることと、定量的増幅技法を実行することと、を含む。いくつかの実施形態では、増幅は、参照ポリヌクレオチド配列に特異的なプライマー対、及び定量的増幅技法を実行することを更に含み、統合されたレトロウイルスベクター核酸配列及び参照ポリヌクレオチドが、実質的に等しい比率で別々に増幅される。いくつかの実施形態では、統合されたレトロウイルスベクター核酸配列のプライマー対の１つのプライマーは、５’ＬＴＲに特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター核酸を増幅するためのプライマー対の１つのプライマーは、５’ＬＴＲのＵ３領域に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、統合されたレトロウイルスベクター核酸配列のプライマー対の１つのプライマーは、５’ＬＴＲのＵ３領域及びＲ領域に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター核酸を増幅するためのプライマー対の１つのプライマーは、５’ＬＴＲのＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、統合されたレトロウイルスベクター核酸配列は、導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ある特定の標的抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。
本開示は、レトロウイルスベクターの形質導入効率を監視するための更に別の方法を提供する。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター核酸によって形質導入されたゲノムＤＮＡを含有する１つ以上の生体試料を提供し、レトロウイルスベクター核酸の一部分が、ゲノムＤＮＡに統合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って、各生体試料のゲノムＤＮＡに統合されたレトロウイルスベクター配列コピー数を決定する。いくつかの実施形態では、生体試料のレトロウイルスベクター配列コピー数を参照と比較する。
本開示はまた、レトロウイルスベクターによって形質導入された細胞製品についてのロットリリース試験の方法を提供する。いくつかの実施形態では、各ロットから、レトロウイルスベクターによって形質導入されたゲノムＤＮＡを含有する細胞製品の１つ以上の生体試料を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の方法に従って、各生体試料に統合されたレトロウイルスベクター配列コピー数を決定する。いくつかの実施形態では、生体試料のレトロウイルスベクター配列コピー数を参照と比較する。いくつかの実施形態では、統合されたレトロウイルスベクター配列コピー数が所定の基準に合格するロットがリリースされる。ある特定の実施形態では、所定の基準は、コピー数範囲又は対照からの変動パーセントであり得る。
本開示はまた、組換えベクター核酸の統合を定量化するための、アッセイ又は試料の確実性をそれぞれ決定するために使用され得る、アッセイ許容基準及び試料許容基準を提供する。いくつかの実施形態では、組換えベクター核酸配列の統合は、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の測定された量の比の２倍として定義される、細胞（ＶＣＮ／細胞）値当たりのベクターコピー数を計算することによって決定される。いくつかの実施形態では、プロウイルス又は参照ポリヌクレオチド配列の量は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を介して決定される。いくつかの実施形態では、プロウイルス又は参照ポリヌクレオチド配列の量は、ｑＰＣＲ機器によって測定された閾値サイクル（Ｃｔ）からの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって決定される。閾値サイクル（Ｃｔ）は、プロウイルス又は参照ポリヌクレオチド配列のいずれかの各増幅曲線から設定蛍光閾値に達するのに必要なＰＣＲサイクルの数として定義され、それぞれのポリヌクレオチド配列の含有量に相互比例する。
いくつかの実施形態では、アッセイ許容基準又は試料許容基準のうちの１つ以上は、３つ以上の標準試料の３つ以上の複製物を利用する。いくつかの実施形態では、各々３．２０ＶＣＮ／細胞である又は約３．２０ＶＣＮ／細胞である３つ以上の標準試料は、希釈剤として緩衝液を使用して、所定の塩基標準試料から最大４～５倍連続希釈物から調製される。いくつかの実施形態では、塩基標準試料は、１２１，２１２．１２１コピーのプロウイルス及び７５，７５７．５７６コピーの参照ポリヌクレオチド配列を含有する。いくつかの実施形態では、アッセイ許容基準又は試料許容基準のうちの１つ以上は、１つ以上の陽性対照試料の３つ以上の複製物について、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の測定された量と、既知の濃度のプロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の別々の試料からの当該１つ以上の陽性対照試料の調製中に計算されたプロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の公称量との比較を必要とする。
いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のアッセイ許容基準を評価することによって、組換えベクター核酸の統合を定量化するためのアッセイの確実性を評価することを更に含む。いくつかの実施形態では、アッセイは、以下からなる群から選択されるアッセイ許容基準のうちの１つ以上の、又はそれらのうちの全てが満たされる場合、確実である：（ａ）テンプレートＤＮＡを含有しない対照の全ての複製物におけるプロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の閾値サイクルが、決定不可能であること、（ｂ）標準試料を使用する線形回帰によって生成された、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の標準曲線の相関係数が、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、又は０．９７以上であること、（ｃ）当該標準曲線の勾配からの推定ＶＣＮ／細胞値が、８０％～１２０％、８２％～１１８％、８４％～１１６％、８６％～１１４％、８８％～１１６％、又は９０％～１１０％のＰＣＲ効率を示すこと、（ｄ）標準試料のうちのいずれかの複製物のうちのいずれにおいても、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の閾値サイクルが、決定不可能でないこと、（ｅ）塩基標準試料における、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の平均閾値サイクルが、３０．０、２８．０、２６．０、２４．０、又は２２．０以下であること、（ｆ）各標準試料における、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の閾値サイクルの標準偏差が、０．９５、０．９０、０．８５、０．８０、０．７５、０．７０、０．６５、又は０．６０以下であること、（ｇ）１つ以上の陽性対照試料の参照ポリヌクレオチド配列の平均測定コピーが、公称予想値の５０％、４５％、４０％、３５％、又は３０％以内であること、（ｈ）１つ以上の陽性対照試料の測定平均ＶＣＮ／細胞値が、各対照の公称予想ＶＣＮ／細胞値の５０％、４５％、４０％、３５％、又は３０％以内であること、並びに（ｉ）１つ以上の陽性対照試料のＶＣＮ／細胞値の変動係数が、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、又は２０％以下であること。
いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の試料許容基準を評価することによって、試料の組換えベクター核酸の統合の定量化の確実性を評価することを更に含む。いくつかの実施形態では、試料は、以下からなる群から選択される試料許容基準のうちの１つ以上、又はそれらのうちの全てが満たされる場合、確実である：（ａ）試料における、参照ポリヌクレオチド配列の平均コピー値が、３０，３０３．０３０コピーの予想値の５０％、４５％、４０％、３５％、又は３０％以内であること、（ｂ）試料が０．０２μｇ／μＬ未満のゲノムＤＮＡ（genomic DNA、ｇＤＮＡ）濃度を有する場合、その試料の参照ポリヌクレオチド配列の予想コピーが、反応に実際に充填されたＤＮＡの量から計算されること、（ｃ）試料における平均標的プロウイルスコピー値が、アッセイのコピー値の検証された範囲の間であること、（ｄ）試料における平均標的プロウイルスコピー値が、１２１，２１２．１２１～１９３．９３９コピーであること、（ｅ）標的試料の複製物のＶＣＮ／細胞値の変動係数が、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、又は２０％以下であること、並びに、（ｆ）試料における、標的プロウイルス及び標的参照ポリヌクレオチド配列の両方のサイクル閾値の標準偏差が、０．９５、０．９０、０．８５、０．８０、０．７５、０．７０、０．６５、又は０．６０以下であること。
いくつかの実施形態では、細胞ゲノムへの組換えベクター核酸の統合を定量化する方法は、導入遺伝子の同定のための方法を更に含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子の同定のための方法は、（ａ）宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供することと、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量的増幅技法を用いて、生体試料のゲノムＤＮＡを増幅することであって、プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、導入遺伝子に特異的にハイブリダイズする、を増幅することと、（ｃ）ステップ（ｂ）を通じて増幅されたゲノム核酸を検出及び／又は定量化することと、を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、キメラ抗原受容体をコードする。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号１８、配列番号２０、又は配列番号２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号１９又は配列番号２１の配列を含む核酸配列によってコードされるポリペピドである。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡ、ＫＬＫ２、又はＧＰＲＣ５Ｄを認識する。
