CN115768899A - 用于定量重组载体核酸整合的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

在某些方面，本公开涉及定量重组载体核酸整合到靶细胞基因组中的方法。本公开还提供了用于执行该定量的包括特定引物和探针的组合物和试剂盒。

Description

用于定量重组载体核酸整合的组合物和方法

相关申请

本申请要求于2020年3月9日提交的美国临时专利申请62/987019和2021年2月11日提交的美国临时专利申请63/148300的权益，这些专利申请据此全文以引用方式并入本文。

序列表

本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII拷贝创建于2021年2月24日，命名为PRD4079WOPCT1_SL.txt，并且大小为21,861字节。

背景技术

在理解基因组材料的递送和整合到靶细胞基因组中的最新进展具有改变各种疾病的护理标准的巨大潜力。嵌合抗原受体(“CAR”)T细胞疗法已经显示出治疗B细胞恶性肿瘤和其他癌症诸如淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、肉瘤、神经母细胞瘤和某些实体瘤癌症的潜力(参见例如，Sadelain等人，Cancer Discovery，第3卷：第388-398页，2013年，以及Titov等人，Cancer，第12卷：第125-146页，2020年)，并且通常涉及在体外修饰T细胞以产生表达CAR的T细胞。大多数工程化用于人类应用的T细胞基因操作方法都使用逆转录病毒，诸如慢病毒，用于嵌合抗原受体(CAR)的稳定表达(Jena等人，2010年；Ertl等人，2011年；Kohn等人，2011年)。然而，目前使用病毒载体递送的整合技术的挑战之一是确定载体是否不仅已经进入细胞，而且确定转基因是否成功整合到宿主基因组中(称为“病毒整合”的过程)以及整合的次数(或病毒整合的频率)。

Southern印迹最初是测量逆转录病毒载体序列拷贝数整合的优选技术，但由于需要手工劳动，因此速度慢且成本高。最近，研究人员已经开发了定量PCR(“qPCR”)方法以确定转导效率和拷贝数。一些方法无法区分自由的未掺入的载体和整合的载体，因此只是对拷贝数的估计。参见例如Charrier等人，Gene Therapy，第18卷：第479-487页，2011年。一些其他方法使用特定于特定转基因的引物。参见Hum.Gene Ther.，第14卷：第497-507页，2003年。然而，这些方法要么无法产生精确的拷贝数，要么由于需要为每个转基因设计不同的特异性引物而成本高昂。

发明内容

本公开提供了定量重组载体核酸(通常包括转基因)整合到靶细胞基因组中的方法，这些方法不受任何特定转基因的限制或特定于任何特定转基因。本公开还提供了用于执行该定量的包括特定引物和探针的组合物和试剂盒。

在一个方面，本公开提供了一种定量重组载体核酸整合到细胞基因组中的方法，该方法包括：(a)提供包含宿主细胞基因组的生物样品；(b)使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对用定量扩增技术扩增生物样品的基因组DNA，其中该引物对的至少一个寡核苷酸引物与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交；以及(c)定量通过步骤(b)扩增的基因组核酸。

在一些实施方案中，定量包括确定拷贝数。在一些实施方案中，定量扩增技术是定量PCR。在一些实施方案中，定量扩增技术是数字PCR。在一些实施方案中，定量扩增技术是微滴式数字PCR。在一些实施方案中，定量扩增技术是终点PCR。

在某些实施方案中，定量重组载体核酸在宿主细胞基因组中的整合进一步包括将生物样品的整合的重组载体序列拷贝数与参考多核苷酸序列进行比较。在一些实施方案中，参考多核苷酸序列编码管家蛋白。在一些实施方案中，管家蛋白是白蛋白。在一些实施方案中，以多重方式测量整合的重组载体序列拷贝数和参考多核苷酸序列拷贝数。在一些实施方案中，以单重方式测量整合的重组载体序列拷贝数和参考多核苷酸序列拷贝数。

在一些实施方案中，该方法进一步包括通过评估选自由以下项组成的组的一个或多个测定接受标准来评价用于定量重组载体核酸整合的测定的有效性：(a)在不含模板DNA的对照的所有复制品中，前病毒和参考多核苷酸序列两者的阈值循环是无法确定的；(b)使用标准样品通过线性回归生成的前病毒和参考多核苷酸序列两者的标准曲线的相关系数大于或等于0.97；(c)从所述标准曲线的斜率估计的前病毒和参考多核苷酸序列的拷贝值表明PCR效率介于90％和110％之间；(d)在标准样品中的任一者的复制品中，前病毒和参考多核苷酸序列两者没有一个的阈值循环是无法确定的；(e)基础标准样品中前病毒和参考多核苷酸序列两者的平均阈值循环小于或等于22.0；(f)每个标准样品中的前病毒和参考多核苷酸序列两者的阈值循环中的标准偏差小于或等于0.60；(g)该一个或多个阳性对照样品的参考多核苷酸序列的平均测量拷贝在标称预期值的30％内；(h)该一个或多个阳性对照样品的所测量的平均VCN/细胞值在每个对照的标称预期VCN/细胞值的30％内；以及(i)该一个或多个阳性对照样品的VCN/细胞值的变异系数小于或等于20％。

在一些实施方案中，该方法进一步包括通过评估选自由以下项组成的组的一个或多个样品接受标准来评价对于样品定量重组载体核酸整合的有效性：(a)样品中参考多核苷酸序列的平均拷贝值在30,303.030拷贝的预期值的30％内；(b)如果样品的基因组DNA(gDNA)浓度低于0.02μg/μL，则该样品的参考多核苷酸序列的预期拷贝根据实际加载到反应中的DNA量计算；(c)样品中的平均靶前病毒拷贝值介于测定的拷贝值的验证范围之间；(d)样品中的平均靶前病毒拷贝值介于121,212.121和193.939拷贝之间；(e)靶样品复制品的VCN/细胞值的变异系数小于或等于20％；以及(f)样品中的靶前病毒和靶参考多核苷酸序列两者的循环阈值中的标准偏差小于或等于0.60。

在一些实施方案中，重组载体包含转基因。在一些实施方案中，重组载体是基因疗法载体。在一些实施方案中，重组载体是病毒载体。在一些实施方案中，重组载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，重组载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体所基于的慢病毒是人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)或人类免疫缺陷病毒2(HIV-2)。

在一些实施方案中，定量重组载体核酸整合到细胞基因组的方法进一步包括用于鉴定转基因的方法。在一些实施方案中，用于鉴定转基因的方法包括：(a)提供包含宿主细胞基因组的生物样品；(b)使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对用定量扩增技术扩增生物样品的基因组DNA，其中该引物对的至少一个寡核苷酸引物与转基因特异性杂交；以及(c)检测和/或定量通过步骤(b)扩增的基因组核酸。在一些实施方案中，转基因是由包含SEQ ID NO:19或21的序列的核酸序列编码的多肽。

在一些实施方案中，与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸引物包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些实施方案中，用于扩增重组载体核酸的第二寡核苷酸引物包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15的核酸序列。

在一些实施方案中，与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸引物与整合的重组载体序列的LTR序列特异性杂交。在一些实施方案中，与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸引物与慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U3区特异性杂交。在一些实施方案中，与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸引物与慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U3区和R区特异性杂交。在一些实施方案中，与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸引物与慢病毒载体核酸序列的5'LTR的PBS区特异性杂交。在一些实施方案中，与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸引物与psi(Ψ)包装信号特异性杂交。在某些实施方案中，引物不会与天然存在的逆转录病毒核酸序列特异性杂交。

在一些实施方案中，该方法利用与所述扩增的重组载体核酸特异性杂交的可检测核酸探针。在一些实施方案中，与重组载体核酸特异性杂交的探针包含SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16的核酸序列。在一些实施方案中，用于整合的重组载体核酸的探针与整合的重组载体核酸的LTR序列特异性杂交。在一些实施方案中，用于步骤(b)中使用的用于慢病毒载体核酸的探针与慢病毒的5'LTR的U3区和R区特异性杂交。在一些实施方案中，用于步骤(b)中使用的用于慢病毒载体核酸的探针与慢病毒的5'LTR的U5区和PBS区特异性杂交。在一些实施方案中，用于步骤(b)中使用的用于慢病毒载体核酸的探针与慢病毒的5'LTR的PBS区特异性杂交。在一些实施方案中，用于步骤(b)中使用的用于慢病毒载体核酸的探针与慢病毒载体核酸序列的5'LTR的R区和U5区特异性杂交。在某些实施方案中，步骤(b)利用嵌入染料。在一些实施方案中，嵌入染料是SYBR绿。

在一些实施方案中，生物样品是细胞样品或组织样品。具体地，在一些实施方案中，组织样品是血液、血浆、血清、唾液或组织活检。在一些实施方案中，样品来自受试者。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，重组载体核酸序列包含转基因。在一些实施方案中，转基因编码嵌合抗原受体。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是由包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的序列的核酸序列编码的多肽。在一些实施方案中，嵌合抗原受体识别BCMA、KLK2或GPRC5D。

在一些实施方案中，该方法进一步包括利用特异性扩增参考多核苷酸序列的至少一对寡核苷酸引物。

在另一方面，本公开提供了一种用于监测重组载体核酸的转导效率的方法，该方法包括：a)提供由重组载体核酸转导的包含基因组DNA的一种或多种生物样品，其中重组载体核酸的一部分被整合到基因组DNA中；以及b)根据本公开的方法定量整合在宿主细胞基因组中的重组载体核酸。在一些实施方案中，该方法进一步包括将生物样品的重组载体序列拷贝数与参考进行比较。

在又一方面，本公开提供了一种对由重组载体转导的细胞产物进行批释放测试的方法，该方法包括：a)提供来自每批的由重组载体转导的包含基因组DNA的细胞产物的一个或多个生物样品；b)根据本公开的方法定量每个生物样品中整合在宿主细胞基因组中的重组载体核酸；c)将步骤(b)中针对生物样品定量的整合的重组载体序列拷贝数与参考进行比较；以及d)释放其中整合的重组载体序列拷贝数通过预先确定的标准的批。

在另一方面，本公开提供了一种定量逆转录病毒载体核酸整合到细胞基因组中的方法，该方法包括：(a)提供包含宿主细胞基因组的生物样品；(b)使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对用定量扩增技术扩增生物样品的基因组DNA，其中该引物对的至少一个寡核苷酸引物与整合的逆转录病毒载体多核苷酸序列特异性杂交；以及(c)定量通过步骤(b)扩增的基因组核酸，其中定量逆转录病毒载体核酸整合到宿主细胞基因组包括将扩增的逆转录病毒载体核酸与参考的比率进行比较，其中逆转录病毒载体核酸是慢病毒载体序列，并且其中寡核苷酸引物对分别包含SEQ ID NO:1的核酸序列和SEQ IDNO:2的核酸序列，或分别包含SEQ ID NO:5的核酸序列和SEQ ID NO:6的核酸序列，或分别包含SEQ ID NO:14的核酸序列和SEQ ID NO:15的核酸序列。在某些实施方案中，定量使用包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16的核酸序列的可检测探针。在另一方面，本公开提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16的核酸序列。

在另一方面，本公开提供了一种用于测量整合的重组载体核酸序列拷贝数的试剂盒，该试剂盒包括：引物对的引物，该引物对的引物与整合的重组载体核酸特异性杂交，其中该引物对特异性扩增整合的重组载体核酸的一部分；和可检测核酸探针，该可检测核酸探针与所述扩增的重组载体核酸特异性杂交。

在另一方面，本公开提供了一种用于测量整合的重组载体核酸序列拷贝数的试剂盒，该试剂盒包括：正向引物，该正向引物与包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:14的核酸序列的整合的重组载体核酸特异性杂交；反向引物，该反向引物与包含SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15的核酸序列的整合的重组载体核酸特异性杂交；和可检测探针，该可检测探针包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16的核酸序列。

本公开涵盖前述方面和实施方案中任一者的所有组合，以及与详细描述和实施例中阐述的实施方案中的任一者的组合。

附图说明

出于示出本发明的目的，附图中描绘的是本公开的某些实施方案。然而，本公开不限于附图中描绘的实施方案的精确布置和手段。

图1A示出了包含编码嵌合抗原受体(CAR)的转基因的示例性慢病毒载体转移质粒。图1B描绘了在将所述载体的一部分整合到靶细胞中以及整合的转基因在细胞表面的表达后的细胞。如图1A中所描绘的，慢病毒载体转基因编码侧接5'-LTR(位点C)和3'-LTR(位点D)的CAR。如图1B中所描绘的，当将慢病毒载体掺入细胞的基因组中时，5'-LTR区(位点A)的一部分已被3'-LTR序列的ΔU3部分替换。矩形黑框指示示例性引物和/或探针结合位点，并且“X”指示缺乏引物结合位点以产生可定量扩增子。整合的5'-LTR(位点a)具有ΔU3位点，而转移质粒5'-LTR(位点C)没有。

图2示出了本公开的所选引物和探针与示例性慢病毒载体序列的比对。描绘了以下序列：示例慢病毒载体序列(SEQ ID NO:13)；5LTR_对1和2_F引物(SEQ ID NO:1)；5LTR_对1_探针(SEQ ID NO:3)；5LTR_对1和2_R引物(SEQ ID NO:2)；5LTR_对2_探针(SEQ ID NO:4)；5LTR_对3_F引物(SEQ ID NO:5)；5LTR_对3_探针(SEQ ID NO:7)；5LTR_对3_R引物(SEQID NO:6)、5LTR_对4_F引物(SEQ ID NO:14)；5LTR_对4_R引物(SEQ ID NO:15)；5LTR_对4_探针(SEQ ID NO:16)。

图3A至图3B示出了血液中并排的qPCR(3A)与流式细胞术(3B)GPRc5d CAR-T的定量结果。

具体实施方式

概述

本发明提供了一种用于检测和/或定量重组载体核酸整合并且因此检测和/或定量递送到宿主细胞的基因组中的转基因的方法。需要对转导细胞诸如CAR-T细胞中重组载体递送的转基因序列进行特异性检测和/或定量。为此，发明人已经开发了一种用于检测和/或定量编码转基因的重组载体核酸(诸如CAR)整合但不检测和/或定量用于递送转基因或未整合的重组载体核酸序列的残留质粒的方法。鉴定载体是否已经成功地掺入到具有转基因独立序列的细胞中的能力允许使用定量PCR、数字PCR或其他定量方法进行更准确、通用和更便宜的定量。本公开提供了利用5'-LTR在整合到宿主基因组后相对于转移质粒载体中的5'-LTR序列的变化的方法和试剂盒，以鉴定和定量经由重组载体递送和掺入的遗传信息。包括拷贝数的这种信息对于理解和优化转染或转导的条件至关重要。本发明的方法有利于了监测慢病毒载体的转导效率和体内表征。因此，本公开提供了用于定量重组载体核酸整合到靶细胞基因组中的改善方法。尽管本文所述的示例性实施方案涉及对整合的逆转录病毒载体核酸进行检测，但是本发明的方法可应用于任何重组核酸载体序列，该序列在整合到宿主基因组中时可与未整合的核酸区分开来。

在整篇本申请中，引用了各种文件。这些文件的全部公开内容在此通过引用方式并入本申请。

本文除非另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、病毒学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学结合使用的命名法以及它们的技术是本领域众所周知且常用的那些。本文所述的本发明的每个实施方案可单独或与本发明的一个或多个其他实施方案组合使用。

除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法进行，并且如在本说明书中引用和论述的各种通用和更具体的参考文献中所述。除非另有说明，否则通常根据本领域众所周知的分子生物学、细胞生物学、生物化学、微阵列和测序技术的方法进行各种实施方案的方法和技术，并且如在本说明书中引用和论述的各种通用和更具体的参考文献中所述。参见例如Motulsky，“Intuitive Biostatistics”，OxfordUniversity Press,Inc.，1995年；Sambrook等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989年；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates，1992年，并且2003年增刊；Harlow和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1990年；Coffin等人，Retroviruses，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1997年；Bast等人，Cancer Medicine，第5版，Frei、Emil编辑，BC Decker Inc.，Hamilton，Canada，2000年；Lodish等人，Molecular Cell Biology，第4版，W.H.Freeman&Co.，NewYork，2000年；Griffiths等人，Introduction to Genetic Analysis，第7版，W.H.Freeman&Co.，New York，1999年；Gilbert等人，Developmental Biology，第6版，SinauerAssociates,Inc.，Sunderland，MA，2000年；以及Cooper，The Cell A MolecularApproach，第2版，Sinauer Associates,Inc.，Sunderland，MA，2000年。

本文使用的化学术语根据本领域的常规用法使用，如通过“McGraw-Hill化学术语词典”(Parker S.编辑，McGraw-Hill，San Francisco，C.A.，1985年)所例示。

本申请中提及的所有以上和任何其他出版物、专利和公开的专利申请均通过引用方式并入本文。若有矛盾，应以本说明书及其明确定义为准。

定义

如本文所用，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用。它们是指任何长度、DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、DNA-RNA杂交体以及它们的类似物的聚合形式的核苷酸。核酸分子可以是核苷酸、寡核苷酸、双链DNA、单链DNA、多链DNA、互补DNA、基因组DNA、非编码DNA、信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、小干扰RNA(siRNA)、异质核RNA(hnRNA)或小发夹RNA(shRNA)。在某些实施方案中，可对核酸样品诸如DNA或RNA(例如基因组DNA)执行这些方法。

多核苷酸可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则可在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。可进一步修饰多核苷酸，诸如通过与标记组分缀合。术语“重组”多核苷酸是指基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，其在自然界中不存在或以非天然排列与另一多核苷酸连接。多核苷酸可与“表达控制序列”可操作地连接，该表达控制序列是指调节基因表达的核苷酸序列。

术语“内源性”是指蛋白质、核酸、细胞或源自受试者体内来源的另一分子。

术语“外源性”是指蛋白质、核酸、细胞或源自受试者体外来源的另一分子。外源性分子的非限制性示例包括：重组蛋白、质粒、病毒、来自供体受试者的细胞、来自供体受试者的组织、来自供体受试者的器官或合成化学品。

在本说明书全篇，词语“包括”或诸如“包含”或“含有”的变型形式将被理解为暗示包括所陈述的整数或者整数的组，但不排除任何其他整数或者整数的组。

此外，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代。

术语“包括”用于意指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。

“受试者”或“个体”可互换使用，并且是指任何动物，诸如狗、猫、鸟、牲畜，并且特别是哺乳动物，并且优选地是人。

术语“重组载体核酸”是指包含用于递送核酸的载体的核酸序列，与天然存在的序列相比该核酸序列包括至少一种修饰，并且可包含编码将在转导细胞基因组中表达的外源性蛋白质的转基因。

术语“逆转录病毒载体核酸”是指作为逆转录病毒载体的至少一部分的核酸序列，与天然存在的逆转录病毒序列相比该核酸序列包括至少一种修饰，并且可包含编码将在转导细胞的基因组中表达的外源性蛋白质的转基因，例如慢病毒载体转移质粒的一部分。“逆转录病毒载体核酸序列”不包含与逆转录病毒载体不相关的天然存在的逆转录病毒核酸。已经整合到宿主细胞基因组中的逆转录病毒载体核酸有时被称为“前病毒核酸”。

术语“逆转录病毒载体”是指含有主要衍生自逆转录病毒的结构和功能性遗传元件的载体。

如本文所用，术语“逆转录病毒”是指将其基因组RNA转录成线性双链DNA拷贝并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中的RNA病毒。适用于特定实施方案的例示性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗云德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)和慢病毒。

术语“慢病毒载体”是逆转录病毒载体的子集，是指包含主要衍生自慢病毒的结构和功能性遗传元件的载体。在某些实施方案中，根据已知方法产生慢病毒载体。参见例如，Kutner等人，BMC Biotechnol.，2009年；Kutner等人，Nat.Protoc.，2009年。本发明包括表达可直接转导到细胞中的转基因的重组、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在特定实施方案中，慢病毒载体用于将编码CAR的多核苷酸递送到细胞。

根据本文考虑的某些具体实施方案，大部分或全部病毒载体主链序列衍生自慢病毒，例如HIV-1。然而，应当理解，可使用或组合使用许多不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，并且可适应某些慢病毒序列的许多取代和改变而不损害转移载体执行本文所述功能的能力。此外，多种慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人(1996a、1996b和1998年)；Zufferey等人，1997年；Dull等人，1998年，美国专利6,013,516和5,994,136，其中许多可适于产生本文考虑的病毒载体或转移质粒。

“慢病毒”是指引起缓慢发展疾病的逆转录病毒组(或属)。包括在该组内的病毒包括HIV(人类免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)，人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体；维斯纳-梅迪病，其引起绵羊脑炎(维斯纳病)或肺炎(梅迪病)，山羊关节炎-脑炎病毒，其引起山羊免疫缺陷、关节炎和脑病；马感染性贫血病毒，其引起马自身免疫性溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV)，其引起猫免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其引起牛淋巴结病、淋巴球增多和可能的中枢神经系统感染；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，其引起亚人类灵长类动物免疫缺陷和脑病。由这些病毒引起的疾病的特征在于潜伏期长和病程长。通常，病毒潜伏地感染单核细胞和巨噬细胞，然后它们会传播到其他细胞。HIV、FIV和SIV也容易感染T淋巴细胞(即T细胞)。在各种实施方案中，本文考虑的慢病毒载体包含一种或多种LTR，以及以下辅助元件中的一种或多种或全部：cPPT/FLAP、Psi(Ψ)包装信号、导出元件、多聚腺苷酸序列，并且可任选地包括如本文其他地方所讨论的WPRE或HPRE、绝缘体元件、可选择标记和细胞自杀基因。