キット
ある特定の実施形態では、本開示はまた、統合された組換えベクター配列コピー数を測定するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、本開示の１つ以上のプライマーを含み得る。ある特定の実施形態では、キットは、本開示の１つ以上のプローブを含み得る。
ある特定の実施形態では、本開示はまた、統合された組換えベクター配列コピー数を測定するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、本開示の１つ以上のプライマーを含み得る。ある特定の実施形態では、キットは、本開示の１つ以上のプローブを含み得る。
本開示はまた、統合された組換えベクター配列コピー数を測定するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズするプライマー対の１つのプライマー又は両方のプライマーを含み、プライマー対が、統合された組換えベクター核酸の一部分を特異的に増幅する。いくつかの実施形態では、キットは、増幅された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする検出可能な核酸プローブを含む。
本開示はまた、統合された組換えベクター配列コピー数を測定するための別のキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする順方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする順方向プライマーを含み、順方向プライマーが、配列番号１、配列番号５、又は配列番号１４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キットは、統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする逆方向プライマーを含み、逆方向プライマーが、配列番号２、配列番号６、又は配列番号１５の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キットは、検出可能なプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号３、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１６の核酸配列を含む検出可能なプローブを含む。
実施例
本開示は、ここで一般に説明され、本開示のある特定の態様及び実施形態を単に例示する目的のために含まれ、本開示を限定することを意図するものではない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。例えば、本明細書に開示の特定の構築物及び実験設計は、適切な機能を検証するための例示的なツール及び方法を表す。したがって、本開示の特定の構築物及び実験計画のうちのいずれも、本開示の範囲内で置換され得ることが容易に明らかになるであろう。
本開示は、ここで一般に説明され、本開示のある特定の態様及び実施形態を単に例示する目的のために含まれ、本開示を限定することを意図するものではない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。例えば、本明細書に開示の特定の構築物及び実験設計は、適切な機能を検証するための例示的なツール及び方法を表す。したがって、本開示の特定の構築物及び実験計画のうちのいずれも、本開示の範囲内で置換され得ることが容易に明らかになるであろう。
実施例１：実施例の材料及び方法
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び６ウェルプレートのウェル当たり４×１０５の細胞密度のプラスミドを用いて、一過性トランスフェクション実験を実施した。２４時間後に培地を除去し、新鮮な成長培地と交換した。
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び６ウェルプレートのウェル当たり４×１０５の細胞密度のプラスミドを用いて、一過性トランスフェクション実験を実施した。２４時間後に培地を除去し、新鮮な成長培地と交換した。
ｑＰＣＲアッセイを実施して、トランスフェクトした細胞のコピー数を決定した。第１に、参照遺伝子及び５’－ＬＴＲ配列線状化プラスミドの両方の標準物質及び品質対照を、ｔＲＮＡ（酵母ｔＲＮＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号６５７４９１）の存在下で別々に調製した。第２に、１倍のＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号４４４４５５８）中で、順方向プライマー（配列番号８）、逆方向プライマー（配列番号９）、プローブ／５ＨＥＸ／ＡＧＧＧＡＧＡ／ＺＥＮ／ＧＡＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＣＡＴＧＡＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／（配列番号１１）からなる参照遺伝子マスターミックスを調製した。第３に、１倍のＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号４４４４５５８）中で、順方向プライマー（配列番号５）、逆方向プライマー（配列番号６）、及びプローブ／ＦＡＭ／ＣＴＴＴＣＡＡＧＴ／ＺＥＮ／ＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＧＣＣ／３ｌＡＢｋＦＱ／（配列番号１２）からなる５’－ＬＴＲマスターミックスを調製した。
ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、標準物質、ＱＣ、及び試料をマルチウェルプレートに添加することによって、ｑＰＣＲアッセイを準備した。ｑＰＣＲアッセイは、任意のリアルタイムＰＣＲ機器で実行した。ｑＰＣＲアッセイは、限定されないが、ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、標準物質、ＱＣ、及び試料を９６ウェルプレートに添加することによる調製を含む。限定されないが、条件：融解に５０℃２分、９５℃１０分、９５℃１５秒、アニーリング及び伸長に６０℃１分を用いる、Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ機器で、ｑＰＣＲアッセイを実行してもよい。
実施例２：ＨＩＶ－１によって送達されたＴ細胞に組み込まれたポリヌクレオチドをコードするＣＡＲの定量化
ユニバーサルｑＰＣＲアッセイは、形質導入された細胞製品のゲノムへの任意の導入遺伝子をコードする統合されたレトロウイルスベクター配列のみを検出するが、レンチウイルスベクターを生成するために使用された転写プラスミドは検出しない。宿主ゲノムへのレンチウイルスベクター統合の特有の特徴に基づいて、レンチウイルス形質導入細胞のコピー数を定量化することができるが、統合されていないベクターを定量化することができない特定のｑＰＣＲアッセイを開発した（図１Ａ及び図１Ｂを参照されたい）。
ユニバーサルｑＰＣＲアッセイは、形質導入された細胞製品のゲノムへの任意の導入遺伝子をコードする統合されたレトロウイルスベクター配列のみを検出するが、レンチウイルスベクターを生成するために使用された転写プラスミドは検出しない。宿主ゲノムへのレンチウイルスベクター統合の特有の特徴に基づいて、レンチウイルス形質導入細胞のコピー数を定量化することができるが、統合されていないベクターを定量化することができない特定のｑＰＣＲアッセイを開発した（図１Ａ及び図１Ｂを参照されたい）。
細胞ゲノムに統合されているレトロウイルスベクター核酸は、発明の方法を使用して容易に定量化可能である。
（表１による）プライマー及びプローブセット１～５を使用して、実施例１の方法に従って統合されたレンチウイルスベクター配列を増幅した。プライマーセット１～４は、ベクターが統合された細胞試料からレンチウイルス配列を増幅したが、形質導入が実施されなかったがレンチウイルストランスファープラスミドが存在した対照細胞試料では増幅しなかった（図２参照）。対照（セット５）は、細胞を含む全ての試料中でヒトアルブミン（human albumin、ｈＡＬＢ）配列を増幅した。
実施例３：血液中の統合されたＧＰＲｃ５ｄＣＡＲ－Ｔの定量化
前述の実施例に記載の方法を使用して、ＧＰＲｃ５ｄ ＣＡＲ－Ｔを使用するマウス研究において、統合されたＣＡＲ導入遺伝子コピー数を定量化した。この研究を実行して、最終クローン／構築物を選択した。
前述の実施例に記載の方法を使用して、ＧＰＲｃ５ｄ ＣＡＲ－Ｔを使用するマウス研究において、統合されたＣＡＲ導入遺伝子コピー数を定量化した。この研究を実行して、最終クローン／構築物を選択した。
ｑＰＣＲアッセイを開発し、５つの異なるマウス研究で首尾よく使用した。ＧＰＲｃ５ｄ ＣＡＲ－Ｔ研究における、プロウイルス方法コピー数は、フローデータと相関する（図３Ａ～図３Ｂ）。５ＬＴＲ対３（表１によるセット３）をこれらの実験で使用した。
実施例４：ＣＡＲ－Ｔ生成物に統合された導入遺伝子の定量化
ＣＡＲ－Ｔ生成物における、ＨＩＶ由来レンチウイルス５’ＬＴＲ領域（プロウイルス配列標的領域）の細胞ゲノム統合形態を標的とすることによる、統合された導入遺伝子の定量化のための定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを開発した。標的抗原ＢＣＭＡを認識する例示的なＣＡＲ－Ｔ生成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を有する。アッセイは、シングルプレックス又はマルチプレックスｑＰＣＲであり、プロウイルス配列の統合された５’ＬＴＲ領域、並びにヒトアルブミン（ｈＡＬＢ；参照ハウスキーピング遺伝子）を標的とした。この方法を使用することができるが、細胞当たりのベクターコピー数（vector copy number、ＶＣＮ）として報告される形質導入効率を決定するために事前に配合された凍結ＣＡＲ－Ｔ細胞ペレットに限定されない。