作为修饰LTR的结果，慢病毒载体优选包含若干安全性增强。“自活化”(SIN)载体是指复制缺陷型载体。术语“自灭活载体”是指其中已知为U3区的右(3')LTR增强子-启动子区已被修饰(例如，通过缺失或取代)以防止病毒转录超过第一轮病毒复制的载体。在某些实施方案中，LTR U3是ΔU3。因此，载体能够感染并且然后仅一次整合到宿主基因组中，并且可能无法进一步传播。这是因为在病毒复制期间右(3')LTR U3区用作左(5')LTR U3区的模板，并且因此在没有U3增强子-启动子的情况下，可能无法复制病毒转录物。如果无法复制病毒转录物，则可不加工或包装成病毒体，因此病毒的生命周期结束。因此，SIN载体大大降低了产生不需要的具有复制能力的病毒的风险，因为右(3')LTR U3区已被修饰，以防止病毒转录超过第一轮复制，从而消除病毒传播的能力。通过用异源启动子替换5'LTR的U3区以在病毒颗粒生产期间驱动病毒基因组的转录，提供了额外的安全性增强。可使用的异源启动子的示例包括例如病毒性猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如，立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)和单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。

术语“长末端重复(LTR)”是指位于某些重组DNA末端的碱基对结构域，诸如逆转录病毒，在其天然序列环境中，它们是直接重复并包含U3、R和U5区。LTR通常为重组基因的表达(例如，基因转录物的促进、起始和聚腺苷酸化)和病毒复制提供基本功能。

术语“R区”是指重组LTR内从加帽基团开始(即转录开始)到多聚腺苷酸链开始之前立即结束的区。R区也被定义为侧接U3和U5区。R区在逆转录期间起重要作用，从而允许将新生DNA从基因组的一端转移到另一端。术语“PBS区”是指5'-LTR的U5区下游的区，该区用作tRNA^Lys引物的引物结合位点(PBS)，并且是启动逆转录所必需的。

术语“与整合的重组载体核酸特异性杂交”是指核酸(例如引物)与已整合到宿主细胞基因组中的重组载体核酸特异性杂交，但不是指与用于递送转基因或未整合的重组载体核酸序列的残留质粒特异性杂交。

测试测定

本公开的重组载体核酸的功效和性质可通过利用许多可用的体外或体内测定法中的任一种来容易地测试。下文描述了几种此类测定。本公开考虑可使用这些测定中的任一种以及本领域中已知的其他测定来测试本公开的任何重组载体核酸。

在一些实施方案中，采用定量聚合酶链反应(qPCR)以便定量重组载体核酸整合到靶细胞基因组中。在一些实施方案中，采用数字聚合酶链反应(dPCR)以便定量重组载体核酸整合到靶细胞基因组中。在一些实施方案中，采用微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)以便定量重组载体核酸整合到靶细胞基因组中。在这些实施方案中，采集表达重组载体核酸的细胞(例如，PBMC细胞)的培养物并且使用对整合的重组载体核酸的LTR序列具有特异性的引物进行制备用于qPCR或dPCR。此类实验检测转导的CAR-T细胞基因组中编码CAR的整合的重组载体核酸序列，但未检测到残留的非整合的转移质粒。

本公开的方法和用途

本公开提供了检测和/或定量重组载体核酸整合到细胞基因组中的方法。在该方法中，在某些实施方案中，提供了包含宿主细胞基因组的生物样品。提供生物材料包括提供新鲜生物材料，诸如在给定时间获取的用于此分析目的的生物材料。提供生物材料还包括为此或其他目的使用在患者护理期间在另一点采集的先前获得的生物材料，或使用存档的患者材料。生物材料可以是新鲜获得的或先前获得的，并且在先前获得的情况下，可能在使用前已经储存(例如，在室温下、冷藏或冷冻)。示例性生物材料包括但不限于全血、血清、血浆、尿液、粪便、脑脊液、腹水等。

在一些实施方案中，生物材料可被纯化或以其他方式加工以分离生物样品的基因组DNA。该处理可包括HPLC、排阻色谱法、凝胶电泳、亲和色谱法、商业DNA提取或纯化试剂盒或其他纯化技术。

扩增生物样品的基因组DNA的方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、线性聚合酶反应、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增、数字PCR(dPCR)、微滴式数字PCR(ddPCR)、终点PCR等，这些方法在本文中以引用方式并入本文中的以下参考文献中公开：Mullis等人，美国专利4,683,195、4,965,188、4,683,202、4,800,159(PCR)；Gelfand等人，美国专利5,210,015(使用“TAQMAN^TM”探针的实时PCR)；Wittwer等人，美国专利6,174,670；Kacian等人，美国专利5,399,491(“NASBA”)；Lizardi，美国专利5,854,033；Aono等人，日本专利公布JP4-262799(滚环扩增)等。

在某些实施方案中，然后使用定量扩增技术使生物样品的基因组DNA扩增。定量扩增技术是本领域技术人员已知的并且包括定量PCR(qPCR)、数字PCR和终点PCR。“qPCR”或“实时定量PCR”(实时定量聚合酶链反应)是指使用PCR同时扩增和定量靶核酸的实验方法。使用多种测量化学物质(包括，例如，SYBR^TM绿的荧光染料或Taqman探针的荧光报告寡核苷酸探针)进行定量，并且在每个扩增循环后用反应中积累的扩增DNA进行实时定量。对于数字PCR方法的描述，参见例如Hindson等人，2011年，Anal.Chem.第83卷第22期：第8604-8610页；Pohl和Shih，2004年，Expert Rev.Mol.Diagn.，第4卷第1期：第41-47页；Pekin等人，2011年，Lab Chip，第11卷第13期，第2156-2166页；Pinheiro等人，2012年，Anal.Chem.第84卷第2期：第1003-1011页；Day等人，2013年，Methods，第59卷第1期：第101-107页；这些文献全文以引用方式并入本文。

如本文所用，术语“引物”意指在诱导与核酸链(模板)互补的引物延伸产物合成的条件下，即在包含核苷酸和DNA聚合酶的聚合混合物以及合适的温度和pH条件存在下，可作为合成起点的寡核苷酸。在某些实施方案中，引物是脱氧核糖核苷酸并且是单链。本发明中使用的引物可包括天然存在的dNMP(即，dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)、修饰的核苷酸或非天然核苷酸。另外，引物还可包括核糖核苷酸。

引物应足够长以能够在聚合混合物存在下引发延伸产物的合成。引物的合适长度由许多因素确定，诸如温度、应用和引物源，同时通常为15个至30个核苷酸。短引物分子通常需要较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。

在一些实施方案中，与扩增产物特异性杂交的可检测核酸探针(例如，整合的逆转录病毒核酸扩增子或对照核酸扩增子)产生在扩增反应中可检测的信号。在一些实施方案中，可检测核酸探针包含可检测药剂。在一些实施方案中，可检测核酸探针包含猝灭剂。可检测药剂和猝灭剂如美国专利公开20190284610中所公开，其通过引用方式并入本文。

在某些实施方案中，荧光分析可由商业检测器(例如，biorad的微滴读数仪)执行，并且每个样品的微滴荧光信号可在设备中检测到，并且可对正微滴和负微滴的数量进行计数，并且可自动完成分析。

在某些实施方案中，术语“可检测核酸探针”意指用于定量PCR的TaqMan探针。在某些实施方案中，荧光材料(HEX、VIC、FAM染料)附接到探针。在某些实施方案中，3lABkFQ可用作探针3'侧的猝灭剂。TaqMan探针是一种寡核苷酸，分别在5'端标记有荧光物质并且在3'端标记有猝灭剂物质。TaqMan探针在退火步骤中与模板DNA特异性杂交，但即使在光照下也不显示荧光，因为探针的3'端有猝灭剂。在以下延伸步骤中，Taq DNA聚合酶的5'到3'核酸外切酶活性降解了与模板杂交的TaqMan探针。然后，荧光物质与探针分离，并且猝灭剂的抑制作用被解除。通过这种原则，定量示出了由于PCR反应引起的荧光。

在某些实施方案中，可使用荧光猝灭测定，其中根据本发明的探针包括荧光团和猝灭剂，它们被定位成使得在不存在靶核酸的情况下，并且在低于探针的Tm的温度下，荧光会发生猝灭。根据本发明，可在探针和引物中使用各种荧光团。可用荧光团包括香豆素、荧光素(FAM)、四氯荧光素、六氯荧光素、荧光黄、罗丹明、BODIPY、四甲基罗丹明、Cy3、Cy5、Cy7、曙红、德克萨斯红和ROX。例如，Lee等人(1997年，Nucleic Acids Research，第25卷：第2816页)描述的组合荧光团诸如荧光素-罗丹明二聚体也是合适的。可选择荧光团以在可见光谱内或可见光谱外诸如在紫外或红外范围内吸收和发射。本领域中描述的合适的猝灭剂包括3lABkFQ、DABCYL以及它们的变体，诸如DABSYL、DABMI和甲基红。荧光团也可以用作猝灭剂，因为当在某些其他荧光团附近时，它们倾向于猝灭荧光。在一些实施方案中，优选的猝灭剂是3lABkFQ。在一些实施方案中，优选的荧光团是荧光素(FAM)。在一些实施方案中，优选的内部猝灭剂是ZEN。在一些实施方案中，优选的荧光团是VIC。

在某些实施方案中，使用特异性扩增参考多核苷酸序列的至少一对寡核苷酸引物并且使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对，用定量PCR同时扩增生物样品的基因组DNA，其中引物对的至少一个寡核苷酸引物与整合的逆转录病毒载体多核苷酸序列特异性杂交。具体地，如图1B所示，参考多核苷酸序列可用于利用基因组信息确定样品中存在的细胞数量，并且因此允许估计拷贝数。这可改善先前方法的准确性，这些方法通常使用来自样品中的遗传物质质量的转化因子来确定拷贝数。也如图1B所示，可将包括编码CAR的多核苷酸的逆转录病毒载体序列掺入到宿主细胞基因组中。这种掺入的逆转录病毒载体序列特别地包括未掺入的载体中不存在的5'-LTRδU3区，如图1A所示。该方法通过包括仅与图1B中的5'-LTRδU3区互补的引物，因此仅对整合的逆转录病毒载体序列而不是未整合的逆转录病毒载体具有选择性。