ＣＡＲ－Ｔ生成物における、ＨＩＶ由来レンチウイルス５’ＬＴＲ領域（プロウイルス配列標的領域）の細胞ゲノム統合形態を標的とすることによる、統合された導入遺伝子の定量化のための定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを開発した。標的抗原ＢＣＭＡを認識する例示的なＣＡＲ－Ｔ生成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を有する。アッセイは、シングルプレックス又はマルチプレックスｑＰＣＲであり、プロウイルス配列の統合された５’ＬＴＲ領域、並びにヒトアルブミン（ｈＡＬＢ；参照ハウスキーピング遺伝子）を標的とした。この方法を使用することができるが、細胞当たりのベクターコピー数（vector copy number、ＶＣＮ）として報告される形質導入効率を決定するために事前に配合された凍結ＣＡＲ－Ｔ細胞ペレットに限定されない。
Ｐｕｒｅｌｉｎｋ ｇＤＮＡ単離キットを使用して、事前に配合したＣＡＲ－Ｔ細胞ペレットからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。ＤＮＡ単離の前に、事前に配合された細胞ペレットを－６０℃以下で凍結保存した。単離されたＤＮＡは、－６０℃以下で保存し、Ｑｕｂｉｔ４蛍光光度計及び蛍光に基づくＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅアッセイキットを使用して定量化のために後で解凍したか、又は直ちに定量化したかのいずれかであった。Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅキットで供給される２つの標準物質を使用して、Ｑｕｂｉｔ ４蛍光光度計を較正した。標準物質を調製し、定量されるＤＮＡ試料の各セットで実行した。同じＱｕｂｉｔ作業溶液を使用して、標準物質及びＤＮＡ試料反応物を調製した。定量化に続いて、単離されたＤＮＡを０．０２０μｇ／μＬの作業濃度まで希釈した。
分子グレードの水を使用して希釈した、オリゴヌクレオチド混合物（プロウイルスプライマー、並びに表１による／５６－ＦＡＭ／ＴＧＣＣＴＴＧＡＧ／ＺＥＮ／ＴＧＣＴＴＣＡＡＧＴＡＧＴＧＴＧＴ／３ＩＡＢｋＦＱ／（配列番号１７）及びｈＡＬＢプライマーを含むプローブセット４、並びにプローブセット５を含有する）、及びｑＰＣＲ ＴａｑＰａｔｈ ＰｒｏＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ溶液を使用して、ｑＰＣＲ反応物を調製した。プロウイルスプライマー及びプローブセット中の３つのオリゴヌクレオチドの各々の最終濃度は、２００ｎＭであった。ｈＡＬＢ順方向及び逆方向プライマーの各々の最終濃度は、５０ｎＭであり、ｈＡＬＢプローブの最終濃度は、２００ｎＭであった。
５μＬの標準物質番号１が、１２１、２１２．１２１コピーのプラスミドを含有するように、０．０５μｇ／μＬのＰＢＭＣ ＤＮＡを線状５’ＬＴＲプラスミドでスパイクすることによってプロウイルス標準物質番号１を作製した。緩衝液を使用して、標準物質番号１を段階希釈した。５μＬの中間対照が、３０，３０３．０３０コピーの５’ＬＴＲプラスミドを含有するように、０．０２μｇ／μＬのＰＢＭＣ ｇＤＮＡを線状５’ＬＴＲプラスミドでスパイクすることによって、プロウイルスｑＰＣＲ中間対照を作製した。希釈剤として０．０２μｇ／μＬのＰＢＭＣ ｇＤＮＡを使用して、中間対照体積を１：１０に希釈することによって、プロウイルスｑＰＣＲ低対照を作製した。これは、５μＬの中間対照における２．００ＶＣＮ／細胞及び５μＬの低対照における０．２０ＶＣＮ／細胞の公称ベクターコピー数に等しいが、中間対照及び低対照の各ロットの実際のＶＣＮ／細胞値は、試薬定量化中に決定した。
ｑＰＣＲプレートの指定されたウェルに、マスターミックスを充填した。各希釈標準点の３つの複製物、プロウイルス中間対照、プロウイルス低対照、試験物品ＤＮＡ、及び低ＥＤＴＡ ＴＥ緩衝液（すなわち、テンプレート対照なし又はＮＴＣ）を、各々、ｑＰＣＲプレート中のマスターミックスを含有する指定されたウェルに充填した。ｑＰＣＲプレートをリアルタイムＰＣＲ機器に充填して、ｑＰＣＲ反応を実行した。
ｑＰＣＲ機器によって、各標的（プロウイルス及びｈＡＬＢ）について測定された閾値サイクル（threshold cycle、Ｃｔ）を決定した。標準物質のＣｔ及び対数濃度値を使用して、線形回帰によって標準曲線を生成した。標準曲線を使用して、各対照及び試験物品複製物の各標的のコピーを計算した。
以下のように、各試料、中間対照、及び低対照複製物のＶＣＮ／細胞を計算した。
以下のアッセイ許容基準を使用して、有効なアッセイを得た。
・プロウイルス及びｈＡＬＢ標準曲線の両方の相関係数（Ｒ２）値が、０．９７以上である必要がある。
・標準曲線の勾配が、－３．５８５～－３．１０４である必要がある（９０．０８～１０９．９７％のＰＣＲ効率に等しい）
・ＮＴＣの全てのＣｔ複製物が、プロウイルス及びｈＡＬＢ導入遺伝子の両方で「未確定」である必要がある。
・標準物質番号１の平均Ｃｔは、プロウイルス及びｈＡＬＢ標的で２２．０以下である必要があり、標準物質のうちのいずれのＣｔ複製物のいずれも「未決定」である可能性がなかった。
・プロウイルス及びｈＡＬＢ標的の両方の各標準物質のＣｔ ＳＤが、０．６０以下である必要がある。
・中間及び低対照の両方の平均ｈＡＬＢコピーが、３０，３０３．０３０コピー±３０％である必要がある（予想範囲：２１，２１２．１２１～３９，３９３．９３９コピー）。
・中間対照及び低対照の平均ＶＣＮ／細胞結果が、各対照では、適格なＶＣＮ／細胞値の－３０％以上～＋３０％以下である必要がある。
・中間及び低対照複製物のＶＣＮ／細胞のＣＶ％が、２０％以下である必要がある。
・プロウイルス及びｈＡＬＢ標準曲線の両方の相関係数（Ｒ２）値が、０．９７以上である必要がある。
・標準曲線の勾配が、－３．５８５～－３．１０４である必要がある（９０．０８～１０９．９７％のＰＣＲ効率に等しい）
・ＮＴＣの全てのＣｔ複製物が、プロウイルス及びｈＡＬＢ導入遺伝子の両方で「未確定」である必要がある。
・標準物質番号１の平均Ｃｔは、プロウイルス及びｈＡＬＢ標的で２２．０以下である必要があり、標準物質のうちのいずれのＣｔ複製物のいずれも「未決定」である可能性がなかった。
・プロウイルス及びｈＡＬＢ標的の両方の各標準物質のＣｔ ＳＤが、０．６０以下である必要がある。
・中間及び低対照の両方の平均ｈＡＬＢコピーが、３０，３０３．０３０コピー±３０％である必要がある（予想範囲：２１，２１２．１２１～３９，３９３．９３９コピー）。
・中間対照及び低対照の平均ＶＣＮ／細胞結果が、各対照では、適格なＶＣＮ／細胞値の－３０％以上～＋３０％以下である必要がある。
・中間及び低対照複製物のＶＣＮ／細胞のＣＶ％が、２０％以下である必要がある。
以下の全ての許容基準を満たさなかった試料は、無効とみなした。
・プロウイルス及びｈＡＬＢ標的の両方の各試料のＣｔ ＳＤが、０．６０以下である必要がある。アッセイ範囲を下回るか又は上回ると決定された試料のＣｔ ＳＤには、アクセスしなかった。
・各試料の平均ｈＡＬＢコピーが、３０，３０３．０３０コピー±３０％である必要がある（予想範囲：２１，２１２．１２１～３９，３９３．９３９コピー）。
・試料ｇＤＮＡの濃度が、０．０２μｇ／μＬ未満であった場合、実際に反応に充填したＤＮＡの量からその試料のｈＡＬＢの予想コピーを計算した。
・各試料の平均プロウイルス標的コピー値は、ＶＣＮ／細胞結果を計算するために、アッセイの検証された範囲に等しいか、又はその間にある必要がある。
・試料の平均プロウイルスコピー値が、１２１，２１２．１２１超であった場合、試料は、アッセイ範囲を上回るとみなした。
・試料の平均プロウイルスコピー値が、１９３．９３９コピー未満であった場合、試料は、アッセイ範囲を下回るとみなした。
・試料ＶＣＮ／細胞複製物のＣＶ％が、２０％以下である必要がある。アッセイ範囲を下回るか若しくは上回ると決定された試料、又はｈＡＬＢ許容基準を満たさない試料のＣＶ％には、アクセスしなかった。
・プロウイルス及びｈＡＬＢ標的の両方の各試料のＣｔ ＳＤが、０．６０以下である必要がある。アッセイ範囲を下回るか若しくは上回ると決定された試料、又はｈＡＬＢ許容基準を満たさない試料のＣＶ％には、アクセスしなかった。
・プロウイルス及びｈＡＬＢ標的の両方の各試料のＣｔ ＳＤが、０．６０以下である必要がある。アッセイ範囲を下回るか又は上回ると決定された試料のＣｔ ＳＤには、アクセスしなかった。
・各試料の平均ｈＡＬＢコピーが、３０，３０３．０３０コピー±３０％である必要がある（予想範囲：２１，２１２．１２１～３９，３９３．９３９コピー）。
・試料ｇＤＮＡの濃度が、０．０２μｇ／μＬ未満であった場合、実際に反応に充填したＤＮＡの量からその試料のｈＡＬＢの予想コピーを計算した。
・各試料の平均プロウイルス標的コピー値は、ＶＣＮ／細胞結果を計算するために、アッセイの検証された範囲に等しいか、又はその間にある必要がある。
・試料の平均プロウイルスコピー値が、１２１，２１２．１２１超であった場合、試料は、アッセイ範囲を上回るとみなした。
・試料の平均プロウイルスコピー値が、１９３．９３９コピー未満であった場合、試料は、アッセイ範囲を下回るとみなした。
・試料ＶＣＮ／細胞複製物のＣＶ％が、２０％以下である必要がある。アッセイ範囲を下回るか若しくは上回ると決定された試料、又はｈＡＬＢ許容基準を満たさない試料のＣＶ％には、アクセスしなかった。
・プロウイルス及びｈＡＬＢ標的の両方の各試料のＣｔ ＳＤが、０．６０以下である必要がある。アッセイ範囲を下回るか若しくは上回ると決定された試料、又はｈＡＬＢ許容基準を満たさない試料のＣＶ％には、アクセスしなかった。
全ての試料許容基準を満たした任意の試料についての形質導入効率を、平均ＶＣＮ／細胞結果として、小数点第２位まで正確に報告した。
本方法を使用して試験したＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ生成は、統合されなかったコピー数に対して統合されたコピー数を区別することができないベクターパッケージングシグナル（packaging signal、ＰＳＩ）を標的とするアッセイよりも、低い統合されたコピー数を示した。試験したＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔバッチにおいて、ＰＳＩ法がプラスミド混入をピックアップする潜在性を有したことが、結果によって確認される（表２）。
発展中の例示的なＧＰＲｃ５ｄ及びＫＬＫ２ ＣＡＲ－Ｔ生成物などの他のＣＡＲ－Ｔ生成物にも、方法を使用した。ＣＡＲのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２０及び２２を含む。これらの結果のＰＳＩ法との比較は、ＶＣＮにおいて、方法間にいかなる差も示さなかった（表３）。ＧＰＲｃ５ｄ ＣＡＲ－Ｔ及びＫＬＫ２ ＣＡＲ－Ｔバッチ生成プロセスに、プラスミド混入がなかったことが、結果によって確認される。
実施例５：他のＣＡＲ－Ｔ生成物に統合された導入遺伝子の定量化
統合された導入遺伝子の定量化のための定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイはまた、ＧＰＲＣ５Ｄを標的とするものなどの他のＣＡＲ－Ｔ生成物においても有用である。実施例３の方法を使用して、ＧＰＲｃ５ｄ ＣＡＲ－Ｔ生成物のマウス血液中の平均ＶＣＮ／細胞又は導入遺伝子コピー／μｇ ｇＤＮＡとして、ＣＡＲ－Ｔ細胞動態をマウス研究で決定した。
統合された導入遺伝子の定量化のための定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイはまた、ＧＰＲＣ５Ｄを標的とするものなどの他のＣＡＲ－Ｔ生成物においても有用である。実施例３の方法を使用して、ＧＰＲｃ５ｄ ＣＡＲ－Ｔ生成物のマウス血液中の平均ＶＣＮ／細胞又は導入遺伝子コピー／μｇ ｇＤＮＡとして、ＣＡＲ－Ｔ細胞動態をマウス研究で決定した。
実施例６：ＣＡＲ－Ｔ生成物に統合された導入遺伝子の定量化後の導入遺伝子の同定
プロウイルスｑＰＣＲ方法は、ＣＡＲ－Ｔ導入遺伝子配列と統合された細胞ゲノムのバッチにおいてＶＣＮ／細胞を正確に推定するのに有用であるが、導入遺伝子内のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするプライマーを使用するｑＰＣＲ方法は、ＣＡＲ導入遺伝子の同一性を確認するために依然として有用である。これは、プロウイルスｑＰＣＲ方法が普遍的であり、導入遺伝子特異的ではないことが理由である。
プロウイルスｑＰＣＲ方法は、ＣＡＲ－Ｔ導入遺伝子配列と統合された細胞ゲノムのバッチにおいてＶＣＮ／細胞を正確に推定するのに有用であるが、導入遺伝子内のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするプライマーを使用するｑＰＣＲ方法は、ＣＡＲ導入遺伝子の同一性を確認するために依然として有用である。これは、プロウイルスｑＰＣＲ方法が普遍的であり、導入遺伝子特異的ではないことが理由である。
導入遺伝子ｑＰＣＲ方法の設計及び実行は、導入遺伝子標的の順方向プライマー、逆方向プライマー、及びプローブ配列の配列、並びに任意選択的に濃度においてのみが異なるプロウイルスｑＰＣＲ方法のものと同じである。導入遺伝子標的が、標的抗原ＢＣＭＡを認識し、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、配列番号１９を含む核酸配列によってコードされるＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ生成物中のＣＡＲをコードする場合、ＣＡＲＤ導入遺伝子のＣＤ１３７（４－１ＢＢ）及びＣＤ３ζ由来配列に特異的なプライマー／プローブセットを使用した。導入遺伝子順方向及び逆方向プライマーの各々には、１００ｎＭの濃度を使用した。両方の方法のヒトアルブミン（ｈＡＬＢ）ハウスキーピング遺伝子オリゴヌクレオチドは同じであったが、導入遺伝子方法におけるｈＡＬＢ順方向及び逆方向プライマーの濃度は、７５ｎＭであった。
簡単に言えば、導入遺伝子ｑＰＣＲ方法を実行するために、モック形質導入リンパ球細胞株の５ポイント連続希釈を使用して、トランスファープラスミド及びヒトアルブミン（ｈＡＬＢ）の両方の標準曲線を生成した。採取後の試料から単離したゲノムＤＮＡを、３回分析した。各３つのＤＮＡ試料の導入遺伝子及びｈＡＬＢの両方のコピーを、それぞれの標準曲線から補間した。ｈＡＬＢの平均コピーを使用して、試料ＤＮＡが由来する細胞の数を推定した。試料ＤＮＡ中に存在する導入遺伝子の平均コピーを、試料ＤＮＡが由来する細胞の推定数によって除算して、試料の細胞当たりのベクターコピー数を決定した。
表２－本方法を使用して試験したＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ生成は、統合されなかったコピー数に対して統合されたコピー数を区別することができないベクターパッケージングシグナル（ＰＳＩ）を標的とするアッセイよりも、低い統合されたコピー数を示した
表３－本方法及びＰＳＩ法を使用する、ＫＬＫ２及びＧＰＲＣ５Ｄを標的とするＣＡＲ Ｔ生成物のＶＣＮの比較
参考文献
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発明の有利な実施形態を、以下に付番した段落に記載する。
１．細胞ゲノムへの組換えベクター核酸の統合を定量化するための方法であって、方法が、
（ａ）宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供することと、
（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量的増幅技法を用いて、生体試料のゲノムＤＮＡを増幅することであって、プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、統合された組換えベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする、増幅することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を通じて増幅されたゲノム核酸を検出及び／又は定量化することと、を含む、方法。
２．組換えベクターが、導入遺伝子を含有する、段落１に記載の方法。
３．導入遺伝子が、キメラ抗原受容体をコードする、段落２に記載の方法。
４．組換えベクターが、遺伝子療法ベクターである、段落１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．遺伝子療法ベクターが、ウイルスベクターである、段落４に記載の方法。
６．生体試料が、細胞試料又は組織試料である、段落１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．組織試料が、血液、血漿、血清、唾液、又は組織生検である、段落６に記載の方法。
８．試料が、対象からのものである、段落１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．対象が、ヒトである、段落８に記載の方法。
１０．組換えベクターが、レトロウイルスベクターである、段落１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、段落１０に記載の方法。
１２．レンチウイルスベクターが基づくレンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、又はヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）である、段落１１に記載の方法。
１３．統合された組換えベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、統合された組換えベクター配列のＬＴＲ配列に特異的にハイブリダイズする、段落１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．ステップ（ｂ）の統合された組換えベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号１、配列番号５、又は配列番号１４の核酸配列を含む、段落１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．ステップ（ｂ）で使用される組換えベクター核酸を増幅するための第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号２、配列番号６、又は配列番号１５の核酸配列を含む、段落１４に記載の方法。
１６．ステップ（ｂ）で使用される統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ３領域に特異的にハイブリダイズする、段落１１に記載の方法。
１７．ステップ（ｂ）で使用される統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ３領域及びＲ領域に特異的にハイブリダイズする、段落１１に記載の方法。
１８．ステップ（ｂ）で使用される統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする、段落１１に記載の方法。
１９．ステップ（ｂ）で使用される統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルに特異的にハイブリダイズする、段落１１に記載の方法。
２０．定量的増幅技法が、ｑＰＣＲである、段落１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．定量的増幅技法が、ｄＰＣＲ又はｄｄＰＣＲである、段落１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２２．定量的増幅技法が、エンドポイントＰＣＲである、段落１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２３．ステップ（ｂ）が、増幅された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする検出可能な核酸プローブを利用する、段落１～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．組換えベクター核酸が、レンチウイルスベクターである、段落２３に記載の方法。
２５．統合された組換えベクター核酸のプローブが、統合された組換えベクター配列のＬＴＲ配列に特異的にハイブリダイズする、段落２３又は段落２４に記載の方法。
２６．ステップ（ｂ）で使用されるレンチウイルスベクター核酸のプローブが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ３領域及びＲ領域に特異的にハイブリダイズする、段落２４に記載の方法。
２７．ステップ（ｂ）で使用されるレンチウイルスベクター核酸のプローブが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ５領域及びＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする、段落２４に記載の方法。
２８．ステップ（ｂ）で使用されるレンチウイルスベクター核酸のプローブが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする、段落２４に記載の方法
２９．ステップ（ｂ）で使用されるレンチウイルスベクター核酸のプローブが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＲ領域及びＵ５領域に特異的にハイブリダイズする、段落２４に記載の方法。
３０．組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズするプローブが、配列番号３、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１６の核酸配列を含む、段落２３～２５のいずれか１つに記載の方法。