在一些实施方案中，逆转录病毒载体核酸基于慢病毒属的成员。具体地，慢病毒已经示出强转染效率，并且是一种经过验证的将遗传信息掺入到宿主细胞中的工具。在一些实施方案中，慢病毒是人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)或人类免疫缺陷病毒2(HIV-2)。在一些实施方案中，用于扩增整合的逆转录病毒载体核酸的引物与整合的逆转录病毒载体序列的LTR序列特异性杂交。在一些实施方案中，用于扩增逆转录病毒载体核酸的引物与慢病毒的5'LTR的U3区特异性杂交。在一些实施方案中，用于扩增逆转录病毒载体核酸的引物与慢病毒的5'LTR的U3区和R区特异性杂交。在一些实施方案中，用于扩增逆转录病毒载体核酸的引物与慢病毒的5'LTR的PBS区特异性杂交。在一些实施方案中，用于扩增逆转录病毒载体核酸的引物与慢病毒的5'LTR的PBS区和R区特异性杂交。在一些实施方案中，用于扩增逆转录病毒载体核酸的引物与psi(Ψ)包装信号特异性杂交。在一些实施方案中，对掺入的逆转录病毒载体核酸具有特异性的序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些实施方案中，对掺入的逆转录病毒载体核酸具有特异性的序列包含SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15的核酸序列。在一些实施方案中，使用可检测核酸探针，该可检测核酸探针与扩增的逆转录病毒载体核酸特异性杂交。具体地，在一些实施方案中，与逆转录病毒载体核酸特异性杂交的探针包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16的核酸序列。在一些实施方案中，与包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:16的核酸序列的逆转录病毒载体核酸特异性杂交的探针进一步包括位于探针的5'端、3'端和/或从序列的5'端测量的第九核苷酸和第十核苷酸之间的荧光团或猝灭剂。在一些实施方案中，与逆转录病毒载体核酸特异性杂交的探针由SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16的核酸序列组成，包括位于5’端、3’端和/或内部的荧光团或猝灭剂。在具体实施方案中，内部猝灭剂位于探针的从序列的5'端测量的第九核苷酸和第十核苷酸之间。在一些实施方案中，探针具有5'端的荧光团、内部猝灭剂和3'端的第二猝灭剂。在一些实施方案中，优选的猝灭剂是3lABkFQ。在一些实施方案中，优选的荧光团是荧光素(FAM)。在一些实施方案中，优选的内部猝灭剂是ZEN。在一些实施方案中，优选的荧光团是VIC。在一些实施方案中，与逆转录病毒载体核酸特异性杂交的探针是/FAM/CTTTCAAGT/ZEN/CCCTGTTCGGGCGCC/3lABkFQ/(SEQ ID NO:12)或/56-FAM/TGCCTTGAG/ZEN/TGCTTCAAGTAGTGTGT/3IABkFQ/(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，扩增存在于所有宿主细胞中的参考序列的引物包含与编码管家蛋白的序列的一部分特异性杂交的核酸序列。具体地，在一些实施方案中，管家蛋白是白蛋白。在一些实施方案中，特异性杂交白蛋白基因的一部分的引物序列是SEQ ID NO:8和/或9。在一些实施方案中，与白蛋白核酸特异性杂交的探针的序列是SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，与白蛋白核酸特异性杂交的探针是/5HEX/AGGGAGA/ZEN/GATTTGTGTGGGCATGAC/3IABkFQ/(SEQ ID NO:11)。

在这种方法中，在某些实施方案中，然后检测和/或定量扩增的基因组核酸，其中扩增的逆转录病毒载体核酸与参考核酸的比率与整合在细胞基因组中的逆转录病毒载体核酸的拷贝数相关。具体地，如上所讨论，由于一种引物对仅在逆转录病毒载体掺入到宿主细胞基因组时出现的多核苷酸序列具有特异性，因此qPCR计数的序列数量与样品中整合的逆转录病毒载体数量成正比。除以检测到的参考多核苷酸序列的数量允许直接计算给定生物样品的拷贝数。

在某些实施方案中，本公开提供了用于确定受试者的基因组中整合的逆转录病毒载体核酸拷贝数的方法。在该方法的一些实施方案中，提供了包含受试者的基因组DNA的生物样品。在该方法的一些实施方案中，通过定量PCR扩增生物样品中受试者的基因组中整合的逆转录病毒载体核酸的一部分和参考多核苷酸序列。在该方法的一些实施方案中，确定(i)包含逆转录病毒载体核酸序列的扩增的多核苷酸的量和(ii)包含参考多核苷酸序列的扩增的多核苷酸的量，并且确定(i)与(ii)的比率，其中该比率对应于整合的逆转录病毒载体核酸拷贝数。

在一些实施方案中，扩增包括将样品与包含对整合的逆转录病毒载体核酸序列具有特异性的引物对的组合物组合，并且进行定量PCR。在一些实施方案中，扩增包括将样品与包含对整合的逆转录病毒载体核酸序列具有特异性的引物对的组合物组合，并且进行定量扩增技术。在一些实施方案中，扩增进一步包括对参考多核苷酸序列具有特异性的引物对，并且进行定量扩增技术，其中整合的逆转录病毒载体核酸序列和参考多核苷酸以基本上相等的比例分别扩增。在一些实施方案中，用于整合的逆转录病毒载体核酸序列的引物对的一个引物与5'LTR特异性杂交。在一些实施方案中，用于扩增逆转录病毒载体核酸的引物对的一个引物与5'LTR的U3区特异性杂交。在一些实施方案中，用于整合的逆转录病毒载体核酸序列的引物对的一个引物与5'LTR的U3区和R区特异性杂交。在一些实施方案中，用于扩增逆转录病毒载体核酸的引物对的一个引物与5'LTR的PBS区特异性杂交。在一些实施方案中，整合的逆转录病毒载体核酸序列包含转基因。在一些实施方案中，转基因编码特异性结合某靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)。

本公开提供了用于监测逆转录病毒载体的转导效率的又一种方法。在一些实施方案中，提供了由逆转录病毒载体核酸转导的包含基因组DNA的一种或多种生物样品，其中逆转录病毒载体核酸的一部分被整合到基因组DNA中。在一些实施方案中，根据本文所述的方法确定每个生物样品的基因组DNA中整合的逆转录病毒载体序列拷贝数。在一些实施方案中，将生物样品的逆转录病毒载体序列拷贝数与参考进行比较。

本公开还提供了一种对由逆转录病毒载体转导的细胞产物进行批释放测试的方法。在一些实施方案中，提供来自每批的由逆转录病毒载体转导的包含基因组DNA的细胞产物的一个或多个生物样品。在一些实施方案中，根据本公开的方法确定每个生物样品中整合的逆转录病毒载体序列拷贝数。在一些实施方案中，将生物样品的逆转录病毒载体序列拷贝数与参考进行比较。在一些实施方案中，将其中整合的逆转录病毒载体序列拷贝数通过预先确定的标准的次释放。在某些实施方案中，预先确定的标准可以是拷贝数范围或与对照的百分比变化。

本公开还提供了可用于分别确定测定或样品的有效性的测定接受标准和样品接受标准，用于定量重组载体核酸整合。在一些实施方案中，通过计算每个细胞的载体拷贝数(VCN/细胞)值来确定重组载体核酸序列的整合，该值定义为前病毒与参考多核苷酸序列的测量量的比率的两倍。在一些实施方案中，经由定量PCR(qPCR)确定前病毒或参考多核苷酸序列的量。在一些实施方案中，经由定量PCR(qPCR)从由qPCR仪器测量的阈值循环(Ct)确定前病毒或参考多核苷酸序列的量。阈值循环(Ct)定义为达到前病毒或参考多核苷酸序列的每个扩增循环所需的PCR循环的数量，并且与相应多核苷酸序列的含量成反比。

在一些实施方案中，测定接受标准或样品接受标准中的该一者或多者利用三个或更多个标准样品的三个或更多个复制品。在一些实施方案中，三个或更多个标准样品，每个为或约3.20VCN/细胞，由预先确定的基础标准样品通过使用缓冲剂作为稀释液的多达四个5倍系列稀释制备。在一些实施方案中，基础标准样品包含121,212.121拷贝的前病毒和75,757.576拷贝的参考多核苷酸序列。在一些实施方案中，对于一个或多个阳性对照样品的三个或更多个复制品，测定接受标准或样品接受标准中的一者或多者需要将测量的前病毒和参考多核苷酸序列的量与在从已知浓度的前病毒和参考多核苷酸序列的单独样品制备所述一个或多个阳性对照样品期间计算的前病毒和参考多核苷酸序列的标称量进行比较。

在一些实施方案中，该方法进一步包括通过评估一个或多个测定接受标准评估用于定量重组载体核酸样品整合的测定的有效性。在一些实施方案中，如果符合选自由以下项组成的组的测定接受标准中的一者或多者或全部，则测定有效：(a)在不含模板DNA的对照的所有复制品中，前病毒和参考多核苷酸序列两者的阈值循环是无法确定的；(b)使用标准样品通过线性回归生成的前病毒和参考多核苷酸序列两者的标准曲线的相关系数大于或等于0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96或0.97；(c)从所述标准曲线的斜率估计的VCN/细胞值表明PCR效率介于80％和120％之间、介于82％和118％之间、介于84％和116％之间、介于86％和114％之间、介于88％和116％之间或介于90％和110％之间；(d)在标准样品中的任一者的复制品中，前病毒和参考多核苷酸序列两者没有一个的阈值循环是无法确定的；(e)基础标准样品中前病毒和参考多核苷酸序列两者的平均阈值循环小于或等于30.0、28.0、26.0、24.0或22.0；(f)每个标准样品中的前病毒和参考多核苷酸序列两者的阈值循环中的标准偏差小于或等于0.95、0.90、0.85、0.80、0.75、0.70、0.65或0.60；(g)该一个或多个阳性对照样品的参考多核苷酸序列的平均测量拷贝在标称预期值的50％、45％、40％、35％或30％内，(h)该一个或多个阳性对照样品的所测量的平均VCN/细胞值在每个对照的标称预期VCN/细胞值的50％、45％、40％、35％或30％内；以及(i)该一个或多个阳性对照样品的VCN/细胞值的变异系数小于或等于50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％。