３１．組換えベクター核酸の形質導入効率を監視するための方法であって、
ａ）組換えベクター核酸によって形質導入されたゲノムＤＮＡを含有する１つ以上の生体試料を提供することであって、組換えベクター核酸の一部分が、ゲノムＤＮＡに統合される、を提供することと、
ｂ）段落１～３０のいずれか１つに記載の方法に従って、宿主細胞ゲノムに統合された組換えベクター核酸を定量化することと、を含む、方法。
３２．ステップ（ｃ）が、生体試料の統合された組換えベクター配列コピー数を参照ポリヌクレオチド配列と比較することを更に含む、段落１～３０のいずれか１つに記載の方法。
３３．参照ポリヌクレオチド配列が、ハウスキーピングタンパク質をコードする、段落３２に記載の方法。
３４．ハウスキーピングタンパク質が、ヒトアルブミンである、段落３３に記載の方法。
３５．参照ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅する少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを更に含む、段落１～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．生体試料の統合された組換えベクター配列コピー数を参照と比較することを更に含む、段落３１に記載の方法。
３７．組換えベクターによって形質導入された細胞製品についてのロットリリース試験の方法であって、
ａ）各ロットから、組換えベクターによって形質導入されたゲノムＤＮＡを含有する細胞製品の１つ以上の生体試料を提供することと、
ｂ）段落１～３５のいずれか１つに記載の方法に従って、各生体試料における、宿主細胞ゲノムに統合された組換えベクター核酸を定量化することと、
ｃ）ステップ（ｂ）で定量化された生体試料の統合された組換えベクター配列コピー数を、参照と比較することと、
ｄ）統合された組換えベクター配列コピー数が、所定の基準に合格するロットをリリースすることと、を含む、方法。
３８．細胞ゲノムへのレンチウイルスベクター核酸の統合を定量化する方法であって、方法が、
（ａ）宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供することと、
（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量的増幅技法を用いて、生体試料のゲノムＤＮＡを増幅することであって、プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする、を増幅することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を通じて増幅されたゲノム核酸を定量化することであって、宿主細胞ゲノムに統合されたレンチウイルスベクター核酸を定量化することが、参照に対する増幅されたレンチウイルスベクター核酸の比を比較することを含む、定量化することと、を含み、
オリゴヌクレオチドプライマー対が、それぞれ配列番号１の核酸配列及び配列番号２の核酸配列、又はそれぞれ配列番号５の核酸配列及び配列番号６の核酸配列、又はそれぞれ配列番号１４の核酸配列及び配列番号１５の核酸配列を含む、方法。
３９．ステップ（ｂ）が、インターカレート色素を利用する、段落１～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．インターカレート色素が、ＳＹＢＲグリーンである、段落３９に記載の方法。
４１．統合された組換えベクター配列コピー数及び参照ポリヌクレオチド配列コピー数が、マルチプレックスで測定される、段落３２～３５のいずれか１つに記載の方法。
４２．統合された組換えベクター配列コピー数及び参照ポリヌクレオチド配列コピー数が、シングルプレックスで測定される、段落３２～３５のいずれか１つに記載の方法。
４３．キメラ抗原受容体が、配列番号１８、２０、又は２２のアミノ酸配列を含む、段落３に記載の方法。
４４．キメラ抗原受容体が、ＢＣＭＡ、ＫＬＫ２、又はＧＰＲＣ５Ｄを認識する、段落３に記載の方法。
４５．導入遺伝子の同定のための方法を更に含む、段落２に記載の方法。
４６．導入遺伝子の同定のための方法が、
（ａ）宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供することと、
（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量的増幅技法を用いて、生体試料のゲノムＤＮＡを増幅することであって、プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、導入遺伝子に特異的にハイブリダイズする、を増幅することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を通じて増幅されたゲノム核酸を検出及び／又は定量化することと、を含む、段落４５に記載の方法。
４７．以下からなる群から選択される１つ以上のアッセイ許容基準を評価することによって、組換えベクター核酸の統合を定量化するためのアッセイの確実性を評価することを更に含む、段落３２～３５のいずれか１つに記載の方法：
（ａ）テンプレートＤＮＡを含有しない対照の全ての複製物における、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の閾値サイクルが、決定不可能であること、
（ｂ）標準試料を使用する線形回帰によって生成された、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の標準曲線の相関係数が、０．９７以上であること、
（ｃ）当該標準曲線の勾配からの、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の推定コピー値が、９０％～１１０％のＰＣＲ効率を示すこと、
（ｄ）標準試料のうちのいずれかの複製物のうちのいずれにおいても、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の閾値サイクルが、決定不可能でないこと、
（ｅ）塩基標準試料における、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の平均閾値サイクルが、２２．０以下であること、
（ｆ）各標準試料における、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の閾値サイクルの標準偏差が、０．６０以下であること、
（ｇ）１つ以上の陽性対照試料の参照ポリヌクレオチド配列の平均測定コピーが、公称予想値の３０％以内であること、
（ｈ）１つ以上の陽性対照試料の測定された平均ＶＣＮ／細胞値が、各対照の公称予想ＶＣＮ／細胞値の３０％以内であること、並びに
（ｉ）１つ以上の陽性対照試料のＶＣＮ／細胞値の変動係数が、２０％以下であること。
４８．以下からなる群から選択される１つ以上の試料許容基準を評価することによって、試料の組換えベクター核酸の統合の定量化の確実性を評価することを更に含む、段落３２～３５のいずれか１つに記載の方法：
（ａ）試料における参照ポリヌクレオチド配列の平均コピー値が、３０，３０３．０３０コピーの予想値の３０％以内であること、
（ｂ）試料が０．０２μｇ／μＬ未満のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）濃度を有する場合、その試料の参照ポリヌクレオチド配列の予想コピーが、反応に実際に充填されたＤＮＡの量から計算されること、
（ｃ）試料における平均標的プロウイルスコピー値が、アッセイのコピー値の検証された範囲の間であること、
（ｄ）試料における平均標的プロウイルスコピー値が、１２１，２１２．１２１～１９３．９３９コピーであること、
（ｅ）標的試料の複製物のＶＣＮ／細胞値の変動係数が、２０％以下であること、並びに、
（ｆ）試料における、標的プロウイルス及び標的参照ポリヌクレオチド配列の両方のサイクル閾値の標準偏差が、０．６０以下であること。
４９．キメラ抗原受容体が、配列番号１９又は２１の配列を含む核酸配列によってコードされたポリペプチドである、段落４３又は４４に記載の方法。
５０．導入遺伝子が、配列番号１９又は２１の配列を含む核酸配列によってコードされたポリペプチドである、段落４５又は４６に記載の方法。
５１．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６の核酸配列を含む、オリゴヌクレオチド。
５２．統合された組換えベクター核酸配列コピー数を測定するためのキットであって、
統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズするプライマー対のプライマーであって、プライマー対が、統合された組換えベクター核酸の一部分を特異的に増幅する、プライマーと、
増幅された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする検出可能な核酸プローブと、を含む、キット。
５３．統合された組換えベクター核酸配列コピー数を測定するためのキットであって、
統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする、配列番号１、配列番号５、又は配列番号１４の核酸配列を含む順方向プライマーと、
統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする、配列番号２、配列番号６、又は配列番号１５の核酸配列を含む逆方向プライマーと、
配列番号３、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１６の核酸配列を含む、検出可能なプローブと、を含む、キット。
１．細胞ゲノムへの組換えベクター核酸の統合を定量化するための方法であって、方法が、
（ａ）宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供することと、
（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量的増幅技法を用いて、生体試料のゲノムＤＮＡを増幅することであって、プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、統合された組換えベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする、増幅することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を通じて増幅されたゲノム核酸を検出及び／又は定量化することと、を含む、方法。
２．組換えベクターが、導入遺伝子を含有する、段落１に記載の方法。
３．導入遺伝子が、キメラ抗原受容体をコードする、段落２に記載の方法。