在一些实施方案中，该方法进一步包括通过评估一个或多个样品接受标准来评价定量样品的重组载体核酸整合的有效性。在一些实施方案中，如果符合选自由以下项组成的组的样品接受标准中的一者或多者或全部，则样品有效：(a)样品中参考多核苷酸序列的平均拷贝值在30,303.030拷贝的预期值的50％、45％、40％、35％或30％内；(b)如果样品的基因组DNA(gDNA)浓度低于0.02μg/μL，则该样品的参考多核苷酸序列的预期拷贝根据实际加载到反应中的DNA量计算；(c)样品中的平均靶前病毒拷贝值介于测定的拷贝值的验证范围之间；(d)样品中的平均靶前病毒拷贝值介于121,212.121和193.939拷贝之间；(e)靶样品复制品的VCN/细胞值的变异系数小于或等于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％；以及(f)样品中的靶前病毒和靶参考多核苷酸序列两者的循环阈值中的标准偏差小于或等于0.95、0.90、0.85、0.80、0.75、0.70、0.65或0.60。

在一些实施方案中，定量重组载体核酸整合到细胞基因组的方法进一步包括用于鉴定转基因的方法。在一些实施方案中，用于鉴定转基因的方法包括：(a)提供包含宿主细胞基因组的生物样品；(b)使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对用定量扩增技术扩增生物样品的基因组DNA，其中该引物对的至少一个寡核苷酸引物与转基因特异性杂交；以及(c)检测和/或定量通过步骤(b)扩增的基因组核酸。在一些实施方案中，转基因编码嵌合抗原受体。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20或SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是由包含SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:21的序列的核酸序列编码的多肽。在一些实施方案中，嵌合抗原受体识别BCMA、KLK2或GPRC5D。

试剂盒

在某些实施方案中，本公开还提供了一种用于测量整合的重组载体序列拷贝数的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒可包括本发明的一种或多种引物。在某些实施方案中，试剂盒可包括本发明的一种或多种探针。

本公开还提供了一种用于测量整合的重组载体序列拷贝数的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包括引物对的一种引物或两种引物，该引物对的一种引物或两种引物与整合的重组载体核酸特异性杂交，其中该引物对特异性扩增整合的重组载体核酸的一部分。在一些实施方案中，该试剂盒包括与所述扩增的重组载体核酸特异性杂交的可检测核酸探针。

本公开还提供了一种用于测量整合的重组载体序列拷贝数的另一试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包括与整合的重组载体核酸特异性杂交的正向引物。在一些实施方案中，该试剂盒包括与整合的重组载体核酸特异性杂交的正向引物，其中该正向引物包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些实施方案中，该试剂盒包括与整合的重组载体核酸特异性杂交的反向引物。在一些实施方案中，该试剂盒包括与整合的重组载体核酸特异性杂交的反向引物，其中该反向引物包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15的核酸序列。在一些实施方案中，该试剂盒包括可检测探针。在一些实施方案中，该试剂盒包括可检测探针，该可检测探针包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:16的核酸序列。

实施例

现在对本公开进行一般性描述，通过参考以下实施例将更容易理解本公开，这些实施例仅仅是为了说明本公开的某些方面和实施方案，而不是为了限制本公开。例如，本文公开的特定构建体和实验设计表示用于验证正确功能的示例性工具和方法。因此，显而易见的是，所公开的特定构建体和实验计划中的任一者可在本公开的范围内被取代。

实施例1：示例的材料和方法

用Lipofectamine2000(Life Technologies)和质粒在6孔板的每孔4x10⁵的细胞密度下进行瞬时转染实验。24小时后去除培养基并用新鲜生长培养基替换。

进行qPCR测定以确定转染细胞的拷贝数。首先，在存在tRNA(酵母tRNA；Invitrogen目录号657491)的情况下，分别为参考基因和5'-LTR序列线性化质粒制备标准品和质制品。其次，我们制备了参考基因预混液，该预混液由1X Fast Advanced MasterMix(ThermoScientific，目录号4444558)中的正向引物(SEQ ID NO:8)、反向引物(SEQ IDNO:9)、探针/5HEX/AGGGAGA/ZEN/GATTTGTGTGGGCATGAC/3IABkFQ/(SEQ ID NO:11)组成。第三，我们制备了5’-LTR预混液，该预混液由1X Fast Advanced Master Mix(ThermoScientific，目录号4444558)中的正向引物(SEQ ID NO:5)、反向引物(SEQ ID NO:6)和探针/FAM/CTTTCAAGT/ZEN/CCCTGTTCGGGCGCC/3lABkFQ/(SEQ ID NO:12)组成。

通过将MasterMix、标准品、QC和样品添加到多孔板中来准备qPCR测定。在任何实时PCR仪器上运行qPCR测定。qPCR测定包括但不限于通过将MasterMix、标准品、QC和样品添加到96孔板进行准备。qPCR测定可在但不限于Quantstudio仪器上运行，条件为：50℃2分钟、95℃10分钟、95℃15秒解链、60℃1分钟退火和延伸。

实施例2：HIV-1递送的T细胞中编码CAR的多核苷酸掺入的定量

通用qPCR测定仅检测编码转导细胞产物的基因组中任何转基因的整合的逆转录病毒载体序列，但不检测用于产生慢病毒载体的转移质粒。基于慢病毒载体整合到宿主基因组中的独特特征，开发了可定量慢病毒转导细胞的拷贝数但不定量未整合的载体的特定qPCR测定(参见图1A和图1B)。

整合在细胞基因组中的逆转录病毒载体核酸可使用本发明的方法容易地定量。

根据实施例1的方法，使用引物和探针组1至5(根据表1)扩增整合的慢病毒载体序列。引物组1至4在细胞样品中扩增了其中载体被整合的慢病毒序列，并且未在其中未进行转导但存在慢病毒转移质粒的对照细胞样品中扩增(参见图2)。对照(组5)在所有带有细胞的样品中扩增了人白蛋白(hALB)序列。

实施例3：血液中整合的GPRc5d CAR-T的定量

先前实施例中描述的方法用于定量使用GPRc5d CAR-T的小鼠研究中整合的CAR转基因拷贝数。进行这项研究是为了挑选最终的克隆/构建体。

在五个不同的小鼠研究中开发并成功地使用qPCR测定。在GPRc5d CAR-T研究中，前病毒方法拷贝数与流数据相关(图3A至图3B)。在这些实验中使用5LTR对3(根据表1的组3)。

实施例4：CAR-T产物中整合的转基因的定量

通过靶向CAR-T产物中HIV衍生慢病毒5'LTR区(前病毒序列靶区)的细胞基因组整合形式，开发了一种用于整合发转基因定量的定量实时PCR(qPCR)测定。识别靶抗原BCMA的示例性CAR-T产物具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。该测定是单重或多重qPCR，其中靶向前病毒序列的整合的5'LTR区以及人白蛋白(hALB；参考管家基因)。该方法可用于但不限于预先配制的冷冻CAR-T细胞颗粒，用于确定报告为每个细胞的载体拷贝数(VCN)的转导效率。

使用Purelink gDNA分离试剂盒从预先配制的CAR-T细胞颗粒中提取基因组DNA(gDNA)。在分离DNA之前，预先配制的细胞颗粒在≤-60℃下冷冻保存。分离的DNA储存在≤-60℃下并在稍后解冻以进行定量，或立即使用Qubit 4荧光计和基于荧光的Qubit dsDNA宽范围检测试剂盒进行定量。Qubit 4荧光计使用Qubit dsDNA宽量程试剂盒中供应的两个标准品校准。为每组待定量的DNA样品制备和运行标准品。使用相同的Qubit工作溶液制备标准品和DNA样品反应。定量后，将分离的DNA稀释至0.020μg/μL的工作浓度。

使用寡核苷酸混合物(包含前病毒引物和探针组4，包括//56-FAM/TGCCTTGAG/ZEN/TGCTTCAAGTAGTGTGT/3IABkFQ/(SEQ ID NO:17)和hALB引物和探针组5，根据表1)和qPCR TaqPath ProAmp预混液溶液准备qPCR反应，使用分子级水稀释。前病毒引物和探针组中三种寡核苷酸中的每种寡核苷酸的最终浓度为200nM。hALB正向和反向引物中的每一者的最终浓度为50nM，而hALB探针的最终浓度为200nM。

前病毒标准品号1通过用线性5’LTR质粒掺入0.05μg/μL PBMC DNA来制备，使得5μL标准品号1包含121,212.121拷贝的质粒。使用缓冲液连续稀释标准品号1。前病毒qPCR中间对照是通过用线性5'LTR质粒掺入0.02μg/μL的PBMC gDNA来制备，使得5μL的中间对照包含30,303.030拷贝的5'LTR质粒。前病毒qPCR低对照是通过使用0.02μg/μL的PBMC gDNA作为稀释剂以1:10稀释中间对照体积制成的。这相当于5μL中等对照的标称载体拷贝数为2.00VCN/细胞，并且5μL低对照的标称载体拷贝数为0.20VCN/细胞，但每批中等对照和低对照的实际VCN/细胞值是在试剂鉴定期间确定的。

将预混液装载到qPCR板的指定孔中。将每个稀释标准品点，前病毒中间对照、前病毒低对照、测试制品DNA和低EDTA TE缓冲液(即，无模板对照或NTC)的三个复制品各自装载到qPCR板中包含预混液的指定孔中。将qPCR板装载到实时PCR仪器中以执行qPCR反应。

通过qPCR仪器确定每个靶(前病毒和hALB)的测量阈值循环(Ct)。标准品的Ct和对数浓度值用于通过线性回归产生标准曲线。标准曲线用于计算每个对照和测试制品复制品的每个靶的拷贝。

如下计算每个样品、中间对照和低对照复制品的VCN/细胞。

其中x是来自群体的每个值，

是数据集的平均值，并且N是群体的大小，然后每个样品、中间对照和低对照的一式三份VCN/细胞值的平均值、标准偏差和％CV计算为：

以下测定接受标准用于产生有效的测定：

·前病毒和hALB标准曲线的相关系数(R²)值必须≥0.97。

·标准曲线的斜率必须介于-3.585和-3.104之间(等于90.08％-109.97％的PCR效率)

·对于前病毒靶和hALB靶两者，NTC的所有Ct复制品必须是“未确定的”。

·对于前病毒靶和hALB靶两者，标准品号1的平均Ct必须≤22.0，并且标准品中的任一者的Ct复制品都不能是“未确定的”。

·对于前病毒靶和hALB靶二者，每个标准品的Ct SD必须≤0.60。

·中等对照和低对照的平均hALB拷贝必须为30,303.030拷贝+/-30％(预期范围：21,212.121-39,393.939拷贝)。

·中间对照和低对照的平均VCN/细胞结果必须是对于每个对照的合格VCN/细胞值的≥-30％和≤+30％。

·中间对照和低对照复制品的VCN/细胞的％CV必须≤20％。

未满足所有以下接受标准的任何样品都被认为是无效的：

·对于前病毒靶和hALB靶二者，每个样品的Ct SD必须≤0.60。对于确定低于或高于测定范围的样品，未访问Ct SD。

·每个样品的平均hALB拷贝必须为30,303.030拷贝±30％(预期范围：21,212.121至39,393.939拷贝)。

·如果样品gDNA的浓度<0.02μg/μL，则根据实际装载到反应中的DNA的量来计算该样品的hALB的预期拷贝。

·每个样品的平均前病毒靶拷贝值必须等于或介于测定的验证范围之间，才能计算VCN/细胞结果。

·如果样品的平均前病毒拷贝值>121,212.121，则认为该样品高于测定范围。

·如果样品的平均前病毒拷贝值<193.939拷贝，则认为该样品低于测定范围。

·样品VCN/细胞复制品的％CV必须为≤20％。对于确定为低于或高于测定范围的样品或未通过hALB接受标准的样品未访问％CV。

·对于前病毒靶和hALB靶二者，每个样品的Ct SD必须≤0.60。对于确定为低于或高于测定范围的样品或未通过hALB接受标准的样品未访问％CV。

对于满足所有样品接受标准的任何样品，转导效率报告为VCN/细胞结果平均值，准确到2个小数位。

使用本发明方法测试的BCMA CAR-T产生示出比靶向载体包装信号(PSI)的测定更低的整合的拷贝数，该测定不能区分整合的与未整合的拷贝数。结果证实PSI方法可能会在测试的BCMA CAR-T批次中挑选质粒污染(表2)。

该方法还用于其他CAR-T产物，诸如正在开发的示例性GPRc5d和KLK2 CAR-T产物。CAR的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:20和22。这些结果与PSI方法的比较未示出这些方法之间VCN的任何差异(表3)。结果证实GPRc5d CAR-T和KLK2 CAR-T批次生产过程中没有质粒污染。

实施例5：其他CAR-T产物中整合的转基因的定量

用于定量整合的转基因的定量实时PCR(qPCR)测定也可用于其他CAR-T产物，诸如靶向GPRC5D的那些。实施例3的方法用于确定小鼠研究中的CAR-T细胞动力学，作为GPRc5dCAR-T产物在小鼠血液中的VCN/细胞平均值或转基因拷贝/μg gDNA。

实施例6：CAR-T产物中整合的转基因的定量后转基因的鉴定

尽管前病毒qPCR方法可用于精确地估计与CAR-T转基因序列整合的细胞基因组的批次的VCN/细胞，但是使用与转基因内的核苷酸序列特异性杂交的引物的qPCR方法仍然可用于确认CAR转基因的同一性。这是因为前病毒qPCR方法是通用的而不是转基因特异性的。

转基因qPCR方法的设计和执行与前病毒qPCR方法的设计和执行相同，仅在转基因靶的正向引物、反向引物和探针序列的序列和任选的浓度方面不同。在转基因靶编码BCMACAR-T产物中的CAR的情况下，该产物识别靶抗原BCMA、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列并且由包含SEQ ID NO:19的核酸序列编码，我们使用对CAR转基因的CD137(4-1BB)和CD3ζ衍生序列具有特异性的引物/探针组。对于转基因正向和反向引物中的每一者，我们使用100nM的浓度。对于两种方法，人白蛋白(hALB)管家基因寡核苷酸是相同的，但是转基因方法中hALB正向和反向引物的浓度为75nM。

简而言之，为了执行转基因qPCR方法，使用模拟转导的淋巴细胞细胞系的5点连续稀释来生成转移质粒和人白蛋白(hALB)两者的标准曲线。从采集后样品分离的基因组DNA以一式三份进行分析。从相应标准曲线内插每个一式三份DNA样品的转基因和hALB两者的拷贝。hALB的平均拷贝用于估计样品DNA衍生自的细胞数量。样品DNA中存在的转基因平均拷贝除以样品DNA衍生的估计细胞数，以确定样品中每个细胞的载体拷贝数。

表1—序列

表2—使用本发明方法测试的BCMA CAR-T产生示出比靶向载体包装信号(PSI)的 测定更低的整合的拷贝数，该测定不能区分整合的与未整合的拷贝数

表3—使用本发明方法和PSI方法对靶向KLK2和GPRC5D的CAR T产物的VCN的比较

参考文献

1.Sadelain M,Brentjens R,Riviere I(2013)The Basic Principles ofChimerica Antigen Receptor(CAR)Design.Cancer Discov 3(4):388-398.

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3.Charrier S,Ferrand M,Zerbato M,Precigout G,Viornery A,Bucher-Laurent S,Benkheilifa-Ziyyat S,Merten OW,Perea J,Galy A(2011)Quantificationof Lentiviral Vector Copy Numbers in Individual Hematopoietic Colony-FormingCells Shows Vector Dose-Dependent Effects on the Frequency and Level ofTransduction.Gene Therapy 18:479-487.

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5.Siegel R,Naishadham D,Jemal A(2012)Cancer statistics,2012.CA:acancer journal for clinicians 62:10-29.

本发明的特定实施方案在以下编号的段落中阐述：

1.一种用于定量重组载体核酸整合到细胞基因组中的方法，所述方

法包括：

(a)提供包含宿主细胞基因组的生物样品；

(b)使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对用定量扩增技术扩增所述生物样品的基因组DNA，其中所述引物对的至少一个寡核苷酸引物与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交；以及

(c)检测和/或定量通过步骤(b)扩增的基因组核酸。

2.根据段落1所述的方法，其中所述重组载体包含转基因。

3.根据段落2所述的方法，其中所述转基因编码嵌合抗原受体。

4.根据段落1至3中任一项所述的方法，其中所述重组载体是基因疗法载体。

5.根据段落4所述的方法，其中所述基因疗法载体是病毒载体。

6.根据段落1至5中任一项所述的方法，其中所述生物样品是细胞样品或组织样品。

7.根据段落6所述的方法，其中所述组织样品是血液、血浆、血清、唾液或组织活检。

8.根据段落1至7中任一项所述的方法，其中所述样品来自受试者。

9.根据段落8所述的方法，其中所述受试者是人。

10.根据段落1至9中任一项所述的方法，其中所述重组载体是逆转录病毒载体。

11.根据段落10所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。

12.根据段落11所述的方法，其中所述慢病毒载体所基于的慢病毒是人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)或人类免疫缺陷病毒2(HIV-2)。

13.根据段落1至12中任一项所述的方法，其中与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与所述整合的重组载体序列的LTR序列特异性杂交。

14.根据段落1至13中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:14的核酸序列。

15.根据段落14所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于扩增所述重组载体核酸的所述第二寡核苷酸引物包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15的核酸序列。

16.根据段落11所述的方法，其中在步骤(b)中使用的与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U3区特异性杂交。

17.根据段落11所述的方法，其中在步骤(b)中使用的与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U3区和R区特异性杂交。

18.根据段落11所述的方法，其中在步骤(b)中使用的与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的PBS区特异性杂交。

19.根据段落11所述的方法，其中在步骤(b)中使用的与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与psi(Ψ)包装信号特异性杂交。

20.根据段落1至19中任一项所述的方法，其中所述定量扩增技术是qPCR。

21.根据段落1至19中任一项所述的方法，其中所述定量扩增技术是dPCR或ddPCR。

22.根据段落1至19中任一项所述的方法，其中所述定量扩增技术是终点PCR。

23.根据段落1至22中任一项所述的方法，其中步骤(b)利用与所述扩增的重组载体核酸特异性杂交的可检测核酸探针。

24.根据段落23所述的方法，其中所述重组载体核酸是慢病毒载体。

25.根据段落23或段落24所述的方法，其中用于所述整合的重组载体核酸的所述探针与所述整合的重组载体序列的LTR序列特异性杂交。

26.根据段落24所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于所述慢病毒载体核酸的所述探针与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U3区和R区特异性杂交。

27.根据段落24所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于所述慢病毒载体核酸的所述探针与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U5区和PBS区特异性杂交。

28.根据段落24所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于所述慢病毒载体核酸的所述探针与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的PBS区特异性杂交。

29.根据段落24所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于所述慢病毒载体核酸的所述探针与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的R区和U5区特异性杂交。

30.根据段落23至25中任一项所述的方法，其中与所述重组载体核酸特异性杂交的所述探针包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16的核酸序列。

31.一种用于监测重组载体核酸的转导效率的方法，所述方法包括：

a)提供了由重组载体核酸转导的包含基因组DNA的一种或多种生物样品，其中所述重组载体核酸的一部分被整合到所述基因组DNA中；以及

b)根据段落1至30中任一项所述的方法定量整合在所述宿主细胞基因组中的所述重组载体核酸。

32.根据段落1至30中任一项所述的方法，其中步骤(c)进一步包括将所述生物样品的所述整合的重组载体序列拷贝数与参考多核苷酸序列进行比较。

33.根据段落32所述的方法，其中所述参考多核苷酸序列编码管家蛋白。

34.根据段落33所述的方法，其中所述管家蛋白是人白蛋白。

35.根据段落1至34中任一项所述的方法，所述方法进一步包括特异性扩增参考多核苷酸序列的至少一对寡核苷酸引物。

36.根据段落31所述的方法，所述方法进一步包括将所述生物样品的所述整合的重组载体序列拷贝数与参考进行比较。

37.一种对由重组载体转导的细胞产物进行批释放测试的方法，所述方法包括

a)提供来自每批的由重组载体转导的包含基因组DNA的细胞产物的一个或多个生物样品；

b)根据段落1至35中任一项所述的方法定量整合在每个生物样品中的所述宿主细胞基因组中的所述重组载体核酸；

c)将步骤(b)中针对所述生物样品定量的所述整合的重组载体序列拷贝数与参考进行比较；以及

d)释放其中所述整合的重组载体序列拷贝数通过预先确定的标准的批。

38.一种定量慢病毒载体核酸整合到细胞基因组中的方法，所述方法包括：

(a)提供包含宿主细胞基因组的生物样品；

(b)使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对用定量扩增技术扩增所述生物样品的基因组DNA，其中所述引物对的至少一个寡核苷酸引物与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交；以及

(c)定量通过步骤(b)扩增的基因组核酸，其中定量整合在所述宿主细胞基因组中的所述慢病毒载体核酸包括将扩增的慢病毒载体核酸的比率与参考进行比较，

其中所述寡核苷酸引物对分别包含SEQ ID NO:1的核酸序列和SEQ ID NO:2的核酸序列，或分别包含SEQ ID NO:5的核酸序列和SEQ ID NO:6的核酸序列，或分别包含SEQID NO:14的核酸序列和SEQ ID NO:15的核酸序列。