４．組換えベクターが、遺伝子療法ベクターである、段落１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．遺伝子療法ベクターが、ウイルスベクターである、段落４に記載の方法。
６．生体試料が、細胞試料又は組織試料である、段落１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．組織試料が、血液、血漿、血清、唾液、又は組織生検である、段落６に記載の方法。
８．試料が、対象からのものである、段落１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．対象が、ヒトである、段落８に記載の方法。
１０．組換えベクターが、レトロウイルスベクターである、段落１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、段落１０に記載の方法。
１２．レンチウイルスベクターが基づくレンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、又はヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）である、段落１１に記載の方法。
１３．統合された組換えベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、統合された組換えベクター配列のＬＴＲ配列に特異的にハイブリダイズする、段落１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．ステップ（ｂ）の統合された組換えベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号１、配列番号５、又は配列番号１４の核酸配列を含む、段落１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．ステップ（ｂ）で使用される組換えベクター核酸を増幅するための第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号２、配列番号６、又は配列番号１５の核酸配列を含む、段落１４に記載の方法。
１６．ステップ（ｂ）で使用される統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ３領域に特異的にハイブリダイズする、段落１１に記載の方法。
１７．ステップ（ｂ）で使用される統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ３領域及びＲ領域に特異的にハイブリダイズする、段落１１に記載の方法。
１８．ステップ（ｂ）で使用される統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする、段落１１に記載の方法。
１９．ステップ（ｂ）で使用される統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルに特異的にハイブリダイズする、段落１１に記載の方法。
２０．定量的増幅技法が、ｑＰＣＲである、段落１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．定量的増幅技法が、ｄＰＣＲ又はｄｄＰＣＲである、段落１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２２．定量的増幅技法が、エンドポイントＰＣＲである、段落１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２３．ステップ（ｂ）が、増幅された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする検出可能な核酸プローブを利用する、段落１～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．組換えベクター核酸が、レンチウイルスベクターである、段落２３に記載の方法。
２５．統合された組換えベクター核酸のプローブが、統合された組換えベクター配列のＬＴＲ配列に特異的にハイブリダイズする、段落２３又は段落２４に記載の方法。
２６．ステップ（ｂ）で使用されるレンチウイルスベクター核酸のプローブが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ３領域及びＲ領域に特異的にハイブリダイズする、段落２４に記載の方法。
２７．ステップ（ｂ）で使用されるレンチウイルスベクター核酸のプローブが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ５領域及びＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする、段落２４に記載の方法。
２８．ステップ（ｂ）で使用されるレンチウイルスベクター核酸のプローブが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする、段落２４に記載の方法
２９．ステップ（ｂ）で使用されるレンチウイルスベクター核酸のプローブが、レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＲ領域及びＵ５領域に特異的にハイブリダイズする、段落２４に記載の方法。
３０．組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズするプローブが、配列番号３、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１６の核酸配列を含む、段落２３～２５のいずれか１つに記載の方法。
３１．組換えベクター核酸の形質導入効率を監視するための方法であって、
ａ）組換えベクター核酸によって形質導入されたゲノムＤＮＡを含有する１つ以上の生体試料を提供することであって、組換えベクター核酸の一部分が、ゲノムＤＮＡに統合される、を提供することと、
ｂ）段落１～３０のいずれか１つに記載の方法に従って、宿主細胞ゲノムに統合された組換えベクター核酸を定量化することと、を含む、方法。
３２．ステップ（ｃ）が、生体試料の統合された組換えベクター配列コピー数を参照ポリヌクレオチド配列と比較することを更に含む、段落１～３０のいずれか１つに記載の方法。
３３．参照ポリヌクレオチド配列が、ハウスキーピングタンパク質をコードする、段落３２に記載の方法。
３４．ハウスキーピングタンパク質が、ヒトアルブミンである、段落３３に記載の方法。
３５．参照ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅する少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを更に含む、段落１～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．生体試料の統合された組換えベクター配列コピー数を参照と比較することを更に含む、段落３１に記載の方法。
３７．組換えベクターによって形質導入された細胞製品についてのロットリリース試験の方法であって、
ａ）各ロットから、組換えベクターによって形質導入されたゲノムＤＮＡを含有する細胞製品の１つ以上の生体試料を提供することと、
ｂ）段落１～３５のいずれか１つに記載の方法に従って、各生体試料における、宿主細胞ゲノムに統合された組換えベクター核酸を定量化することと、
ｃ）ステップ（ｂ）で定量化された生体試料の統合された組換えベクター配列コピー数を、参照と比較することと、
ｄ）統合された組換えベクター配列コピー数が、所定の基準に合格するロットをリリースすることと、を含む、方法。
３８．細胞ゲノムへのレンチウイルスベクター核酸の統合を定量化する方法であって、方法が、
（ａ）宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供することと、
（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量的増幅技法を用いて、生体試料のゲノムＤＮＡを増幅することであって、プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする、を増幅することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を通じて増幅されたゲノム核酸を定量化することであって、宿主細胞ゲノムに統合されたレンチウイルスベクター核酸を定量化することが、参照に対する増幅されたレンチウイルスベクター核酸の比を比較することを含む、定量化することと、を含み、
オリゴヌクレオチドプライマー対が、それぞれ配列番号１の核酸配列及び配列番号２の核酸配列、又はそれぞれ配列番号５の核酸配列及び配列番号６の核酸配列、又はそれぞれ配列番号１４の核酸配列及び配列番号１５の核酸配列を含む、方法。
３９．ステップ（ｂ）が、インターカレート色素を利用する、段落１～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．インターカレート色素が、ＳＹＢＲグリーンである、段落３９に記載の方法。
４１．統合された組換えベクター配列コピー数及び参照ポリヌクレオチド配列コピー数が、マルチプレックスで測定される、段落３２～３５のいずれか１つに記載の方法。
４２．統合された組換えベクター配列コピー数及び参照ポリヌクレオチド配列コピー数が、シングルプレックスで測定される、段落３２～３５のいずれか１つに記載の方法。
４３．キメラ抗原受容体が、配列番号１８、２０、又は２２のアミノ酸配列を含む、段落３に記載の方法。
４４．キメラ抗原受容体が、ＢＣＭＡ、ＫＬＫ２、又はＧＰＲＣ５Ｄを認識する、段落３に記載の方法。
４５．導入遺伝子の同定のための方法を更に含む、段落２に記載の方法。
４６．導入遺伝子の同定のための方法が、
（ａ）宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供することと、
（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量的増幅技法を用いて、生体試料のゲノムＤＮＡを増幅することであって、プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、導入遺伝子に特異的にハイブリダイズする、を増幅することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を通じて増幅されたゲノム核酸を検出及び／又は定量化することと、を含む、段落４５に記載の方法。
４７．以下からなる群から選択される１つ以上のアッセイ許容基準を評価することによって、組換えベクター核酸の統合を定量化するためのアッセイの確実性を評価することを更に含む、段落３２～３５のいずれか１つに記載の方法：