39.根据段落1至38中任一项所述的方法，其中步骤(b)利用嵌入染料。

40.根据段落39所述的方法，其中所述嵌入染料是SYBR绿。

41.根据段落32至35中任一项所述的方法，其中以多重方式测量所述整合的重组载体序列拷贝数和所述参考多核苷酸序列拷贝数。

42.根据段落32至35中任一项所述的方法，其中以单重方式测量所述整合的重组载体序列拷贝数和所述参考多核苷酸序列拷贝数。

43.根据段落3所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:18、20或22的氨基酸序列。

44.根据段落3所述的方法，其中所述嵌合抗原受体识别BCMA、KLK2或GPRC5D。

45.根据段落2所述的方法，所述方法进一步包括用于鉴定所述转基因的方法。

46.根据段落45所述的方法，其中用于鉴定所述转基因的所述方法包括：

(a)提供包含宿主细胞基因组的生物样品；

(b)使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对用定量扩增技术扩增生物样品的基因组DNA，其中所述引物对的至少一个寡核苷酸引物与所述转基因特异性杂交；以及

(c)检测和/或定量通过步骤(b)扩增的基因组核酸。

47.根据段落32至35中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过评估选自由以下项组成的组的一个或多个测定接受标准来评价用于定量重组载体核酸整合的测定的有效性：

(a)在不含模板DNA的对照的所有复制品中，前病毒和参考多核苷酸序列两者的阈值循环是无法确定的；

(b)使用标准样品通过线性回归生成的所述前病毒和所述参考多核苷酸序列两者的标准曲线的相关系数大于或等于0.97；

(c)从所述标准曲线的斜率估计的前病毒和参考多核苷酸序列的拷贝值表明PCR效率介于90％和110％之间；

(d)在所述标准样品中的任一者的复制品中，所述前病毒和所述参考多核苷酸序列两者没有一个的所述阈值循环是无法确定的；

(e)基础标准样品中所述前病毒和所述参考多核苷酸序列两者的平均阈值循环小于或等于22.0；

(f)每个标准样品中的所述前病毒和所述参考多核苷酸序列两者的所述阈值循环中的标准偏差小于或等于0.60；

(g)所述一个或多个阳性对照样品的所述参考多核苷酸序列的平均测量拷贝在标称预期值的30％内；

(h)所述一个或多个阳性对照样品的所测量的平均VCN/细胞值在每个对照的标称预期VCN/细胞值的30％内；以及

(i)所述一个或多个阳性对照样品的所述VCN/细胞值的变异系数小于或等于20％。

48.根据段落32至35中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过评估选自由以下项组成的组的一个或多个样品接受标准来评价所述定量样品的重组载体核酸所述整合的有效性：

(a)所述样品中所述参考多核苷酸序列的平均拷贝值在30,303.030拷贝的预期值的30％内；

(b)如果所述样品的基因组DNA(gDNA)浓度低于0.02μg/μL，则所述样品的所述参考多核苷酸序列的预期拷贝根据实际加载到反应中的DNA量计算；

(c)所述样品中的平均靶前病毒拷贝值介于所述测定的所述拷贝值的验证范围之间；

(d)所述样品中的所述平均靶前病毒拷贝值介于121,212.121和193.939拷贝之间；

(e)所述靶样品复制品的VCN/细胞值的变异系数小于或等于20％；以及

(f)所述样品中的靶前病毒和靶参考多核苷酸序列两者的循环阈值中的标准偏差小于或等于0.60。

49.根据段落43或44所述的方法，其中所述嵌合抗原受体是由包含SEQ ID NO:19或21的序列的核酸序列编码的多肽。

50.根据段落45或46所述的方法，其中所述转基因是由包含SEQ ID NO:19或21的序列的核酸序列编码的多肽。

51.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的核酸序列。

52.一种用于测量整合的重组载体核酸序列拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括：

引物对的引物，所述引物对的所述引物与整合的重组载体核酸特异性杂交，其中所述引物对特异性扩增所述整合的重组载体核酸的一部分；和

可检测核酸探针，所述可检测核酸探针与所述扩增的重组载体核酸特异性杂交。

53.一种用于测量整合的重组载体核酸序列拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括：

正向引物，所述正向引物与包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:14的核酸序列的整合的重组载体核酸特异性杂交；

反向引物，所述反向引物与包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15的核酸序列的整合的重组载体核酸特异性杂交；和

可检测探针，所述可检测探针包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7或SEQID NO:16的核酸序列。

以引用方式并入

本文提及的所有出版物和专利都据此全文以引用方式并入本文，就如同明确且独立地指明每个单独的出版物或专利都是以引用方式并入的。

虽然已经讨论了本公开的具体实施方案，但是以上说明书是例示性的而非限制性的。在查看本说明书和以下权利要求后，本公开的许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本公开的全部范围应参考权利要求书以及其等同物的全部范围和说明书以及此类变化来确定。

序列表

<110> JANSSEN PHARMACEUTICA NV

<120> 用于定量重组载体核酸整合的组合物和方法

<130> PRD4079WOPCT1

<140>

<141>

<150> 63/148,300

<151> 2021-02-11

<150> 62/987,019

<151> 2020-03-09

<160> 22

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成引物”

<400> 1

ctaattcact cccaacgaag acaag 25

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成引物”

<400> 2

ggtttccctt tcgctttcaa g 21

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成探针”

<400> 3

cgccactgct agagat 16

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成探针”

<400> 4

gcttgtactg ggtctctctg gttagac 27

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成引物”

<400> 5

ctgctttttg cttgtactgg g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成引物”

<400> 6

gagagagctc ctctggtttc c 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成探针”

<400> 7

ctttcaagtc cctgttcggg cgcc 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成引物”

<400> 8

tcatctcttg tgggctgtaa tc 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成引物”

<400> 9

tgctggttct ctttcactga c 21

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成探针”

<400> 10

agggagagat ttgtgtgggc atgac 25

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成探针”

<400> 11

gatttgtgtg ggcatgac 18

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成探针”

<400> 12

ccctgttcgg gcgcc 15

<210> 13

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”

<400> 13

ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 60

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 120

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 180

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 240

gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 300

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成引物”

<400> 14

tgcttgtact gggtctctc 19

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成引物”

<400> 15

gcgccactgc tagagatt 18

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成探针”

<400> 16

tgccttgagt gcttcaagta gtgtgt 26

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成探针”

<400> 17

tgcttcaagt agtgtgt 17

<210> 18

<211> 488

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 18

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gln Ala Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu His

35 40 45

Thr Phe Ser Ser His Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Glu Arg Glu Ser Val Ala Val Ile Gly Trp Arg Asp Ile Ser Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

85 90 95

Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Arg Ile Asp Ala Ala Asp Phe Asp

115 120 125

Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met

165 170 175

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala

180 185 190

Ile Ser Leu Ser Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly

195 200 205

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Val Leu Gln

210 215 220

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala

225 230 235 240

Asp Arg Lys Ser Val Met Ser Ile Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

305 310 315 320

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg

325 330 335

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

340 345 350

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

355 360 365

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

370 375 380

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

385 390 395 400

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

405 410 415

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

420 425 430

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

435 440 445

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

450 455 460

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

465 470 475 480

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 19

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”

<400> 19

atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgctgctcgc 60

cctcaggtca aactggaaga atctggcgga ggcctggtgc aggcaggacg gagcctgcgc 120

ctgagctgcg cagcatccga gcacaccttc agctcccacg tgatgggctg gtttcggcag 180

gccccaggca aggagagaga gagcgtggcc gtgatcggct ggagggacat ctccacatct 240

tacgccgatt ccgtgaaggg ccggttcacc atcagccggg acaacgccaa gaagacactg 300

tatctgcaga tgaacagcct gaagcccgag gacaccgccg tgtactattg cgcagcaagg 360

agaatcgacg cagcagactt tgattcctgg ggccagggca cccaggtgac agtgtctagc 420

ggaggaggag gatctgaggt gcagctggtg gagagcggag gcggcctggt gcaggccgga 480

ggctctctga ggctgagctg tgcagcatcc ggaagaacct tcacaatggg ctggtttagg 540

caggcaccag gaaaggagag ggagttcgtg gcagcaatca gcctgtcccc taccctggcc 600

tactatgccg agagcgtgaa gggcaggttt accatctccc gcgataacgc caagaataca 660

gtggtgctgc agatgaactc cctgaaacct gaggacacag ccctgtacta ttgtgccgcc 720

gatcggaaga gcgtgatgag cattagacca gactattggg ggcagggaac acaggtgacc 780

gtgagcagca ctagtaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 840

gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 900

cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 960

tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa 1020

ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1080

ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1140

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1200

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1260

atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1320

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1380

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1440

cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1467

<210> 20

<211> 474

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 20

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Phe Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Thr Gln Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser

115 120 125

Thr Gly Gly Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val

130 135 140

Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser

145 150 155 160

Leu Thr Asn Ile Arg Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly

165 170 175

Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser

180 185 190

Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser

195 200 205

Lys Ser Gln Val Val Leu Thr Leu Thr Asn Val Asp Pro Val Asp Thr

210 215 220

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Arg Leu Pro Tyr Gly Met Asp Val

225 230 235 240

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Pro Ala

245 250 255

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

260 265 270

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

275 280 285

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

290 295 300

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

305 310 315 320

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

325 330 335

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

340 345 350

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

355 360 365

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

370 375 380

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

385 390 395 400

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

405 410 415

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

420 425 430

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

435 440 445

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

450 455 460

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 21

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”

<400> 21

atggcttggg tgtggacctt gctattcctg atggcagctg cccaaagtat acaggccgac 60

attgtgatga cccaaacacc tcttagtagt cctgtaactc tcggacagcc agcttcaata 120

tcttgtcgct caagtcaatc cctcgtccat tccgacggca acacctacct ctcttggctc 180

caacagagac ccggccagcc tcccagactt ctcatctaca aaatcagtaa caggttcttc 240

ggcgtccctg acaggttcag tggatctgga gcaggtacag atttcacctt gaagataagt 300

agagtggagg ctgaggacgt aggcgtctat tattgtatgc aagctaccca attcccacat 360

acattcggcc aaggcactaa attggaaata aaaggcggct ccgagggcaa gagcagcggc 420

agcggcagcg agagcaagag caccggcggc agccaagtaa cactcaagga gagcggacca 480

gtcttggtga aaccaactga gaccttgact ttgacatgta ctgtaagtgg cttcagcctt 540

accaacatca ggatgtcagt atcttggata aggcaaccac ctggcaaggc actcgaatgg 600

ctggcacaca tcttttctaa cgacgaaaaa tcctattctt ccagtctcaa aagtcgcctt 660

accatcagcc gagataccag taagagtcaa gtagttctta cattgaccaa tgtagatcca 720

gttgatacag ccacatacta ctgcgcacga atgcggcttc catacggcat ggatgtatgg 780

ggacagggaa ctactgttac cgttagttcc actagtaccc cagccccacg ccctcccacc 840

cctgctccta caatagcatc ccagcccttg tcacttcgcc ccgaagcatg cagaccagcc 900

gcaggcggtg ctgtgcatac ccgaggactg gacttcgcct gcgacatcta catctgggcc 960

ccactggccg gcacctgcgg cgtgctgctg ctgagcctgg tgatcaccct gtactgcaag 1020

cgcggccgca agaagctgct gtacatcttc aagcagccat tcatgcgccc agtgcagacc 1080

acccaggagg aggacggctg cagctgccgc ttcccagagg aggaggaggg cggctgcgag 1140

ctgcgcgtga agttcagccg cagcgccgac gccccagcct acaagcaggg ccagaaccag 1200

ctgtacaacg agctgaacct gggccgccgc gaggagtacg acgtgctgga caagcgccgc 1260

ggccgcgacc cagagatggg cggcaagcca cgccgcaaga acccacagga gggcctgtac 1320

aacgagctgc agaaggacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag 1380

cgccgccgcg gcaagggcca cgacggcctg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggac 1440

acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg ccaccacgct ga 1482

<210> 22

<211> 474

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 22

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Glu Gly

100 105 110

Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp

145 150 155 160

Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Arg Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

Arg Asp Gln Asn Tyr Asp Ile Leu Thr Gly His Tyr Gly Met Asp Val

225 230 235 240

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Pro Ala

245 250 255

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

260 265 270

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

275 280 285

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

290 295 300

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

305 310 315 320

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

325 330 335

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

340 345 350

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

355 360 365

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

370 375 380

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

385 390 395 400

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

405 410 415

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

420 425 430

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

435 440 445

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

450 455 460

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

Claims (53)

1.一种用于定量重组载体核酸整合到细胞基因组中的方法，所述方法包括：

(a) 提供包含宿主细胞基因组的生物样品；

(b) 使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对用定量扩增技术扩增所述生物样品的基因组DNA，其中所述引物对的至少一个寡核苷酸引物与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交；以及

(c) 检测和/或定量通过步骤(b)扩增的基因组核酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组载体包含转基因。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述转基因编码嵌合抗原受体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组载体是基因疗法载体。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述基因疗法载体是病毒载体。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组载体是逆转录病毒载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述慢病毒载体所基于的慢病毒是人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）或人类免疫缺陷病毒2（HIV-2）。

9. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 14的核酸序列。

10. 根据权利要求9所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于扩增所述重组载体核酸的所述第二寡核苷酸引物包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 15的核酸序列。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是细胞样品或组织样品。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述组织样品是血液、血浆、血清、唾液或组织活检。

13.根据权利要求1所述的方法，其中与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与所述整合的重组载体序列的LTR序列特异性杂交。

14.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(b)中使用的与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U3区特异性杂交。

15.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(b)中使用的与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U3区和R区特异性杂交。

16.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(b)中使用的与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的PBS区特异性杂交。

17.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)进一步包括将所述生物样品的所述整合的重组载体序列拷贝数与参考多核苷酸序列进行比较。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述定量扩增技术是qPCR。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述定量扩增技术是dPCR或ddPCR。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述参考多核苷酸序列编码管家蛋白。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述管家蛋白是人白蛋白。

22.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)利用与所述扩增的重组载体核酸特异性杂交的可检测核酸探针。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述重组载体核酸是慢病毒载体。

24. 根据权利要求22所述的方法，其中与所述重组载体核酸特异性杂交的所述探针包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 16的核酸序列。

25.根据权利要求22所述的方法，其中用于所述整合的重组载体核酸的所述探针与所述整合的重组载体序列的LTR序列特异性杂交。

26.根据权利要求23所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于所述慢病毒载体核酸的所述探针与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U3区和R区特异性杂交。

27.根据权利要求23所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于所述慢病毒载体核酸的所述探针与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U5区和PBS区特异性杂交。

28.根据权利要求23所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于所述慢病毒载体核酸的所述探针与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的PBS区特异性杂交。

29.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(b)中使用的与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与psi（Ψ）包装信号特异性杂交。

30.根据权利要求23所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于所述慢病毒载体核酸的所述探针与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的R区和U5区特异性杂交。

31.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品来自受试者。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者是人。

33.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括特异性扩增参考多核苷酸序列的至少一对寡核苷酸引物。

34. 一种用于监测重组载体核酸的转导效率的方法，所述方法包括：

a) 提供了由重组载体核酸转导的包含基因组DNA的一种或多种生物样品，其中所述重组载体核酸的一部分被整合到所述基因组DNA中；以及

b)根据权利要求1所述的方法定量整合在所述宿主细胞基因组中的所述重组载体核酸。

35. 根据权利要求34所述的方法，所述方法进一步包括将所述生物样品的所述整合的重组载体序列拷贝数与参考进行比较。

36.一种对由重组载体转导的细胞产物进行批释放测试的方法，所述方法包括

a)提供来自每批的由重组载体转导的包含基因组DNA的细胞产物的一个或多个生物样品；

b)根据权利要求1所述的方法定量每个生物样品中整合在所述宿主细胞基因组中的所述重组载体核酸；

c) 将步骤(b)中针对所述生物样品定量的所述整合的重组载体序列拷贝数与参考进行比较；以及

d)释放其中所述整合的重组载体序列拷贝数通过预先确定的标准的批。

37.一种定量慢病毒载体核酸整合到细胞基因组中的方法，所述方法包括：

(a) 提供包含宿主细胞基因组的生物样品；

(b) 使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对用定量扩增技术扩增所述生物样品的基因组DNA，其中所述引物对的至少一个寡核苷酸引物与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交；以及

(c) 定量通过步骤(b)扩增的所述基因组核酸，其中定量整合在所述宿主细胞基因组中的所述慢病毒载体核酸包括将扩增的慢病毒载体核酸的比率与参考进行比较，

其中所述寡核苷酸引物对分别包含SEQ ID NO: 1的核酸序列和SEQ ID NO: 2的核酸序列，或分别包含SEQ ID NO: 5的核酸序列和SEQ ID NO: 6的核酸序列，或分别包含SEQID NO: 14的核酸序列和SEQ ID NO: 15的核酸序列。

38. 一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO: 16的核酸序列。

39. 一种用于测量整合的重组载体核酸序列拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括：

引物对的引物，所述引物对的所述引物与整合的重组载体核酸特异性杂交，其中所述引物对特异性扩增所述整合的重组载体核酸的一部分；和

可检测核酸探针，所述可检测核酸探针与所述扩增的重组载体核酸特异性杂交。

40.一种用于测量整合的重组载体核酸序列拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括：

正向引物，所述正向引物与包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 14的核酸序列的整合的重组载体核酸特异性杂交；

反向引物，所述反向引物与包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 15的核酸序列的整合的重组载体核酸特异性杂交；和

可检测探针，所述可检测探针包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7或SEQID NO: 16的核酸序列。

41. 根据权利要求3所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO: 18、20或22的氨基酸序列。

42.根据权利要求3所述的方法，其中所述嵌合抗原受体识别BCMA、KLK2或GPRC5D。

43.根据权利要求1所述的方法，其中所述定量扩增技术是终点PCR。

44.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)利用嵌入染料。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述嵌入染料是SYBR绿。

46.根据权利要求17所述的方法，其中以多重方式测量所述整合的重组载体序列拷贝数和所述参考多核苷酸序列拷贝数。

47.根据权利要求17所述的方法，其中以单重方式测量所述整合的重组载体序列拷贝数和所述参考多核苷酸序列拷贝数。

48.根据权利要求2所述的方法，所述方法进一步包括用于鉴定所述转基因的方法。

49.根据权利要求48所述的方法，其中用于鉴定所述转基因的所述方法包括：

(a) 提供包含宿主细胞基因组的生物样品；

(b) 使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对用定量扩增技术扩增所述生物样品的基因组DNA，其中所述引物对的至少一个寡核苷酸引物与所述转基因特异性杂交；以及

(c) 检测和/或定量通过步骤(b)扩增的所述基因组核酸。

50.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法进一步包括通过评估选自由以下项组成的组的一个或多个测定接受标准来评价用于定量重组载体核酸整合的测定的有效性：

(a) 在不含模板DNA的对照的所有复制品中，前病毒和所述参考多核苷酸序列两者的阈值循环是无法确定的；

(b) 使用标准样品通过线性回归生成的所述前病毒和所述参考多核苷酸序列两者的标准曲线的相关系数大于或等于0.97；

(c) 从所述标准曲线的斜率估计的前病毒和参考多核苷酸序列的拷贝值表明PCR效率介于90%和110%之间；

(d) 在所述标准样品中的任一者的复制品中，所述前病毒和所述参考多核苷酸序列两者没有一个的所述阈值循环是无法确定的；

(e) 基础标准样品中所述前病毒和所述参考多核苷酸序列两者的平均阈值循环小于或等于22.0；

(f) 每个标准样品中的所述前病毒和所述参考多核苷酸序列两者的所述阈值循环中的标准偏差小于或等于0.60；

(g) 所述一个或多个阳性对照样品的所述参考多核苷酸序列的平均测量拷贝在标称预期值的30%内；

(h) 所述一个或多个阳性对照样品的所测量的平均VCN/细胞值在每个对照的标称预期VCN/细胞值的30%内；以及

(i) 所述一个或多个阳性对照样品的所述VCN/细胞值的变异系数小于或等于20%。

51.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法进一步包括通过评估选自由以下项组成的组的一个或多个样品接受标准来评价所述定量样品的重组载体核酸所述整合的有效性：

(a) 所述样品中所述参考多核苷酸序列的平均拷贝值在30,303.030拷贝的预期值的30%内；

(b) 如果所述样品的基因组DNA（gDNA）浓度低于0.02µg/µL，则所述样品的所述参考多核苷酸序列的预期拷贝根据实际加载到反应中的DNA量计算；

(c) 所述样品中的平均靶前病毒拷贝值介于所述测定的所述拷贝值的验证范围之间；

(d) 所述样品中的所述平均靶前病毒拷贝值介于121,212.121和193.939拷贝之间；

(e) 所述靶样品复制品的VCN/细胞值的变异系数小于或等于20%；以及

(f) 所述样品中的靶前病毒和靶参考多核苷酸序列两者的循环阈值中的标准偏差小于或等于0.60。

52. 根据权利要求41所述的方法，其中所述嵌合抗原受体是由包含SEQ ID NO: 19或21的序列的核酸序列编码的多肽。

53. 根据权利要求48所述的方法，其中所述转基因是由包含SEQ ID NO: 19或21的序列的核酸序列编码的多肽。

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