（ａ）テンプレートＤＮＡを含有しない対照の全ての複製物における、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の閾値サイクルが、決定不可能であること、
（ｂ）標準試料を使用する線形回帰によって生成された、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の標準曲線の相関係数が、０．９７以上であること、
（ｃ）当該標準曲線の勾配からの、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の推定コピー値が、９０％～１１０％のＰＣＲ効率を示すこと、
（ｄ）標準試料のうちのいずれかの複製物のうちのいずれにおいても、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の閾値サイクルが、決定不可能でないこと、
（ｅ）塩基標準試料における、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の平均閾値サイクルが、２２．０以下であること、
（ｆ）各標準試料における、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の閾値サイクルの標準偏差が、０．６０以下であること、
（ｇ）１つ以上の陽性対照試料の参照ポリヌクレオチド配列の平均測定コピーが、公称予想値の３０％以内であること、
（ｈ）１つ以上の陽性対照試料の測定された平均ＶＣＮ／細胞値が、各対照の公称予想ＶＣＮ／細胞値の３０％以内であること、並びに
（ｉ）１つ以上の陽性対照試料のＶＣＮ／細胞値の変動係数が、２０％以下であること。
４８．以下からなる群から選択される１つ以上の試料許容基準を評価することによって、試料の組換えベクター核酸の統合の定量化の確実性を評価することを更に含む、段落３２～３５のいずれか１つに記載の方法：
（ａ）試料における参照ポリヌクレオチド配列の平均コピー値が、３０，３０３．０３０コピーの予想値の３０％以内であること、
（ｂ）試料が０．０２μｇ／μＬ未満のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）濃度を有する場合、その試料の参照ポリヌクレオチド配列の予想コピーが、反応に実際に充填されたＤＮＡの量から計算されること、
（ｃ）試料における平均標的プロウイルスコピー値が、アッセイのコピー値の検証された範囲の間であること、
（ｄ）試料における平均標的プロウイルスコピー値が、１２１，２１２．１２１～１９３．９３９コピーであること、
（ｅ）標的試料の複製物のＶＣＮ／細胞値の変動係数が、２０％以下であること、並びに、
（ｆ）試料における、標的プロウイルス及び標的参照ポリヌクレオチド配列の両方のサイクル閾値の標準偏差が、０．６０以下であること。
４９．キメラ抗原受容体が、配列番号１９又は２１の配列を含む核酸配列によってコードされたポリペプチドである、段落４３又は４４に記載の方法。
５０．導入遺伝子が、配列番号１９又は２１の配列を含む核酸配列によってコードされたポリペプチドである、段落４５又は４６に記載の方法。
５１．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６の核酸配列を含む、オリゴヌクレオチド。
５２．統合された組換えベクター核酸配列コピー数を測定するためのキットであって、
統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズするプライマー対のプライマーであって、プライマー対が、統合された組換えベクター核酸の一部分を特異的に増幅する、プライマーと、
増幅された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする検出可能な核酸プローブと、を含む、キット。
５３．統合された組換えベクター核酸配列コピー数を測定するためのキットであって、
統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする、配列番号１、配列番号５、又は配列番号１４の核酸配列を含む順方向プライマーと、
統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする、配列番号２、配列番号６、又は配列番号１５の核酸配列を含む逆方向プライマーと、
配列番号３、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１６の核酸配列を含む、検出可能なプローブと、を含む、キット。
参照による組み込み
本明細書において言及される全ての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において言及される全ての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
主題の開示の特定の実施形態について論じてきたが、上の明細書は例示的であり、限定的ではない。本明細書及び以下の特許請求の範囲を考察すると、本開示の多くの変形が当業者には明らかになるであろう。等価物の全範囲と共に特許請求の範囲、及びそのような変形と共に明細書を参照することによって、本開示の全範囲は決定されるべきである。
Claims (53)
- 細胞ゲノムへの組換えベクター核酸の統合を定量化するための方法であって、前記方法が、
（ａ）宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供することと、
（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量的増幅技法を用いて、前記生体試料のゲノムＤＮＡを増幅することであって、前記プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、統合された組換えベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする、増幅することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を通じて増幅されたゲノム核酸を検出及び／又は定量化することと、を含む、方法。 - 前記組換えベクターが、導入遺伝子を含有する、請求項１に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、キメラ抗原受容体をコードする、請求項２に記載の方法。
- 前記組換えベクターが、遺伝子療法ベクターである、請求項１に記載の方法。
- 前記遺伝子療法ベクターが、ウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。
- 前記組換えベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
- 前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項６に記載の方法。
- 前記レンチウイルスベクターが基づくレンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、又はヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）である、請求項７に記載の方法。
- ステップ（ｂ）の統合された組換えベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号１、配列番号５、又は配列番号１４の核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
- ステップ（ｂ）で使用される前記組換えベクター核酸を増幅するための前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号２、配列番号６、又は配列番号１５の核酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
- 前記生体試料が、細胞試料又は組織試料である、請求項１に記載の方法。
- 前記組織試料が、血液、血漿、血清、唾液、又は組織生検である、請求項１１に記載の方法。
- 統合された組換えベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記統合された組換えベクター配列のＬＴＲ配列に特異的にハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
- ステップ（ｂ）で使用される統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ３領域に特異的にハイブリダイズする、請求項７に記載の方法。
- ステップ（ｂ）で使用される統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ３領域及びＲ領域に特異的にハイブリダイズする、請求項７に記載の方法。
- ステップ（ｂ）で使用される統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする、請求項７に記載の方法。
- ステップ（ｃ）が、前記生体試料の統合された組換えベクター配列コピー数を参照ポリヌクレオチド配列と比較することを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 前記定量的増幅技法が、ｑＰＣＲである、請求項１に記載の方法。
- 前記定量的増幅技法が、ｄＰＣＲ又はｄｄＰＣＲである、請求項１に記載の方法。
- 前記参照ポリヌクレオチド配列が、ハウスキーピングタンパク質をコードする、請求項１７に記載の方法。
- 前記ハウスキーピングタンパク質が、ヒトアルブミンである、請求項２０に記載の方法。
- ステップ（ｂ）が、前記増幅された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする検出可能な核酸プローブを利用する、請求項１に記載の方法。
- 前記組換えベクター核酸が、レンチウイルスベクターである、請求項２２に記載の方法。
- 前記組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする前記プローブが、配列番号３、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１６の核酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
- 前記統合された組換えベクター核酸の前記プローブが、前記統合された組換えベクター配列のＬＴＲ配列に特異的にハイブリダイズする、請求項２２に記載の方法。
- ステップ（ｂ）で使用される前記レンチウイルスベクター核酸の前記プローブが、前記レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ３領域及びＲ領域に特異的にハイブリダイズする、請求項２３に記載の方法。
- ステップ（ｂ）で使用される前記レンチウイルスベクター核酸の前記プローブが、前記レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＵ５領域及びＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする、請求項２３に記載の方法。
- ステップ（ｂ）で使用される前記レンチウイルスベクター核酸の前記プローブが、前記レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＰＢＳ領域に特異的にハイブリダイズする、請求項２３に記載の方法。
- ステップ（ｂ）で使用される前記統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチドプライマーが、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルに特異的にハイブリダイズする、請求項７に記載の方法。
- ステップ（ｂ）で使用される前記レンチウイルスベクター核酸の前記プローブが、前記レンチウイルスベクター核酸配列の５’ＬＴＲのＲ領域及びＵ５領域に特異的にハイブリダイズする、請求項２３に記載の方法。
- 前記生体試料が、対象からのものである、請求項１に記載の方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項３１に記載の方法。
- 参照ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅する少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 組換えベクター核酸の形質導入効率を監視するための方法であって、
ａ）組換えベクター核酸によって形質導入されたゲノムＤＮＡを含有する１つ以上の生体試料を提供することであって、前記組換えベクター核酸の一部分が、前記ゲノムＤＮＡに統合される、を提供することと、
ｂ）請求項１に記載の方法に従って、前記宿主細胞ゲノムに統合された前記組換えベクター核酸を定量化することと、を含む、方法。 - 前記生体試料の統合された組換えベクター配列コピー数を参照と比較することを更に含む、請求項３４に記載の方法。
- 組換えベクターによって形質導入された細胞製品についてのロットリリース試験の方法であって、
ａ）各ロットから、組換えベクターによって形質導入されたゲノムＤＮＡを含有する細胞製品の１つ以上の生体試料を提供することと、
ｂ）請求項１に記載の方法に従って、各生体試料における、前記宿主細胞ゲノムに統合された前記組換えベクター核酸を定量化することと、
ｃ）ステップ（ｂ）で定量化された前記生体試料の統合された組換えベクター配列コピー数を、参照と比較することと、
ｄ）前記統合された組換えベクター配列コピー数が、所定の基準に合格するロットをリリースすることと、を含む、方法。 - 細胞ゲノムへのレンチウイルスベクター核酸の統合を定量化する方法であって、前記方法が、
（ａ）宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供することと、
（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量的増幅技法を用いて、前記生体試料のゲノムＤＮＡを増幅することであって、前記プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、統合されたレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする、増幅することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を通じて増幅されたゲノム核酸を定量化することであって、前記宿主細胞ゲノムに統合された前記レンチウイルスベクター核酸を定量化することが、参照に対する増幅されたレンチウイルスベクター核酸の比を比較することを含む、定量化することと、を含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマー対が、それぞれ配列番号１の核酸配列及び配列番号２の核酸配列、又はそれぞれ配列番号５の核酸配列及び配列番号６の核酸配列、又はそれぞれ配列番号１４の核酸配列及び配列番号１５の核酸配列を含む、方法。 - 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６の核酸配列を含む、オリゴヌクレオチド。
- 統合された組換えベクター核酸配列コピー数を測定するためのキットであって、
統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズするプライマー対のプライマーであって、前記プライマー対が、前記統合された組換えベクター核酸の一部分を特異的に増幅する、プライマーと、
前記増幅された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする検出可能な核酸プローブと、を含む、キット。 - 統合された組換えベクター核酸配列コピー数を測定するためのキットであって、
配列番号１、配列番号５、又は配列番号１４の核酸配列を含み、統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする、順方向プライマーと、
配列番号２、配列番号６、又は配列番号１５の核酸配列を含み、統合された組換えベクター核酸に特異的にハイブリダイズする、逆方向プライマーと、
配列番号３、配列番号４、配列番号７、又は配列番号１６の核酸配列を含む、検出可能なプローブと、を含む、キット。 - 前記キメラ抗原受容体が、配列番号１８、２０、又は２２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
- 前記キメラ抗原受容体が、ＢＣＭＡ、ＫＬＫ２、又はＧＰＲＣ５Ｄを認識する、請求項３に記載の方法。
- 前記定量的増幅技法が、エンドポイントＰＣＲである、請求項１に記載の方法。
- ステップ（ｂ）が、インターカレート色素を利用する、請求項１に記載の方法。
- 前記インターカレート色素が、ＳＹＢＲグリーンである、請求項４４に記載の方法。
- 前記統合された組換えベクター配列コピー数及び前記参照ポリヌクレオチド配列コピー数が、マルチプレックスで測定される、請求項１７に記載の方法。
- 前記統合された組換えベクター配列コピー数及び前記参照ポリヌクレオチド配列コピー数が、シングルプレックスで測定される、請求項１７に記載の方法。
- 前記導入遺伝子の同定のための方法を更に含む、請求項２に記載の方法。
- 前記導入遺伝子の同定のための前記方法が、
（ａ）宿主細胞ゲノムを含む生体試料を提供することと、
（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を使用する定量的増幅技法を用いて、前記生体試料のゲノムＤＮＡを増幅することであって、前記プライマー対のうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、前記導入遺伝子に特異的にハイブリダイズする、を増幅することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を通じて増幅された前記ゲノム核酸を検出及び／又は定量化することと、を含む、請求項４８に記載の方法。 - 以下からなる群から選択される１つ以上のアッセイ許容基準を評価することによって、組換えベクター核酸の前記統合を定量化するためのアッセイの確実性を評価することを更に含む、請求項１７に記載の方法：
（ａ）テンプレートＤＮＡを含有しない対照の全ての複製物における、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の両方の閾値サイクルが、決定不可能であること、
（ｂ）標準試料を使用する線形回帰によって生成された、前記プロウイルス及び前記参照ポリヌクレオチド配列の両方の標準曲線の相関係数が、０．９７以上であること、
（ｃ）前記標準曲線の勾配からの、プロウイルス及び参照ポリヌクレオチド配列の推定コピー値が、９０％～１１０％のＰＣＲ効率を示すこと、
（ｄ）前記標準試料のうちのいずれかの複製物のうちのいずれにおいても、前記プロウイルス及び前記参照ポリヌクレオチド配列の両方の前記閾値サイクルが、決定不可能でないこと、
（ｅ）塩基標準試料における、前記プロウイルス及び前記参照ポリヌクレオチド配列の両方の平均閾値サイクルが、２２．０以下であること、
（ｆ）各標準試料における、前記プロウイルス及び前記参照ポリヌクレオチド配列の両方の前記閾値サイクルの標準偏差が、０．６０以下であること、
（ｇ）１つ以上の陽性対照試料の前記参照ポリヌクレオチド配列の平均測定コピーが、公称予想値の３０％以内であること、
（ｈ）前記１つ以上の陽性対照試料の測定された平均ＶＣＮ／細胞値が、各対照の公称予想ＶＣＮ／細胞値の３０％以内であること、並びに
（ｉ）前記１つ以上の陽性対照試料の前記ＶＣＮ／細胞値の変動係数が、２０％以下であること。 - 以下からなる群から選択される１つ以上の試料許容基準を評価することによって、試料の組換えベクター核酸の統合の定量化の前記確実性を評価することを更に含む、請求項１７に記載の方法：
（ａ）前記試料における前記参照ポリヌクレオチド配列の平均コピー値が、３０，３０３．０３０コピーの予想値の３０％以内であること、
（ｂ）前記試料が０．０２μｇ／μＬ未満のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）濃度を有する場合、その試料の前記参照ポリヌクレオチド配列の予想コピーが、反応に実際に充填されたＤＮＡの量から計算されること、
（ｃ）前記試料における平均標的プロウイルスコピー値が、前記アッセイの前記コピー値の検証された範囲の間であること、
（ｄ）前記試料における平均標的プロウイルスコピー値が、１２１，２１２．１２１～１９３．９３９コピーであること、
（ｅ）前記標的試料の前記複製物の前記ＶＣＮ／細胞値の変動係数が、２０％以下であること、並びに、
（ｆ）前記試料における、前記標的プロウイルス及び標的参照ポリヌクレオチド配列の両方の前記サイクル閾値の標準偏差が、０．６０以下であること。 - 前記キメラ抗原受容体が、配列番号１９又は２１の配列を含む核酸配列によってコードされたポリペプチドである、請求項４１に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、配列番号１９又は２１の配列を含む核酸配列によってコードされたポリペプチドである、請求項４８に記載の方法。
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